DE69132701T2

DE69132701T2 - Klonierung durch Komplementierung und verwandte Prozesse

Info

Publication number: DE69132701T2
Application number: DE69132701T
Authority: DE
Inventors: John J. Colicelli; Michael H. Wigler
Original assignee: Cold Spring Harbor Laboratory
Current assignee: Cold Spring Harbor Laboratory
Priority date: 1990-04-20
Filing date: 1991-04-19
Publication date: 2002-06-20
Anticipated expiration: 2011-04-20
Also published as: US20060199247A1; CA2080920C; EP0940469A2; CA2080920A1; US6080540A; DK0666314T3; EP0666314A1; DE69132701D1; EP0940469A3; JPH11239481A; WO1991016457A1; HK1013314A1; JP4031027B2; EP0537173A1; EP0666314B1; US6569617B1; ATE204603T1; JPH05507196A; US5527896A; EP0537173A4

Description

HINTERGRUND

Die vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen DNAs, die für RAS-verwandte Proteine kodieren. Diese DNAs stellen im Gegenzug wertvolle Materialien bereit, die als Hybridisierungssonden für verwandte DNAs nützlich und beim Erhalt von Polypeptid- Expressionsprodukten nützlich sind, wenn sie zum Transformieren geeigneter Wirtszellen verwendet werden.
Von Interesse für die vorliegende Erfindung sind die folgenden Diskussionen, die RAS- verwandte Proteine betreffen.
Die RAS-Gene wurden zuerst als das transformierende Prinzip der murinen Harvey-and- Kirsten-Sarkomviren entdeckt [Ellis et al., Nature, 292: 506 (1981)]. Die zellulären Homologe der Oncogene der murinen Harvey-and-Kirsten-Sarkomviren (H-RAS und K-RAS) stellen zwei Mitglieder der RAS-Genfamilie dar [Shimizu et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 80: 2112 (1983)]. Ein drittes Mitglied ist N-RAS [Shimizu et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 80: 2112 (1983)]. Diese Gene sind als Oncogene bekannt, da Punktmutationen in RAS zu Genen führen können, die in der Lage sind, nicht-kanzeröse Zellen in kanzeröse Zellen umzuwandeln [Tabin et al., Nature, 300: 143 (1982); Reddy et al., Nature, 300: 149 (1982); Taparowsky et al., Nature, 300: 762 (1982)]. Viele Tumorzellen enthalten RAS-Gene mit solchen Mutationen [Capon et al., Nature, 302: 33 (1983); Capon et al., Nature, 304: 507 (1983); Shimizu et al Nature, 304: 497 (1983); Taparowsky et al., Cell, 34: 581 (1983); Taparowsky et al., Nature, 300: 762 (1982); Barbacid, Ann. Rev. Biochem., 56: 779 (1987)].
Trotz der Wichtigkeit der RAS-Oncogene für unser Verständnis von Krebs ist die Funktion von RAS-Genen in Säugetieren nicht bekannt. Die RAS-Proteine sind kleine Proteine (21.000 Daltons bei Säugetieren), die GTP und GDP binden [Papageorge et al., J. Virol., 44: 509 (1982)]. Die RAS-Proteine hydrolisieren GTP langsam; spezifische zelluläre Proteine können diesen Prozeß beschleunigen [McGrath et al., Nature, 310: 644 (1984); Trahey et al., Science, 238: 542 (1987)]. RAS-Proteine binden an die innere Oberfläche der Plasmamembran [Willingham et al., Cell, 19: 1005 (1980)] und durchlaufen eine komplexe kovalente Modifizierung an ihren Carboxy-Termini [Hancock et al., Cell, 57: 1167 (1989)]. Die Kristallstruktur von H- RAS ist bekannt [De Vos et al., Science, 239: 888 (1988)].
Die Hefe Saccharomyces cerevisiae enthält zwei Gene, RAS1 und RAS2, die strukturelle und funktionelle Homologie mit Säugetier RAS-Oncogenen haben [Powers et al., Cell, 36: 607 (1984); Kataoka et al., Cell, 40: 19 (1985); Defeo-Jones et al., Science, 228: 179 (1985); Dhar et al., Nucl. Acids Res., 12: 3611 (1984)]. Sowohl RAS1 als auch RAS2 sind aus Hefeplasmidbibliotheken kloniert worden, und die vollständige Nukleotidsequenz ihrer kodierenden Regionen ist bestimmt worden [Powers et al., Cell, 36: 607 (1984); DeFeo-Jones et al., Nature, 306: 707 (1983)]. Die zwei Gene kodieren für Proteine mit nahezu 90% Identität mit den ersten 80 Aminosäurepositionen der Säugetier-RAS-Proteine, und nahezu 50% Identität mit den nächsten 80 Aminosäurepositionen. Die Hefe-RAS1- und RAS2-Proteine sind zueinander homologer, mit ungefähr 90% Identität für die ersten 180 Positionen. Danach, an nahezu derselben Position, an der die Säugetier-RAS-Proteine voneinander zu divergieren beginnen, divergieren die beiden Hefe-RAS-Proteine radikal. Die Hefe-RAS-Proteine, wie Proteine, die durch die Säugetiergene kodiert werden, terminieren mit der Sequenz cysAAX, wobei A eine aliphatische Aminosäure ist und X die terminale Aminosäure ist [Barbacid, Ann Rev. Biochem., 56: 779 (1987)]. Ein gegen Säugetier-RAS-Proteine gerichteter monoklonaler Antikörper immunfällt RAS-Proteine in Hefezellen [Powers et al., Cell, 47: 413 (1986)]. Daher haben die Hefe-RAS-Proteine dieselbe Gesamtstruktur und Beziehung zueinander, wie sie bei der Familie der Säugetier-RAS-Proteine gefunden wird.
RAS-Gene sind bei einer großen Vielzahl von eukaryontischen Spezies nachgewiesen worden, einschließlich Schizosaccharomyces pombe, Dictyostelium discoidiem und Drosophila melanogaster [Fukui et al., EMBO, 4: 687 (1985); Reymond et al., Cell, 39: 141 (1984); Shilo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA, 78: 6789 (1981); Neuman-Silberberg, Cell, 37: 1027 (1984)]. Die weitverbreitete Verteilung von RAS-Genen in der Evolution zeigt an, daß Studien von RAS bei einfachen eukaryontischen Organismen die normalen zellulären Funktionen von RAS bei Säugetieren aufklären kann.
Umfassende genetische Analysen von RAS1 und RAS2 von S. cerevisiae sind durchgeführt worden. Durch in-vitro-Konstruktion von RAS-Genen, die durch selektierbare biochemische Marker zertrermt sind, und durch Einführung dieser mittels Genersatz in die chromosomalen RAS-Loci ist festgestellt worden, daß weder RAS1 noch RAS2 selbst ein essentielles Gen ist. Jedoch sind RAS-doppelt-defiziente (ras1&supmin; ras2&supmin;)-Sporen von doppelt heterozygoten Diploiden nicht in der Lage, vegetatives Wachstum wieder fortzusetzen. Wenigstens eine gewisse RAS- Funktion ist deshalb für die Lebensfähigkeit von S. cerevisiae erforderlich [Kataoka et al., Cell, 37: 437 (1984)]. Es ist ebenso festgestellt worden, daß RAS1 sich auf Chromosom XV, 7 cM von ADE2 und 63 cM von HIS3 befindet; und daß RAS2 sich auf Chromosom XIV, 2 cM von MET4 befindet [Kataoka et al., Cell, 37: 437 (1984)].
Saugetier-RAS, die in Hefe exprimiert worden ist, kann dahingehend wirken, daß sie die phänotypischen Defekte korrigiert, die ansonsten aus dem Verlust von sowohl RAS1 als auch RAS2 resultieren würden [Kataoka et al., Cell, 40: 19 (1985)]. Umgekehrt ist Hefe-RAS1 in der Lage, in Vertebratenzellen zu funktionieren [De Feo-Jones et al., Science, 228: 179 (1985)]. Somit hat es eine ausreichende Konservierung der Struktur zwischen Hefe- und menschlichen RAS-Proteinen gegeben, um es jedem zu ermöglichen, in heterologen Wirtszellen zu funktionieren.
Die Missense-Mutante, RAS2val19, die für Valin anstelle von Glyzin an der neunzehnten Aminosäureposition kodiert, hat dieselbe Mutationssorte, die in einigen oncogenen Mutanten von Säugetier-RAS-Genen gefunden wird [Tabin et al Nature, 300: 143 (1982); Reddy et al., Nature, 300: 149 (1982); Taparowsky et al., Nature, 300: 762 (1982)]. Diploide Hefezellen, die diese Mutation enthalten, sind nicht in der Lage, effizient Sporen zu bilden, sogar, wenn sie Wildtyp-RAS-Allele enthalten [Kataoka et al., Cell, 37: 437 (1984)]. Wenn eine aktivierte Form des RAS2-Gens (z. B. RAS2val19) in haploiden Zellen vorhanden ist, können Hefezellen Glykogen nicht synthetisieren, sind nicht in der Lage, in G1 anzuhalten, sterben schnell im Nährstoffnungerzustand und sind akut empfindlich gegenüber Hitzeschock [Toda et al., Cell, 40: 27 (1985); Sass et al Proc. Natl. Acad. Sci., 83: 9303 (1986)].
Die S. cerevisiae Stämme, die RAS2val19 enthalten, haben Wachstums- und biochemische Eigenschaften, die Hefe, welche die IAC- oder bcyl-Mutationen trägt, welche den cAMP-Weg in Hefe aktivieren, auffallend ähnlich sind [Uno et al., J. Biol. Chem., 257: 14110 (1981)]. Die Hefestämme, die die IAC-Mutation tragen, haben erhöhte Niveaus der Adenylatcyclase- Aktivität. bcyl&supmin;-Zellen fehlt der regulatorische Bestandteil der cAMP-abhängigen Proteinkinase [Uno et al., J. Biol. Chem., 257: 14110 (1982); Toda et al., Mol. Cell. Biol., 7: 1371 (1987)]. Hefestämme, die hinsichtlich der RAS-Funktion defizient sind, weisen Eigenschaften, ähnlich Adenylylcyclase-defizienter Hefe auf [Toda et al., Cell, 40: 27 (1985)]. Die bcyl&supmin;-Mutation unterdrückt die Lethalität in ras1&supmin; ras2&supmin;-Hefe. Diese Resultate legen nahe, daß in der Hefe S. cerevisiae die RAS-Proteine in dem cAMP-Signalweg wirken.
Es ist gezeigt worden, daß Adenylylcyclase durch RAS-Proteine kontrolliert wird [Toda et al., Cell, 40: 27 (1985)]. RAS-Proteine, entweder aus Hefe oder Menschen, kann die Adenylylcyclase bis zu fünfzigfach in biochemischen in vitro-Assays stimulieren. RAS-Proteine werden die Adenylylcyclase nur stimulieren, wenn sie mit GTP gebunden sind [Field et al., Mol. Cell. Biol., 8: 2159 (1988)].
Die Phänotypen, die aus der Aktivierung von RAS resultieren, einschließlich Empfindlichkeit gegenüber Hitzeschock und Hungerzustand, sind hauptsächlich das Resultat einer Überexpression oder nicht-kontrollierten Aktivierung des cAMP-Effektor-Wegs über Adenylylcyclase [Kataoka et al., Cell, 37: 437 (1984); Kataoka et al Cell, 43: 493 (1985); Toda et al., Cell, 40: 27 (1985); Field et al Mol. Cell Biol., 8: 2159 (1988)].
Zwei S. cerevisiae Hefegene, PDE1 und PDE2, die für die cAMP-Phosphodiesterasen mit niedriger bzw. hoher Affinität kodieren, sind isoliert worden [Sass et al Proc. Natl. Acad. Sci., 83: 9303 (1986); Nikawa et al., Mol. Cell. Biol., 7: 3629 (1987)]. Diese Gene wurden aus genomischen Hefebibliotheken aufgrund ihrer Fähigkeit kloniert, die Hitzeschockempfindlichkeit in Hefezellen, die ein aktiviertes RAS2val19-Gen beinhalten, zu unterdrücken. Zellen, denen die PDE-Gene (d. h. pde1&supmin; pde2&supmin;-Hefe) sind hitzeschockempfindlich, sind hinsichtlich der Glykogenakkumulierung defizient, können nicht auf einer Acetat-Kohlenstoffquelle wachsen und haben im allgemeinen Defekte aufgrund der Aktivierung des cAMP-Signalwegs [Nikawa et al., Mol. Cell. Biol., 7: 3629 (1987)].
Eine genetische Analyse zeigt deutlich an, daß RAS-Proteine andere Funktionen in S. cerevisiae zusätzlich zu der Stimulierung von Adenylylcyclase haben [Toda et al., Japan Sci Soc. Press., Tokyo/VNU Sci. Press, S. 253 (1987); Wigler et al., Cold Spring Harbor Symposium, LIII: 649 (1988); Michaeli et al., EMBO, 8: 3039 (1989)]. Die genaue biochemische Natur dieser Funktionen ist unbekannt. Experimente mit anderen Systemen, wie S. pombe und Xenopus laevis Oocyten, zeigen an, daß die RAS-Stimulierung von Adenylylcylase in der Evolution nicht weit verbreitet ist [Birchmeier et al., Cell, 43: 615 (1985)]. Es ist unwahrscheinlich, daß RAS die Adenylylcyclase in Säugetieren stimuliert (Beckner et al., Nature, 317: 1 (1985)).
Mehrere Verfahren sind gegenwärtig zum Klonieren von Säugetiergenen verfügbar. Eine Standard-Vorgehensweise zum Klonieren von Säugetiergenen erfordert das Gewinnen von aufgereinigtem Protein, das Bestimmen einer partiellen Aminosäuresequenz des aufgereinigten Proteins, die Verwendung der partiellen Aminosäuresequenz zum Erzeugen, von degenerierten Oligonukleotidsonden und das Screenen von cDNA-Bibliotheken mit diesen Sonden, um eine cDNA zu erhalten, die für das Protein kodiert. Dieses Verfahren ist zeitaufwendig und kann wegen der Degeneriertheit der verwendeten Sonden Sequenzen identifizieren, die nicht diejenigen sind, die für das (die) Protein(e) von Interesse kodieren. Viele Säugetiergene sind auf diese Weise kloniert worden, einschließlich zum Beispiel dem Gen, das für die in der Retina exprimierte cGMP-Phosphodiesterase kodiert [Ovchinnikov et al., FEBS, 223: 169 (1987)].
Ein zweiter Ansatz zum Klonieren von Genen, die für ein interessierendes Protein kodieren, ist, ein bekanntes Gen als eine Sonde zu verwenden, um Homologe zu finden. Dieser Ansatz ist insbesondere nützlich, wenn die Mitglieder einer Genfamilie oder -familien hinreichend homolog sind. Das Drosophila melanogaster dunce-Phosphodiesterase-Gen wurde zum Beispiel verwendet, um Ratten-Homologe zu klonieren. Davis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 3604 (1989); und Swinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci (USA), 86: 5325 (1989). Obwohl zusätzliche Mitglieder einer Familie von Phosphodiesterase-Genen kloniert werden könnten, wenn ein erstes Mitglied dieser Familie kloniert worden ist, ist es niemals von vornherein bekannt, ob die Nukleotidsequenzen der Gene, die zu verschiedenen Phosphodiesterase-Genfamilien gehören, ausreichend Homologie aufweisen werden, um die aus einer Familie stammenden Sonden zu verwenden, um die Mitglieder einer anderen Familie zu identifizieren.
Noch ein weiterer Ansatz zum Klonieren von Genen ist bekannt als Komplementierung. Eine Anzahl von Forschern haben über die Isolierung von Hefe-Genen aufgrund ihrer Fähigkeit, eine Mutation/einen Defekt in dem entsprechenden Gen in einer anderen Hefe zu komplementieren, berichtet. Siehe zum Beispiel: McKnight et al., EMBO J., 4: 2093 (1985) - Aspergillus nidulans-Gen, das für eine Alkoholdehydrogenase kodiert, isoliert anhand seiner Fähigkeit, eine adh1-Mutation in S. cerevisiae zu komplementieren; Sass et al., PNAS (USA), 83: 9303 (1986) - S. cerevisiae PDE2-Gen, isoliert anhand seiner Fähigkeit, eine RAS2val19- Allel im S. cerevisiae Stamm TK161-R2V zu komplementieren; Nikawa et al Mol. Cell. Biol., 7: 3629 (1987) - S. cerevisiae PDE1-Gen, isoliert durch Transformieren von S. cerevisiae Stamm TK161-R2V; und Wilson, Molec. Cell. Biol 8: 505 (1988) - S. cerevisiae SRA5- Gen, isoliert aufgrund seiner Fähigkeit, einen RAS&spplus; sra5-5 S. cerevisiae Stamm RW60-12C zu retten.
Hefe ist ebenso verwendet worden, um Nicht-Hefe-Gene zu isolieren. Zum Beispiel berichteten Henikoff et al., Nature, 289: 33 (1981), über die Isolierung eines D. Melanogaster-Gens mittels Komplementierung von Hefemutanten, und Lee et al., Nature, 327: 31 (1987), berichteten über die Isolierung eines menschlichen Gens anhand seiner Fähigkeit, eine Mutation in dem cdc2-Gen in S. pombe zu komplementieren. Der verwendete Expressionsvektor schloß einen viralen (SV40) Promoter ein.

KURZE ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft Säugetiergene, die für Proteine kodieren, die in Mikroorganismen, insbesondere Hefe, funktionieren können und einen genetischen Defekt, der mit einer identifizierbaren phänotypischen Veränderung oder Eigenschaft in dem Mikroorganismus assoziiert ist, modifizieren, komplementieren oder unterdrücken können. Von der Erfindung werden Säugetiergene bereitgestellt sowie Produkte, die von solchen Genen kodiert werden.
Gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine aufgereinigte isolierte DNA- Sequenz bereitgestellt, die im wesentlichen aus einer DNA-Sequenz besteht, die für ein Säugetier RAS-verwandtes Protein-Polypeptid kodiert und aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den Säugetier-cDNA-Inserts besteht, die in den Plasmiden pJC99 (A. T. C. C.68599), pJC265 (A. T. C. C.68598), pJC310 (A. T. C. C.68597), pML5 (A. T. C. C.68593), pATG16 (A. T. C. C.68592) und pATG29 (A. T. C. C.68591) vorhanden sind. Die vorliegende Erfindung umfaßt ebenso eine aufgereinigte isolierte DNA-Sequenz, die im wesentlichen aus einer DNA-Sequenz besteht, die für ein RAS-verwandtes Protein-Polypeptid kodiert, wobei die DNA-Sequenz unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an eine DNA-Sequenz gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung hybridisiert, sowie eine aufgereinigte und isolierte DNA-Sequenz, die im wesentlichen aus einer DNA-Sequenz besteht, die für ein Polypeptid kodiert, welches durch eine DNA-Sequenz mittels degenerierter Kodons kodiert wird.
Gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Polypeptidprodukt der Expression in einer prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszelle einer DNA-Sequenz gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung bereitgestellt.
RAS-Protein-verwandte DNA-Sequenzen, die als Säugetier-DNA-Inserts in bakteriellen Plasmiden vorhanden sind, sind der Gegenstand von Hinterlegungen, die am 15. April 1991 bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 in Übereinstimmung mit den Erfordernissen des US-Patent- und Markenamts und des Budapester Vertrags gemacht wurden.
Säugetier-RAS-verwandte DNAs, die zum Gegenstand einer Hinterlegung gemacht worden sind, schließen ein:
1. Plasmid pJC99 in E. coli (A. T. C. C. Hinterlegungsnr. 68599), das ein menschliches Glioblastomzell-cDNA-Insert enthält, das für ein RAS-verwandtes Polypeptid kodiert;
2. Plasmid pJC265 in E. coli (A. T. C. C. Hinterlegungsnr. 68598), das ein menschliches Glioblastomzell-cDNA-Insert enthält, das für ein RAS-verwandtes Polypeptid kodiert;
3. Plasmid pJC310 in E. coli (A. T. C. C. Hinterlegungsnr. 68597), das ein menschliches Glioblastomzell-cDNA-Insert enthält, das für ein RAS-verwandtes Polypeptid kodiert;
4. Plasmid pML5 in E. coli (A. T. C. C. Hinterlegungsnr. 68593), das ein menschliches Glioblastomzell-cDNA-Insert enthält, das für ein RAS-verwandtes Polypeptid kodiert;
5. Plasmid pATG16 in E. coli (A. T. C. C. Hinterlegungsnr. 68592), das ein menschliches Glioblastomzell-cDNA-Insert enthält, das für ein RAS-verwandtes Polypeptid kodiert; und
6. Plasmid pATG29 in E. coli (A. T. C. C. Hinterlegungsnr. 68591), das ein menschliches Glioblastomzell-cDNA-Insert enthält, das für ein RAS-verwandtes Polypeptid kodiert. Hefeexpressionsplasmide, die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung hinterlegt worden sind, schließen ein:
7. Plasmid pAAUN in E. coli (A. T. C. C. Hinterlegungsur. 68590);
8. Plasmid pAAUN-ATG in E. coli (A. T. C. C. Hinterlegungsnr. 68589);
9. Plasmid pADANS in E. coli (A. T. C. C. Hinterlegungsnr. 68587); und
10. Plasmid pADNS in E. coli (A. T. C. C. Hinterlegungsur. 68588).
Hefewirtszellen, die zum Gegenstand einer Hinterlegung im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung gemacht worden sind, schließen ein:
11. S. pombe SP565 (A. T. C. C. Hinterlegungsnr. 74047);
12. S. cerevisiae SKN37 (A. T. C. C. Hinterlegungsnr. 74048);
13. S. cerevisiae 10DAB (A. T. C. C. Hinterlegungsnr. 74049); und
14. S. cerevisiae TK161-R2V (A. T. C. C. Hinterlegungsnr. 74050).
Neue Proteinprodukte der Erfindung schließen Polypeptide ein, die die primäre strukturelle Konformation (d. h. Aminosäuresequenz) von Nicht-Phosphodiesterase-Proteinen haben, einschließlich Peptidfragmenten davon und synthetischen Peptiden, die so zusammengesetzt sind, daß sie Aminosäuresequenzen davon verdoppeln. Es wird angenommen, daß die Proteine, Proteinfragmente und synthetischen Peptide der Erfindung zahlreiche Verwendungen einschließlich therapeutischer, diagnostischer und prognostischer Verwendungen haben werden und die Grundlage zur Herstellung von monoklonalen und polyklonalen Antikörpern bereitstellen werden, die mit diesen Proteinen spezifisch immunreaktiv sind. Bevorzugte Proteinfragmente und synthetische Peptide schließen diejenigen duplizierenden Regionen der Proteine ein, die nicht an den Substratbindungsfunktionen beteiligt sind, und die bevorzugtesten sind diejenigen, die wenigstens ein antigenes Epitop mit den Proteinen der Erfindung gemeinsam haben.
Es wird erwartet, daß die Verwendung von Säugetierwirtszellen zur Expression von DNAs der Erfindung solche posttranslationalen Modifizierungen bereitstellt (z. B. Trunkierung, Anhängen von Lipiden, Glykosylierung und Tyrosin-, Serin- oder Threonin-Phosphorylierung), wie sie benötigt werden, um optimale biologische Aktivität den rekombinanten Expressionsprodukten der Erfindung zu verleihen.
Unter den vielfachen Aspekten der vorliegenden Erfindung ist deshalb die Bereitstellung von (a) neuen Nukleinsäuresequenzen, die für RAS-Proteine, wie hiernach beschrieben, kodieren, und (b) DNA-Sequenzen, die daran hybridisieren unter Hybridisierungsbedingungen der Stringenz, die gleich oder größer als die hierin beschriebenen und bei der anfänglichen Isolierung von bestimmten cDNAs der Erfindung verwendeten Bedingungen sind, sowie (c) DNA- Sequenzen, die für dieselben kodieren, oder allelische Varianten oder analoge Polypeptide durch die Verwendung von wenigstens teilweise degenerierten Codons. Entsprechend werden virale Vektoren oder zirkuläre Plasmid-DNA-Vektoren bereitgestellt, die solche DNA- Sequenzen enthalten, und prokaryontische und eukaryontische Wirtszellen, die mit solchen DNA-Sequenzen und Vektoren transformiert oder transfiziert sind, sowie Verfahren zur rekombinanten Herstellung von Proteinen, die von den DNA-Sequenzen kodiert werden, mittels Kulturwachstums von solchen Wirten und der Isolierung dieser Proteine aus den Wirten oder ihren Kulturmedien.
Die vorliegende Erfindung offenbart weiterhin ein Verfahren zum Identifizieren von Mitteln, die die Aktivität der Proteinprodukte von solchen Säugetiergenen, die in Mikroorganismen, wie Hefe, exprimiert worden sind, modifizieren oder verändern (d. h. reduzieren oder stimulieren). Die Identifizierung von solchen Mitteln kann durchgeführt werden unter Verwendung von zwei Arten von Screening-Prozeduren: Eine auf der Basis von biochemischen Assays von Säugetierproteinen mit bekannter enzymatischer Funktion und eine auf der Basis von Phänotyp-Assays für Proteine von bestimmter oder noch unbestimmter Funktion.
Im letzteren Fall, wenn die kodierten Proteine mit RAS-Proteinen wechselwirken, schließen zum Beispiel pharmakologische Screens den Assay auf Mittel ein, die die Wechselwirkungen mit RAS-Proteinen reduzieren oder stimulieren. Diese Screeningverfahren können entweder mit Ganzzell-Zubereitungen oder Zellextrakten verwendet werden und erfordern keine Enzymaufreinigung.
Andere Gesichtspunkte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden nach Betrachtung der folgenden detaillierten Beschreibung ersichtlich sein, die zahlreiche erläuternde Beispiele enthält, wobei Bezug genommen wird auf die Zeichnung, wobei:
Fig. 1 [Fig. 1(A), 1(B), 1(C) und 1(D)] ein vergleichendes Alignment der Nukleotidsequenzen der menschlichen cDNA-Inserts der Plasmide pJC44X, pTM3, pGB14 und pGB18ARR ist, wobei Kleinbuchstaben einen Mangel an Homologie bezeichnen und Lücken die Abwesenheit von entsprechenden Basenpositionen anzeigen;
Fig. 2 [Fig. 2(A), 2(B), 2(C) und 2(D)] ein vergleichendes Alignment der Nukleotidsequenzen der menschlichen cDNA-Inserts der Plasmide pPDE2RR, pTM72, pPDE7 und pPDE 10x-INV ist, wobei Kleinbuchstaben einen Mangel an Homologie bezeichnen und Lücken die Abwesenheit von entsprechenden Basenpositionen anzeigen;
Fig. 3 ein vergleichendes Alignment der Nukleotidsequenzen der menschlichen cDNA- Inserts der Plasmide pPDE18 und pGB25 ist, wobei Kleinbuchstaben einen Mangel an Homologie bezeichnen und Lücken die Abwesenheit von entsprechenden Basenpositionen anzeigen; und
Fig. 4 [Fig. 4(A) und 4(B)] ein vergleichendes Alignment der abgeleiteten Aminosäuresequenzen der Plasmide pTM72 (TM72), pRATDPD, pJC44X, pPDE18 und pPDE21 ist, wobei Kleinbuchstaben nicht-homologe Reste bezeichnen und Lücken den Mangel irgendeines Rests an der ausgerichteten Position anzeigt.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG

Beispiel 1 betrifft die Klonierung und die Identifizierung von Säugetiergenen durch Komplementierung in Hefe. Beispiel 2 betrifft die Klonierung und Identifizierung von Säugetiergenen durch Hybridisierung mit Säugetiergenen, die durch Komplementierung kloniert worden sind. Beispiel 3 betrifft die Charakterisierung von klonierten Genen mittels Komplementierungsfähigkeit. Beispiel 4 betrifft die weitere Charakterisierung von klonierten Genen mittels Nukleotidsequenzanalyse. Beispiel 5 betrifft das Screening und die Identifizierung von Mitteln, die die enzymatische Phosphodiesteraseaktivität verändern. BEISPIEL 1 Klonierung von Säugetiergenen durch Komplementierung in Hefe
Als erstes wird eine cDNA-Bibliothek von Säugetier-mRNAs unter Verwendung von bekannten Techniken hergestellt. Diese Bibliothek kann durch Klonierung von doppelsträngiger cDNA in einen Expressionsvektor hergestellt werden. Die cDNA kann aus einer vorher existierenden cDNA-Bibliothek erzeugt werden, oder sie kann durch die reverse Transkription von mRNA erzeugt werden, die aus einem Gewebe oder einer Zellinie der Wahl, unter Verwendung von Standardprozeduren, aufgereinigt worden ist. Watson et al., In: DNA Cloning, a Practical Approach, IRL Press Oxford (1984).
Die so erhaltene cDNA wird in einen Expressionsvektor kloniert, der in der Lage ist, Säugetier-cDNA-Inserts als mRNA zu exprimieren, die im Gegenzug in ein Protein in einer Wirtszelle der Wahl translatiert werden kann, z. B. veränderte Hefe, wie S. pombe SP565 (ras1::Leu2/ras1::Leu2) (A. T. C. C. 74047), S. cerevisiae SKN37 (cap::H1S3) (A. T. C. C.74048), S. cerevisiae 10DAB (pde1&supmin;, pde2&supmin;) (A. T. C. C.74049); und S. cerevisiae TK161-R2V (RAS2val19) (A. T. C. C.74050). Die Expressionsvektoren, die für diesen Zweck verwendet wurden, werden in den Beispielen, die folgen, beschrieben und schließen pAAUN (A. T. C. C.68590), pAAUN-ATG (A. T. C. C.68589), pADNS (A. T. C. C.68587) und pADANS (A. T. C. C.68588) ein.
Die bevorzugten Expressionsvektoren enthalten einen Transkriptionspromoter, der für die Wirtszelle spezifisch ist, in die der Vektor eingeführt wird, z. B. Promoter, die für die Expression in S. cerevisiae spezifisch sind. Die transkribierte mRNA kann das ATG des cDNA- Insert als das "Start"-Codon verwenden oder kann das cDNA-Produkt als ein Fusionsprotein exprimieren.
Die cDNA-Bibliothek (vorhanden als cDNA-Inserts in einem ausgewählten Expressionsvektor) wird in eine geeignete Wirtszelle eingeführt. Diese Wirtszelle enthält genetische Veränderungen, die bewirken, daß die Wirtszelle eine identifizierbare Phänotyp-Veränderung oder Abnormität hat, die mit der genetischen Veränderung assoziiert ist. Die Wirtszelle kann ein eukaryontischer Mirkoorganismus, wie etwa die Hefe S. cerevisiae, oder eine Säugetierzelle sein.
Bekannte Verfahren, wie Lithiumacetat-induzierte Transformation werden verwendet, um den cDNA-enthaltenden Expressionsvektor einzuführen. Bei den Beispielen, die folgen, wurde die Transformation der Hefezellen mit Lithiumacetat durchgeführt. Die Hefezellen wurden in entweder Vollmedium (YPD) oder synthetischem Medium mit geeigneten auxotrophen Zusätzen (SC) kultiviert. Mortimer et al., In: The Yeast, 1: 385 (1969). Ito et al., J. Bacteriol., 153: 163 (1983).
Die genetischen Veränderungen der ausgewählten Wirtszellen können zum Beispiel zu Defekten in den Stoffwechselwegen führen, die durch die RAS-Proteine kontrolliert werden, und der leicht unterscheidbare, damit verbundene Phänotyp mag eine Empfindlichkeit gegenüber Hitzeschock oder Stickstoffmangelzustand, ein Unvermögen, normale Mengen Glykogen zu synthetisieren, ein Unvermögen, auf bestimmten Kohlenstoffquellen zu wachsen, ein Unvermögen, Sporen zu bilden, ein Unvermögen zur Paarung, oder andere Eigenschaften, die mit Defekten auf den Wegen assoziiert sind, die durch RAS-Proteine kontrolliert werden oder diese kontrollieren, sein. Zum Beispiel kann die genetische Veränderung das Vorhandensein des RAS2val19-Gens sein. Hefe, die eine solche Veränderung enthält, weist eine Hitzeschock- Empfindlichkeit auf, die durch die Expression von Säugetiergenen überwunden werden kann. In den Beispielen, die folgen, wurden Hitzeschock-Experimente mittels Replica-Plattierung auf vorerhitzte SC-Platten durchgeführt, die bei 55ºC für 10 Minuten gehalten, abkühlen gelassen und bei 30ºC für 24-48 h inkubiert wurden.
Andere Wirtszellen mit genetischen Veränderungen können ausgewählt werden, wie etwa Zertrennung der PDE1- und PDE2-Gene in S. cerevisiae oder Zertrennungen von oder das Vorhandensein eines aktivierten Allels von ras1 in S. pombe. Andere genetische Veränderungen in einer Wirtszelle können durch unterschiedliche Teilmengen von Säugetier-cDNA- Genen korrigierbar sein.
Nach Einführung des cDNA-Insert-enhaltenden Expressionsvektors werden die Wirtszellen unter Bedingungen gehalten, die für das Wirtszellwachstum geeignet sind. Die Wirtszellen, die hinsichtlich ihrer Phänotyp-Veränderung korrigiert worden sind, werden selektioniert oder andersartig identifiziert, und das Säugetiergen, das sie exprimieren, kann wiedergewonnen werden, z. B. durch Transformation von E. coli mit DNA, die aus der Wirtszelle isoliert worden ist. Eine Segregationsanalyse wurde in den Beispielen, die folgen, mittels Wachsenlassen von Hefe-Transformanten in YPD für 2-3 Tage, Ausplattieren auf YPD-Platten und Replica- Plattieren auf YPD, SC-Leucin (Plasmid-Selektion) und YPD-Hitzeschock-Platten durchgeführt. Der E. coli Stamm HB101 wurde für die Plasmid-Fortführung und -Isolierung verwendet, und der Stamm SCS1 (Stratagene) wurde zur Transformation und dem Erhalt der cDNA- Bibliothek verwendet. Mandel et al., Mol. Biol., 53: 159 (1970), Hanahan J. Mol. Biol., 166: 557 (1983).
Wenn erwünscht, kann das Säugetiergen isoliert und sequenziert werden; alternativ kann das durch das Gen kodierte Protein identifiziert und in Kulturzellen zur Verwendung bei weiteren Prozessen exprimiert werden.
Die Teile A, B und C unten beschreiben die Isolierung von Säugetiergenen mittels Komplementierung in Hefe und ihre anschließende biochemische Charakerisierung.

A. Isolierung und biochemische Charakterisierung einer cDNA aus Rattenhirn, die für eine Phosphodiesterase kodiert

Eine cDNA-Bibliothek aus Rattenhirn wurde erzeugt und in den Hefe-Expressionsvektor pADNS kloniert. Die RNA wurde aus Sprague-Dawley-Rattenhirnen mittels veröffentlichter Prozeduren aufgereinigt. Chirgwin et al., Biochem., 18: 5294 (1979); Licardi, Methods Enzymol., 92: 24 (1983); Watson et al., In: DNA cloning, a practical approach, IRL, Press Oxford (1984). pADNS besteht aus einem 2,2 kbp BgIII-an-HpaI-Fragment, das das S. cerevisiae LEU2-Gen aus YEp213 enthält [Sherman et al., Laboratory Manual for Methods in Yeast Genetics, Sherman, F., Fink, G. R. und Hicks, J. B., eds., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1986)], einem 1,6 kbp HpaI-an-HindIII-Fragment des S. cerevisiae 2 u- Plasmids, das den Replikationsursprung enthält, und einem 2,1 kbp SspI-an-EcoRI-Fragment, das das Ampicillinresistenzgen aus dem Plasmid pUC18 enthält. Es enthält ebenso ein 1,5 kbp BamHI-an-HindIII-Fragment des modifizierten S. cerevisiae Alkoholdehydrogenase(ADH1)- Promoter [Bennetzen et al., J. Biol. Chem., 257: 3018 (1982); Ammerer, Meth. Enzymol., 101: 192 (1983)] und ein 0,6kbp HindIII-an-BamHI-Fragment, das die ADH1- Terminatorsequenzen enthält. Die Promoter- und Terminatorsequenzen sind durch einen Polylinker getrennt, der die Restriktionsendonukleasestellen NotI, SacII und SfI zwischen den existierenden Hindill und SacI-Stellen enthält.
Doppelsträngige cDNAs wurden hergestellt und an NotI-Linker ligiert, mit dem NotI- Restriktionsenzym gespalten und in pADNS an der NotI-Stelle einkloniert, die zwischen dem Alkoholdehydrogenasepromoter und Terminationssequenzen des Vektors gelegen ist. Die Verwendung des selten schneidenden NotI machte den Bedarf für Restriktionsstellen- Methylasen, die häufig beim cDNA-Klonieren verwendet werden, unnötig. Die cDNAs wurden an die NotI-Linker-Oligonukleotide ligiert:
SEQ ID NO: 1
5'-AAGCGGCCGC, und
SEQ ID NO: 2
5'-GCGGCCGCTT.
Näherungsweise 1,5 · 10&sup5; unabhängige cDNA-Inserts waren in der Bibliothek enthalten, mit einer durchschnittlichen Insertgröße von 1,5 kbp. DNA, die aus der cDNA- Expressionsbibliothek hergestellt worden war, wurde verwendet, um den RAS2val19- Hefestamm TK161-R2V zu transformieren. Die 50.000 erhaltenen Leu&spplus;-Transformanten wurden darauffolgend auf Hitzeschock-Empfindlichkeit getestet. Nur ein Transformant wies eine Hitzeschock-Resistenz auf, die vom Beibehalten des Expressionsplasmids abhängig war. Das Plasmid, bezeichnet als pRATDPD, wurde aus diesem Transformant isoliert und das 2,17 kb NotI-Insert wurde mittels Restriktionsstellenkartierung und Nukleotidsequenzierung analysiert. SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4 stellen die Nukleotidsequenz des Insert und der entsprechenden abgeleiteten Aminosäuresequenz bereit. Die Sequenzierung wurde unter Verwendung des Dideoxy-Kettenterminierungsverfahrens durchgeführt. Sanger et al., Proc Natl. Acad. Sci (USA), 74: 5463 (1977); Biggin, et al., Proc. Natl. Acad. Sci (USA), 80: 3963 (1983). Genalign wurde verwendet, um die DPD- und dunce-Sequenzen aneinander auszurichten (GENALIGN ist ein urheberrechtlich geschütztes Softwareprodukt von IntelliGenetics, Inc.; entwickelt von Dr. Hugo Martinez).
Ein großer offener Leserahmen von 562 Codons wurde gefunden. Das erste ATG tritt bei Codon 46 auf, und ein Protein, das an diesem Codon beginnt, hätte ein vorhergesagtes Molekulargewicht von näherungsweise 60 kDa. Dieses Rattengen wird als RATDPD bezeichnet. Eine Suche für ähnliche Sequenzen wurde mittels Computeranalyse von Sequenzdatenbanken durchgeführt, und das Drosophila melanogaster dunce-Gen wurde gefunden. Die beiden Gene würden für Proteine mit einer 80% Aminosäure-Identität, ohne die Einführung von Lücken, über eine 252 Aminosäureregion kodieren, die sich im Zentrum der Ratten-DPD-cDNA befindet. Es ist gezeigt worden, daß das dunce-Gen für eine cAMP-Phosphodiesterase mit hoher Affinität kodiert. Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci (USA), 83: 9313 (1986); Davis et al., J. Cell. Biol, 90: 101 (1981); Walter et al J. Neurosci., 4: 494 (1984).
Um zu demonstrieren, daß die Sequenzen stromauf und stromab von der großen Sequenzidentitätsregion tatsächlich an diese Region in der mRNA angrenzen, anstelle von Artefakten des Verfahrens zum cDNA-Klonieren, wurde die Struktur der klonierten cDNA mit der Struktur der DPD-cDNAs verglichen, die in einer unabhängig erzeugten Erststrang-cDNA- Population enthalten waren, welche durch reverses Transkribieren der gesamten poly(A)&spplus;- RNA aus Rattenhirn mit einem oligo-dT-Primer erhalten wurde. Es wurden Oligonukleotidprimer, die zu Sequenzen, welche sich innerhalb der Identitätsregion befanden, und zu Sequenzen nahe dem 5' oder 3'-Ende des kodierenden Stranges komplementär waren, gemacht. Unter Verwendung von der klonierten pRATDPD-DNA oder des gesamten Erststrang-cDNA- Materials als Matrize wurden Polymerasekettenreaktionen (PCR) durchgeführt unter Verwendung von vier verschiedenen Primersätzen, und die Reaktionsprodukte wurden mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert.
Polymerasekettenreaktionen (PCRs) wurden in einem Thermocycler (Perkin Elmer, Cetus) unter Verwendung einer Modifizierung von veröffentlichten Prozeduren durchgeführt. Saiki et al., Science, 239: 487 (1988). Die Reaktionsmischungen enthielten Matrizen-DNA (1 ng klonierte DNA oder 1 ug gesamte Erststrang-cDNA), 25 pmol Oligonukleotidprimer, 200 uM Deoxyribonukleotidtriphosphate, 10 mM Tris HCl (pH 8,4), 50 mM KCl, 3 mM MgCl&sub2; und 0,01% (w/v) Gelatine. Die verwendeten Oligonukleotidprimer waren:
SEQ ID NO: 5
A, 5'-CACCCTGCTGACAAACCT&sup4;&sup4;;
SEQ ID NO: 6
B, 5'-ATGGAGACGCTGGAGGAA¹&sup5;³;
SEQ ID NO: 7
C, 5'-ATACGCCACATCAGAATG&sup6;&sup7;&sup6;;
SEQ ID NO: 8
D, 5'-TACCAGAGTATGATTCCC¹&sup4;&sup4;&sup9;;
SEQ ID NO: 9
E, 5'-GTGTCGATCAGAGACTTG¹&sup6;&sup6;&sup8;; und
SEQ ID NO: 10
F, 5'-GCACACAGGTTGGCAGAC²&sup0;&sup4;&sup8;.
Die hochgestellten Zahlen zeigen die Positionskoordinaten in der pRATDPD SEQ ID NO: 3 an. Die Primer C, E und F sind nicht-kodierende Strangsequenzen. Dreißig Zyklen (1,5 min bei 94ºC, 3 min bei 55ºC und 7 min bei 72ºC) wurden durchgeführt, und die Reaktionsprodukte wurden mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert.
In jedem Fall wurde ein Fragment der vorhergesagten Länge unter Verwendung von jeder der beiden Matrizen-DNAs erhalten. Die Bandenzuordnungen wurden durch Spaltung mittels Restriktionsendonukleasen mit Erkennungsstellen innerhalb des amplifizierten DNA-Produkts bestätigt. Wiederum ergab in jedem Fall das unter Verwendung von jeder der beiden Matrizenquellen erhaltene Haupt-PCR-Produkt Spaltprodukte der vorhergesagten Größen. Die Resultate zeigen an, daß die Sequenzanordnung in der klonierten cDNA wahrheitsgetreu die Struktur der Ratten-mRNA reflektiert.
Um die biochemischen Eigenschaften des pRATDPD-Genprodukts zu analysieren, wurden rohe Zellextrakte aus Ein-Liter-Kulturen von 10DAB Hefezellen hergestellt, die mit entweder pADNS oder pRATDPD transformiert worden waren. Die Zellen vom Hefestamm 10DAB sind pde1&supmin; und pde2&supmin; und haben kein meßbares Niveau an endogener zyklischer Nukleotid- Phosphodiesteraseaktivität. Die Phosphodiesteraseaktivitätsassays wurden unter Verwendung von cAMP als Substrat wie folgt durchgeführt. Hefezellen wurden bei 30ºC für 36 Stunden in Ein-Liter-Kulturen synthetischer Medien (SC-Leucin) wachsen gelassen. Die Zellen wurden geerntet und mit Puffer C (20 mM MES (pH 6,2), 0,1 mM MgCl&sub2;, 0,1 mM EGTA, 1 mM β- Mercaptoethanol) gewaschen, wurden in 30 ml Puffer C mit 50 ul 1M PMSF resuspendiert und wurden mit einer French-Press aufgebrochen. Die Extrakte wurden zentrifugiert bei 1.600 g für 10 min, und die Überstände wurden bei 18.000 g für 90 min (4ºC) gedreht. Der Überstand wurde auf Phosphodiesteraseaktivität getestet wie in Collicelli et al supra. Alle Reaktionen enthielten Tris-HCl (pH 7,5) (100 mM), Zellextrakt (50 ug Protein/ml), 5'-Nukleotidase (Sigma, 20 ng/ml) und 10 mM Mg²&spplus; (wenn nicht anders dargestellt) und die angezeigten zyklischen Nukleotidkonzentrationen. Die Assays für die cGMP-Hydrolyse verwendeten 1,5 uM cGMP. Inhibitionsstudien verwendeten 5 uM cAMP in der Anwesenheit verschiedener Mengen cGMP bis zu 500 uM. [³H]cAMP und [³H]cGMP wurden von NEN (New England Nuclear) erworben. Die Reaktionen wurden für 10 min bei 30ºC inkubiert und mit 5X Stop- Lösung (250 mM EDTA, 25 mM AMP, 100 mMcAMP) abgebrochen.
Kontrollextrakte (10DAB mit pADNS) zeigten keine cAMP-Phosphodiesteraseaktivität. Die Resultate mit den Kontrollen blieben unverändert, wenn sie bei 0ºC oder in der Abwesenheit von Mg²&spplus; durchgeführt wurden, und waren mit Resultaten vergleichbar, die erhalten wurden, wenn kein Extrakt zugegeben wurde. Diese Resultate zeigen an, daß es keine nachweisbare Hintergrund-Phosphodiesteraseaktivität in dem nicht-transformierten Kontrollstamm 10DAB gibt.
Im Gegensatz dazu wurde eine beträchtliche cAMP-Phosphodiesteraseaktivität in dem 10AB- Hefestamm gesehen, der mit pRATDPD transformiert worden war. Die Rate der cAMP- Hydrolyse in den resultierenden Transformanten wurde als eine Funktion der cAMP- Konzentration gemessen. Die abgeleitete Km für cAMP ist 3,5uM, und die berechnete Vmax ist 1,1 nmol/min/mg.
Die Assaybedingungen wurden variiert, um die Kationen-Präferenzen des Enzyms festzustellen und die Fähigkeit von Calcium und Calmodulin zu bestimmen, seine Aktivität zu stimulieren. Bei diesen Assays kann Mn²&spplus; ebenso wie Mg²&spplus; verwendet werden, und jedes Kation war in einer 1 mM Endkonzentration ausreichend. Calcium/Calmodulin waren nicht in der Lage, die gemessene Phosphodiesteraseaktivität in dem Extrakt zu stimulieren. Ein paralleler Assay unter Verwendung von Rinderherz-Phosphodiesterase (Boehringer Mannheim) ergab eine 6,5-fache Stimulierung mit der Zugabe von Calcium/Calmodulin. Schließlich wurde keine cGMP-Phosphodiesteraseaktivität bei diesen Assays nachgewiesen. Rinderherz- Phosphodiesterase wurde wiederum als eine positive Kontrolle verwendet. Zusätzlich war cGMP, das in 100-fachen Mengen über den Substratkonzentrationen vorhanden war, nicht in der Lage, cAMP-Phosphodiesteraseaktivität zu inhibieren.
Die biochemische Charakterisierung des pRATDPD-cDNA-Produkts, exprimiert in Hefe, zeigt an, daß es eine cAMP-spezifische Phosphodiesterase mit hoher Affinität ist, ebenso wie dunce. Davis et al J. Cell. Biol., 90: 101 (1981); Walter et al., J. Neurosci., 4 (1984). Zusätzlich wird die Phosphodiesteraseaktivität nicht durch die Anwesenheit von Calcium/Calmodulin stimuliert. Diese Eigenschaft ist mit dunce gemeinsam und unterscheidet sich von einigen anderen Phosphodiesterasen. Beavo, In Advances in second messenger and phosphoprotein research Greengard et al., eds., Raven Press (1988). Die beiden Proteine, pRATDPD und dunce, scheinen somit ähnliche biochemische Eigenschaften zu haben. Es sollte jedoch bemerkt werden, daß pRATDPD für ein Proteinprodukt kodiert, das viel weniger signifikante Homologie (35%) mit dunce außerhalb der zuvor beschriebenen, hochkonservierten Kernregion zeigt. Diese nicht-konservierten Sequenzen könnten zu einer veränderten oder verfeinerten Funktion für dieses Säugetier-dunce-Homolog führen.
Die pRATDPD-Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID NO: 3 dargestellt, kodiert für ein Methionin-Codon an Position 46, und der ermittelte Leserahmen bleibt bis zu Position 563 offen, was zu einem Protein mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von 60kDa führt. Derselbe Leserahmen ist jedoch über das 5'-Ende des kodierenden Stranges offen. Gegenwärtig ist es nicht bekannt, ob das Methionin-Codon an Position 46 das Initiationscodon für das DPD- Protein ist. Die kodierende Sequenz wird durch drei nahe beabstandete Terminationscodons unterbrochen. Jedoch bleibt der ermittelte Leserahmen dann für zusätzliche 116 Codons offen, gefolgt von mehreren Terminationscodons, einem Polyadenylierungs-Consensussignal und einem Polyadenin-Abschnitt. Dieser 3'-offene Leserahmen könnte in eine andere dunceartige Phosphodiesterase durch alternatives Splicing eingebaut werden.

B. Klonierung von menschlichen Glioblastomzell-cDNAs durch Komplementierung

Eine cDNA-Bibliothek wurde in λZAP unter Verwendung von NotI-Linkern konstruiert. Bei diesem Beispiel wurde die aus der mRNA stammende cDNA aus der menschlichen Glioblastomzellinie U118MG aufgereinigt. Die Inserts aus dem λ-Vektor wurden in zwei Hefe- Expressionsvektoren pADNS und pADANS übertragen. Das Plasmid pADANS unterscheidet sich von pADNS darin, daß die transkribierte mRNA die Synthese eines Fusionsproteins, einschließlich eines N-terminalen Teils, stammend aus dem Alkoholdehydrogenaseprotein, und des Rests aus dem Säugetier-cDNA-Insert, steuern wird.
Die zwei so konstruierten Säugetier-cDNA-Expressionsbibliotheken wurden gescreent, wie in dem vorherigen Beispiel, auf cDNAs, die in der Lage sind, die Hitzeschock-Empfindlichkeit des S. cerevisiae Wirts TK161-R2V zu korrigieren. Mehrere cDNAs wurden isoliert und mittels Sequenzierung analysiert. Vier verschiedene cDNAs, die als Inserts in den Plasmiden pJC44x, pJC99, pJC265 und pJC310 enthalten waren, wurden dadurch entdeckt, und ihre DNA- und abgeleiteten Aminosäuresequenzen werden in SEQ ID NO: 11 und 12; 13 und 14; 15 und 16 bzw. 17 und 18 bereitgestellt.
Mittels Computeranalyse wurde gezeigt, daß das Insert von pJC44 mit dem Ratten- pRATDPD-Gen homolog ist, und eine biochemische Analyse von Zellysaten demonstrierte, daß es für eine cAMP-Phosphodiesterase kodiert. Die Inserts in pJC99, pJC265 und pJC310 zeigen keine signifikante Homologie mit zuvor isolierten Genen.

C. Klonierung von menschlichen Glioblastomzell-Phosphodiesterase-cDNAs durch Komplementierung

Die zuvor beschriebene menschliche Glioblastom-cDNA-Expressionsbibiliothek wurde auf cDNAs gescreent, die in der Lage sind, die Hitzeschock-Empfindlichkeit des Phosphodiesterase-defizienten Hefestamms 10DAB zu korrigieren. Mehrere cDNAs wurden so isoliert und mittels Nukleotid- und Restriktionsendonukleasen-Sequenzierungskartierung analysiert. Das cDNA-Insert in pTM22 kodiert für ein neues menschliches Gen. Seine Nukleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz werden in SEQ ID NO: 19 und 20 gezeigt.
Aus einer Computeranalyse der Nukleotidsequenz des pTM22-Insert kodiert mutmaßlich für ein Protein, das mit verschiedenen cAMP-Phosphodiesterasen, wie der bovinen Ca²&spplus;/Calmodulin-abhängigen cAMP-Phosphodiesterase und der Ratten-DPD- Phosphodiesterase, die in Beispiel 1A beschrieben ist, homolog ist. Eine biochemische Analyse hat bewiesen, daß die isolierte DNA für eine neue cAMP-Phosphodiesterase kodiert.
Es wurde gefunden, daß Sequenzen, die mit dem pTM22-Insert verwandt sind, auch im menschlichen Herz exprimiert werden, und Splicing-Varianten von TM22 wurden aus einer menschlichen Herz-cDNA-Bibliothek unter Verwendung von pTM22-Insert-Sequenzen als eine Nukleinsäure-Hybridisierungssonde isoliert.
Das Plasmid pTM22 war nicht in der Lage, die Hitzeschock-Empfindlichkeit von RAS2val19 Hefestämmen zu korrigieren, d. h. von TK161-R2V. Es scheint so, daß der pde1&supmin; pde2&supmin; Hefestamm 10DAB gegenüber einer Phänotyp-Umkehrung durch Säugetier-cAMP- Phosphodiesterase-Klone empfindlicher als der RAS2val19 Hefestamm ist.
Mehrere andere menschliche Glioblastom-cDNAs, isoliert als Inserts in den als pTM3 und pTM72 bezeichneten Plasmiden, wurden auf ähnliche Weise charakterisiert. Es wurde gefunden, daß diese beiden verschiedenen cAMP-Phosphodiesterase-cDNAs sehr eng verwandt mit, aber unterschiedlich zu dem pRATDPD-cDNA-Insert und dem pJC44x-cDNA-Insert sind. Ihre Nukleotidsequenzen und abgeleiteten Aminosäuresequenzen werden in SEQ ID NO: 21 und 22 (pTM3); bzw. 23 und 24 (pTM72) gezeigt.
Eine biochemische Analyse der Zellysate hat ergeben, daß die cDNAs von pTM3 und pTM72, pJC44x und pRATDPD für Rolipram-empfindliche cAMP-Phosphodiesterasen kodieren.

D. Kinetische Analyse von pPDE-cDNA-Expressionsprodukten.

Proben, die näherungsweise 10¹&sup0; transformierte S. cerevisiae 10DAB-Zellen enthalten, die die menschlichen cDNAs, die in pJC44x, pTM3, ein pTM22-artiges Plasmid (bezeichnet als L22 Met und ein aus pTM22 stammendes 1,7 kb Fragment-Insert einschließend und für die PDE- Aktivität kodierend) und pAD72 (einen TM72-artigen Klon) eingebaut waren, exprimierten, wurden in 2,5 ml PBS resuspendiert und durch Vortexen in der Anwesenheit von Glaskügelchen bei 4ºC aufgebrochen. Die Überstandsfraktion nach einer Zentrifugation für 5 min bei 12.000 xg war die Quelle für das Enzym in diesen Studien.
Die Phosphodiesteraseaktivität wurde bestimmt, wie beschrieben, mit geringen Modifizierungen in Davis et at., J. Cyc. Nuc. Res 5: 65-74 (1979). Die Inkubationsmischungen enthielten 40 mM Tris pH 8,0, 1 mM EGTA, 5 mM MgCl&sub2;, 0,1 mg/ml BSA, verdünnten Hefeextrakt, [3H]cAMP und verschiedene Mengen nicht-markierter zyklischer Nukleotide auf ein Endvolumen von 0,25 ml. Die Reaktionen wurden durch die Zugabe von 0,25 ml Stop-Puffer, enthaltend 0,5 M Carbonat pH 9,3, 0,5 M NaCl und 0,1% SDS, beendet. Die Nukleotidprodukte und nicht-umgesetzten Substrate wurden auf Boronat-Säulen (8 · 33 mm) getrennt. Die Produkte wurden aus den Boronat-Säulen mit Sorbitol in Szintillationsgefäße für eine Tritium- Analyse eluiert. Alle kinetischen Daten repräsentieren Messungen der Anfangsraten, bestimmt anhand von Inkubationen für vielfache Zeitintervalle mit geeigneten Enzymverdünnungen. Die Analyse der kinetischen Daten mittels der Lineweaver-Burk-Tranformation des Michaelis-Menten-Kinetik-Modells demonstriert einen doppelt reziproken, linearen Graph, der auf ein einfaches kinetisches Modell für jedes getestete Enzym hinweist. Die zyklischen Nukleotidkonzentrationen variierten von 3 · 10&supmin;&sup8; bis 1 · 10&supmin;&sup4; M [cAMP]. Die erhaltenen Resultate werden in Tabelle 1 unten gezeigt. TABELLE 1 Vorläufige kinetische Analyse der menschlichen zyklischen Nukleotid- Phosphodiesterasen, aus Hefe-Komplementierung stammend
1 als uM cAMP ausgedrückt
2 als nmol/min/10¹² Zellen ausgedrückt

E. Klonierung von menschlichen Glioblastomzell-RAS-verwandten cDNAs durch Komplementierung in Hefe

Bei diesem Beispiel wurden vier menschliche Glioblastomzell-cDNAs isoliert, die nicht für PDEs kodieren. Sie wurden mittels Komplementierung zweier genetisch veränderter S. cerevisiae und S. Pombe Hefestämmen erhalten.
Der Klon S46 wurde mittels Komplementierung in S. cerevisiae Stamm RS60.15B selektioniert. Dieser Stamm enthält eine mutante Allele von RAS2, RAS2val19ala15, die die Zellen unfähig macht, bei 36ºC zu wachsen [Powers et al., Mol. Cell Biol., 9: 390-395 (19ß9)], weil solche Zellen in der RAS-Funktion bei erhöhten Temperaturen defizient sind. Menschliche cDNAs aus einer menschlichen Glioblastomzell-Bibliothek wurden selektioniert, die diesen Defekt komplementieren konnten. Eine auf diese Weise gefundene cDNA wurde als S46 bezeichnet. Ihre Nukleotid- und abgleitete Aminosäuresequenzen werden in SEQ ID NO: 25 und 26 bereitgestellt. Die abgeleitete Aminosäuresequenz ist mit einem Xenopus laevis Gen homolog, das für eine bekannte Proteinkinase kodiert, die 56-Proteinkinase.
Das Plasmid pML5 wurde mittels Komplementierung in einem anderen S. cerevisiae Stamm, SKN37, selektioniert. Dieser besondere Stamm enthält ein zertrenntes Allel von CAP, cap::HIS3. CAP kodiert für ein Adenylylcylase-assoziiertes Protein von nicht-bestimmter Funktion [Field et al., Cell, 61: 319-327 (1990)]. Als eine Konsequenz dieser Gen- Zertrennung vermag SKN37 nicht, in einem an Aminosäuren reichen Medium zu wachsen [Gerst et al., Mol. Cell Biol., 11: 1248-1257 (1991)]. Menschliche cDNAs wurden selektioniert, die diesen Defekt komplementieren konnten. Ein auf diese Weise gefundenes cDNA- Insert ist in pML5 vorhanden. Seine Nukleotid- und abgeleiteten Aminosäuresequenzen werden in SEQ ID NO: 27 und 28 bereitgestellt. Seine Kodierungskapazität ist noch nicht sicher.
Die Plasmide pATG16 und pATG29 wurden mittels Komplementierung in dem diploiden S. pombe Stamm SP565 selektioniert. Dieser Stamm ist hinsichtlich Zertrennungen von ras1 homozygot (ras1::LEU2). Als eine Konsequenz vermag dieser Stamm es nicht, Sporen zu bilden [Fukui et al., Cell, 44: 329-336 (1986)], und menschliche cDNAs wurden selektioniert, die diesen Defekt komplementieren konnten. Die DNA-Sequenzinformation für die Inserts von pATG16 und pATG29 ist in SEQ ID NO: 29 und 30 bzw. 31 und 32 dargestellt. Diese Gene haben eine unbekannte Funktion. Der zum Screenen in S. pombe verwendete Vektor unterscheidet sich von dem zum Screenen in S. cerevisiae verwendete Vektor. Dieser Vektor, pAAUN-ATG, verwendet einen S. pombe-spezifischen Promoter, den adh-Promoter, und wurde wie folgt konstruiert. Der Klonierungsvektor pAAUN stammte aus dem Plasmid pART1 (McLeod et al., EMBO J., 6: 729-736 (1987) durch Ersetzen des S. cerevisiae LEU2- Gens durch ein 1,8 kbp HindIII ura4-Fragment aus S. pombe und Zufügen von NotI-Linkern an der SmaI-Stelle des Polylinkers (PL), der aus Viera et al., Methods in Enzymology, 153: 3- 11 (1987) stammt. pAAUN enthält den S. pombe adh-Promoter zur Genexpression und eine ARS-Region für die DNA-Replikation. Das Plasmid pAAUN-ATG stammte aus Plasmid pART8, erhalten von David Beach, am Cold Spring Harbor Laboratory, und aus pAAUN. Das Fragment von BamHI-EcoRV in pAAUN wurde durch das Fragment von BamHI und EcoRV in pART8 ersetzt, das ein ATG-Startcodon hatte, das von der NdeI-Stelle in dem Polylinker zur Verfügung gestellt wurde.

BEISPIEL 2

Klonierung und Identifizierung von Säugetiergenen mittels Hybridisierung mit durch Komplementierung klonierten Säugetiergenen

Dieses Beispiel betrifft die Klonierung und Identifizierung zusätzlicher Säugetiergene durch Hybridisierung an Sonden mit Sequenzen, die aus den in Beispiel 1 beschriebenen Genen stammen, d. h. den durch Komplementierung in Hefe klonierten Genen.
Es wurden Hybridisierungen mit niedriger und hoher Stringenz unter denselben Bedingungen für 12 bis 16 Stunden bei 65ºC in einer wässrigen Lösung, bestehend aus 6-mal der normalen Konzentration von Natriumcitrat (SSC), 5-mal der normalen Konzentration von Denhardts Lösung, 0,5% Natriumdodekylsulfat (SDS), 0,05 mg/ml denaturierter Lachsspermium-DNA und Sonde durchgeführt. Nach der Hybridisierung werden die Nitrocellulosefilter für fünf Minuten in 2 · SSC, 0,5% SDS bei Zimmertemperatur und für 20 Minuten in frischer 2 · SSC, 0,5%SDS bei 60ºC inkubiert.
Nur für Hochstringenz-Hybridisierungen wird eine dritte Waschung für 20 Minuten bei 60ºC in 0,1 · SSC, 0,1% SDS durchgeführt. Die normale Konzentration von SSC ist 0,15 M Natriumcitrat und 0,15 M Natriumchlorid, und die normale Konzentration von Denhardts Lösung ist 0,2 g/l Ficoll, 0,2 g/l Polyvinyl/Pyrrolidon und 0,2 g/l bovines Serumalbumin.
Die Plasmide pPDE7, pPDE10X inv und pPDE2RR wurden mittels Niedrigstringenz- Hybridisierungsscreens einer menschlichen Schläfenlappen-cDNA-Bibliothek unter Verwendung des pRATDPD-Insert als Sonde isoliert. Nukleotidsequenzvergleiche (SEQ ID NO: 33, 34 bzw. 35) zeigen an, daß die Insert denselben genetischen Lokus repräsentieren wie das Insert in pTM72 SEQ ID NO: 36 stellt die abgleitete Aminosäuresequenz des Insert von pPDE2RR dar.
Die Plasmide pGB14 und pGB 18ARR wurden auf dieselbe Weise erhalten. Eine DNA- Sequenzanalyse (SEQ ID NO: 37 bzw. 39) zeigte, daß sie denselben genetischen Lokus repräsentieren wie die Inserts in pTM3 und pJC44x. Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen der Inserts werden in SEQ ID NO: 38 bzw. 40 dargestellt.
Das Plasmid pGB25 wurde ebenso mittels Niedrigstringenz-Hybridisierung unter Verwendung des pRATDPD-Insert als eine Sonde erhalten. Nach seiner Nukleotid- und abgeleiteter Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO: 41 und 42 dargestellt, repräsentiert es ein neues Mitglied der PDE-Familie-IV.
Das cDNA-Insert von pGB25 wurde als eine Sonde verwendet, um pPDE18 und pPDE21 zu erhalten. Die cDNA von pPDE18 (SEQ ID NO: 43) repräsentiert denselben Lokus wie die von pGB25 (SEQ ID NO: 41) und enthält mehr Sequenzinformation als die pGB25-cDNA. Das pPDE21-Insert repräsentiert ein viertes Mitglied der PDE-Familie-IV. Seine DNA- und abgeleiteten Aminosäuresequenzen werden in SEQ ID NO: 45 und 46 dargestellt.
Keine biochemischen Daten für die Expressionsprodukte dieser Klone sind bisher erhalten worden. Ihre Zuordnung zu Klasse-IV wird allein auf der Basis von Sequenzbeziehungen gemacht.

BEISPIEL 3

Charakterisierung von klonierten Genen mittels Komplementierungsfähigkeit

Dieses Beispiel betrifft die weitere Charakterisierung der in Beispiel 1 klonierten Gene anhand ihrer Kapazität, andere Hefestämme als den ursprünglich zum Klonieren des Gens verwendeten Hefestamm zu komplementieren.
Zum Beispiel wurden 10DAB-Zellen (pde1&supmin; pde2&supmin;) mit dem DPD-Expressionsplasmid, pRATDPD, transformiert und auf Hitzeschock-Empfindlichkeit getestet. Die Expression des Ratten-DPD-Gens machte diesen Wirt in der Tat gegen Hitzeschock resistent. Auf ähnliche Weise war pJC44x in der Lage, die phänotypische Defekte dieses pde1&supmin; pde2&supmin;-Hefestamms zu korrigieren.
Im Gegensatz dazu waren pJC99, pJC265 und pJC310 nicht in der Lage, dies zu tun. Dies legt nahe, daß die cDNAs der letzteren Inserts nicht für cAMP-Phosphodiesterasen kodieren. Stattdessen kodieren diese Gene für Proteine von nicht-bestimmter Funktion, die in der Lage sind, phänotypische Defekte in Hefe mit aktivierten RAS-Proteinen zu korrigieren, was sich in ihrer Fähigkeit widerspiegelt, den Hefestamm TK161-R2V zu komplementieren.
Die unten beschriebenen Prozeduren wirken dahingehend, festzustellen, daß cDNAs nicht mittels Komplementierung kloniert werden müssen (oder durch Hybridisierung an durch Komplementierung klonierte DNAs), um in einem genetisch veränderten Wirt funktionell zu sein. Auf eine andere Weise gesagt, die folgenden Prozeduren demonstrieren, daß Methodologien zum Screenen von chemischen Mitteln gemäß der vorliegenden Erfindung nicht die anfängliche direkte oder indirekte Klonierung von passenden DNAs mittels Komplementierung beinhalten müssen.

A. Hefe-Phänotyp-Komplementierung durch Expression einer cDNA, die für CaM-PDE aus Rinderhirn kodiert

Das Plasmid pCAM-40 (in E. coli, A. T. C. C. Hinterlegungsnr. 68576) beinhaltet ein cDNA- Insert aus Rinderhirn, das für eine 61 kDa Ca²&spplus;/Calmodulin-stimulierte zyklische Nukleotid- Phosphodiesterase kodiert.
Ein 2,2 kb cDNA-Fragment, das zur Insertion in die Hefe-Expressionsplasmide pADNS und pADANS angepaßt war, wurde aus dem Plasmid pCAM-40 mittels Polymerase- Kettenreaktion gewonnen. In Kürze, die folgende PCR-Amplifizierung wurde verwendet, um das pCAM-40 DNA-Insert zu verändern, um es mit dem ADH1-Promoter in den Vektoren passend auszurichten.
Ein Oligonukleotid-Primer (Oligo A), das in der PCR-Reaktion verwendet wurde,
SEQ ID NO: 47
5'-TACGAAGCTTTGATGGGGTCTACTGCTAC-3'
annealt mit dem pCaM-40 cDNA-Klon an den Basenpaarpositionen 100-116 und schließt eine HinDIII-Stelle vor dem Anfangsmethionincodon ein. Ein zweiter Oligonukleotidprimer (Oligo B)
SEQ ID NO: 48
5'-TACGAAGCTTTGATGGTTGGCTTGGCATATC-3'
wurde so angelegt, daß er an den Positionen 520-538 annealt und ebenso eine HindIII-Stelle zwei Basen vor einem Methionincodon einschließt. Das dritte Oligonukleotid
SEQ ID NO: 49
5'-ATTACCCCTCATAAAG-3'
machte ein Annealing an eine Position in dem Plasmid, die sich 3' von dem Insert befand. Für eine Reaktion wurden Oligo A und Oligo C als Primer mit dem pCAM-40 als die Matrize verwendet. Das Nukleinsäureprodukt dieser Reaktion schloß den gesamten offenen Leserahmen ein. Eine zweite Reaktion verwendete Oligo B und Oligo C als Primer auf der Matrize pCAM-40 und ergab ein Nukleinsäureprodukt, dem der Teil der cDNA-Sequenz fehlte, der für die Calmodulin-Bindungsdomäne kodiert. Diese amplifizierten Produkte wurden verdaut mit Hindill und NotI und an die HinDIII/NotI-verdauten Hefe-Expressionsvektoren pADNS und pADANS ligiert. Die Plasmidklone, die die Inserts enthielten, wurden selektioniert und in S. cerevisiae Stamm 10DAB mittels Lithiumacetat-Transformation transformiert.
Die transformierte Hefe wurde in Abschnitten auf Agarplatten ausgestrichen, die synthetisches Medium enthielten, dem die Aminosäure Leucin fehlte (SC-Leucin-Agar), und für 3 Tage bei 30ºC wachsen gelassen. Es wurden Replicas dieser Agarplatte mit drei Typen Agarplatten gemacht: Eine Replica auf SC-Leucin-Agar, eine Replica auf YPD-Agar bei Zimmertemperatur und drei Replicas auf YPD-Agarplatten, die auf 56ºC erwärmt worden waren. Die drei erwärmten Platten wurden bei 56ºC für 10, 20 oder 30 Minuten gehalten. Diese Replicas ließ man dann auf Zimmertemperatur abkühlen, und dann wurden alle Platten auf 30ºC gebracht. Hefe, die mit den Plasmiden transformiert worden war, welche konstruiert waren, um die CaM-PDE zu exprimieren, waren gegenüber dem thermischen Puls resistent. Genauer, sowohl das Konstrukt, das angelegt war, den vollständigen offenen Leserahmen zu exprimieren, und das, welches angelegt war, das trunkierte Protein (einschließlich der katalytischen Region, aber nicht der Calmodulin-Bindungsdomäne) zu exprimieren, komplementierte, entweder in pADNS oder pADANS, den Hitzeschock-Empfindlichkeit-Phänotyp der 10DAB- Wirtszellen, d. h. machte sie gegenüber dem 56ºC-Temperaturpuls resistent.

B. Biochemischer Assay der Expressionsprodukte

Das CaM-PDE-Expressionsprodukt wurde ebenso durch Herstellen von zellfreien Extrakten aus der Hefe und durch Messen der biochemischen Phosphodiesteraseaktivität des Extrakts bewertet. Zu diesem Zweck wurden 200 ml-Kulturen transformierter Hefe in flüssigem SC- Leucin auf eine Dichte von ungefähr 6 Millionen Zellen pro ml wachsen gelassen. Die Zellen wurden mittels Zentrifugation gesammelt, und die Zellpellets wurden eingefroren. Die Extrakte wurden durch Auftauen der gefrorenen Zellen auf Eis, Mischen der Zellen mit 1 ml PBS und einem gleichen Volumen Glasperlen, Vortexen, um die Hefezellen aufzubrechen, und Zentrifugieren der aufgebrochenen Zellen bei näherungsweise 12.000 · g für 5 min, um unlösliche Bruchstücke zu entfernen, hergestellt. Der Überstand wurde auf Phosphodiesteraseaktivität getestet.
Die Extrakte der Hefezellen, bis zu 50 ul, wurden auf Phosphodiesteraseaktivität in 50 mM Tris (pH 8,0), 1,0 mM EGTA, 0,01 mg/ml BSA (bovines Serumalbumin), [³H]-zyklisches Nukleotid (4-10.000 cpm/pmol) und 5 mM MgCl&sub2; in einem Endvolumen von 250 ul bei 30ºC in 10 · 75 mm Glas-Teströhrchen getestet. Die Inkubationen wurden durch Zugabe von 250 ul 0,5 M Natriumcarbonat (pH 9,3), 1 M NaCl und 0,1% SDS beendet. Die Produkte der Phosphodiesterasereaktion wurden von dem zyklischen Nukleotid durch Chromatographie auf 8 · 33 mm Säulen mit BioRad Affi-Gel 601 Boronsäure-Gel getrennt. Die Säulen wurden mit 0,25 M Natriumhydrogencarbonat (pH 9,3) und 0,5 M NaCl äquilibriert. Die Reaktionen wurden auf die Säulen aufgebracht. Die Assayröhrchen wurden mit 0,25 M Natriumhydrogencarbonat (pH 9,3) und 0,5 M NaCl gespült und diese Spülung wurde auf die Säulen aufgebracht. Die Boronat-Säulen wurden zweimal mit 3,75 ml 0,25 M Natriumhydrogencarbonat (pH 9,3) und 0,5 M NaCl gewaschen, gefolgt von 0,5 ml 50 mM Natriumacetat (pH 4,5). Das Produkt wurde mit 2,5 ml 50 mM Natriumacetat (pH 4, 5) eluiert, das 0,1 M Sorbitol enthielt, und in Szintillationsgefäßen gesammelt. Das Eluat wurde mit 4,5 ml Ecolite Scintillation Cocktail gemischt und die Radioaktivität mittels Flüssig-Szintillationsspektrometrie gemessen.
Sowohl das Konstrukt, das angelegt war, den vollständigen offenen Leserahmen zu exprimieren, als auch das, welches angelegt war, ein trunkiertes Protein zu exprimieren, in entweder pADNS oder pADANS, exprimierten aktives Protein, bestimmt mittels biochemischem Phosphodiesterase-Assay von Zellextrakten unter Verwendung von cAMP-Substrat.

C. Hefe-Phänotyp-Komplementierung durch Expression einer cDNA, die für eine bovine adrenale cGS-PDE kodiert

Das Plasmid p3CGS-5 (A. T. C. C. 68579), das ein 4,2 kb DNA-Fragment enthält, das für die bovine cGMP-stimulierte, zyklische Nukleotid-Phosphodiesterase kodiert (cGS-PDE), wurde zum Klonieren in pADNS und pADANS durch Ersetzen der ersten 147 Basen der cDNA mit einer Restriktionsstelle, die zur Verwendung bei der Insertion in die Plasmide geeignet ist, angepaßt. Das Oligonukleotid BS1, das die Sequenz hat
SEQ ID NO: 50
5'-TACGAAGCTTTGATGCGCCGACAGCCTGC-3'
kodiert für eine HinDIII-Stelle und annealt an die Positionen 148-165 des cDNA-Insert. Ein als BS3 bezeichnetes Oligonukleotid
SEQ ID NO: 51
5'-GGTCTCCTGTTGCAGATATTG-3',
annealt an Positionen 835-855 gerade 3' von einer einzigartigen NsiI-Stelle. Das resultierende PCR-erzeugte Fragment nach Verdau mit HinDIII und NsiI wurde dann an den HinDIII- und NsiI-verdauten P3CGS-5 ligiert, und ersetzte dadurch das ursprüngliche 5'-Ende der bovinen cDNA. Ein Plasmid, das aus dieser Ligation stammte, wurde mit HinDIII und NotI verdaut, um das modifizierte cDNA-Insert freizusetzen. Das Insert wurde in pADNS und pADANS an ihren HinDIII- und NotI-Stellen kloniert. Diese Plasmide wurden dann in den Hefestamm 10DAB mittels des Lithiumacetat-Verfahrens transformiert, und die transformierten Zellen ließ man wachsen und unterzog sie erhöhten Temperaturen, wie in Abschnitt A, oben. Beide Transformationen führten zu einer Komplementierung des Hitzeschock-Empfindlichkeit- Phänotyps, der 10DAB-Wirtszellen.

D. Biochemischer Assay des Expressionsprodukts

Die Expression der cGS-PDE wurde ebenso durch Herstellen von zellfreien Extrakten aus der Hefe und Messen der biochemischen Phosphodiesteraseaktivität des Extrakts bewertet. Zu diesem Zweck wurden 50-ml-Kulturen transformierter Hefe in flüssigem SC-Leucin auf eine Dichte von ungefähr 10 Millionen Zellen pro ml wachsen gelassen. Sherman et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1986). Die Zellen wurden mittels Zentrifugation gesammelt, die Zellpellets wurden einmal mit Wasser gewaschen, und am Ende wurden die Zellpellets eingefroren. Um einen Extrakt herzustellen, wurden die gefrorenen Zellen auf Eis aufgetaut, mit 1 ml PBS und einem gleichen Volumen Glasperlen gemischt, gevortext, um die Hefezellen aufzubrechen, und zentrifugiert, um Bruchstücke zu entfernen. Der Überstand wurde dann auf Phosphodiesteraseaktivität wie in Abschnitt B, oben, getestet.
Die Konstrukte in entweder pADNS oder pADANS exprimierten aktives Protein, bestimmte mittels biochemischem Phosphodiesterase-Assay von Zellextrakten unter Verwendung von cGMP.

BEISPIEL 4

Weitere Charakterisierung klonierter Gene mittels Nukleotidsequenzanalyse

Dieses Beispiel beschreibt die Familien-Verwandtschaft der verschiedenen menschlichen PDE-Klone, die in den vorangehenden Beispielen beschrieben worden sind. Diese Klone schließen sowohl die durch Komplementierung erhaltenen als auch die durch Hybridisierung erhaltenen ein.

Komplementierung Hybridisierung

pJC44x pPDE7
pTM22 pPDE10X inv
pTM3 pPE2RR
pTM72 pGB14
pGB 18ARR
pGB25
pPDE21
pPDE18
Die Einzigartigkeit ihrer DNA-Sequenz zeigt an, daß die pPDE21-cDNA aus einem Locus stammt, der hierin als PDE-Klasse-IV1 bezeichnet wird. Plasmid pTM3, pJC44x, pGB 18ARR und pGB14-cDNA stammen alle aus demselben genetischen Locus, der hierin als PDE- Klasse-IV2 bezeichnet wird. Beweisanzeichen für diese Beziehung wird in Fig. 1 gezeigt, die eine faktische Sequenzidentität demonstriert.
Ebenso stammen pTM72, pPDE7, pPDE10Xinv und pPDE2RR-cDNAs alle aus einem genetischen Locus, der hiernach als PDE-Klasse-IV4 bezeichnet wird. Beweisanzeichen für diese Beziehung wird in Fig. 2 gezeigt, die eine faktische Sequenzidentität demonstriert.
Die cDNAs von pGB25 und pPDE18 stammen von einem noch anderen genetischen Locus, der hierin als PDE-Klasse-IV3 bezeichnet wird. Beweisanzeichen für dieses Verhältnis wird in Fig. 3 gezeigt, die eine faktische Sequenzidentität demonstriert.
Diese Beziehung kann veranschaulicht werden als: Zyklische Nukleotid-Phosphodiesterasen
Die aus einem beliebigen gegebenen Locus stammenden Sequenzen sind nicht genau identisch. Diese Sequenzabweichungen können aus einer Anzahl verschiedener Quellen stammen, einschließlich Sequenzierfehlern, echten Polymorphismen in menschlichen Populationen, Klonierungsartefakten und Unterschiede hinsichtlich der Splicing-Muster. Die Unterschiede hinsichtlich der Splicing-Muster sind vielleicht verantwortlich für die Hauptunterschiede bei den pTM3- und pJC44x-Inserts. Die pJC44x-Insert-cDNA kann ebenso einige Klonierungsartefakte enthalten. Es können Sequenzfehler, nicht nur für die oben beschriebenen Klone, sondern auch für die veröffentlichten PDE-Sequenzen stattgefunden haben. Natürlich vorkommende Sequenzvariationen oder Polymorphismen können ebenso für die beobachteten Resultate verantwortlich sein. Dies führt eine gewisse Unsicherheit in die abgeleitete Aminosäuresequenz des Produkts eines gegebenen Locus ein. Entsprechend muß erkannt werden, daß die beanspruchten Nukleotidsequenzen nicht nur die spezifischen beanspruchten Sequenzen umfassen, sondern auch DNA-Sequenzen, die im wesentlichen dieselben sind wie die, die hierin für die interessierenden klonierten cDNAs bereitgestellt werden.
Die PDE-Familie-IV-Klassen 1-4 umfassen eine Genfamilie, die mit dem Ratten-DPD verwandt ist. Die Beweisanzeichen hierfür beruhen auf der Ähnlichkeit der kodierten Aminosäuresequenz von Vertretern dieser Familie.
Es gibt scheinbar nur vier Mitglieder der PDE-Familie-1V. In der Beschreibung, die folgt, bezieht sich der Begriff "menschliche dunce-PDEs" auf alle Mitglieder der Familie-IV, d. h. die Gene, die eine Nukleotidsequenz-Homologie mit der Drosophila dunce-PDE zeigen.
Es kann sein, daß nur eine Untermenge der Mitglieder einer Genfamilie in einem beliebigen gegebenen Gewebe exprimiert werden. Versuche, eine Genfamilie durch Studium der aus einem oder nur wenigen Geweben klonierten cDNAs quantitativ zu bestimmen, können deshalb die Gesamtzahl der Mitglieder der Familie unterschätzen. Eine Analyse der genomischen DNA vermeidet jedoch dieses Problem. Menschliche genomische DNA wurde als ein Substrat bei parallel durchgeführten PCR-Reaktionen verwendet, von denen jede eines von einer Anzahl von verschiedenen Paaren an Oligonukleotiden enthielt, die verschiedenen Regionen der Familie-IV-PDEs entsprechen. Die ausgewählten Regionen waren die während der Evolution stark konservierten und/oder bei allen bekannten Mitgliedern dieser menschlichen Genfamile vorhandenen. Die Oligonukleotide umfaßten Mischungen, die die volle Degeneriertheit der Codons, welche die erwünschte Aminosäuresequenz spezifizieren, repräsentierten. Die große Mehrheit der getesteten Oligonukleotidpaare erzeugte mehrere verschiedene PCR- Produkte, die hinsichtlich ihrer Länge heterogen, aber immer gleich oder länger als diejenigen waren, die aus den entsprechenden cDNAs produziert wurden. Zwei Paare erzeugten jedoch nur Produkte, die hinsichtlich der Länge mit der cDNA identisch waren. Die längeren, heterogenen Populationen an Produkten resultierten aus dem Priming von Oligonukleotidpaaren, die sich auf zwei separaten Exons befanden. Die beiden Oligonukleotidpaare, die Produkte identischer Länge erzeugten, primten von dem selben Exon.
Um zu bestätigen, daß die heterogenen Fragmentpopulationen wirklich das Priming von separaten Exons repräsentierten, wurden menschliche Familie-N-PDE-genomische-DNA-Klone als Substrate in Kontroll-PCR-Reaktionen verwendet. Bei diesen Experimenten erzeugte jeder dieser Klone ein einzelnes PCR-Produkt, das hinsichtlich der Länge immer gleich mit einem der heterogenen Produkte war, die aus der genomischen DNA erhalten wurden.
Die Produkte von einer der Reaktionen unter Verwendung von Oligonukleotidpaaren, die von einem Exon primten, wurden kloniert und sequenziert. Die verwendeten Oligonukleotide waren
SEQ ID NO: 52
5'TTYAARTCTNYTNCARGRNGA, und
SEQ ID NO: 53
5'ACNATRTCTRATNACCATYTT
wobei: N irgendeines der vier Nukleotide ist; Y C oder T ist; und R G oder A ist. Dies entspricht den vollständig degenerierten Codons, die vier potentielle Aminosäuresequenzen spezifizieren
FKLLQ(E/G)EN
repräsentiert durch SEQ ID NO: 54 und 55, bzw.
DMVID(M/I)V
repräsentiert durch SEQ ID NO: 56 und 57,
die beiden konservierten Domänen, die in Fig. 4 mit einem Kasten versehen sind. Unter Verwendung dieser Primer wurden vier verschiedene PCR-Klone erhalten, von denen jeder in seiner Nukleotidsequenz einem der Mitglieder der bekannten menschlichen Familie-IV-PDEs entspricht. Die Anzahl der Klone, die in jede Kategorie fallen, waren wie folgt:

Typ Gesamt

TM72-Typ (Klasse-IV4): 16
JC44-Typ (Klasse-IV2): 29
PDE18-Typ (Klasse-IV3): 25
PDE21-Typ (Klasse-IV1): 9
Gesamt: 79
Unter der Annahme, daß die menschlichen Gene jedes als einzelne Kopien existieren (was mit dieser Analyse der erhältlichen genomischen Klone konsistent ist), sollten die vier PCR- Produkte idealerweise mit gleicher Häufigkeit erhalten werden. Die hier erhaltene, geringfügig schiefe Verteilung spiegelt wahrscheinlich unterschiedliche Effizienzen bei der Produktion dieser Produkte in einer PCR-Reaktion aufgrund von Fehlpaarungen mit den PCR- Oligonukleotiden wieder. Jedoch wurden alle vier zuvor bekannten Gene in dem endgültigen PCR-Produkt repräsentiert, und keine neuen Sequenzen wurden identifiziert. Deshalb besteht die menschliche PDE-Familie-IV am wahrscheinlichsten aus insgesamt vier Mitgliedern. Wenn dieses Verfahren ein neues Mitglied der Familie identifiziert hätte, hätte der PCR-Klon als eine Sonde verwendet werden können, um cDNA-Klone zu isolieren. Es ist jedoch möglich, daß diese Familie-IV-Familie andere Mitglieder hat, die an den Codons, die die Aminosäuresequenzen, die in Fig. 4 mit einem Kasten versehen sind, spezifizieren, divergieren.
Das cDNA-Insert pTM22 repräsentiert einen genetischen Locus, der nicht ein Mitglied der Familie-IV ist. Die Beweisanzeichen hierfür sind, daß, während die abgeleitete Aminosäuresequenz des pTM22-Insert die allgemeine Eigenschaften hat, die von einer cAMP- Phosphodiesterase erwartet werden, diese Sequenz nicht besonders eng mit den Sequenzen der Mitglieder der Familie-IV oder der Familie-I, den Ca²&spplus;/Calmodulin-empfindlichen PDEs oder der anderen bekannten PDE-Familien verwandt ist.

BEISPIEL 5

Screening und Identifizierung von Mitteln, die die enzymatische Aktivität verändern

In ihrer allgemeinsten Form erlauben die pharmakologischen Screening-Verfahren der Erfindung das Screening auf Mittel, die die Aktivität eines beliebigen Säugetierproteins reduzieren oder stimulieren, dessen Anwesenheit oder Expression in einer veränderten mikrobiellen Wirtszelle, bei der eine genetische Veränderung mit einer identifizierbaren Phänotyp- Veränderung assoziiert ist, zur Korrektur der Phänotyp-Veränderung führt. Zwei allgemeine Typen an Screens sind möglich. Beide Verfahren sind auf entweder lebende Zellen oder Zellzubereitungen oder Zellextrakte anwendbar.

A. Identifizierung von Mitteln, die Proteine von bekannter Aktivität beeinflussen

Der erste Typ pharmakologischer Screen ist anwendbar, wenn das Säugetiergen für ein Protein von bekannter und mit einem Assay nachweisbarer biochemischer Funktion kodiert. Das Säugetiergen wird zuerst in einem mikrobiellen Wirt exprimiert durch Verwenden eines geeigneten Wirtexpressionsvektors des bereits beschriebenen Typs. Entweder können ganze Zellen oder Extrakte von Wirtszellen verwendet werden. Die Extrakte werden unter Verwendung bekannter Techniken hergestellt, d. h., die Zellen werden aufgebrochen und ihre zellulären Bestandteile freigesetzt. Ein roher Zellextrakt von aufgereinigtem Säugetierprotein wird auf die bekannte biochemische Funktion in der Anwesenheit von Mitteln getestet, deren Effekte auf das Protein beurteilt werden sollen. Auf diese Weise können Mittel, die die Aktivität des Säugetierproteins inhibieren oder stimulieren, identifiziert werden.
Diese Art von Prozedur kann durchgeführt werden, um die Effekte von ausgewählten Mitteln auf Säugetier-cAMP-Phosphodiesterasen zu analysieren. Zum Beispiel kann ein Hefestamm, dem beide endogene PDE1- und PDE2-Gene fehlen, als die Wirtszelle verwendet werden, in die die cDNA, die für Säugetier-cAMP-Phosphodiesterase kodiert, in einem geeigneten Expressionsvektor eingeführt und exprimiert wird. Eine solche Wirtszelle ist besonders nützlich, weil es keine endogene (Hintergrund) cAMP-Phosphodiesteraseaktivität gibt. [Colicelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 3599 (1989)]. Daher kann die Aktivität des Säugetierenzyms sogar in rohen Zellextrakten sauber getestet werden. Diese Prozedur wird unten erläutert, bei der gezeigt wird, daß die enzymatische Aktivität des Ratten DPD-Genprodukts auf leichte Weise durch die pharmakologischen Mittel Rolipram und R020 1724, aber nicht so leicht durch das pharmakologische Mittel Theophyllin inhibiert wird.
Die in den vorangehenden Beispielen beschriebenen Gene und Zellen können verwendet werden, um chemische Verbindungen zu identifizieren, die die Aktivität eines bekannten Enzyms, der Ratten-DPD-Phosphodiesterase zu inhibieren. Um die Effizienz von bekannten inhibitorischen Verbindungen zu testen, wurden zellfreie Extrakte gemacht. Hefezellen, die hinsichtlich der endogenen Phosphodiesterase defizient waren (10DAB) und die die Ratten- DPD- oder Hefe-PDE2-Gene aus dem beschriebenen Expressionsvektor exprimierten, wurden verwendet. Ein Liter Kulturen wurden geerntet, in Puffer C gewaschen (20 mM MES (pH 6,2)/0,1 mM MgCl&sub2;/1,1 mM EGTA/1 mM 2-Mercaptoethanol), in Puffer C resuspendiert, der 1,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid enthielt, und in einer French Press bei 4ºC aufgebrochen. Die Zellextrakte wurden bei 100 g für 10 Minuten und bei 18.111 g für 90 Minuten geklärt. Die PDE-Aktivitäten wurden getestet, wie veröffentlicht (Charbonneau et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 83: 9308-9312 (1986); Tempel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 80: 1482-1486 (1983)), in einer Reationsmischung, die 50ug Zellprotein/ml, 100 mM Tris (pH 7,5), 10mM Mg&spplus;&spplus;, 5uM cAMP, 5'-Nukleotidase und [³H]-cAMP enthielt. Das AMP wurde von dem cAMP unter Verwendung eines AG1-X8-Harzes von Bio Rad getrennt. Ungefähr 10&sup4; cpm wurden für 10 min-Reaktionen erhalten, und die Hintergründe (Phosphodiesterasedefiziente Hefe oder kein Extrakt) waren ungefähr 300 cpm. Die cytosolische Fraktion wurde in der Anwesenheit oder Abwesenheit von inhibitorischen Verbindungen getestet. Diese Assays messen die Menge an Adenosin-5'-Monophosphat (AMP), die durch eine Phosphodiesterase-katalysierte Hydrolyse von Adenosin-3', 5'-zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP) erzeugt wird. Für jeden Extrakt wird die prozentuale Inhibition für verschiedene Konzentrationen von bekannten Inhibitoren in Tabelle 2 angegeben. Die prozentuale Inhibition repräsentiert die Abnahme an Phosphodiesteraseaktivität relativ zu Messungen, die in der Abwesenheit von Inhibitoren gemacht wurden. Rolipram und die verwandte Verbindung R020 1724 waren die effektivsten Inhibitoren der DPD-Aktivität. TABELLE 2 Inhibition von Phosphodiesterasen durch Chemikalien
Diese Analyse kann natürlich dahingehend ausgeweitet werden, um neue oder verwandte chemische Verbindungen auf ihre Fähigkeit zu testen, die PDE-Aktivität zu inhibieren oder die Aktivität einer anderen in diesem System exprimierten Phosphodiesterase. Natürlich kann diese Form der Analyse auch auf andere klonierte und in ähnlicher Weise exprimierte Gene ausgedehnt werden, für die es eine mit einem Assay nachweisbare enzymatische Aktivität gibt.
Die Phosphodiesteraseaktivität wurde bestimmt, wie in der vorherigen Tabelle beschrieben, unter Verwendung von 0,04 und 1,0 uM cAMP für pL22 Met bzw. pJC44x. Diese cAMP- Konzentrationen wurden spezifisch ausgewählt, daß sie unterhalb der Km für ihre entsprechenden Enzyme waren. Damit nähert sich die EC&sub5;&sub0; stark der Inhibitorkonstante oder Ki jedes Enzyms an. Alle kinetischen Daten repräsentieren anfängliche Geschwindigkeiten der Enzymkatalyse. TABELLE 3 Inhibitor-Empfindlichkeiten von menschlichen zyklischen-AMP-Phosphodiesterasen, aus einer Hefe-Komplementierung stammend
1 EC&sub5;&sub0; = Inhibitorkonzentration bei 50% Enzymgeschwindigkeit, Konzentration ausgedrückt in uM
Die folgende Prozedur wurde auf das Screening von ganzen transformierten Wirtszellen angewandt. Der Hefestamm 10DAB wurde mit dem Expressionsvektor pAD72 transformiert, der eine menschliche Familie-IV-Phosphodiesterase, d. h. eine cAMP-spezifische PDE exprimiert. Dieser transformierte Stamm wurde in SC-Leucin-Medium für drei Tage bei 30ºC wachsen gelassen. Diese Kulturen erreichten eine Zelldichte von ungefähr 50 Millionen Zellen pro ml. Die Aliquots dieser Kultur (300 ul) wurden genommen und mit 4,8 ul 10% DMSO oder 10% DMSO, das eine geeignete Konzentration an Phosphodiesteraseinhibitor enthielt, gemischt. Die behandelten Kulturen wurden dann für zwei Stunden bei 30ºC inkubiert, wonach zwei 3 ul-Aliquots entfernt und auf eine SC-Leucin-Agarplatte übertragen wurden. Dann wurde ein 100 ul-Aliquot aus den behandelten Kulturen entfernt und in ein 12 · 75 mm Glasteströhrchen übertragen, und die Teströhrchen wurden bei 50ºC in einem Mineralölenthaltenden Wärmeblock für 30 Minuten inkubiert. Die Teströhrchen wurden aus dem Wärmeblock entfernt und auf Zimmertemperatur gebracht. Zwei 3 ul-Aliquots wurden entfernt und auf eine SC-Leucin-Platte übertragen. Die Agarplatten wurden dann bei 30ºC inkubiert und zu verschiedenen Zeiten untersucht, um das Wachstum zu bewerten.
Hefe, die mit 10% DMSO alleine behandelt worden war, zeigte eine geringfügige Abnahme hinsichtlich der Anzahl an lebensfähigen Zellen nach der 50ºC Hitzebehandlung. Die Behandlung von Zellen mit Rolipram reduzierte die Anzahl an lebensfähigen Zellen, so daß bei 100 uM Rolipram weniger als 10 von näherungsweise 150.000 Zellen lebensfähig blieben. Milrinon hatte bis zu 100 uM keinen beobachtbaren Effekt auf die Kultur.

B. Identifizierung von Mitteln, die Proteine von nicht-spezifizierter Funktion beeinflussen

Dieses Beispiel verdeutlicht die Verwendung der oben beschriebenen Gene und Verfahren zur Verwendung beim Identifizieren von chemischen Verbindungen, die die Funktion der in Hefe exprimierten kodierten Säugetierproteine beeinflussen, sogar, wenn die Funktion dieses Proteins noch nicht bestimmt worden ist.
10DAB-Zellen, die Phosphodiesterase defizient sind, sind gegenüber Hitzeschock empfindlich. Wie bereits diskutiert, wenn diese Zellen die Fähigkeit erlangen, die cDNA von pRATDPD zu exprimieren, werden sie resistent gegenüber Hitzeschock. 10DAB-Zellen, die die cDNA von pRATDPD exprimieren, wurden in Vollmedium (YPD) für drei Tage in stationärer Phase gehalten. Diese Kulturen wurden dann mit Rolipram, einem bekannten Phosphodiesterase-Inibitor, für 40 Minuten in einer Endkonzentration von 100uM behandelt. Die Kontrollkulturen wurden mit keinem Inhibitor behandelt. Diese Kulturen wurden dann in Glasröhrchen bei 50ºC für 30 Minuten hitzegeschockt. Ein Mikroliter jeder Kultur wurde ausplattiert. Die mit Rolipram behandelten Kulturen waren viel empfindlicher gegenüber Hitzeschock, was eine Inhibition der enzymatischen Funktion widerspiegelt.
Der zweite Typ pharmakologischer Screen ist sogar anwendbar, wenn das Säugetiergen für ein Protein von nicht-bestimmter Funktion kodiert und daher nicht durch eine biochemische Aktivität getestet werden kann. Bei diesem Verfahren werden die zu testenden Mittel angewandt oder direkt in den genetisch veränderten, mikrobiellen Wirt, der das Säugetierprotein exprimiert, eingeführt. Mittel, die in der Lage sind, das Säugetiergen oder Genprodukt zu inhibieren, werden anhand ihrer Fähigkeit identifiziert, den Phänotyp, der ursprünglich durch die Expression des Säugetierproteins in dem veränderten Wirt korrigiert worden war, umzukehren.
Diese Prozedur ist für Säugetier-cDNAs verwendet worden, die für zyklische Nukleotid- Phospodiesterasen kodieren, und eine Hefe, die RAS2val19 enthielt, als den Wirtsstamm. Wenn das Ratten-DPD-Gen in den Hitzeschock-empfindlichen Wirt eingeführt und exprimiert wird, wird der Wirtsstamm Hitzeschock-resistent. Wenn die jetzt resistenten Zellen in Rolipram inkubiert werden, werden sie wieder Hitzeschock-empfindlich, was anzeigt, daß Rolipram die Aktivität des Ratten-DPD-Genprodukts inhibiert. Dieser pharmakologische Screen erfordert nicht, daß die Funktion des DPD-Genprodukts bekannt ist. Dieser selbe Ansatz kann angewandt werden, um andere Gene zu beurteilen.
Zusätzlich sollte jeder andere Phänotyp, der von der DPD-Phosphodiesteraseaktivität abhängig ist, durch die Anwesenheit der inhibitorischen Arznei beeinflußt werden. Die Wirkung einer Arznei oder eines Mittels kann wie beschrieben beurteilt werden. Schließlich können im allgemeinsten Fall inhibitorische Chemikalien für Proteine mit einer unbekannten Funktion, die aus Säugetier-cDNAs in Hefe exprimiert werden, auf eine ähnliche Weise entdeckt werden. Dieser Ansatz hängt nur von dem aus der Expression des Proteins folgenden Phänotyp und nicht von der Kenntnis seiner Funktion ab.
Zum Beispiel umfassen Tyrosinkinasen eine sehr große und mannigfaltige Superfamilie von Proteinen. Sie sind bei der Regulierung des Zellwachstums wichtig. Bestimmte Tyrosinkinasen werden ubiquitär in Zellen exprimiert. Andere Tyrosinkinasen weisen eine gewebespezifische Verteilung auf. Es könnte somit erwartet werden, daß wirklich spezifische Inhibitoren von solchen Tyrosinkinasen spezifische und wünschenswerte therapeutische Wirkungen ohne unerwünschte Nebenwirkungen haben. Zum Beispiel könnte erwartet werden, daß spezifische Inhibitoren der PDGF-Rezeptor-Tyrosinkinase das Wachstum von arteriosklerotischen Plaques verlangsamen oder die Narbenbildung verzögern; es könnte erwartet werden, daß spezifische Inhibitoren der lck-Tyrosinkinase, die Signale von den CD4- und CD8-T- Zell-Rezeptoren vermittelt, anti-entzündlich sind, ohne zytotoxisch zu sein.
Es ist wahrscheinlich, daß Hefe dazu verwendet werden kann, pharmakologische Mittel auf die Inhibition von spezifischen Tyrosinkinasen zu screenen. Brugge et al., Mol. Cell. Biol., 7: 2180-2187 (1987) zeigten, daß die Expression des Vogelgens v-src in der Hefe S. cerevisiae Wachstum inhibiert. Dieses virale Gen kodiert für eine Tyrosin-spezifische Proteinkinase, die den zellulären src-Genen stark ähnelt, die ubiquitär in Säugetier- und Vogelzellen exprimiert werden. Wenn dies eine allgemeine Eigenschaft von aktiven, in Hefe exprimierten Säugetier- Tyrosinkinasen ist, dann würde erwartet werden, daß das folgende Design für einen pharmakologischen Screen wirksam ist.
Ein spezifisches Säugetier-Tyrosinkinase-cDNA-Gen kann so in einen Hefe-Shuttle-Vektor eingefügt werden, daß es unter der Kontrolle eines induzierbaren Hefe-Promoters, wie des GAL10-Promoters ist, der in der Anwesenheit von Galaktose und in der Abwesenheit von Glukose induzierbar ist. Es kann erwartet werden, daß die Einführung dieses Vektors in eine Hefezelle diese Zelle unfähig macht, in einem Induktionsmedium (enthaltend Galaktose in der Abwesenheit von Glukose) zu wachsen, da unter solchen Bedingungen die Säugetier- Tyrosinkinase zum Nachteil der Zelle exprimiert würde. In der Anwesenheit eines Inhibitors der Tyrosinkinase würden solche Zellen in Induktionsmedium gedeihen. Dies stellt einen einfachen Screen für pharmakologische Mittel bereit, die Säugetier-Tyrosinkinasen inhibieren. Falsch-Positive würden Mittel einschließen, die die Induktion der Kinase-Expression blockierten. Solche Falsch-Positiven könnten anhand des Unvermögens der Säugetier-Kinase, induziert zu werden, unterschieden werden, was durch quantitative Bestimmung mit spezifischen Antikörpern bestimmt werden kann.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:

(i) ANMELDER: Wigler, Michael H. Colicelli, John J.
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Klonierung durch Komplementierung und verwandte Prozesse
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 57
(iv) KORRESPONDENZANSCHRIFT:
(A) EMPFÄNGER: Marshall, O'Toole, Gerstein, Murray & Bicknell
(B) STRASSE: Two First National Plaza, 20 South Clark Street
(C) ORT: Chicago
(D) STAAT: Illinois
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL: 60603
(v) COMPUTERLESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM-PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release # 1.0, Version # 1.25
(vi) DATEN DER JETZIGEN ANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER:
(B) ANMELDETAG:
(C) KLASSIFIKATION:
(vii) DATEN DER VORANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER: US 07/511,715
(B) ANMELDETAG: 20. April 1990
(viii) INFORMATION ZUM ANWALT:
(A) NAME: Borun, Michael F.
(B) REGISTRIERNUMMER: 25447
(C) REFERENZ/AKTENZEICHEN: 27805/30197
(ix) INFORMATION ZUR TELEKOMMUNIKATION:
(A) TELEFON: (312) 346-5750
(B) TELEFAX: (312) 984-9740
(C) TELEX: 25-3856
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 10 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:

AAGCGGCCGC
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 10 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:

GCGGCCGCTT

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN
(A) LÄNGE: 2158 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CD5
(B) LAGE: 1..1688 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 562 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 18 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:

CACCCTGCTG ACAAACCT

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:

ATGGAGACGC TGGAGGAA
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 18 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(iv) ANTISENSE: ja

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:

ATACGCCACA TCAGAATG 8

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:

TACCAGAGTA TGATTCCC 18

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 9:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 18 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(iv) ANTISENSE: JA

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:

GTGTCGATCA GAGACTTG

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 10:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:

GCACACAGGT TGGCAGAC 18

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 11:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 2702 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LÄGE: 2..2701 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 12:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN
(A) LÄNGE: 900 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 13:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 1721 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 60..1274 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 14:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 405 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS; Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 15:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 1829 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 30..1421 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 15:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 16:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 464 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 16:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 17:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 1299 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 17:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 18:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 433 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 18:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 19:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 3987 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 3.. 1493 (xi) SEQUENZBESCKREIBUNG: SEQ ID NO: 19:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 20:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 498 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 20:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 21:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 3131 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc-feature
(B) LAGE: 1652
(D) SONSTIGE ANGABEN: Beachten = "Eine Verschiebung im Leserahmen kann an diesem Rest stattfinden."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: (Verbinden) (743..1648, 1651..2661) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 21:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 22:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 638 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 22:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 23:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 3186 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 139..2348 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 23:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 24:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 736 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 24:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 25:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN
(A) LÄNGE: 1276 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 2..504 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 25:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 26:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 167 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 26:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 27:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 2384 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: join (Verbindung) (1..1539, 1859..2383) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 27:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 28:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 688 Aminosäuren
(S) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 28:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 29:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 1675 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 492.1330 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 29:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 30:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 279 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 30:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 31:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 3073 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 3..1111 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 31:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 32:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 369 Aminosäuren
(β) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(i1) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 32:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 33:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 1811 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: linzelstrane
(D) TOPOLOGIE: linear
(i1) ART DES MOLEKÜLS: cDNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 33:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 34:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 1672 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 34:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 35:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 1649 Basenpaare
(B) ART: Nuklelinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 210..1018 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 35:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 36:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN
(A) LÄNGS: 269 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(i1) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 36:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 37:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 609 Basenpaare
(II) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 2..606 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 37:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 38:

(i) SEQUENZZEICHEN:
(A) LÄNGE: 201 Aminosauren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(i1) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 38:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 39:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 1230 Basenpaare
(13) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAMESCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 3.1156 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 39:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 40:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 384 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 40:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 41:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 798 Basenpaare
(3) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(13) LAGE: 3..798 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 41:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 42:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 265 Aminosäuren
(13) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 42:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 43:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 1902 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHÜSSEL; CDS
(B) LAGE: 97..1256 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 43:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 44.

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 386 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 44:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 45.

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 1155 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 95..762 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 45:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 46:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE; 222 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 46:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 47:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 29 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelsrang
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 47:

TACGAAGCTT TGATGGGGTC TACTGCTAC

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 48:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 31 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 48:
TACGAAGCTT TGATGGTTGG CTTGGCATAT C

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 49:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE; 16 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(iv) ANTISENSE: JA

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 49:

ATTAAGCCCTC ATAAAG 16

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 50:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 29 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE; linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 50:

TACGAAGCTT TGATGCGCCG ACAGCGTGC 29

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 51:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 21 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 51:

GGTCTCCTGT TGCAGATATT G 21

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 52:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 21 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM; Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 52:

TTYAARTCTN YTNCARGRNG A 21

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 53:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 53:

ACNATRTCTR ATNACCATYT T

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 54:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 8 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 54:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 55:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 8 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MULEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 35:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 56:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 56.

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 57:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES Moleküls: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 57.

Claims

1. Gereinigte isolierte DNA-Sequenz, die im wesentlichen aus einer DNA-Sequenz besteht, die für ein Säuger RAS-verwandtes Protein-Polypeptid kodiert und aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den Säuger cDNA Inserts besteht, die in den Plasmiden pJC99 (A. T. C. C. 68599), pJC265 (A. T. C. C. 68598), pJC310 (A. T. C. C. 68597), pML5 (A. T. C. C. 68593), pATG16 (A. T. C. C. 68592) und pATG29 (A. T. C. C. 68591) vorhanden sind.

2. Gereinigte isolierte DNA-Sequenz, die im wesentlichen aus einer DNA-Sequenz besteht, die für ein RAS-verwandtes Protein-Polypeptid kodiert, wobei die DNA-Sequenz unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an eine DNA-Sequenz nach Anspruch 1 hybridisiert.

3. Gereinigte und isolierte DNA-Sequenz, die im wesentlichen aus einer DNA-Sequenz besteht, die für ein Polypeptid kodiert, welches durch eine DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2 mittels degenerierter Kodons kodiert wird.

4. Polypeptidprodukt der Expression einer DNA-Sequenz nach Anspruch 1, 2 oder 3 in einer prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszelle.