DE69634671T2

DE69634671T2 - Mit Nima interagierende Proteine

Info

Publication number: DE69634671T2
Application number: DE69634671T
Authority: DE
Inventors: Tony Hunter; Ping Kun LU
Original assignee: Salk Institute for Biological Studies
Current assignee: Salk Institute for Biological Studies
Priority date: 1995-11-13
Filing date: 1996-10-28
Publication date: 2006-03-02
Anticipated expiration: 2016-10-29
Also published as: US20070042467A1; CA2235225C; US5952467A; US5972697A; US6596848B1; US20050049404A1; US7125955B2; US20050027107A1; EP0880359A1; CA2235225A1; DE69634671D1; US7148003B2; US20050033032A1; US7164012B2; WO1997017986A1; AU1115897A; EP0880359B1; EP0880359A4

Description

Fachgebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen den eukaryontischen Zellzyklus und im Speziellen eine neue Klasse von Proteinen, die mit der Proteinkinase NIMA im mitotischen NIMA-Signalweg interagieren.
Hintergrund der Erfindung
Es wurde gezeigt, dass die CDC2-Kinase, die mit ihren Cyclin-Partnern assoziiert ist, eine wichtige Rolle während des Fortschreitens der G2/M-Phase in eukaryontischen Zellen spielt. Neuere Studien haben jedoch gezeigt, dass die Aktivierung der CDC2-Kinase alleine nicht ausreichend ist, um Mitose in einigen eukaryontischen Zellen wie z.B. in Sachcaromyes cerevisiae (Amon et al., Nature 355: 368, 1992; Sorger und Murray, Nature 355: 365, 1992; Stueland et al., Mol Cell Bio 13: 3744, 1993) und Aspergillus nidulans (Osmani et al., Cell 67: 283, 1991 a) auszulösen. Des weiteren enthüllte die detaillierte Analyse der Reifung von Oocyten der Maus, dass die Aktivität der CDC2-Histon H1-Kinase während des G2/M-Übergangs nicht ansteigt, wie durch den Zusammenbruch der germinalen Vesikel (GVBD) angezeigt wird (Choi et al., Development 113: 789, 1991; Jung et al., Int J Dev Biol 37: 595, 1993; Gavin et al., J Cell Sci 107: 275, 1994). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass ein oder mehrere andere Signalwege zur mitotischen Aktivierung existieren, die bisher noch nicht identifiziert wurden.
Neuere Studien haben eine neue mitotische Kinase, NIMA, identifiziert, die durch das Aspergillus nimA-Gen codiert wird (Osmani et al., Cell 53: 237, 1988). Die Kinaseaktivität von NIMA ist während des nukleären Teilungszyklus streng reguliert, wobei sie ihren Höhepunkt in der späten G2-Phase und in der M-Phase erreicht. Die Überexpression von NIMA fördert den Eintritt von Aspergillus-Zellen in die M-Phase (Osmani et al., Cell 53: 237, 1988; Lu and Means, EMBO J 13: 2103, 1994). Daher ist NIMA für das Fortschreiten in die Mitose in Aspergillus von Bedeutung.
NIMA ist eine Ser/Thr-Proteinkinase, die sich biochemisch von anderen Proteinkinasen unterscheidet und deren Phosphotransferase-Aktivität durch Ser/Thr-Phosphorylierung reguliert ist. Es wurde kürzlich gezeigt, dass der mitotische Signalweg von NIMA nicht auf Aspergillus beschränkt ist, sondern auch in Zellen von Wirbeltieren existiert (Lu and Hunter, Cell 81: 413, 1995a). In den Oocyten von Xenopus induziert NIMA den Zusammenbruch der germinalen Vesikel ohne Mos, CDC2 oder MAP-Kinase zu aktivieren. In HeLa-Zellen induziert NIMA mitotische Ereignisse ohne CDC2 zu aktivieren, wohingegen dominant negative Mutanten von NIMA einen spezifischen G2 Arrest hervorrufen. Zusätzlich haben O'Connell et al. (EMBO J, 13: 4926, 1994) gezeigt, dass NIMA eine frühzeitige Kondensation des Chromatins in Spalthefe und HeLa-Zellen induziert. Diese Ergebnisse enthüllen die Existenz eines NIMA ähnlichen, mitotischen Signalwegs in anderen eukaryontischen Zellen. Lu et al., J Biol Chem 268: 8769–8776 (1993), beschreiben die Kinetiken der Kinaseaktivität von NIMA und die Aktivität der Autophosphorylierung einer Kinase negativen Mutante.
Peptidyl-prolyl-cis/trans-Isomerasen (PPlasen, Prolin-Isomerasen) sind ubiquitär exprimierte Enzyme, welche die cis/trans-Isomerisierung der Peptidyl-prolyl-Peptidbindung katalysieren, was unter einigen Umständen der geschwindigkeitsbegrenzende Schritt bei der Proteinfaltung oder beim -aufbau sein kann. Cyclophiline und FK506-bindende Proteine (FKBPs) sind zwei gut charakterisierte Familien von PPlasen, die wenig oder keine Ähnlichkeit in den Aminosäuren zu einander zeigen. Die Mitglieder von jeder Familie enthalten aber eine Kernstruktur, die von Prokaryonten zu Eukaryonten hoch konserviert ist. Die Bedeutung dieser PPlasen wird durch die Erkenntnis hervorgehoben, dass Cyclophilin und FK506-bindende Proteine die Ziele der immunsuppressiven Arzneistoffe Cyclosporin A beziehungsweise FK506 sind und dass sie eine wichtige Rolle in den zellulären Signalwegen der Aktivierung von T-Zellen spielen, obwohl gezeigt wurde, dass keines dieser Gene für das Leben essentiell ist (für einen Übersichtsartikel vergl. Schreiber, Science 251: 283, 1991; Fruman et al., FASEB J, 8: 391, 1994).
Die kürzliche Entdeckung von Parvulin führte zur der Identifizierung einer dritten Familie von PPlasen, die nur eine geringe Homologie zu Cyclophilinen oder FKBPs zeigen und die nicht sensitiv gegen die immunsuppressiven Arzneistoffe sind (Rahfeld et al., FEBS Lett 352: 180, 1994a und FEBS Lett 343: 65, 1994b). Eine Suche nach Sequenzhomologie identifizierte mehrere andere Mitglieder dieser Familie, einschließlich solcher, die in der Proteinreifung und/oder dem Transport involviert sind, und das ESS1-Gen (Rudd et al., TIBS 20: 12, 1995). ESS1 ist ein essentielles Gen für das Wachstum in knospender Hefe und frühere Ergebnisse deuteten darauf hin, dass es in den späteren Stadien des Zellzyklus benötigt werden kann (Hanes et al., Yeast 5: 55, 1989). ESS1 wurde kürzlich als PTF1 in einer Durchmusterungsanalyse für Gene, die in der Reifung der 3'-Endung von mRNA involviert sind, erneut isoliert. Es wurde gezeigt, dass Ptf1 eine mutmaßliche PPlase-Domäne enthält, aber eine PPlase-Aktivität konnte nicht nachgewiesen werden (Hanf et al., FEBS Lett 365: 198, 1995). Bisher konnte nicht gezeigt werden, dass eine der PPlasen spezifisch in der Kontrolle des Zellzyklus involviert ist.
Es besteht ein Bedarf, Komponenten des mitotischen NIMA-Signalwegs in Säugern zu identifizieren, um Gene zu identifizieren, die für das Leben essentiell sind. Die Identifizierung solcher Gene hat mehrere Vorteile einschließlich zum Beispiel der Identifizierung von geeigneten therapeutischen Zielen und von Kandidaten-Genen für die Gentherapie (z.B. der Austausch von Genen), der Kartierung von Genorten, die mit Krankheiten assoziiert sind, und der Identifizierung von diagnostischen und prognostischen Indikatorgenen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt eine neue Klasse von Proteinen zur Verfügung, die mit der Proteinkinase NIMA assoziiert sind. Einige dieser Proteine sind dadurch gekennzeichnet, dass sie die Mitose fördernde Funktion von NIMA hemmen, wenn sie überexprimiert werden, und einen Arrest der Mitose und die nucleäre Fragmentierung induzieren, wenn sie abgereichert werden.
In einer ersten Ausführungsform stellt die Erfindung ein exemplarisches, NIMA assoziiertes Protein da, das „mit NIMA interagierendes Protein" (Pin1) genannt wird. Pin1 besitzt C-terminal eine Peptidy-prolyl-cis/trans-Isomerase-Aktivität und enthält N-terminal eine konservierte Tryptophan-Domäne (WW-Domäne), von der angenommen wird, dass sie die Protein-Protein-Interaktionen vermittelt. Ebenfalls werden Polynucleotide eingeschlossen, die PIN-Proteine codieren.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung eines Proteins zur Verfügung, das die Mitose fördernde Funktion der Proteinkinase NIMA hemmt. Das Verfahren basiert auf einem genetischen System, das entwickelt wurde, um Protein-Protein-Interaktionen zu detektieren. Das Verfahren umfasst das Kultivieren transformierter Zellen, die nachfolgendes enthalten: ein Nucleinsäurekonstrukt, das eine DNA-bindende Domäne umfasst, die funktionell mit der codierenden Sequenz von NIMA assoziiert ist, oder funktionelle Fragmente davon; eine Nucleinsäure-Bibliothek, wobei jedes Mitglied der Bibliothek eine transaktivierende Domäne umfasst, die funktionell mit einer Sequenz assoziiert ist, die ein Protein codiert; und ein Nucleinsäure-Reporter-Konstrukt, das ein Response-Element für die DNA-bindende Domäne umfasst, das funktionell mit einem Reporter-Gen assoziiert ist, und überprüfen eines Hinweises auf Expression des Reporter-Gens.
In noch einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Kontrolle des Wachstums von Zellen zur Verfügung, welches das Inkontaktbringen der Zelle mit einer Zusammensetzung, welche die Pin1-Aktivität moduliert, umfasst. Zum Beispiel kann ein Hemmstoff der Pin1-Aktivität wie z.B. ein PPlase-Inhibitor oder ein anti-Pin1-Antikörper oder ein Inhibitor der PIN1-Expression wie z.B. eine Antisense-Nucleotidsequenz oder ein Ribozym verwendet werden, um das Wachstum einer Zelle zu kontrollieren. In einer anderen Ausführungsform kann zum Beispiel die Aktivität von Pin1 durch einen Aktivator erhöht werden oder die Expression von PIN1 kann durch einen Enhancer erhöht werden.
Schließlich stellt die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung eines Proteins oder einer anderen Zusammensetzung (z.B. einen Arzneistoff oder ein kleines Molekül) zur Verfügung, das die mit Pin1 assoziiert und/oder die Aktivität von Pin1 oder die Genexpression von PIN1 moduliert.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1A und 1B zeigen menschliche cDNA-Clone, die Proteine codieren, welche mit NIMA interagieren (Pins).
1A zeigt eine β-Galactosidase-Aktivität im Zwei-Hybrid-System. 1B zeigt einen Vergleich von NIMA und NLK1.
2A–2C zeigen die cDNA und die abgeleiteten Aminosäuresequenzen von menschlichem PIN1 und die Homologien mit anderen Proteinen mit WW-Domänen und PPlasen. 2A zeigt die vorhergesagte Aminosäuresequenz von Pin1, die im Ein-Buchstaben-Code dargestellt wird. Die Fusionspunkte zwischen GAL4 und Pin1 in sechs verschiedenen isolierten Clonen waren: Clon H20 bei C-9; Clon H16, 24 und 38 bei G+13; Clone H6 und H36 bei C+15. Die unterstrichenen Reste bilden eine Konsensussequenz für ein zweiteiliges nucleäres Lokalisationssignal. Die N- und C-terminalen Kästen verweisen auf die WW-Domäne und die PPlase-Domäne. Die Nummern der Nucleotide sind auf der linken Seite und die Nummern der Aminosäuren auf der rechten Seite dargestellt.
2B und 2C zeigen die Ausrichtung der WW-Domäne (B) und der PPlase-Domäne (C) in ausgewählten Proteinen. Identische Reste sind in der untersten Reihe dargestellt. Striche verweisen auf Lücken, die eingeführt wurden, um die Ausrichtung durchzuführen. Cbf2, zellbindender Faktor 2; SC, S. cerevisiae; EC, E. coli; BS, B. subtilis; CJ, C. jejuni; AT, A. thaliana.
3 zeigt eine Analyse der mRNA-Expression von PIN1 in menschlichen Zelllinien und menschlicher fötaler Leber. HeLA, epitheloide Karzinomzellen; HFF, menschliche Vorhaut-Fibroblasten; Ramos, Burkitt-Lymphomzellen; A431, epitheloide Karzinomzellen; 293, Adenovirus E1A transformierte, menschliche embryonale Nierenzellen; U937, immunblastische Lymphomzellen; Saos-2, Osteosarcomzellen; U87-MG, Glioblastomzellen; Jurkat, T-Zell-Leukämie-Zelllinie und HFL, menschliche fötale Leber. Die Position des molekularen Gewichtsstandards der RNA (Promega) ist auf der linken Seite dargestellt.
4 zeigt die PPlase-Aktivität von Pin1. Verschiedene Konzentrationen von Pin1 wurden verwendet, wie angezeigt wird, wobei die rekombinante PPlase des FK506 bindenden Proteins (FKBP) als Positivkontrolle verwendet wurde. Die Kontrollproben enthielten die gesamten Komponenten außer der PPlase. Die Insertion zeigt die PPlase-Aktivität während der ersten Minute der Untersuchung.
5A–5E zeigen Immunpräzipitationen, um die Interaktion zwischen Pin1 und der C-terminalen, nichtkatalytischen Domäne von NIMAs in HeLa-Zellen zu zeigen. 5A zeigt die Expression und Reinigung von His-Pin1. Die PIN1-cDNA wurde in pProEx1 subcloniert und das rekombinante Protein wurde aus Bakterien gereinigt, wobei eine Ni²⁺-NTA-Agarosesäule verwendet wurde, gefolgt von der Analyse des Proteins auf einem 15%igen SDS enthaltenden Gel und einer Coomassie-Färbung. Die Positionen von His-Pin1 und des Standard-Größenmarkers sind angegeben. 5B zeigt die Expression von NIMAs in HeLa-Zellen. tTA-1-Zellen wurden mit verschiedenen FLAG-markierten NIMA-Konstrukten transfiziert und mit ³⁵S Express Label für 24 h markiert, gefolgt von einer Immunpräzipitation, wobei M2-mAk verwendet wurden. Die präzipitierten Proteine wurden auf einem 10%igen SDS enthaltenden Gel analysiert, gefolgt von einer Autoradiographie. Die Positionen von K40M, NIMA, K40M-NIMA280, NIMA280-699 und des Standard-Größenmarkers sind angegeben. 5C zeigt einen stabilen Komplex zwischen dem rekombinanten Pin1 und den NIMAs. Zelllysate, die denen im Bild B ähnlich sind, wurden mit His-Pin1-Ni²⁺-NTA-Kugeln inkubiert, wie im Bild A angegeben ist, und gewaschen, gefolgt von einer Elektrophorese auf einem Gel, das SDS enthielt, und einer Autoradiographie. 5D und 5E zeigen Koimmunpräzipitationen von K40M-NIMA und Pin1. tTA-1-Zellen wurden mit FLAG-markiertem NIMA und HA-PIN1-Konstrukten für 24 h kotransfiziert. Die Zelllysate wurden mit dem HA-spezifischen 12CA5-mAk immunpräzipitiert, gefolgt durch ein Immunblott-Verfahren, wobei der M2-mAk verwendet wurde, der für die FLAG-Markierung (D) spezifisch ist, und umgekehrt (E).
6 zeigt die Kolokalisation von Pin1 und NIMA und seiner Kinase negativen Mutante in HeLa-Zellen. 24 h nach der Transfektion mit den Vektoren, die nur HA-markiertes Pin1 (rechtes Bild) oder HA-markiertes Pin1 und FLAG-markierte NIMA (linkes Bild) oder ihre Kinase negative Mutante (K40M-NIMA, mittleres Bild) exprimieren, wurden die transfizierten tTA-1-Zellen für die indirekte Immunfluoreszenzfärbung verarbeitet und mittels konfokaler Mikroskopie untersucht. Obere Bilder: Färbungsmuster für NIMA oder K40M-NIMA, erhalten mit dem für die FLAG-Markierung spezifischen M2-mAk, oder SC-35, erhalten mit anti-SC-35-mAk und anschließend mit FITC-konjugierten IgG1 spezifischen, sekundären Antikörpern; mittlere Bilder: Färbungsmuster für Pin1, erhalten mit einem für die HA-Markierung spezifischen 12CA5-mAk und Texas-Rot-konjugierten IgG2b spezifischen, sekundären Antikörpern; untere Bilder: Doppelfärbung für Pin1 und NIMA, Pin1 und K40M-NIMA oder Pin1 und SC-35, welche durch die Überlagerung der entsprechenden oberen und mittleren Bilder gezeigt werden, wobei die gelbe Farbe eine Kolokalisation anzeigt. Pfeile zeigen zu einer nichttransfizierten Zelle, weiche sehr wenig Kreuzreaktivität zwischen den Antikörpern zeigt. Balken, 1 μM.
7A–7D zeigen, dass die Überexpression von PIN1 den durch NIMA induzierten, mitotischen Arrest verzögert und einen spezifischen G2-Arrest in HeLa-Zellen induziert. 7A zeigt die Ergebnisse von tTA-1-Zellen, die mit nimA und PIN1 oder einem Kontrollvektor kotransfiziert wurden. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden die Zellen fixiert und mit dem M2-mAk und dem Hoechst-Farbstoff doppelt markiert, gefolgt durch das Auszählen des prozentualen Anteils der Zellen, die sich abrundeten und eine Kondensation von Chromatin aufwiesen, in einer Probe von mindestens 250 NIMA exprimierenden Zellen. Diese Daten stellen den Durchschnittswert von zwei unabhängigen Experimenten dar.
7B, C und D zeigen tTA-1-Zellen, die 48 h nach der Transfektion mit einem PIN1-Expressionsvektor oder dem Kontrollvektor mit dem 12CA5-mAk und anschließend mit den FITC-konjugierten sekundären Antikörpern und Propidiumjodid gefärbt wurden, gefolgt durch eine FACS-Analyse. Basierend auf der Intensität von FITC der PIN1-transfizierten Zellen wurden die Zellen in zwei Populationen mit 12CA5-negativen (B) oder -positiven Zellen (C) unterteilt und die Profile des Zellzyklus wurden bestimmt, um sie mit solchen Zellen zu vergleichen, die nur mit Vektor transfiziert wurden (A).
8 zeigt, dass die Abreichung von Pin1/Ess1 zu einem mitotischen Arrest und zur nukleären Fragmentierung in Hefe führt. Ein Pin1 abhängiger Stamm (YSH12.4) wurde von induzierenden Medien in unterdrückende Medien überführt, geerntet und mit 70% Ethanol zu den angegebenen Zeitpunkten fixiert. Die Zellen wurden mit DAPI oder Propidiumjodid gefärbt, entweder gefolgt von einer Videomikroskopie unter Nomarksi (DIC)- oder Fluoreszenz (DAPI)-Beleuchtung bzw. einer FACS-Analyse. Der Balken ist 10 μm lang und die Insertionen zeigen eine höhere Vergrößerung einer repräsentativen Zelle.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Ein NIMA-ähnlicher Signalweg wird für den G2/M-Übergang in Aspergillus nidulans und menschlichen Zellen benötigt. Die vorliegende Erfindung stellt das erste mit NIMA interagierende Protein, Pin1, mit Säugerursprung und die Verfahren zur Identifizierung anderer mit NIMA interagierender Proteine zur Verfügung. Die Überexpression von PIN1 und die Pin1-Aktivität induzieren einen spezifischen G2-Arrest und verzögern die durch NIMA induzierte Mitose, während der Abreicherung von Pin1 einen mitotischen Arrest und die nucleäre Fragmentierung in knospender Hefe auslöst. Die EMBL-Datenbank-Zugangsnummer H41102 scheint eine 361 bp große Nucleotidsequenz zu beschreiben, die einer EST-Sequenz mit einer nichtdokumentierten Aktivität entspricht. Die EST-Sequenz zeigt weniger als eine 95% Identität zu einer angrenzenden Region einer Pin1 codierenden Nucleinsäure.
In einer ersten Ausführungsform stellt die Erfindung ein isoliertes Säugerprotein zur Verfügung, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es mit der Proteinkinase NIMA assoziiert, die Mitose fördernde Funktion von NIMA hemmt, wenn es überexprimiert wird, und den Eintritt von Zellen in die Mitose induziert, wenn es abgereichert wird. Die C-terminale Domäne eines solchen Proteins katalysiert die cis/trans-Isomerisierung von Peptidyl-Propyl-Peptid-Bindungen. Die N-terminale Domäne assoziiert mit NIMA und enthält mindestens zwei konservierte Tryptophanreste (WW-Domäne). Während die exemplarischen Polynucleotide und Polypeptide der Erfindung auf Pin1 gerichtet sind, ist es selbstverständlich, dass nun jedes PIN-Polynucleotid oder Pin-Protein durch die Verfahren, die hierin beschrieben werden, identifiziert und charakterisiert werden kann.
In einer bevorzugen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein im Wesentlichen reines, mit NIMA interagierendes Protein (Pin1) zur Verfügung, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es ein Molekulargewicht von etwa 18 kD besitzt, wie durch eine reduzierende SDS-PAGE bestimmt wurde, dass es eine Peptidyl-prolyl-cis/trans-Isomerase-Aktivität besitzt, dass es mit der Proteinkinase NIMA assoziiert und dass es im Wesendlichen die Aminosäuresequenz von SEQ ID No: 2 besitzt. Der Ausdruck „im Wesentlichen rein", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf Pin1, das im Wesentlichen frei von anderen Proteinen, Lipiden, Kohlenhydraten oder anderen Materialien ist, mit denen es natürlicherweise assoziiert ist. Der Fachmann kann Pin1 unter Verwendung von Standardtechniken zur Proteinreinigung reinigen. Das im Wesentlichen reine Polypeptid wird eine einzelne Hauptbande auf einem nichtreduzierenden Polyacrylamidgel ergeben. Die Reinheit des Pin1-Polypeptids kann ebenfalls mittels einer Amino-terminalen Aminosäure-Sequenzanalyse bestimmt werden. Das Pin1-Polypeptid schließt funktionelle Fragmente des Polypeptids ein, wenn die Aktivität von Pin1 erhalten bleibt. Kleinere Peptide, die eine der biologischen Aktivitäten von Pin1 enthalten, sind daher in der Erfindung eingeschlossen. Solche Peptide schließen immunologisch reaktive Peptide ein, welche die Herstellung von Antikörpern induzieren können. Das bevorzugte Pin1 der Erfindung ist von einer menschlichen Zelle abgeleitet.
Die Erfindung stellt isolierte Polynucleotide zur Verfügung, die Pin-Polypeptide einschließlich Pin1 codieren. Diese Polynucleotide schließen DNA-, cDNA- und RNA-Sequenzen ein, die Pin1 codieren. Es ist selbstverständlich, dass alle Polynucleotide, die das gesamte oder einen Teil von Pin1 codieren, hierin eingeschlossen sind, wenn sie ein Polypeptid mit Pin1-Aktivität codieren. Solche Polynucleotide schließen natürlich vorkommende, synthetische und absichtlich manipulierte Polynucleotide ein. Ein PIN1-Polynucleotid kann zum Beispiel einer ortsgerichteten Mutagenese unterzogen werden. Die Polynucleotidsequenz für PIN1 schließt ebenfalls Antisense-Sequenzen ein. Die Polynucleotide der Erfindung schließen Sequenzen ein, die als ein Ergebnis des genetischen Codes degeneriert sind. Es existieren 20 natürliche Aminosäuren, die meisten davon sind durch mehr als ein Codon spezifiziert. Daher sind alle degenerierten Nucleotidsequenzen in der Erfindung eingeschlossen, wenn die durch die Nucleotidsequenz codierte Aminosäuresequenz des Pin1-Polypeptids funktionell unverändert ist. Polynucleotide der Erfindung schließen Variationen davon, welche die gleiche Aminosäuresequenz codieren, aber unterschiedliche Codons für einige der Aminosäuren verwenden oder die Nucleotidsequenzen von Spleißvarianten davon ein.
Im Speziellen ist hierin eine DNA-Sequenz enthüllt, die das menschliche PIN1-Gen codiert. Die Sequenz enthält einen offenen Leserahmen, der ein Polypeptid mit 163 Aminosäuren in der Länge codiert. Das Methionin-Startcodon des menschlichen PIN1, das in 2A in Position 25-27 gezeigt ist, ist das erste ATG-Codon. Vorzugsweise handelt es sich bei der menschlichen PIN1-Nucleotidsequenz um SEQ ID No: 1 und bei der abgeleiteten Aminosäuresequenz handelt es sich vorzugsweise um SEQ ID No: 2 (2A).
Das Polynucleotid, das Pin1 codiert, schließt die SEQ ID No: 1, ein sowie die Nucleinsäuresequenzen, die komplementär zu SEQ ID No: 1 (2A) sind. Eine komplementäre Sequenz kann ein Antisense-Nucleotid einschließen. Wenn es sich bei der Sequenz um RNA handelt, sind die Desoxynucleotide A, G, C und T von SEQ ID Nr.: 1 durch die jeweiligen Ribonucleotide A, G, C und U ersetzt. In der Erfindung sind ebenfalls Fragmente der vorstehend beschriebenen Nucleinsäuresequenzen eingeschlossen, die mindestens 15 Basen in der Länge besitzen, die ausreichend sind, um dem Fragment die selektive Hybridisierung an die DNA, die das Protein von SEQ ID No: 2 codiert, unter physiologischen Bedingungen zu erlauben. Im Speziellen bedeutet der Ausdruck „selektive Hybridisierung", dass die Fragmente unter moderaten bis hoch stringenten Bedingungen mit der DNA hybridisieren sollten, die das Pin1-Protein codiert.
Kleinere Veränderungen der primären Aminosäuresequenz von Pin1 können Proteine ergeben, die im Wesentlichen eine äquivalente Aktivität im Vergleich zum Pin1-Polypeptid besitzen, das hierin beschrieben ist. Diese Proteine schließen solche ein, die durch den Ausdruck „die im Wesentlichen die Aminosäuresequenz von SEQ ID No: 2 besitzen" definiert sind. Solche Veränderungen können absichtlich wie z.B. mittels ortsgerichteter Mutagenese oder spontan erfolgen. Jedes der Polypeptide, die durch diese Veränderungen hergestellt wurden, ist hierin eingeschlossen, wenn die biologische Aktivität von Pin1 noch existiert. Des weiteren kann die Deletion von einer oder von mehreren Aminosäuren ebenfalls zu einer Veränderung der Struktur des daraus resultierenden Moleküls führen, ohne dass seine biologischen Aktivität signifikant verändert würde. Dies kann zu der Entwicklung eines kleineren aktiven Moleküls führen, das einen weiter gefächerten Nutzen besitzen würde. Zum Beispiel können die Amino- oder Carboxyl-terminalen Aminosäuren entfernt werden, die für die biologische Aktivität von Pin1 nicht notwendig sind.
Das Pin1-Polypeptid der Erfindung, das durch das Polynucleotid der Erfindung codiert wird, schließt die offenbarte Sequenz (SEQ ID No: 2, 2A) und konservative Variationen davon ein. Der Ausdruck „konservative Variationen", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet den Austausch eines Aminosäurerestes durch einen anderen, biologisch ähnlichen Rest. Beispiele von konservativen Variationen schließen die Substitution eines hydrophoben Restes wie z.B. Isoleucin, Valin, Leucin oder Methionin durch einen anderen oder die Substitution eines polaren Restes durch einen anderen ein, wie z.B. die Substitution von Arginin für Lysin, Glutaminsäure für Asparaginsäure oder Glutamin für Asparagin und dergleichen. Der Ausdruck „konservative Variation" schließt ebenfalls die Verwendung einer substituierten Aminosäure anstelle einer nicht substituierten, ursprünglichen Aminosäure ein, vorausgesetzt, dass die Antikörper, die gegen das substituierte Polypeptid hergestellt werden, ebenfalls mit dem nicht substituierten Polypeptid immunologisch reagieren.
Die DNA-Sequenzen der Erfindung können durch verschiedene Verfahren erhalten werden. Zum Beispiel kann die DNA unter Verwendung von Hybridisierungstechniken isoliert werden, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind. Diese schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf: 1) die Hybridisierung genomischer oder cDNA-Bibliotheken mit Sonden, um homologe Nucleotidsequenzen zu detektieren, 2) die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) bei genomischer DNA oder cDNA unter Verwendung von Primern, die sich an die DNA-Sequenz des Interesses anlagern können und 3) die Durchmusterungsanalyse von Expressions-Bibliotheken mit Antikörpern, um clonierte DNA-Fragmente zu detektieren, die sich strukturelle Merkmale teilen.
Vorzugsweise ist das PIN-Polynucleotid der Erfindung (z.B. PIN1) von einem Säugerorganismus abgeleitet und am stärksten bevorzugt vom Menschen. Die Durchmusterungsverfahren, die auf der Hybridisierung von Nucleinsäuren basieren, ermöglichen es, jede Gensequenz von jedem Organismus zu isolieren, vorausgesetzt, dass die geeignete Sonde verfügbar ist. Oligonucleotid-Sonden, die einem Teil der Sequenz entsprechen, die das in Frage kommende Protein codiert, können chemisch synthetisiert werden. Dies setzt voraus, dass kurze Oligopeptidbereiche der Aminosäurensequenz bekannt sein müssen. Die DNA-Sequenz, die das Protein codiert, kann von dem genetischen Code abgeleitet werden, es muss jedoch die Degeneration des Codes in Betracht gezogen werden. Es ist möglich, eine Reaktion mit gemischten Zusätzen durchzuführen, wenn die Sequenz degeneriert ist. Dies schließt ein heterogenes Gemisch von denaturierter doppelsträngiger DNA ein. Für ein solches Absuchen wird die Hybridisierung vorzugsweise entweder mit einzelsträngiger DNA oder mit denaturierter doppeisträngiger DNA durchgeführt. Die Hybridisierung ist besonders bei der Detektion von cDNA-Clonen nützlich, die von Quellen abgeleitet wurden, bei denen nur eine sehr geringe Menge von mRNA-Sequenzen, die das Polypeptid des Interesses betreffen, vorhanden sind. Mit anderen Worten, durch die Verwendung von stringenten Bedingungen bei der Hybridisierung, die darauf gerichtet sind, eine unspezifische Bindung zu vermeiden, ist es zum Beispiel möglich, eine Darstellung eines spezifischen cDNA-Clons mittels autoradiographischer Sichtbarmachung durch die Hybridisierung der Ziel-DNA mit dieser einzelnen Sonde, welche vollständig komplementär ist, in dem Gemisch zu ermöglichen (Wallace et al., Nucl Acid Res 9: 879, 1981; Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
Die Entwicklung von spezifischen DNA-Sequenzen, die PIN codieren, kann ebenfalls erfolgen durch: 1) die Isolation doppelsträngiger DNA-Sequenzen von der genomischen DNA; 2) die chemische Herstellung einer DNA-Sequenz, um die notwendigen Codons für das Polypeptid des Interesses zur Verfügung zu stellen; 3) die in-vitro-Synthese einer doppelsträngigen DNA-Sequenz durch die reverse Transkription von mRNA, die aus einer eukaryontischen Spenderzelle isoliert wurde; und die PCR von genomischer DNA oder cDNA, wobei Primer verwendet werden, die sich an die DNA-Sequenz des Interesses anlagern können. Im letzteren Fall wird schließlich eine doppelsträngige DNA, die komplementär zur mRNA ist, erzeugt, die im Allgemeinen als cDNA bezeichnet wird.
Von den drei vorstehend beschriebenen Verfahren zur Entwicklung spezifischer DNA-Sequenzen für die Verwendung in den rekombinanten Verfahren, ist die Isolation von genomischen DNA-Isolaten die am wenigsten übliche. Dies gilt aufgrund der möglichen Anwesenheit von Introns besonders, wenn es erwünscht ist, eine mikrobielle Expression von Polypeptiden von Säugern zu erhalten.
Die Synthese von DNA-Sequenzen ist häufig das Verfahren der Wahl, wenn die gesamte Sequenz der Aminosäurereste des gewünschten Polypeptidprodukts bekannt ist. Wenn die gesamte Sequenz der Aminosäurereste des gewünschten Polypeptids nicht bekannt ist, dann ist die direkte Synthese der DNA-Sequenzen nicht möglich und das Verfahren der Wahl ist die Synthese der cDNA-Sequenzen. Zu den Standardverfahren zur Isolation von cDNA-Sequenzen des Interesses zählt die Erzeugung von Plasmid oder Phagen tragender cDNA-Biblioheken, die durch die reverse Transkription von mRNA abgeleitet werden, die reichlich in den Spenderzellen vorhanden ist, die einen hohen Spiegel der genetischen Expression besitzen. Wenn in Kombination mit der Technologie der Polymerase-Ketten-Reaktion verwendet, können sogar seltene Expressionsprodukte cloniert werden. In solchen Fällen, in denen wichtige Anteile der Aminosäuresequenz des Polypeptids bekannt sind, kann die Herstellung von markierten einzel- oder doppelsträngigen Sequenzen von DNA- oder RNA-Sonden, die eine Sequenz verdoppeln, die vermeintlich in der Ziel-cDNA vorhanden ist, in einem Verfahren der DNA/DNA-Hybridisierung verwendet werden, welches an den clonierten Kopien der cDNA durchgeführt wird, die in eine einzelsträngige Form denaturiert wurden (Jay et al., Nucl Acid Res 11: 2325, 1983).
Eine cDNA-Expressionsbibliothek wie z.B. Lambda gt11 kann indirekt nach PIN-Peptiden, die wenigstens ein Epitop besitzen, durchgemustert werden, wobei Antikörper verwendet werden, die spezifisch für PIN sind. Solche Antikörper können entweder polyclonal oder monoclonal abgeleitet sein und können dazu verwendet werden, Expressionsprodukte zu detektieren, die einen Hinweis auf die Anwesenheit einer PIN1-cDNA geben.
DNA-Sequenzen, die Pin1 codieren, können in vitro durch den DNA-Transfer in eine geeignete Wirtszelle exprimiert werden. „Wirtszellen" sind Zellen, in denen ein Vektor vermehrt und dessen DNA exprimiert werden kann. Der Ausdruck schließt ebenfalls jeden Nachkommen der betreffenden Wirtszelle ein. Es ist selbstverständlich, dass nicht alle Nachkommen identisch zu der Elternzelle sein müssen, da Mutationen vorhanden sein können, die während der Replikation auftreten. Solche Nachkommen sind jedoch eingeschlossen, wenn der Ausdruck „Wirtszelle" verwendet wird. Verfahren zum stabilen Transfer, welches bedeutet, dass die fremde DNA kontinuierlich im Wirt erhalten bleibt, sind auf dem Fachgebiet bekannt.
In der vorliegenden Erfindung können die PIN1-Polynucleotidsequenzen in einen rekombinanten Expressionsvektor eingebracht werden. Der Ausdruck „rekombinanter Expressionsvektor" bezieht sich auf ein Plasmid, ein Virus oder ein anderes Vehikel, das auf dem Fachgebiet bekannt ist und welches durch die Insertion oder die Aufnahme der genetischen Sequenz von PIN manipuliert wurde. Solche Expressionsvektoren enthalten eine Promotorsequenz, welche die effiziente Transkription der eingeführten genetischen Sequenz durch den Wirt ermöglicht. Der Expressionsvektor enthält typischerweise einen Ursprung der Replikation, einen Promotor sowie spezifische Gene, welche die phänotypische Auswahl der transformierten Zellen ermöglichen. Vektoren, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, schließen den T7-basierenden Expressionsvektor zur Expression in Bakterien (Rosenberg et al., Gene 56: 125, 1987), den pMSXND-Expressionsvektor zur Expression in Säugerzellen (Lee und Nathans, J Biol Chem 263: 3521, 1988) und die Baculovirus abgeleiteten Vektoren zur Expression in Insektenzellen ein, sind aber nicht auf diese beschränkt. Das DNA-Segment kann im Vektor vorhanden sein, wobei es funktionell mit regulatorischen Elementen wie zum Beispiel einem Promotor (z.B. T7, Metallothionein I, auf Tetracyclin ansprechender Promotor oder Polyhedrin-Promotoren) verbunden ist.
Polynucleotidsequenzen, die Pin1 codieren, können entweder in Prokaryonten oder in Eukaryonten exprimiert werden. Die Wirte können mikrobielle Organismen, Hefe-, Insekten- und Säugerorganismen einschließen. Die Verfahren zur Expression von DNA-Sequenzen, die eukaryontische oder virale Sequenzen in Prokaryonten haben, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Biologisch funktionelle virale und Plasmid-DNA-Vektoren, welche zur Expression und zur Replikation in einem Wirt fähig sind, sind auf dem Fachgebiet bekannt. Solche Vektoren werden verwendet, um die DNA-Sequenzen der Erfindung aufzunehmen.
Die Transformation einer Wirtszelle mit rekombinanter DNA kann durch konventionelle Techniken durchgeführt werden, die dem Fachmann gut bekannt sind. Wenn der Wirt ein Prokaryont wie z.B. E. coli ist, können kompetente Zellen, die zur Aufnahme von DNA fähig sind, von Zellen hergestellt werden, die nach einer exponentiellen Wachstumsphase geerntet und anschließend mittels des CaCl₂-Verfahrens behandelt werden, wobei Verfahren verwendet werden, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind. In einer anderen Ausführungsform kann MgCl₂ oder RbCl verwendet werden. Die Transformation kann ebenfalls nach der Erzeugung eines Protoplasten aus der Wirtszelle durchgeführt werden, falls dies erwünscht ist.
Wenn der Wirt ein Eukaryont ist, können solche Verfahren der Transfektion von DNA wie Calcium-Phosphat-Kopräzipitation oder konventionelle mechanische Verfahren wie z.B. Mikroinjektion, Elektroporation, die Insertion eines Plasmids, das in Liposomen eingeschlossen ist, oder virale Vektoren verwendet werden. Eukaryontische Zellen können ebenfalls mit DNA-Sequenzen, die das PIN der Erfindung codieren, und einem zweiten fremden DNA-Molekül, welches einen selektierbaren Phänotyp wie z.B. das Herpes simplex-Thymidinkinase-Gen codiert, kotransfiziert werden. Ein anderes Verfahren ist die Verwendung eines eukaryontischen, viralen Vektors wie z.B. das Affen-Virus 40 (SV40) oder das Rinder-Papillom-Virus, um eukaryontische Zellen transient zu infizieren oder zu transformieren und das Protein zu exprimieren (vergl. zum Beispiel „Eukaryotic Viral Vectors", Cold Spring Harbor Labortory, Gluzman Hrsg., 1982).
Die Isolation und die Reinigung eines mikrobiell exprimierten Polypeptids oder von Fragmenten davon, die durch die Erfindung zur Verfügung gestellt werden, kann durch konventionelle Verfahren durchgeführt werden, einschließlich der präparativen Chromatographie und der immunologischen Trennungen, die monoclonale oder polyclonale Antikörper involvieren. Zum Beispiel könnte ein Fachmann die Affinitätsreinigung mittels der (His)₆-Markierung verwenden, die in den hierin enthaltenen BEISPIELEN beschrieben wird.
Die Pin-Polypeptide der Erfindung können ebenfalls dazu verwendet werden, um Antikörper herzustellen, die immunreaktiv sind oder an Epitope des Pin-Polypeptids binden. Antikörper, die im Wesentlichen aus vereinigten monoclonalen Antikörpern mit unterschiedlichen Epitopspezifitäten bestehen, sowie bestimmte monoclonale Antikörperherstellungen werden zur Verfügung gestellt. Monoclonale Antikörper werden von Fragmenten des Proteins, die ein Antigen enthalten, hergestellt, wobei Verfahren verwendet werden, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind (Köhler et al., Nature 256: 495, 1975; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Hrsg., 1989).
Der Ausdruck „Antikörper", wie er in dieser Erfindung verwendet wird, schließt intakte Moleküle sowie Fragmente davon wie z.B. Fab, F(ab')₂ und Fv ein, die zur Bindung an die epitopische Determinante fähig sind. Diese Antikörperfragmente behalten eine gewisse Fähigkeit, selektiv an ihr Antigen oder ihren Rezeptor zu binden, und sind wie nachfolgend definiert:

(1) Fab, das Fragment, das ein monovalentes, Antigen bindendes Fragment eines Antikörpermoleküls enthält, kann durch die Spaltung eines gesamten Antikörpers mit dem Enzym Papain hergestellt werden, um eine intakte leichte Kette und eine Anteil einer schweren Kette zu erhalten;
(2) Fab', das Fragment eines Antikörpermoleküls kann durch die Behandlung des gesamten Antikörpers mit Pepsin, gefolgt von einer Reduktion, erhalten werden, um eine intakte leichte Kette und einen Anteil der schweren Kette zu erhalten; es werden zwei Fab'-Fragmente pro Antikörpermolekül erhalten.
(3) (Fab')₂, das Fragment des Antikörpers, das durch die Behandlung des gesamten Antikörpers mit dem Enzym Pepsin ohne die nachfolgende Reduktion erhalten werden kann; F(ab')₂ ist ein Dimer von zwei Fab'-Fragmenten, die durch zwei Disulfid-Bindungen zusammengehalten werden;
(4) Fv, das als ein gentechnisch hergestelltes Fragment definiert ist, das die variable Region der leichten Kette und die variable Region der schweren Kette als zwei Ketten exprimiert enthält; und
(5) Einzelketten-Antikörper („SCA"), der als gentechnisch hergestelltes Molekül definiert ist, das die variable Region der leichten Kette und die variable Region der schweren Kette enthält, die durch einen geeignetem Polypeptid-Linker als ein gentechnisch fusioniettes Einzelkettenmolekül verbunden sind.

Die Verfahren zur Herstellung dieser Fragmente sind auf dem Fachgebiet bekannt. (Vergl. zum Beispiel Harlow und Lane, „Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988), welches hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird).
Der Ausdruck „Epitop", wie er in dieser Erfindung verwendet wird, bezeichnet jede antigene Determinante eines Antigens, an der das Paratop eines Antikörpers bindet. Epitopische Determinanten bestehen im Allgemeinen aus chemisch aktiven Oberflächengruppierungen von Molekülen wie z.B. Aminosäuren oder Zuckerseitenketten und besitzen im Allgemeinen spezifische dreidimensionale strukturelle Kennzeichen sowie spezifische Ladungskennzeichen.
Antikörper, die an das Pin1-Polypeptid der Erfindung binden, können hergestellt werden, indem ein intaktes Polypeptid oder Fragmente, die kleine Peptide des Interesses enthalten, als immunisierendes Antigen verwendet werden. Zum Beispiel kann es wünschenswert sein, Antikörper herzustellen, die spezifisch an die N- oder an die C-terminalen Domänen von Pin1 binden. Das Polypeptid oder ein Peptid, das zu Immunisierung eines Tieres verwendet wird, kann von einer translatierten cDNA oder durch eine chemische Synthese abgeleitet sein und die mit einem Trägerprotein konjugiert werden, wenn dies erwünscht ist. Solche häufig verwendeten Träger, die chemisch mit dem Peptid verbunden sind, schließen KLH ("keyhole limpet hemocyanin"), Thyroglobulin, Rinderserumalbumin (BSA) und Tetanustoxoid ein. Das verbundene Peptid wird anschließend verwendet, um das Tier (z.B. eine Maus, eine Ratte oder ein Kaninchen) zu immunisieren.
Falls es erwünscht ist, können polyclonale oder monoclonale Antikörper weiter gereinigt werden, zum Beispiel durch die Bindung an und die Elution von einer Matrix, an die das Polypeptid oder ein Peptid, welches gegen den Antikörper hervorgerufen wurde, gebunden ist. Der Fachmann wird verschiedene Techniken, die in der Immunologie für die Reinigung und/oder der Konzentration von polyclonalen Antikörpern sowie von monoclonalen Antikörpern verbreitet sind, kennen (vergl. zum Beispiel Coligan et al., Einheit 9, Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1994, welches durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird).
Es ist ebenfalls möglich, die anti-idiotypische Technologie zur Herstellung eines monoclonalen Antikörpers zu verwenden, der ein Epitop nachahmt. Ein anti-idiotypischer, monoclonaler Antikörper, der zu einem ersten monoclonalen Antikörper hergestellt wurde, wird eine Bindungsdomäne in der hypervariablen Region haben, welche die „Kopie" des Epitops ist, das durch den ersten monoclonalen Antikörper gebunden wird.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung eines Proteins zur Verfügung, das die Mitose fördernde Funktion der Proteinkinase NIMA hemmt. Das Verfahren umfasst die Kultivierung transformierter Zellen, die nachfolgendes enthalten: ein Nucleinsäurekonstrukt, welches eine DNA bindende Domäne umfasst, die funktionell mit der codierenden Sequenz von NIMA oder funktionellen Fragmente davon verbunden ist; eine Nucleinsäure-Bibliothek, in der jedes Mitglied der Bibliothek eine transaktivieren Domäne umfasst, die funktionell mit einer Protein codierenden Sequenz verbunden ist; und ein Nucleinsäure-Reporterkonstrukt, das ein Response-Element für die DNA bindende Domäne umfasst, die funktionell mit einem Reporter-Gen verbunden ist, und das Überwachen eines Nachweises der Expression der Reporter-Gens.
Der Ausdruck „hemmen" bezieht sich auf ein Herabsetzen der Mitose fördernden Funktion von der Proteinkinase NIMA. Die „Mitose fördernde Funktion von NIMA" bezieht sich auf die Fähigkeit von NIMA, das Fortschreiten des G2/M- Übergangs in einer Zelle zu fördern. Der Ausdruck „funktionell verbunden mit" bezieht sich auf die funktionelle Verbindung zwischen dem Promotor oder einer regulatorischen Sequenz und der kontrollierten Nucleinsäuresequenz; die kontrollierte Sequenz und die regulatorische Sequenz oder der Promotor sind typischerweise kovalent miteinander verbunden, vorzugsweise durch konventionelle Phosphodiesterbindungen.
Das Verfahren der Erfindung umfasst die Kultivierung von Zellen unter geeigneten Bedingungen, wobei diese durch Standardverfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind und wie es vorstehend beschrieben wurde, transformiert wurden. Die transformierten Zellen enthalten das Nachfolgende: ein Nucleinsäurekonstrukt, das eine DNA bindende Domäne, die funktionell mit der codierenden Sequenz von NIMA oder funktionellen Fragmente davon assoziiert ist, umfasst. Der Ausdruck „DNA bindende Domäne", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf eine Nucleinsäuresequenz, die eine Erkennungsstelle für ein Protein enthält, welches spezifisch an DNA-Sequenzen bindet. Die codierende Sequenz von NIMA schließt eine Nucleinsäuresequenz ein, die ein Protein codiert, das die biologische Aktivität von NIMA besitzt, wie hierin beschrieben. Das Verfahren schließt „funktionelle Fragmente" von NIMA ein, die weniger als die vollständige Länge der codierenden Sequenz besitzen, die aber ein Protein codieren, das die biologische Aktivität von NIMA besitzt (z.B. eine Ser/Thr-Proteinkinase).
Die transformierten Zellen enthalten ebenfalls eine Nucleinsäure-Bibliothek, in der jedes Mitglied der Bibliothek eine transaktivierende Domäne umfasst, die funktionell mit einer Protein codierenden Sequenz assoziiert ist. Eine „transaktivierende Domäne" bezieht sich auf eine Nucleinsäuresequenz, welche die Transkription aktiviert, aber typischerweise nicht an die DNA binden kann. Eine Nucleinsäure-Bibliothek umfasst eine Clonbank mit genomischen oder komplementären DNA-Sequenzen, die „Protein codierende Sequenzen" sind. Der Ausdruck bezieht sich auf cDNA, die funktionell mit der transaktivierenden Domäne eines Proteins assoziiert ist, wie in den BEISPIELEN beispielhaft erklärt ist.
Die Zellen enthalten ebenfalls ein Nucleinsäure-Reporterkonstrukt, welches ein Response-Element für die DNA bindende Domäne umfasst, die funktionell mit einem Reportergen assoziiert ist. Der Ausdruck „Reporter", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein Gen, welches ein charakteristisches Merkmal oder einen Phänotyp codiert und welches das Überwachen und die Selektion von oder das Absuchen nach einer Zelle erlaubt, die den Marker und daher ein mit NIMA interagierendes Protein enthält. Der Nucleinsäure-Reporter ist ein selektierbarer Marker wie z.B. ein Farbstoffindikator (z.B. lacZ). Andere geeignete Reporter-Gene werden dem Fachmann bekannt sein.
Das System der Protein-Protein-Interaktion, das in den BEISPIELEN hierin exemplarisch dargestellt wird, verwendet vorzugsweise das GAL4-Protein, um die DNA bindenden und die transaktivierenden Domänen zur Verfügung zu stellen (Fields und Song, Nature 340: 245, 1989). Andere Nucleinsäurekonstrukte, welche die codierenden Sequenzen von Proteinen umfassen, die eine DNA bindende und eine transaktivierende Domäne besitzen, werden dem Fachmann bekannt sein und können im Verfahren der Erfindung verwendet werden, um die Hybridkonstrukte zur Verfügung zu stellen.
Das Verfahren der Erfindung beruht auf der Interaktion zwischen dem in der Bibliothek codierten Protein und dem NIMA-Protein oder funktionellen Fragmenten davon, um die Transkription des Reportergens zu aktivieren. Sobald das in der Bibliothek codierte Protein und das NIMA-Protein assoziieren, bringen sie die DNA bindende Domäne und die transaktivierende Domäne in einer engen Nachbarschaft, was in einer transkriptionellen Aktivität resultiert. Das Verfahren stellt daher ein Mittel zu Identifizierung eines Proteins zur Verfügung, das mit der Proteinkinase NIMA interagiert oder assoziiert.
Obwohl das Verfahren der Erfindung, wie es vorstehend beschrieben wurde, bevorzugt ist, ist es selbstverständlich, dass die transformierte Zelle die reversen Konstrukte enthalten kann, z.B. ein Nucleinsäurekonstrukt, das eine transaktivierende Domäne umfasst, die funktionell mit der codierenden Sequenz von NIMA oder mit Fragmenten davon assoziiert ist, und eine Nucleinsäure-Bibliothek, in der jedes Mitglied der Bibliothek eine DNA bindende Domäne umfasst, die funktionell mit einer Protein codierenden Sequenz assoziiert ist.
In der vorliegenden Erfindung sind ebenfalls mit NIMA interagierende Proteine eingeschlossen, die mit dem vorstehend beschriebenen Verfahren identifiziert wurden.
Die Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren für die Kontrolle des Wachstums einer Zelle zur Verfügung, welches das Inkontaktbringen der Zelle mit einer Zusammensetzung, welche die Aktivität von Pin1 moduliert, umfasst. Der Ausdruck „modulieren" bedeutet das Unterdrücken der Expression von PIN1 oder das Unterdrücken der Aktivität von Pin1, wenn es überexprimiert ist, oder die Zunahme der Expression von PIN1 oder der Aktivität von Pin1, wenn es unterexprimiert ist. Das Wachstum einer Zelle wird zum Beispiel durch die Hemmung der Mitose fördernden Funktion von NIMA oder durch die Induktion des Eintritts von Zellen in die Mitose „kontrolliert". Ein Hemmstoff der Aktivität oder des Proteinspiegels von Pin1 würde zum Beispiel zu einem Arrest in der Mitose führen. Daher kann die Aktivität oder der Proteinspiegel von Pin1 herabgesetzt werden, was in der Zelle zu einem mitotischen Arrest führt, oder in einer anderen Ausführungsform kann die Aktivität oder der Proteinspiegel von Pin1 erhöht werden, was die Zellen in der G2-Phase arretiert.
Wenn die Kontrolle des Wachstum einer Zelle mit der Expression des PIN1-Polynucleotids assoziiert ist, können Nucleinsäuresequenzen, welche die Expression von PIN1 auf dem translationellen Niveau stören, verwendet werden. Dieser Ansatz verwendet zum Beispiel eine Antisense-Nucleinsäure, Ribozyme oder Triplex-Stoffe, um die Transkription oder die Translation einer spezifischen PIN-mRNA zu blockieren, entweder durch die Maskierung der mRNA mit einer Antisense-Nucleinsäure oder einem Triplex-Stoff oder durch die Spaltung mit einem Ribozym.
Antisense-Nucleinsäuren sind DNA- oder RNA-Moleküle, die wenigstens zu einem Teil eines spezifischen mRNA-Moleküls komplementär sind (Weintraub, Scientific American 262: 40, 1990). In der Zelle hybridisieren die Antisense-Nucleinsäuren mit der entsprechenden mRNA, wobei ein doppelsträngiges Molekül erzeugt wird. Die Antisense-Nucleinsäuren funktionieren primär über RNaseH vermittelte Degradation der Ziel-mRNA. Das Antisense-Molekül kann ebenfalls die Transkription der mRNA stören, da die Zelle eine mRNA, die doppelsträngig ist, nicht translatieren wird. Es werden Antisense-Oligomere von etwa 15 Nucleotiden bevorzugt, da diese einfach zu synthetisieren sind und es weniger wahrscheinlich als bei größeren Molekülen ist, dass sie Probleme erzeugen, wenn sie in die Zielzelle, die PIN herstellt, eingebracht werden. Die Verwendung von Antisense-Verfahren ist auf dem Fachgebiet gut bekannt (Marcus-Sacura, Anal Biochem 172: 289, 1988).
Die Verwendung eines Oligonucleotids, um die Transkription zu verzögern, ist als Triplex-Strategie bekannt, da sich das Oligomer um eine doppelsträngige DNA windet, wobei eine dreisträngige Helix erzeugt wird. Daher können diese Triplex-Verbindungen so entwickelt werden, dass sie eine einzigartige Stelle eines ausgewählten Gens erkennen (Maher et al., Antisense Res and Dev 1 (3): 227, 1991; Helene C, Anticancer Drug Design 6 (6): 569, 1991).
Ribozyme sind RNA-Moleküle, welche die Fähigkeit besitzen, eine andere einzeisträngige RNA spezifisch in einer Weise zu spalten, die analog zu der von DNA-Restriktionsendonucleasen ist. Durch die Modifikation von Nucleotidsequenzen, die diese RNAs codieren, ist es möglich, Moleküle herzustellen, die spezifische Nucleotidsequenzen in einem RNA-Molekül erkennen und diese spalten (Cech, J Amer Med Assn 260: 3030, 1988). Ein großer Vorteil dieses Ansatzes ist, dass aufgrund der Sequenzspezifität nur mRNAs mit bestimmten Sequenzen inaktiviert werden.
Andere Hemmstoffe von Pin schließen PPlase-Inhibitoren ein. Zum Beispiel sind immunsuppressive Arzneistoff wie Cyclosporin A und FK506 im Verfahren der Erfindung nützliche PPlase-Hemmstoffe zur Hemmung einiger Pin-Proteine. Das Pin1-Protein oder ein anderes Pin-Protein der Erfindung ist ebenfalls nützlich für das Absuchen nach anderen Hemmstoffen. Zum Beispiel wird ein vermeintlicher PPlase-Hemmstoff mit dem Pin1-Protein unter geeigneten Bedingungen inkubiert, um zu ermöglichen, dass die enzymatische Aktivität von Pin1 exprimiert und gemessen wird, und der Spiegel der Aktivität wird in Anwesenheit und in Abwesenheit des Hemmstoffs untersucht, um den Effekt auf die Pin1-Aktivität zu bestimmen.
Die Pin1-Aktivität kann ebenfalls in Anwesenheit eines Aktivators erhöht werden. Die Expression von PIN1 kann zum Beispiel durch die Anwesenheit eines Enhancers erhöht werden. Die Stimulation der Pin1-Aktivität oder die Überexpression von PIN1 arretiert die Zellen in der G2-Phase und hemmt die Mitose fördernde Funktion von NIMA. Die cis-wirkenden Elemente, welche die Gene kontrollieren, werden Promotoren, Enhancer oder Silencer genannt. Promotoren sind neben der Startseite der Transkription positioniert und funktionieren in einer orientierungsabhängigen Weise, während Enhancer- und Silencer-Elemente, welche die Aktivität des Promotors modulieren, flexibel in Bezug auf ihre Orientierung und Entfernung zum Startpunkt der Transkription sind. Ein Fachmann wird Verfahren zur Stimulation der Expression von PIN1 zum Beispiel durch das Einfügen eines Enhancers kennen, um die PIN1-Expression zu stimulieren. Der Effekt eines Enhancers oder eines anderen regulatorischen Elements kann durch Standardverfahren des Fachgebiets bestimmt werden (z.B. durch Northern-Blot-Analysen, nucleäre Run-off-Test).
Die Aktivität von Pin1 kann durch einen Aktivator beeinflusst werden. Ein „Aktivator", wie er hierin verwendet wird, schließt zum Beispiel ein Protein oder ein kleines Molekül wie z.B. eine organische Verbindung ein, das die Aktivität oder den Proteinspiegel von Pin1 erhöht, so dass eine Zelle in der G2-Phase arretiert. Ein Aktivator kann durch die Inkubation von Pin1 und einem vermeintlichen Aktivator unter Bedingungen identifiziert werden, die eine Interaktion zwischen den Komponenten und das Messen des Effekts des Aktivators auf Pin1 ermöglichen. Zum Beispiel könnte bestimmt werden, ob Zellen in der G2-Phase arretiert werden (z.B. durch eine erhöhte Aktivität von Pin1) oder ob Zellen im Zyklus durch die G2-Phase in die M-Phase fortschreiten (z.B. durch eine FACS-Analyse oder durch eine Analyse mit markierten Kernen).
Das Pin1-Protein der Erfindung ist in einem Durchmusterungsverfahren nützlich, um Verbindungen oder Zusammensetzungen zu identifizieren, welche die Aktivität des Proteins oder die Expression des Gens beeinflussen. In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung daher ein Verfahren zur Identifizierung einer Zusammensetzung, die Pin1 beeinflusst, bereit, welches die Inkubation der Komponenten, welche die Zusammensetzung, die getestet werden soll (z.B. ein Arzneistoff oder ein Protein), und Pin1 einschließt, unter Bedingungen umfasst, die ausreichend sind, um den Komponenten die Interaktion zu ermöglichen, wobei anschließend der Effekt, den die Zusammensetzung auf die Aktivität oder die Expression von Pin1 hat, gemessen wird. Der beobachtete Effekt auf Pin1 kann entweder hemmend oder stimulierend sein. Zum Beispiel kann der Eintritt der Zellen in die Mitose oder in einen G2-Arrest durch den nucleären Gehalt (z.B. durch Immunfluoreszenz oder durch eine FACS-Analyse, die auf dem DNA-Gehalt basiert) oder durch andere Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, bestimmt werden.
Die Zunahme oder die Abnahme der Transkription/Translation von PIN1 kann durch die Zugabe einer radioaktiven Verbindung wie z.B. ³²P-ATP (für die Kerne) oder ³H-Uridin oder ³⁵S-Met zu dem Gemisch der Komponenten und durch die Beobachtung des radiaktiven Einbaus in das Transkript bzw. in das Protein von PIN1 gemessen werden. In einer anderen Ausführungsform können andere Markierungen verwendet werden, um den Effekt einer Zusammensetzung auf die Transkription/Translation von PIN1 zu bestimmen. Zum Beispiel könnte ein Radioisotop, eine fluoreszierende Verbindung, eine biolumineszierende Verbindung, eine chemilumiszierende Verbindung, ein Metallkomplexbildner oder ein Enzym verwendet werden. Der Fachmann wird andere geeignete Markierungen kennen oder er wird diese unter Verwendung von Routineexperimenten bestimmen können. Die Analyse des Effekts einer Verbindung auf PIN1 wird zum Beispiel mittels Standardverfahren des Fachgebiets wie z.B. Northern-Blot-Analysen (um die Genexpression zu messen) oder SDS-PAGE (um das Proteinprodukt zu messen) durchgeführt. Des weiteren kann die biologische Aktivität von Pin1 zum Beispiel ebenfalls durch die Aufnahme einer Markierung in den Zellkern bestimmt werden.
Das Verfahren der Erfindung, das vorstehend beschrieben wurde, schließt ebenfalls die Identifizierung eines Proteins ein, das mit dem Pin1-Protein assoziiert. Das Verfahren umfasst die Inkubation des Proteins mit dem Pin1-Protein oder mit einer rekombinanten Zelle, die Pin1 exprimiert, unter Bedingungen, die ausreichend sind, um den Komponenten die Interaktion zu ermöglichen und um den Effekt des Proteins auf die Aktivität oder die Expression von Pin1 zu bestimmen. In einer anderen Ausführungsform könnte der Fachmann das Zwei-Hybrid-System verwenden, das vorstehend beschrieben wurde, um ein Protein zu identifizieren, das mit dem Pin1-Protein interagiert oder assoziiert. Wenn sie identifiziert sind, können solche Pin/PIN-assoziierten Proteine anschließend als Ziele zur Entwicklung von Arzneistoffen verwendet werden.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung einer zellproliferierenden Erkrankung zur Verfügung. Das Verfahren umfasst die Verabreichung einer Menge des Pin1-Hemmstoffes, die effektiv ist, um den Eintritt der Zellen in die Mitose oder in die Apoptose zu induzieren, an eine bedürftige Person, die einer solchen Behandlung bedarf. Die „Menge des Pin1-Hemmstoffes, die effektiv ist, um den Eintritt der Zellen in die Mitose zu induzieren" bedeutet, dass zum Beispiel die Menge des Polypeptids, des Peptids, des Polynucleotids oder des monoclonalen Antikörpers, wenn sie verwendet wird, von ausreichender Quantität ist, um die Erkrankung zu verbessern. Der Ausdruck „zellproliferative Erkrankung" bezeichnet sowohl bösartige als auch nicht bösartige Zellpopulationen, die sich morphologisch häufig von dem umgebenden Gewebe sowohl morphologisch als auch genotypisch zu unterscheiden scheinen. Bösartige Zellen (z.B. Krebs) entwickeln sich als Ergebnis eines mehrstufigen Prozesses. Das PIN1-Polypeptid, welches ein Antisense-Molekül ist, ist nützlich bei der Behandlung von bösartigen Erkrankungen verschiedener Organsysteme. Zum Beispiel kann das Verfahren nützlich bei der Behandlung von bösartigen Erkrankungen von den verschiedenen Organsystemen wie zum Beispiel Lunge, Brust, Lymph-, Gastrointestinal- und Urogenitaltrakt sowie von Adenokarzinomen sein, die bösartige Erkrankungen wie z.B. Kolonkrebs, Nierenzellkarzinom, Prostatakrebs, Leukämie, Brustkrebs, großzelliges Karzinom der Lunge, Dünndarmkrebs und Speiseröhrenkrebs einschließen. Im Wesentlichen kann jede Erkrankung, die ätiologisch mit einer veränderten Expression von PIN1 verbunden ist, auch dafür in Betracht gezogen werden, dass sie für die Behandlung mit einem PIN1 supprimierenden/hemmenden Wirkstoff empfänglich ist.
Das Verfahren ist ebenfalls nützlich für die Behandlung nicht bösartiger oder immunologisch verwandter zellproliferativer Erkrankungen wie z.B. Psoriasis, Pemphigus vulgaris, Bechet-Syndrom, akutes Atemwegserkrankungssyndrom (ARES), ischämische Herzerkrankung, Post-Dialyse-Syndrom, rheumatoide Arthritis, erworbenes Immunschwächesyndrom, Gefäßentzündung, Lipidhistiozytose, septischer Schock und Entzündung im Allgemeinen. Im Wesentlichen würde jede Erkrankung, die ätiologisch mit PIN1 verbunden ist, dafür in Betracht gezogen werden, dass sie für eine Behandlung empfänglich ist.
Für die Ziele der Erfindung kann ein Antikörper oder eine Nucleinsäuresonde, die spezifisch für Pin1 ist, verwendet werden, um das Pin1-Polypeptid (unter Verwendung eines Antikörpers) oder das Pin1-Polynucleotid (unter Verwendung einer Nucleinsäuresonde) in biologischen Flüssigkeiten oder Geweben zu detektieren. Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Detektion einer zellproliferativen Erkrankung zur Verfügung, welches das Inkontaktbringen eines anti-PIN1-Antikörpers oder einer Nucleinsäuresonde mit einer Zelle umfasst, von der angenommen wird, dass sie eine PIN1 assoziierte Erkrankung hat, und das Detektieren der Bindung an den Antikörper oder die Nucleinsäuresonde umfasst. Der PIN1 reaktive Antikörper oder die Nucleinsäuresonde wird vorzugsweise mit einer Verbindung markiert, die eine Bindung an PIN1 ermöglicht. Jede Probe, die eine detektierbare Menge Antigen oder Polynucleotid enthält, kann verwendet werden. Der Spiegel von PIN1 in der verdächtigen Zelle kann mit dem Spiegel in einer normalen Zelle verglichen werden, um zu bestimmen, ob das Individuum unter einer PIN1-assoziierten, zellproliferativen Erkrankung leidet. Vorzugsweise ist das Individuum ein Mensch.
Wenn die Zellkomponente eine Nucleinsäure ist, kann es notwendig sein, die Nucleinsäure vor der Bindung an eine PIN1-spezifische Sonde zu amplifizieren. Vorzugsweise wird die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) verwendet, andere Verfahren zur Amplifikation von Nucleinsäure wie z.B. die Ligase-Ketten-Reaktion (LCR), die ligierte aktivierte Transkription (LAT) und die Nucleinsäuresequenz basierende Amplifikation (NASBA) können jedoch ebenfalls verwendet werden.
Die Antikörper der Erfindung können in jedem Individuum verwendet werden, in dem es erwünscht ist, in vitro oder in vivo eine Immundiagnose oder eine Immuntherapie anzuwenden. Die Antikörper der Erfindung sind zum Beispiel für die Verwendung in Immunanalysen geeignet, in denen sie in einer flüssigen Phase oder gebunden an einem Festphasenträger verwendet werden können. Zusätzlich können die Antikörper in diesen Immunanalysen in verschiedenen Weisen nachweisbar markiert werden. Beispiele von Arten der Immunanalysen, welche die Antikörper der Erfindung verwenden können, sind kompetitive und nicht kompetitive Immunanalysen, entweder in einem direkten oder in einem indirekten Format. Beispiele solcher Immunanalysen sind die Radioimmunanalyse (RIA) und die (immunometrische) Sandwich-Analyse. Der Nachweis des Antigens unter Verwendung der Antikörper der Erfindung kann erfolgen, indem die Immunanalysen verwendet werden, die entweder in einer Vorwärts-, Rückwärts- oder in einer Simultanrichtung durchgeführt werden, einschließlich immunhistochemischen Analysen von physiologischen Proben. Der Fachmann wird andere Formate der Immunanalysen kennen oder kann diese auf einfacher Weise ohne übermäßige Experimente ermitteln.
Verschiedene virale Vektoren, die zur Gentherapie verwendet werden können, wie hierin erklärt wurde, schließen das Adenovirus, das Herpesvirus, das Vacciniavirus oder vorzugsweise ein RNA-Virus wie z.B. ein Retrovirus ein. Vorzugsweise ist der retrovirale Vektor von einem murinen oder einem Vogel-Retrovirus abgeleitet. Beispiele von retroviralen Vektoren, in denen ein einzelnes fremdes Gen eingebracht werden kann, schließen das murine Moloney-Leukämie- Virus (MoMuLV), das murine Harvey-Sarcom-Virus (HaMuSV), das murine Brusttumor-Virus (MuMTV) und das Rous-Sarcom-Virus (RSV) ein. Wenn das Individuum ein Mensch ist, wird vorzugsweise ein Vektor wie z.B. das Gibbon-Affen-Leukämie-Virus (GaLV) verwendet. Eine Anzahl zusätzlicher retroviraler Vektoren kann multiple Gene aufnehmen. Andere virale Vektoren schließen DNA-Vektoren wie z.B. das Adenovirus und das Adeno-assoziierte Virus (AAV) ein. Alle diese Vektoren können ein Gen für eine selektierbare Markierung transferieren oder aufnehmen, so dass die transduzierte Zelle identifiziert und generiert werden kann. Durch das Einbringen einer PIN1-Sequenz des Interesses in den viralen Vektor zusammen mit einem anderen Gen, das zum Beispiel den Liganden für einen Rezeptor auf einer spezifischen Zielzelle codiert, wird der Vektor zielspezifisch. Retrovirale Vektoren können zum Beispiel durch das Anbringen eines Zuckers, eines Glycolipids oder eines Proteins zielspezifisch hergestellt werden. Ein bevorzugtes Ansteuern eines Ziels wird durch die Verwendung eines Antikörpers erreicht, damit der retrovirale Vektor ein Ziel ansteuert. Der Fachmann wird spezifische Polynucleotidsequenzen, die in ein retrovirales Genom eingebracht oder an einer viralen Hülle angebracht werden können, um die zielspezifische Überbringung des retroviralen Vektors zu ermöglichen, der das PIN1-Antisense-Polynucleotid enthält, kennen oder er kann diese auf einfacher Weise ohne übermäßige Experimente ermitteln. Zusätzlich kann der virale Vektor ein regulatorisches Element wie z.B. einen auf Tetracyclin ansprechenden Promotor (induzierbar oder unterdrückbar) enthalten, das funktionell an eine Polynucleotidsequenz gebunden ist.
Da rekombinante Retroviren defekt sind, benötigen sie Hilfe, um infektiöse Vektorpartikel herzustellen. Diese Hilfe kann zum Beispiel zur Verfügung gestellt werden, indem eine Helfer-Zelllinie verwendet wird, die Plasmide enthält, die jedes der strukturellen Gene des Retrovirus unter der Kontrolle der regulatorischen Sequenzen innerhalb der LTR codiert. Diesen Plasmiden fehlt eine Nucleotidsequenz, die dem Verpackungsmechanismus ermöglicht, ein RNA-Transkript zur Einkapselung zu erkennen. Helferzelllinien, die Deletionen des Verpackungssignals besitzen, schließen zum Beispiel ψ2, PA317 und PA12 ein, sind aber nicht auf diese beschränkt. Diese Zelllinien stellen leere Viruspartikel her, da kein Genom verpackt wird. Wenn ein retroviraler Vektor in solche Zellen eingebracht wird, in denen das Verpackungssignal intakt ist, in denen aber die strukturellen Gene durch andere Gene des Interesses ersetzt wurden, kann der Vektor verpackt und Vektor-Virionpartikel hergestellt werden.
Ein weiteres zielgerichtetes Verabreichungssystem für PIN1-Polynucleotide (z.B. Antisense) ist ein kolloides Dispersionssystem. Kolloide Dispersionssysteme schließen Makromolekül-Komplexe, Nano-Kapseln, Microsphären, Kugeln und auf Lipide basierende Systeme ein, einschließlich Öl-in-Wasser-Emulsionen, Mizellen, gemischte Mizellen und Liposomen. Das bevorzugte kolloide System dieser Erfindung ist ein Liposom. Liposomen sind artifizielle Membranvesikel, die als Verabreichungsvehikel in vitro und in vivo nützlich sind. Es wurde gezeigt, dass große unilamellare Vesikel (LUV), die in der Größe von 0,2–4,0 μm variieren, einem deutlichen Prozentsatz eines wässrigen Puffers einkapseln können, der große Makromoleküle enthält. RNA, DNA und intakte Virionpartikel können innerhalb des wässrigen Innenraums eingekapselt und an Zellen in einer biologisch aktiven Form verabreicht werden (Fraley et al., Trends Biochem Sci 6: 77, 1981). Zusätzlich zu Säugerzellen wurden Liposomen zur Verabreichung von Polynucleotiden an Pflanzen, Hefe und bakterielle Zellen verwendet. Damit ein Liposom als Gentransfervehikel effizient ist, sollten die nachfolgenden Kennzeichen vorhanden sein: (1) das Einkapseln von den Genen des Interesses mit einer hohen Effizienz, wobei ihre biologische Aktivität nicht beeinträchtigt wird; (2) die bevorzugte und starke Bindung an eine Zielzelle im Vergleich zu einer Nicht-Zielzelle; (3) die Verabreichung des wässrigen Inhalts des Vesikels an das Cytoplasma der Zielzelle mit einer hohen Effizienz; und (4) die akkurate und effiziente Expression der genetischen Information (Mannino et al., Biotechniques 6: 682, 1988).
Das Ansteuern eines Ziels von Liposomen kann basierend auf anatomische und mechanische Faktoren klassifiziert werden. Die anatomische Klassifikation basiert auf dem Spiegel der Selektivität, wie zum Beispiel organspezifisch, zellspezifisch und organellspezifisch. Das mechanistische Ansteuern eines Ziels kann darauf basierend unterschieden werden, ob es passiv oder aktiv ist. Das passive Ansteuern eines Ziels verwendet die natürliche Tendenz von Liposomen, sich an Zellen des Reticulo-Endothelial-Systems (RES) in Organen zu verteilen, die sinusoidale Kapillaren enthalten. Auf der anderen Seite involviert das aktive Ansteuern eines Ziels die Veränderung des Liposoms durch die Verbindung des Liposoms mit einem spezifischen Liganden wie z.B. einem monoclonalen Antikörper, einem Zucker, einem Glycolipid oder einem Protein oder durch die Veränderung der Zusammensetzung oder der Größe des Liposoms, um das zielgerichtete Ansteuern von Organen und Zelltypen zu ermöglichen, die anders als die natürlich vorkommenden Stellen der Lokalisation sind.
Die folgenden Beispiele beabsichtigen die Erfindung darzustellen, nicht aber sie zu beschränken. Während sie typisch für solche sind, die verwendet werden können, sind dem Fachmann andere Verfahren bekannt, die alternativ verwendet werden können.
BEISPIEL 1
MATERIAL UND METHODEN
1. Hefe-Zwei-Hybrid-Durchmusterungsanalyse und cDNA-Isolation
Für die Hefe-Zwei-Hybrid-Durchmusterungsanalyse wurde die nimA-cDNA von Aspergillus nidulans in den pAS2-Vektor (von S Elledge, HHMI, Baylor University) (Durfee et al., 1993; Harper et al., 1993) als Fusion mit der GAL4-DNA-bindenden Domäne eingebracht, woraus NIMA/PAS2 entstand. Eine HeLa-Zellen-Zwei-Hybrid-cDNA-Bibliothek, die Insertionen enthielt, die mit der Transaktivierungsdomäne von GAL4 (Rest 768–881) (erhalten von D. Beach; HHMI, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 12. November, 1995) (Hannon et al., 1993) fusioniert war, wurde mit NIMA/PAS2 in den Hefe-Reporter-Stamm Y190 kotransformiert, der anschließend auf einem Hefe-Dropout-Medium ausplattiert wurde, dem Leu, Trp und His fehlte und das 35 mM 3-Amino-1,2,4-triazol enthielt, und es wurden etwa 10⁶ Transformanten analysiert, wie zuvor beschrieben wurde (Harper et al., 1993). Um die Interaktionseigenschaften der isolierten Clone zu bestimmen, wurden K40M-NIMA, NIMA280-699, NLK1 und eine Leserasterverschiebungsmutante NIMA280-699^FS (eine Basenpaardeletion am Prozessierungspunkt) ebenfalls in den pAS2-Vektor subcloniert, gefolgt von einer Kotransformation der isolierten cDNA-Clone in Y190-Zellen. Um zusätzlich die 5'-nichttranslatierte Sequenz von PIN1 zu erhalten, wurde eine HeLa-Zellen-cDNA-Bibliothek, die von R Fukunaga; Salk Institute, La Jolla, CA hergestellt wurde, mit dem H20-cDNA-Fragment durchgemustert. Die DNA-Sequenz wurde durch das Didesoxynucleotid-Ketten-Terminationsverfahren bestimmt.
2. Isolation der menschlichen NIMA-ähnlichen Kinase1 (NLK1)
Für die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) wurden die drei degenerierten Oligonucleotide
(SEQ ID No: 3):
(SEQ ID No: 4):
und (SEQ ID No: 5):
spezifisch für die katalytischen Domäne V, VII beziehungsweise VIII entworfen, die bei NIMA (Osmani et al., Cell 53: 237, 1988), NPK, eine mit NIMA verwandte Kinase in knospender Hefe (Schweitzer und Philippsen, Mol Gen Genet 234: 164, 1992), und menschlicher HsPK21 (Schultz und Nigg, Cell Growth Differ 4: 821, 1993) konserviert sind. Eine menschliche Plazenta-cDNA-Bibliothek (von R Evans, Salk Institute, La Jolla, CA) wurde als Matrize verwendet. Der PCR-Zyklus betrug 1 min bei 95°C, 2 min bei 42°C und 3 min bei 63°C. PCR-Produkte mit der erwarteten Größe wurden subcloniert und sequenziert. Drei mögliche Clone (Ping-1, -44, -77) wurden entsprechend erhalten und zeigten eine hohe Sequenzidentität zu NIMA bei den abgeleiteten Aminosäuren. Um die vollständige cDNA-Sequenz zu erhalten, wurde das PCR-Produkt von Ping-1 als eine Sonde verwendet, um HeLa-Zellen-cDNA-Bibliotheksfilter, die von XD Fu (Gui et al., Nature 369: 678, 1994) zur Verfügung gestellt wurden, abzusuchen; über dreißig positive Clone wurden erhalten und sie codierten das gleiche Protein, das als NLK1 (NIMA-ähnliche Kinase1) bezeichnet wurde. Die NLK1-cDNA ist 2152 bp groß und codiert 445 Aminosäuren mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 45 kDa in einem SDS-Polyacrylamidgel. Man fand heraus, dass NLK1 identisch zu NEK2 war, die später von Schulz et al. (Cell Growth Differ 5: 625, 1994) beschrieben wurde.
3. DNA-Transfektion und indirekte Immunfluoreszenzmikroskopie
NIMA und ihre abgeleiteten und mutierten Expressionskonstrukte waren die gleichen, die vorstehend beschrieben wurden (Lu und Hunter, Cell 81: 413, 1995a). Für die Expression von PIN1 wurde eine HA-Markierung (MYDVPDYASRPQN) (SEQ ID No: 6) an den N-Terminus der PIN1-Clone H20 und H6 zugefügt, gefolgt von einer Insertion in den pUHD 10-3-Vektor, wie zuvor beschrieben wurde (Lu and Means, EMBO J 13: 2103, 1994). Die Transfektion der tTA-1-Zelllinie (Gossen and Bujard, Proc Natl Acad Sci USA 89: 5547, 1992) wurde zuvor (Elredge et al., Meth Enzymol 254: 481, 1995) beschrieben, mit der Ausnahme, dass die Zellen mit einer niedrigeren Dichte (30%) ausplattiert wurden, was die Transfektionseffizienz und die Prozentzahl der Zellen, die sich im Zyklus befinden, zu erhöhen scheint. Eine indirekte Immunfluoreszenzmikroskopie wurde durchgeführt, wie beschrieben wurde (Lu und Hunter, Cell 81: 413, 1995a). Die Verdünnung für die primären Antikörper betrug: Maus-M2-mAk (Kodak/IBI, IgG-Isotyp), 1:600; 12CA5-mAk (IgG2b-Isotyp), 1:1500; SC35-mAk (von X Fu, IgG1-Isotyp) (Fu und Maniatis, Nature 343: 437, 1990), Überstand unverdünnt; und Kaninchen-anti-PML-Antikörper (von R Evans) (Dyck et al., Cell 76: 333, 1994), 1:100. Die FITC konjugierte Ziege-anti-Maus-IgG1- und die Texas-Rot konjugierte Ziege-anti-Maus-IgG2b Sekundärantikörper (Southern Biotechnology) wurden mit 1:50 ohne signifikante Kreuzreaktivität verwendet. Die Zellen wurden mit einem Zeiss-Mikroskop oder einer MRC-1000-Laser-Scanning-Konfokal-Baugruppe (BioRad) beobachtet und fotografiert.
4. Durchflusszytrometrie-Analyse
Zellen wurden 48 h nach der Transfektion geerntet und mit dem 12CA5-mAk gefärbt, gefolgt von einer Analyse mittels Durchflusszytrometrie an einer Becton-Dickinson-FACScan-Maschine (Lu und Hunter, Cell 81: 413, 1995a). 12CA5-negative oder -positive Zellen (10⁴) wurden gesammelt, um den DNA-Gehalt zu bestimmen, und die Zellzyklusprofile wurden unter Verwendung der M-Cycle-Analysesoftware (Phoenix Flow Systems, San Diego, CA) bestimmt.
5. Metabolische Markierung, Immunpräzipitation und Immunblot-Analyse
Die metabolische Markierung von tTA-1-Zellen wurde durchgeführt, wie zuvor beschrieben (Lu und Hunter, Cell 81: 413, 1995a). Die Zellen wurden in einem NP40-Lysepuffer (50 mM Tris-HCl; pH-Wert 8,0; 0,1% NP40; 200 mM NaCl; 20 mM β-Glycerophosphat; 20 mM NaF; 0,1 mM Natriumorthovanadat; 50 μg/ml Phenylmethylsulfonylfluorid; 10 μg/ml Leupeptin, 10 μg/ml Aprotinin und 1 mM DTT oder 10 mM β-Mercaptoethanol (im Fall der Ni²⁺-NTA-Agarose-Präzipitation) lysiert und mit gekochtem S. aureus oder mit Ni²⁺-NTA-Agarose (Qiagen) vorgereinigt. Die Lysate wurden anschließend mit M2 oder 12CA5 oder His-Pin1-Ni²⁺-NTA-Agarose inkubiert. Nachdem die Präzipitate sechsmal mit Lysepuffer gewaschen worden waren, wurden sie einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und einer Immunblot-Analyse unterzogen.
6. Expression und Reinigung von PIN1 und Kinase-Untersuchungen
Um das die (His)₆-Markierung enthaltene PIN1-Protein zu exprimieren, wurde die cDNA-Insertion vom H20-Clon in die SpeI/HindIII-Stellen von pProEx1 subcloniert und das rekombinante Protein wurde in dem bakteriellen BL21-Stamm exprimiert und aus diesem unter Verwendung von Ni²⁺-NTA-Agarosesäule (Qiagen) gereinigt, wie es vom Hersteller beschrieben wurde. Um zu untersuchen, ob PIN1 phosphoryliert werden kann, wurde rekombinantes PIN1-Protein zu dem NIMA-Kinase-Reaktionsgemisch mit Konzentrationen bis zu 0,5 mg/ml zusammen mit β-Casein und PL1-Peptid als Positivkontrollen zugegeben, wie zuvor beschrieben wurde (Lu et al., J Biol Chem 269: 6603, 1994). Der Effekt von PIN1 auf NIMA wurde unter Verwendung von PL1 als ein Substrat mit ansteigenden Konzentrationen von rekombinanten PIN1 analysiert (Lu et al., J Biol Chem 269: 6603, 1994). Cyclin B/CDC2 (erhalten von N Watanabe; Salk Institute), ERK1 MAPK (erhalten von R Fukunaga) und PKA (Promega) wurden unter Verwendung von Histon H1, basischem Myelin Protein bzw. H1 als Substrate untersucht.
7. PPlase-Untersuchung
Die PPlase-Aktivität der gereinigten rekombinanten Proteine wurde unter Verwendung des Verfahrens von Heitman et al. (Methods 5: 176, 1993) mit den nachfolgenden Ausnahmen untersucht. Die Reaktion wurde bei 5°C durchgeführt und Chymotrypsin wurde direkt vor dem Peptidsubstrat (N-Succ-Ala-Pro-p-Nitroanilid, Sigma) zugegeben. Die cis-zu-trans-Isomerisierung wurde alle sechs Sekunden durch einen Wechsel in der Absorption bei 395 nm unter Verwendung eines DMS 2000-UV und Visible-Spectrophometer (Varian) beobachtet. FKBP, Cyclosporin A und FK520, ein Derivat von FK506, waren Geschenke von D Schultz und C Zuker; University of California, San Diego.
8. Hefe-Komplementationsuntersuchungen
Die PIN1-Expression wurde von dem starken, konstitutiven Hefe-Triosephosphat-Isomerase-Promotor (TPI) (Smith et al., 1985) angetrieben. Das Plasmid pTPI-PIN1 wurde durch die Insertion eines 850 bp großen BamHI-XhoI-Fragments der PIN1-cDNA (von H20/GADGH) in pJK305-TPI (J Kames, Ph.D.- Dissertation, Harvard University, 1991) hergestellt. PTPI-PIN1 lenkt die Synthese des nativen Pin1-Proteins mit vollständiger Länge und trägt den Hefe-2 μ-Replikator und die selektierbare LEU2-Markierung. Das Plasmid YepHESS trägt das Hefe-ESS1-Gen, einen 2 μ-Replikator und die selektierbare HIS3-Markierung (Hanes et al., Yeast 5: 55, 1989).
Für die Tetraden-Analyse wurde ein heterozygoter ESS1-Disruptionsstamm MGG3/pSH-U (MATa/MATα ura3/ura3 leu2/leu2 his3/his3 ess1::URA3/ESS1) (Hanes et al., Yeast 5: 55, 1989) mit dem Kontrollvektor pJK305-TPI, YepHESS oder pTPI-PIN1 transformiert. Die Zellen wurden zur Sporenbildung auf 1% Kaliumacetat-Platten induziert, die Tetraden wurden zerteilt und man ließ die haploiden Segreganten für 3–4 Tage bei 30°C auf reichem Medium (YEPD)-Platten wachsen. Nur Tetraden, welche die richtige Segregation von URA3- und MATa- und MATα-Allelen zeigten, wurden in der Zählung der lebensfähigen Sporen eingeschlossen. Für das Heilungsexperiment wurde ein homozygotes Disruptionsderivat von MGG3/pSH-U (relevanter Genotyp ess1::URA3/ess1::URA3), das ESS1 auf einem episomalen Plasmid (YepHESS) trägt, entweder mit pJK305-TPI oder pTPI-PIN1 transformiert. Die Zellen wurden einmal pro Tag (mit Verdünnungen von 1/50) für 6 Tage in synthetisches Flüssig-Komplettmedium, dem Leucin fehlte, seriell Passagen unterworfen; auf dieser Weise wurde die Selektion für das PIN1 exprimierende Plasmid oder für den Kontrollvektor (2 μ, LEU2) aufrechterhalten, nicht aber für das ESS1 enthaltene Plasmid (2 μM, HIS3). Die Zellen wurden ausplattiert und die Phänotypen der individuellen Kolonien wurden durch eine Replikaausplattierung auf geeignete Selektionsmedien ausgewertet.
9. PIN1-abhängige Hefe und die Bestimmung des terminalen Phänotyps
Für Abreicherungsexperimente von Pin1 in Hefe verwendeten wir den GAL1-Promotor (Yocum et al., Mol Cell Bio 4: 1985, 1984). Das Plasmid pGAL-PIN1 wurde durch die Insertion eines SpeI-XhoI-Fragments der PIN1-cDNA von pN2P1/GADGH in die AvrII- und XhoI-Spaltung von pBC103 hergestellt. PGAL-PIN1 lenkt die Synthese einer HA1-Hämagglutinin-Epitop markierten Version von Pin1, die eine 31 Aminosäure große, endständige Extension
(SEQ ID No: 7) enthält, wobei die unterstrichenen Reste das HA1-Epitop bzw. der normale PIN1-Initiator sind. Die anderen Reste wurden von Polylinker-Sequenzen abgeleitet. Eine integrierende Version, I-GAL-PIN1, wurde durch die Entfernung der GAL-PIN1-Kasette von pGAL-PIN1 mit XbaI und SacI und durch die erneute Insertion in die gleichen Stellen in pRS305 (Sikorski und Hieter, Genetics 122: 19, 1989) hergestellt. I-GAL-PIN1 trägt eine selektierbare LEU2-Markierung.
Der ursprüngliche ess1^–-Knockout-Stamm (MGG3/pSH-U) wächst nicht auf Galactose, wahrscheinlich aufgrund einer gal2-Mutation. Um einen Stamm (YSH12) herzustellen, dem die ESS1-Funktion fehlt und dessen Wachstum von einer Galactose induzierbaren Version von PIN1 abhängig ist, wurde daher das folgende Schema verwendet. Ein gal^–-Stamm, FY86 (MATα his3Δ200 ura3-52 leu2Δ1) wurde mit dem integrierenden Vektor GAL-PIN1 (LEU2) transformiert. Leu⁺-Transformanten wurden mit einem haploiden MGG3/pSH-U-Segreganten (MATa ura3 his3 leu2 ess1::URA3), der YEpHESS trägt, gepaart. Diploide Zellen wurden zur Sporenbildung angeregt und die Tetraden wurden auf reichem Medium, das 2% Galactose/1% Raffinose enthielt, zerteilt. Haploide Segreganten, welche die ess1::URA3-Disruption (ura⁺) und GAL-PIN1 (leu⁺) enthielten, denen aber YEpHESS (his^–) fehlte, wurden identifiziert. Isolierte Segreganten, die ein Wachstum auf Galactose (YEPG)-Medium, nicht aber auf Glucose (YEPD)-Medium zeigten, wurden weitergehend charakterisiert. Zellen, die nicht die ess1-Knockoutmutation (ura^–) enthielten, die aber GAL-PIN1 (leu⁺) enthielten, wurden als Kontrolle verwendet. Die induzierbare Expression von PIN1 wurde in mehreren Isolaten von YSH12 durch die Immunblot-Analyse bestätigt.
Um die Expression von PIN1 in ess1^–-Zellen auszuschalten, ließ man den Stamm YSH12 über Nacht in Galactose oder Galactose/Glucose enthaltenem Medium wachsen und beimpfte (~1/50 Verdünnung) Glucose enthaltendes Medium mit ihnen. Man ließ die Zellen für ungefähr 12 Stunden wachsen und beimpfte anschließend erneut frisches, Glucose enthaltendes Medium für zusätzliche 18 Stunden. Aliquots der Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, durch die Zugabe von 70%igen Ethanol fixiert und bei 4°C gelagert. Die Größenverteilung der Knospen wurde unter DIC (Normarski)-Beleuchtung ausgewertet, nachdem die Zellen in Wasser resuspendiert und extensiv mit Ultraschall behandelt wurden, um zusammenhängende Zellen zu verteilen. Für die DAPI-Färbung wurden die fixierten Zellen mit 1 μg/ml DAPI gefärbt und in 75%iges Glycerin eingebettet und unter Fluoreszenzbeleuchtung fotografiert. Die FACS-Analyse von Hefezellen wurde zuvor beschrieben (Sazer und Sherwood, J Cell Sci 509, 1990).
BEISPIEL 2
IDENTIFIZIERUNG VON CLONEN, DIE MIT NIMA INTERAGIERENDE PROTEINE (PINS) CODIEREN
Um nach menschlichen cDNAs zu suchen, die Proteine codieren, die mit NIMA interagieren können, wurde ein Hefe-Zwei-Hybrid-System verwendet, das die GAL4-Erkennungsstellen verwendet, um die Expression sowohl von HIS3 als auch LacZ zu regulieren (Durfee et al., Genes Dev 7: 555, 1993). Als Köder wurde die vollständige codierende Sequenz von Aspergillus nidulans nimA mit dem C-terminalen Ende der GAL4-DNA bindenden Domäne in pAS2, die durch einen partiellen ADH-Promotor angetrieben wird, fusioniert (Harper et al., Cell 75: 805, 1993). Als Beute verwendeten wir die transaktivierende GAL4-Domäne und eine menschliche HeLa-Zellen-cDNA-Fusionsbibliothek, die durch den hochaktiven, vollständigen ADH-Promotor angetrieben wurde, was zu einer starken Expression führte (Hannon et al., Genes Dev 2378, 1993). Zunächst wurden Y190-Zellen mit dem Expressionsvektor NIMA/pAS2 transformiert, um zu versuchen, stabile Stämme zu etablieren, die konstitutiv NIMA exprimieren, aber die transformierten Kolonien waren sehr klein und konnten nicht vermehrt werden. Das Versagen der Transformanten zu wachsen ist wahrscheinlich auf die Tatsache zurückzuführen, dass NIMA einen mitotischen Arrest in knospender Hefe induziert, wie dies auch in anderen eukaryontischen Zellen, die bisher untersucht wurden, geschieht (Osami et al., Cell 53: 237, 1988; Lu und Means, Embo J 13: 2103, 1994; O'Connell et al., EMBO J 13: 4926, 1994; Lu und Hunter, Cell 81: 413, 1995a). Um dieses Problem zu umgehen, wurden Y190-Hefezellen mit NIMA/pAS2 und der cDNA-Bibliothek der Zwei-Hybrid-Durchmusterungsanalyse in der Hoffnung kotransformiert, dass die Expression von einem oder mehreren Produkten der cDNA-Bibliothek die Zellen von dem letalen Phänotyp von NIMA befreien.
Von den 10⁶ Kolonien, die durchgemustert wurden, waren 13 durchgehend positiv nach wiederholten Transformationen. Die Spezifität der Interaktion wurde getestet, wobei NIMA mit vollständiger Länge, ein C-terminales, nichtkatalytisches Fragment von NIMA, NIMA280-699 und eine menschliche NIMA-ähnliche Kinase 1 (NLK1) (1A) verwendet wurden. 1a zeigt eine β-Galactosidase-Aktivität im Zwei-Hybrid-System. Der Hefestamm Y190 wurde mit Vektoren kotransformiert, die drei verschiedene Typen von cDNA und verschiedene Domänen von NIMA oder NLK1 exprimierten, wie angezeigt wird, und die in SC-Medien gezüchtet wurden, denen Trp und Leu fehlten, gefolgt von einer β-Galactosidase-Aktivitätsfilter-Analyse, wie zuvor beschrieben wurde (Durfee et al., Genes Dev 7: 555, 1993). NLK1, die aus einer menschlichen Plazenta-cDNA-Bibliothek isoliert wurde und von der nachgewiesen wurde, dass sie identisch mit Nek2 ist (Schultz et al., Cell Growth Differ 5: 625, 1994), ist zu 47% identisch mit NIMA in ihrer katalytischen Domäne, aber NIMA und NLK1 besitzen nur eine geringe Ähnlichkeit in ihren C-terminalen nichtkatalytischen Domänen (1B). Basierend auf den Sequenzen ihrer Insertionen und den Spezifitäten ihrer Interaktion mit NIMA und NLK1 fielen diese Clone in drei verschiedenen Gen-Klassen, die als PIN1, PIN2 und PIN3 (PIN = mit NIMA interagierendes Protein) bezeichnet wurden. Es gab sechs PIN1-, drei PIN2- und vier PIN3-Clone. Die Analyse der Zwei-Hybrid-Interaktionen deuten darauf hin, dass Pin3 mit den katalytischen Domänen sowohl von NIMA als auch von NLK1s interagiert, wohingegen Pin1 und Pin2 mit der C-terminalen Domäne von NIMA interagieren. Die nachfolgenden Beispiele fokussieren auf Pin1 als ein beispielhaftes Pin-Protein.
BEISPIEL 3
DIE ANALYSE DER PIN1-cDNA
Die DNA-Sequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz des Proteins, das durch die längste PIN1-cDNA (1,0 kb) codiert wird, ist in 2A gezeigt. Sie codiert ein Protein mit 163 Aminosäuren mit dem angenommenen Molekulargewicht von 18.245. Wenn Pin1 in HeLa-Zellen exprimiert wird, wandert es mit einer scheinbaren Größe von ~18 kDa in einem SDS-Polyacrylamidgel. Pin1 zeigt eine hohe Ähnlichkeit zu dem Ess1-Protein in knospender Hefe (Hanes et al., Yeast 5: 55, 1989). Basierend auf neueren RNA-Primer-Extensionsstudien und der erneuten Untersuchung der Nucleotidsequenz von ESS1 (Hani er al., FEBS Lett 365: 198, 1995) gilt es als wahrscheinlich, dass eher das zweite ATG als das erste ATG, das ursprünglich vorgeschlagen wurde, als Initiations-Codon verwendet wird (Hanes et al., Yeast 5: 55, 1989); zusätzlich sollte ein G in Position 919 eingefügt werden, was zu einer Verschiebung des Leserasters im C-terminalen Ende führt. Die korrigierte ESS1-Sequenz codiert ein 169 Aminosäuren großes Protein mit einer 45%igen Identität zu Pin1. Die Northern-Blot-Analyse von menschlichen Zelllinien und menschlicher RNAs einer fötalen Leber zeigte, dass eine einzelne PIN1-mRNA von ~1,0 kb in allen Zelllinien und Gewebe, die getestet wurden, vorhanden ist (3). 15 μg der angezeigten Gesamt-RNAs wurden in jeder Spur aufgetragen. HeLA, epitheloide Karzinomzellen; HFF, menschliche Vorhaut-Fibroblasten; Ramos, Burkitt-Lymphomzellen; A431, epitheloide Karzinomzellen; 293, Adenovirus E1A transformierte, menschliche embryonale Nierenzellen; U937, immunblastische Lymphomzellen; Saos-2, Osteosarcomzellen; U87-MG, Glioblastomzellen; Jurkat, T-Zell-Leukämie-Zelllinie und HFT, menschliche fötale Leber. Die Position des molekularen RNA-Gewichtsstandards (Promega) ist auf der linken Seite dargestellt.
Diese Ergebnisse zusammen mit dem Sequenzvergleich zwischen Pin1 und Ess1 bestätigen die Authentizität des offenen Leserasters von PIN1, obwohl es innerhalb des Leserasters kein Terminations-Codon gibt, das der mutmaßlichen Initiationsstelle vorausgeht. Die Sequenzanalyse von sechs verschiedenen PIN1-cDNA-Clonen identifizierte die Punkte der Fusion mit der aktivierenden GAL4-Domäne als Arg-(–3), Glu+(+5) und Lys-(+6), was darauf hinweist, dass die fünf N-terminalen Aminosäuren von Pin1 nicht für die Interaktion mit NIMA notwendig sind. Die Immunblot-Analyse unter Verwendung von anti-Pin1-Antikörpern bestätigte, dass Pin1 ein 18 kD großes Protein in der Zelle ist.
Die abgeleitete Sequenz von Pin1 enthält zwei identifizierbare Domänen, eine N-terminale WW-Domäne und eine mutmaßliche C-terminale PPlase-Domäne. Die WW-Domäne enthält zwei nicht variable Trp-Reste und andere Reste, die in den WW-Domänen anderer Proteine einschließlich Dystrophin und Yap von Säugern und Rsp1 und Ess1 von Hefe hochkonserviert sind (Sudol et al., 1995). Die Cys- oder His-reiche Domäne, welche die WW-Domäne flankiert, die in den WW-Domäne enthaltenen Proteinen einschließlich Ess1 gefunden wird (Sudol et al., 1995), ist in dem menschlichen Pin1 nicht konserviert. Die C-terminalen Zweidrittel von Pin1 enthalten Motive, die charakteristisch für die erst kürzlich identifizierte dritte Familie von PPlasen sind (Rudd et al., TIBS 20: 12, 1995). Die PPlase-Domäne von Pin1 enthält drei hochkonservierte Unterdomänen mit 45%iger Identität zu Parvulin und 62%iger Identität zu einer partiellen PPlase von A. thaliana. Ein mutmaßliches nucleäres Lokalisationssignal wurde am Anfang der PPlase-Domäne lokalisiert, das ebenfalls in Ess1 konserviert ist.
2A zeigt die vorhergesagte Aminosäuresequenz von Pin1, die im Ein-Buchstaben-Code angezeigt ist. Die Fusionspunkte zwischen GAL4 und Pin1 in sechs verschiedenen isolierten Clonen waren: Clon H20 bei C-9; Clon 16, 24 und 38 bei G+13; Clone H6 und H36 bei C+15. Die unterstrichenen Reste bilden eine Konsensussequenz für ein zweiteiliges nucleäres Lokalisationssignal. Die N- und C-terminalen Kästen verweisen auf die WW-Domäne und die PPlase-Domäne. Die Nummern der Nucleotide sind auf der linken Seite und die Nummern der Aminosäuren auf der rechten Seite dargestellt. 2B und 2C zeigen die Ausrichtung der WW-Domäne (B) und der PPlase-Domäne (C) in ausgewählten Proteinen. Identische Reste sind in der untersten Reihe dargestellt. Striche verweisen auf Lücken, die eingeführt wurden, um die Ausrichtung durchzuführen. Cbf2, zellbindender Faktor 2; SC, S. cerevisiae; EC, E. coli; BS, B. subtilis; CJ, C. jejuni; AT, A. thaliana.
BEISPIEL 4
Pin1 HAT PPlase-AKTIVITÄT
Wegen der großen Sequenzähnlichkeit zwischen Pin1 und der dritten PPlase-Familie wurde Pin1 getestet, um zu bestimmen, ob Pin1 die cis/trans-Isomerisierung von Peptidyl-Prolyl-Peptidbindungen in vitro katalysieren kann, ein charakteristisches Merkmal der PPlase. Pin1 wurde in Bakterien mit einer N-terminalen (His)₆-Markierung exprimiert und wurde aus den Bakterien unter Verwendung einer Ni²⁺-NTA-Agarosesäule gereinigt. Wenn das gereinigte, rekombinante Pin1 auf PPlase-Aktivität getestet wurde, wobei eine Chymotrypsin-gekoppelte spektrophotometrische Standardanalyse verwendet wurde (Heitman et al., Methods 5: 176, 1993), wurde auf einfache Weise eine PPlase-Aktivität, die stark konzentrationsabhängig war, mit einer spezifischen Aktivität detektiert, die der von rekombinanten FKBP ähnlich war (4). Die Isomerase-Aktivität wurde gemessen, wie in Beispiel 1 beschrieben wurde. Die cis-zu-trans-Isomerisierung wurde in Abständen von je 6 Sekunden durch einen Wechsel in der Absorption bei 395 nm beobachtet, wobei die entgültige, stabile Absorption jeder Probe auf 1,0 gesetzt wurde. Verschiedene Konzentrationen von Pin1 wurden verwendet, wie angezeigt wird, wobei die rekombinante PPlase des FK506 bindenden Proteins (FKBP) als eine Positivkontrolle verwendet wurde. Die Kontrollproben enthielten alle Bestandteile außer der PPlase. Die Insertion zeigt eine PPlase-Aktivität während der ersten Minute der Analyse (
Kontrolle; o Pin1, 71 μg/ml; ☐ Pin1, 14 μg/ml,
Pin1 7 μg/ml; • FKBP 70 μg/ml).
Ähnlich wie bei Parvulin wurde die PPlase-Aktivität von Pin1 weder von Cyclosporin A noch von FK520, einem Derivat von FK506, gehemmt, auch nicht bei 25 μM. Diese Ergebnisse bestätigen, dass Pin1 ein Mitglied der dritten Familie von PPlasen ist.
BEISPIEL 5
Pin1 INTERAGIERT MIT DER C-TERMINALEN DOMÄNE VON NIMA
In dem Zwei-Hybrid-System interagiert Pin1 mit NIMA, der Kinase negativen Mutante K40M-NIMA und dem C-terminalen Fragment NIMA280-699, nicht aber mit NLK1 (Tabelle 1), was darauf hinweist, dass NIMA spezifisch mit der C-terminalen, nichtkatalytischen Domäne von NIMA in Hefe interagiert. Um zu bestimmen, ob eine stabile Interaktion zwischen Pin1 und NIMA in Extrakten von HeLa-Zellen existiert, wurde rekombinantes Pin1 an Kugeln gebunden, um zu bestimmen, ob NIMA aus Lysaten von Zellen, die transient verschiedene NIMA-Mutanten exprimierten, gewonnen werden könnte. Da NIMA einen mitotischen Arrest induziert (Lu und Hunter, Cell 81: 413, 1995a), ist es schwierig, ausreichend Wild-Typ-NIMA zu exprimieren, um die Erzeugung eines Komplexes zu detektieren, aber da Pin1 mit der Kinase negativen Mutante K40M-NIMA im Hefe-Zwei-Hybrid-System genauso effizient wie mit Wild-Typ-NIMA interagierte, verwendeten wir K40M-NIMA und verkürzte, abgeleitete Mutantenkonstrukte.
5A–E zeigen immunpräzipitationen, um die Interaktion zwischen Pin1 und der C-terminaten, nichtkatalytischen Domäne von NIMA in HeLa-Zellen zu zeigen. 5A zeigt die Expression und die Reinigung von His-Pin1. Die Pin1-cDNA wurde in pProEx1 subcloniert und das rekombinante Protein wurde aus Bakterien unter Verwendung einer Ni²⁺-NTA-Agarosesäule gereinigt, gefolgt von der Analyse des Proteins auf einem 15%igen SDS enthaltenden Gel und einer Färbung mit Coomassie. Die Positionen von His-Pin1 und des Standard-Größenmarkers sind angegeben. 5B zeigt die Expression von NIMAs in HeLa-Zellen. tTA-1-Zellen wurden mit verschiedenen FLAG-markierten NIMA-Konstrukten transfiziert und mit ³⁵S Label für 24 h markiert, gefolgt von einer Immunpräzipitation, wobei M2-mAk verwendet wurden. Die präzipitierten Proteine wurden auf einem 10%igen SDS enthaltenden Gel analysiert, gefolgt von einer Autoradiographie. Die Positionen von K40M, NIMA, K40M-NIMA280, NIMA280-699 und des Standard-Größenmarkers sind angegeben. 5C zeigt einen stabilen Komplex zwischen dem rekombinanten Pin1 und den NIMAs. Zelllysate, die denen im Bild B ähnlich sind, wurden mit His-Pin1-Ni²⁺-NTA-Kugeln inkubiert, wie im Bild A angegeben ist, und gewaschen, gefolgt von einer Elektrophorese auf einem SDS enthaltenden Gel und einer Autoradiographie. 5D und 5E zeigen Koimmunpräzipitationen von K40M-NIMA und Pin1. tTA-1-Zellen wurden mit FLAG-markiertem NIMA und HA-PIN1-Konstrukten für 24 h kotransfiziert. Die Zelllysate wurden mit dem HA-spezifischen 12CA5-mAk immunpräzipitiert, gefolgt durch ein Immunblot-Verfahren, wobei der M2-mAk verwendet wurde, der für die FLAG-Markierung (D) spezifisch ist, und umgekehrt (E).
Von mehreren verschiedenen Fusionsproteinen, die getestet wurden, wurde His-Pin1 als das Protein identifiziert, das am stabilsten und am einfachsten in großen Mengen zu reinigen war, wenn es in Bakterien exprimiert wurde (5A). Wenn es zusammen mit ³⁵S-markierten Extrakten von Zellen inkubiert wurde, die transient K40M-NIMA in vollständiger Länge, ein N-terminales Fragment K40M-NIMA280 oder ein C-terminates Fragment NIMA280-699 exprimierten (5B), wurden K40M-NIMA und NIMA280-699, nicht aber K40M-NIMA280, von den rekombinanten His-Pin1-Kugeln spezifisch gebunden (5C). Die Ergebnisse zeigten ebenfalls, dass das gereinigte GST-NIMA 280-699 direkt mit gereinigtem Pin1 in vitro interagiert. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das rekombinante Pin1 mit der C- terminalen Domäne von NIMA in Extrakten von HeLa-Zellen interagiert.
Um zu untersuchen, ob ein Komplex aus Pin1 und NIMA in der Zelle erzeugt wird, wurde eine HA-Epitop-Markierung am N-terminalen Ende von Pin1 eingeführt und zusammen mit FLAG-markierten NIMA-Konstrukten in HeLa-Zellen exprimiert, wobei ein auf Tetracyclin ansprechendes Expressionssystem verwendet wurde, wie zuvor beschrieben wurde (Lu und Hunter, Cell 81: 413, 1995a). Wenn die Zelllysate mit einem für die HA-Markierung spezifischen mAk (12CA5) immunpräzipitiert wurden, gefolgt von einer Immunblot-Analyse unter Verwendung des M2-mAk, der spezifisch für die FLAG-Markierung ist, und umgekehrt, dann wurde K40M-NIMA, nicht aber K40M-NIMA280 in den Pin1-Immunpräzipitaten detektiert (5D). Umgekehrt wurde Pin1 nur in K40M-NIMA-Immunpräzipitaten detektiert (5E). Wenn die isolierte katalytische Domäne von NIMA in HeLa-Zellen exprimiert wurde, befand sie sich im Cytosol (Lu und Hunter, Cell 81: 413, 1995a), wohingegen Pin1 ein nucleäres Protein ist (vergl. nachfolgende Beschreibung); aus diesem Grund ist es unwahrscheinlich, dass Pin1 mit der katalytischen Domäne von NIMA interagiert. Diese Ergebnisse, zusammen mit der in-vitro-Bindungsanalyse und der Zwei-Hybrid-Analyse, deuten darauf hin, dass die C-terminate nichtkatalytische Domäne von NIMA in der Interaktion mit Pin1 involviert ist.
Um zu untersuchen, ob Pin1 die Kinaseaktivität von NIMA beeinflusst, wurde gereinigtes rekombinantes Pin1-Protein zu einem Reaktionsgemisch der NIMA-Kinase in der Anwesenheit oder der Abwesenheit des PL1-Peptidsubstrats zugegeben. Unter diesen getesteten Bedingungen wurde Pin1 weder durch die NIMA-Kinase phosphoryliert noch gehemmt. Ähnliche Ergebnisse wurden mit verschiedenen anderen Proteinkinasen einschließlich Cyclin B/CDC2, ERK1 und PKA erhalten. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass es unwahrscheinlich ist, dass Pin1 als ein Substrat oder ein Hemmstoff für die Proteinkinasen NIMA, CDC2, ERK1 und PKA fungiert.
BEISPIEL 6
Pin1 IST GEMEINSAM MIT NIMA IN EINER DEFINIERTEN NUCLEÄREN UNTERSTRUKTUR LOKALISIERT
Um zu untersuchen, ob Pin1 mit Nima gemeinsam in menschlichen Zellen lokalisiert ist, wurde die subzelluläre Lokalisation von Pin1 bestimmt, wobei eine indirekte Immunfluoreszenzfärbung verwendet wurde, wie zuvor beschrieben wurde (Lu und Hunter, Cell 81: 413, 1995a). Wenn Ha-markiertes Pin1 in HeLa-Zellen exprimiert und mit dem 12A5-mAk gefärbt wurde, wurde Pin1 fast ausschließlich im Nucleus beobachtet. Dieses Ergebnis deutet in Übereinstimmung mit der Anwesenheit eines nucleären Lokalisationssignals in Pin1 (2A) darauf hin, dass Pin1 ein nucleäres Protein ist. Die konlokale Mikroskopie zeigte des weiteren, dass, obwohl Pin1 überall im Nucleus verteilt war, es in bestimmten Gebieten mit einer gefleckten Erscheinung hochkonzentriert vorlag (6, rechtes Bild).
6 zeigt die Kolokalisation von Pin1 und NIMA und seiner Kinase negativen Mutante in HeLa-Zellen. 24 h nach der Transfektion mit den Vektoren, die nur HA-markiertes Pin1 (rechte Bilder) oder HA-markiertes Pin1 und FLAG-markiertes NIMA (linke Bilder) oder die Kinase negative Mutante (K40M-NIMA, mittlere Bilder) exprimierten, wurden die transfizierten tTA-1-Zellen für die indirekte Immunfluoreszenzfärbung verarbeitet und mittels konfokaler Mikroskopie untersucht. Oberes Bild: Das Färbungsmuster für NIMA oder K40M-NIMA, erhalten mit dem für die FLAG-Markierung spezifischen M2-mAk, oder SC-35, erhalten mit anti-SC-35-mAk und anschließend mit FITC-konjugierten, IgG1 spezifischen sekundären Antikörpern; mittlere Bilder: Färbungsmuster für Pin1, erhalten mit einem für die HA-Markierung spezifischen 12CA5-mAk und Texas-Rot-konjugierten, IgG2b spezifischen sekundären Antikörpern; untere Bilder: Doppelfärbung für Pin1 und NIMA, Pin1 und K40M-NIMA oder Pin1 und SC-35, welche durch die Überlagerung der entsprechenden oberen und mittleren Bilder gezeigt werden, wobei die gelbe Farbe eine Kolokalisation anzeigt. Pfeile zeigen zu einer nichttransfizierten Zelle, welche sehr wenig Kreuzreaktivität zwischen den Antikörpern zeigt. Balken, 1 μM.
Um zu untersuchen, ob Pin1 und NIMA in HeLa-Zellen kolokalisiert sind, wurden HA-markiertes PIN1 und FLAG-markiertes nimA oder die Kinase negative Mutante (K40M-nimA) in tTA-1-Zellen kotransfiziert und anschließend wurde die Lokalisation der exprimierten Proteine unter Verwendung der für die Markierung spezifischen 12CA5- und M2-mAk und für das Isotop spezifischen sekundären Antikörper untersucht. In Zellen mit dem durch NIMA induzierten mitotischen Phänotyp (6, linke Bilder), war Pin1 genau wie NIMA (Lu und Hunter, 1995a) mit dem kondensierten Chromatin assoziiert, aber es war außerdem überall in der Zelle verteilt. In K40M-NIMA exprimierenden Zellen war Pin1 in nucleären Unterstrukturen konzentriert, wo das mutierte NIMA ebenfalls konzentriert war (6, mittlere Bilder). Die Kolokalisation war erheblich, aber nicht vollständig (6, mittleres untere Bilder). Pin1 wurde ebenfalls mit dem C-terminalen NIMA280-699 in den nucleären Unterstrukturen kolokalisiert. Weil ähnliche nucleäre Unterstrukturen durch Immunfärbung mit dem anti-Spleißfaktor SC35 (Fu und Maniatis, Natur 343: 437, 1990) und den anti-PML-Antikörpern (Dyck et al., Cell 76: 333, 1994) beobachtet wurden, wurden die nucleären Unterstrukturen von Pin1 untersucht, um zu bestimmen, ob sie die gleichen wie diejenigen sind, die durch SC35 oder PML lokalisiert wurden. Wenn Zellen, die Pin1 exprimierten, mit 12CA5 und anti-Spleißfaktor SC35 oder anti-PML-Antikörpern doppelt gefärbt wurden, waren die Tüpfel, die durch Pin1 angezeigt wurden, die gleichen wie die, die unter Verwendung von anti-SC35 (6, rechte Bilder) detektiert wurden, nicht aber die gleichen, die von anti-PML-Antikörpern detektiert wurden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Pin1 und K40M-NIMA in den nucleären Unterstrukturen des Spleißosoms kolokalisiert sind. Weil identische Protokolle verwendet wurden und vollständig andere Lokalisierungmuster für mehrere andere Proteine einschließlich des menschlichen NLK1, das mit Pin3 im Nucleolus kolokalisiert war, beobachtet wurden, ist es unwahrscheinlich, dass das Lokalisierungsmuster von Pin1 und NIMA wegen einer nichtspezifischen Akkumulation in bestimmten Gebieten des Nucleus aufgrund einer Überexpression zustande kommt. Daher zeigen diese Ergebnisse, dass Pin1 mit NIMA im Nucleus in einer definierten nucleären Unterstruktur kolokalisiert ist.
DIE ÜBEREXPRESSION VON Pin1 HEMMT DEN NIMA INDUZIERTEN MITOTISCHEN ARREST UND INDUZIERT EINEN G2-ARREST IN HELA-ZELLEN
Im Hefe-Zwei-Hybrid-System befreit die Expression von Pin1 vor dem letalen Phänotyp von NIMA, wobei dies darauf hinweist, dass Pin1 die mitotische Funktion von NIMA hemmen könnte. Um zu untersuchen, ob die Überexpression von Pin1 in HeLa-Zellen den durch NIMA induzierten, mitotischen Arrest blockiert, wurden Zellen mit den Expressionsvektoren für nimA und entweder PIN1 oder einem Kontroll-Expressionsvektor kotransfiziert und ihre Phänotypen wurden untersucht, wie zuvor beschrieben wurde (Lu und Hunter, Cell 81: 413, 1995a).
7A–7D zeigen, dass die Überexpression von PIN1 den durch NIMA induzierten, mitotischen Arrest verzögert und einen spezifischen G2-Arrest in HeLa-Zellen induziert. 7A zeigt die Ergebnisse von tTA-1-Zellen, die mit nimA und PIN1 oder einem Kontrollvektor kotransfiziert wurden. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden die Zellen fixiert und mit dem M2-mAk und dem Hoechst-Farbstoff doppelt markiert, gefolgt durch das Auszählen des prozentualen Anteils der Zellen, die sich abrundeten und eine Kondensation von Chromatin aufwiesen, in einer Probe von mindestens 250 NIMA exprimierenden Zellen. Diese Daten stellen den Durchschnittswert von zwei unabhängigen Experimenten dar.
7B, C und D zeigen tTA-1-Zellen, die 48 h nach der Transfektion mit dem PIN1-Expressionsvektor oder dem Kontrollvektor mit dem 12CA5-mAk und anschließend mit den FITC-konjugierten sekundären Antikörpern und Propidiumjodid gefärbt wurden, gefolgt durch eine FACS-Analyse. Basierend auf der Intensität von FITC in den mit PIN1 transfizierten Zellen wurden die Zellen in zwei Populationen mit 12CA5-negativen (B) oder -positiven Zellen (C) unterteilt und die Profile des Zellzyklus wurden bestimmt, um sie mit solchen Zellen zu vergleichen, die mit dem gesamten Vektor transfiziert wurden (A).
24 h nach der Transfektion waren ~80% der NIMA exprimierenden Zellen abgerundet und enthielten hochkondensiertes Chromatin (7A). Wenn die Zellen mit nimA und PIN1 kotransfiziert wurden, wurde NIMA in viel größeren Mengen exprimiert als in Zellen, die mit nimA und dem Kontrollvektor kotransfiziert wurden, wie durch Immunfluoreszenzmikroskopie detektiert wurde. Nach 24 h zeigten jedoch nur ~21% der NIMA exprimierenden Zellen den vollständigen mitotischen Phänotyp. Die übrigen NIMA exprimierenden Zellen waren nicht vollständig abgerundet und ihr Chromatin war nicht so stark kondensiert wie das in den Zellen, die nur NIMA exprimierten (5, linke Bilder, und 7A), obwohl nach 36 h alle NIMA exprimierenden Zellen den mitotischen Phänotyp zeigten (7A). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Pin1 die Mitose fördernde Funktion von NIMA partiell hemmen kann.
Um zu untersuchen, ob die Überexpression von Pin1 den G2/M-Übergang blockiert, wurden HeLa-Zellen entweder mit PIN1 oder dem Kontrollvektor transfiziert und die Progression des Zellzyklus wurde durch die Immunfluoreszenzmikroskopie und die FACS-Analyse untersucht. Zellen, die Pin1 exprimierten, enthielten einen großen Interphase-Nucleus und es war sehr schwierig, mitotische Zellen zu finden, die Pin1 exprimierten, was darauf hindeutet, dass Pin1 einen G2 Arrest induzieren kann. Die FACS-Analyse deutete darauf hin, dass der prozentuale Anteil der Zellen mit 4n DNA-Gehalt in Zellen, die Pin1 exprimierten (12CA5-positiv), deutlich erhöht war (7D). Etwa 50% der Zellen waren in der G2-Phase mit entsprechend weniger Zellen in der G1- und der S-Phase. Ähnliche Ergebnisse wurden ebenfalls durch die Überexpression eines anderen unabhängigen PIN1-Clons (H6) erhalten, der eine am N-terminalen Ende um 5 Aminosäuren verkürzte Mutante codiert. Im Gegensatz hierzu zeigten die mit Vektor transfizierten Zellen sehr wenig 12CA5-Färbung und sie zeigten ein ähnliches Profil des Zellzyklus wie Zellen, die nicht Pin1 exprimierten (12CA5-negativ), in der mit Pin1 transfizierten Zellpopulation (7B und 7C). Diese Ergebnisse, zusammen mit dem verzögernden Effekt von Pin1 auf den durch NIMA induzierten mitotischen Arrest, deuten darauf hin, dass Pin1 den NIMA-Signalweg hemmen kann, der für den G2/M-Übergang benötigt wird.
BEISPIEL 8
PIN1 IST EIN FUNKTIONELLES HOMOLOG DES ESSENTIELLEN ESS1-GENS VON S. CEREVISAE
Die Überexpression von Pin1 hemmt den G2/M-Übergang in HeLa-Zellen, wie vorstehend gezeigt wurde. Wenn dieser hemmende Effekt von der Tatsache abhängig ist, dass große Mengen von Pin1 die Kontrolle eines Kontrollpunktes des Zellzyklus beeinflussen, dann sollte die Abreicherung von Pin1 den G2/M-Übergang fördern, was zu einem mitotischen Arrest führt. Um diese Möglichkeit zu untersuchen, wurden knospende Hefen verwendet, in der die Expression endogener Proteine leicht manipuliert werden kann. Da Pin1 eine auffällige Ähnlichkeit zum ESS1 der Hefe zeigt, wurde das menschliche PIN1 getestet, um zu bestimmen, ob es funktionell das Hefe-Gen ersetzen kann. Da Ess1-Knockout-Mutationen in Hefe letal sind (Hanes et al., Yeast 5: 55, 1989), wurde die Fähigkeit von PIN1 bestimmt, die Lebensfähigkeit von ess1^–-Mutanten wiederherzustellen. Zuerst wurden Plasmide, die PIN1 unter der Kontrolle eines konstitutiven Hefe-Promotors exprimierten, in diploide Zellen eingeführt, in denen eine Kopie von ESS1 unterbrochen ist (ess1::URA3/ESS1). Die Zellen wurden zur Sporenbildung angeregt, die Tetraden wurden zerteilt und die Lebensfähigkeit der daraus resultierenden haploiden Sporen wurde bewertet (Tabelle 1A). Wie erwartet zeigten die Tetraden, die von Zellen abgeleitet wurden, die nur mit dem Vektor transformiert wurden, eine Trennung von 2:2, was die Lebensfähigkeit der Sporen betrifft (lebensfähig:nicht lebensfähig). Im Gegensatz hierzu zeigten ~25% der Tetraden von Zellen, die mit einem PIN1-Expressionsplasmid transformiert wurden, eine Trennung von 4:00, was die die Lebensfähigkeit der Sporen betrifft, was darauf hinweist, dass PIN1 die ess1^–-Mutante ergänzt und das Auswachsen von Sporen und die Lebensfähigkeit von haploiden Zellen ermöglicht. PIN1 ergänzte die ess1^–-Mutante nicht und erlaubte nicht das Auswachsen von Sporen und die Lebensfähigkeit von haploiden Zellen. PIN1 ergänzte die ess1^–-Mutanten nicht so effizient wie ESS1 selber, bei denen mehr als die Hälfte der Tetraden von Zellen, die ein ESS1-Plasmid trugen, eine Trennung von 4:00, was die Lebensfähigkeit der Sporen betrifft, zeigte. Die Wachstumskurven zeigten, dass die PIN1 exprimierenden ess1^–-Zellen Verdopplungszeiten besaßen, die nur geringfügig länger als die der Kontrollzellen waren. Daher kann menschliches PIN1 funktionell ESS1 in haploiden Hefezellen ersetzen.
Als zweites wurde das PIN1-Espressionsplasmid in diploide Zellen eingeführt, in denen beide chromosomalen Kopien von ESS1 zerstört waren (ess1::URA3/ess1::URA3), die aber durch die Erhaltung einer von einem Plasmid getragenen Kopie von ESS1 lebensfähig blieben. Wenn PIN1 funktionell ESS1 ersetzen kann, dann sollte es möglich sein, die Zellen von dem ESS1-Plasmid zu heilen. Tabelle 1B zeigt, dass Zellen, die seriell Passagen in Medien unterworfen wurden, die nur auf das PIN1-Plasmid (LEU2) selektierten, das ESS1-Plasmid (HIS3) zu etwa 12% verloren, während Zellen, die einen Kontrollvektor enthielten, das ESS1-Plasmid nicht verloren. Daher kann menschliches PIN1 funktionell ESS1 in diploiden Hefezellen ersetzen. Tabelle 1 PIN1 Ergänzt die ESS1-Knockout-Mutation in Knospender Hefe A. Tetraden-Analyse
B. Heilungsexperiment

A.: PIN1 befreit von der ess1^–-Letalität in haploiden Zellen. Der heterozygote Disruptionsstamm MGGS3/pSH-U wurde mit einem ESS1- oder einem PIN1-Expressionsvektorplasmid oder einem Kontrollvektor transformiert. Die Zellen wurden zur Sporenbildung angeregt und die Tetraden wurden zerteilt. In der Anzahl der lebensfähigen Sporen wurden nur solche eingeschlossen, die eine richtige Trennung der unabhängigen Markierungen zeigten. Wie erwartet, waren fast alle Segreganten, die ura⁺ waren (das heißt, sie trugen das ess1::URA3-Knockout-Allel), auch his⁺ oder leu⁺, was entweder die Anwesenheit des ESS bzw. des PIN1 enthaltenen Plasmids anzeigte.
B.: PIN1 erlaubt den Verlust von ESS1 enthaltenden Plasmiden in einem diploiden ess1^–-Knockout-Stamm. Ein diploider Disruptionsstamm (ess1::URA3/ess1::URA3), der ein ESS^–-Plasmid (His3) trug, wurde nur mit dem Vektor (LEU2) oder mit einem PIN1-Expressionsvektorplasmid (LEU2) transformiert. Die Zellen wurden seriell Passagen in Medien unterworfen, die kein Leucin enthielten, so dass die Selektion für das Kontroll- oder das PIN1-Plasmid nicht aber für das ESS1-Plasmid, aufrechterhalten wurde. Die Zellen wurden ausplattiert und die Phänotypen der individuellen Kolonien wurden durch Replikaausplattieren auf geeignete Selektionsmedien ausgewertet. Der Verlust des ESS1-Plasmids wurde durch den Verlust des his⁺-Phänotyps detektiert, während die Anwesenheit von PIN1 durch einen leu⁺-Phänotyp detektiert wurde. Ein ura⁺-Phänotyp bestätigt die Anwesenheit des Knockout-Allels (ess1::URA3).

BEISPIEL 9
ABREICHERUNG VON PIN1/ESS1 FÜHRT ZU EINEM MITOTISCHEN ARREST UND ZUR NUCLEÄREN FRAGMENTIERUNG IN S. CEREVISIAE
Um den Effekt der Abreicherung von Pin1/Ess1 auf den Zellzyklus zu untersuchen, wurde PIN1, das durch den regulierten GAL-Promotor angetrieben wurde, in einen ess1^–-Hefestamm eingeführt. Wie erwartet, zeigten Pin1 exprimierende Stämme in induzierenden Medien (Galactose) oder in nichtinduzierenden Medien (Galactose/Glucose, mit einem basalen Spiegel der PIN1-Expression) ein normales Wachstum, aber sie zeigten kein Wachstum in unterdrückenden Medien (Glucose).
8 zeigt, dass die Abreicherung von Pin1/Ess1 zu einem mitotischen Arrest und zur nukleären Fragmentierung in Hefe führt. Ein Pin1 abhängiger Stamm (YSH12.4) wurde von induzierenden Medien in unterdrückende Medien überführt, geerntet und mit 70% Ethanol zu den angegebenen Zeitpunkten fixiert. Die Zellen wurden mit DAPI oder Propidiumjodid gefärbt, entweder gefolgt von einer Videomikroskopie unter Nomarksi (DIC)- oder Fluoreszenz (DAPI)-Beleuchtung oder von einer FACS-Analyse. Der Balken ist 10 μm lang und die Insertionen zeigen eine höhere Vergrößerung einer repräsentativen Zelle.
Die Zellen, in denen Pin1 nach dem Umsetzen in unterdrückende Medien abgereichert ist, zeigten einen auffälligen terminalen Phänotyp, der auf einen mitotischen Arrest hinweist (Tabelle 2, 8). Nach etwa 6 h mit einem normalen Wachstum wurde die Zellteilung gehemmt und nach 12 h begannen die Zellen, in der Mitose zu akkumulieren, wie durch den steigenden prozentualen Anteil der Zellen, die eine große Knospe (hantelförmig) enthielten und durch die FACS-Analyse beurteilt wurde (Tabelle 2, 8, mittlere Bilder). Wie durch die DAPI-Färbung gezeigt wurde, enthielten ein hoher prozentualer Anteil der Zellen nucleär gefärbtes Material im Hals zwischen der Mutterzelle und der Knospe, was darauf hinweist, dass die mitotische Trennung der Chromosomen verlangsamt oder gehemmt war. Kontrollstämme, die GAL::PIN1 trugen, die aber den ESS1-Wildtyp besaßen, zeigten eine normale Verteilung der Zellen im Zellzyklus, wie mikroskopisch und durch eine FACS-Analyse beurteilt wurde. Nach 24 h stoppte die Zellteilung und die meisten Zellen waren in der Mitose arretiert. Interessanterweise zeigten Zellen, in denen Pin1 für einen längeren Zeitraum (18–30 h) abgereichert war, multiple nucleäre Fragmente, die zufällig verteilt in der gesamten Zelle erschienen (8, rechte Bilder). Die FACS-Analyse zeigte, dass Zellen mit einem 2n DNA-Gehalt über die Zeit akkumulierten, wobei die meisten Zellen einen 2n DNA-Gehalt 24 h nach dem Umsetzen in unterdrückende Medien enthielten (8, untere Bilder). Wenn die Zellen von nichtinduzierende Medien in exprimierende Medien umgesetzt wurden, erschien dieser Phänotyp früher. Die Zellen wurden in der Mitose nach 12 h arretiert, wobei bei etwa 40% der Zellen mitotisches Chromatin im Hals lokalisiert war und in den meisten anderen Zellen eine nucleäre Fragmentierung zu sehen war, was auf die Abhängigkeit der Phänotypen von dem ursprünglichen Spiegel der Pin1-Expression hinweist. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Abreicherung von Pin1 zu einem mitotischen Arrest und schließlich zu einer nucleären Fragmentierung führt; wobei die Phänotypen ähnlich zu solchen sind, die in Aspergillus und HeLa-Zellen beobachtet wurden, die NIMA überexprimieren (Osmain et al., Cell 53: 237, 1988; O'Conell et al., EMBO J 13: 4926, 1994; Lu und Hunter, Cell 81: 413, 1995a).
Tabelle 2 Abreicherung von Pin1/Ess1 führt zu einem mitotischen Arrest in knospender Hefe
Ein Pin1 abhängiger Stamm (YSH12.4) wurde von induzierenden Medien in unterdrückende Medien umgesetzt, geerntet und zu den angegebenen Zeitpunkten mit Ethanol fixiert. Die Verteilung der Knospengröße wurde unter Nomarski-Beleuchtung bewertet, nachdem die Zellen mit DAP1 gefärbt und mit Ultraschall behandelt wurden. Etwa 500 Zellen wurden für jeden Punkt ausgezählt.
ZUSAMMENFASSUNG
Unter Verwendung des Hefe-Zwei-Hybrid-Systems konnte durch die vorliegende Erfindung Pin1 identifiziert werden, das erste mit NIMA interagierende Potein menschlichen Ursprungs. Pin1 enthält eine N-terminale WW-Domäne und eine C-terminate PPlase-Domäne und besitzt in vitro eine PPlase-Aktivität. PIN1 befreit funktionell vor einer Knockout-Mutation des ESS1-Gens, das essentiell für das Wachstum von knospenden Hefezellen ist. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Pin1 von der Hefe zum Menschen konserviert ist; Pin1/Ess1 ist die erste PPlase, von der bekannt ist, dass sie essentiell für das Leben ist. Pin1 interagiert mit der C-terminalen nichtkatalytischen Domäne von NIMA und ist gemeinsam mit NIMA in einer definierten nucleären Substruktur in HeLa-Zellen lokalisiert. Während die Überexpression von Pin1 einen spezifischen G2-Arrest induziert und die durch NIMA induzierte Mitose in HeLa-Zellen verzögert, ruft die Abreicherung von Pin1/Ess1 einen mitotischen Arrest und die nucleäre Fragmentierung in knospender Hefe hervor. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Pin1 den Eintritt in die Mitose reguliert, wahrscheinlich über den mitotischen Signalweg von NIMA.
Die primäre Struktur von Pin1 enthält zwei identifizierbare Domänen. Die C-terminalen Zweidrittel von Pin1 enthalten Reste, die in der kürzlich beschriebenen Familie von PPlasen, die Parvulin, PrsA, SurA, NifM, PrtM, Cbf2 und Ess1 einschließt, hoch konserviert sind (Rudd et al., TIBS 20: 12, 1995). Es wurde gezeigt, dass PrsA, SurA, NifM und PrtM in der Reifung und/oder im Transport spezifischer Proteine oder Proteinklassen involviert sind. Parvulin, das ursprünglich während eines chromatographischen Verfahrens zur Reinigung identifiziert wurde, ist der Prototyp dieser Familie; es enthält 96 Aminosäuren und katalysiert die cis/trans-Isomerisierung von X-Pro-Peptidbindungen sogar in der Anwesenheit von immunsuppressiven Arzneistoffen (Rahfeld et al., FEBS Lett 352: 180, 1994a und FEBS Lett 343: 65, 1994b). Die Homologie zwischen Pin1 und Parvulin umspannt fast das gesamte Parvulin-Molekül, was deutlich darauf hinweist, dass Pin1 eine PPlase ist. Die in-vitro-PPlase-Analyse, die in den vorstehenden Beispielen gezeigt wurde, bestätigt, dass Pin1 tatsächlich die cis/trans-Isomerisierung von Peptidyl-Prolyl-Peptidbindungen katalysieren kann.
Obwohl die Erfindung mit Bezug auf die zur Zeit bevorzugten Ausführungsformen beschrieben wurde, sollte es selbstverständlich sein, dass verschiedene Modifikationen durchgeführt werden können, ohne dass der Umfang der Erfindung verlassen wird. Dementsprechend wird die Erfindung nur durch die nachfolgenden Patentansprüche begrenzt.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Pin1-Protein, umfassend eine Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 2 (2A) gezeigt.
Pin1-Protein nach Anspruch 1, welches aus einer menschlichen Zelle stammt.
Fragment des Pin1-Proteins nach Anspruch 1, wobei das Fragment eine oder mehrere Aktivitäten besitzt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) Peptidyl-propyl-cis/trans-Isomerase Aktivivität; (b) assoziiert mit NIMA-Proteinkinase; (c) hemmt die Funktion von NIMA, wenn es überexprimiert wird; oder (d) immunologische Reaktivität mit einem Antikörper, welcher an das Pin1-Protein bindet.
Proteinfragment nach Anspruch 3, umfassend eine Aminosäureeinheit Nr. 5 bis Aminosäureeinheit Nr. 43 oder eine Aminosäureeinheit Nr. 59 bis Aminosäureeinheit Nr. 164, wie in SEQ ID NO: 2 (2A) gezeigt.
Nucleinsäuresequenz, welche das Proteinfragment nach Anspruch 4 codiert, umfassend Nucleotid Nr. 13 bis Nucleotid Nr. 129 oder Nucleotid Nr. 175 bis Nucleotid Nr. 489, wie in SEQ ID NO: 1 (2A) gezeigt, oder degenerierte Formen davon.
Nucleinsäuresequenz, welche ein Pin1-Protein oder Pin1-Proteinfragment nach einem der Ansprüche 1 bis 4 codiert, eine degenerierte Form davon oder ein Fragment davon, das unter stringenten Bedingungen selektiv an die Pin1 codierende Nucleinsäure hybridisiert.
Rekombinanter Expressionsvektor, umfassend die Nucleinsäuresequenz nach Anspruch 6.
Transformierte Wirtszelle, welche die Nucleinsäuresequenz nach Anspruch 6 oder den Vektor nach Anspruch 7 enthält.
Verfahren zur Herstellung eines Pin1-Proteins oder Pin1-Proteinfragments nach einem der Ansprüche 1 bis 4, umfassend: (a) Züchtung der Wirtszelle nach Anspruch 8 unter Bedingungen die geeignet sind für die Expression des Pin1-Proteins oder Pin1-Proteinfragments; und (b) Gewinnung des Pin1-Proteins oder Pin1-Proteinfragments aus der Kultur.
Antikörper, welcher selektiv an das Pin1-Protein oder Pin1-Proteinfragment nach einem der Ansprüche 1 bis 4 bindet.
Nucleinsäuremolekül, welches in der Lage ist, selektiv an eine Nucleinsäuresequenz nach Anspruch 6 oder einen komplementären Strang davon zu binden.
Verfahren zur Identifizierung eines Proteins, welches mit einem Pin1-Protein oder Pin1-Proteinfragment assoziiert, umfassend: (a) Inkubieren des Proteins mit einem Pin1-Protein oder Pin1-Proteinfragment nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder mit der Zelle nach Anspruch 8, welche ein Pin1-Protein oder Pin1-Proteinfragment exprimiert, unter Bedingungen die ausreichend sind, um die Interaktion der Komponenten zu ermöglichen; und (b) Bestimmung der Wirkung des Proteins auf die Aktivität oder Expression eines Pin1-Proteins oder Pin1-Proteinfragments.
Verfahren zur Bestimmung, ob eine Zusammensetzung Pin1-Aktivität moduliert, umfassend: (a) Inkubieren der Zusammensetzung mit einem Pin1-Protein oder Pin1-Proteinfragment nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder mit einer Zelle nach Anspruch 8, welche ein Pin1-Protein oder Pin1-Proteinfragment exprimiert unter Bedingungen welche ausreichend sind um die Interaktion der Komponenten zu ermöglichen; und (b) Bestimmung des Effekts der Substanz auf die Aktivität oder Expression eines Pin1-Proteins oder Pin1-Proteinfragments.
Verwendung des Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 4, eines PPlase-Inhibitors, der Nucleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 5, 6 oder 11, des Vektors nach Anspruch 7 oder des Antikörpers nach Anspruch 10 zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung einer Zell-proliferativen Erkrankung in einem Patienten.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei der Inhibitor ein PPlase-Inhibitor, ein Anti-Pin1-Antikörper, eine Antisense-Nucleotidsequenz oder ein Ribozym ist.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei die Zell-proliferative Erkrankung ein bösartiger Tumor der Lunge, der Brust, des Lymphoid-, Gastrointestinal- oder Urogenitaltrakts oder Darmkrebs, ein Nierenzell-Karzinom, Prostatakrebs, Leukämie, Brustkrebs, ein Lungen-Karzinom vom nicht-kleinzelligen Typ, Krebs des Dünndarms oder Speiseröhenkrebs oder eine nicht bösartige oder immunologische Zell-proliferative Erkrankung wie Psoriasis, Pemphigus vulgaris, Bechet's Syndrom, akutes Atemnotsyndrom (ARDS), eine ischämische Herzkrankheit, Postdialysesyndrom, rheumatoide Arthritis, AIDS, Vasculitis, Lipid-Histiozytose, septischer Schock oder eine Entzündung ist.
Verfahren zum Nachweis des Pin1-Proteins oder Pin1-Proteinfragments nach einem der Ansprüche 1 bis 4 in einer Zelle, umfassend: (a) Inkontaktbringen der Zelle mit dem Antikörper nach Anspruch 10 in einer Weise, dass der Antikörper mit dem Pin1-Protein oder Pin1-Proteinfragment, welches in der Zelle vorhanden ist, reagiert; und (b) Nachweis der Bindung des Antikörpers an das Pin1-Protein oder Pin1-Proteinfragmentin der Zelle.
Verfahren zum Nachweis der Expression der Nucleinsäure nach Anspruch 4 in einer Zelle, umfassend: (a) Inkontaktbringen der Zelle mit einer Nucleinsäuresonde in einer Weise, dass die Sonde selektiv an die Nucleinsäure nach Anspruch 6, welche in der Zelle vorhanden ist, hybridisiert; und (b) Nachweis der Bindung der Nucleinsäuresonde an die Nucleinsäure in der Zelle.
Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, wobei die Zelle von einem Patienten stammt, von dem vermutet wird, dass er eine Pin1-assoziierte Zell-proliferative Erkrankung hat.