DE69633065T2

DE69633065T2 - Herstellung einer multikombinatonischen bank von antikörpergenen exprimierendenvektoren

Info

Publication number: DE69633065T2
Application number: DE69633065T
Authority: DE
Inventors: Regis Sodoyer; Luc Aujame; Frederique Geoffroy; Annabelle Bouchardon
Original assignee: Aventis Pasteur SA
Current assignee: Sanofi Pasteur SA
Priority date: 1995-12-04
Filing date: 1996-12-04
Publication date: 2005-08-18
Anticipated expiration: 2016-12-05
Also published as: DE69633065D1; EP0865487B1; FR2741892B1; EP0865487A1; CA2239490A1; FR2741892A1; US6174708B1; ES2225904T3; CA2239490C; ATE272709T1; WO1997020923A1

Description

Antikörpermoleküle bestehen aus der Verknüpfung von zwei großen Ketten (H) und zwei kleinen Ketten (L) über Disulfidbrücken. Dabei sind die zwei großen Ketten miteinander gemäß einer Y-förmigen Struktur und zwei kleine Ketten jeweils mit den zwei Armen dieser Struktur derart verknüpft, dass die variablen Regionen der kleinen (V_L) und großen Ketten (V_H) sich in der Nähe voneinander befinden. Die Bindung an ein Antigen resultiert aus den Eigenschaften der veränderlichen Teile der kleinen und großen Ketten. Ein komplexes Umordnungs- und Auswahlsystem erlaubt es dann, eine große Menge an gegen das Antigen spezifischen Antikörpern schnell zu induzieren.
Das herkömmliche Hybridom-Verfahren erlaubt die Auswahl von Klonen von Hybridzellen, die Gene exprimieren, die für die kleinen und die großen Kette eines Antikörpermoleküls codieren. Dieses Verfahren erfordert die Fusion von Zellen mit Lymphocytenursprung, die die Gene enthalten, die für die Bildung von Antikörpern und von Zellen, die unsterbliche Zelllinien bilden, verantwortlich sind. Die die betreffenden Gene tragenden Zellen werden im allgemeinen durch eine zufällige Erzeugung von Banken aus zirkulären Zellen, gegebenenfalls mit vorhergehender Immunisierung durch das spezifische Antigen, erhalten, wobei das Screening der Hybridome durch eine Antigen-Antikörper-Reaktion nach Vervielfältigungen und Kultivierungen der Hybridomklone erfolgt. Dieses Verfahren ist aufwendig, seine Produktivität ist begrenzt, und das Screening ist nicht leicht.
Vor kurzem ist ein weiteres Verfahren angewendet worden, in welchem rekombinante Bakteriophagen eingesetzt werden. Die Prinzipien und verschiedenen Ausführungsformen dieses Verfahrens wurden beispielsweise von D. R. Burton, Tiptech, Mai 1991, Bd. 9, 169–175; D. J. Chiswell et al., Tiptech, März 1992, Bd. 10, 80–84 und H. R. Hoogenboom et al., Rev. Fr. Transfus. Hémobiol., 36, 19–47 (1993) beschrieben (siehe auch die Patentanmeldungen PCT WO 92/01047 und 92/20791).
Dieses Verfahren besteht darin, in einen Vektor eine Bibliothek aus Genen von veränderlichen Regionen von Antikörpern zusammen mit einem Bakteriophagengen unter Bedingungen zu insertieren, welche die Expression des Gens in Form eines Fusionsproteins ermöglichen, das an der Oberfläche des Phagen vorliegt, die veränderlichen Regionen der variablen kleinen und großen Kette, die über Disulfidbrücken miteinander verbunden sind, wie ein Fab-Antikörperfragment zu exprimieren und die Phagen durch ein schnelles Auftrennungsverfahren, in welchem das immobilisierte spezifische Antigen verwendet wird, beispielsweise durch Immunoaffinitätschromatographie, direkt auszuwählen. Die nach Elution ausgewählten Phagen können ein Bakterium infizieren und für eine direkte Produktion oder die Wiederholung der Selektionszyklen verwendet werden. Dieses Verfahren ist besonders leistungsfähig, da es theoretisch die Erzeugung sehr großer Banken und ein extrem feines, effizientes und schnelles Screening der Bank erlaubt. Ein Phage, der sich besonders gut für dieses Verfahren eignet, ist der fadenförmige Phage fd, in welchem das Fragment, das für eine der großen und der kleinen Antikörperkette codiert, mit dem Gen für das kleinere Oberflächenprotein fusioniert und das Fragment, das für die andere Kette codiert, derart insertiert werden kann, dass, nach Infektion von Bakterien durch den Phagen, eine Phagenpopulation erhalten wird, die auf ihre Oberfläche ein Fusionsprotein trägt, das große und kleine Ketten in einer Gestaltung besitzt, die in der Lage ist, das Antigen zu erkennen, und deshalb für ein Screening geeignet ist.
Abgesehen von seiner Einfachheit, hat dieses Verfahren große Vorteile. In Verbindung mit der vorhergehenden Amplifikation der Bank aus Antikörpergenen kann die Selektion eines Phagen, der ein spezifisches Antikörperfragment besitzt, aus einer sehr großen Phagenpopulation von etwa 10⁷ durchgeführt werden, was es erlauben kann, die humanen Antikörpergene zu suchen, ohne gezwungen zu sein, eine vorhergehende Immunisierung des Spenders durchzuführen.
Durch Spaltung mit anschließender Religierung oder ausgehend von zwei separaten Banken aus Genen für kleine und große Ketten können Phagen erhalten werden, in welchen eine kleine und eine große Kette zufällig miteinander verknüpft sind.
Die Anzahl an unterschiedlichen Klonen, die man erhalten kann, ist jedoch durch die Ausbeute der Selektion und durch den Wirkungsgrad der bakteriellen Transformation begrenzt.
Ein Mittel zur Vergrößerung der Anzahl erfolgreicher Verknüpfungen, in welchen die kleinen Ketten einer ersten Bank mit den großen Ketten einer zweiten Bank verbunden werden, ist von P. Waterhouse et al., Nucleic acids Research, 21, Nr. 9, 2265–2266 (1993) beschrieben. Es erlaubt, bis zu 10¹² Klone zu erhalten, indem ein spezifisches Rekombinationssystem für die loxP-Loci verwendet wird, das gegenüber der Wirkung einer Cre-Recombinase empfindlich ist. Diese Verknüpfung bleibt jedoch reversibel. Weiterhin existiert keine Kontrolle über die Wirkung der Recombinase, und die rekombinierten Vektoren haben keinen selektiven Vorteil gegenüber den anderen Vektoren.
Jedoch ist es unter Berücksichtung der Ausbeute der Selektionsstufe der rekombinierten Phagen, die in der Praxis nur eine Fraktion an interessanten Phagen enthalten, wünschenswert, eine höchstmögliche Ausbeute an rekombinierten Vektoren mit dem geringstmöglichen Anteil an nicht rekombinierten Vektoren zu erhalten.
Im Rahmen einer früheren Patentanmeldung (WO 95/21914, eingereicht am 2. Februar 1995 unter der französischen Priorität FR 9 401 519 vom 10. Februar 1994) wurde von den Erfindern ein Verfahren zur Herstellung multikombinatorischer Banken, insbesondere in Form von Phagen oder Phagemiden, ausgehend von zwei Genbibliotheken, die eine von kleinen Ketten und die andere von großen Ketten, die es erlauben, eine hohe Klon-Anzahl zu erhalten, beschrieben.
Dieses System besitzt dadurch verbesserte Nicht-Reversibilität und Selektivität, dass nach der Rekombination ein neuer Selektionsmarker erscheint.
Dabei ist die Nicht-Reversibilität auf das Fehlen von Exzisionsmitteln sowohl in den Vektoren als auch in der Wirtsquelle zurückzuführen. Die Beispiele, welche jene Patentanmeldung erläutern, zeichnen sich somit durch das Fehlen des Exzisionsproteins Xis sowohl in den Vektoren als auch in der Quelle Xis^– aus. Weiterhin trägt der stabile Charakter der Bindungssequenzen, die aus der Rekombination der spezifischen Rekombinationsloci stammen, zur Nicht-Reversibilität des Systems bei.
Deshalb liegt der Erfindung als Aufgabe zugrunde, dieses Verfahren zu perfektionieren und insbesondere seine Ausbeute, die Einfachheit seiner Durchführung sowie die Diversität erzeugter Klone zu erhöhen.
Dazu ermöglicht die Erfindung, nach zwei Rekombinationsereignissen einen Sequenzaustausch zwischen den zwei Vektoren durchzuführen. Dieser Austausch findet mit zwei rekombinanten Vektoren statt, wovon einer die zwei Transkriptionseinheiten für die große und die kleine Kette besitzt, dessen Größe aber kleiner als diejenige eines Vektors ist, der aus einer Fusion der zwei Ausgangsvektoren miteinander resultieren würde. Der fertige Vektor ist dann kleiner, seine Replikation und Umhüllung sind effizienter und seine Herstellung ist daher verbessert, was auch die Anzahl der fertigen Klone erhöht.
Erfindungsgemäß wird außerdem eine beträchtliche Vergrößerung der Auswahl der Quellen, die als Wirtszellen verwendbar sind, in dem Maße möglich, in welchem es nicht mehr erforderlich ist, dass die verwendete Quelle in ihrem Genom das Integrase-Gen besitzt, das bisher von einem der zwei Ausgangsvektoren getragen wurde und sich in einem fertigen Vektor wiederfand.
Dies erlaubt es, sich von Quellen unabhängig zu machen, die das Integrase-Gen in ihrem Genom integriert erhalten, und eine beliebige Quelle zu wählen, die hochinfektiös ist und Phagen produziert (TG1, 71-18 oder NM522).
Die Quellen 71-18 (Stratagene; Yanisch-Perron, C. et al., Gene, 33, 103–109 (1985)) und NM522 (New England Biolabs; Woodcock, D. L. et al., Nucl. Acids. Res., 17, 1563–1575 (1989)) haben sich als besonders gute Phagenproduzenten erwiesen. Sie erlauben eine Vervielfältigung der Anzahl der produzierten Phagen um den Faktor 10 bis 50, insbesondere im Vergleich mit der Quelle E. coli D1210HP, vertrieben von Stratagene.
Die Erfindung hat ein Verfahren zur Herstellung multikombinatorischer Banken zum Gegenstand, in welchem, ausgehend von einer ersten Bibliothek von Genen, die für eine Gesamtheit aus einem von zwei Polypeptid-Typen, insbesondere variablen Regionen einer kleinen oder großen Antikörper-Kette, die sich gegebenenfalls kovalent miteinander verbinden können, codieren, und mindestens einem Gen, das für den anderen Polypeptid-Typ, insbesondere eine variable Region des anderen Antikörperketten-Typs, codiert, oder vorzugsweise einer zweiten Bibliothek von Genen, die für eine Gesamtheit des anderen Typs codieren, die Gene der ersten Bibliothek in einen ersten Vektor eingeführt werden, um eine Gesamtheit aus Vektoren zu bilden, welche die verschiedenen Gene der ersten Bibliothek tragen, das Gen für den anderen Typ oder die Gene der zweiten Bibliothek in einen zweiten Vektor eingeführt wird/werden und eine Rekombination des ersten und des zweiten Vektors unter Bedingungen durchgeführt wird, die es einem der Vektoren nach Rekombination erlauben, ein Gen von einem der zwei Typen und ein Gen des anderen Typs zu enthalten und die beiden Gene in Form von miteinander verknüpften Polypeptiden zu exprimieren, die in der Lage sind, auf der Oberfläche des Produktes des Vektors zu erscheinen, wo sie befestigt bleiben und indem sie miteinander wie ein multimeres Protein oder ein multimeres Protein vortäuschend miteinander verbunden sind, dadurch gekennzeichnet, dass der erste und der zweite Vektor Mittel besitzen, um durch eine oder mehrere irreversible Rekombinationen jeweils einen Teil derart auszutauschen, dass nach Rekombination/en rekombinierte fertige Vektoren erzeugt werden, wovon einer ein Gen von einem der beiden Typen und ein Gen von dem anderen Typ enthält.
Vorteilhafterweise ist das erfindungsgemäße Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass die Ausgangsvektoren jeweils zwei spezifische Rekombinationsloci von einem oder zwei spezifischen Rekombinationssystem/en, insbesondere die Loci attB von E. coli und attP des Lambda-Phagen, enthalten, die derart angeordnet sind, dass sie unter dem Einfluss einer angelagerten Recombinase oder Integrase zwei Rekombinationsereignisse erlauben, um in jedem der fertigen Vektoren, die aus der Rekombination resultieren, zwei stabile Bindungssequenzen wie attL und attR zu bilden.
Vorzugsweise haben die zwei Rekombinationsloci, die in jedem der Ausgangsvektoren enthalten sind, eine entgegengesetzte Orientierung.
In einer vorteilhaften Abwandlung enthalten die Ausgangsvektoren jeweils zwei Loci attP des Lambda-Phagen und zwei Loci attB von E. coli.
Vorzugsweise enthält einer der zwei Ausgangsvektoren außerdem eine Sequenz, die für eine Recombinase oder Integrase codiert. Diese vorteilhafte Abwandlung erlaubt es, eine beliebige Quelle nutzen zu können, die hochinfektiös ist und den Phagen produziert, beispielsweise TG1, 71-18 oder NM522, ohne sich auf die wenigen Quellen beschränken zu müssen, die in ihrem Genom das Gen von einem dieser Enzyme besitzen. Dabei erscheinen im Zusammenhang mit den vorgesehenen Verwendungen die Quellen NM522 und 71-18 als besonders interessant. Vorzugsweise ist das Enzym, das zur Kontrolle der Stufe der Rekombination zwischen den Ausgangsvektoren verwendet wird, eine induzierbare Recombinase und insbesondere eine thermoinduzierbare Recombinase.
Vorteilhafterweise wird im erfindungsgemäßen Verfahren der rekombinante fertige Vektor, der aus den Ausgangsvektoren erhalten wird, welche die zu exprimierenden Gene enthalten, angeordnet, um einen Selektionsmarker zu besitzen, der ursprünglich nicht funktionell war und durch die Rekombination funktionell gemacht worden ist. Dieser Marker ist beispielsweise ein Antibiotika-Resistenzgen, insbesondere ein Gen der Gruppe, die von den Genen einer Resistenz gegenüber Tetracyclinen, Gentamycin, Kanamycin und Chloramphenicol gebildet wird, mit seinem Promotor.
Vorzugsweise enthält dieser Selektionsmarker einen für das Gen geeigneten Promotor, wobei der Promotor anfänglich in einen der Ausgangsvektoren und das Markergen in den anderen insertiert worden ist. Das Selektionsgen und dessen Promotor können beispielsweise durch eine Antiterminationssequenz, insbesondere die Sequenz NutL, voneinander getrennt werden. Die Ausgangsvektoren enthalten auch mindestens einen Phagen- oder Plasmidreplikationsursprung, wobei diese Ursprünge derart angeordnet werden, dass die rekombinanten fertigen Vektoren jeweils nur einen Phagen- und/oder Plasmidreplikationsursprung enthalten.
Im erfindungsgemäßen Verfahren wird eines der zwei zu exprimierenden Gene mit einer Sequenz fusioniert, die für ein Polypeptid des Capsids eines Phagen oder einen Teil davon codiert. Diese Sequenz entspricht beispielsweise dem Gen, das für das Protein III des Lambda-Phagen codiert. Vorteilhafterweise befinden sich das zu exprimierende Gen und die Sequenz, mit welcher es fusioniert ist, derart in einem der Ausgangsvektoren, dass sie in dem rekombinanten Phagemidprodukt, das die zwei zu exprimierenden Gene enthält, vorhanden sind.
Die Erfindung hat weiterhin zum Gegenstand die Vektoren, die durch das zuvor beschriebene Verfahren erhalten werden oder erhalten werden können, insbesondere die Vektoren vom Typ Plasmid oder Phagemid, die durch das Vorhandensein einer Sequenz gekennzeichnet sind, die für einen der zwei Polypeptidtypen, die sich miteinander verbinden können, insbesondere einen variablen Teil der kleinen Antikörperkette, codiert, und einer Sequenz, die für den anderen dieser zwei Typen, insbesondere einen variablen Teil der großen Antikörperkette, codiert, wobei die Sequenzen in geeigneten Rahmen von Elementen, die ihre Expression in einem Wirt ermöglichen, umgeben und durch stabile Bindungssequenzen, insbesondere attR und attL, voneinander getrennt sind.
Diese Vektoren, die insbesondere vom Typ Plasmid sind, enthalten vorzugsweise eine funktionelle Sequenz, die für eine Recombinase oder Integrase codiert, und enthalten auf besonders vorteilhafte Weise auch stabile Bindungssequenzen, die durch einen Abstandshalter voneinander getrennt sind.
Die Erfindung hat auch zum Gegenstand multikombinatorische Vektorbanken, die von den erfindungsgemäßen Vektoren gebildet werden und eine Sequenz, die für einen der zwei Polypeptidtypen, die sich miteinander verbinden können, insbesondere einen variablen Teil der kleinen Antikörperkette, codiert, mit einer Sequenz, die für den anderen der beiden Typen, insbesondere einen variablen Teil der großen Antikörperkette codiert, zufällig miteinander verknüpfen.
Die Erfindung hat schließlich zum Gegenstand die Antikörper oder Antikörperteile vom Typ Fab, die nach Selektion der erfindungsgemäßen Vektorbanken mittels Selektionsmarkern, anschließend Screening, das vorgesehen ist, die Klone auszuwählen, die Verknüpfungen von kleiner Antikörperkette mit großer Antikörperkette mit den gewünschten Affinitäten zu bestimmten Antigenen exprimieren, anschließend Expression der durchmusterten Klone in einem Expressionssystem und schließlich Extraktion und/oder Aufreinigung der Antikörper oder Antikörperteile vom Typ Fab, die im Expressionssystem produziert worden sind, erhalten werden können. Die Selektions- und Screeningverfahren sind beispielsweise von Parmley, S. F. et al., Gene, 73, 305–308 (1988) beschrieben. Die Extraktions- und Aufreinigungsverfahren sind beispielsweise von Neu, H. C. et al., J. Biol. Chem., 240, 3685–3692 (1965) beschrieben.
Bisher ist ein Beispiel für die Konstruktion eines erfindungsgemäßen rekombinierten Vektors beschrieben worden, der die variablen Teile der kleinen Kette und der großen Kette ein und desselben Anti-HIV-gp160-Klons kombiniert, ein Vektor, der sich als in der Lage erwiesen hat, die Gene der variablen kleinen und großen Teile zu exprimieren und ihre Expressionsprodukte auf seiner Oberfläche aufzuweisen oder, in einer Abwandlung, sie in Form einer Verknüpfung von große Kette-kleine Kette, die das Antigen gp160 erkennt, abzusondern.
Dasselbe Verfahren kann zur Realisierung der multikombinatorischen Konstruktionen angewendet werden, in welchen die Gene einer Bibliothek aus variablen Teilen der kleinen Kette mit einem Gen für den variablen Teil der großen Kette oder einer Bibliothek von variablen Teilen der großen Kette mit einem Gen für den variablen Teil der kleinen Kette oder zwei Bibliotheken aus variablen Teilen der großen und der kleinen Kette miteinander verknüpft werden.
Figuren
1 zeigt eine schematische Ansicht des Plasmids pM858, das eine Transkriptionseinheit für die variablen Regionen von kleinen Ketten in Fusion mit dem Gen III besitzt.
2 zeigt eine schematische Ansicht des Phagemids pM867, das eine Transkriptionseinheit für die variablen Regionen von großen Ketten besitzt.
3 zeigt eine schematische Ansicht der rekombinanten Vektoren, die nach Sequenzaustausch zwischen dem Plasmid pM858 und dem Phagemid pM867 erhalten worden sind.
3A zeigt das multikombinatorische Phagemid mit 7,2 kb, das die zwei Transkriptionseinheiten für die kleine und die große Kette besitzt.
3B zeigt das rekombinante Plasmid mit 6,5 kb, welches das Integrase-Gen besitzt.
Beschreibung der Vektoren
Wegen Einzelheiten zu den molekularbiologischen Verfahren, die bei der Konstruktion der Vektoren angewendet wurden, kann man sich aus der Patentanmeldung WO 95/21914 unterrichten, die hiermit als Bezugnahme aufgenommen wird.
Plasmid pM858 (7,2 kb): Plasmid, das den Replikationsursprung "große Kopienzahl" ColE1, eine Transkriptionseinheit für die variablen Regionen von kleinen Ketten in Fusion mit dem Gen III (Promotor lacZ-Signalsequenz Pe1B-VH-Gen III), das Gen N, auf welches das Gen folgt, das für den Selektionsmarker gegenüber Gentamycin codiert, den Selektionsmarker für Ampicilin und zwei Rekombinationssequenzen attP mit entgegengesetzter Orientierung, die von einem Abstandshalter getrennt sind, der mindestens 2 kb groß sein muss, besitzt.
Phagemid pM867 (6,5 kb): Vektor, der den Replikationsursprung "kleine Kopienzahl" p15A, die Integrase des Lambda-Phagen sowie den thermosensiblen Repressor cI857, den Selektionsmarker gegenüber Kanamycin und zwei Rekombinationssequenzen attB mit entgegengesetzter Orientierung, die von folgenden Sequenzen voneinander getrennt sind: eine Transkriptionseinheit für die variablen Regionen von großen Ketten (LacZ-pelB-VH), Replikationsursprung des Phagen F1 und den Tryptophanpromotor Trp, gefolgt vom Antiterminator NutL in derselben Orientierung, besitzt.
Nach Rekombination (2 Rekombinationsereignisse) wurden Sequenzen ausgetauscht, welche die Rekombinationssequenzen zwischen Ausgangsplasmid und -phagemid voneinander trennen. Ein rekombinantes Phagemid wurde mit zwei Sequenzen attR in entgegengesetzter Orientierung, die von den Elementen des Ausgangsplasmids, d. h. der Transkriptionseinheit der variablen Regionen von großen Ketten, dem Ursprung F1, dem Promotor Trp, gefolgt NutL, voneinander getrennt waren, erhalten. In diesem rekombinanten Phagemid, das die zwei Transkriptionseinheiten für die große und die kleine Kette besaß, wurde auch eine Transkriptionseinheit für einen neuen Selektionsmarker, hier das Gentamycin (Promotor Trp-NuTL-N-Gentamycin), erzeugt.
Die weiteren Eigenschaften dieses Systems (Nicht-Reversibilität, neuer Selektionsmarker nach Rekombination) waren identisch mit denjenigen des Systems, das in WO 95/21914 beschrieben ist.
I – Beschreibung der Stufen der Konstruktion der zwei Ausgangsvektoren

I. Erzeugung eines Plasmids, das einen Replikationsursprung ColE1, ein Ampicillin-Resistenzgen, ein Gentamycin-Resistenzgen (ohne seinen Promotor), das Gen für das Protein N, die Klonierkassette für die kleinen Ketten und zwei Rekombinationssequenzen attP, die einen Abstandshalter von etwa 2 Kb einrahmen, besitzt. Dieser Vektor dient als Ausgangspunkt, um die Bank aus kleinen Ketten (variable Regionen) zu insertieren.
1. Insertion der ersten Rekombinationssequenz attP (271 bp) nach Amplifiktion durch PCR mit dem Lambda-Phagen (Basen 27571 bis 27820) zwischen den Loci EcoRI und KpnI des Plasmids pUC18 (2686 bp) (kontrollierte Orientierung). Es wurde das Plasmid pM 852 (2957 bp) erhalten.
2. Insertion des Gentamycin-Resistenzgens (Gen aacC1), gekoppelt an die zweite Rekombinationssequenz attP
– Die Sequenz attP wurde durch PCR aus dem Lambda-Phagen der Basen 27571 bis 27820 mit folgenden Primern amplifiziert:
– Das Gen aacC1 mit 732 bp wurde aus dem Plasmid pSS11 9 (siehe: Stibitz, S., Methods in enzymology, Bd. 235, 458–465, (1994)) amplifiziert.
– Eine zweite Amplifikation durch PCR erlaubte die Vereinigung der zwei vorgehenden Sequenzen durch folgende Primern:
Das Fragment, das das Gen aacC1 und die Sequenz AttP, verdaut durch XbaI, enthielt, wurde in den Vektor pM852 an den Loci SmaI und XbaI mit Zerstörung des Locus SmaI (kontrollierte Orientierung) cloniert. Man erhielt das Plasmid pM854 (3960 bp).
3. Deletion eines Teils der Sequenz, die das Gen der β-Galactosidase in dem Plasmid pM854 einrahmt, durch Verdauung mit HindIII und SspI und anschließend Behandlung der Enden des Vektors mit Klenow und Ligierung des Plasmids mit sich selbst unter Zerstörung der 2 Restriktions-Loci. Man erhielt das Plasmid pM855 (3378 bp).
4. Der Restriktionslocus XbaI wurde durch Verdauung des Vektors pM855 mit XbaI und Behandlung seiner Enden mit Klenow zerstört. Man erhielt das Plasmid pM856 (3382 bp).
5. Insertion einer Expressionskassette für die kleine Kette (Promotor lac, Signalsequenz PelB und kleine Kette (642 bp) eines Anti-HIV-gp160-Klons, fusioniert mit dem Gen III), gekoppelt an das System, das dem rekombinierten Phagemid eine neue Resistenz verleiht (Gen für das Protein N und Gen aacC1, ohne dessen Promotor). Das komplette Fragment (2609 bp) wurde aus dem Plasmid pM845 (weiter unten beschrieben) durch vollständige Verdauung mit SphI und teilweise Verdauung durch Asp718 erhalten. Das Fragment nach Behandlung seiner Enden mit Klenow wurde in das Plasmid pM856 kloniert, mit SphI geschnitten und ebenfalls mit Klenow behandelt, mit Zerstörung des Locus phI. Man erhielt das Plasmid pM857 (5991 bp).
6. Das Plasmid pM857 wurde aus dem Gen aacC1 durch Schneiden KpnI-BamHI (768 bp) deletiert, anschließend wurden seine Enden mit Klenow behandelt. Ein Abstandshalter mit etwa 2 Kb wurde zwischen diese zwei Loci insertiert. Die Sequenz dieses Abstandshalters blieb noch zu bestimmen. Man erhielt das Plasmid pM858 (etwa 7200 bp).
II. Erzeugung eines Vektors vom Typ Phagemid, der zwei Replikationsursprünge P15A und f1, ein Kanamycin-Resistenzgen, zwei Rekombinationssequenzen attB, welche die Klonierkassette der großen Ketten einrahmen, sowie den Tryptophanpromotor und die Sequenz nutL trägt Dieser Vektor dient als Ausgangspunkt zum Insertieren einer Bank aus großen Ketten (variable Regionen). Das Basenplasmid für die Konstruktion ist das Plasmid pM825 (beschrieben in der Patentanmeldung WO 95/21914).
1. Insertion einer zweiten Rekombinationssequenz attB p in Form synthetischer mit 23 bOligonucleotide in den Locus SphI. Die zwei möglichen Klonierorientierungen wurden erhalten. Die Orientierung, die uns interessierte, war diejenige der 2 attB in entgegengesetzten Richtungen. Man erhielt das Plasmid pM851 (3079 bp).
2. Ein Fragment mit 2118 bp (enthält die Basen 997 bis 3079 + 0 bis 36) von pM851 wurde mit PCR amplifiziert. Es enthielt die zwei Rekombinationssequenzen attB, das Kanamycin-Resistenzgen und den Replikationsursprung P15A mit Erzeugung eines Locus AscI an jedem Ende und Entfernung der existierenden Loci EcoRI und SphI. Man erhielt das Plasmid pM861 (2126 bp).
3. Mutagenese des Restriktionslocus XhoI, der sich in -925-Position befindet, mit dem Kit Clontech. Man erhielt das Plasmid pM862 (2126 bp).
4. Insertion eines synthetischen mehrfachen Klonierlocus "Polylinker" mit 36 bp, der die Loci XbaI, NcoI, SphI und EcoRI am einzigen Locus AscI des Vektors pM862 (kontrollierte Orientierung) enthält. Man erhielt das Plasmid pM863 (2162 bp).
5. Insertion eines Fragments mit 1122 bp, das die Sequenz nutL, die Sequenz des Tryptophanpromotors und den Replikationsursprung f1 enthält, in den Vektor pM863. Dieses Fragment wurde aus dem Vektor pM847 (weiter unten beschrieben) durch Verdauung mit NheI und BspHI extrahiert und anschließend in den Vektor pM863 an den Loci XbaI und NcoI (kontrollierte Orientierung) cloniert. Man erhielt das Phagemid pM864 (3284 bp).
6. Insertion eines Fragments mit 1080 bp, das der Expressionskassette der großen Ketten (lac-Promotor, Signalsequenz PelB und große Kette (684 bp) eines Anti-HIV-gp160-Klons) entspricht, in den Vektor pM864. Dieses Fragment wurde aus dem Vektor pM847 durch Verdauung mit SphI + EcoRI extrahiert und anschließend in den Vektor pM864 an den Loci SphI und EcoRI (kontrollierte Orientierung) kloniert. Man erhielt das Phagemid pM865 (4363 bp).
7. Insertion des λ-Integrase-Gens und seines durch PCR aus dem Plasmid pCW107 (Wülfing & Plückthun, Gene, 136, 199–203 (1993)) amplifizierten Promotors (1280 bp). Dieses Fragment wurde an den Loci NheI und StuI des pM865 insertiert (kontrollierte Phagemids Orientierung). Man erhielt das Phagemid pM866 (etwa 5643 bp).
8. Insertion der Sequenz cI857 unter der Abhängigkeit des λ-Promotors pR, amplifiziert durch PCR (820 bp) aus dem Plasmid pCW107. Diese Sequenz ist notwendig, um die Expression der Integrase nach einem Hitzeschock bei 42°C zu ermöglichen. Dieses Fragment wird an den Loci AvaII und BspHI des Phagemids pM866 insertiert. Man erhielt das Phagemid pM867 (etwa 6463 bp). Die letzten beiden Stufen 7 und 8 lassen sich modifizieren.

Die Konstruktion dieser zwei Vektoren erlaubt die Verwendung einer beliebigen Bakterienquelle für die Rekombination (Typ XL1 blue).
II Beschreibung der Plasmide pM845 und pM847, die für die Konstruktion der Ausgangsvektoren verwendet wurden

I. Konstruktion des Plasmids pM845, das einen Replikationsursprung ColE1, ein Kanamycin-Resistenzgen, eine Rekombinationssequenz attB und eine Kassette, welche die Klonierung und Expression der mit dem Produkt des Gens III fusionierten kleinen Ketten erlaubt.
1. Klonierung des Gens aacC1 (Gm^R) im Plasmid pM826.
– Amplifizierung durch PCR des Gens aacC1 (575 bp) ohne seinen Promotor, ausgehend von pSS1129 (Stibitz, S., Methods in enzymology, Bd. 235, 458–465 (1994)) und Insertion an dem einzigen Locus AscI von pM826, beschrieben in der Patentanmeldung WO 95/21914. Man erhielt das Plasmid pM840 (3611 bp).
2. Veränderung des Replikationsursprungs P15A des Plasmids pM840 durch den Ursprung große Kopienzahl ColE1.
– Amplifikation durch PCR von ColE1 (953 bp) aus dem Vektor pM840 ohne den Ursprung P15A (2750 bp).
– Verknüpfung der zwei PCR-Fragmente durch die neu geschaffenen Loci MluI und BamHI. Man erhielt das Plasmid pM842 (3692 bp).
3. Klonierung des Gens III in 3' der kleinen Kette im Plasmid pM842.
– Amplifikation durch PCR des Gens III (658 bp) aus dem Phagemid pM841 und Insertion an 3' der kleinen Kette, wobei der Leserahmen (mit einem Amber-Codon zwischen den zwei) zwischen den Loci XbaI und SphI erhalten bleibt. Man erhielt das Plasmid pM844 (4339 bp).
4. Klonierung des Proteins N (erforderlich für das Funktionieren des Antiterminators nutL) an 3' von attB und an 5' des Gens aacC1.
– Amplifikation durch PCR des Gens für das Protein N (453 bp) aus dem Lambda-Phagen (Basen 35022 bis 35465) und des Gens aacC1 (575 bp), ausgehend von pSS1129, anschließend Verknüpfung der zwei Fragmente durch eine zweite PCR mit den Primern 5' N Mlu und Genta 3'.
– Insertion des PCR-Fragments mit 1022 bp am Locus AscI von pM844 nach Deletion des zuvor klonierten Gens aacC1. Man erhielt das Plasmid pM845 (4785 bp).
II. Konstruktion des Phagemids pM847, das einen Replikationsursprung P15A, ein Ampicillin-Resistenzgen, eine Rekombinationssequenz attP und eine Kassette für die Klonierung und Expression der großen Ketten besitzt.
1. Klonierung des Antiterminators nutL im Phagemid pM834 (beschrieben in WO 95/21914).
- Zerstörung des Locus NotI, der sich an 3' des Promotors lac befindet, durch Verdauung, anschließend Auffüllung mit Klenow.
– Synthese von 4 Oligonucleotiden, die die 120 bp der Sequenz nutL des Lambda-Phagen (Basen 35467 bis 35586) umfassen, und Insertion am Locus NotI, der sich an 3' der Rekombinationssequenz attP befindet. Dabei ist eine einzige Orientierung zulässig, damit der Antiterminator nach Rekombination funktioniert. Man erhielt das Phagemid pM839 (4937 bp).
2. Veränderung des Replikationsursprungs ColE1 im Phagemid pM839 durch den Ursprung kleine Kopienzahl P15A.
– Amplifikation durch PCR von P15A (833 bp) aus pM840 und dem Vektor pM839 ohne den Ursprung colE1 (4007 bp).
– Verknüpfung der zwei PCR-Fragmente durch die neu geschaffenen Loci XbaI und SphI. Man erhielt das Phagemid pM841 (4828 bp).
3. Deletion des Gens III, das sich an 3' der großen Kette befindet.
– Amplifikation durch PCR des gesamten Phagemids pM841, aber ohne das Gen III (4150 bp) und Ligierung nach Verdauung durch den einzigen Locus SpeI. Man erhielt das Phagemid pM846 (4144 bp).
4. Austausch des Promotors cat durch den Promotor trp.
– Amplifikation durch PCR des Bicistron-Tryptophan-Promotors (233 bp) aus dem Vektor pM800 (im Laboratorium verfügbar) und Insertion am Locus KpnI, der sich an 3' der Sequenz nutL befindet, nach Deletion des zuvor klonierten Promotors cat. Man erhielt das Phagemid pM847 (4194 bp).

III – Rekombination zwischen den zwei Vektoren pM858 und pM867
Diese zwei Vektoren dienten als Ausgangspunkt, um multikombinatorische Antikörperbanken zu erhalten. In diesem Beispiel erfolgte die Rekombination zwischen den Ketten V_L und V_H des verwendeten Anti-HIV-gp160-Klons. Wenn jedoch die zwei Vektoren aus Banken von Genen für große Antikörperketten und/oder Genen für kleine Antikörperketten konstruiert werden, erlauben sie, eine multikombinatorische Antikörperbank zu erhalten, die anschließend durchmustert werden kann.
In eine adäquate Quelle (D1210HP) transformiert, können sich die zwei Vektoren durch die Sequenzen AttP und AttB miteinander verknüpfen und mit einem int-induzierbaren Rekombinationsfaktor durchmustert werden. Die Rekombinationsmechanismen sind beschrieben im Kapitel 9 des Buchs "The recombination of genetic material" (Miller, H. V., Viral and cellular control of sitespecific recombination, S. 360–384 (1988), Hrsg. Brooks Low, K., Academic Press). Der so erzeugte multikombinatorische Vektor (7200 bp) besitzt einen Replikationsursprung, ein Gentamycin-Resistenzgen und die zwei Kassetten, welche die Expression der Ketten V_L und V_H erlauben.

1) Es wurde die Transformation durch Elektroporation der Quelle E. coli XL-1 Blue (vertrieben von Stratagene) durchgeführt.
2) Rekombinationsstufen
– Es wurde die Transformation dieser Quelle durch das Plasmid pM858 (enthielt die Ketten V_L) und parallel dazu diejenige einer kompatiblen Quelle durch das Phagemid pM867 (trägt die Ketten V_H) durchgeführt.

Ausgehend von der durch das Phagemid pM867 transformierten Quelle wurde sie in Form des Phagen hergestellt, anschließend wurde die XL-1-Blue-Kultur, die das Plasmid pM858 enthielt, bei 30°C (optische Dichte D_o = 0,6) infiziert.
Nach 30minütiger Infektion bei 30°C wurde die Kultur eine Stunde lang einem Hitzeschock bei 42°C unterworfen, um die Rekombination unter dem Einfluss der induzierbaren Recombinase auszulösen.
Nachdem die Kultur auf 30°C abgekühlt und Gentamycin zugegeben worden war, wurden die Klone auf Gelose, die Gentamycin enthielt, ausgebreitet. Eine Stunde später wurde die Helfer-Phage VCSM13 (Kan^®) von Stratagene mit einem Anteil von 10¹² pfu/100 ml Kultur zugegeben. Danach wurde, 2 Stunden später, Kanamycin mit einer Endkonzentration von 70 μg/ml zugegeben und die Kultur einige Stunden lang bei 30°C stehengelassen.
Die Analyse der Klone nach Rekombination der Vektoren pM858 und pM867 zeigte, dass die Verknüpfung ordnungsgemäß stattgefunden hatte. Man erhielt ein stabiles rekombiniertes Phagemid mit 7200 bp, das ein Fab exprimierte und immer noch in der Lage war, die Quelle XL-1 Blue zu infizieren. Die Bindungsstellen AttL und AttR wurden durch Sequenzierung nachgewiesen.
IV – Herstellung einer multikombinatorischen Bank aus einer Bank aus kleinen Antikörperketten und einer Bank aus großen Antikörperketten
Die Insertionsstufe I.4 der variablen Region der kleinen Kette des durch PCR amplifizierten Anti-HIV-gp160-Klons 160 wurde durch eine ähnliche Insertion der variablen Regionen der kleinen Ketten einer Bank aus kleinen Antikörperketten, die durch PCR mittels eines bekannten geeigneten Primersystems, das für den gewünschten Typ einer kleinen Kette geeignet war, oder einer Vielzahl von Primersystemen, wenn die Multikombination, ausgehend von Populationen verschiedener Typen kleiner Ketten, gewünscht war, amplifiziert worden war, ersetzt. Die Primersysteme, die die Amplifikation der kleinen Ketten erlauben, sind bekannt und von W. D. Huse et al., Science, Bd. 246, 1275–1281 (1989) beschrieben.
Auf dieselbe Weise wurde zur Klonierung der großen Ketten die Insertionsstufe II.1 der großen Kette eines Anti-HIV-gp160-Klons durch die Insertion einer Bank aus variablen Regionen großer Ketten, die durch PCR mittels geeigneter Primersysteme amplifiziert worden war, ersetzt, die von M. J. Campbell et al., Molecular Immunology, Bd. 29, Nr. 2, 193–203 (1992) oder von W. D. Huse et al., siehe oben, beschrieben worden ist.
Nach den Rekombinationsstufen wurden die gegenüber Gentamycin resistenten Klone ausgewählt und anschließend ein Screening durchgeführt, das vorgesehen war, die Klone auszuwählen, die Verknüpfungen von kleiner Antikörperkette und großer Antikörperkette zu exprimieren, welche die gewünschten Affinitäten zu den festgelegten Antigenen haben, entsprechend den Verfahren, die beispielsweise von S. F. Parmley et al., Gene, 73, 305–318 (1988) beschrieben wurden.
Die aus der Selektions- und der Screeningstufe erhaltenen Klone erlauben anschließend, die entsprechenden Fab-Moleküle zu produzieren. Das verwendete Phagemid enthält ein Amber-Codon an der Verbindung der großen Kette des Fab und des gp3. Wenn beispielsweise eine Ambresuppressive E.-coli-Quelle, XL1-Blue (Stratagene, La Jolla, CA, USA), mit dem Phagemid transformiert wird, wird das Fab an der Oberflächen des Phagen exprimiert. Beispielhaft wird in einer nicht-suppressiven Bakterienquelle, TOP10 (Stratagene, La Jolla, CA, USA), die Proteinsynthese am Ende der großen Kette unterbrochen. Durch die Signalfrequenz des Gens, das für die Pectase Lyase "pelB" von E. cartovora codiert, wird dann das Fab in das Periplasma transportiert. Es wird anschließend durch einen osmotischen Schock extrahiert (Neu, H. C. et al., J. Biol. Chem., 240, 3685–3692 (1965)). In Abhängigkeit vom Charakter des Fab können verschiedene bekannte chromatographische Verfahren zu seiner Aufreinigung angewendet werden: beispielsweise Ionenaustausch-, Affinitäts- und Molekularsiebchromatographie.

Claims

Verfahren zur Herstellung multikombinatorischer Banken, in welchem, ausgehend von einer ersten Bibliothek von Genen, die für eine Gesamtheit aus einem von zwei Polypeptid-Typen, insbesondere variablen Regionen einer kleinen oder großen Antikörper-Kette, die sich gegebenenfalls kovalent miteinander verbinden können, codieren, und mindestens einem Gen, das für den anderen Polypeptid-Typ, insbesondere eine variable Region des anderen Antikörperketten-Typs, codiert, oder vorzugsweise einer zweiten Bibliothek von Genen, die für eine Gesamtheit des anderen Typs codieren, – die Gene der ersten Bibliothek in einen ersten Ausgangsvektor eingeführt werden, um eine Gesamtheit aus fertigen Vektoren zu bilden, welche die verschiedenen Gene der ersten Bibliothek tragen, – das Gen für den anderen Typ oder die Gene der zweiten Bibliothek in einen zweiten Ausgangsvektor eingeführt wird/werden, wobei die Ausgangsvektoren jeweils zwei Loci attP des Lambda-Phagen und zwei Loci attB von E. coli mit umgekehrter Orientierung derart enthalten, dass sie zwei Rekombinationen unter dem Einfluß einer Recombinase oder Integrase ermöglichen, die gebunden ist, um in den fertigen Vektoren, die aus der Rekombination resultieren, je zwei stabile attL- und attR-Bindungssequenzen zu bilden, und – zwei irreversible Rekombinationen derart durchgeführt werden, dass nach Rekombinationen fertige rekombinierte Vektoren erzeugt werden, wovon ein Vektor ein Gen für einen der beiden Typen und ein Gen für den anderen Typ enthält und es ermöglicht, die zwei Gene auf der Oberfläche eines Phagen in Form von Polypeptiden zu exprimieren, die wie ein multimeres Protein oder ein multimeres Protein vortäuschend festgehalten und miteinander verbunden werden.
Verfahren nach Anspruch 1, in welchem einer der Ausgangsvektoren eine Sequenz enthält, die für eine Recombinase oder Integrase codiert.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, in welchem der rekombinante fertige Vektor, der aus den Ausgangsvektoren erhalten worden ist und die zu exprimierenden Gene enthält, erzeugt wird, um einen Selektionsmarker aufzuweisen, der anfänglich nicht funktionell war und durch die Rekombination funktionell gemacht worden ist.
Verfahren nach Anspruch 3, in welchem der Selektionsmarker ein Gen, das die Selektion ermöglicht, wenn es exprimiert wird, und einen dem Gen eigenen Promotor enthält, wobei der Promotor in einen der Ausgangsvektoren und das Markergen in den anderen insertiert wird.
Verfahren nach Anspruch 4, in welchem das Selektionsgen und dessen Promotor durch eine Antiterminationssequenz, insbesondere die Sequenz NutL, voneinander getrennt sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, in welchem der Marker das Antibiotikaresistenz-Gen, insbesondere ein Gen der Gruppe, die von den Genen der Resistenz gegen Tetracycline, Gentamycin, Kanamycin und Chloramphenicol gebildet wird, mit seinem Promotor ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, in welchem die Ausgangsvektoren mindestens einen Phagen- oder Plasmidreplikationsursprung enthalten, wobei die Ursprünge derart erzeugt werden, dass die rekombinanten fertigen Vektoren jeweils nur einen Phagen- und/oder Plasmidreplikationsursprung enthalten.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, in welchem eines der zu exprimierenden Gene mit einer Sequenz fusioniert wird, die für ein Polypeptid des Capsids eines Phagen oder einen Teil davon codiert.
Verfahren nach Anspruch 8, in welchem die Fusionssequenz dem Gen entspricht, das für das Protein III des Lambda-Phagen codiert.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, in welchem sich das Gen und dessen fusionierte Sequenz derart in einem der Ausgangsvektoren befinden, dass sie in dem rekombinanten Phagemidprodukt vorhanden sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, in welchem zur Kontrolle der Stufe der Rekombination zwischen den Ausgangsvektoren eine insbesondere thermoinduzierbare induzierbare Recombinase verwendet wird.
Vektor, der durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 erhalten werden kann, insbesondere ein Vektor vom Typ Plasmid oder Phagemid, der eine Sequenz, die für einen der zwei Polypeptid-Typen, die sich miteinander verbinden können, insbesondere einen variablen Teil der kleinen Antikörperkette, codiert, und eine Sequenz, die für den anderen dieser zwei Typen, insbesondere einen variablen Teil der großen Antikörperkette, codiert, enthält, wobei die Sequenzen in geeigneten Rahmen von Elementen, die ihre Expression in einem Wirt ermöglichen, umgeben und durch die stabilen attR- und attL-Bindungssequenzen voneinander getrennt sind.
Vektor nach Anspruch 12, der durch einen Abstandshalter getrennte stabile Bindungssequenzen enthält.
Multikombinatorische Vektorbanken, die von Vektoren nach Anspruch 12 oder 13 gebildet werden, die eine Sequenz, die für einen der zwei Polypeptid-Typen, die sich miteinander verbinden können, insbesondere einen variablen Teil der kleinen Antikörperkette, codiert, mit einer Sequenz, die für den anderen der beiden Typen, insbesondere einen variablen Teil der großen Antikörperkette, codiert, auf eine zufällige Weise miteinander verknüpfen.