DE60029108T2

DE60029108T2 - Von cycklischem gmp-abhängige proteinkinase als chemotherapeutisches ziel für gegen protozoen gerichtete agenzien

Info

Publication number: DE60029108T2
Application number: DE60029108T
Authority: DE
Inventors: Anne Rahway GURNETT; A. Paul Rahway LIBERATOR; Robert Rahway DONALD; Dennis Rahway SCHMATZ; Georgianna Rahway HARRIS; J. Sandra Rahway RATTRAY
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1999-04-13
Filing date: 2000-04-10
Publication date: 2007-05-31
Anticipated expiration: 2020-04-11
Also published as: WO2000061781A1; US7125700B2; DE60041369D1; US20070009979A1; EP1212451A4; EP1212451B1; JP4540235B2; ES2265932T3; US20030211552A1; DK1676924T3; DE60029108D1; US6555358B1; JP5118721B2; PT1676924E; US7718390B2; SI1676924T1; CY1108977T1; ATE331807T1; JP2010193900A; AU776066B2

Description

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Proteinkinase, welche als chemotherapeutische Zielverbindung (target) für Antiprotozoika verwendet werden kann. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Identifizierung potentieller Antiprotozoika unter Verwendung der neuen Kinase, als auch ein Verfahren zur Behandlung protozoaler Infektionen unter Verwendung einer Substanz, die die Wirkung dieser Kinase inhibiert.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Parasitische Protozoen sind für eine große Anzahl von Infektionen bei Mensch und Tier verantwortlich. Viele dieser Krankheiten sind lebensbedrohend für den Wirt und in der Tierhaltung kann dies zu erheblichen wirtschaftlichen Verlusten führen. Zum Beispiel bleibt Malaria eine bedeutsame Gesundheitsbedrohung für Menschen, trotz massiver internationaler Anstrengungen, diese Krankheit auszurotten; Trypanosomiasis, wie zum Beispiel die durch Trypanosoma Cruzi verursachte Chagaskrankheit und die durch T. Brucei verursachte Schlafkrankheit sind in Südamerika bzw. Afrika nicht selten; und opportunistische Infektionen in immunsupprimierten Wirten verursacht durch Pneumocystis Carinii, Toxoplasma Gondii, Cryptoporidium sp. werden in den Industrieländern stetig bedeutsamer.
Coccidiosis, eine weit verbreitete Krankheit bei domestizierten Tieren, wird durch protozoale Infektion verursacht. In der Geflügelindustrie ist Coccidiosis für einen hohen Grad an Morbidität und für einen hohen Grad an Sterblichkeit in Geflügelpopulationen verantwortlich und kann zu extremen wirtschaftlichen Verlusten führen. Die Infektionserreger sind Protozoen der Gattung Eimeria. Einige der bedeutendsten Spezies der Vogel-Emeria schließen E. tenella, E. acervulina, E. necatrix, E. brunetti und E. maxima ein.
Für einige protozoale Krankheiten, wie zum Beispiel die Chagaskrankheit, gibt es keine befriedigende Behandlung; für andere könnten sich wirkstoffresistente Stämme der Protozoen entwickeln. Daher besteht ein stetes Bedürfnis, neue und effektive antiprotozoale Arzneimittel zu identifizieren. Jedoch war die antiparasitische Wirkstoffentwicklung meist ein wahlloses und aufwendiges Verfahren durch biologisches Screening von natürlichen Produkten und synthetischen Verbindungen gegen eine Gruppe von Parasiten. Dieser Prozess kann stark vereinfacht und mehr spezifisch gemacht werden, wenn eine biochemische Zielverbindung (target) für anti-protozoale Arzneimittel identifiziert werden kann und in den Screeningprozess einbezogen wird.
Von cGMP-abhängige Proteinkinasen (PKG) katalysieren die Phosphorylierung spezifischer Proteinsubstrate. In Abwesenheit von cGMP ist die Aktivität dieser Enzyme sehr gering. In Säugerzellen gibt es zwei Typen von PKG, eine lösliche Form (PKG1) und eine membrangebundene Form (PKG2). Mehrfach-Spleiss-Varianten des löslichen Proteins wurden identifiziert. Von PKGs ist bekannt, dass sie viele zelluläre Prozesse in höheren Lebewesen kontrollieren. Säuger-PKG1 tritt am reichlichsten im glatten Muskel, in Blutplättchen und im Kleinhirn auf. Gezielte Störung von PKG1 in Mäusen generierte Phenotypen, die eindeutig mit dem glatten Muskel assoziiert sind, nämlich schwere intestinale und vaskuläre Dysfunktionen. Die Exprimierung von PKG2 ist am höchsten im Dünndarm, in verschiedenen Regionen des Gehirns (insbesondere im Hypothalamus) und in der Lunge. Transgene Mäuse, denen PGK2 fehlt, zeigen einen verkümmerten Phenotyp, verursacht durch Ossifikationsfehler in den Wachstumsplatten, und haben ebenso intestinale Sekretionsdysfunktionen. PKGs wurden auch in Dictyostelium, Paramecium, Tetrahymena und Ascarides identifiziert.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine neue protozoale, cGMP-abhängige Proteinkinase (PKG) und eine Polynukleotidsequenz, die für das PKG Polypeptid codiert, bereit. Die Erfindung stellt eine PKG gereinigte Fraktion von Eimeria tenella, die im Wesentlichen aus der Aminosäuresequenz der SEQ-ID-NO: 11 besteht, und die Polynukleotidsequenz, die für das Polypeptide der SEQ-ID-NO: 11 codiert, bereit. Noch spezifischer handelt es sich um Polynukleotidsequenzen, wie in SEQ-ID-NO: 10 dargestellt sind.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen mit Aktivität gegen Protozoen bereit, umfassend:

(a) Kontaktieren einer Protozoen-PKG der Erfindung mit (i) einer bekannten Menge einer markierten Verbindung, welche mit einer PKG wechselwirkt, und (ii) einer bekannten Verdünnung einer Testverbindung oder eines Extrakts eines natürlichen Produktes; und
(b) quantitative Bestimmung der prozentualen Inhibierung der Wechselwirkung dieser markierten Verbindung, welche durch die Testverbindung induziert wird.

Die Verfahren der Erfindung stellen einen leichten und spezifischen Test bereit, um Verbindungen als potentielle anti-protozoale Arzneimittel zu überprüfen.
Polypeptide
Die neue PKG der vorliegenden Erfindung ist von protozoalem Ursprung; insbesondere liegt das Enzym in Protozoen der Apicomplexan-Familie und noch spezieller in Eimeria sp. vor. Die native Eimeria tenella PKG der vorliegenden Erfindung ist ein Protein mit etwa 120 kDa und hat etwa 1003 Aminosäuren. Die PKG der vorliegenden Erfindung umfasst ein Rohextrakt des löslichen Proteins, eine gereinigte PKG-Fraktion, die aus einem protozoalen Parasiten isoliert ist (natives Enzym), ein affinitätsgereinigtes natives PKG (gereinigt aus einem löslichen Extrakt unter Verwendung von cGMP, substratbasierenden Peptiden, inhibitorbasierenden Molekülen oder Antikörpern) sowie eine PKG, welche durch rekombinante DNA-Technik (rekombinant exprimiertes Enzym) hergestellt wird. Der Ausdruck "gereinigte PKG-Fraktion" wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein PKG-Polypeptid, welches frei ist von meist anderen Proteinen, Lipiden, Kohlenhydraten, Nucleinsäuren oder anderen Materialien, mit denen es naturgemäß assoziiert ist. Ein Fachmann kann unter Verwendung von Standardtechniken für die Proteinreinigung PKG reinigen. Die gereinigte PKG-Fraktion wird eine Hauptbande auf einem reduzierenden Polyacrylamidgel ergeben. Die Sequenz des Polypeptids kann durch Aminosäuresequenzierung bestimmt werden.
Die protozoalen PKGs der vorliegenden Erfindung umfassen ein Polypeptid der SEQ-ID-NO: 11. Kleinere Modifikationen der ursprünglichen Aminosäuresequenz der PGK können zu Proteinen führen, welche eine im Wesentlichen äquivalente Aktivität haben, im Vergleich zu dem hierin beschriebenen PKG-Polypeptid. Solche Modifikationen können bewusst, beispielsweise durch zielgerichtete Mutagenese, oder spontan auftreten. Des Weiteren kann die Deletion einer oder mehrere Aminosäuren zu einer Modifikation der Struktur des resultierenden Moleküls führen, ohne wesentlich die Kinaseaktivität zu verändern. Dies kann zur Entwicklung eines kleineren aktiven Moleküls führen, welches einen breiteren Nutzen haben kann. Zum Beispiel ist es möglich, die Aminsäuren am Amino- oder Carboxyl-terminalen Ende, welche nicht für die Kinaseaktivität notwendig sind, zu entfernen.
Das PKG-Polypeptid der Erfindung kann konservative Variationen der Polypeptidsequenz eingehen, was nicht wesentlich die biologische Aktivität des Proteins verändert. Der Ausdruck "konservative Variation" wie hierin verwendet, bezeichnet den Austausch eines Aminosäurerests durch einen anderen, biologisch ähnlichen Rest. Beispiele für konservative Variationen umfassen die Substitution eines hydrophoben Restes, wie Isoleucin, Valin oder Leucin, durch einen anderen, oder die Substitution eines polaren Restes durch einen anderen, wie zum Beispiel die Substitution von Arginin für Lysin, die Substitution von Glutaminsäure für Asparginsäure, oder die Substitution von Glutamin für Asparagin, und dergleichen. Der Ausdruck "konservative Variation" umfasst auch die Verwendung einer substituierten Aminosäure anstatt einer unsubstituierten Stammaminosäure, vorausgesetzt, dass die Aktivität des Enzyms nicht im Wesentlichen geändert wird.
Polynukleotide
Die Erfindung stellt auch isolierte Polynukleotidsequenzen bereit, die für ein Polypeptid codieren, das die Aminosäuresequenz der SEQ-ID-NO: 11 hat. Wie hierin verwendet, bezieht sich "Polynukleotid" auf Polydesoxyribonukleotide oder Polyribonukleotide in der Form eines separaten Fragments oder eines längere Konstrukts, und umfasst DNA-, cDNA- und RNA-Sequenzen, welche für protozoales PKG codieren. Der Ausdruck "isoliert", wie hierin verwendet, umfasst Polynukleotide, welche im Wesentlichen frei sind von anderen Nucleinsäuren, Porteinen, Lipi den, Kohlehydraten oder anderen Materialien, mit welchen sie naturgemäß assoziiert sind.
Es ist bekannt, dass eine beachtliche Menge an Redundanz in den verschiedenen Codons, welche für spezifische Aminosäuren codieren, vorhanden ist. Es gibt 20 natürliche Aminosäuren, wobei die meisten davon durch mehr als ein Codon bestimmt werden. Daher ist die Erfindung auch auf solche DNA-Sequenzen gerichtet, die alternative Codons enthalten, welche für die eventuelle Translation der identischen Aminosäure codieren. Zum Zwecke dieser Beschreibung wird eine Sequenz, die eine oder mehrere ausgetauschte Codons enthält, als eine degenerierte Variation bezeichnet. Daher offenbart die vorliegende Erfindung eine Codonredundanz, welche zu verschiedenen DNA-Molekülen führen kann, die ein identisches Protein exprimieren.
Besonders offenbart ist hierin eine cDNA-Sequenz mit einer Länge von 4283 Basenpaaren (bp) (SEQ-ID-NO: 10), welche die vorausgesagte Codierungsregion für E. tenella PKG enthält. Die cDNA umfasst einen offenen Leserahmen von 3009 Basenpaaren, der ein Protein von etwa 1003 Aminosäuren codiert, mit einem abgeleiteten Molekulargewicht von etwa 113 kDa. Die Polynucleotide, welche PKG codieren, umfassen die Nukleotidsequenz SEQ-ID-NO: 10 sowie zu dieser Sequenz komplementäre Nukleinsäuresequenzen. Eine komplementäre Sequenz kann ein Antisinn-Nukleotid umfassen. Wenn die Sequenz RNS ist, sind die Desoxynukleotide A, G, C und T durch die Ribonukleotide A, G, C bzw. U ausgetauscht.
Jede aus einer Vielzahl von Verfahren kann verwendet werden, um PKG zu klonieren. Diese Methoden umfassen, aber sind nicht beschränkt darauf,

(1) eine RACE-PCR-Klonierungstechnik (Frohman et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 8998-9002). 5' und/oder 3' RACE kann durchgeführt werden, um eine cDNA-Sequenz von voller Länge zu generieren. Die Vorgehensweise beinhaltet die Verwendung genspezifischer Oligonukleotidprimer für die PCR-Amplifikation von PKG-cDNA. Diese genspezifischen Primer sind aufgebaut durch Identifikation einer expressed-sequence-tag-(EST)-Nukleotidsequenz, welche durch Durchsuchung je der Nummer von öffentlich zugänglichen Nukleinsäure und Protein-Datenbanken identifiziert wurde;
(2) Direktfunktionalexpression der PKG-cDNA in einem geeigneten Expressionsvektorsystem im Anschluß an den Aufbau einer cDNA-Bibliothek welche PKG enthält;
(3) Screening einer PKG-enthaltenden cDNA-Bibliothek, welche in einem Bakteriophagen- oder Plasmid-Vektor angelegt ist, mit einer markierten degenerierten Oligonucleotidsonde, welche aus der Aminosäuresequenz des PKG-Proteins aufgebaut ist;
(4) Screening einer PKG-enthaltenden cDNA-Bibliothek, welche in einem Bakteriophagen- oder Plasmid-Vektor angelegt ist, mit einer partiellen cDNA, die das PKG-Protein codiert. Diese partielle cDNA ist durch die spezifische PCR-Amplifikation der PKG-DNA Fragmente erhalten worden durch den Aufbau von degenerierten Oligonukleotidprimern aus der Aminosäuresequenz, die für Kinasen bekannt sind, welche mit dem PKG-Protein zusammenhängen;
(5) Screening einer PKG-enthaltenden cDNA Bibliothek, welche in einem Bakteriophagen- oder Plasmid-Vektor angelegt ist, mit einer partiellen cDNA, welche das PKG-Protein codiert. Diese Vorgehensweise kann auch die Verwendung von Genspezifischen Oligonukleotidprimern für die PCR-Amplifikation der PGK-cDNA, identifiziert als ein EST wie oben beschrieben, umfassen; oder
(6) Aufbau von 5' und/oder 3' Gen-spezifischen Oligonukleotiden unter Verwendung von SEQ-ID-NO: 10 als ein Templat, so dass entweder die cDNA mit voller Länge durch bekannte RACE-Techniken generiert wird, oder es wird ein Teil der Codierungsregion durch dieselben bekannten RACE-Techniken generiert, um einen Teil der Codierungsregion zu erzeugen und zu isolieren, zur Verwendung als Sonde zum Screenen einer Vielzahl von Typen von cDNA und/oder Genombibliotheken, mit dem Zweck, eine Volllängenversion der Nucleotidsequenz zu isolieren, die PKG codiert.

Es ist für den Fachmann leicht ersichtlich, dass geeignete cDNA-Bibliotheken von Zellen oder Zelllinien hergestellt werden können, die eine PKG-Aktivität haben. Die Selektion von Zellen oder Zelllinien zur Verwendung für die Herstellung einer cDNA-Bibliothek, um eine PKG-cDNA zu isolieren, wird so durchgeführt, dass zunächst die zellassoziierte PKG-Aktivität unter Verwendung irgendeines bekannten Tests für PKG-Aktivität, gemessen wird.
Die Herstellung von cDNA-Bibliotheken kann durch Standardtechniken, wie sie allgemein bekannt sind, durchgeführt werden. Bekannte Konstruktionstechniken für cDNA-Bibliotheken können z.B. in Sambrook, et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor New York gefunden werden. Komplementäre DNA-Bibliotheken können auch von einer Vielzahl kommerzieller Quellen erhalten werden, eingeschlossen, aber nicht beschränkt auf Clontech Laboratories, Inc. und Stratagene.
Es ist für den Fachmann leicht ersichtlich, dass DNA, welche PKG codiert, auch von geeigneten Genom-DNA-Bibliotheken isoliert werden kann. Der Aufbau von Genom-DNA-Bibliotheken kann durch allgemein bekannte Standardtechniken durchgeführt werden. Bekannte Aufbautechniken für eine Genom-DNA-Bibliothek können in Sambrook et al., siehe oben, gefunden werden. Genom-DNA-Bibliotheken können auch von einer Vielzahl kommerzieller Quellen erhalten werden, eingeschlossen, aber nicht beschränkt auf Clontech Laboratories, Inc. und Stratagene.
Um das PKG-Gen durch eine der bevorzugten Methoden zu klonieren, ist die Aminosäuresequenz oder DNA-Sequenz von PKG oder eines homologen Proteins notwendig. Um dies zu bewerkstelligen, kann die PKG oder ein homologes Protein gereinigt werden und eine Teilaminosäuresequenz durch einen automatischen Sequenzierer bestimmt werden. Es ist nicht notwendig, die gesamte Aminosäuresequenz zu bestimmen, aber die lineare Sequenz von zwei Regionen von 6 bis 8 Aminosäuren kann für die PCR Amplifikation eines partiellen PKG-DNA Fragments bestimmt werden. Sobald geeignete Aminosäuresequenzen identifiziert wurden, werden die DNA-Sequenzen synthetisiert, die geeignet sind diese zu codieren. Da der genetische Code degeneriert ist, kann mehr als ein Codon verwendet werden, um eine bestimmte Aminosäure zu codieren, und demnach kann die Aminosäuresequenz durch jede aus einer Reihe von ähnlichen DNA-Oligonukleotiden codiert werden. Nur ein Mitglied dieser Reihe ist identisch mit der PKG-Sequenz, wobei die anderen in der Reihe je doch geeignet sind, sogar in der Gegenwart von DNA-Nukleotiden mit Basenfehlpaarungen, an die PKG-DNA zu hybridisieren. Die DNA-Oligonukleotide mit Basenfehlpaarungen können weiterhin an die PGK-DNA hybridisieren und erlauben somit eine Identifikation und Isolierung von für PKG codierender DNA.
Alternativ kann die Nukleotidsequenz einer Region einer exprimierten Sequenz mittels Durchsuchung einer oder mehreren zugänglichen Datenbanken identifiziert werden. Genspezifische Primer von entweder einer cDNA-Bibliothek oder von eine Population von cDNA können verwendet werden, um eine PCR Amplifikation einer cDNA, die von Interesse ist, durchzuführen. Wie oben erwähnt kann die geeignete Nukleotidsequenz für die Verwendung in einem PCR-basierenden Verfahren von SEQ-ID-NO: 10 erhalten werden, entweder zum Zwecke der Isolierung von überlappenden 5' und 3' RACE-Produkten für die Herstellung einer für PKG codierenden Volllängensequenz, oder zur Isolierung eines Teils der für PKG codierenden Nukleotidsequenz zur Verwendung als Sonde, zum Screenen einer oder mehrerer cDNA-Bibliotheken oder Genom-basierende Bibliotheken, um eine für PKG oder PKG-artige Proteine codierende Volllängensequenz zu isolieren.
DNA-Sequenzen der Erfindung können durch verschiedene Methoden erhalten werden. Zum Beispiel kann die DNA unter Verwendung von Hybridisierungstechniken, welche auf dem Gebiet bekannt sind, isoliert werden. Diese umfassen, sind aber nicht beschränkt auf: 1) Hybridisierung an Genom- oder cDNA-Bibliotheken mit Sonden um homologe Nukleotidsequenzen zu detektieren; 2) Antikörperscreening von Expressionsbibliotheken, um klonierte DNA-Fragmente mit gemeinsamen Strukturelementen zu detektieren; und 3) PCR-Amplifikation einer gewünschten Nukleotidsequenz unter Verwendung von Oligonukleotidprimern.
Auf Nukleinsäurehybridisierung basierende Screeningverfahren machen es möglich, jede Gensequenz von jedem Organismus zu isolieren, vorausgesetzt die geeignete Sonde ist zugänglich. Oligonukleotidsonden, welche mit einem Teil der Sequenz korrespondieren, die das fragliche Protein codiert, können chemisch synthetisiert werden. Dies verlangt, dass kurze Oligopeptidstrecken der Aminosäuresequenz bekannt sein müssen.
Die das Protein codierende DNA-Sequenz kann von dem genetischen Code abgeleitet werden; jedoch muss die Entartung des Codes berücksichtigt werden. Es ist möglich eine gemischte Additionsreaktion durchzuführen, wenn die Sequenz entartet ist. Dieses umfasst eine heterogene Mischung von entarteter doppelsträngiger DNA. Für solch ein Screening wird die Hybridisierung entweder an einer einzelsträngigen DNA oder an einer denaturierten doppelsträngigen DNA durchgeführt. Die Hybridisierung ist insbesondere bei der Detektion von cDNA Klonen geeignet, die aus Quellen stammen, in denen eine extrem geringe Menge an der zu dem Polypeptid von Interesse zugehörigen mRNA-Sequenz vorliegt. Mit anderen Worten, bei der Verwendung stringenter Hybridisierungsbedingungen, die darauf ausgerichtet sind nicht-spezifische Bindung zu vermeiden, ist es zum Beispiel möglich, die autoradiographische Visualisierung eines spezifischen cDNA Klons bei der Hybridisierung der Ziel-DNA an diese Einzelsonde in der Mischung, welche sein genaues Gegenstück ist, zu ermöglichen (Wallace, et al., Nucl. Acid. Res., 9: 879, 1981).
Der Herausbildung von spezifischen DNA-Sequenzen, die für PKG codieren, ist ebenso erhältlich durch: 1) Isolation von doppelsträngigen DNA-Sequenzen aus einer genomischen DNA; 2) chemische Herstellung einer DNA-Sequenz, zur Bereitstellung der notwendigen Codons für das Polypeptid von Interesse; und 3) in vitro Synthese einer doppelsträngigen DNA-Sequenz durch reverse Transkription einer mRNA, welche aus einer eukaryontischen Spenderzelle isoliert ist. Im letzteren Fall wird letztlich eine doppelsträngige DNA als Gegenstück einer mRNA gebildet, welche allgemein als cDNA bezeichnet wird.
Wenn die gesamte Sequenz der Aminosäurereste des gewünschten Polypeptids unbekannt ist, ist die direkte Synthese von DNA-Sequenzen nicht möglich und die Methode der Wahl ist die Synthese von cDNA-Sequenzen. Unter den Standardverfahren für die Isolierung von cDNA-Sequenzen von Interesse ist die Bildung von Plasmid- oder Phagentnagenden cDNA-Bibliotheken, die von der revensen Transkription der mRNA stammen, welche reichlich in Donorzellen vorhanden ist, die einen hohen Grad an genetischer Expression haben. Im Falle einer Kombination mit der Polymerasekettenreaktionstechnik können sogar seltene Expressionsprodukte kloniert werden. In den Fällen, wo beachtliche Teilbereiche der Aminosäuresequenz des Polypeptids bekannt sind, kann die Produktion von markierter einzel- oder doppelsträngi ger DNA oder RNA-Sondensequenzen, die eine Sequenz vermeintlich gegenwärtig in der Ziel cDNA duplizieren, in den DNA/DNA Hybridisierungsverfahren angewendet werden, welche an klonierten Kopien der cDNA ausgeführt werden, welche in Einzelstrangform denaturiert wurden.
Ein bevorzugtes Verfahren, um beispielsweise genomische DNA zu erhalten, ist die Polymerasekettenreaktion (PCR), welche auf ein in-vitro Verfahren zur Nukleinsäuresynthese basiert, bei der ein bestimmtes Segment der DNA spezifisch repliziert wird. Zwei Oligonukleotideprimer, die das zu amplifizierende DNA-Fragment flankieren, werden in sich wiederholenden Zyklen von Wärmedenaturierung der DNA, Anlagerung (annealing) der Primer an ihre komplementären Sequenzen und Verlängerung der angelagerten (annealed) Primer mit DNA-Polymerase, verwendet. Diese Primer hybridisieren an gegenüberliegenden Strängen der Zielsequenz und sind so orientiert, dass die DNA-Synthese mittels der Polymerase in der Regionen zwischen den beiden Primer vonstatten geht. Nachdem die Verlängerungsprodukte selbst ebenfalls komplementär zueinander und geeignet sind, Primer zu binden, verdoppeln aufeinander folgende Zyklen von Amplifikation, im Wesentlichen die doppelte Menge der Ziel-DNA, die im vorhergehenden Zyklus synthetisiert worden ist. Das Ergebnis ist eine exponentielle Akkumulation der spezifischen Zielfragmente in etwa 2 <n>, worin n die Zahl der Zyklen der durchgeführten Amplifikation ist (sieh PCR Protocols. Eds. Innis, et al., Academie Press. Inc. 1990).
Eine cDNA-Expressionsbibliothek, in einem Vektor wie Lambda gt11, kann für PKG-Peptide, welche zumindest ein Epitop haben, durch Verwendung von Antikörpern, die spezifisch für PKG sind, indirekt gescreent werden. Solche Antikörper können entweder polyklonal oder monoklonal erhalten worden sein und können verwendet werden, um ein Expressionsprodukt zu detektieren, welches auf die Gegenwart von PKG-cDNA hinweist. Die Polynukleotidsequenz für PKG umfasst auch Sequenzen, die komplementär zu dem Polynukleotid sind, das für PKG codiert (antisinn Sequenzen). Anitsinn-Nukleinsäuren sind DNA- oder RNA-Moleküle, die zumindest zu einem Teil eines spezifischen mRNA-Moleküls komplementär sind (Weintraub, Scientific American, 262: 40, 1990). Die Erfindung umfasst alle Antisinn-Polynukleotide, welche geeignet sind die Produktion des PKG-Polypeptids zu inhibieren. In der Zelle hybridisieren die Antisinn-Nukleinsäuren an die korrespondierende mRNA, und bilden ein doppelsträngiges Molekül. Die Antisinn-Nukleinsäuren können Einfluss haben auf die Translation der mRNA, da die Zelle eine mRNA, die doppelsträngig ist, nicht translatiert, oder alternativ eine doppelsträngige mRNA für den Abbau markiert. Antisinn-Oligomere mit etwa 15 Nukleotiden sind bevorzugt, da sie leicht herzustellen sind, klein genug sind in die Zelle einzudringen und weniger wahrscheinlich Probleme verursachen als größere Moleküle, wenn diese in die Zelle, die das Ziel-PKG produziert, eingeführt werden. Die Verwendung von Antisinn-Verfahren, um die Translation von Genen zu inhibieren, ist auf dem Gebiet bekannt (Marcus-Sakura, Anal Biochem. 172: 289, 1988)
Vektoren, Wirtszellen, Expression
DNA-Sequenzen die PKG codieren, können in vitro mittels DNA-Transfer in eine geeignete Wirtszelle exprimiert werden. "Wirtszellen" sind Zellen, in denen ein Vektor, der DNA-Sequenzen von Interesse trägt, vermehrt werden kann, und das Protein, für das durch die DNA-Sequenzen codiert, exprimiert werden kann. Der Ausdruck umfasst jeden Abkömmling der betreffenden Wirtszelle. Es versteht sich, dass alle Abkömmlinge nicht identisch zur Elternzelle sind, da Mutationen auftreten können, die sich während der Replikation ereignen. Jedoch werden solche Abkömmlinge von dem Ausdruck "Wirtszelle" umfasst, wenn dieser verwendet wird. Verfahren eines stabilen Transfers, das bedeutet, dass die fremde DNA in dem Wirt beständig verbleibt, sind bekannt.
Eine Vielzahl von Expressionsvektoren können verwendet werden, um eine rekombinante PKG in Wirtszellen zu exprimieren. "Expressionsvektoren" sind DNA Sequenzen, die für die Transkription einer klonierten DNA und für die Translation ihrer mRNAs in einen geeigneten Wirt benötigt werden. Solche Vektoren können verwendet werden, um eukaryotische DNA in einer Reihe von Wirten, wie zum Beispiel Bakterien, Blau-Grün-Algen, Pflanzenzellen, Insektenzellen, Apikomplexanparasiten und tierischen Zellen, zu exprimieren. Besonders aufgebaute Vektoren erlauben das Pendeln der DNA zwischen Wirten, wie zum Beispiel Bakterien-Hefe, Bakterien-Insektenzellen, Bakterien-Apikomplexanparasiten oder Bakterien-tierische Zellen. Ein geeigneter konstruierter Expressionsvektor sollte enthalten: einen Replikationsursprung für die selbständige Replikation in Wirtszellen, ausgewählte Marker, eine begrenzte Anzahl von nützlichen Restriktionsenzymstellen, ein Leistungsvermögen, welches eine hohe Anzahl von Kopien erlaubt, und aktive Promotoren. Andere Expressionsvektoren enthalten keinen Replikationsursprung für die selbständige Replikation in Wirtszellen sondern hängen eher von der Fähigkeit des Vektors ab, sich unter Verwendung eines Markers, der hinsichtlich der Integration/Aufrechterhaltung gewählt werden muss, stabil zu integrieren (entweder willkürlich oder durch ein homologes Integrationsereignis). Ein Promotor ist definiert als eine DNA-Sequenz, die die RNA-Polymerase leitet, an DNA zu binden und die RNA-Synthese initiiert. Ein starker Promotor ist einer der in hoher Anzahl die Initiierung von mRNAs verursacht. Expressionsvektoren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Klonierungsvektoren, modifizierte Klonierungsvektoren, spezifisch designed Plasmide oder Viren.
Kommerziell erhältliche Säugetierexpressionsvektoren, welche für rekombinante PKG Expression geeignet sind, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, pcDNA3, pcDNA3.1, pcDNAI, pcDNAIamp (Invitrogen), pMCIneo (Stratagene), pXTI (Stratagene), pSG5 (Stratagene) EBO-pSV2-neo (ATCC 37593) pBPV-1(8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo(342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460), und λZD35 (ATCC 37565).
Eine Vielzahl von Bakterienexpressionsvektoren können verwendet werden, um rekombinante PKG in Bakterienzellen zu exprimieren. Kommerziell erhältliche Bakterienexpressionsvektoren, welche geeignet sind für die rekombinante PKG-Expression umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, pCR2.1 (Invitrogen), pET11a (Novagen) Lambda gt11 (Invitrogen), pcDNAII (Invitrogen), pKK223-3 (Pharmacia) und pQE Vektoren (Qiagen).
Eine Vielzahl von Expressionsvektoren für Pilzzellen können verwendet werden, um rekombinante PKG in Pilzzellen zu exprimieren. Kommerziell erhältliche Expressionsvektoren für Pilzzellen, welche für die rekombinante PKG-Expression geeignet sind, umfassen, aber sind nicht beschränkt auf, pYES2 (Invitrogen), Pichia Expressionsvektor (Invitrogen).
Eine Vielzahl von Expressionsvektoren für Insektenzellen können verwendet werden, um rekombinante PKG in Insektenzellen zu exprimieren. Kommerziell erhältlich Expressionsvektoren für Insektenzellen, welche für die rekombinante Expression von PKG geeignet sind, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf pBlueBacIII, pBlueBacHis2 (Invitrogen) und pFastBacI, pFastBacHT (Life Technologies).
Eine Vielzahl von Expressionsvektoren kann verwendet werden, um rekombinante PKG in Apikomplexanparasiten, vor allem Toxoplasma gondii, zu exprimieren. Expressionsvektoren, welche für die rekombinante Expression von PKG geeignet sind, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf pminCAT/HXGPRT-, pDHFR-TSc3/M3, pDHFR-TSc3/M2M3, pminiHXGPRT, und pminP30/G (NIH AIDS Research and Reference Reagent Program).
Der Expressionsvektor kann in die Wirtszellen über jede aus einer Vielzahl von verschiedenen Techniken, umfassend, aber nicht beschränkt auf, Infektion, Transformation, Transfektion, Lipofektion, Protoplastfusion und Elektroporation, eingeführt werden. Die Zellen, die den Expressionsvektor enthaltenen, werden klonal vermehrt und werden einzeln analysiert, um festzustellen, ob sie das PKG-Protein produzieren. Die Identifikation von PKG exprimierenden Wirtszellklonen kann über verschiedener Wege erfolgen, umfassend, aber nicht beschränkt auf, immunologische Reaktivität mit Anti-PKG-Antikörpern.
Die Expression von PKG-DNA kann auch unter Verwendung von in vitro produzierter synthetischer mRNA oder nativer mRNA durchgeführt werden. Synthetische mRNA oder mRNA, welche aus PKG produzierenden Zellen isoliert wird, kann effizient in verschiede zellfreie Systeme translatiert werden, umfassend, aber nicht beschränkt auf, Weizenkeimextrakten und Retikulozytenextrakten, als auch effizient in zellbasierende Systeme translatiert werden, umfassend, aber nicht beschränkt auf, Mikroinjektion in Froschoozyten, wobei die Mikroinjektion in Froschoozyten bevorzugt ist.
Eine Vielzahl von Wirt-Expressionsvektor-Systemen kann verwendet werden, um die PKG codierende Sequenz zu exprimieren. Dies umfasst, ist aber nicht beschränkt auf Mikroorganismen, wie zum Beispiel mit rekombinanter Bakteriopha gen-DNA transformierte Bakterien, mit Plasmid-DNA oder mit Cosmid-DNA Expressionsvektoren, welche die für PKG codierende Sequenz enthalten; Hefe, transformiert mit rekombinanten Hefeexpressionsvektoren, die die für PKG codierende Sequenz enthalten; Pflanzenzellsysteme, welche mit rekombinanten Virusexpressionsvektoren infiziert sind (z.B. Blumenkohlmosaikvirus, CaMV; Tabakmosaikvirus, TMV) oder welche mit rekombinanten Plasmidexpressionsvektoren (z.B. Ti Plasmid), die die für PKG codierende Sequenz enthalten, transformiert sind; Insektenzellsysteme, welche mit rekombinanten Virusexpressionsvektoren (z.B. Baculovirus), welche die für PKG codierende Sequenz enthalten, infiziert sind; oder tierische Zellsysteme, welche mit rekombinanten Virusexpressionsvektoren (z.B. Retroviren, Adenovirus, Kuhpockenvirus), die die für PKG codierende Sequenz enthalten, infiziert sind oder transformierte Tierzellsysteme, welche für eine stabile Expression geschaffen wurden.
Um die PKG-cDNA-Sequenze(n) zu bestimmen, die zu optimalen Grad an PKG-Protein führen, können folgende, aber nicht darauf beschränkte PKG-cDNA-Moleküle hergestellt werden: der offene Leserahmen der PGK-cDNA in voller Länge und verschiedene Konstrukte, welche Teile der cDNA enthalten, die nur spezifische Domären des Proteins oder eine Neuordnung der Domänen des Proteins codieren. Alle Konstrukte können so aufgebaut sein, dass sie keine, alle, oder Teile der 5'- und/oder 3'-untranslatierten Region der PKG enthalten. Die PKG-Aktivität und der Grad an Proteinexpression kann im Anschluss an das Einführen dieser Konstrukte, beide einzeln und in Kombination, in die geeigneten Wirtszellen, bestimmt werden. Im Anschluss an die Bestimmung der PKG-cDNA-Kassette, welche zu optimalen Expressionen in einem Transienttest führt, wird dieses PKG-cDNA-Konstrukt in eine Vielzahl von Expressionsvektoren (umfassend rekombinante Viren), umfassend, aber nicht beschränkt auf, solche für Säugetierzellen, Pflanzenzellen, Insektenzellen, Oozyten, Bakterien und Hefezellen, überführt.
Die Proteincodierungsregion der rekombinanten für PKG codierenden Sequenz kann auch auf der Stufe der cDNA modifiziert werden, um Epitop-Tags hinzuzufügen. Die Modifikation der cDNA-Sequenz ist meistens, aber nicht ausschließlich, auf die Region gerichtet, die für das amino- oder carboxytermiale Ende des Prote ins codiert. Dies ist wird durch jedes der verschiedenen Verfahren, die allgemein bekannt sind, erreicht. Beispiele der Modifikationen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, die influenzavirale HA-Markierung (tag), die FLAG-Markierung (tag), eine Hexahistidin-Markierung (tag), die c-myc-Markierung (tag), sowie die Fusionen mit maltosebindendem Protein, Glutathiontransferase und grün fluoreszierendes Protein. Diese Markierungen (tags) können als Mittel dienen, um rekombinante PKG von Wirt-PKG immunologisch unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Antiseren zu den Markierungssequenzen (Tag-Sequenzen) zu unterscheiden und können als ein Aufreinigungswerkzeug dienen, um rekombinante PKG von Wirt-PKG zu trennen.
Der Grad an rekombinantem PKG-Protein in Wirtszellen wird durch eine Vielzahl von Techniken, umfassend, aber nicht beschränkt auf, Immunoaftinitätstechnik und/oder Ligandenaffinitätstechnik, bestimmt. PKG-spezifische Affinitätskügelchen oder PKG-spezifische Antikörper werden verwendet, um PKG-Protein, welches metabolisch mit radioaktiven Aminosäuren wie [³H]-Leucin oder [³⁵S]-Methionin markiert ist, oder um unmarkiertes PKG Protein zu isolieren. Markiertes PKG-Protein wird durch SDS-PAGE analysiert. Unmarkiertes PKG-Protein wird mittels Western-Blot, ELISA oder RIA-Tests unter Einsatz von PKG-spezifischen oder Epitop-tag-spezifischen Antikörpern, bestimmt.
Reinigung von PKG
Im Anschluss an die Expression von PKG in Wirtszellen, kann das PKG-Protein zurück gewonnen werden, um PKG in aktiver Form bereitzustellen. Verschiedene PKG Reinigungsverfahren sind erhältlich und geeignet zur Verwendung. Rekombinante PKG kann von Zell-Lysaten und Extrakten oder von konditioniertem Kulturmedium durch verschiedene Kombination oder Einzelanwendung von Salzfraktionierung, Ionenaustauschchromatographie, Größenaustauschchromatographie, Hydroxylapatitadsorptionschromatographie, Hydrophobchromatographie und cyclischer Nukleotidaftinitätschromatographie gereinigt werden.
Zusätzlich kann die rekombinante PKG von anderen zellulären Proteinen durch die Verwendung einer Immunoaftinitätssäule, konditioniert mit monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern, die spezifisch für die PKG in der gesamten Länge oder spezifisch für Polypeptidfragmenten der PKG sind, separiert werden. Zusätzlich können polyklonale oder monklonale Antikörper gegen ein synthetisches Peptid (normalerweise etwa 9 bis 25 Aminosäuren lang), welches einen Teil des Proteins bildet, gerichtet werden.
Zur PKG monospezifische Antikörper werden aus Säugetierantisera gewonnen, die Antikörper enthalten, die gegen PKG reaktiv sind, oder werden als mit PKG reagierende monoklonale Antikörper unter Verwendung der Technik von Kohler und Milstein (1975 Nature 256: 495-497) hergestellt. Ein monospezifischer Antikörper wie hierin verwendet, ist als eine einzelne Antikörperspezies oder als multiple Antikörperspezies mit homogenen Bindungseigenschaften für PKG definiert. Homogenes Binden, so wie hierin verwendet, bezieht sich auf die Fähigkeit der Antikörperspezies an ein spezifisches Antigen oder Epitop, wie zum Beispiel solche, die mit dem PKG, wie es oben beschrieben ist, assoziiert sind, zu binden. PKG spezifische Antikörper werden durch die Immunisierung von Lebewesen, wie Mäuse, Ratten, Meerschweinchen, Hasen, Ziegen, Pferde und dergleichen, mit einer geeigneten Konzentration an PKG oder synthetischem PKG-Peptid, entweder mit oder ohne einen immunen Hilfsstoff, vermehrt.
Das präimmune Serum wird vor der ersten Immunisierung gesammelt. Jedes Tier erhält zwischen etwa 0,1 μg und etwa 1000 μg der PKG, welche mit einem verträglichen immunen Hilfsstoff assoziiert ist. Solche verträglichen Hilfsstoffe umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Freund'scher kompletter Hilfsstoff, Freund'scher inkompletter Hilfsstoff, Alum-Prezipitat, Wasser in Ölemulsion, die Corynebacterium parvum und tRNA enthalten. Die Initialimmunisierung besteht aus dem PKG-Protein oder dem synthetischen PKG-Peptid, vorzugsweise in Freund'schen komplettem Hilfsstoff an mehreren Stellen, entweder subkutan (SK), intraperitoneal (IP) oder beide. Jedem Tier wird in regelmäßigen Intervallen, vorzugsweise wöchentlich, Blut abgenommen, um den Antikörpertiter zu bestimmen. Die Tiere erhalten oder erhalten keine zusätzlichen Injektionen, die der Initialimmunisierung folgen. Tieren, die zusätzliche Injektionen erhalten, werden gewöhnlich gleiche oder geringere Mengen an PKG in Freund's inkompletten Hilfsstoff über dieselbe Route verabreicht. Zusätzliche Injektionen werden in etwa drei Wochenintervallen bis die maximalen Titer erreicht sind, verabreicht. Nach etwa 7 Tagen nach jeder zusätzlichen Immunisierung oder etwa wöchentlich nach der ersten Immunisierung wird den Tieren Blut abgenommen, das Serum gesammelt und die Aliquote bei etwa –20°C aufbewahrt.
Monoklonale Antikörper (mAb) die mit PKG reagieren, werden durch Immunisierung gezüchteter Mäuse, vorzugsweise Balb/c, mit PKG hergestellt. Die Mäuse werden über die IP oder SC Route mit etwa 1 μg bis etwa 100 μg, vorzugsweise etwa 10 μg, an PKG in etwa 0,5 ml Puffer oder Salzlösung, eingearbeitet in das selbe Volumen eines verträglichen Hilfsstoffs wie oben beschrieben, immunisiert. Freund's kompletter Hilfsstoff ist bevorzugt. Die Mäuse erhalten eine Initialimmunisierung am Tag 0 und werden für 3 bis 30 Wochen geschont. Den immunisierten Mäusen werden ein oder mehrere zusätzliche Immunisierungen von etwa 1 bis etwa 100 μg desselben PKG-Antigens in einer Pufferlösung, wie phosphatgepufferte Salzlösung, über die intravenöse (IV) Route verabreicht. Die Lymphozyten von auf Antikörper positiven Mäusen, vorzugsweise Milzlymphozyten, werden durch die Entfernung der Milz aus den immunisierten Mäusen mittels Standardverfahren, wie im Stand der Technik bekannt, erhalten. Hybridomazellen werden durch Mischen der Milzlymphozyten mit geeigneten Fusionspartnern, vorzugsweise Tumorzellen, unter Bedingungen, welche die Bildung stabiler Hybridome erlauben, hergestellt. Fusionspartner umfassen, sind aber nicht beschränkt darauf: Maustumore P3/NS1/Ag 4-1; MPC-11; S-194 und Sp 2/0, wobei Sp 2/0 bevorzugt sind. Die die Antikörper produzierenden Zellen und die Tumorzellen werden in Polyethylenglycol, etwa 1000 mol. Gew.-% bei Konzentrationen von etwa 30% bis etwa 50% verschmolzen. Verschmolzene Hybridomazellen werden durch Wachstum in mit Hypoxanthin, Thymidin und Aminopterin ergänzten Dulbecco's modifizierten Eagles Medium (DMEM) mittels bekannter Vorgehensweisen gewonnen. Die überstehenden Flüssigkeiten der vom Wachstum positiven Mulden werden nach etwa 14, 18 und 21 Tagen gesammelt und bezüglich Antikörperproduktion mittels Immunoassay, wie zum Beispiel Festphasenimmunoradioassay (SPIRA) unter Verwendung von PKG als Antigen gescreent. Die Kulturflüssigkeiten werden ebenfalls in dem Ouchterlony-Präzipitationstest getestet, um das Isotyp des mAb zu bestimmen. Die Hybridomazellen der Antiköper positiven Mulden werden mittels Techniken, wie der Soft-Agar-Technik von MacPherson, 1973, Soft Agar Techniques, in Tissue Culture Methods and Applications, Kruse and Paterson, Eds., Academic Press., kloniert.
Monoklonale Antikörper werden in vivo mittels Injektion unberührter gezüchteter Balb/c Mäuse, etwa 0,5 ml pro Maus, mit etwa 2 × 10⁶ bis etwa 6 × 10⁶ Hybridomazellen nach 4 Tagen nach dem ersten Versetzen, produziert. Die Bauchflüssigkeit wird etwa 8-12 Tage nach dem Zelltransfer gesammelt und die monoklonalen Antikörper werden mittels Techniken, wie sie allgemein bekannt sind, gereinigt.
Die in vitro Produktion von anti-PKG-monoklonalen Antikörpern wird mittels Wachsen der Hybridoma in DMEM, welches etwa 2% fetales Kälberserum enthält, um ausreichende Mengen an dem spezifischen monoklonalen Antikörper zu erhalten, ausgeführt. Die monoklonalen Antikörper werden mittels Techniken, wie sie allgemein bekannt sind, aufgereinigt.
Die Antikörpertiter der Bauchwasser oder Hybridomakulturflüssigkeiten werden mittels verschiedener serologischer oder immunologischer Tests, welche umfassen, aber nicht beschränkt sind auf Präzipitation, passive Agglutination, enzymgekoppelte Immunabsorptionsantikörper-(ELISA)-Technik oder Radioimmunotest-(RIA)-Techniken, bestimmt. Ähnliche Tests werden verwendet, um die Gegenwart von PKG in Körperflüssigkeiten oder Geweben oder Zellextrakten zu bestimmen.
Es ist für den Fachmann leicht ersichtlich, dass die oben beschriebenen Verfahren für die Herstellung monospezifischer Antikörper genutzt werden können, um Antikörper spezifisch für PKG Polypeptidfragmente oder PKG-Polypeptid mit voller Länge herzustellen.
Affinitätssäulen für PKG Antikörper werden durch Hinzufügen der Antikörper zu Affigel-10 (Biorad), einem Gelträger, welcher mit N-Hyxdroxysuccinimidestern voraktiviert ist, so dass die Antikörper kovalente Bindungen mit dem Agarosegelträger bilden, hergestellt. Die Antikörper werden dann an das Gel über die Amidbindung mit dem Spacerarm gebunden. Die verbleibenden aktivierten Ester werden dann mit 1 M Ethanolamin HCl (pH 8) gequenscht. Die Säule wird mit Wasser, gefolgt von 0,23 M Glycin-HCl (pH 2,6), gewaschen, um jeden nicht-konjugierten Antikörper oder fremdes Protein zu entfernen. Die Säule wird dann in Phosphatpuffersalzlösung (pH 7,3) äquilibriert und die Zellkulturüberstände oder die Zellextrakte, die PKG oder PKG Fragmente enthalten, werden langsam durch die Säule geschickt. Die Säule wird dann mit Phosphatpuffersalzlösung gewaschen, bis die optische Dichte (A₂₈₀) auf den Hintergrund zurückfällt, dann wird das Protein mit 0,23 M Glycin-HCL (pH 2,6) eluiert. Das gereinigte PKG-Protein wird dann gegen Phosphatpuffersalzlösung dialysiert.
Der Fachmann wird erkennen, dass die oben beschriebenen Verfahren zur Reinigung von rekombinanter expremierter PKG auch für die Reinigung von nativem Enzym von Protozoe-Parasiten geeignet sind.
Inhibitoren – Test und Moleküle
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die antiprotozoale Aktivität haben, bereitgestellt. In einer Ausführungsform umfasst dieses Verfahren:

(a) Kontaktieren einer Protozoen-PKG der Erfindung mit (i) einer bekannten Menge einer markierten Verbindung, welche mit einer PKG wechselwirkt, und (ii) einer bekannten Verdünnung einer Testverbindung oder eines Extrakts eines natürlichen Produktes; und
(b) quantitative Bestimmung der prozentualen Inhibierung der Wechselwirkung der markierten Verbindung, welche durch die Testverbindung induziert wird.

Die PKG kann ein gereinigtes oder partiell gereinigtes natives Enzym, ein geklontes PKG oder eine hergestellte Variante davon oder ein Rohprodukt des Enzyms sein.
Eine Verbindung, die mit PKG wechselwirkt, kann eine Verbindung sein, die ein Substrat für ein Enzym ist oder eine Verbindung, die an das Enzym entweder an seine aktive Seite oder an eine alternative Seite (z.B. die cGMP Bindungsdomänen), welches zu einer veränderten Bindungsaktivität führt, binden. Ein Substrat kann ein gewöhnliches Substrat der Proteinkinase (z.B. basisches Myosinprotein, MBP), ein synthetisches Peptid oder andere natürlich vorkommende Substrate sein. Beispiele von Verbindungen, die an PKG binden, sind bekannte Inhibitoren, wie KT5823, synthetische oder natürlich auftretende Peptide sowie andere kleine Molekül-(z.B. Nicht-Peptidyl)-Inhibitoren wie 2-(4-Fluorophenyl)-5-(N-methylpiperidin-4-yl)-3-(4-pyridyl)pyrrol, welches hierin als "Inhibitorverbindung" bezeichnet wird. Die Inhibitorverbindung und seine Herstellung wird in US Patent Nr. 5,792,778 offenbart. Die Verbindung, die mit PKG wechselwirkt, ist vorzugsweise markiert, um den Grad der Wechselwirkung zwischen der Verbindung und dem Enzym leicht bestimmen zu können. Bevorzugte radioaktive Marker sind [¹⁴C] oder [³H]. Die tritiierte Inhibitorverbindung kann wie folgt hergestellt werden:
Eine Lösung der Inhibitorverbindung (als freies Amin, 2,5 mg, 0,007 mmol) in DMSO (0,8 ml) wurde für eine halbe Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Hochspezifisch aktiviertes mit Tritium markiertes Methyliodid (200 mCi, 0,0026 mmol, bei 80 Ci/mmol in 0,4 ml Toluollösung) wurde zu dieser Mischung hinzugefügt und die sich ergebende klare Lösung wurde für 24 Stunden gerührt. Das Produkt wurde mit Isopropanol (35 ml) verdünnt, zur Trocknen eingedampft und mit 3 ml Methanol für die HPLC-Reinigung gelöst. Das Produkt wurde in einer Ampulle, die 7 ml kaltes Wasser (vor Verwendung im Kühlschrank gekühlt) enthielt, gesammelt. Nach dem Radioaktivitätstest und dem Radioreinheitstest, wurde die Probe im Kühlschrank gelagert, um sie vor Zersetzung zu schützen. Die Gesamtaktivität des gereinigten Produkts war 45 mCi und bei einer spezifischen Aktivität von 68 Ci/mmol (bei Messung des UV-Spektrums). HPLC Bedingungen waren: Zorbax SB-C18 Semi-prep Säule (5 um, 8,4 mml.D. × 250 mm), 65/35/0,1 (v/v/v) Wasser/Acetonitril/HClO₄. UV-Detektion bei 230 nm, 4,5 ml/min, Rt = 24,5 min, radiochemische Reinheit: 98,5%.
Die Testverbindung kann eine synthetische Verbindung, eine gereinigte Zubereitung, eine Rohzubereitung oder ein ursprüngliches Extrakt eines natürlichen Produktes, welches aus Pflanzen, Mikroorganismen oder tierischen Quellen erhalten wird, sein.
Eine besondere Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens basiert auf einer Testverbindung, die die Inhibierung der PKG-Aktivität induziert. Der Test der Enzym-Inhibierung umfasst die Zugabe der PKG der Erfindung zu Mischungen von Enzym substraten (eine davon ist radiomarkiert) und der Testsubstanz, wobei jede davon in bekannten Konzentrationen vorhanden ist. Die Menge an Enzym ist so gewählt, dass weniger als 20% des radiomarkierten Substrats (normalerweise [³²P] oder [³³P]-ATP) während den Tests verbraucht wird. Der Test wird mit der Testverbindung bei einer Serie von verschiedenen Verdünnungsgraden ausgeführt. Nach einer Inkubationsperiode, wird der markierte Teil des ATP Substrats kovalent durch enzymatische Reaktion an das Peptid oder Protein-Substrat gebunden. Dieses Reaktionsprodukt ist von dem nicht-inkooperierten Precursor getrennt und gezählt. Der Test wird gewöhnlich gleichzeitig mit einer Kontrolle (keine Testverbindung) und einer Positivkontrolle (enthält einen bekannten Enzyminhibitor anstatt der Testverbindung) durchgeführt. Die Konzentration der Testverbindung, bei welcher 50% der Enzymaktivität inhibiert wird (IC₅₀), wird unter Verwendung einer Erkennungsmethode bestimmt.
Obwohl die Enzyminhibierung die direkteste Messung für die Inhibierungsaktivität der Testverbindung ist, haben die vorliegenden Erfinder herausgefunden, dass Ergebnisse, die durch Konkurrenzbindungstests erhalten werden, in welchen die Testverbindung mit einem bekannten Inhibitor um die Bindung an der aktiven Seite des Enzyms in Wettbewerb steht sehr gut mit den Resultaten korreliert, die von dem Enzyminhibierungstests, wie oben beschrieben, erhalten werden. Demnach basiert eine andere Methode auf dem konkurrierenden Binden der Testverbindung und eines bekannten PKG-Inhibitors. Der Bindungstest stellt einen angenehmeren Weg dar, um die Enzyminhibierung zu bestimmen, da es die Verwendung eines Rohextraktes, der PKG enthält, anstatt eines partiell gereinigten Enzyms erlaubt. Die Verwendung des Rohextraktes mag nicht immer in dem Enzyminhibierungstest geeignet sein, da andere Enzyme die in dem Extrakt vorliegen, das Testsubstrat phoshorylieren können. Der Konkurrenzbindungstest wird durch die Zugabe der PKG der Erfindung zu einer Mischung aus der Testsubstanz und einem markierten Inhibitor, beide liegen in bekannten Konzentrationen vor, durchgeführt. Nach Inkubation wird der Enzym-Inhibitor-Komplex von den ungebundenen markierten Inhibitoren und der unmarkierten Testverbindung getrennt und gezählt. Es wird die Konzentration an Testverbindung kalkuliert, die notwendig ist, um 50% der Bindung des markierten Inhibitors an die PKG (IC₅₀) zu inhibieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform, nutzt das Verfahren der vorliegenden Erfindung eine rekombinante PKG oder eine native PKG, die von Eimeria sp. erhalten wird.
In einer noch mehr bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung des Weiteren die Bestimmung des IC₅₀ der Testverbindungen gegen die Wirt-PKG in entweder dem Enzyminhibierungstest oder dem Bindungstest, wie oben beschrieben, um solche Verbindungen zu identifizieren, die eine Selektivität für parasitische PKG über der eines Wirts haben. Die Tests sind dieselben wie die eben beschrieben mit der PKG-Aktivität, die man vom Protozoenwirt erhält, z.B. kann die Wirt-PKG von einer Säugetierquelle, z.B. Menschen, oder einer Vogelquelle, z.B. Hühner, erhalten werden.
Ein anderes Verfahren, welches geeignet ist, um Inhibitoren zu identifizieren, die selektiv für parasitische PKG der Erfindung sind, ist die Verwendung eines im Gel-Kinase-Tests, um den Grad der Substratphosphorylierung katalysiert durch parasitische PKG relativ zur Wirt-PKG oder anderen zellulären Kinaseaktivitäten zu bestimmen. Daher werden Verbindungen, die spezifisch die Phosphorylierung eines Testsubstrats (z.B. Myelin basisches Protein) durch parasitische PKG inhibieren und nicht eine Wirt-PKG, als selektive parasitische PKG-Inhibitoren betrachtet.
Wo die Enzyminhibierung oder der Bindungstests eine Rohzubereitung nutzt, die PKG enthält, kann das Ziel der Testverbindung durch Überprüfung des Grades an nativer Substratphosphorylierung verifiziert werden. Daher wird der intakte Wirt oder die Parasit-Zelle, die das Enzym enthält, mit der Testverbindung versetzt. Alternativ dazu wird die intakte Zelle oder die Parasit-Zellen, die das Enzym enthalten, mit der Testsubstanz in Gegenwart von markiertem Phosphat ([³³P] oder [³²P] ist der bevorzugte Marker) versetzt. In beiden Fällen werden die Zellen lysiert, die löslichen Proteine teilweise gereinigt, und mittels zweidimensionaler Polyacrylamidelektrophorese analysiert. Die Proteine werden mittels Färbung oder mittels Detektion des Radiomarkers durch Autoradiographie oder Fluorographie detektiert. Andersartig phosphorylierte Spezies können leicht auf solchen Gelen unterschieden werden durch die geänderte Migration der vielfach phosphorylierten Proteine oder durch die Anwesenheit/Abwesenheit eines autoradiographischen Signals. Ein PKG-Inhibitor wird den Einbau radiomarkierten Phosphats in das Substrat blockieren. Nachdem diese Technik intakte Zellen verwendet, die mit der Testsubstanz behandelt sind, kann diese Technik auch verwendet werden, um Vorläuferarzneimittel, die zu einem PKG-Inhibitor innerhalb der zellulären Umgebung umgewandelt werden, zu identifizieren, die aber nicht durch einen Test der auf dem Enzym selbst basiert so identifiziert werden könnten.
Verbindungen, die als PKG-Inhibitoren identifiziert sind, können als Antiprotozoen nutzvoll sein, und als solche können sie in der Behandlung und Prävention von protozoalen Krankheiten bei Menschen und Tieren, Geflügel eingeschlossen, verwendet werden. Daher können PKG-Inhibitoren an einem Wirt verabreicht werden, der an protozoaler Infektion leidet, wobei die Verbindung die PKG inhibiert, in einer therapeutisch effektiven Menge verabreicht wird. Eine therapeutisch effektive Menge, kann eine Menge sein, die ausreichend ist, um die PKG der ursächlichen Protozonen zu inhibieren. Beispiele protozoaler Krankheiten, gegen die PKG-Inhibitoren genutzt werden können und ihre zugehörigen ursächlichen Pathogene umfassen: 1) Amoebiasis (Dientamoeba sp., Entamoeba histolytica); 2) Giardiasis (Giardia lamblia); 3) Malaria (Plasmodium Spezies umfassend P. vivax P. falciparum, P. malaria und P. ovale), 4) Leishmaniasis (Leishmania Spezies umfassend L. donovani, L. tropica, L. mexicana und L, braziliensis); 5) Trypanosomiasis und Chagas-Krankheit (Trypanosoma Spezies umfassend T. brucei, T. theileri, T. rhodesiense T. gambiense T. evansi T. equiperdum T. equinum, T. congolense, T. vivax und T. cruzi); 6) Toxoplasmose (Toxoplasma gondii); 7) Neosporosis (Neospora caninum); 8) Babesiosis (Babesia sp.); 9) Cryptosporidiosis (Cryptosporidium sp.); 10) Ruhr (Balantidtum coli); 11) Scheidenkatarrh (Trichomonas Spezies umfassend T. vaginitis, und T. foetus); 12) Coccidiosis (Eimeria Spezies umfassend E. tenella E. necatrix E acervulina, E. maxima E. brunetti, E. mitis, E. bovis E. melagramatis, und Isospora sp); 13) Enterohepatitis (Histomonas gallinarum), und 14) Infektionen verursacht durch Anaplasma sp., Besnoitia sp., Leucocytozoan sp., Microsporidia sp., Sarcocystis sp., Theileria sp., und Pneumocystis carinii.
PKG-Inhibitoren werden vorzugsweise bei der Behandlung oder Prävention von protozoaler Infektionen, die durch ein Mitglied der Sub-phyllum Apicomplexa verursacht wird, verwendet. PKG-Inhibitoren werden ebenso vorzugsweise in der Behandlung oder Prävention von Malaria, Toxoplasmose, Cryptosporidiosis und Trypanosomiasis bei Menschen und Tieren verwendet; und bei der Behandlung von Coccidiosis, insbesondere bei Geflügel, entweder um coccidiale Infektion zu behandeln oder das Auftreten solch einer Infektion vorzubeugen.
Für den Fall, dass beabsichtigt ist, einen PKG-Inhibitor auf chronischer Basis zu verabreichen, beispielsweise bei der Prävention von Coccidiosis bei Geflügel, ist der PKG-Inhibitor vorzugsweise selektiv für protozoale über die Aktivität der Wirt-PKG. Langzeitverabreichung eines solchen selektiven Inhibitors, verringert Nebeneffekte für den Wirt durch die PKG Inhibierung.
Zwei spezifische Beispiele für die Verwendung von PKG-Inhibitoren, um die Anlage von parasitischen Infektion bei Mensch und Tier vorzubeugen, sind 1) die Prävention von Plasmodium-(Malaria)-Infektion bei Menschen in endemischen Bereichen und 2) die Prävention von Coccidiosis bei Geflügel durch kontinuierliche Verabreichung der Verbindung in das Futter oder Trinkwasser. Malaria ist die Todesursache Nummer eins in der Welt. Die Krankheit wird durch Moskitos in die endemischen Bereiche übertragen und kann sehr schnell zu einer lebensbedrohenden Infektion fortschreiten. Daher nehmen Individuen, die in Gebieten leben oder die Gebiete besuchen, wo malariatragende Moskitos anwesend sind, routinemäßig prophylaktisch Arzneimittel, um sich vor der Infektion zu schützen. Der PKG-Inhibitor kann oral oder parenteral einmal oder mehrmals pro Tag verabreicht werden. Die Dosis kann sich von 0,01 mg/kg bis 100 mg/kg belaufen. Die Verbindung kann während der ganzen Dauer, während der Patient oder das Tier dem Risiko einer parasitischen Infektion ausgesetzt ist, verabreicht werden.
Coccidiosis ist eine Krankheit, welche bei Mensch und Tier auftreten kann und wird durch verschiedene Gattungen der Coccidia verursacht. Das ökonomisch wichtigste Vorkommnis der Coccidiosis ist die Erkrankung bei Geflügel. Coccidiosis bei Geflügel wird durch protozoische Parasiten der Gattung Eimeria verursacht. Die Erkrankung kann sich schnell auf die ganze Vogelherde über kontaminierte Fäkalien ausbreiten. Die Parasiten zerstören das Darmgewebe und schädigen damit den Darmbelag, was die Nährstoffabsorption schmälert. Ein Ausbruch an Coccidiosis in einer Geflügelfarm kann solch dramatische ökonomische Verlus te für die Geflügelproduzenten verursachen, dass es Standardpraxis wurde, anticoccidiale Agenzien prophylaktisch im Futter zu verwenden. Ein PKG-Inhibitor wird über das Futter oder das Trinkwasser für ein Teil des Lebens oder das ganze Leben lang dem Geflügel verabreicht. Die Dosis bewegt sich zwischen 0,1 ppm und 500 ppm im Futter oder Wasser.
Für die Behandlung von festgestellten parasitischen Infekten in Menschen oder Tieren, kann der PKG Inhibitor oral oder parenteral, sobald die Infektion vermutet oder diagnostiziert ist, verabreicht werden. Die Behandlungsperiode variiert bezüglich der parasitischen Erkrankung und der Ernsthaftigkeit der Infektion. Im Allgemeinen wird die Behandlung solange fortgesetzt, bis die Parasiten ausgerottet sind und/oder die Symptome der Krankheit gelöst sind. Zwei typische Beispiele sind die Behandlung von 1) einer Cryptosporidium parvum Infektion bei Tier und Mensch und die Behandlung von akuter Plasmodium falciparum Malaria bei Menschen. Cryptosporidium parvum ist ein protozoischer Parasit, der Zellen, die den intestinalen Trakt von Menschen und Tieren bedecken, infiziert und zerstört. Die Infektion breitet sich sehr schnell aus und hat akute Effekte für den Patienten. Im Falle des Menschen bekommen die Patienten ernsthaften Durchfall für einen Zeitraum von 5-7 Tagen. In immunbeeinträchtigen Patienten können C. parvum Infektionen fortdauern und lebensbedrohlich sein. Bei Tieren, ist die C. parvum Infektion die Nummer eins, die bei jungen Milchkälbern den Tod verursacht. Eine C. parvum Infektion kann leicht durch die Symptome und die Untersuchung einer Stuhlprobe diagnostiziert werden. Sobald die Krankheit vermutet und/oder diagnostiziert ist, kann die Behandlung mit PKG Inhibitor gestartet werden. Die Dosis kann zwischen 0,01 mg/kg bis 500 mg/kg variieren. Die Behandlung kann einmal oder mehrmals pro Tag oral oder parenteral stattfinden, bis die Infektion eliminiert ist. Routinemäßig dauert dieser Dosierungszeitraum 1-3 Wochen.
P. falciparum verursacht bei Menschen akute lebensbedrohende Malaria-Infektionen. Die Infektion kann, wenn sie unbehandelt bleibt, sehr oft zum Tod des Patienten führen. Eine Malariainfektion kann leicht durch die Symptome oder durch die Untersuchung einer Blutprobe des Patienten diagnostiziert werden. Die Behandlung erfolgt im Anschluss der Diagnose. Ein PKG-Inhibitor wird einmal oder mehrere Male pro Tag oral oder parenteral, bis die Infektion eliminiert ist, verabreicht. Die Dosis kann zwischen 0,01 mg/kg bis 200 mg/kg betragen.
PKG-Inhibitoren können an einem Wirt, der einer Behandlung bedarf, in einer Weise verabreicht werden, die ähnlich zu der ist, die bei anderen protozoischen Wirkstoffen verwendet wird; zum Beispiel werden sie parenteral, oral, äußerlich oder rektal verabreicht. Die Dosis, welche verabreicht wird, variiert abhängig von der jeweiligen verwendeten Substanz, vom infektiösen Organismus, der betroffen ist, insbesondere vom spezifischen Wirt, von der Ernsthaftigkeit der Erkrankung, von der physischen Kondition des Wirtes und von der gewählten Route der Verabreichung: die angemessene Dosis kann leicht durch den Fachmann festgestellt werden. Für die Behandlung von protozoischer Krankheiten bei Mensch und Tier kann die Dosis zwischen 0,01 mg/kg bis 500 mg/kg variieren. Für die prophylaktische Verwendung bei Mensch und Tier kann die Dosis zwischen 0,01 mg/kg bis 100 mg/kg betragen. Für die Verwendung als anticoccidialer Wirkstoff, insbesondere bei Geflügel, wird die Verbindung vorzugsweise im tierischen Futter oder Trinkwasser zugesetzt. Die Dosis reicht von 0,1 ppm bis 500 ppm.
Die PKG-Inhibitoren können nach konventionellen pharmazeutischen Bindungstechniken formuliert werden. Daher kann eine Zusammensetzung eines PKG-Inhibitors, zusätzlich zu dem aktiven Wirkstoff, einen pharmazeutischen verträglichen Träger und optional andere therapeutische Bestandteile enthalten. Die Zusammensetzung kann eine für orale, rektale, äußerliche oder parenterale (eingeschlossen subkutane, intramuskuläre und intravenöse) Verabreichungen geeignete sein, obwohl die am meisten geeignete Route in jedem Fall vom jeweiligen Wirt und der Art und Ernsthaftigkeit des Zustandes, weswegen der Wirkstoff zu verabreichen ist, abhängt. Die Zusammensetzung kann in der angenehmen Einmaldosenform angeboten werden und nach jedem Verfahren, welches auf dem Gebiet der Pharmazie bekannt ist, hergestellt werden.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die für orale Verabreichung geeignet sind, können als separate Einheiten wie Kapseln, Gelatinekapseln oder Tabletten, wobei jede eine vorgegebene Menge des aktiven Bestandteils enthält, sowie als Pulver oder Granulat oder als Lösung oder als Suspension einer wässri gen Flüssigkeit einer nicht-wässrigen Flüssigkeit, einer Öl-in-Wasser-emulsion oder einer Wasser-in-Öl-Flüssigkeitsemulsion angeboten werden. Solche Zusammensetzungen können nach jedem Verfahren der Pharmazie hergestellt werden, jedoch umfassen all diese Verfahren den Schritt des Zusammenbringens des aktiven Bestandteils mit dem Träger, welcher ein oder mehrere notwendige Bestandteile beinhaltet. Im Allgemeinen werden die Zusammensetzungen durch gleichförmiges und genaues Mischen des aktiven Bestandteils mit den flüssigen Trägern oder feinen zerteilten festen Trägern oder beiden vermischt, und dann, wenn notwendig, das Produkt in die gewünschte Aufmachung geformt. Zum Beispiel kann eine Tablette durch Pressen oder Pressformen, optional mit ein oder mehreren Bestandteilen, hergestellt werden. Gepresste Tabletten können durch Pressen des aktiven Wirkstoffs in eine frei fließenden Form, wie zum Beispiel Puder oder Granulat, optional gemischt mit Binder, Gleitmittel, inerten Lösungsmittel, Oberflächenaktivator und Dispergierungsagenzien, in einer geeigneten Maschine hergestellt werden. Pressgeformte Tabletten können durch Formen einer Mischung der gepulverten Zusammensetzung, befeuchtet mit einem inerten löslichen Streckmittel, in einer geeigneten Maschine hergestellt werden. Wünschenswerterweise enthält jede Tablette von etwa 1 mg bis etwa 500 mg des aktiven Bestandteils und jede Gelatinekapsel oder Kapsel enthält etwa 1 bis etwa 500 mg des aktiven Bestandteils.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, welche für die parenterale Verabreichung geeignet sind, können als Lösungen oder Suspensionen dieser aktiven Verbindungen in Wasser, bevorzugt gemischt mit einem oberflächenaktiven Stoff, wie zum Besipiel Hydroxypropylcellulose, hergestellt werden. Dispersionen können auch in Glycerin, flüssigem Polyethylenglycolen und Mischungen daraus in Ölen, hergestellt werden. Unter normalen Lagerungsbedingungen und normalen Verwendungsbedingungen enthalten diese Zubereitungen Konservierungsstoffe, um das Wachstum von Mikroorganismen zu verhindern.
Die pharmazeutischen Formen, welche zur Verwendung als Injektion geeignet sind, umfassen sterile wässrige Lösungen oder Dispersionen und sterile Pulver für die extemporierte Präparation von sterilen injizierbaren Lösungen oder Dispersionen. In allen Fällen muss die Form steril sein und flüssig sein, bis zu einem Aus maß, dass leichte Spritzbarkeit besteht. Sie muss stabil unter den Herstellungsbedingungen und Lagerbedingungen sein und muss konserviert gegen Kontaminierungsereignisse von Mikroorganismen, wie Bakterien und Pilze, sein. Der Träger kann ein lösliches oder dispergiertes Medium sein, welches z.B. Wasser, Ethanol, Polyol (z.B. Glycerin, Propylenglycol und flüssiges Polyethylenglycol), geeignete Mischungen davon und pflanzliche Öle enthält.
Geeignete topische Formulierungen umfassen transdermale Vorrichtungen, Aerosole, Cremes, Salben, Lotionen, staubende Puder und dergleichen. Diese Formulierungen können mittels konventioneller Verfahren den aktiven Bestandteil umfassend hergestellt werden. Zur Illustration wird eine Creme oder Salbe durch Mischen ausreichender Mengen an hydrophilen Material und Wasser, welches von etwa 5-10 Gew.-% der Verbindung, in ausreichenden Mengen, um eine Creme oder Salbe, die die gewünschte Konsistenz hat, herzustellen.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die sich für die rektale Verabreichung eignen, worin der Träger ein fester Träger ist, werden am meisten bevorzugt als Einmaldosenzäpfchen bereitgestellt. Geeignete Träger umfassen Kakaobutter und andere Materialien, die gewöhnlich auf diesem Gebiet verwendet werden, und die Zäpfchen können leicht durch die Beimischung der Kombination mit dem erweichten oder geschmolzenen Träger(n), gefolgt durch Abkühlung und Formen der Formkörper hergestellt werden.
Es versteht sich, dass zusätzlich zu dem zuvor erwähnten Trägerbestandteilen die pharmazeutischen Formulierungen, wie oben beschrieben, wenn angebracht ein oder mehrere zusätzliche Trägerbestandteile enthält, wie Verdünnungsmittel, Puffer, Aromastoffe, Bindemittel oderflächenaktive Stoffe, Verdicker, Gleitmittel, Konservierungsstoffe (einschließlich Antioxidantien) und dergleichen, und Substanzen, die zu dem Zweck eingeführt werden, die Formulierung isotonisch mit dem Blut des beabsichtigten Empfängers zu machen.
Für die Verwendung zur Behandlung von Coccidiosis bei Geflügel kann ein PKG-Inhibitor als ein Bestandteil einer Futterzusammensetzung in geeigneter Weise verabreicht werden. Eine geeignete Geflügelfutterzusammensetzung enthält typi scherweise von etwa 1 ppm bis etwa 1000 ppm, vorzugsweise von etwa 0,01% bis etwa 0,1%, pro Gewicht eines PKG-Inhibitors. Der optimale Grad kann naturgemäß mit den Spezies von Eimeria, die beteiligt sind, variieren und kann leicht vom Fachmann bestimmt werden. Mengen in Geflügelfuttern von etwa 0,01 bis etwa 0,1 Gew.-% der Nahrung sind besonders geeignet zur Kontrolle der Symptomatik, welche mit E. tenella assoziiert ist, während die bevorzugte Konzentration für ähnliche Kontrollen von intestinal hausenden Spezies von etwa 0,01% bis etwa 0,1 Gew.-% an Nahrung. Mengen von etwa 0,01 bis etwa 0,1 Gew.-% sind bevorzugt, um die symptomatischen Effekte von sowohl cecaler als auch intestinaler Coccidiosis zu reduzieren.
Bei der Herstellung von Geflügelfutter kann ein PKG-Inhibitor leicht durch mechanisches Mischen desselben in fein geriebener Form mit dem Geflügelfutter oder mit einer Zwischenproduktformulierung (premix), das anschließend mit anderen Komponenten verblendet wird, um das letztendliche Geflügelfutter, das an das Geflügel verfüttert wird, herzustellen, dispergiert werden. Typische Komponenten des Geflügelfutters umfasst Melasse, Fermentationsreste, Getreidemehl, gemahlener oder gerollter Hafer, Weizenprodukte (wheat shorts) und Weizendunst, blaue Luzerne, Klee und Fleischabfälle, zusammen mit Mineralzusätzen, wie Tiermehl, Calciumcarbonat und Vitaminen.
Zusammensetzungen, die eine Verbindung enthalten, können auch in Pulver oder flüssiger konzentrierter Form hergestellt werden. In Übereinstimmung mit der Standardpraxis für Veterinärformulierung können konventionelle wässrige Hilfsstoffe, wie Lactose oder Sucrose, in das Pulver eingearbeitet werden, um die physikalischen Eigenschaften zu verbessern. Daher umfassen insbesondere geeignete Pulver der vorliegenden Erfindung 50 bis 100% Gew./Gew., und vorzugsweise 60 bis 80% Gew./Gew. der Zusammenstellung und 0 bis 50% Gew./Gew. und vorzugsweise 20 bis 40% Gew./Gew. der konventionellen veterinären Hilfsstoffe. Diese Pulver können zu dem tierischen Futter, z.B. durch einen innigen Premix, oder gelöst im Trinkwasser für Tiere, zugeführt werden.
Flüssige Konzentrate dieser Erfindung enthalten eine wasserlösliche Zusammensetzung der Verbindung und können optional veterinäre wassermischbare Lö sungsmittel enthalten, zum Beispiel Polyethylenglycol, Propylenglycol, Glycerin, Glycerinformal sowie ein Lösungsmittel, gemischt mit bis zu 30% v/v an Ethanol. Die Flüssigkonzentrate können zum Trinkwasser der Tiere, insbesondere Geflügel, verabreicht werden.
Die folgenden Beispiele sind zur Illustration der Erfindung zur Verfügung gestellt.
ERLÄUTERNDES BEISPIEL 1
Verdrängungsbindungstest unter Verwendung von [³H]-Inhibitorverbindung
PKG wird mit einer adäquaten verdünnten [³H]-Inhibitorverbindung für 60 Minuten auf Eis inkubiert und der freie Ligand wird vom gebundenen Liganden durch Elution über 0,8 ml G-25 Gelfiltrationssäulen (bezogen von AGTC) getrennt. Das Hohlraumvolumen, welches das ligandengebundene Protein enthält, wird gesammelt und die Radioaktivität mittels Flüssig-Szintillationszählung bestimmt. Für Verdrängungsbindungsstudien, wird ein Überschuss oder eine adäquate Menge an verdünnten kalten Wettbewerber(n) gleichzeitig mit, oder 0,01-5 Minuten vor der Zugabe der radiomarkierten Verbindung, hinzu gegeben. Die Konzentration der Testverbindung, die benötigt wird, um 50% (IC₅₀) der Bindung des markierten Inhibitors an das Parasitenarzneimittel, welches Protein(e) bindet, zu inhibieren, wird bestimmt.
Für den Verdrängungsbindungstest kann PKG die S100 Fraktion, oder die Rohzubereitung, welche PKG Aktivität enthält, oder die rekombinante PKG sein. Im Allgemeinen enthält die PKG Zubereitung 20-50 μg Protein.
BEISPIEL 2
PKG katalytische Aktivität
E. tenella PKG gereinigte Fraktion (erhalten wie in Beispiel 3 beschrieben) (0,05 μl) wird für 2 Stunden bei Raumtemperatur in 20 μl einer Inkubationsmischung, die 25 mM HEPES, pH 7,4, 10 mM MgCl₂, 5 mM beta-Mercaptoethanol, 20 mM beta-Glycerinphosphat (oder 100 mM Natriumorthovanadat), 10 μM cGMP, 2 μM ATP, 10 nM [³³P] ATP (2000 Ci/mmol), 400 μM Kemptid (oder 2 mM Kemptid oder 0,43 mg/ml Myelin basischen Protein) inkubiert. Die Reaktion wird dann mit 2,5 μl an 0,25 M Phosphorsäure pro 20 μl Testvolumen gequenscht und die Mischung auf ein Whatman P81 Chromatographiepapier aufgepunktet. Das Chromatographiepapier wird für 2 Minuten getrocknet, 5 mal für 3 Minuten jeweils mit 150 ml an 75 mM Phosphorsäure gewaschen, dann kurz mit 95%igem Ethanol gewaschen. Nach dem Trocknen an der Luft wird das markierte Kemptid, welches auf dem Filter verbleibt, quantitativ durch Flüssig-Szintillationszählung bestimmt.
BEISPIEL 3
Reinigung des Bindungsproteins von E. tenella für die [³H] Inhibitorverbindung
(a) Herstellung der E. tenella Lysate
Etwa 6 × 10⁹ E. tenella nicht-sporenbildende Oozyten wurden zweimal in 50 ml von 10 mM Hepes pH 7,4 gewaschen. Die Oozyten wurden dann in einem gleichen Volumen von Lysierungspuffer (20% Glycerin, 10 mM Hepes, pH 7,4, 0,1 mM Natriumorthovanadat, Proteaseinhibitorcocktail, [Sigma P8340, verdünnt zu 1:200]) und gleichen Volumen an 3 mm Glaskörner suspendiert und durch Verwirbeln bei 4°C für 15 Minuten gemischt. Die Oozyten wurden mikroskopisch auf Bruch untersucht; das Mischen wurde weitergeführt bis 95% der Oozyten gebrochen waren. Die Glaskörner wurden dann entfernt und mit 20 ml Lysierungspuffer, welcher zu dem Rest der Suspension zugeführt wurde, gewaschen. Das erhaltene Homogenisat wurde von den Glasperlen getrennt und bei 100,000 × g für 1 Stunde zentrifugiert. Das Pellet wurde verworfen und der Überstand, bezeichnet als E. tenella S100 Fraktion, wurde zurückbehalten für Bindungstest und weiterer Targetreinigung. Nach Abschätzung der Proteinkonzentration, wurde die S100 Fraktion zu gleichen Teilen aufgeteilt und bei –80°C eingefroren.
(b) Reinigung eines E. tenella [³H] Inhibitorverbindungsproteins
Die S100 Fraktion wurde mit 2 l eines Puffers A (30 mM Natriumphospat pH 7,4, 1 mM DTT. 1 mM EDTA, 20% Glycerin, 10 mM Natriumfluorid, 0,1 mM Natriumorthovanadat) über Nacht bei Raumtemperatur dialysiert. Das Dialysat wurde bei 100,000 × g für 1 Stunde zentrifugiert und das Pellet verworfen. Der Überstand wurde über eine HiLoad Q26/10 Säule (Pharmacia), die mit einem Puffer A äquilibriert wurde, geschickt. Die Säule wurde mit Puffer A gewaschen bis der OD bei 280 nm auf die Grundlinie zurückfiel, was andeutet, dass kein weiteres Protein mehr von der Säule eluiert wird. Die Proteine wurden dann unter Verwendung eines linearen Natriumchloridgradienten (0-1 M NaCl) in Puffer A eluiert. Jede Fraktion wurde unter Verwendung von [³H] Inhibitorverbindung (wie in Beispiel 1 oben beschrieben) auf sein Bindungsverhalten getestet. Die Bindungsaktivität eluiert als ein einzelner Peak und Fraktionen, welche Bindungsaktivität enthalten, wurden gesammelt und über Nacht mit 2 l Puffer B (30 mM Natriumphosphat pH 7,4 1 mM DTT, 1 mM EDTA, 10 mM Natriumfluorid, 0,1 mM Natriumorthovanadat, 1 M Ammoniumsulfat) dialysiert. Der dialysierte Pool wurde über eine Butylsepharose-Säule (Pharmacia), welche mit Puffer B äquilibriert wurde, geschickt. Die Säule wurde mit Puffer B bis der OD bei 280 nm auf die Grundlinie zurückgekehrt ist, gewaschen, was andeutet, dass kein weiteres Protein mehr von der Säule eluiert wird. Die Proteine wurden von der Säule mit einem linearen inversen Gradienten von Ammoniumsulfat (von 1 M bis kein Ammoniumsulfat) in Puffer B eluiert. Jede Fraktion wurde bezüglich des Bindungsverhaltens an die [³H]-Inhibitorverbindung, wie oben beschrieben, getestet und die Fraktionen, die Bindungsaktivität enthielten, gesammelt und über Nacht gegen 2 l Puffer C (10 mM Natriumphosphat, pH 7,4, 1 mM DTT, 10 mM Natriumfluorid, 0,1 mM Natriumorthovanadat) dialysiert. Die Dialysate wurde einer Hydroxyapatitsäule (Biorad), die mit Puffer C äquilibriert wurde, geschickt. Die Säule wurde mit Puffer C bis der OD bei 280 nm auf die Grundlinie zurückgekehrt ist, gewaschen, was andeutet, dass kein weiteres Protein von der Säule eluiert wird. Die Proteine wurden von der Säule unter der Verwendung eines linearen Gradienten aus Natriumphosphat (10-400 mM Natriumphosphat) in Puffer C eluiert. Die Fraktionen wurden bezüglich des Bindungsverhaltens an die [³H]-Inhibitorverbindung, wie in Beispiel 1 beschrieben, getestet und die Fraktionen, welche Bindungsaktivität enthalten, wurden gesammelt und über Nacht gegen 2 l Puffer A dialysiert. Die Dialysate wurden einer Mo noQ 5/5 Säule (Pharmacia) die mit Puffer A äquilibriert wurde, geschickt, die Säule wurde mit Puffer A gewaschen bis der OD bei 280 nm auf die Grundlinie zurückkehrt ist, was andeutet, dass kein weiteres Protein mehr von der Säule eluiert wird. Die Proteine wurden dann unter Verwendung eines linearen Gradienten von Natriumchlorid (null bis 1 m) Puffer A eluiert. Jede Fraktion wurde bezüglich des Bindungsverhaltens an die [³H]-Inhibitorverbindung, wie oben beschrieben, getestet. Aliquote der Fraktionen, welche die gleiche Bindungsaktivität aufweisen, wurden auf 4-20% oder 4-12% Polyacrylamidgele (Novex) aufgetragen und Elektrophorese in der Gegenwart von SDS durchgeführt. Die fertigen Gele wurden mit einem Silberfärbemittel-Kit nach den Anweisungen des Herstellers (Daiichi Pure Chemical Co., Ltd.) gefärbt. Die zwei Peaks der Bindungsfraktionen werden in den anschließenden Beispielen als "PKG gereinigte Fraktion" bezeichnet.
In den Peakfraktionen wurde ein 120 kDa Protein identifiziert, was mit dem gleichen Profil eluiert wird wie [³H] Inhibitorverbindungsbindungsaktivität. Das Protein wurde aus einem Coomassie-Blau angefärbten Polyacrylamidgel herausgeschnitten, verdaute Peptide generiert und die Peptidsequenz erhalten. Die erhaltenen Peptide werden wie folgt gezeigt:

1. AENRQFLA [SEQ ID NO: 1]
2. VLYIL [SEQ ID NO: 2]
3. LVSIK [SEQ ID NO: 3]
4. EDTQAEDARLLGHLEK [SEQ ID NO: 4]
5. EMPTASTGTPEQQQQQQQQ [SEQ ID NO: 5]
6. HGEEQQQERKPSQQQQN [SEQ ID NO: 6]
7. VFLXIV [SEQ ID NO: 7]

BEISPIEL 4
Klonierung der cDNA, welche das Bindungsprotein von E. tenella für die Inhibitorverbindung codiert
Eine Serie von degenerierten Oligonucleotiden wurde aus der Sequenz der oben gelisteten Peptide synthetisiert. Kombinationen dieser degenerierten Oligonucleotide wurden in einer gekoppelten reversen Transkriptase-Polymerasekettenreaktionen (RT-PCR) verwendet. RNA, welche aus nicht-sporenbildenden Oozyten von E. tenella hergestellt wurde, wurde als ein Substrat zusammen mit willkürlichen Hexamer-Primern in einer Reaktion verwendet, die durch reverse Transkriptase katalysiert wurde, um cDNA Kopien der RNA zu synthetisieren. Ein Aliquot dieser cDNA wurde dann als Templat in einer Serie von PCR Reaktionen mit verschiedenen Kombinationen der degenerierten Oligonucleotide, wie oben beschrieben, verwendet.
Quantifizierte PCR Reaktionen unter Verwendung des ersten PCR Reaktionsprodukts als Templat und verschiedene degenerierte Oligonucleotid(e) aus der ursprünglichen Gruppe der Primer, wie oben beschrieben, wurden durchgeführt um interessante cDNA Produkte besser zu identifizieren.
Der Fachmann, der mit diesem Verfahren vertraut ist, weiß dass eine vermischte Hybridisierung von Primern während der PCR Reaktion entstehen kann und wird, und dass die Häufigkeit von vermischter Hybridisierung extrem ansteigt, wenn degenerierte Oligonucleotide verwendet werden. Bei Durchführung einer zweiten oder quantifizierten PCR Reaktion mit einem verschiedenen oder einem Paar von degenerierten Oligonucleotidprimern, welche aus dem ursprünglichen Set an Peptidsequenzen stammen, kann man ein sehr viel größeres Vertrauen in die Authentizität der Reaktionsprodukt(e) haben, da es sich auf das Protein, welches von Interesse ist, bezieht. Bei Verwendung dieses Kriteriums für die Selektion, wurden einige der RT-PCR Reaktionsprodukte mit dem Bestreben kloniert und sequenziert, ein intern abgeleitetes Peptid zu identifizieren, welches identisch zu einem der nativen Peptide und/oder zu einem offenen Leserahmen (ORF) ist, der eine Ähnlichkeit zu bekannten Sequenzen in Sequenzdatenbanken aufweist. Eines der RT-PCR Produkte (Klon Et.52035) hat einen einzelnen offenen Leserahmen, definiert an einem Ende durch ein degeneriertes Oligonucleotid, welches von dem vierten Peptid, wie oben aufgelistet, abgeleitet ist und am anderen Ende durch ein degeneriertes Oligonucleotid, welches sich vom ersten Peptid, wie oben aufgelistet, ableitet. Darüber hinaus hat dieser ORF von Klon Et.52035 eine begrenzte Aminosäuresequenzidentität mit einer D. melanogaster cGMP abhängigen Proteinkinase (PKG) und eine regulatorische Untereinheit einer S. cerevisiae cAMP abhängigen Proteinkinase. Die Nukleotidsequenzen von Klon Et.52305 ist als Sequenz SEQ-ID-NO: 8 gezeigt, und die abgeleitete Aminosequenz ist als SEQ-ID-NO: 9 gezeigt. Die degenerierten Oligonucleotide, die verwendet wurden, um das Et.52035 PCR Produkt zu generieren, sind oben gelistet. In der ersten PCR Reaktion, Oligonucleotide AGI-2 (von Peptid SEQ-ID-NO: 5) und AG4-1 (von SEQ-ID-NO: 1) wurden als ein Primerpaar verwendet. Das Produkt dieser PCR wurde dann als ein Substrat in einer zweiten Reaktion mit Oligonucleotiden AG3-1 (von Peptid SEQ-ID-NO: 4) und AG4-1 als Primerpaar verwendet.
AG1-2: 5'-ACNGGNCANCCNGA(A/G)CA(A/G)CA-3'
AG4-1: 5'-GCNA(A/G)(A/G)AA(C/T)TGNC(T/G)(A/G)TT(C/T)TC-3'
AG3-1: 5'-GA(A/G)GA(C/T)ACNCA(A/G)GCNGA(A/G)GA(C/T)GC-3'
Die Einfügung von Klon Et.52035 wurde als eine Hybridisierungssonde verwendet, um eine E. tenella cDNA Bibliothek zu screenen. Die cDNA Bibliothek wurde nach bekannten Verfahren aufgebaut. Die gesamte RNA wurde aus nicht-sporenbildenden Oozyten (USO) von E. tenella hergestellt. Poly(A) RNA wurde zweimal ausgewählt unter Verwendung von Oligo(dT)cellulose-Chromatographie und als Templat für die erste Strang cDNA Synthese mit SuperScript reverse Transkriptase (Life Technologies, Inc.) verwendet und mit Olig(dT) angelagert. Im Anschluss an die zwei Strang cDNA Synthese und die EcoRI Adapterligation, wurde die Doppelstrang cDNA durch Säulenchromatographie unter Verwendung von Sephacryl S-500 HR größenfraktioniert und dann in den Phagenvektor Lambda ZAP II (Stratagene) legiert. Die Ligasereaktionsprodukte wurden dann unter Verwendung von Gigapack III Gold packaging extract (Stratagene) nach den Herstellerangaben verpackt. Eine Gesamtmenge von 1,25 × 10⁶ rekombinanter Phagen wurden unter Verwendung des 453-Basenpaare-Einschubs von Klon Et.52035 gescreent. Mehrere plaquereine positive Klone wurden von jeder Bibliothek isoliert und in pBluescript SK (Stratagene) mittels in vivo Exzision nach Herstellerangaben subkloniert. Phagenemidklone wurden durch Restriktionsenzymkatierung und partielle Nucleotidsequenzanalyse charakterisiert. Eine automatisierte DNA Sequenz wurde unter Verwendung eines Applied Biosystems Modell 373 Instrument mit dem Prism FS Zyklussequenz-Kit erstellt.
Der längste cDNA Klon, welcher in diesem Screen (Et.PKG7) gereinigt wurde, ist ungefähr 4,3 kb lang mit einem abgeleiteten ORF von 1003 Aminosäuren, geeignet für ein Protein von 113 kDa zu codieren. Jedes der sieben Peptidsequenzen von dem biochemisch gereinigten 120 kDa E. tenella Protein kann innerhalb dieses ORF lokalisiert sein. Die Nucleotidsequenz des Et.PKG7 ist als SEQ-ID-NO: 10 angegeben, und die abgeleitete Aminosäuresequenz als SEQ-ID-NO: 11 gezeigt. Die abgeleitete Aminosequenz ähnelt weiterhin sehr der Drosophila-PKG; 31% Identität in den Doppel-cGMP Bindungsdomänen und 45% Identität zu der katalytischen Domäne. Im Unterschied zu allen anderen PKGs, in welchen diese zwei funktionalen Domänen nahe beieinander sind, entlang der Länge des Proteins, wird für das Eimeria-Gen-Produkt angenommen, dass es fast 300 Aminosäuren zwischen den beiden Domänen hat. Diese Länge von 300 Aminsäuren ist hauptsächlich für den Längenunterschied zwischen Eimeria-Protein und anderen PKGs verantwortlich.
BEISPIEL 5
Funktionale rekombinante Expression des Proteins, welches für E. tenella PKG7 codiert
Der offene Leserahmen des cDNA Klons Et.PKG7 wurde durch PCR modifiziert, indem sechs Histidinreste an das C-Terminusende des Proteins angefügt wurden. Dies wurde unter Verwendung von für den Fachmann bekannten Methoden erreicht. Oligonucleotidprimer, welche an die Enden des abgeleiteten offenen Leserahmens des Klons Et.PKG7 hybridiesierten, wurden synthetisiert. Das 5'-Oligonucleotid startet mit dem, was als das Initiatormethionin angenommen wird, und wurde modifiziert, um eine BamHI Klonierungsseite anzufügen. das 3'-Oligonucleotid trägt eine Sequenz, die komplementär zur Nucleotidsequenz ist, die die letzten sechs hergeleiteten Aminosäurereste des Et PKG codieren. Am Anschluss daran, hat das synthetische Oligonucleotid 18 Nucleotide, die geeignet sind für sechs konsekutive Histidinreste zu codieren. Dieser Länge wiederum folgt ein TAA Nucleotid-Triplet (ein Translationsterminationscodon) und dann eine XbaI Restriktionsenzym-Erkennungssequenz für Klonierungszwecke. Diese zwei synthetischen Primer wurden in einer PCR Reaktion mit Et.PKG7 als Templat verwendet, um eine cDNA zu generieren, die zu der Proteincodierungsregion korrespondiert und ausgerichtet als 5'-BamHI/3'-XbaI Fragment in den Baculovirusexpressionsvektor pFastBac1 (Life Technologies) für rekombinante Proteinexpression in wirbellosen Zellen subkloniert. Das Hexa-Histidin-Motiv dient für beides, als ein Epitop, um der Expression zu folgen und zur Reinigung des rekombinanten Proteins beim Western Blot, als auch als ein Affinitätstag um in der Reinigung von rekombinant Et.PKG7 bei der immobilisierten Metallchelataffinitätschromatographie (IMAC) zu helfen. Ein beim Western-Blot positives rekombinantes Protein, welches in wirbellosen Sf9 Zellen exprimiert wird, wurde partiell durch sequenzielle IMAC und cGMP Agaroseaffinitäts-Chromatographie (siehe unten) für biochemische Charakterisierung gereinigt.
BEISPIEL 6
Identifikation des nativen 120 kDa E. tenella [³H] Inhibitorverbindungsproteins und des rekombinanten Proteins, welches aus den cDNA Klon Et.PKG7 als eine von cGMP abhängige Proteinkinase exprimiert wird.

(a) PKG katalytische Aktivität. E. tenella PKG gereinigte Fraktion wie oben beschrieben (0,05 μl) wurde für 2 Stunden bei Raumtemperatur in 20 μl einer Inkubationsmischung inkubiert, wobei die Inkubationsmischung enthält: 25 mM HEPES, pH 7,4, 10 mM MgCl₂, 5 mM beta-Mercaptoethanol, 20 mM beta-Glycinphosphat (oder 100 μM Natriumorthovanadat), 10 μM cGMP, 2 μM ATP, 10 nM [³³P] ATP (2000 Ci/mmol), 400 μM Kemptide (oder 2 mM Kemptide oder 0,43 mg/ml Myelin basisches Protein). Die Reaktion wurde dann mit 2,5 μl von 0,25 M Phosphorsäure pro 20 μl Testvolumen gequenscht und die Mischung wurde auf ein Whatman P81 Chromatographiepapier aufgepunktet. Das Chromatographiepapier wurde für 2 Minuten getrocknet, 5 mal für 3 Minuten jedes Mal mit 150 ml 75 mM Phosphorsäure gewaschen, dann kurz mit 95% Ethanol gewaschen. Nach Lufttrocknung wurde das markierte Kemptide, welches auf dem Filter verbleibt, mittels Flüssig-Szintillationszählung bestimmt.

Das biochemisch gereinigte native E. tenella Inhibitorverbindungs-Bindungsprotein besitzt sehr geringe Kinaseaktivität, wenn in Abwesenheit von zyklischen Nukleotidcofaktoren getestet wurde. Die Kinaseaktivität war gering stimuliert, wenn in Gegenwart von cAMP ermittelt wurde, aber mehr als 400fach stimuliert mit cGMP.

(b) "In-Gel" Kinasetest. Um zu bestätigen, dass die Kinaseaktivität durch das 120 kDa Polypeptid bewirkt wird und nicht durch ein anderes kleineres Porteinen in dieser biochemischen Fraktion, wurde ein "In-Gel" Kinasetest durchgeführt (siehe Verfahren unten). Der In-Gel Kinasetest wurde nach Herstellerangaben durchgeführt (Stratagene In-Gel Protein Kinase Assay Kit, Instruction Manual Cat. # 206020, Revision # 117002) bis auf dass das im Kit beigefügte Substrat, das durch 0,33 mg Myelin basisches Protein pro ml des Gels ersetzt wurde. In diesem Verfahren wird ein SDS-Polyacrylamidgel mit Kinasesubstrat imprägniert und die gereinigte Fraktion wird im Gel elektrophoresiert. Im Anschluss an extensive Waschungen wurde die Kinase, nach Aussetzen an SDS, um diese zu renaturieren, ³²P ATP und cGMP hinzugefügt. Der Marker wird in das Substrat an Positionen eingebaut, wo die katalytischen aktiven Kinasen gegenwärtig sind. In diesem Test wurde der Marker nur an die Position des 120 kDa Proteins inkorporiert.
(c) Lösliche Proteine, welche aus dem Lysat von E. tenella stammen, wurden an einer HiLoad Q Säule (siehe Beispiel 3 oben) chromatographiert. Die Fraktionen wurden bezüglich Kinase und Dehnungsaktivitäten getestet. Die Ergebnisse deuten an, dass dies zwei Aktivitäten übereinstimmen und bestätigt weiter, dass das Binden an [³H]-Inhibitorverbindung und Kinaseaktivität sich in dem selben Protein befinden.
(d) cGMP Agaroseaffinitätschromatographie. Eine 1 ml cGMP Agarosesäule (Biolog) wurde mit cGMP Agarosepuffer (50 mM Hepes, pH 7,4, 10% Glycerol, 10 mM Natriumfluorid, 0,1 mM Natriumorthovanadat, 1 mM EDTA) äquilibriert und die gereinigte Fraktion der Säule ausgesetzt. Die Säule wurde mit 10 ml an cGMP Agarosepuffer gewaschen. Nicht-spezifisch gebundene Proteine wurden mit 5 ml an cGMP Agarosepuffer der 1 mM GMP entfernt. Die Proteine wurden mit 5 ml von cGMP Agarosepuffer der 15 mM cGMP enthält, eluiert und die Fraktionen wurden gesammelt. Die Fraktionen wurden bezüglich [³H]-Inhibitor-Verbindungsbindung, PKG Aktivität analysiert und zwar bei Silberfärbung gefolgt auf Polyacrylamidgelelektrophorese. Die Affinitätsmatrix, cGMP Agarose (Biolog) bindet cGMP Bindungsproteine. Wenn die gereinigte native Parasiten-PKG-Fraktion solch einer Säule ausgesetzt wurde, wurde die Gesamte Inhibitorverbindung-Bindungsaktivität und PKG katalytische Aktivität an die Säule gebunden und konnte mit cGMP, aber nicht mit GMP (siehe unten) eluiert werden. Gefärbte Gele der Eluate zeigen, dass das einzige Protein, welches von der Säule eluiert wurde, das 120 kDa Polypeptid ist. Das rekombinante Protein exprimiert in Nicht-Wirbeltierzellen aus dem cDNA Klon Et.PKG7 und partiell gereinigt durch IMAC Chromatographie, bindet auch an die cGMP Agaroseaffinitätsmatrix und kann insbesondere mit einem Puffer, der cGMP enthält, eluiert werden. Rekombinantes Protein, welches durch diese sequenzielle Affinitätschromatographien gereinigt ist, ist auch ein katalytisch aktives PKG.

Die Ergebnisse der oben angeführten Tests zeigen, dass das 120 kDa E. tenella Protein ein PKG ist und dass es spezifisch an die Inhibitorverbindung bindet. Zusätzlich können beide, die native und die rekombinante exprimierte PKG katalytische Aktivität mit der Inhibitorverbindung mit einem IC₅₀ von < 5nM inhibiert werden. SEQUENZLISTE

Claims

Isoliertes Polynukleotid, umfassend eine Nukleotidsequenz, welche für eine cGMP-abhängige Proteinkinase mit einer Aminosäuresequenz wie in SEQ-ID-Nr. 11 angegeben codiert.
Isoliertes Polynukleotid nach Anspruch 1, welches eine Nukleotidsequenz wie in SEQ-ID-Nr. 10 angegeben umfasst.
Wirtszelle, transformiert oder transfiziert mit dem Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder 2.
Expressionsvektor, umfassend das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder 2 in funktionsfähiger Verknüpfung mit einer regulatorischen Nukleotidsequenz, welche die Expression des Nukleinsäuremoleküls in einer Wirtszelle steuert.
Expressionsvektor nach Anspruch 4, wobei der Vektor ein Plasmid ist.
Im wesentlichen reine cGMP-abhängige Proteinkinase G der Familie Apicomplexan, umfassend die in SEQ-ID-Nr. 11 angegebene Aminosäuresequenz.
Im wesentlichen reine cGMP-abhängige Proteinkinase G der Familie Apicomplexan, umfassend eine Aminosäuresequenz, die von der in SEQ-ID-Nr. 10 angegebenen Nukleotidsequenz codiert wird.
Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen mit Aktivität gegen Protozoen, umfassend: (a) Kontaktieren einer cGMP-abhängigen Protozoen-Proteinkinase G (PKG) der Famile Apicomplexan, umfassend die Aminosäuresequenz, welche in SEQ-ID-Nr. 11 angegeben ist oder welche von der in SEQ-ID-Nr. 10 angegebenen Nukleotidsequenz codiert wird, mit (i) einer bekannten Menge einer markierten Verbindung, welche mit einer cGMP-abhängigen Proteinkinase G wechselwirkt, und (ii) einer bekannten Verdünnung einer Testverbindung oder eines Extrakts eines natürlichen Produkts; und (b) quantitative Bestimmung der prozentualen Inhibierung der Wechselwirkung der markierten Verbindung, welche durch die Testverbindung induziert wird.
Verfahren zum Screenen hinsichtlich von Substanzen, welche die Aktivität der isolierten cGMP-abhängigen Proteinkinase G nach Anspruch 6 oder 7 inhibieren, umfassend das Kontaktieren der Kinase mit der nachzuweisenden Substanz und Messen der cGMP-abhängigen Proteinkinaseaktivität in der kontaktierten isolierten Kinase G.
Verfahren zur Identifzierung eines Antiprotozoikums, welches bei der Inhibierung der Kinaseaktivität einer cGMP-Proteinkinase G, die von Eimeria tenella stammt, wirksam ist, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (i) Kombinieren von (a) einem Test-Agens, (b) einer Kinase, welche dadurch gekennzeichnet ist, dass sie die in SEQ-ID-Nr. 11 angegebene Aminosäuresequenz aufweist oder die Aminosäuresequenz, welche von der in SEQ-ID-Nr. 10 angegebenen Nukleotidsequenz codiert wird, (c) einem geeigneten Substrat, welches für die Kinase von (b) oben spezifisch ist, und (d) markiertem ATP in einer Reaktionsmischung; und (ii) Bestimmen des Ausmaßes, in dem das Test-Agens die Phosphorylierung des Substrats im Vergleich zu einer Kontrollreaktion, bei der die Testverbindung fehlt, inhibiert, wobei die Inhibierung der Phosphorylierung in Anwesenheit der Verbindung anzeigt, dass das Test-Agens ein Antiprotozoikum ist.
Verfahren zum Screenen hinsichtlich einer Verbindung, welche die Bindungs- oder Kinaseaktivität der Kinase nach Anspruch 6 oder 7 inhibiert, wobei das Verfahren umfasst: (a) Kombinieren der Kinase mit mindestens einer Testverbindung unter Bedingungen, welche die Aktivität der Kinase gestatten; (b) Ermitteln der Aktivität der Kinase in Anwesenheit der Testverbindung; und (c) Vergleichen der Aktivität der Kinase in Anwesenheit der Testverbindung mit der Aktivität der Kinase in Abwesenheit der Testverbindung, wobei eine Abweichung zwischen den Aktivitäten eine Verbindung anzeigt, welche die Aktivität der Kinase nach Anspruch 6 oder 7 inhibiert.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Inhibierung der Aktivität der Kinase durch direkte Bindung der Testverbindung an die Kinase nachgewiesen wird.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die direkte Bindung durch Lysieren der Zelle und Durchführen einer Immunpräzipitation bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Inhibierung (i) die Messung der Inhibierungswirksamkeit der Kinase ist und (ii) durch Verwendung eines Assays hinsichtlich der Aktivität der Kinase nachgewiesen wird.