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Gebiet der
Erfindung
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Die
Erfindung betrifft ein Hefeausflockungsgen und dessen Verwendung.
Insbesondere betrifft die Erfindung ein Protein, welches die Wirkung
hat, Hefe die Ausflockungseigenschaft von Bierhefe zu verleihen, eine
DNA, die das Protein kodiert, ein Plasmid, das die DNA enthält, ein
Verfahren zur Herstellung eines Hefestamms, worin die Ausflockungseigenschaft
von Bierhefe übertragen
oder verstärkt
worden ist unter Verwendung der DNA, ein Verfahren zur Herstellung
eines Hefestamms, worin die Ausflockungseigenschaft von Bierhefe
eliminiert oder reduziert worden ist unter Verwendung der DNA, ein
Verfahren zum Eliminieren oder Reduzieren der Ausflockungseigenschaft
von Bierhefe in Hefe durch Inhibieren der Expression der DNA.
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Die
Erfindung betrifft außerdem
einen Hefestamm, worin die Ausflockungseigenschaft von Bierhefe übertragen,
verstärkt,
eliminiert oder reduziert worden ist durch eines oben erwähnten Verfahren.
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Darüber hinaus
betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von gebrauten
Produkten, umfassend das Kultivieren des obigen Hefestamms sowie
gebraute Produkte, die durch das oben erhaltenene Verfahren erhalten
werden.
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Hintergrund
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Es
ist wohlbekannt, dass in alkoholischen Getränken, wie Bier und Wein, die
Ausflockungseigenschaft von Hefe, die bei der Fermentierung verwendet
wird, nicht nur wichtig ist da sie das Aroma und den Geschmack der
resultierenden Produkte bestimmt, sondern auch weil sie die Verarbeitbarkeit
bei den Fermentierungsverfahren beeinflusst. Die Hefe, die beim
Brauen von Hellbier, das weitgehend in Deutschland, Japan und vielen
anderen Ländern
hergestellt wird, hat die Eigenschaft, dass Zellen ausflocken und
zum Boden der fermentierten Stammwürze am Ende der Fermentierung
sedimentieren; solche Hefe wird insbesondere untergärige Hefe
genannt. Beim Bierbrauen gibt es ein charakteristisches Verfahrensmerkmal,
das bei anderen Brauarten nicht vorkommt, das ist, dass Hefezellen,
die am Ende der Fermentierung sedimentierten, zurückgewonnen
werden und bei der nachfolgenden Fermentierung wieder verwendet
werden. Folglich hat die Eigenschaft der untergärigen Hefe, dass sie in einem
späten
Stadium der Fermentierung sedimentiert, eine besonders große Bedeutung
beim Bierbrauen.
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Da
die Bierhefe eine der wichtigsten Faktoren ist, die die Qualität des Endbierproduktes
bestimmt, ist das Züchten
von ausgezeichneten Hefestämmen
ein wichtiges Unterfangen von Bierbrauereien. Beim Züchten von
untergäriger
Hefe hat das Übertragen
einer geeigneten Ausflockungseigenschaft auf Hefe eine wichtige Bedeutung.
Das liegt daran, dass ein Hefestamm, der eine zu starke Ausflockungseigenschaft
hat, in der fermentierten Stammwürze
während
der Fermentierung ausfällt,
was zur Beendigung der Fermentierung führt, und auf der anderen Seite
bleibt ein Hefestamm, dem die Ausflockungseigenschaft fehlt, sogar
in einem späten Stadium
der Fermentierung aufgelöst
und ein Vorgang, wie die Zentrifugierung, ist notwendig, um Hefezellen aus
der fermentierten Stammwürze
zu entfernen. Ein wünschenswerter
Hefestamm beim gegenwärtigen
Herstellungsverfahren ist daher ein Stamm, der sich zu Beginn der
Fermentierung dispergiert und zu einem späten Stadium der Fermentierung
ausfällt.
Bei einem anderen Herstellungsverfahren ist natürlich ein Hefestamm mit einer
Ausflockungseigenschaft, der sich für das Verfahren eignet, erforderlich.
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Trotz
der zahlreichen Studien, die die Hefeausflockungseigenschaft betreffen,
die industriell bedeutend ist, ist der Mechanismus der Hefeausflockung
noch nicht aufgeklärt
worden. Es ist schwierig zu sagen, dass die Kontrolle der Ausflockungseigenschaft
durch Verbesserung eines Hefestammes per se erfolgreich sein würde. Als
Ergebnis jahrelanger genetischer Forschungen wurde das Vorhandensein
von Hefegenen, wie FLO1, flo3, FLO5, FLO8, sf11, fsu1, fsu2, tup1,
cyc8, cka2, FMC1, sowie der Gene oli1 und oxi2 in DNA von Mitochondrien
bestätigt
als Gene, die an der Ausflockungseigenschaft von Hefe beteiligt
sind. Eine Studie dieser Gene schloss die Ausflockungseigenschaft
von Hefe auf der molekularen Ebene ein, und die Isolierung und Analyse
des FLO1-Gens wurde durchgeführt
[Yeast, 9, 423 (1993) und Yeast, 10, 211 (1994)]. Über die Isolierung
und Analyse des FLO5-Gens
wurde ebenfalls berichtet. Dieser Bericht hat gezeigt, dass, obgleich sich
der Ort des FLO5-Gens von dem des zuvor berichteten FLO1-Gens in
der chromosomalen DNA von Hefe unterscheidet, die Restriktionskarte
und die Nukleotidsequenz des FLO5-Gens fast identisch mit denen
des FLO1-Gens ist [J. Inst. Brew., 85, 95, (1979) und Curr. Genet.,
25, 196 (1994)].
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Die
Analysen dieser Gene auf molekularer Ebene reichten jedoch nicht
aus, und es ist bisher noch nicht geklärt worden, durch welchen Mechanismus
diese Gene an der Ausflockungseigenschaft von Hefe beteiligt sind.
Hinsichtlich anderer Gene als FLO1 und FLO5, die an der Hefeausflockungseigenschaft
beteiligt sind, sind bisher sogar keine Isolierung oder Strukturanalyse
durchgeführt
worden. Es gibt keinen Bericht über Proteine,
für die
diese Gene kodieren.
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Beim
Versuch, die Ausflockungseigenschaft von Hefe unter Verwendung eines
solchen oben beschriebenen Gens, das an dieser Eigenschaft beteiligt
ist, zu verbessern, wurde ein Bericht erstellt, bei dem die Ausflockungseigenschaft
auf verschiedene nicht-flokkulierende Hefestämme einschließlich Bierhefestämme durch Einführen des
FLO1-Gens, eines Ausflockungsgens von Saccharomyces cerevisiae, übertragen
wurde [Agric. Biol. Chem., 55, 1547 (1991)]. Es ist jedoch nicht
darüber
berichtet worden, dass die Ausflockungsfähigkeit der so erhaltenen transformierten
Bierhefe im Anfangsstadium der Fermentierung ausgedrückt worden
ist und dass die Fermentierung dazu neigt, sich zu verspäten [Journal
of the Brewing Society of Japan, 88, 665 (1993)]. Folglich kann
nicht gesagt werden, dass das Verleihen der Ausflockungseigenschaft
auf Hefe mit diesem FLO1-Gen auf eine günstige Art gesteuert wird und
eine weitere Verbesserung war erforderlich, um ein solches Verfahren
tatsächlich
anwenden zu können.
Obgleich bekannt war, dass das FLO1-Gen Hefe Ausflockungseigenschaft
verleihen kann, war die Rolle dieses Genprodukts bei der Hefeausflockungseigenschaft nicht
aufgeklärt.
Als Ergebnis der Analyse der von der Nukleotidsequenz des FLO1-Gens
abgeleiteten Aminosäuresequenz
wurde angenommen, dass sich das FLO1-Genprodukt in der Oberflächenschicht
von Hefezellen befindet. Es scheint, dass diese Annahme auch durch
einen Bericht gestützt
ist, dass die Aminosäuresequenz
der N-terminalen
14 Reste eines Proteins (Flocculin), erhältlich insbesondere von der
Oberflächenschicht
von flockigen Bierhefezellen, etwas Homologie mit der Aminosäuresequenz,
die von der Nukleotidsequenz des FLO1-Gens angenommen wird, hat
[Appl. Environ. Microbiol., 60, 2754 (1994)], aber der Mechanismus
des obigen Proteins ist bisher nicht aufgeklärt worden. Folglich hat der
Versuch, die Hefeausflockung durch das FLO1-Gen zu steuern, seine
Grenzen erreicht.
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Als
Versuch, ein Gen außer
FLO1 zu verwenden, wurde das Verleihen einer erblichen Eigenschaft
auf Hefe unter Verwendung des FLO5-Gens und des Zellfusionsverfahrens
versucht und der Nutzwert des Verleihens der erblichen Eigenschaft
wurde gezeigt [J. Inst. Brew., 98, 315 (1992)]. Da das Verfahren
zum Einführen einer
erblichen Eigenschaft jedoch das Zellfusionsverfahren ist, war es
schwierig, einen Hefestamm mit der Eigenschaft von Interesse zu
erhalten, und darüber
hinaus ergab sich ein Problem, dass DNA-Sequenzen außer dem
Ausflockungs-verwandten Gen von Interesse in den resultierenden
Hefestamm eingeführt
wurden, z.B. das POF1-Gen,
das dem Bier Phenolgeschmack verleiht und in vielen Saccharomyces
cerevisiae-Stämmen
zu finden ist, gleichzeitig eingeführt wurde [Proc. Eur. Brew.
Conv. 497 (1981)]. Folglich kann die Verbesserung der Ausflockungseigenschaft
von brauchbaren Hefestämmen
durch dieses Verfahren nicht gesteuert werden.
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Verbesserungen
der Ausflockungsfähigkeit
von Hefe unter Verwendung dieser Gene, die an der Hefeausflockung
beteiligt sind und die bis jetzt versucht wurden, sind von keiner
praktischen Anwendbarkeit, wie zuvor beschrieben ist.
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Unter
diesen Umständen
zielt die Erfindung auf die folgenden Angelegenheiten ab:
- (1) ein Protein bereitzustellen, das Aktivität aufweist,
Hefe die Ausflockungseigenschaft von Bierhefe zu verleihen;
- (2) einen DNA-Strang bereitzustellen, der ein Protein kodiert,
das Aktivität
aufweist, Hefe die Ausflockungseigenschaft von Bierhefe zu verleihen;
- (3) ein Verfahren bereitzustellen zur Herstellung eines Hefestammes,
wobei die Ausflockungseigenschaft von Bierhefe übertragen oder verbessert wurde
unter Verwendung des obigen DNA-Stranges, oder ein Verfahren zur
Herstellung eines Hefestammes, wobei die Ausflockungseigenschaft
von Bierhefe eliminiert oder reduziert wurde unter Verwendung des
obigen DNA-Stranges, und ein Hefestamm, auf den die Ausflockungseigenschaft
von Hefe übertragen,
verbessert, eliminiert oder reduziert wurde unter Verwendung des oben
erwähnten
Verfahrens;
- (4) ein Verfahren bereitzustellen zur Eliminierung oder Reduzierung
der Ausflockungseigenschaft eines Hefestammes durch Inhibierung
der Expression des obigen DNA-Stranges; und
- (5) ein Verfahren bereitzustellen zur Herstellung von gebrauten
Produkten, umfassend das Kultivieren des oben beschriebenen Hefestammes
sowie gebraute Produkte, die durch das Verfahren erhalten werden.
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Offenbarung
der Erfindung
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Um
die obigen Probleme zu lösen,
haben die Erfinder intensive und ausführliche Untersuchungen über die
Ausflockungseigenschaft von untergäriger Bierhefe durchgeführt. Als
Ergebnis haben die Erfinder die Existenz des FLO1-homologen Gens,
das insbesondere ausflockende untergärige Hefe aufweist (hiernach
als „Lg-FLO1
(Gen)" bezeichnet),
bestätigt
und die Beziehung zwischen dem Lg-FLO1-Gen und der Ausflockungseigenschaft
aufgeklärt.
Anschließend
ermöglichten
die Erfinder, dass das Lg-FLO1-Genprodukt
in einem Hefestamm hergestellt werden kann, der aufgrund der Zerstörung von
FLO1, was durch die Einführung von
Lg-FLO1 verursacht wurde, nicht-ausflockend wurde. Als Ergebnis
haben die Erfinder festgestellt, dass die Ausflockung in der Art
von Bierhefe durch die Einführung
der Lg-FLO1-Gens induziert werden kann. Dieses Ergebnis impliziert
nicht nur das Verleihen der Ausflockungseigenschaft in der Art von
Bierhefe, sondern auch die Umwandlung eines Hefestammes mit einer
Ausflockungseigenschaft in der Art einer Laborhefe in einen Hefestamm
mit einer Ausflockungseigenschaft in der Art von Bierhefe. Darüber hinaus
haben die Erfinder den Bereich des Lg-FLO1-Genproduktes bestimmt,
der in Hefe die Ausflockung vom Bierhefe-Typ steuert. Außerdem gelang
es den Erfindern, einen ausflockenden Bierhefestamm in einen nicht-ausflockenden Stamm
umzuwandeln, und zwar durch Einführen eines
zerstörten
Lg-FLO1-Gens. Die vorliegende Erfindung wurde folglich erzielt.
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Die
vorliegende Erfindung stellt das Lg-FLO1-Genprodukt bereit mit der
Aminosäuresequenz,
die im Wesentlichen in SEQ ID NO: 1 in der Sequenzliste gezeigt
ist, oder ein Protein, das ein Peptid mit der Aminosäuresequenz,
die im Wesentlichen in SEQ ID NO: 1 der Sequenzliste gezeigt ist,
umfasst und das die Wirkung hat, Hefe die Ausflockungseigenschaft
von Bierhefe zu verleihen, oder ein Protein, das ein Polypeptid
mit einer Teilsequenz der Aminosäuresequenz,
die im Wesentlichen in SEQ ID NO: 1 der Sequenzliste gezeigt ist,
umfasst, enthaltend die Aminosäurereste
von Position 25 bis Position 213, und welches die Wirkung hat, Hefe
die Ausflockungseigenschaft von Bierhefe zu verleihen, Protein,
welches ein Polypeptid mit einer Teilsequenz der Aminosäuresequenz,
die im Wesentlichen in SEQ ID NO: 1 der Sequenzliste gezeigt ist,
umfasst, enthaltend mindestens die Aminosäurereste von Position 25 bis
Position 97, und welches die Wirkung hat, Hefe die Ausflockungseigenschaft
von Bierhefe zu verleihen, und ein Polypeptid, das die Wirkung hat,
Hefe die Ausflockungseigenschaft von Bierhefe zu verleihen, und
das die Aminosäuresequenz,
die im Wesentlichen in SEQ ID NO: 2 der Sequenzliste gezeigt ist,
aufweist. Der Ausdruck „im
Wesentlichen", der
hier verwendet wird, bedeutet, dass die Aminosäuresequenz Deletion, Substitution,
Addition, Polymerisation und dergleichen von einem oder mehreren
Aminosäureresten
aufweisen kann, solange die Aminosäuresequenz die Wirkung hat, Hefe
die Ausflockungseigenschaft von Bierhefe zu verleihen.
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Außerdem stellt
die Erfindung einen DNA-Strang bereit, umfassend eine Nukleotidsequenz,
die die Aminosäuresequenz,
die im Wesentlichen in SEQ ID NO: 1 als Sequenzliste gezeigt ist,
kodiert, oder eine DNA, umfassend eine Nukleotidsequenz, kodierend
für ein
Polypeptid mit einer Teilsequenz der Aminosäuresequenz, welche im Wesentlichen
in SEQ ID NO: 1 der Sequenzliste gezeigt ist, enthaltend die Aminosäurereste
von Position 25 bis Position 213, oder eine DNA, umfassend eine
Nukleotidsequenz, kodierend für
ein Polypeptid mit einer Teilsequenz der Aminosäuresequenz, die im Wesentlichen
in SEQ ID NO: 1 der Sequenzliste gezeigt ist, enthaltend mindestens
die Aminosäurereste
von Position 25 bis Position 97. Der Ausdruck „im Wesentlichen", der hier verwendet
wird, bedeutet, dass die Aminosäuresequenz
Deletion, Substitution, Addition, Polymerisation und dergleichen
von einem oder mehreren Aminosäureresten
aufweisen kann, solange die Aminosäuresequenz die Wirkung hat,
Hefe die Ausflockungseigenschaft von Bierhefe zu verleihen.
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Darüber hinaus
stellt die vorliegende Erfindung eine DNA bereit, die eine Nukleotidsequenz,
kodierend für
eine Aminosäuresequenz,
die die Wirkung hat, Hefe die Ausflockungseigenschaft von Bierhefe
zu verleihen, und die eine Teilsequenz der Nukleotidsequenz, die
in SEQ ID NO: 3 der Sequenzliste gezeigt ist, enthaltend die Nukleotidsequenz
von Position 59 bis Position 697, oder eine DNA, die dazu komplementär ist, eine DNA,
die eine Nukleotidsequenz umfasst, kodierend für ein Protein, welches die
Wirkung hat, Hefe die Ausflockungseigenschaft von Bierhefe zu verleihen,
und die eine Teilsequenz der Nukleotidsequenz, die in SEQ ID NO:
3 der Sequenzliste gezeigt ist, enthaltend die Nukleotidsequenz
von Position 131 bis Position 697 oder eine DNA, die dazu komplementär ist, eine
DNA, umfassend eine Teilsequenz der in SEQ ID NO: 3 der Sequenzliste
gezeigten Nukleotidsequenz, enthaltend die Nukleotidsequenz von
Position 131 bis Position 349, oder eine DNA, die dazu komplementär ist, und
eine DNA, die die in SEQ ID NO: 4 der Sequenzliste gezeigte Nukleotidsequenz
umfasst, und die ein Polypeptid kodiert, welches die Wirkung hat,
Hefe die Ausflockungseigenschaft von Bierhefe zu verleihen, oder
eine DNA, die dazu komplementär
ist.
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Die
vorliegende Erfindung stellt außerdem
eine DNA bereit, die in das Plasmid KTYT2, YESKT2, KNWtC3 oder KNYES
eingeführt
ist und die eine Nukleotidsequenz umfasst, die ein Protein kodiert,
welches die Wirkung hat, Hefe die Ausflockungseigenschaft von Bierhefe
zu verleihen, sowie ein Plasmid, umfassend die obige DNA.
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Darüber hinaus
stellt die Erfindung ein Verfahren bereit zur Herstellung eines
Hefestamms, worin die Ausflockungseigenschaft von Bierhefe übertragen
oder verstärkt
worden ist, dadurch gekennzeichnet, dass die oben erwähnte DNA
darin eingeführt
wird. Die Erfindung stellt außerdem
ein Verfahren zur Herstellung eines Hefestammes bereit, worin die
Ausflockungseigenschaft von Bierhefe eliminiert oder reduziert wurde,
dadurch gekennzeichnet, dass eine DNA darin eingeführt wird,
deren Fähigkeit,
ein Protein zu exprimieren, das die Wirkung hat, die Ausflockungseigenschaft
von der Art von Bierhefe zu verleihen, durch Unterbrechen der oben
erwähnten
DNA eliminiert oder reduziert wurde.
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Darüber hinaus
stellt die Erfindung einen Hefestamm bereit, der durch eines der
oben beschriebenen Verfahren hergestellt wird, und bei dem die Ausflockungseigenschaft
von Bierhefe verliehen, verbessert, eliminiert oder reduziert wurde.
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Darüber hinaus
stellt die Erfindung ein Verfahren zum Eliminieren oder Reduzieren
der Ausflockungseigenschaft von Bierhefe in Hefe durch Inhibieren
der Expression der oben erwähnten
DNA bereit. Schließlich stellt
die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von gebrauten Produkten,
umfassend die Kultivierung des oben beschriebenen Hefestammes, sowie
gebraute Produkte, die durch dieses Verfahren erhalten werden, bereit.
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Kurze Beschreibung der
Abbildungen
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1 zeigt
die Ergebnisse (Photographien) der Southern und Northern Elektrophoreseanalysen
eines Bierhefestammes und meiotischer Segregantien davon.
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2 zeigt
eine Restriktionskarte des Lg-FLO1-Gens.
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3 zeigt
ein Konzeptdiagramm der Klonierung des Lg-FLO1-Gens in seiner gesamten Länge durch Umkehr-PCR.
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4 zeigt
eine Restriktionskarte des Lg-FLO1-Genfragmentes in Volllänge.
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5 ist
ein Konzeptdiagramm, das die Herstellung eines Lg-Sc-chimären FLO1-Gens
zeigt.
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6 ist
ein Diagramm, das die Herstellung eines Gens zur Zerstörung des
Lg-FLO1-Gens zeigt.
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7 ist
ein Diagramm (fortgesetzt), das die Herstellung eines Plasmids zur
Zerstörung
des Lg-FLO1-Gens zeigt.
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8 zeigt
jeweils den Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenzen der N-terminalen
Bereiche des Lg-FLO1-Gens
und des Sc-FLO1-Gens.
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9 zeigt
die Phänotypen
der Ausflockung bei diesen Stämmen
mit verschiedenen modifizierten FLO1-Genen.
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Beste Ausführungsform
der Erfindung
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Die
Erfindung wird hiernach im Detail beschrieben. Es ist anzumerken,
dass die Ausdrücke „DNA", „Nukleotidsequenz", „Gen" und „DNA-Strang" hier verwendet werden
und im Wesentlichen die gleiche Bedeutung haben. Es ist außerdem anzumerken,
dass die Begriffe „Aminosäure", „Peptid" und „Protein" hier verwendet werden
und im Wesentlichen die gleiche Bedeutung haben.
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<Intercelluläre Ausflockung in Hefe>
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Es
ist bekannt, dass die intercelluläre Ausflockung in Hefe auf
geschlechtliche Ausflockung zwischen a-Zellen und α-Zellen, Untrennbarkeit
von knospenden Schwesterzellen von Mutterzellen, nicht-geschlechtliche
Ausflockung usw. zurückzuführen ist.
Von diesen Faktoren zielt die vorliegende Erfindung darauf ab, die nicht-geschlechtliche
Ausflockung zu steuern.
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Als
Modell zur Erklärung
des Mechanismus der nicht-geschlechtlichen
Ausflockung gilt die Lectinhypothese, wobei zwei benachbarte Hefezellen
durch die Bindung eines Lectin-ähnlichen
Proteins an die Oberfläche
von ausflockenden Hefezellen mit Zuckerketten miteinander in Wechselwirkung
stehen können
[J. Bacteriol., 150, 878 (1982)], aber das Lectin-ähnliche
Protein ist bisher nicht identifiziert worden. Das ist einer der Gründe, warum
die Steuerung der Hefeausflockung immer noch schwierig ist.
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Es
wurde darüber
berichtet, dass die nicht-geschlechtliche Ausflockung ungefähr in zwei
Typen klassifiziert werden kann, in Abhängigkeit der Art des Zuckers,
der die Ausflockung inhibiert, d.h. Ausflockung vom Mannose-spezifischen
FLO1-Typ und Ausflockung vom NewFlo-Typ, die durch Maltose, Glucose
und dergleichen zusätzlich
zu Mannose inhibiert wird [Yeast, 7, 559 (1991)]. Die Erfinder haben
festgestellt, dass die Ausflockungseigenschaft von gewöhnlicher
untergäriger
Hefe dem NewFlo-Typ zuzuordnen ist. Zum leichteren Verständnis werden
diese Typen der Ausflockungseigenschaften mit den folgenden Begriffen
ausdrückt.
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Kurz
gesagt, die Ausflockungseigenschaft gewöhnlicher Laborhefen, die durch
co-existierende Mannose, aber nicht durch Maltose und Glucose inhibiert
wird, wird hier mit dem Begriff „Ausflockungseigenschaft vom
Laborhefe-Typ" bezeichnet.
Auf der anderen Seite wird die Ausflockungseigenschaft von solchen
Hefestämmen,
die durch gewöhnliche
untergärige
Bierhefe dargestellt ist, und die durch Maltose, Glucose und dergleichen
zusätzlich
zu co-existierender
Mannose inhibiert wird, mit dem Begriff „Ausflockungseigenschaft vom
Bierhefe-Typ" bezeichnet.
Beide Typen von Ausflockungseigenschaften werden nicht durch Galactose
inhibiert. Die Erfinder nehmen an, dass es sehr wichtig ist, zumindest
beim Bierbrauen, dass die untergärige Bierhefe
die Ausflockungseigenschaft vom Bierhefe-Typ aufweist, und zwar
aus den unten genannten Gründen.
Kurz gesagt unterscheidet sich die „Ausflockungseigenschaft vom
Bierhefe-Typ" stark
von der Ausflockungseigenschaft vom Laborhefe-Typ, insofern das
der Ersteren durch Glucose, Maltose und dergleichen inhibiert wird.
Bier wird durch Stammwürze
mit Bierhefe hergestellt. Da ungefähr 6% Maltose und ungefähr 1% Glucose
in der Stammwürze
enthalten sind, hat die Tatsache, dass die Ausflockung der Bierhefe
durch diese Zucker inhibiert wird, eine wichtige Bedeutung. Mit
anderen Worten kann man wie folgt mutmaßen. Aufgrund der Eigenschaft
der „Ausflockungseigenschaft
vom Bierhefe-Typ" ist
die Bierhefe, die zu der Stammwürze
gegeben wird, durch darin enthaltende Zucker daran gehindert, auszuflocken
und kann in der Stammwürze
dispergieren. Folglich schreitet die Fermentierung schnell voran
und wenn sich die Zuckerkonzentrationen in der fermentierten Stammwürze zum
Ende der Fermentierung verringern, wird die Inhibierung der Ausflockung schlechter.
Als Folge bilden Hefezellen Flocken und sedimentieren, so dass es
leicht wird, sie zurückzugewinnen.
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<Lg-FLO1-Protein>
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Das
Lg-FLO1-Protein ist das Protein, das durch das FLO1-homologe Gen, genannt
das Lg-FLO1-Gen, kodiert wird, welches eigentümlich für untergärige Bierhefe und meiotische Segregantien
davon, die die Ausflockungseigenschaft von Bierhefe entfalten, ist.
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Die
vorliegende Erfindung umfasst das Lg-FLO1-Protein und dessen Derivate.
Das Lg-FLO1-Protein kann abstammen von Hefe, insbesondere von Saccharomyces
cerevisiae, und hat die Eigenschaft, dass es Hefe die Ausflockungseigenschaft
von Bierhefe verleihen kann. Das Lg-FLO1-Protein enthält in seiner
Aminosäuresequenz
die Aminosäuresequenz,
die im Wesentlichen in SEQ ID NO: 1 der Sequenzliste gezeigt ist. „Die Aminosäuresequenz,
die im Wesentlichen in SEQ ID NO: 1 der Sequenzliste gezeigt ist" umfasst zusätzlich zu „der Aminosäuresequenz,
die in SEQ ID NO: 1 der Sequenzliste gezeigt ist" die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1
mit Modifikationen, d.h. mit Addition, Insertion, Deletion oder
Substitution von einem oder mehreren Aminosäureresten, solange die Aminosäuresequenz
Hefe die Ausflockungseigenschaft von Bierhefe verleiht.
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Die „erfindungsgemäße Aminosäuresequenz,
die in SEQ ID NO: 1 der Sequenzliste gezeigt ist" weist etwa Homologie zu der Aminosäuresequenz
auf, die von der bekannten Nukleotidsequenz des Laborhefe-FLO1-Gens
abgeleitet wird. Der entscheidende Unterschied zwischen den beiden
ist jedoch, dass das Lg-FLO1-Protein
und dessen Derivate, umfassend die erfindungsgemäße „Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO:
1 der Sequenzliste gezeigt ist",
Hefe „die
Ausflockungseigenschaft von Bierhefe", wie oben beschrieben, verleihen kann,
was eine wichtige Eigenschaft von Bierhefe ist. Bei Vervollständigung
der Erfindung wurde zum ersten Mal gezeigt, dass das Lg-FLO1-Protein und dessen
Derivate Hefe „die
Ausflockungseigenschaft von Bierhefe" verleihen kann.
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In
Bezug auf Flocculin, das ein Protein ist, erhalten von der Oberflächenschicht
von ausflockenden Bierhefezellen, wurden dessen biologische Wirkungen
bisher nicht aufgeklärt,
aber die Aminosäuresequenz der
16 Reste dessen N-terminalen Endes wurden bestimmt (*TQACLPVG*RKNGMN:
* stellt einen nicht-identifizierten
Aminosäurerest
dar) (Appl. Environ. Microbiol., 60, 2754 (1994)]. Das Lg-FLO1-Protein,
dessen Wirkungen durch die vorliegenden Erfindung zum ersten Mal
aufgeklärt
wurden, umfasst diese Aminosäuresequenz
(von Position 25 bis Position 40 der SEQ ID NO: 1 der Sequenzliste).
Derzeit gibt es keinen Beweis, dass das erfindungsgemäße Lg-FLO1-Protein
identisch mit Flocculin ist. Bei dem erfindungsgemäßen Lg-FLO1-Protein
besteht jedoch eine äußerst hohe
Möglichkeit,
dass der Bereich, der durch die Aminosäuresequenz, die von Position
1 bis Position 24 der SEQ ID NO: 1 reicht, eine Sekretionssignalsequenz
ist, die dafür
erforderlich ist, dass sich das Lg-FLO1-Protein in der Oberflächenschicht
von Zellen befindet. Demzufolge wird vermutet, dass das Protein,
das sich in der Oberflächenschicht
von ausflockenden Hefezellen befindet und das die Wirkung hat, Hefe
die Ausflockungseigenschaft zu verleihen, ein Protein mit der Aminosäuresequenz
ist, das von der Position 25 bis zum Ende der SEQ ID NO: 1 der Sequenzliste
reicht.
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<Lg-FLO1-Gen>
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Die
vorliegende Erfindung umfasst den DNA-Strang von Lg-FLO1. Der Begriff „der DNA-Strang
von Lg-FLO1", der
hier verwendet wird, bedeutet eine DNA, umfassend eine Nukleotidsequenz,
die das Lg-FLO1-Protein oder ein Derivat davon mit der Wirkung,
Hefe die Ausflockungseigenschaft von Bierhefe zu verleihen, kodiert.
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Insbesondere
umfasst die vorliegende Erfindung einen DNA-Strang, umfassend eine Nukleotidsequenz,
die ein Protein mit der Aminosäuresequenz,
die im Wesentlichen in SEQ ID NO: 1 der Sequenzliste gezeigt ist,
kodiert. Es ist hier zu bemerken, dass die Expression „einer
Nukleotidsequenz, die ein Protein mit der Aminosäuresequenz kodiert" alle unterschiedlichen
Nukleotidsequenzen bedeutet, die durch die Degeneration des genetischen
Codes hergestellt werden können.
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Für die Vervollständigung
der vorliegenden Erfindung war unentbehrlich das in Beispiel 1 beschriebene
Herausfinden, dass ein untergäriger
Hefestamm und meiotische Segregantien davon, die die Ausflockungseigenschaft
von Bierhefe entfalten, das besondere FLO1-homologe Gen aufweisen.
In der vorliegenden Beschreibung wird dieses „FLO1-homologe Gen, das für untergärige Hefe
und meotische Segregantien davon, die die Ausflockungseigenschaft
von Bierhefe entfalten" mit
dem Ausdruck „das
Lg-FLO1-Gen" bezeichnet. Das
obige Herausfinden allein könnte
aber keineswegs zu der Tatsache führen, dass „das Lg-FLO1-Gen" die Wirkung hat,
Hefe die „Ausflockungseigenschaft
von Bierhefe" zu
verleihen. Weitere Überlegungen
waren für die
Vervollständigung
der vorliegenden Erfindung erforderlich.
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Aus
einer anderen Sicht umfasst die vorliegende Erfindung ebenfalls
eine DNA, die in das Plasmid KTYT2 eingeführt wird und die eine Nukleotidsequenz
umfasst, die ein Protein kodiert, das die Wirkung hat, Hefe die
Ausflockungseigenschaft von Bierhefe zu verleihen.
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Hiernach
werden die erfindungsgemäßen DNAs,
die oben beschrieben sind, zusammen als „der Lg-FLO1-DNA"-Strang bezeichnet.
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Der
erfindungsgemäße Lg-FLO1-DNA-Strang
kann eine in der Natur vorkommende DNA, eine gänzlich synthetisierte DNA oder
eine synthetisierte Teil-DNA, die unter Verwendung eines Teils der
in der Natur vorkommenden DNA synthetisiert worden ist, sein.
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<Transformation>
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Durch
Einführung
des erfindungsgemäßen Lg-FLO1-Gen-DNA-Strangs ist es möglich, einen
Hefestamm zu erhalten, auf den die Ausflockungseigenschaft von Bierhefe übertragen
worden ist oder die verbessert wurde.
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Als
Verfahren zum Einführen
des Lg-FLO1-DNA-Strangs können
Standardtechniken, die herkömmlich im
Bereich der Gentechnik verwendet werden, nach herkömmlichen
Standards verwendet werden [siehe z.B. Analytical Biochemistry 163,
391 (1987)]. Spezifische Beispiele solcher Verfahren umfassen z.B.
ein Verfahren, bei dem eine gewünschte
DNA in einen Vektor eingeführt
wird, der daraufhin in Hefezellen eingeführt wird, und ein Verfahren,
bei dem eine gewünschte
DNA direkt in Hefezellen eingeführt
wird, ohne in einen Vektor eingeführt zu werden.
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Bei
dem ersten Verfahren, bei dem eine gewünschte DNA in einen Vektor
eingeführt
wird, der anschließend
in Hefezellen eingeführt
wird, umfassen Vektoren, die zu diesem Zweck eingesetzt werden können, z.B. einen
YRp-Vektor (ein Hefevektor in mehreren Kopien und unter Verwendung
einer ARS-Sequenz
des Hefechromosoms als dessen Replikationsursprung), einen YEp-Vektor
(ein Hefevektor in mehreren Kopien mit einem Replikationsursprung
von 2 μm
Hefe-DNA), einen YCp-Vektor (ein Hefevektor in einzelner Kopie mit
einer ARS-Sequenz des Hefechromosoms als dessen Replikationsursprung
und außerdem
mit einer Centromersequenz des Hefechromosoms) und ein YIp-Vektor (ein Vektor,
der in das Hefechromosom eingeführt
ist, und keinen Replikationsursprung von Hefe hat), andere bekannte
Vektoren können
verwendet werden. Diese Vektoren sind in der Literatur offenbart
(siehe „New
Biotechnology of Yeast",
Medical Publication Center, S. 284) und können leicht hergestellt werden.
-
Als
eine repräsentative
Technik zum Einführen
von DNA direkt in Hefezellen, ohne Einführung der DNA in einen Vektor,
kann das Co-Transformationsverfahren angewendet werden, bei dem Hefezellen
mit einem Plasmid mit einem Markergen (wie ein Medikament-Resistenzgen)
und einer einzuführenden
DNA (geprüfte
japanische Patentmeldung Nr. 5-60918) transformiert werden.
-
In
solchen oben beschriebenen Verfahren werden zum Exprimieren der
eingeführten
DNA-Sequenz in Hefe oder zum Verbessern oder Verringern seiner Expression
ein Promotor (der eine Einheit ist, die Transkription und Translation
zu steuern) und ein Terminator in die DNA-Kette der Erfindung jeweils
am 5'-stromaufwärts liegenden
Bereich und am 3'-stromabwärts liegenden
Bereich eingeführt.
Als Promotor und Terminator für
die obigen Zwecke können
solche verwendet werden, die von bekannten Genen, wie dem Alkoholdehydrogenasegen
[J. Biol. Chem., 257, 3018 (1982)], dem Phosphoglyceratkinasegen
[Nucleic Acid Res., 10, 7791 (1982)], dem Glycerinaldehyd-3-phosphodehydrogenasegen
[J. Biol. Chem., 254, 9839 (1979)] oder solchen, die erhalten wurden
durch artifizielle Verbesserungen der obigen, zusätzlich zu
denen verwendet werden, die vom Lg-FLO1-Gen per se abstammen. Genauer
gesagt können
Promotoren und Terminatoren, wie ADH (auch als ADC bekannt), GAPDH
(auch als GPD bekannt), PHO, GAL, PGK, ENO, TRP und HIP verwendet
werden.
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Darüber hinaus
ist es zum Auswählen
eines geeigneten Promotors auch möglich, das Gen mit der erfindungsgemäßen DNA-Kette
in Hefezellen auf eine kontrollierte Art zu exprimieren. Wenn zum
Beispiel ein Promotor des Galactokinasegens verwendet wird, kann
die Expression des Gens durch Änderung
der Zuckerquelle eines Mediums, z.B. von Glucose zu Galactose, erhöht werden.
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Darüber hinaus
durch Einführung
einer DNA, deren Fähigkeit
das Lg-FLO1-Protein zu exprimieren, durch Einführen des Lg-FLO1-Gens, eliminiert oder reduziert
worden ist, ist es außerdem
möglich,
einen Hefestamm zu erhalten, bei dem die Ausflockungseigenschaft
eliminiert oder reduziert worden ist. Die Zerstörung des Lg-FLO1-Gens kann
erreicht werden durch Zugeben oder Deletieren einer oder mehrerer
Basen in einen Bereich, der in dem Lg-FLO1-Gen an der Expression
des Lg-FLO1-Proteins
beteiligt ist (wie der Promotorbereich oder der kodierende Bereich)
oder durch Deletieren eines solchen Bereiches als ganzes. Eine DNA,
dessen Fähigkeit,
das Lg-FLO1-Gen
zu exprimieren, durch Zerstören
des Lg-FLO1-Gens eliminiert oder reduziert worden ist, kann in Hefezellen
unter Verwendung der gleichen Technik wie in der oben erwähnten DNA-Einführung verwendet
werden. Es wird wie folgt angesehen. Mit der Einführung dieser
DNA tritt homologe Rekombination zwischen dem Lg-FLO1-Gen in der
chromosomalen DNA der Wirtshefezellen und der eingeführten DNA
auf, und das Lg-FLO1-Gen der Wirtszelle wird zerstört. Dies
führt zur
Eliminierung oder Reduzierung der Fähigkeit, das Lg-FLO1-Protein zu exprimieren,
und als Folge wird die Ausflockungseigenschaft dieses Wirtshefestammes
eliminiert oder reduziert.
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Als
zu transformierender Hefestamm, d.h. ein erfindungsgemäßer Wirtshefestamm,
kann jeder sein, der taxonomisch Hefe zuzuordnen ist. Zum Zweck
der Erfindung ist industrielle Hefe, die zu Saccharomyces cerevisiae
gehört,
insbesondere Bierhefe, Weinhefe oder Hefe, die zur Herstellung von
Alkohol verwendet wird, bevorzugt.
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Die
vorliegende Erfindung umfasst ein Verfahren zum Eliminieren oder
Reduzieren der Ausflockungseigenschaft von Hefe durch Inhibieren
der Expression des oben erwähnten
Lg-FLO1-Gens. Spezifische
Beispiele dieses Verfahrens umfassen ein Verfahren, bei dem eine
DNA, bei dem die Fähigkeit,
das Lg-FLO1-Protein zu exprimieren, durch Zerstören des Lg-FLO1-Gens, eliminiert
oder reduziert worden ist, eingeführt wird, das Antisense-RNA-Verfahren
und dergleichen.
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Die
vorliegende Erfindung umfasst ein Verfahren, wie in (6) des Beispiels
1 beschrieben, Laborhefe mit Ausflockungseigenschaft in Bierhefe
mit Ausflockungseigenschaft umzuwandeln, indem das oben erwähnte Lg-FLO1-Gen
mit dem FLO1-Gen der Laborhefe ersetzt wird. Außerdem ist die umgekehrte Umwandlung unter
Verwendung der erfindungsgemäß bereitgestellten
Lg-FLO1-Gen-DNA möglich.
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Gebraute
Produkte, die durch ein Verfahren, umfassend das Kultivieren des
Hefestammes der Erfindung, hergestellt werden, umfassen alkoholische
Getränke,
wie Bier, japanischer Sake, minderwertige destillierte Spirituosen,
Wein, Whisky und Brandy, Gewürze,
wie Sojasauce, Miso und süßer Sake,
und Brennstoffalkohole. Als erfindungsgemäßes Verfahren zur Herstellung
der gebrauten Produkte sind Brauverfahren, die mit den oben erwähnten gebrauten
Produkten in Zusammenhang stehen, umfasst.
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Hiernach
wird die vorliegende Erfindung detaillierter unter Bezugnahme auf
die folgenden Beispiele beschrieben, die nicht als für den Umfang
der Erfindung limitierend anzusehen sind.
-
[Beispiel 1]
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Klonierung des FLO1-homologen
Gens, das stark an der Ausflockung vom Bierhefe-Typ beteiligt ist
-
(1) Suche nach Genen,
die an der Ausflockungseigenschaft von Bierhefe beteiligt sind
-
Zur
Suche nach Genen, die an der Ausflockungseigenschaft von Bierhefe
beteiligt sind, wurde das folgende Experiment durchgeführt. Von
dem ausflockenden Bierhefestamm KI084 wurden Sporen durch das Verfahren
von Stewart et al. [J. Inst. Brew., 93, 216-219, (1987)] gebildet,
um dadurch Stämme
herzustellen, bei denen die Chromosomenzahl reduziert war (hiernach
werden solche Stämme
als „meiotische
Segregantien" bezeichnet].
Von den resultierenden meiotischen Segregantien wurden 6 Stämme in dem
in Tabelle 1 gezeigten Medium bei 20°C unter statischen Bedingungen
48 Stunden kultiviert. Nach der Kultivierung wurden die Zellen durch
Zentrifugierung geerntet, zweimal mit 0,1 M EDTA und zweimal mit
sterilisiertem Wasser gewaschen und anschließend in sterilisiertem Wasser
suspendiert. Die Bewertung der Ausflockungseigenschaft der Zellen
wurde durch das folgende Verfahren durchgeführt. Kurz gesagt wurden die
Zellen in einem Ausflockungsmesspuffer suspendiert (50 mM Natriumacetat,
0,1% Calciumchlorid, pH 4,6), um eine End-OD von OD600=2,0 zu ergeben,
bei Raumtemperatur 30 Minuten stehengelassen und anschließend 20
Sekunden heftig geschüttelt.
Die Zellen wurden weitere 5 Minuten stationär stehengelassen und anschließend wurde
die Ausflockung oder Nicht-Ausflockung mit dem Auge bewertet. Als
Ergebnis wurden die untersuchten 6 meiotischen Segregans-Stämme in 2
nicht-ausflockende
Stämme
und 4 ausflockende Stämme
gruppiert. Medium
zur Messung der Ausflockung
- Hefe-Stickstoff-Base, nicht enthaltend
Aminosäuren
oder Ammoniumsulfat. Bei der Kultivierung der Transformanten wurde
das obige Medium mit Adeninsulfat, Tryptophan und Histidinhydrochlorid
jeweils in einer Menge von 20 mg/l ergänzt.
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Diese
Stämme
wurden der Southern- und Northern Analyse, wie nachfolgend beschrieben,
unterworfen. Die Extraktion der gesamten DNA wurde durch Kultivieren
der Zellen unter Schütteln
in einem YPD-Medium [2% Bacto-Pepton (Difco), 1% Hefeextrakt (Difco),
2% Glucose] bei 30°C
und Extrahieren der gesamten DNA aus diesen Zellen, die gemäß dem Verfahren
von Hereford et al. [Cell, 18, 1261-1271, (1979)] die stationäre Phase
erreichten, durchgeführt.
Zwei Mikrogramm der extrahierten DNA wurden mit HindIII (Boehringer Mannheim)
extrahiert und unter Verwendung von einem 1%igen Agarosegel der
Elektrophorese unterworfen. Die DNA wurde anschließend auf
einem Nylonfilter, Hybond N+ (Amersham) gemäß dem beigefügten Protokoll geblottet
und anschließend
der Southern Analyse unterworfen. Auf der anderen Seite wurde die
Extraktion der gesamten RNA dieser Stämme durch Kultivierung derselben
unter statischen Bedingungen in dem in Tabelle 1 gezeigten Medium
bei 20°C
48 Stunden und Extrahieren der gesamten RNA gemäß dem Verfahren von Villeneve
und Meyer [Cell, 48, 25-37 (1987)] durchgeführt. Zehn Mikrogramm der so
erhaltenen RNA wurden durch Behandlung in 16 μl Glyoxal/DMSO-Lösung [1 M Glyoxal, 50% DMSO,
10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,0)] 1 Stunde bei 50°C glyoxiliert.
Anschließend
wurden 2 μl
Beladungspuffer [50% (G/V) Glycerin, 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0),
0,4% (G/V) Bromphenolblau] und 1 μl
1 mg/ml Ethidiumbromidlösung
zugegeben und die resultierende Lösung wurde in einem Gel, enthaltend
10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) und 1% Agarose der Elektrophorese
unterworfen. Während
dieser Elektrophorese wurde der Puffer in der Elektrophoreseschicht
konstant zirkuliert unter Verwendung einer peristaltischen Pumpe,
um die Erzeugung eines pH-Gradienten zu vermeiden. Wenn Bromphenolblau
ungefähr
70% der Länge
des Gels erreichte, wurde die Elektrophorese beendigt. RNA in dem
Gel, das mit Ethidiumbromid gefärbt
ist, wurde unter Verwendung eines UV-Transilluminators beobachtet und es
wurde bestätigt,
dass sich die RNA unter Verwendung von ribosomaler RNA als Indikator
nicht zersetzt hat. Danach wurde die RNA in dem Gel auf ein Nylonfilter,
Genescreen-Plus (DuPont), gemäß dem beiliegenden
Protokoll geblottet und dieser Filter, auf dem die RNA geblottet
ist, wurde bei 80°C
2 Stunden behandelt. Der Filter wurde anschließend gemäß dem Genscreen-Plus beiliegenden
Protokoll der Northern Analyse unterworfen.
-
DNA-Teillängen-Fragmente
des FLO1-Gens, die bei der Southern und Northern Analyse als Sonden verwendet
wurden, wurden wie folgt hergestellt. Auf Basis der Nukleotidsequenz
des von Teunissen et al. [Yeast, 9, 423-427 (1993)] berichteten
FLO1-Gens wurden
zwei Primer 5'GATGAAACTGTTCATTGTTGTCAAA3' und 5'TCGTTTCAGCAGCTAAAGTAT3' synthetisiert. Mit
diesen Primern wurde PCR unter Verwendung der Gesamt-DNA des ausflockenden
Stammes ABXL-1D (a, FLO1, Yeast Genetic Stock Center) als Matrize
durchgeführt
und die gesamten PCR-Produkte wurden in einem 1%igen Agarosegel
der Elektrophorese unterworfen. Ein amplifiziertes DNA-Fragment
von 1045 Bp (hiernach als „FLO1-Fragment mit Teillänge" (evtl. „FLO1-Teillängen-Fragment") bezeichnet] wurde
aus dem Gel herausgeschnitten und dieses Fragment wurde unter Verwendung
von Prep-A-Gen (Bio-Rad) zurückgewonnen.
Dieses Fragment wurde mit [α-32P]dCTP (Amersham) markiert und als Sonde
verwendet. Der Radioaktivitätsnachweis wurde
unter Verwendung von Röntgenfilmen
durchgeführt.
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Die
Ergebnisse sind in 1 gezeigt. Als Ergebnis der
Southern Analyse wurden in dem Elternstamm KI084 vier HindIII-Fragmente
von ungefähr
9,5 kb, 5,4 kb, 4,8 kb und 3,7 kb Länge nachgewiesen, die Homologie
mit dem FLO1-Gen aufwiesen. Von diesen Fragmenten wurden zwei Fragmente
von ungefähr
4,8 kb und 3,7 kb Länge
in allen der untersuchten KI084-abstammenden meiotischen Segregantien
nachgewiesen. In nur vier meiotischen Segregantien, die in dem Ausflockungs-Bewertungs-Test als
ausflockend eingestuft wurden, wurde darüber hinaus von ungefähr 9,5 kb
zusätzlich
zu den gewöhnlichen
Banden auch nachgewiesen. Darüber
hinaus wurde als Ergebnis der Northern Analyse auch das Transkriptionsprodukt
des FLO1-Gens nur in dem Elternstamm und den vier meiotischen Segregantien,
die mit dem Ausflockungs-Bewertungs-Test als ausflockend eingestuft
wurden, festgestellt. Durch diese Ergebnisse wurde angenommen, dass
nur das FLO1-homologe Gen, von dem nur ein Teil oder das vollständige in
dem HindIII-Fragment von ungefähr
9,5 kb enthalten ist, unter den drei HindIII-Fragmenten, die mit dem FLO1-Gen homolog
sind, in KI084-abstammenden
meiotischen Segregantien transkribiert wird und dass nur solche
Stämme,
die dieses homologe Gen aufweisen, Ausflockungseigenschaft enthalten.
Hiernach wird das FLO1-homologe
Gen, wobei ein Teil oder das vollständige Gen in dem HindIII-Fragment
von ungefähr
9,5 kb des KI084-Stammes enthalten ist, als Lg-FLO1 bezeichnet (Lager-Typ-FLO1).
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(2) Herstellung einer
Restriktionskarte von Lg-FLO1
-
Von
den von KI084 abstammenden meiotischen Segregantien wurden ein ausflockender
Stamm KMS004 und ein nicht-ausflockender
Stamm KMS001 ausgewählt.
Ihre DNAs wurden wie oben beschrieben hergestellt und der Southern
Analyse unter Verwendung verschiedener Restriktionsenzyme in Abhängigkeit oder
in Kombination von zwei Enzymen und unter Verwendung des oben beschriebenen
Teillängen-Fragmentes
FLO1 als Sonde unterworfen. Eine Bande, die nicht bei dem nicht-ausflockenden meiotischen
Segregans beobachtet wurde, wurde im Ergebnis immer bei dem ausflockenden
KMS004-Stamm beobachtet, zusätzlich zu
zwei Banden, die mit dem nicht-ausflockenden
meiotischen Segregans gemein waren. Es wurde in Betracht gezogen,
dass ein Teil oder das Lg-FLO1 mit Volllänge in dieser Bande, die spezifisch
für das
ausflockende meiotische Segregans ist, enthalten ist. Folglich wurde
die Länge
dieses Fragments bestimmt und eine Restriktionskarte wurde wie in 2 gezeigt
hergestellt.
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(3) Klonierung eines KpnI-Fragmentes,
das eine Teillänge
von Lg-FLO1 enthält.
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Auf
Basis der in 2 gezeigten Restriktionskarte
wurde die Klonierung eines KpnI-Fragmentes von ungefähr 5,6 kb
angestrebt. Die DNA des ausflockenden meiotischen Segregans KMS004,
abstammend von KI084, wurde vollständig mit KpnI (Boehringer,
Mannheim) verdaut und anschließend
unter Verwendung von 0,8% Agarose durch Elektrophorese fraktioniert.
Eine Mischung der DNA-Fragmente von ungefähr 5,6 kb wurde aus dem Gel
ausgeschnitten und in einem Dialyseröhrchen durch Elektroelution
gereinigt. Als Ergebnis der Southern Analyse unter Verwendung des
oben erwähnten
FLO1-Fragmentes mit Teillänge
als Sonde wurde bestätigt,
dass das DNA-Fragment von Interesse in der gereinigten DNA-Fragmentmischung
enthalten war. Anschließend
wurde das vollständig
mit KpnI verdaute Plasmid pUC18 (Takara Shuzo) an die gereinigte DNA-Fragmentmischung
unter Verwendung des DNA-Ligationskits
(Takara Shuzo) ligiert und anschließend wurde E. coli DH5α (BRL) mit
dem resultierenden Plasmid transformiert. Von den erhaltenen resultierenden Transformanten
wurden 5000 Stämme
auf einen Nylonfilter Hybond N+ (Amersham) gemäß dem beigelegten Protokoll
an den Filter geblottet und Koloniehybridisierung wurde unter Verwendung
des oben erwähnten FLO1-Fragmentes
mit Teillänge
als Sonde durchgeführt,
um dadurch 10 positive Stämme
zu erhalten. Die Plasmide wurden von diesen Stämmen durch das Alkaliverfahren
hergestellt und mit Restriktionsenzymen analysiert. Als Ergebnis
wurde bestätigt,
dass die in diesen Stämmen
enthaltenen Plasmide das gleiche Insertionsfragment aufweisen. Das
Insertionsfragment des Plasmids pKF-Kpn11 von einem der obigen Stämme wurde
der Southern Analyse unter Verwendung der DNA des ausflockenden
meiotischen Segregans KMS004 und des nicht-ausflockenden meiotischen
Segregans KMS001 als Sonde unterworfen. Im Ergebnis wurde bestätigt, dass
das Insertionsfragment ein Teil des Lg-FLO1-Gens von Interesse ist.
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(4) Teilsequenzierung
der Nukleotidsequenz für
ein KpnI-Fragment,
das eine Teillänge
von Lg-FLO1 enthält
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Zur
Bestimmung der Nukleotidsequenz des Insertionsfragmentes aus pKF-Kpn11
wurden Delektionsserien des Insertionsfragmentes aus pKF-Kpn11 unter
Verwendung eines Deletionskits für
eine Kilosequenz (Takara Shuzo) gemäß dem Kit-beiliegenden Protokoll
hergestellt. Die Nukleotidsequenz wurde mit einem DNA-Sequenzierer
(Perkin Elmer) unter Verwendung des PCR-Sequenzierungskits (Perkin
Elmer) bestimmt. Die Nukleotidsequenz wurde unter Verwendung von
DNASIS (Hitachi Software Engineering) analysiert. Die Nukleotidsequenz
von 2,9 kb von der KpnI-Stelle zu der HindIII-Stelle, in der ein
kodierender Bereich festgestellt worden war, der homolog mit dem
für FLO1
bekannten kodierenden Bereich war, wurde aus beiden Richtungen bestimmt.
Ein ORF von 2,6 kb, der von der Mitte des kodierenden Bereichs von
Lg-FLO1 bis zum Terminationskodon reicht, wurde in der bestimmten
Nukleotidsequenz festgestellt.
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(5) Erhalt von Lg-FLO1
in Volllänge
durch Umkehr-PCR
-
Der
Erhalt von Lg-FLO1 in Volllänge
durch Umkehr-PCR ist kennzeichnend in 3 gezeigt.
Durch die zuvor bestimmte Nukleotidsequenz von Lg-FLO1 mit Teillänge [(1)
in 3] wurden die Primer5 [5'AATACACAACATGGTGTCCT3', (2) in 3]
und Primer8 [5'ACCAGAGGTGGAACTACTGG3', (3) in 3]
synthetisiert. Die DNA aus dem ausflockenden meiotischen Segregansstamm
KMS004 (60 μg)
wurde mit 300 Einheiten HindIII (Boehringer Mannheim) verdaut, durch
Ethanolausfällung
zurückgewonnen
und in 30 μl
TE-Puffer aufgelöst.
Die Selbst-Ligierung
der DNA-Fragmente wurde unter Verwendung des DNA-Ligierungskits (Takara Shuzo) in einer
Menge von 300 μl
durchgeführt.
Im Ergebnis wird erwartet, dass zyklische Moleküle, bei denen die in (4) und
(5) dargestellten HindIII-Stellen
ligiert sind, in den resultierenden Reaktionsprodukten vorhanden
sind. Diese Reaktionsprodukte wurden durch Ethanolausfällung gewonnen.
Unter Verwendung von 4 μg
dieser Reaktionsprodukte als Matrize und der obigen Primer5 [(2)
in 3] und Primer8 [(3) in 3] als Primer
wurde eine Umkehr-PCR mit dem LA-PCR-Kit (Takara Shuzo) durchgeführt. Die
Zusammensetzung dieser Reaktionslösung wurde in dem dem Kit beiliegenden
Protokoll empfohlen. Die Reaktion wurde unter Verwendung des DNA-Thermalen-Zyklussequenzierers
480 (Perkin Elmer) durchgeführt:
1 Zyklus bei 94°C
1 Minute, gefolgt von 30 Zyklen bei 98°C 20 Sekunden und bei 68°C 10 Minuten.
Als Folge der Elektrophorese der Reaktionsprodukte unter Verwendung
von 0,8% Agarose wurde beobachtet, dass DNA-Fragmente von ungefähr 8,2 kb, ungefähr 3,6 kb
und ungefähr
3,0 kb amplifiziert wurden.
-
Von
diesen DNA-Fragmenten wurde das Fragment von ungefähr 8,2 kb
[(6) in 3] aus dem Gel herausgeschnitten
und unter Verwendung von Prep-A-Gen (Bio Rad) gemäß beiliegendem
Protokoll gereinigt. Da dieses Fragment die BamHI-, EcoRI- und XbaI-Stellen
enthielt, die auf der in 2 gezeigten Restriktionskarte
angezeigt sind, wurde angenommen, dass ein bisher nicht erhaltener
Teil von Lg-FLO1 in diesem Fragment enthalten ist. Dieses DNA-Fragment
wurde mit AluI (Boehringer Mannheim) verdaut, an die HincII-Stelle von
pUC118 (Takara Shuzo) ligiert und in den E. coli DH5-Stamm (Toyobo)
eingeführt.
Plasmide wurden von 30 Stämmen
der resultierenden Transformanten hergestellt und die Größen der
Insertionsfragmente wurden untersucht. Im Ergebnis konnten diese
Plasmide in 24 Gruppen aufgeteilt werden. Unter Bezugnahme auf diese
Plasmide wurde die Nukleotidsequenz des Insertionsfragmentes durch
das oben beschriebene Verfahren bestimmt. Im Ergebnis wurde ein
Klon erhalten, der ein Insertionsfragment von 467 Bp aufwies, das
stark mit dem aminoterminalen Bereich des bekannten FLO1 homolog
ist. Dieses Plasmid wurde als KF1 bezeichnet. Die Stelle des Insertionsfragmentes
von KF1 auf dem Chromosom ist in 3 durch
(7) dargestellt.
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Das
Insertionsfragment von KF1 enthielt jedoch keine Sequenz, die eine
Translationsinitiationsstelle zu sein schien. Auf Basis der Nukleotidsequenz
für KF1
wurde der PrimerKN-2 [5'TTGTATCGGAGTATTTATA3', (8) in 3]
synthetisiert. Unter Verwendung der bei der obigen Umkehr-PCR verwendeten
Matrize und unter Verwendung der obigen Primer5 [(2) in 3]
und PrimerKN-2 [(8) in 3] als Sonde wurde eine Umkehr-PCR
mit dem GeneAmp-PCR-Reagenskit (Takara Shuzo) durchgeführt. Die
Zusammensetzung der Reaktionslösung
entsprach dem Kitbeiliegenden Protokoll empfohlenen Protokoll. Die Reaktion
wurde wie folgt unter Verwendung des DNA-Thermalen-Zyklussequenzierers
480 durchgeführt:
30 Zyklen bei 94°C
1 Minute, bei 55°C
2 Minuten und bei 72°C
2 Minuten, gefolgt von einem Zyklus bei 72°C 10 Minuten. Als Ergebnis der
Elektrophorese der Reaktionsprodukte unter Verwendung von 0,8% Agarose
wurde beobachtet, dass DNA-Fragmente von ungefähr 4,4 kb, ungefähr 1,1 kb
und ungefähr
0,6 kb amplifiziert wurden. Von diesen Fragmenten wurde das DNA-Fragment von ungefähr 4,4 kb
[(9) in 3] aus dem Gel herausgeschnitten,
gemäß dem oben
beschriebenen Verfahren gereinigt, mit dem Klenow-Fragment mit glatten Enden
versehen (Takara Shuzo), in die HincII-Stelle von pUC118 ligiert
und in den E. coli-DH5-Stamm eingeführt. KF14, das ein Plasmid
einer der erhaltenen Transformanten ist und die BamHI-, EcoRI- und
XbaI-Stellen enthielt, ist in der in 2 gezeigten
Restriktionskarte angezeigt. Daraufhin wurde die Translationsinitiationsstelle
von Lg-FLO1 und sein 5'-stromabwärts liegender
Bereich als in diesem Fragment enthaltend angesehen.
-
Um
die Nukleotidsequenz des Insertionsfragmentes von KF14 von der EcoRI-Stelle
[dargestellt durch (10) in 3] bis zu
3' teilweise zu
bestimmen, wurde KF14 mit EcoRI verdaut und daraufhin wurde ein selbst-ligiertes
Plasmid, KF14ΔEc,
hergestellt. Dieses Plasmid weist ein Fragment auf, das von der
EcoRI-Stelle, dargestellt durch (10) in 3, bis zur
Annealing-Stelle des PrimersKN-2, dargestellt durch (8) in 3,
reicht. Die Nukleotidsequenz des Insertionsfragmentes von KF14ΔEc wurde
von der EcoRI-Stelle teilweise bestimmt. Auf Basis der erhaltenen
Nukleotidsequenz wurde der PrimerKT5'Ec [5'AGCGGTCGACCTAATAAAGGAAAAGGGGAA3', (11) in 3]
synthetisiert. Außerdem
wurde auf Basis eines Teils der zuvor bestimmten Nukleotidsequenz
des Insertionsfragmentes pKF-Kpn11 der Primer KT3'Hd [5'GGAAGCTTTTTTGTAAAACAGATTTTTTGCCCCGCTT3', (12) in 3]
synthetisiert. Unter Verwendung dieser beiden Primer und unter Verwendung
von 2 μg
DNA aus dem ausflockenden meiotischen Segregansstamm KMS004 als
Matrize wurde mit dem LA-PCR-Kit die PCR durchgeführt. Die
Reaktion wurde wie folgt durchgeführt: 1 Zyklus bei 94°C 1 Minute,
gefolgt von 30 Zyklen bei 98°C
20 Sekunden und bei 68°C
10 Minuten. Als Ergebnis der Elektrophorese der Reaktionsprodukte
unter Verwendung von 0,8% Agarose wurde beobachtet, dass ein DNA-Fragment von ungefähr 9 kb
[(13) in 3] amplifiziert wurde. Da dieses
Fragment die BamHI- und XbaI-Stellen, die in der in 2 gezeigten
Restriktionskarte angezeigt sind, enthielt, wurde angenommen, dass
Lg-FLO1 in Volllänge
in diesem Fragment enthalten ist. Hiernach wird dieses PCR-Fragment als Lg-FLO1-Fragment
in Volllänge
bezeichnet. Das Lg-FLO1-Fragment in Volllänge wurde mit verschiedenen
Restriktionsenzymen verdaut und die resultierenden verdauten Produkte
wurden unter Verwendung von 0,8% Agarosegel der Elektrophorese unterworfen.
Die Größen der
Restriktionsfragmente wurden anschließend bestimmt und eine Restriktionskarte
wurde hergestellt. 4 zeigt eine Restriktionskarte
des Lg-FLO1-Fragmentes in Volllänge.
-
(6) Einführung des
Lg-FLO1-Fragmentes in Volllänge
in Hefe und Charakterisierung der Ausflockungseigenschaft
-
Als
Wirtshefestamm zur Untersuchung der phänotypischen Änderungen
aufgrund der Einführung
von Lg-FLO1 wurde der Stamm KY644 verwendet, der ein FLO1-zerstörter Stamm
ist, der durch die folgenden Verfahren hergestellt wird. Kurz gesagt
wird ein Fragment mit einer FLO1-Teillänge an pRS405 (Stratagene)
zwischen der BamHI- und HindIII-Stelle ligiert. Dieses Plasmid wurde
aus der einzigen BstEII-Stelle, die nur in diesem Insertionsfragment
vorhanden war, herausgeschnitten und anschließend in einen ausflockenden
Hefestamm, KY642 (a, ura3, leu2, FLO8) durch das Lithiumverfahren
eingeführt,
um dadurch einen Stamm zu erhalten, der aufgrund der homologen Rekombination
des FLO1-Locus nicht-ausflockend geworden war. Es wurde durch Southern
Analyse bestätigt,
dass das FLO1-Gen dieses Stammes durch Einführung von pRS405 zerstört worden
war. Dieser Stamm wurde als KY644-Stamm bezeichnet.
-
Das
Lg-FLO1-Fragment in Volllänge
war mit Primern, die derart entworfen worden waren, um das Fragment
mit einer SalI-Stelle am 5'-Ende
und einer HindIII-Stelle am 3'-Ende
zu versehen, PCR-amplifiziert worden. Dieses Fragment wurde mit
SalI und HindIII verdaut. Als ein Klonierungsvektor wurde pYT37
verwendet der durch die Einführung
der folgenden zwei Fragmente in die EcoRI-Stelle von YIp5 erhalten
worden war: ein Fragment, enthaltend die Nukleotidsequenz für CEN3, erhalten
von Entrez (National Center for Biotechnology Information), einer
Datenbank für
DNA-Sequenzen, sowie von CEN3 von 1,2 kb, erhalten durch PCR auf Basis
der gesamten Nukleotidsequenz des Hefechromosoms Nr. 3, und eines
Fragmentes, enthaltend eine ARS-Sequenz, erhalten als YRP7-abstammendes EcoRI-HindIII-Fragment.
Das Lg-FLO1-Fragment in Volllänge
wurde an pYT37 zwischen der SalI- und HindIII-Stelle ligiert und anschließend direkt
in den KY644-Stamm durch das Lithium-Verfahren eingeführt.
-
Die
DNAs von den resultierenden Transformanten wurden der Southern Analyse
unterworfen. Als Ergebnis wurde bestätigt, dass das Lg-FLO1-Fragment
in Volllänge
in einen Stamm eingeführt
wurde. Das Plasmid, das in diesem Stamm (KY650 genannt) enthalten
war, wurde KTYT2 genannt. In Bezug auf den KY650-Stamm und einen
Stamm (KY652-Stamm genannt), erhalten durch Einführen von nur des Vektors pYT37
in KY650, wurde die Charakterisierung der Ausflockungseigenschaft
durch das Verfahren, das zuvor beschrieben wurde, durchgeführt, wobei
sie bis zum Erreichen der stationären Phase in dem in Tabelle
1 gezeigten Medium bei 20°C
unter Schütteln
kultiviert wurden. Zur Untersuchung der Inhibierung der Ausflockung durch
Zucker wurden Zucker zu dem Ausflockungs-Messpuffer in einer Endkonzentration
von 1 M gegeben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle
2 Ausflockungseigenschaft
des Lg-FLO1-Fragmentes in Volllänge,
eingeführt
in den Hefestamm
- "+" bedeutet ausflockend
und „-„ nicht-ausflockend
-
Während der
KY652-Stamm keine Ausflockungseigenschaft unter irgendeiner der
Bedingungen entfaltete, entfaltete der KY650-Stamm, der das Lg-FLO1-Fragment in Volllänge enthält, Ausflockungseigenschaft
in dem Ausflockungs-Messpuffer, wenn kein Zucker zugegeben wurde.
Diese Ausflockungseigenschaft wurde durch Mannose, Glucose, Maltose
und etwas durch Fructose inhibiert, aber wurde nicht durch Galactose
inhibiert. Diesen Ergebnissen war zu entnehmen, dass es durch die
Einführung
des Lg-FLO1-Fragmentes in Volllänge
möglich
ist, einer Laborhefe die Ausflockungseigenschaft von Bierhefe zu
verleihen.
-
[Beispiel 2]
-
Erhalt des kodierenden
Bereiches von Lg-FLO1 durch PCR, Einführung desselben in Laborhefe
und Beurteilung
-
In
Bezug auf einen benachbarten Bereich zu dem Teil, der an den Vektor
in dem Insertionsfragment von KF14 ligiert worden war, wurde die
Nukleotidsequenz durch das oben beschriebene Verfahren bestimmt. Als
Ergebnis wurde festgestellt, dass eine Stelle, die die Translationsinitiationsstelle
zu sein schien, 49 Bp stromaufwärts
vom 5'-Ende des
Insertionsfragmentes von KF1 liegt. Der PrimerKTF7 [5'CCCCAAGCTTGCTCTGCAGTAAATTCCGCA3', (14) in
3],
der zur PCR von der stromabwärts
liegenden Base an Position 58 Bp bis zum 5' dieses Anfangskodons in 3'-Richtung verwendet
werden soll, wurde synthetisiert. Auch auf Basis der zuvor bestimmten
Nukleotidsequenz des Insertionsfragmentes pKF-Kpn11, wurde der PrimerKTORFA [5'CGGAATTCTAAACACTATAAGCGTGATGATAG3', (15) in
3]
synthetisiert, der zur PCR von der stromabwärts liegenden Base an Position
53 Bp bis zum 3'-Ende
des Terminationskodons des Lg-FLO1-kodierenden Bereichs in der 5'-Richtung verwendet
werden soll. Unter Verwendung dieser zwei Primer und unter Verwendung
von 2 μg
DNA des ausflockenden meiotischen Segregansstammes KMS004 als Matrize
wurde PCR mit einem LA-PCR-Kit
durchgeführt.
Die Reaktion wurde durch Wiederholung von 30 Zyklen bei 94°C 30 Sekunden,
bei 60°C
1 Minute und bei 72°C
3,5 Minuten durchgeführt.
Als Ergebnis der Elektrophorese der Reaktionsprodukte unter Verwendung
von 0,8% Agarose wurde beobachtet, dass ein DNA-Fragment von ungefähr 5,8 kb
[(16) in
3] amplifiziert wurde. Dieses
PCR-Fragment wurde
hiernach als das Lg-FLO1ORF-Fragment bezeichnet. Das Lg-FLO1ORF-Fragment
wurde mit Primern PCR-amplifiziert, die
so entworfen worden waren, dass sie dem Fragment eine HindIII-Stelle
am 5'-Ende und eine
EcoRI-Stelle am 3'-Ende
verliehen. Dieses Fragment wurde mit HindIII und EcoRI verdaut und
in den Hefeexpressionsvektor pYES2 (Invitrogen) zwischen der HindIII-
und der EcoRI-Stelle auf eine solche Weise ligiert, dass das Fragment
stromabwärts
des GALI-Promotors in der Sense-Richtung eingeführt wurde. Der Vektor wurde
anschließend
direkt in den oben beschriebenen KY644-Stamm durch das Lithiumverfahren
eingeführt.
Die DNAs von den resultierenden Transformanten wurden der Southern
Analyse unterworfen und einer dieser Stämme, bei dem die Einführung des
Lg-FLO1ORF-Fragmentes bestätigt
worden war, wurde als KY646-Stamm bezeichnet. Das Plasmid, das in
dem KY646-Stamm enthalten war, wurde als YESKT2 bezeichnet. In Bezug
auf den KY646-Stamm und einen Stamm (als KY649-Stamm bezeichnet),
der durch Einführen
nur des Vektors pYES2 in den KY644-Stamm erhalten worden war, wurde
die Charakterisierung der Ausflockungseigenschaft durch das zuvor
beschriebene Verfahren durchgeführt,
nachdem sie bis zum Erreichen der stationären Phase in dem in Tabelle
1 gezeigten Medium bei 20°C
unter Schütteln
kultiviert worden waren. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle
3 Ausflockungseigenschaft
des Hefestammes, in den das GALI-Promotor-gesteuerte
Lg-FLO1ORF-Fragment eingeführt
ist
- "+" bedeutet ausflockend
und „-„ nicht-ausflockend
-
Während der
KY649-Stamm keine Ausflockungseigenschaft unter irgendeiner der
Bedingungen entfaltete, entfaltete der KY646-Stamm, der das Lg-FLO1ORF-Fragment enthält, Ausflockungseigenschaft
in den Ausflockungs-Messpuffer, zu dem kein Zucker zugegeben wurde.
Diese Ausflockungseigenschaft war, ähnlich wie bei dem KY650-Stamm,
die Ausflockungseigenschaft vom Typ der Bierhefe. Mit anderen Worten
wurde diese Ausflockungseigenschaft durch Mannose, Glucose und Maltose
und etwas Fructose inhibiert, aber wurde nicht durch Galactose inhibiert.
Durch diese Ergebnisse kam man zu dem Schluss, dass es durch Einführung der
Lg-FLO1ORF-Fragmentes,
gesteuert durch den GALI-Promotor, möglich war, Laborhefe die Ausflockungseigenschaft
von Bierhefe zu verleihen. Mit anderen Worten kam man zu dem Entschluss,
dass der kodierende Bereich des Lg-FLO1-Gens in dem Lg-FLO1ORF-Fragment vorhanden
ist.
-
[Beispiel 3]
-
Beschreibung des Bereichs
in Lg-FLO1, der die Ausflockungseigenschaft vom Bierhefe-Typ steuert
-
Um
den Lg-FLO1-Bereich zu spezifizieren, der die Ausflockungseigenschaft
vom Bierhefe-Typ steuert, wurde ein chimäres Gen, zusammengesetzt aus
Lg-FLO1 und Sc-FLO1 [Laborhefe-Typ FLO1, der von Watari et al. in
Yeast, 10, 211-225
(1994) offenbart ist], durch das in 5 beschriebene
Verfahren erzeugt und auf dessen Ausflockungseigenschaft untersucht.
Das Lg-FLO1ORF-Fragment wurde mit XhoI und KpnI verdaut, mit dem
Klenow-Fragment mit glatten Enden versehen und anschließend in
die HincII-Stelle von pUC118 kloniert. Von den resultierenden Transformanten
wurde ein Klon mit einem Insertionsfragment von ungefähr 1 kb ausgewählt und
die Nukleotidsequenz dieses Insertionsfragmentes wurde bestimmt.
Auf Basis des Ergebnisses wurde der Primer KTF8 (5'CGGGATCCATCTGGCAATACCACACTAACA3') synthetisiert,
der von der Base 639 stromabwärts
von 3' des Anfangskodons
von Lg-FLO1 bis
5' reicht. Unter
Verwendung der PrimerKTF7 und KTF8 und unter Verwendung einer Matrize
2 μg DNA
aus dem ausflockenden meiotischen Segregansstamm KMS004 wurde PCR
mit dem LA-PCR-Kit durchgeführt.
Die Reaktion wurde ausgeführt durch
Wiederholen von 30 Zyklen bei 94°C
30 Sekunden, bei 60°C
1 Minute und bei 72°C
3,5 Minuten. Als Ergebnis der Elektrophorese der Reaktionsprodukte
unter Verwendung von 0,8% Agarose wurde beobachtet, dass ein Fragment
von ungefähr
0,7 kb [(16) in 3] amplifiziert wurde. Hiernach
wird dieses PCR-Fragment das Lg-FLO1-N-terminale Fragment genannt.
Das Fragment wurde in pT7Blue (Novagen), das ein Klonierungsvektor
von PCR-Produkten ist, kloniert. Unter Verwendung von vier erhaltenen
unabhängigen
Klonen wurden die Nukleotidsequenzen ihrer Insertionsfragmente von
beiden Richtungen aus bestimmt. Es wurde festgestellt, dass alle
der vier Klone das gleiche Insertionsfragment aufweisen. Die erhaltene
Nukleotidsequenz ist in SEQ ID NO: 3 gezeigt. Einer der Klone wurde
als KNTA1 bezeichnet. Das Lg-FLO1-N-terminate Fragment wurden mit
Primern PCR-amplifiziert, die entworfen worden waren, um dem Fragment
eine HindIII-Stelle am 5'-Ende
und eine BamHI-Stelle am 3'-Ende
zu verleihen. KNTA1 wurde mit HindIII und BamHI verdaut und der
Elektrophorese unterworfen. Das aus dem Vektor getrennte Insertionsfragment
wurde anschließend
aus dem Gel herausgeschnitten, durch das oben beschriebene Verfahren
gereinigt und in die HindIII-BamHI-Stelle
von pYES2 auf eine solche Weise kloniert, dass das Fragment stromabwärts des
GALI-Promotors in der Sense-Richtung
eingeführt
wurde. Das erhaltene Plasmid wurde KNYES genannt. Escherichia coli
EKB707, enthaltend dieses Plasmid KNYES, wurde hinterlegt bei dem
National Institute von Bioscience and Human-Technology, Agence of
Industrial Science and Technology (1-3, Higashi 1-Chome, Tsukuba
City, Ibaragi Pref., Japan) am 27. Januar 1995 unter der Hinterlegungs-Nr.
FERM BP-4983.
-
Auf
Basis der Nukleotidsequenz des FLO1-Gens vom Laborhefe-Typ (hiernach als
das „Sc-FLO1-Gen" bezeichnet), das
von Watari et al. offenbart wurde [Yeast, 10, 211-225 (1994)], wurden
der PrimerWtF1N (5'CGGGATCCACTGTAAGTGATGACTTCGAAG3'), der von der Base
721 stromabwärts
vom 3' des Anfangskodons
bis 3' reicht, und
der Primer FLID4 (5'CGGAATTCTCAGCGTATAATTAGCAAAGAA3'), der von dem Basenpaar
58 stromabwärts
vom 3' des Terminationskodons
bis 5' reicht, synthetisiert.
Unter Verwendung dieser Primer und unter Verwendung von 2 μg DNA des
ABXL-1D-Stammes als Matrize wurde PCR mit dem LA-PCR-Kit durchgeführt. Die
Reaktion wurde ausgeführt
durch Wiederholen von 30 Zyklen bei 94°C 30 Sekunden, bei 60°C 1 Minute
und bei 72°C
3,5 Minute. Als Ergebnis der Elektrophorese der Reaktionsprodukte
unter Verwendung von 0,8% Agarose wurde beobachtet, dass ein Fragment
von ungefähr
3,9 kb amplifiziert wurde. Hiernach wird dieses Fragment als das
Sc-FLO1-C-terminale Fragment bezeichnet. Das Sc-FLO1-C-terminale
Fragment wurde mit Primern, die entworfen worden waren, um dem Fragment
eine BamHI-Stelle am 5'-Ende
und eine EcoRI-Stelle am 3'-Ende
zu verleihen, PCR-amplifiziert. Dieses Fragment wurde mit BamHI
und EcoRI verdaut und an den zuvor hergestellten KNYES zwischen
der BamHI- und der EcoRI-Stelle auf eine solche Weise ligiert, dass
das Fragment stromabwärts
des Lg-FLO1-N-terminalen
Fragmentes in der Sense-Richtung eingeführt wurde. Als Ergebnis ist
zu erwarten, dass ein Gen, das ein chimäres FLO1-Protein kodiert, hergestellt
wird, bei dem ein Teil des Sc-FLO1-kodierenden Bereiches, der der
Aminosäuresequenz
vom aminoterminalen Ende bis zur Position 240 entspricht, mit einem
Bereich des Lg-FLO1-Gens, der der Aminosäuresequenz vom aminoterminalen
Ende bis zur Position 213 entspricht, ausgetauscht worden ist. Das
Ligations-Reaktions-Produkt wurde direkt in den KY644-Stamm durch
das oben beschriebene Lithiumverfahren eingeführt. DNAs der resultierenden
Transformanten wurden der Southern Analyse unterworfen. Von diesen
Stämmen,
bei denen die Einführung
des chimären
Gens, zusammengesetzt aus dem Lg-FLO1-N-terminalen Fragment und
dem Sc-FLO1-C-terminalen Fragment bestätigt wurde, wurde ein Stamm
als KY648-Stamm bezeichnet. Das in diesem Stamm enthaltende Plasmid
wurde auch als KNWtC3 bezeichnet.
-
Darüber hinaus
wurde der PrimerFLID1 (5'CCCCAAGCTTTCGTTTGATGTAAGCTCTCT3'), der von –69 Bp stromaufwärts vom
5' des Anfangskodons
von Sc-FLO1 bis 3' reicht,
synthetisiert. Unter Verwendung der PrimerFLID1 und FLID4 und unter
Verwendung von 2 μg
DNA des ABXL-1D-Stammes als Matrize wurde PCR mit dem LA-PCR-Kit
durchgeführt.
Die Reaktion wurde ausgeführt
durch Wiederholen von 30 Zyklen bei 94°C 30 Sekunden, bei 60°C 1 Minute
und bei 72°C
3,5 Minuten. Als Ergebnis der Elektrophorese der Reaktionsprodukte
unter Verwendung von 0,8% Agarose wurde bemerkt, dass ein Fragment
von 4,8 kb amplifiziert wurde. Hiernach wird dieses Fragment Sc-FLO1ORF-Fragment
genannt. Das Sc-FLO1ORF-Fragment wurde PCR-amplifiziert mit Primern,
die entworfen worden waren, um dem Fragment eine HindIII-Stelle
am 5'-Ende und eine
EcoRI-Stelle am
3'-Ende zu verleihen.
Dieses Fragment wurde mit HindIII und EcoRI verdaut und an pYES2
zwischen der HindIII- und
der EcoRI-Stelle auf eine solche Weise ligiert, dass das Fragment
stromabwärts
von dem GALI-Promotor in der Sense-Richtung eingeführt wurde. Der resultierende
Vektor wurde direkt in den oben erwähnten KY644-Stamm durch das
Lithiumverfahren eingeführt.
Die DNAs der resultierenden Transformanten wurden der Southern Analyse
unterworfen. Von diesen Stämmen,
bei denen die Einführung des
Sc-FLO1ORF-Fragmentes
bestätigt
worden war, wurde ein Stamm als KY647-Stamm bezeichnet und zum Vergleich der
Ausflockungseigenschaften verwendet. Das in diesem Stamm enthaltene
Plasmid wurde auch als YESWt1 bezeichnet.
-
In
Bezug auf den KY647-Stamm, den KY648-Stamm und den zuvor beschriebenen
KY649-Stamm wurde die Charakterisierung der Ausflockungseigenschaft
durch das zuvor beschriebene Verfahren vorgenommen, nachdem sie
bis zum Erreichen der stationären
Phase in dem in Tabelle 1 gezeigten Medium bei 20°C unter Schütteln kultiviert
worden waren. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle
4 Ausflockungseigenschaft
des Hefestammes, in den das GALI-Promotor-gesteuerte
Lg-Sc-chimäre
FLO1-Gen eingeführt
ist
- "+" bedeutet ausflockend
und „-„ nicht-ausflockend
-
Während der
Stamm KY649 bei allen Bedingungen keine Ausflockungseigenschaft
entfaltete, entfaltete der Stamm KY648, der das chimäre Gen,
zusammengesetzt aus dem Lg-FLO1-N-terminalen
Fragment und dem Sc-FLO1-C-terminalen Fragment, enthält, und
der Stamm KY647, der das Sc-FLO1ORF-Fragment enthält, Ausflockungseigenschaft
in dem Ausflockungsmesspuffer, wenn kein Zucker zugegeben wurde.
Die Ausflockungseigenschaft von KY649 war, ähnlich wie bei KY650, durch
Mannose, Glucose und Maltose inhibiert und etwas durch Fructose
inhibiert, war aber nicht durch Galactose inhibiert. Auf der anderen
Seite wurde die Ausflockungseigenschaft von KY647 nur durch Mannose
inhibiert, aber nicht durch Glucose, Maltose, Fructose oder Galactose
inhibiert. Mit anderen Worten, während
das Sc-FLO1ORF-Fragment Ausflockungseigenschaft vom Laborhefe-Typ
verleiht, wurde die Ausflockungseigenschaft, die durch das chimäre Gen,
hergestellt durch Austauschen eines Teils dieses Fragmentes, der
von dessen Anfangskodon bis 720 Bp bis zu 3' reicht, mit einem Lg-FLO1-Teil, der
vom Anfangskodon bis 639 Bp bis zu 3' reicht, verliehen wird, in die vom Bierhefe-Typ
umgewandelt.
-
Diesen
Ergebnissen wurde entnommen, dass das Lg-FLO1-N-terminale Fragment in dem Lg-FLO1ORF-Fragment,
d.h. die in SEQ ID NO: 3 der Sequenzliste gezeigte Sequenz, stark
daran beteiligt ist, die Ausflockungseigenschaft vom Bierhefe-Typ
zu übertragen.
-
[Beispiel 4] Bewertung
der Lg-FLO1-zerstörten
Bierhefe
-
(1) Herstellung eines
Plasmids zur Zerstörung
von Lg-FLO1
-
Ein
Plasmid zur Zerstörung
von Lg-FLO1 wurde, wie in 6 und 7 gezeigt,
hergestellt. Kurz gesagt wurde das Plasmid pUC18 mit KpnI verdaut
und anschließend
wurden die DNA-Fragmente,
die mit dem Klenow-Fragment mit glatten Enden versehen waren, selbst-ligiert,
um ein Plasmid pUC18ΔK
herzustellen. Dieses Plasmid wurde mit HincII verdaut und anschließend wurde
ein KpnI-Linker (GGGTACCC) darin eingeführt, um dadurch das Plasmid
pUC18±K
herzustellen. Zwischen der EcoRI- und BamHI-Stelle dieses Plasmids
wurde ein 0,9 Kb-EcoRI-BamHI-Fragment (enthaltend den 5'-flankierenden Bereich), erhalten durch
das Plasmid KF14 eingeführt,
um dadurch das Plasmid pKF5B1 herzustellen.
-
Durch
das Plasmid pKF3HP, das durch Einführen eines 1,7 Kb-HincII-PvuII-Fragmentes
(enthaltend den 3'-flankierenden
Bereich) in die SmaI-Stelle des Plasmids pUC118 erhalten wurde,
wurde ein 1,7 kb BamHI-KpnI-Fragment erhalten und zwischen der BamHI-
und der KpnI-Stelle des Plasmids pKF5B1 eingeführt, um dadurch das Plasmid
pKF53-1 herzustellen.
-
Das
Plasmid pSY114P (ungeprüfte
japanische Patentveröffentlichung
Nr. 2-265488), das einen Promotorbereich (1,0 kb) des GPD(Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase)-Hefegens
und einen Terminatorbereich (0,4 kb) des PGK(Phosphoglyceratkinase)-Hefegens
enthält,
wurde mit SmaI verdaut und anschließend wurde ein HindIII-Linker (CAAGCTTG)
daran eingeführt.
Anschließend
wurde das Plasmid mit HindIII verdaut und dann selbst-ligiert, um
das Plasmid pSY114H herzustellen. In die HindIII-Stelle dieses Plasmids wurde
ein 0,5 kb-HindIII-Fragment von pSV2bsr (Funakoshi), enthaltend
ein Blasticidin S-Resistenzgen, eingeführt, um dadurch das Plasmid
pGPDBSR herzustellen. Dieses Plasmid wurde mit SalI verdaut und
anschließend
mit dem Klenow-Fragment mit glatten Enden versehen, um dadurch ein
1,9 kb-DNA-Fragment zu erhalten. Dieses DNA-Fragment wurde an ein
DNA-Fragment ligiert, das erhalten wurde durch Verdauen des Plasmids
pKF53-1 mit BamHI und anschließendem
Versehen von glatten Enden mit dem Klenow-Fragment, um dadurch das
Plasmid pKF53BSR19 herzustellen.
-
(2) Transformation von
Bierhefe
-
Die
Transformation von Bierhefe wurde durch Elektroporation durchgeführt. Ausflockende
Bierhefe, die in 200 ml YPD-Medium,
bis OD600 ungefähr
7 erreichte, kultiviert ist, wurde zweimal mit sterilisiertem Wasser
und zweimal mit 1 M Sorbit gewaschen und anschließend in
1 ml M Sorbit suspendiert. Zu 50 μl
dieser Hefesuspension wurden 2,7 μg
DNA-Fragmente, erhalten durch Verdau des Plasmids pKF53BSR mit EcoRI, und
10 μg Lachsspermien-DNA
(Sigma) zugegeben und 5 Minuten stehengelassen. Anschließend unter
Verwendung einer 0,2 cm-Zelle
von Gene Pulser (Bio Rad) wurde ein elektrischer Puls von 1,5 KV,
25 μF und
200 Ω geladen.
Zu der resultierenden Suspension wurde 1 ml 1 M Sorbit und 400 μl YPD gegeben
und bei 30°C
4 Stunden unter Schütteln
kultiviert. Danach wurde die Suspension auf einem YPD-Agarmedium,
enthaltend 50 μg/ml
Blasticidin S (Funakoshi), plattiert und bei 30°C 3 Tage kultiviert. Die resultierenden
Transformanten wurden der Southern Analyse unterworfen und im Ergebnis
wurde bestätigt,
dass das Lg-FLO1-Gen zerstört
wurde. Die so erhaltenen Lg-FLO1-zerstörte Bierhefe
wurde auf Ausflockungseigenschaft untersucht und es wurde festgestellt,
dass keine Ausflockung übertragen
worden ist.
-
[Beispiel 5]
-
Vergleich der abgeleiteten
Aminosäuresequenz
des N-terminalen Bereichs von Lg-FLO1 und Sc-FLO1
-
Beispiel
3 hat gezeigt, dass die Ausflockungseigenschaft vom Bierhefe-Typ
durch die Sequenz von 213 Aminosäureresten
im N-terminalen
Bereich von Lg-FLO1 gesteuert wird. Anschließend wurden die abgeleiteten
Aminosäuresequenzen
dieser Bereiche des Lg-FLO1 und Sc-FLO1 verglichen. Im Ergebnis
wurden zwischen den beiden Sequenzen die folgenden charakteristischen
Unterschiede, wie in 8 gezeigt, festgestellt. 1)
In Lg-FLO1 sind 27 Aminosäurereste,
entsprechend der von Position 84 bis zu Position 110 von Sc-FLO1 deletiert. 2)
Bis zu Position 123 auf Basis von Sc-FLO1 ist die Homologie zwischen
Sc-FLO1 und Lg-FLO1 verhältnismäßig niedrig.
3) An der Position 124 und danach auf Basis von Sc-FLO1 ist die
Homologie zwischen Sc-FLO1 und Lg-FLO1 hoch.
-
Auf
Basis dieser Ergebnisse wurden ein chimäres Gen, zusammengesetzt aus
Sc-FLO1 und Lg-FLO1, und ein modifiziertes Sc-FLO1-Gen mit einer
Deletion von 27 Aminosäureresten
von Position 84 bis Position 110 hergestellt. Die N-terminalen Bereiche
dieser modifizierten FLO1-Gene wurden unter Verwendung des rekombinanten
PCR-Verfahrens,
das auf Seiten 115-160 des PCR Experimentellen Handbuchs [M.A. Innis
et al. (Hrsg.), herausgegeben und übersetzt von Takashi Saito,
HBJ Shuppan Co., Ltd. (1991)] beschrieben ist, hergestellt. Ein
Fragment des so erhaltenen T-terminalen Bereichs des modifizierten
FLO1-Gens wurde an das Positionl KNWtC3 (beschrieben in Beispiel
3) zwischen der HindIII- und BamHI-Stelle (d.h. zwischen dem GALI-Promotor
und dem Sc-FLO1-C-terminalen Fragment) in der Sense-Richtung ligiert
und anschließend
in den Hefestamm KY644 eingeführt.
Das Kultivieren der resultierenden Transformanten und die Beurteilung
der Ausflockungseigenschaft wurden im Wesentlichen auf die gleiche
Weise wie in Beispiel 3 durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in 9 gezeigt. Solche Stämme (KY707,
KY708 und KY709) mit einem chimären
FLO1-Gen, zusammengesetzt aus einem Lg-FLO1-abstammenden Teil bis
zum Aminosäurerest
der Position 46, 68 oder 83 (auf Basis von Sc-FLO1) und einem Sc-FLO1-abstammenden
Teil, dem obigen Teil folgend, entfalteten ähnlich wie ein Stamm mit Sc-FLO1
(KY706) starke Ausflockung von Laborhefe-Typ. Auf der anderen Seite
entfaltete ein Stamm mit einem chimären FLO1-Gen, zusammengesetzt
aus einem Lg-FLO1-abstammenden Teil bis zum Aminosäurerest
der Position 124 auf Basis von Sc-FLO1 (Photosensibilisator 97 auf
Basis von Lg-FLO1) und einem Sc-FLO1-abstammenden
Teil, der dem obigen Teil folgt, ähnlich wie KY648 und KY646,
in Beispiel 3 gezeigt, schwache Ausflockungseigenschaft vom Bierhefe-Typ.
Darüber hinaus
entfaltete KY711 mit einem modifizierten FLO1-Gen mit einer Deletion
von 27 Aminosäureresten
von Positiono 84 bis Position 110 von Sc-FLO1 schwache Ausflockung
vom Laborhefe-Typ.
Diesen Ergebnissen ist zu entnehmen, dass ein Teil des Lg-FLO1-Gens,
das am Bierhefe-Typ beteiligt ist, ein Teil ist, der den 14 Aminosäureresten
von Position 84 bis Position 87 auf Basis von Lg-FLO1 entspricht,
d.h. die in SEQ ID NO: 4 gezeigte Sequenz, die für die in SEQ ID NO: 2 in der
Sequenzliste gezeigte Aminosäuresequenz
kodiert.
-
Industrielle
Anwendbarkeit
-
Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird das Lg-FLO1-Protein bereitgestellt, welches die Wirkung
hat, die Ausflockungseigenschaft vom Bierhefe-Typ zu übertragen,
sowie der Lg-FLO1-DNA-Strang, der das Protein kodiert. Durch Einführung der
erfindungsgemäßen DNA
in Hefe als fremde DNA, d.h. Einführung dieser DNA in Hefezellen
als ein extranukleares Gen und(/oder) ein nukleares Gen, ermöglicht,
die Ausflockungseigenschaft vom Bierhefe-Typ zu übertragen oder die Eigenschaft
in Hefe zu verbessern. Im Gegensatz dazu ist es möglich durch
Einführen
eines DNA-Stranges, der durch Zerstören der erfindungsgemäßen DNA
erhalten wird, in Hefezellen oder durch Inhibieren der Expression
der erfindungsgemäßen DNA
einen ausflockenden Hefestamm in einen nicht-ausflockenden Hefestamm
umzuwandeln oder die Ausflockungseigenschaft zu verringern.
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