CN100370028C - 絮凝菌f2的絮凝基因 - Google Patents
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Abstract
絮凝菌F2的絮凝基因，它涉及一种絮凝菌的絮凝基因。鉴于絮凝菌F2的絮凝基因在构建具有絮凝作用的多功能工程菌株方面具有重要的意义，本发明旨在获得絮凝菌F2基因组中的絮凝基因。本发明絮凝菌F2的絮凝基因序列全长1071bp，其中T、C、G、A分别为307bp(29%)、191bp(18%)、266bp(25%)、307bp(29%)。本发明得到了絮凝菌F2基因组中的絮凝基因，为将来构建具有絮凝作用的多种功能的工程菌株，节约水处理费用和科学研究奠定了物质基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种絮凝菌的絮凝基因。
背景技术
絮凝菌F2的絮凝率＞80％，属于芽孢杆菌属，是从大庆炼油厂含油废水处理单元曝气池活性污泥中分离出的高效絮凝菌菌株(复合型生物絮凝剂产生菌筛选及絮凝机理研究，哈尔滨工业大学学报2004.6：第36卷第6期759～762页)。具有絮凝作用的多功能工程菌株在水处理中有显著的优越性和经济价值，因此得到絮凝菌F2的絮凝基因有着重要的意义。
发明内容
鉴于絮凝菌F2的絮凝基因在构建具有絮凝作用的多功能工程菌株方面具有重要的意义，本发明旨在获得絮凝菌F2基因组中的絮凝基因。本发明絮凝菌F2的絮凝基因序列全长1071bp，如SEQ ID NO：1所示，其中T、C、G、A分别为307bp(29％)、191bp(18％)、266bp(25％)、307bp(29％)。
本发明得到了絮凝菌F2基因组中的絮凝基因，为将来构建具有絮凝作用的多种功能的工程菌株，节约水处理费用和科学研究奠定了物质基础。
附图说明
图1是絮凝基因PCR扩增凝胶电泳图，其中1号泳道条带是Marker，图中黑色箭头所指条带为1000bp，2号和4号泳道条带是PCR扩增基因片段；图2是BamH I酶切载体PUC19的凝胶电泳图，其中1号泳道条带是Marker，2号泳道中的条带是经BamH I酶切的载体PUC19的DNA片段。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式通过以下步骤获得絮凝菌F2的絮凝基因。
其具体方法如下：
1、提取絮凝菌F2基因组DNA
取絮凝菌F2菌液50mL，用上海华舜生物工程有限公司生产的华舜小量细菌基因组DNA抽提试剂盒(W6511)提取絮凝菌F2的絮凝基因DNA，提取步骤参见小量细菌基因组DNA抽提试剂盒(W6511)使用操作手册。
2、PCR扩增絮凝基因
絮凝菌F2的絮凝基因的PCR扩增引物P1和P2的序列见表1，扩增程序见表2，PCR扩增体系如下(20μL)：
Buffer 2μL
dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP各3.2mol/L)2μL
P1(10pmol/L) 1μL
P2(10pmol/L) 1μL
Ex Taq DNA聚合酶(5U/μL) 0.25μL
絮凝菌F2基因组DNA 0.5μL
蒸馏水 13.25μL
表1
| 引物名称 | 引物序列 |
| P<sub>1</sub> | 5’-AGTCTAGATGTAAGCTCTCTTCCGG-3’ |
| P<sub>2</sub> | 5’-CTCTCGAGCAATAAGGACGCAATG-3’ |
表2
| 步骤 | 时间 | 温度 | 循环数 |
| 预变性 | 15min | 96℃ | 1 |
| 变性 | 40sec | 94℃ | 30 |
| 退火 | 60sec | 50℃ | |
| 延伸 | 4min | 72℃ | |
| 终延伸 | 7min | 72℃ | 1 |
3、凝胶电泳检测
图1中2号和4号泳道在1000bp附近的DNA条带为目的基因片段。
4、回收目的基因
用上海华舜生物工程有限公司生产的柱式华舜小量胶回收试剂盒(W5211)回收，回收步骤参见试剂盒操作手册。
5、BamH I酶切载体PUC19
酶切体系如下(20μL)：
BamH I 1～5μL
10×Buffer 2μL
PUC19 1μL
加无菌水至总体积为20μL
在37±0.5℃条件下反应1h。
6、凝胶电泳
图2中2号泳道中的条带是经BamH I酶切的载体PUC19的DNA片段。
7、回收BamH I酶切载体PUC19的DNA片段
用上海华舜生物工程有限公司生产的柱式华舜小量胶回收试剂盒(W5211)回收，回收步骤参见试剂盒操作手册。
8、载体PUC19的DNA片段进行碱性磷酸化
碱性磷酸化反应体系如下(50μL)：
PUC19 DNA Fragments in TE Buffer 1～20pmol
10×Alkaline Phosphataes Buffer 5μL
碱性磷酸化酶(10～30U/μL) 1～2μL
加蒸馏水至总体积为50μL
在65±0.5℃条件下反应30±2min。
9、絮凝菌F2基因组DNA片段与载体PUC19片段连接
连接反应体系如下(20μL)：
10×T4 DNA Ligase Buffer 1～1.5μL
DNA酶切片段 15μL
载体PUC19 3μL
T4 DNA Ligase 0.5～1μL
在16±0.5℃条件下反应24±0.5h。
10、连接产物转化感受态细胞JM109
①在1mL无菌离心管中加入5μL连接产物和20μL(北京博大泰克生物基因技术有限责任公司，高效感受态JM109细菌细胞试剂盒)试剂A，并加入无菌水稀释至100μL混合均匀(放于冰上备用)；
②向80～100μL感受态细胞JM109的细胞液中加入100μL 10-①混合液，混合均匀后冰浴20min，然后再置于无菌室温环境中放置10min；
③向上一步骤(10-②)混合液中加入400μL液体LB培养基，在37℃、200r/min的环境中振荡培养10～40min；
④用10-③的培养液涂铺LB固体培养基平皿，再将平皿放入37℃的培养箱中培养12～16h，长出单克隆菌菌落。
11、絮凝基因测序
连接产物转化感受态细胞JM109形成的单克隆菌由大连宝生物公司进行序列测定。絮凝菌F2的絮凝基因序列全长1071bp，其中T、C、G、A分别为307bp(29％)、191bp(18％)、266bp(25％)、307bp(29％)。
12、絮凝测定
目测法：将连接产物转化感受态细胞JM109形成的单克隆菌单菌落接种于3mL液体LB培养基试管中，在37℃条件下静置培养48h，之后剧烈振荡1min，再静置观察有絮凝沉淀产生。
序列表
<110>哈尔滨工业大学
<120>絮凝菌F2的絮凝基因
<160>3
<210>1
<211>1071
<212>DNA
<213>芽孢杆菌属(Bacillus.sp)
<400>1
gccagtgcca agcttggtta ggcttattaa tgagtctact tgctgttttg tttttagtgg 60
cgtgtggagg taagtctgaa aagacagcta catcttcatc atctacgact tcttcttcat 120
cagaagaagc tgtttcaggt gcatctgaga aagtttatac agatccatct gagttgaaag 180
atagctacga tgttatcgtt gttggttcag gtggtgcagg tatgtcagca gctatctcag 240
ctaaagacgc tggtgctagt gttgctctct tggagaaaat gcctgttatc ggtggtaata 300
cggctaaatc atcagctggt atgaatgctt cacagactaa attccaagaa gcggaaggta 360
ttgctgatac aaatgataaa ttctacgaag aaacgcttaa aggtggtaaa gggacaaacg 420
atcctgaatt gcttcgttat cttgtagata actctgctag tgcaattgac tggttggatg 480
gaatggggat cactcttagc aacctaacta caactggtgg tatgagcgag aaacgtaccc 540
accgtccagc agatggttca gctgtcggtg gctacttggt aaatggtctt taccacaatc 600
ttgttgaacg tgaagtacca atttttgtca atgcagatgt tacaaaactc caagacaagg 660
atggagctgt gacaggtgtt gaagtgaaga ttgctggtga aactaagaaa atctcagcta 720
aagcagttgt attggcgact ggtggtttcg gtgctgattt ggaaatggtt gctaaattaa 780
acccagcatt gaaaggttat gttacaacta accaagaagg atcaacaggt gacggtattg 840
cgcttgctga atcagaaggt gcagcaactg ttgatatgga acaaatccaa attcacccaa 900
gtgttgagca agaaacttct tacttgatta cagaagcagt tcgtggcgaa ggtgctatcc 960
ttgtcaactc aaaaggtgag cgttttgtta acgaattgga aactcgtgat aaagtttctg 1020
cggctatcaa tagtttggat ccccgggtac cgagctcgaa ttcgtaatca t 1071
<210>2
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>絮凝菌F2的絮凝基因的PCR扩增引物P1
<400>2
agtctagatg taagctctct tccgg 25
<210>3
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>絮凝菌F2的絮凝基因的PCR扩增引物P2
<400>3
ctctcgagca ataaggacgc aatg 24
Claims (1)
1.絮凝菌F2的絮凝基因，其特征是絮凝菌F2的絮凝基因序列如下所示：
GCCAGTGCCAAGCTTGGTTAGGCTTATTAATGAGTCTACTTGCTGTTTTGT
TTTTAGTGGCGTGTGGAGGTAAGTCTGAAAAGACAGCTACATCTTCATCA
TCTACGACTTCTTCTTCATCAGAAGAAGCTGTTTCAGGTGCATCTGAGAA
AGTTTATACAGATCCATCTGAGTTGAAAGATAGCTACGATGTTATCGTTGT
TGGTTCAGGTGGTGCAGGTATGTCAGCAGCTATCTCAGCTAAAGACGCT
GGTGCTAGTGTTGCTCTCTTGGAGAAAATGCCTGTTATCGGTGGTAATAC
GGCTAAATCATCAGCTGGTATGAATGCTTCACAGACTAAATTCCAAGAAG
CGGAAGGTATTGCTGATACAAATGATAAATTCTACGAAGAAACGCTTAAA
GGTGGTAAAGGGACAAACGATCCTGAATTGCTTCGTTATCTTGTAGATAA
CTCTGCTAGTGCAATTGACTGGTTGGATGGAATGGGGATCACTCTTAGCA
ACCTAACTACAACTGGTGGTATGAGCGAGAAACGTACCCACCGTCCAGC
AGATGGTTCAGCTGTCGGTGGCTACTTGGTAAATGGTCTTTACCACAATC
TTGTTGAACGTGAAGTACCAATTTTTGTCAATGCAGATGTTACAAAACTC
CAAGACAAGGATGGAGCTGTGACAGGTGTTGAAGTGAAGATTGCTGGT
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| GR01 | Patent grant | ||
| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20080220 Termination date: 20120403 |