DE69623267T2

DE69623267T2 - Stabiles polymerisiertes hämoglobin-blutersatzmittel

Info

Publication number: DE69623267T2
Application number: DE69623267T
Authority: DE
Inventors: S. Gawryl; A. Houtchens; E. Jacobs; J. Laccetti; R. Light; W. Rausch
Original assignee: Biopure Corp
Current assignee: Biopure Corp
Priority date: 1995-03-23
Filing date: 1996-03-22
Publication date: 2003-04-17
Anticipated expiration: 2016-03-23
Also published as: CA2215697A1; EP1094079A3; EP1211261A3; NZ305258A; ATE222926T1; EP1211261A2; EP1093720B1; DE69623267D1; ATE447324T1; AU5322796A; DK0815138T3; JP2007260393A; EP1093720A1; EP1094078A3; PT815138E; EP1094079A2; WO1996029346A1; JP4382877B2; EP0815138A1; CA2215697C

Description

Es besteht ein Bedürfnis für einen Blutersatz zur Behandlung oder Verhinderung von Hypoxie als Folge von Blutverlust (z. B. von einer akuten Hämorrhagie oder während chirurgischer Eingriffe) als Folge von Anämie (wie z. B. einer perniziösen Anämie oder Sichelzellen-Anämie) oder aber von einem Schock, (wie z. B. Volumenmangel-Schock, anaphylaktischer Schock, septischer Schock oder allergischer Schock).
Die Verwendung von Blut und Blutfraktionen wie bei diesen Leistungsfähigkeiten als Blutersatz ist voll von Nachteilen. Beispielsweise ist die Verwendung von Vollblut oft vom Risiko der Übertragung von Hepatitis hervorrufenden Viren und AIDS hervorrufenden Viren begleitet, welche die Gesundung des Patienten komplizieren oder zum Tod des Patienten führen. Ferner erfordert die Verwendung von Vollblut eine Typisierung des Bluts und Kreuzproben, um immunohämatologische Probleme und Interdonator-Unverträglichkeit zu vermeiden.
Menschliches Hämoglobin besitzt als Blutersatz osmotische Aktivität und die Fähigkeit, Sauerstoff zu transportieren und zu übertragen, jedoch hat es den Nachteil einer schnellen Ausscheidung aus dem Kreislauf auf renalem Weg und durch die Gefäßwände, was zu einer sehr kurzen und damit typischerweise unbefriedigenden Halbwertszeit führt. Ferner ist Hämoglobin auch häufig mit toxischen Spiegeln von Endotoxinen, Bakterien und/oder Viren verunreinigt. Nichtmenschliches Hämoglobin leidet unter den gleichen Mängeln wie menschliches Hämoglobin. Ferner ist Hämoglobin aus nicht-menschlichen Quellen typischerweise auch mit Proteinen, wie z. B. Antikörpern, verunreinigt, was eine Immunsystem- Reaktion beim Empfänger hervorrufen kann.
Bislang wurden mindestens vier andere Arten von Blutersatzstoffen verwendet, einschließlich Perfluorchemikalien, synthetische Hämoglobinanaloge, Liposom-verkapseltes Hämoglobin und chemisch modifiziertes Hämoglobin. Jedoch hatten viele dieser Blutersatzstoffe typischerweise kurze intravaskuläre Retentionszeiten, wobei sie vom Kreislaufsystem als Fremdsubstanzen entfernt oder in der Leber, Milz, und anderen Geweben aufgenommen werden. Auch waren viele dieser Blutersatzstoffe biologisch mit lebenden Systemen unverträglich.
Infolgedessen besteht trotz dieser neueren Fortschritte bei der Herstellung von Blutersatzstoffen auf Hämoglobinbasis weiterhin das Bedürfnis nach einem Blutersatz, der Spiegel an Verunreinigungen wie Endotoxinen, Bakterien, Viren, Phospholipiden und Nicht-Hämoglobin-Proteinen aufweist, die ausreichend gering sind, um in der Regel eine Reaktion des Immunsystems und toxikologische Wirkungen, welche sich bei einer Infusion des Blutersatzes ergeben, verhindern. Ferner muss der Blutersatz auch fähig sein, ausreichende Mengen von Sauerstoff unter Umgebungsbedingungen zum Gewebe zu transportieren und auf dieses zu übertragen, und es muss eine gute intravaskuläre Verweilzeit besitzen.
Ferner wird es bevorzugt, dass der Blutersatz 1) eine onkotische Aktivität, die in der Regel derjenigen von Vollblut gleichwertig ist, besitzt, 2) an die meisten Empfänger ohne Durchführung von Kreuzproben transfundiert werden kann, und 3) mit minimaler Kühlung während langer Zeiträume gelagert werden kann.

ZUSAMMENFASSUNG

In einem ihrer Aspekte stellt vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer stabilen, polymerisierten Hämoglobinlösung aus einer deoxidierten polymerisierten Hämoglobinlösung zur Verfügung, umfassend folgende Stufen: a) Bereitstellung einer deoxidierten polymerisierten Hämoglobinlösung, welche unter Verwendung eines Dialdehyd-Vernetzungsmittels polymerisiert wurde; b) In- Berührung-Bringen der deoxidierten polymerisierten Hämoglobinlösung mit einer Alkalilösung, wobei die deoxidierte polymerisierte Hämoglobinlösung basisch gemacht wird; c) In-Berührung-Bringen der basisch gemachten, deoxidierten polymerisierten Hämoglobinlösung mit Natriumborhydrid, wobei eine stabile, reduzierte polymerisierte Hämoglobinlösung gebildet wird; und d) Diafiltrierung des stabilen, reduzierten polymerisierten Hämoglobins mit einer ersten physiologischen Lösung (z. B. bei einem pH-Wert von 7,9 oder weniger), wobei die reduzierte, polymerisierte Hämoglobinlösung physiologisch annehmbar gemacht wird, und sich eine stabile, polymerisierte Hämoglobinlösung bildet.
Die Erfindung stellt auch eine stabile polymerisierte Hämoglobinlösung zur Verfügung, welches Säugetier-Hämoglobin umfasst, mit einer Konzentration zwischen 10 bis 250 g Hämoglobin/Liter Lösung, die folgende Eigenschaften besitzt: a) einen Methhämoglobingehalt von weniger als 15 Gew.-%; b) einen Oxyhämoglobingehalt von weniger als oder gleich 10 Gew.-%; c) eine Endotoxinkonzentration von weniger als 0,5 Endotoxineinheiten/ml; d) weniger als oder gleich 15 Gew.-% polymerisiertes Hämoglobin mit einem Molekulargewicht von über 500.000 Daltons; e) weniger als oder gleich 10 Gew.-% polymerisiertes Hämoglobin mit einem Molekulargewicht unter 65.000 Daltons; und f) weniger als oder gleich 5 Gew.-% Hämoglobin mit einem Molekulargewicht unter 32.000 Daltons.
Andere Aspekte der Erfindung werden der Gegenstand von einer oder mehreren Ausscheidungsanmeldungen sein. Jedoch wurde aus Zweckmäßigkeit der Beschreibung der sich auf andere Aspekte beziehende Gegenstand im folgenden beibehalten, wobei die im vorliegenden gedeckten Erfindungsaspekte durch die Patentansprüche definiert sind.
Im vorliegenden beschriebene Ausführungsformen beziehen sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines stabilen polymerisierten Hämoglobin-Blutersatzes aus Vollblut, unter Verwendung einer Chromatographiesäule. Die Ausführungsformen betreffen auch ein Verfahren zur Konservierung der Stabilität eines Hämoglobin-Blutersatzes in einer Atmosphäre, die im wesentlichen von Sauerstoff frei ist. Die Ausführungsformen beziehen sich ferner auf eine Zusammensetzung, die ein stabiles polymerisiertes Hämoglobinprodukt umfasst, sowie eine stabile, polymerisiertes Hämoglobin und ein Reduktionsmittel umfassende stabile Lösung.
Bei einer Ausführungsform umfasst das Verfahren das Vermischen von Blut mit einem Antikoagulationsmittel unter Bitdung einer Blutlösung und das anschließende Waschen der roten Blutzellen in der Blutlösung zur Abtrennung kleiner Plasmaproteine von den roten Blutzöllen. Das Verfahren umfasst auch die Stufen der Abtrennung der gewaschenen roten Blutzellen von den weißen Blutzellen und des anschließende Zerreißen der roten Blutzellen zur Freisetzung von Hämoglobin und Bildung einer Hämoglobinlösung. Die Komponenten, welche sich von Hämoglobin unterscheiden, in der Hämoglobinlösung werden sodann in der Hämoglobinlösung durch Molekulargewichts-Fraktionierung mit Ultrafiltern mit einer nominellen MoIekulargewichts-Abtrennung von 100 kD und 30 kD und Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie unter Bildung eines Hämoglobineluats abgetrennt. Das Hämoglobineluat wird sodann deoxidiert und danach mit einem Reduktionsmittel unter Bildung einer Oxidations-stabilisierten deoxidierten Hämoglobinlösung in Berührung gebracht, welche danach mit einem Vernetzungsmittel vermischt wird, um ein Polymerisations-Reaktionsgemisch zu bilden. Das Polymerisations-Reaktionsgemisch wird danach stabilisiert und mit einer physiologischen Lösung und einem Reduktionsmittel diafiltriert, wobei die polymerisierte Hämoglobinlösung physiologisch verträglich gemacht wird, und wobei das Reduktionsmittel Spurenmengen von Sauerstoff unter Bildung des stabilen polymerisierten Hämoglobinersatzes abfängt.
Die erfindungsgemäßen Blutersatzstoffe können bei einem Verfahren zur Erhöhung der Gewebe-Sauerstoffanreicherung in einem Wirbeltiergewebe verwendet werden, wenn das Gewebe eine verringerte Strömung an roten Blutzellen hat, und wobei das Wirbeltier ein normovolämisches Blutvolumen und zumindest einen normalen systemischen vaskulären Widerstand hat, durch Einführung mindestens einer Dosis Hämoglobin in das Kreislaufsystem des Wirbeltiers.
Die Vorteile vorliegender Erfindung sind zahlreich. Ein Vorteil ist, dass das hergestellte Hämoglobin einen größeren Reinheitsgrad als bei den vorherigen Verfahren aufweist. Es ist im wesentlichen von regelmäßigen recalcitranten Proteinmaterialien, wie z. B. Carboanhytrase, frei. Infolgedessen kann das von einer Gattung abgeleitete Hämoglobin erfolgreich bei verschiedenen Gattungen als Blutersatz verwendet werden, ohne dass die Gattung des Empfängers bedeutsame Nebenwirkungen erleidet.
Der hergestellte stabile polymerisierte Hämoglobin-Blutersatz kann aus Rinderblut gewonnen werden, das in großen Mengen unter geringen Kosten zugänglich ist. Rinderhämoglobin hat den weiteren Vorteil, eine physiologisch relevante Sauerstoff-Bindungskurve zu besitzen, ohne die Notwendigkeit für chemische Modifizierungsmittel wie Pyridoxal-5-phosphat oder andere Chemikalien, welche zur Modifizierung der Sauerstoffaffinität menschlichen Hämoglobinserforderlich sind.
Ferner wird das polymerisierte Hämoglobin auch in höheren Ausbeuten mit geringeren Spiegeln an nicht-stabilisiertem Hämoglobin als bei den bisherigen Verfahren erhalten.
Überdies besitzt der hergestellte und gelagerte Blutersatz einen größeren Reinheitsgrad und eine längere Lebensdauer. Der Blutersatz ist bei Raumtemperatur für einen Zeitraum bis zu zwei Jahren oder mehr stabil. Der Blutersatz hat eine verhältnismäßig geringe Sauerstoffaffinität, eine erhöhte intravaskuläre Verweilzeit und einen geeignten onkotischen Druck.
Vorliegende Erfindung hat einen weiteren Vorteil bei der Verringerung der Wahrscheinlichkeit und des Ausmaßes von Gewebe- und/oder Organhypoxie sowie einer möglichen Gewebenekrose, welche von einer zumindest teilweisen Verminderung der Strömung roter Blutzellen (RBC) herrührt. Ein anderer Vorteil ist eine verbesserte Überlebensfähigkeit für ein Wirbeltier, das unter einer bedeutsamen Verminderung der RBC-Strömung zu einem lebenswichtigen Organ oder einem Teil deselben leidet. Vorliegende Erfindung ermöglicht auch die Durchführung von invasiven Verfahren, welche eine Beschränkung der RBC- Strömung erfordern, ohne die Sauerstoffanreicherung distalen Gewebes signifikant zu vermindern.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1A bis 1C stellen ein schematisches Fließdiagramm eines Verfahrens zur Herstellung eines stabilisierten polymerisierten Hämoglobin-Blutersatzes dar;
Fig. 2 ist ein Diagramm von ateriellem Sauerstoff pro Gramm roten Blutzelllen- Hämoglobins für akut normovolämische, blutverdünnte Beagle-Hunde, deren Milz entfernt war, welche Raumluft atmeten und mit verschiedenen Mengen Hämoglobin- Blutersatz oder einer synthetischen kolloiden Lösung (RHEOMACRODEX®- Kochsalzlösung) behandelt waren, welche aus 10% Dextran 40 und 0,9% Kochsalzlösung bestand.
Fig. 3 ist ein Diagramm des arteriellen Sauerstoff-Gesamtgehalts für akut normovolämische, blutverdünnte Beagle-Hunde, deren Milz entfernt war, und die Raumluft atmeten und mit verschiedenen Mengen Hämoglobin-Blutersatz oder einer synthetischen kolloiden Lösung (RHEOMACRODEX®-Kochsalzlösung) behandelt waren.
Fig. 4 ist ein Diagramm einer Sauerstofflieferung für akut normovolämische, blutverdünnte Beagle-Hunde mit entfernter Milz, welche Raumluft atmen und mit verschiedenen Mengen Hämoglobin-Blutersatz oder einer synthetischen kolloiden Lösung (RHEOMACRODEX®-Kochsalzlösung) behandelt waren.
Fig. 5 ist ein Diagramm durchschnittlicher Sauerstoffdrucke (in Torr) in hinterem Körpergliedgewebe (hind limb tissue) für die im Beispiels beschriebenen Versuchshunde unter folgenden Bedingungen: 1) Grundlinie mit einer mittleren RBC-Hämoglobin-(Hb)-Konzentration von 15.8 g/dl, 2) nach einer isovolämischen Blutverdünnung mit Hetastärke (hetastarch) auf eine mittlere RBC-Hämoglobin- Konzentration von 3,0 g/dl, 3) nach einer isovolämischen Blutverdünnung mit Hetastärke (auf eine mittlere RBC-Hämoglobin-Konzentration von 3,0 g/dl und Infusion einer Lösung polymerisierten Hämoglobins, um einen Anstieg der Plasma- Hb-Konzentration von etwa 0,6 g/dl zu erhalten, was zu einer Hämoglobin- Gesamtkonzentration von etwa 3,6 g/dl führt, 4) nach isovolämischer Blutverdünnung mit Hetastärke auf eine mittlere RBC-Hämoglobin-Konzentration von 3,0 g/dl und Infusion einer Lösung polymerisierten Hämoglobins zum Erreichen einer Erhöhung der Plasma-Hb-Konzentration auf etwa 1,6 g/dl zu erreichen, was zu einer Hämoglobin-Gesamtkonzentration von 4,6 g/dl führt, und 5) nach isovolämischer Blütverdünnung mit Hetastärke auf eine mittlere RBC-Hämoglobin- Konzentration von 3,0 g/dl und Infusion einer Lösung von polymerisiertem Hämoglobin, um einen Anstieg der Plasma-Hb-Konzentration von etwa 2,6 g/dl zu erreichen, was zu einer Hämoglobin-Gesamtkonzentration von 5,6 g/dl führt.
Fig. 6 ist ein Diagramm von durchschnittlichen Sauerstoffdrucken im hinteren Körpergliedgewebe (in Torr) für die Kontrollhunde im Vergleich zur Versuchsgruppe A der Hunde, beschrieben im Beispiel 10, für folgende Bedingungen: 1) Grundlinie, 2) 30 Minuten nach Einrichtung einer Stenose der Femoralarterie bei jedem Hund (d. h. eine 94%ige Stenose für die Versuchsgruppe A der Hunde, und eine 90-93%ige Stenose bei der Kontrollgruppe der Hunde), 3) 30 Minuten nach intravenöser Injektion von Mengen der Lösung des polymerisierten Hämoglobins in die Versuchshunde (oder äquivalenter Volumina von Hetastärkelösung in die Kontrollhunde), in das allgemeine Kreislaufsystem eines jeden Hundes proximal zu der Stenose in einer Menge, die ausreicht, die Plasma-Hämoglobin-Konzentration um etwa 0,5 g/dl zu erhöhen, und 4) 30 Minuten nach intravenöser Injektion von Mengen der Lösung des polymerisierten Hämoglobins in die Versuchshunde (oder äquivalenter Volumina der Hetastärkelösung in die Kontrollhunde), in das allgemeine Kreislaufsystem jeden Hundes proximal zur Stenose, in einer Menge, die zur Erhöhung der Plasma-Hämoglobin-Konzentration um etwa 1,2 g/dl ausreicht.
Fig. 7 ist ein Diagramm durchschnittlicher Sauerstoffdrucke (in Torr) im hinteren Körpergliedgewebe für die Versuchsgruppe B der Hunde, beschrieben in Beispiel 10, wobei in ein hinteres Körperglied jeden Hundes eine 94%ige Stenose der Famoralarterie nach intravenöser Injektion von Mengen der Lösung des polymerisierten Hämoglobins in das allgemeine Kreislaufsystem jeden Hundes proximal zur künftigen Stenose bewirkt wurde, und zwar in einer Menge, die ausreichend war, um die Hämoglobin-Gesamtkonzentration um etwa 2 g/dl zu erhöhen. Das Diagramm stellt die mittleren Sauerstoffdrucke in hinterem Körpergliedgewebe unter folgenden Bedingungen zur Verfügung: 1) Grundlinie, 2) 30 Minuten nach Einrichten einer 94%igen Femoralarterienstenose bei jedem Hund, und 3) 45 Minuten nach Einrichten einer 94%igen Femoralarterienstenose bei jedem Hund.

Detaillierte Beschreibung

Die Merkmale und andere Einzelheiten der Ausführungsformen werden nun unter Bezugnahme auf die Zeichnungen näher beschrieben und in den Patentansprüchen dargelegt. Es wird darauf hingewiesen, dass die speziellen Ausführungsformen zur Veranschaulichung und nicht als Begrenzungen gezeigt werden. Die Hauptmerkmale vorliegender Erfindung können in verschiedenen Ausführungsformen angewandt werden, ohne dass man sich aus dem Bereich vorliegender Erfindung begibt.
Wie im vorliegenden definiert, ist ein Blutersatz eine Sauerstoff tragende Zusammensetzung auf Basis von Hämoglobin zur Verwendung bei Menschen, Säugetieren und anderen Wirbeltieren, der fähig ist, Sauerstoff zumindest zu lebenswichtigen Organen und Gewebe zu transportieren und auf diese zu übertragen, und der einen ausreichenden intravaskulären onkotischen Druck aufrecht erhalten kann. Ein Wirbeltier ist so, wie es klassisch definiert ist, und schließt Menschen oder andere Wirbeltiere, welche Blut in einem Kreislaufsystem zur Übertragung von Sauerstoff auf ein Gewebe verwenden. Ein bevorzugtes Wirbeltier für das erfindungsgemäße Verfahren ist ein Säugetier, wie ein Primat, ein Hund, eine Katze, eine Ratte, ein Pferd, ein Schwein oder ein Schaf. Ein noch bevorzugteres Wirbeltier ist der Mensch. Ein mit dem erfindungsgemäßen Verfahren behandeltes Wirbeltier kann ein Fetus (prenatales Wirbeltier), ein postnatales Wirbeltier oder ein Wirbeltier zur Zeit seiner Geburt sein.
Ferner ist die Definition des Kreislaufsystems so, wie dieses klassisch definiert ist, bestehend aus dem Herzen, Arterien, Venen und dem Mikrokreislauf, der kleinere Gefäßstrukturen wie Kapillarien umfasst.
Ein durch das erfindungsgemäße Verfahren gebildeter Blutersatz hat Spiegel von Endotoxinen, Phospholipiden, Fremdproteinen und anderen Verunreinigungen, welche nicht zu einer signifikanten Reaktion des Immunsystems führen und die für den Empfänger nicht toxisch sind. Vorzugsweise ist ein Blutersatz ultrarein. Unter Ultrarein wird im vorliegenden verstanden, dass er weniger als 0,5 EU/ml Endotoxin, weniger als 3,3 nMole/ml Phospholipide und keine nachweisbaren Spiegel an Proteinen, die sich von Hämoglobin unterscheiden, wie z. B. Serumalbumin oder Antikörper, enthält.
Der Begriff "Endotoxin" bezieht sich auf die zellgebunden Lipopolysaccharide, gebildet als Teil der Außenschicht von Zellwänden gramnegativer Bakterien, die unter vielen Bedingungen toxisch sind. Wenn sie in Tiere injiziert werden, können Endotoxine Fieber, Diarrhöe, einen hämorrhagischen Schock und andere Gewebebeschädigung herbeiführen. Eine Endotoxineinheit (EU) wurde durch von der U.S.-Arzneimittelbuch-Konvention von 1983, S. 3014 als die Aktivität definiert, welche in 0,1 Nanogramm der U.S. Bezugsstandardmenge EC-5 enthalten ist. Eine Ampulle EC-5 enthält 10.000 EU.
Beispiele für geeignete Mittel zur Bestimmung von Endotoxin-Konzentrationen in einem Blutersatz umfassen das Verfahren "Kinetic/Turbidimetric Limuus Amebocytic Lystat (LAL) 5000 Methodology", entwickelt von Associates of Cape Cod, Woods Hole, Massachusetts, U.S.A..
Stabiles polymerisiertes Hämoglobin, wie hierin definiert, ist eine Sauerstofftragende Zusammensetzung auf Basis von Hämoglobin, welche die Molekulargewichtsverteilung und/oder den Methämoglobingehalt während Lagerungszeiträumen bei geeigneten Lagerungstemperaturen während Zeiträumen von 2 Jahren und mehr nicht wesentlich erhöht oder senkt, und vorzugsweise während Zeiträumen von zwei Jahren oder mehr, wenn sie in einer Umgebung mit geringem Sauerstoff gelagert wird. Geeignete Lagerungstemperaturen für die Lagerung von einem Jahr oder mehr liegen zwischen 0ºC und etwa 40ºC. Die bevorzugte Lagerungstemperatur liegt im Bereich zwischen etwa 4ºC und etwa 30ºC.
Eine geeignete Umgebung geringen Sauerstoffs ist als die kumulative Menge von Sauerstoff im Kontakt mit dem Blutersatz innerhalb einer Lagerungsperiode von mindestens einem Jahr definiert, welche zu einer Methämoglobinkonzentration von weniger als etwa 15 Gew.-% in dem Blutersatz führt. Die kumulative Sauerstoffmenge umfasst Sauerstoff, der aufgrund einer Undichtigkeit in die Verpackung des Blutersatzes eindringt, und den ursprünglichen Sauerstoffgehalts des Blutersatzes und der Verpackung. Dieses Verfahren hindurch, von dem RBC- Sammeln bis zur Hämoglobinpolymerisation, werden die Blutlösung, RBC's und Hämoglobin unter Bedingungen gehalten, die ausreichen, Mikrobenwachstum oder die Biobelastung zu minimieren, z. B. Aufrechterhalten einer Temperatur bei weniger als etwa 20ºC und oberhalb 0ºC. Vorzugsweise wird die Temperatur bei etwa 15ºC oder weniger gehalten. Bevorzugter wird die Temperatur auf 10 ± 2ºC gehalten.
Bei diesem Verfahren werden Teile der Komponenten für das Verfahren zur Herstellung von Lösungen aus polymerisiertem Hämoglobin, und hiervon abgeleitete Blutersatzstoffe zur Herstellung eines sterilen Produkts ausreichend keimfrei gemacht. Steril bedeutet wie auf dem Fachgebiet definiert, speziell, dass die Lösung die Erfordernisse für Sterilität gemäß dem U.S.-Arzneimittelbuch, welche in USP XXII, Abschnitt 71, Seiten 1483-1488 vorgesehen sind, erfüllt. Ferner werden Teile von Komponenten, die dem Verfahrensstrom ausgesetzt sind, üblicherweise aus einem Material hergestellt oder mit diesem ausgekleidet, das nicht mit dem Verfahrensstrom reagiert oder diesen verunreinigt. Solche Materialien können rostfreien Stahl und andere Stahllegierungen, wie z. B. Inconel, umfassen.
Ein Verfahren zur Herstellung eines stabilen polymerisierten Hämoglobin- Blutersatzes, das System 10, ist in den Fig. 1A bis 1C veranschaulicht. In Fig. 1A umfasst das System 10 das Blutbeschickungs-Untersystem 12. Das Blutbeschickungs-Untersystem 12 umfasst einen Filter 14. Beschickungsbehälter 16, eine Beschickungspumpe 18 und Vorfilter 20, 22 in Reihe. Der Beschickungsbehälter 16 ist mit einer Blutlösung gefüllt, welche rote Blutzellen (RBC's) oder Hämoglobin und mindestens ein Antikoagulationsmittel umfasst.
Geeignete RBC oder Hämoglobinquellen, welche im System 10 verarbeitet werden können, umfassen neues, altes oder veraltetes menschliches Blut, Rinderblut, Schafsblut, Schweineblut, Pferdeblut sowie Blut von anderen Wirbeltieren sowie transgen hergestelltes Hämoglobin, wie z. B. das in BIO/TECHNOLGY, 12: 55-59 (1994) beschriebene transgene Hb und das rekombinant hergestellte Hämoglobin (Nature, 356: 258-60 (1992)).
Das Blut kann von lebenden oder frisch geschlachteten Spendern gesammelt werden. Ein Verfahren zum Sammeln von Rindervollblut ist in den U.S.-Patenten 5.084.558 und 5.296.465, erteilt an Rausch u. a., beschrieben. Es wird bevorzugt, dass das Blut auf eine sterile Art und Weise gesammelt wird.
Beim Sammeln oder bald danach wird das Blut mit mindestens einem Antikoagulationsmittel vermischt, um ein deutliches Verklumpen des Bluts zu vermeiden. Geeignete Antikoagulanzien für Blut sind die auf dem Fachgebiet bekannten klassischen; sie umfassen z. B. Natriumcitrat, Ethylendiamintetraessigsäure und Heparin. Wenn sie mit dem Blut vermischt werden, können die Antikoagulanzien in einer festen Form, wie z. B. als Pulver, oder in wässeriger Lösung vorliegen.
Es wird darauf hingewiesen, dass die Blutlösungsquelle von einer frisch gesammelten Probe oder von einer alten Probe sein kann, wie z. B. verfallenes Menschenblut von einer Blutbank. Ferner kann die Blutlösung zuvor in gefrorenem und/oder flüssigen Zustand gehalten worden sein. Es wird bevorzugt, dass die Blutlösung vor Verwendung in diesem Verfahren nicht gefroren wird.
Bei einer anderen Ausführungsform werden vor der Einführung der Blutlösung in den Beschickungsbehälter 16 die Antibiotikaspiegel in der Blutlösung, wie z. B. von Penecillin, getestet. Antibiotikaspiegel werden bestimmt, um einen Sicherheitsgrad bereitzustellen, dass die Blutprobe nicht mit einem infizierenden Organismus belastet ist, indem man nachweist, dass der Spender der Blutprobe nicht mit einem Antibiotikum behandelt war. Beispiele für geeignete Tests auf Antibiotika umfassen einen Penicillin-Testausstattung (Difco, Detroit, MI, U.S.A.) unter Anwendung eines Verfahrens des Titels "schneller Nachweis von Penicillin in Milch". Es wird bevorzugt, dass Blutlösungen einen Penicillinspiegel von weniger als oder gleich etwa 0,008 Einheiten/ml enthalten. Es kann aber auch ein Herdlen- Managementprogramm zur Überwachung des Fehlens einer Erkrankung des Viehs oder der antiobiotischen Behandlung des Viehs angewandt werden.
Vorzugsweise wird vor oder während der Füllung des Beschickungsbehälters 16 die Blutlösung filtriert, um große Aggregate und Teilchen zu entfernen. Ein Sieb mit einer Maschenweite von 600 mesh ist ein Beispiel für einen geeigneten Filter.
Um zur Fig. 1A zurückkehren: die Beschickungspumpe 18 saugt die Blutlösung in den Beschickungsbehälter 16 und zieht die Blutlösung durch in Reihe geschaltete Vorfilter 20, 22 zur Entfernung großer Blutlösungs-Trümmer eines Durchmessers von annähernd 50 Mikrometern (um) oder mehr in den Diafiltrationsbehälter 24 zur Vorbereitung des Waschens der in der Blutlösung enthaltenen RBC's ab. Beispiele für geeignete Vorfilter in Reihe sind 800 um und 50 um Polypropylenfilter. Die Vorfiltrierung der Blutlösung durch in Reihe geschaltete Vorfilter 20, 22 wird zur Verbesserung der Verfahrenswirksamkeit bevorzugt. Bei einer anderen Ausführungsform wird die Blutlösung nicht vorfiltriert, sondern große Trümmer werden vielmehr durch eine anschließende Ultrafiltration und/oder chromatographische Reinigungsstufen entfernt.
Die RBC's in der Blutlösung werden sodann mit geeigneten Mitteln gewaschen, wie z. B. durch Diafiltrieren oder durch eine Kombination einzelner Verdünnungs- und Konzentrationsstufen mit mindestens einer isotonischen Lösung, um die RBC's von extrazellularen Plasmaproteinen wie Serumalbuminen oder Antikörpern (wie z. B. Immunoglobulin (IgG)) abzutrennen. Die RBC's können auf eine kontinuierliche oder diskontinuierliche Beschickungsweise gewaschen werden.
Annehmbare isotonische Lösungen sind bekannt und umfassen Lösungen wie eine Citrat/Kochsalzlösung mit einem pH-Wert und einer Osmolarität, welche die Zellmembranen der RBC's nicht zerreißen und die den Plasmateil des Vollbluts ersetzen. Eine bevorzugte isotonische Lösung hat einen neutralen pH-Wert und eine Osmolarität zwischen etwa 285-315 mOsm. Bei einer bevorzugten Ausführungform setzt sich die isotonische Lösung aus einer wässerigen Lösung von Natriumcitratdihydrat (6,0 g/Liter) und Natriumchlorid (8,0 g/Liter) zusammen. Das beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Wasser kann destilliertes Wasser, entionisiertes Wasser, Wasser zur Injektion (WFI) und/oder niedrig-pyrogenes Wasser (LPW) sein. WFI, das bevorzugt wird, ist entionisiertes, destilliertes Wasser, das die Anforderungen der U.S. Pharmakologischen Spezifikationen für Wasser zur Injektion erfüllt WFI ist ferner in Pharmaceutical Engineering, 11, 15-23 (1991) beschrieben. LPW, das bevorzugt wird, ist entionisiertes Wasser mit einem Gehalt an weniger als 0,002 EU/ml.
Es wird bevorzugt, dass die isotonische Lösung vor der Zugabe zur Blutlösung filtriert wird. Beispiele für geeignete Filter umfassen eine Millipore 10.000 Dalton-Ultrafiltrationsmembran, wie z. B. einen Millipore Cat # CDUF 050 G1-Filter oder eine A/G Technology-Hohlfaser, 10.000 Dalton (Cat # UFD-10-C-85).
Um auf Fig. 1A zurückzukommen: das Zellwasch-Untersystem 26 enthält den Diafiltrationsbehälter 24, die Diafiltrationsschleife 28, die Ablaufleitung 30 und die Pumpe 32. Geeignete Pumpen umfassen ein Waukeshaw-Modell W30 mit 100 Gallonen pro Minute. Die Pumpe 32 saugt Flüssigkeit aus dem Diafiltrationsbehälter 24 ab und zieht sie durch die Diafiltrationsschleife oder Abzugsleitung 30 ab. Die Diafiltrationsschleife 28, welche den Dyafilter 34 umfasst, führt die Strömung von der Pumpe 32 zum Diafiltrationsbehälter 24 zurück. Die Temperatur innerhalb des Diafiltrationsbehälters 24 kann durch Kühlen der Außenseite des Diafiltrationsbehälters 24 unter Verwendung eines Mantelkühlsystems mit Ethylenglycol (nicht gezeigt) aufrecht erhalten werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden RBC's in der Blutlösung durch Diafiltration gewaschen. Die im Diafiltrationsbehälter 24 enthaltene Blutlösung wird durch die Pumpe 32 durch die Diafiltrationsschleife 28 hindurch im Kreislauf geführt, wobei die Blutlösung durch den Verlust des Filtrats durch den Diafilter 34 konzentriert wird. Geeignete Diafilter umfassen mikroporöse Membranen mit Porengrößen, welche RBC's von wesentlich kleineren Komponenten der Blutlösung abtrennen, wie beispielsweise ein 0,1 um bis 0,5 um Filter (wie z. B. ein 0,2 um Hohlfaserfilter, eine Mikrofiltrations-Hülse Microgon Krosflo II. Gleichzeitig wird filtrierte isotonische Lösung kontinuierlich (oder absatzweise) zur Ergänzung mit einer Rate zugegeben, die der Rate (oder dem Volumen) des durch den Diafilter verlorenen Filtrats gleich ist. Während des Waschens von RBC's gehen Komponenten der Blutlösung, welche einen bedeutend kleineren Durchmesser als die RBC's besitzen, oder Flüssigkeiten wie Plasma sind, durch die Wände des Diafilters 34 im Filtrat. RBC's, Blutplättchen und größere Körper der verdünnten Blutlösung, wie z. B. weiße Blutzellen, werden zurückgehalten und mit isotonischer Lösung vermischt, welche kontinuierlich oder absatzweise zur Bildung einer dialysierten Blutlösung zugegeben wird.
Bei einer bevorzugteren Ausführungsform wird das Volumen der Blutlösung im Diafiltrationsbehälter 24 anfangs durch Zugabe eines Volumens einer filtrierten isotonischen Lösung zum Diafiltrationsbehälter 24 verdünnt. Vorzugsweise ist das Volumen der zugegebenen isotonischen Lösung dem Anfangsvolumen der Blutlösung etwa gleich.
Bei einer alternativen Ausführungsform werden die RBC's durch eine Reihe von aufeinander folgenden (oder umgekehrt aufeinander folgenden) Verdünnungs- und Konzentrationsstufen gewaschen, wobei die Blutlösung durch Zugabe mindestens einer isotonischen Lösung verdünnt und durch Durchströmen eines Filters konzentriert wird, wobei sich eine dialysierte Blutlösung bildet.
Das RBC-Waschen ist vollständig, wenn der Spiegel an, Plasmaproteinen, welche die RBC's verunreinigen, signifikant herabgesetzt wurde, typischerweise um etwa 90%. Das RBC-Waschen ist typischerweise vollständig, wenn das Volumen des aus dem Diafilter 34 abgezogenen Filtrats etwa 300% oder mehr des Volumens der Blutlösung gleich ist, welche vor der Verdünnung der Blutlösung mit filtrierter isotonischer Lösung im Diafiltrationsbehälter 24 enthalten war. Um nochmals auf Fig. 1A zurückzukommen: das Volumen des durch den Diafilter 34 abgezogenen Filtrats wird durch einen Abzugsleitung-Strömungsmesser (nicht gezeigt) gemessen. Zusätzliches RBC-Waschen kann ferner extrazelluläre Plasmaproteine von den RBC's abtrennen. Beispielsweise kann eine Diafiltrierung mit 6 Volumina isotonischer Lösung mindestens etwa 99% IgG aus der Blutlösung entfernen.
Die dialysierte Blutlösung wird sodann Mittel zum Abtrennen der RBC's in der dialisierten Blutlösung von den weißen Blutzellen und Blutplättchen ausgesetzt, wie z. B. einer Zentrifugierung. In Fig. 1A wird die dialisierte Blutlösung durch die Pumpe 32 vom Diafiltrationsbehälter 24 kontinuierlich zu einer Zentrifuge 36 gepumpt, welche betrieben wird, während gleichzeitig dialisierte Blutlösung durch die Pumpe 32 zugeführt wird, um die RBC's von den weißen Blutzellen und Blutplättchen abzutrennen. Während des Betriebs dreht sich die Zentrifuge 36 mit einer Geschwindigkeit, welche ausreicht, um die RBC's in eine schwere RBC-Phase zu trennen, während auch ein wesentlicher Teil der weißen Blutzellen (WBC's) und Blutplättchen in eine leichte WBC-Phase abgetrennt wird. Eine Fraktion der RBC- Phase und der WBC-Phase werden kontinuierlich von der Zentrifuge 36 während des Betriebs getrennt abgezogen. Geeignete Zentrifugen umfassen z. B. eine Sharples Super Centrifuge, Modell # AS-16, ausgestattet mit einem Ringdamm #28.
Selbstverständlich können andere auf dem Fachgebiet zur Abtrennung von RBC's von anderen Blutkomponenten bekannte Verfahren angewandt werden, wie z. B. ein Absetzen, wobei das Trennverfahren die Zellmembranen einer signifikanten Menge der RBC's nicht zerreißt, wie z. B. weniger als 30% der RBC's, vor der RBC- Abtrennung von den anderen Blutkomponenten.
Nach der Abtrennung der RBC's werden diese mit einem Mittel zur Lyse von RBC's lysiert, um Hämoglobin aus den RBC's unter Bildung einer hämoglobinhaltigen Lösung freizusetzen. Die Mittel zur Lyse können verschiedene Lyseverfähren umfassen, wie z. B. eine mechanische Lyse, chemische Lyse, hypotonische Lyse oder andere bekannte Lyseverfähren, welche Hämoglobin ohne signifikante Beschädigung der Fähigkeit von Hb, Sauerstoff zu transportieren und freizusetzen, freisetzen.
Um auf Fig. 1A zurückzukommen: Es wird bevorzugt, dass ein wesentlicher Teil der in der RBC-Phase enthaltenen RBC's mechanisch lysiert werden, wenn sie aus der Zentrifuge 36 abgelassen werden. Die Zellmembranen der RBC's reißen beim Aufprall auf eine in der Regel steife Oberfläche oder Struktur, wie z. B. auf die Wand der Abzugsleitung 38 für die RBC-Phase, wodurch Hämoglobin (Hb) aus den RBC's in die RBC-Phase freigesetzt wird. Bei einer bevorzugteren Ausführungsform steht die Strömung der RBC-Phase durch die Abzugsleitung 38 für die RBC-Phase in einem Winkel zur Strömung der RBC-Phase aus der Zentrifuge 36, wodurch bewirkt wird, dass ein wesentlicher Teil der RBC's mechanisch durch Aufprall auf die Innenfläche der Abzugsleitung 38 lysiert wird.
Bei einer weiteren Ausführungsform kann rekombinant gebildetes Hämoglobin, wie z. B. das in Nature, 356: 258-260 (1992) beschriebene, rekombinant gebildete Hämoglobin anstelle von RBC's verarbeitet werden. Die das Hämoglobin enthaltenden Bakterienzellen werden gewaschen und wie zuvor beschrieben von Verunreinigungen getrennt. Diese Bakterienzellen werden sodann durch bekannte Mittel mechanisch zerrissen, wie z. B. mit einer Kugelmühle, um Hämoglobin aus den Zellen freizusetzen und eine lysierte Zellphase zu bilden. Diese lysierte Zellphase wird sodann als solche verarbeitet.
Im Anschluss an die Lyse wird die lysierte RBC-Phase zur Entfernung größerer Zelltrümmer, wie z. B. von Proteinen mit einem Molekulargewicht oberhalb etwa 100.000 Daltons ultrafiltriert. In der Regel umfassen Zelltrümmer alle ganzen und fragmentierten Zellkomponenten mit Ausnahme von Hb, kleineren Zellproteinen, Elektrolyten, Coenzymen und organischen Stoffwechsel-Zwischenprodukten. Annehmbare Ultrafilter umfassen z. B. 100.000 Dalton Filter, hergestellt von Millipore (Cat # CDUF 050 H1) und von A/G Technology (Needham, MA, U.S.A.; Modell Nr. UFP100E55).
Wie in Fig. 1A gezeigt, strömt sodann die lysierte RBC-Phase in die Abzugsleitung 38 für die RBC-Phase, wonach sie durch die Pumpe 39 durch die Klärungs-Nebenleitung 40 in den Behälter 42 gepumpt wird. Die lysierte RBC-Phase im Behälter 42 wird sodann durch die Pumpe 44 durch den Ultrafilter 46 gepumpt. Ein wesentlicher, in der lysierten RBC-Phase enthaltener Teil von Hb und Wasser durchdringenden Ultrafilter 46 unter Bildung eines Hb-Ultrafiltrats, während größere Zelltrümmer, wie z. B. Zellmembranen und Proteine mit einem Molekulargewicht oberhalb etwa 100.000 Daltons, zurückgehalten und in den Behälter 42 rückgeführt werden. Gleichzeitig wird Wasser kontinuierlich zum Behälter 42 zugegeben, als Ergänzung für mindestens einen Teil der im Hb-Ultrafiltrat verlorenen Flüssigkeit.
Es wird bevorzugt, dass die Ultrafiltration fortgesetzt wird, bis die Konzentration von Hb im Behälter 42 weniger als 8 g/Liter (g/l) ist, um die Ausbeute am für die Polymerisation zur Verfügung stehendem Hämoglobin zu maximieren. Andere Verfahren zur Abtrennung von Hb von der lysierten RBC-Phase können angewandt werden, einschließlich ein Absetzen, Zentrifugieren oder eine Mikrofiltrierung. Die Temperatur des Behälters 42 wird durch geeignete Mittel gesteuert, wie z. b. durch Kühlen der Außenseite des Behälters 42 unter Verwendung eines Mantelkühlsystems mit Ethylenglycol (nicht gezeigt).
Bei einer alternativen Ausführungsform strömt die lysierte RBC-Phase von der Abzugsleitung 38 für die RBC-Phase durch die Klärleitung 47 in die statische Mischvorrichtung 48. Gleichzeitig mit der Übertragung der RBC-Phase zur statischen Mischvorrichtung 48 wird auch Wasser in die statische Mischvorrichtung 48 eingespritzt, vorzugsweise eine annähernd gleiche Menge, mit einer nichtgezeigten Vorrichtung, wobei das Wasser sodann unter niederen Scherbedingungen mit der RBC-Phase unter Bildung eines lysierten RBC-Kolloids vermischt wird.
Selbstverständlich können auch andere Vorrichtungen zum Vermischen unter geringer Scherkraft, welche bekannt sind, verwendet werden, vorausgesetzt, dass die Mischvorrichtung keine wesentliche Menge der RBC-Membranen, die in der lysierten RBC-Phase vorliegen, während des Vermischens zertrümmert.
Das lysierte RBC-Kolloid wird sodann durch die Pumpe 50 von der statischen Mischvorrichtung 48 in eine geeignete Vorrichtung zur Abtrennung von Hb von den RBC-Komponenten, die sich von Hämoglobin unterscheiden, gepumpt, wie z. B. eine Absetzvorrichtung oder Zentrifuge 52, welche betrieben wird, um das Hb von den RBC-Membranen, mit Proteinen verbundenen Membranen und anderen Komponenten abzutrennen. Die Zentrifuge 52 dreht sich mit einer Geschwindigkeit, die ausreicht, um das lysierte RBC-Kolloid in eine leichte Hb-Phase und eine schwere Hb-Phase zu trennen. Die leichte Phase setzt sich aus Hb zusammen und enthält typischerweise von Hämoglobin verschiedene Komponenten mit einer Dichte, welche der Dichte von Hb annähernd gleich oder weniger als diese ist. Ein Beispiel für eine akzeptable Zentrifuge ist eine "Sharples Super Zentrifuge, Modell, AS-16" von Sharples Division der Firma Alfa-Laval Separation, Inc.. Die Hb-Phase fließt von der Zentrifuge 52 während der Abtrennung von Hb kontinuierlich ab und wird im Lagerungsbehälter 54 zur Vorbereitung für die Hb-Reinigung gesammelt. Bei einer anderen Ausführungsform fördert die Pumpe 55 sodann die Hb-Phase von dem Lagerungsbehälter 54 durch den Mikrofilter 56, wobei das Hb in der Hb-Phase aus dem Zellstroma unter Erhalt eines Hb-Mikrofiltrats in Querströmung abfiltriert wird. Das Zellstroma wird sodann mit dem Rückstand auf den Mikrofilter 56 zum Lagerungstank 54 rückgeführt. Geeignete Mikrofilter umfassen einen 0,45 u Mikrofilter "Millipore Pellicon Cassette, Cat # HVLP 000 C5". Die Temperatur des Lagerungsbehälters 54 wird durch geeignete Mittel gesteuert, wie z. B. durch Kühlen der Außenseite des Lagerungsbehälters 54 unter Verwendung eines Mantelkühlsystems mit Ethylenglycol (nicht gezeigt). Zur Optimierung der Leistung dieses Verfahrens ist die Mikrofiltration vollständig, wenn der Flüssigkeitsdruck am Einlass des Mikrofilters 56 von einem Anfangsdruck von etwa 10 psi auf etwa 25 psi ansteigt. Die Pumpe 58 fördert dann das Hb-Mikrofiltrat vom Mikrofilter 56 in den Behälter 42, wonach das Hb-Mikrofiltrat durch den Ultrafilter 46 unter Bildung eines Hb-Ultrafiltrats ultrafiltriert wird.
Das Hb-Ultrafiltrat wird sodann zur Entfernung kleinerer Zelltrümmer, wie z. B. von Elektrolyten, Coenzymen. Stoffwechsel-Zwischenprodukten und Proteinen mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 30.000 Daltons und Wasser aus dem Hb-Ultrafiltrat ultrafiltriert. Geeignete Ultrafilter umfassen einen 30.000 Dalton Ultrafilter (Millipore Cat # CDUF 050 T1 und/oder Armicon, # 540 430).
Um auf die Fig. 1B zurückzukommen: das Hb-Ultrafiltrat wird durch die Pumpe 60 in den Ultrafiltratbehälter 62 gepumpt. Das Hb-Ultrafiltrat wird sodann durch die Pumpe 64 durch den Ultrafilter 66 rückgeführt und zurück in den Ultrafiltrationsbehälter 62, wobei sich ein Hb-Rückstand bildet, der typischerweise eine konzentrierte Hb-Lösung ist.
Vorzugsweise wird die Ultrafiltration fortgesetzt, bis die Konzentration von Hb im Ultrafiltratbehälter gleich 100 g/Liter ist, um die Wirksamkeit der nachfolgenden Reinigungsstufen zu verbessern.
Um das Hämoglobin weiter durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie von anderen Verunreinigungen, wie z. B. Antikörpern, Endotoxinen. Phospholipiden, Enzymen und Viren abzutrennen, wird die konzentrierte Hb-Lösung sodann in eine oder mehrere parallele Chromatographiesäulen geleitet.
Die konzentrierte Hb-Lösung wird sodann von dem Ultrafiltratbehälter 52 durch die Pumpe 68 auf das in Chromatographiesäulen 70 enthaltene Medium geleitet, um das Hb von Verunreinigungen abzutrennen. Die Chromatographiesäule 70 muss ein Volumen eines Mediums enthalten, das geeignet ist und ausreicht, um Hb von den sich von Hämoglobin unterscheidenen Komponenten des Ultrafiltrats abzutrennen. Beispiele für geeignete Medien umfassen Anionenaustauscher, Kationenaustauscher, hydrophobe Interaktionsmedien und Affinitätsmedien. Bei einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die Chromatographiesäulen 70 ein zur Abtrennung von Hb von Proteinen, die sich von Hb unterscheiden, geeignetes Anionenaustauschermedium. Geeignete Anionenaustauschermedien umfassen z. B. Kieselsäure, Aluminiumoxid, Titandioxidgel, vernetztes Dextran, Agarose oder einen derivatisierten Rest, wie z. B. ein Polyacrylamid, ein Polyhydroxyethyl-methacrylat oder ein Styrol-Divinylbenzol, der mit einer kationischen chemischen Funktionalität, wie z. B. einer Diethylaminoethyl- oder quartären Aminoethylgruppe, derivatisiert wurde. Ein geeignetes Anionenaustauschermedium und entsprechende Elutionsmittel für die selektive Absorption und Desorption von Hb im Vergleich zu anderen Proteinen und Verunreinigungen, welche wahrscheinlich in der lysierten RBC-Phase vorhanden sind, sind vom Durchschnittsfachmann leicht bestimmbar. Bei einer bevorzugteren Ausführungsform wird ein Verfahren angewandt, um ein Anionenaustauschermedium aus Silicagel zu bilden, das hydrothermisch zur Erhöhung der Porengröße behandelt, γ-Glycidoxypropyltrimethoxysilan unter Bildung aktiver Epoxidgruppen und sodann Dimethylaminoethanol (HOCH&sub2;CH&sub2;N(CH&sub3;)&sub2;) ausgesetzt wird, unter Bildung eines quartären Ammonium-Anionenaustauschermediums. Dieses Verfahren ist in Journal of Chromatography, 120: 321-333 (1976) beschrieben.
Die Chromatographiesäulen 70 werden zuerst durch Spülen der Chromatographiesäulen 70 mit einem ersten Elutionsmittel vorbehandelt, welches die Hb-Bindung erleichtert. Sodann wird eine konzentrierte Hb-Lösung auf das Medium in den Säulen 70 aufgetragen. Nach Auftragen der konzentrierten Hb- Lösung werden die Chromatographiesäulen 70 sodann nacheinander mit verschiedenen Elutionsmitteln durch die Chromatographiesäulen 70 gewaschen, um ein getrenntes, gereinigtes Hb-Eluat herzustellen.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird in den Chromatographiesäulen 70 zur Abtrennung von Proteinverunreinigungen, wie z. B. des Enzyms Carboanhydrase, von Phospholipiden, Antikörpern und Endotoxinen vom Hb ein pH- Gradient angewandt. Jeder einer Reihe von Puffern mit verschiedenen pH-Werten wird durch die Chromatographiesäulen 70 zur Schaffung eines pH-Gradienten innerhalb des Mediums in der Chromatographiesäule 70 geleitet. Es wird bevorzugt, dass die Puffer filtriert werden, wie z. B. mit einer Depyrogenierungsmembran von 10.000 Dalton. Die zur Abtrennung von Hb benutzten Puffer sollten eine geringe Ionenstärke besitzen, so dass die Elution von Hb und sich von Hämoglobin unterscheidenden Verunreinigungen in der Regel vom pH-Wert und nicht signifikant von der Ionenstärke abhängig ist. Typischerweise besitzen Puffer mit einer Ionenkonzentration von etwa 50 mM oder weniger eine geeignete niedere Ionenstärke.
Der erste Puffer transportiert die konzentrierte Hb-Lösung in das Medium in den Chromatographiesäulen 70 und erleichtert das Binden von Hb an das Medium. Der zweite Puffer stellt sodann den pH-Wert innerhalb der Chromatographiesäulen 70 zur Elution von verunreinigenden Komponenten, die sich von Hämoglobin unterscheiden aus den Chromatographiesäulen 70 ein, während das an das Medium gebundene Hb aufrechterhalten wird. Der dritte Puffer eluiert sodann das Hb aus den Chromatographiesäulen 70. Das Hb-Eluat wird sodann im Behälter 76 gesammelt. Es wird bevorzugt, dass das Hb-Eluat durch einen sterilen Filter, wie z. B. den sterilen Filter 77, vor weiterer Verwendung geleitet wird. Geeignete sterile Filter umfassen 0,22 um Filter, wie z. B. einen Filter "Sartorius Sartobran pH Cat # 5232507 G1PH".
Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden die ersten 3-4% des Hb- Eluats und die letzten 3-4% des Hb-Eluats verworfen, um die Sicherheit der Reinheit des Hb-Eluats bereitzustelllen. Wenn die Chromatographiesäulen 70 wieder verwendet werden sollen, werden die verunreinigenden, sich von Hämoglobin unterscheidenden Proteine und Endotoxin, welche auf den Chromatographiesäulen zurückbleiben, sodann mit einem vierten Puffer eluiert. Der vierte Puffer braucht nicht eine geringe Ionenstärke aufzuweisen, da das Hb schon abgetrennt und aus den Chromatographiesäulen 70 eluiert wurde.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist der erste Puffer eine Lösung von Trishydroxymethylaminomethan (Tris-Lösung) (Konzentration: etwa 20 mM; pH-Wert etwa 8,4 bis etwa 9,4). Der zweite Puffer ist ein Gemisch des ersten Puffers mit einem dritten Puffer, wobei der zweite Puffer einen pH-Wert von etwa 8,2 bis etwa 8,6 aufweist. Der dritte Puffer ist eine Tris-Lösung (Konzentration: etwa 50 mM; pH- Wert: etwa 6,5 bis etwa 7,5). Der vierte Puffer ist eine NaCl/Tris-Lösung (Konzentrationen: etwa 1,0 M NaCl und etwa 20 mM Tris; pH-Wert: etwa 8,4 bis etwa 9,4, vorzugsweise etwa 8,9 bis 9,1). Es wird besonders bevorzugt, dass der pH-Wert des zweiten Puffers zwischen etwa 8,2 und etwa 8,4 liegt.
Typischerweise werden die Puffer bei einer Temperatur zwischen etwa 0ºC und etwa 50ºC verwendet. Vorzugsweise beträgt die Puffertemperatur etwa 12.4 ± 1,0ºC während der Verwendung. Zusätzlich werden die Puffer typischerweise bei einer Temperatur von etwa 9ºC bis etwa 11ºC gelagert.
Das Hb-Eluat wird sodann vor der Polymerisation unter Bildung einer deoidierten Hb-Lösung (im folgenden als Deoxy-Hb bezeichnet) durch ein Mittel von Sauerstoff befreit, das im wesentlichen das Hb von Sauerstoff befreit, ohne eine signifikante Verminderung der Fähigkeit von Hb im Hb-Eluat Sauerstoff zu transportieren und freizugeben, was bei der Denaturierung oder Bildung von oxidiertem Hämoglobin (MetHb) auftritt.
Bei einer Ausführungsform wird das Hb-Eluat durch Gastransfer eines Inertgases durch eine Phasentransfermembran von Sauerstoff befreit. Derartige Inertgase umfassen z. B. Stickstoff, Argon und Helium. Selbstverständlich können auch andere Mittel zur Deoxidierung einer Lösung von Hämoglobin, welche bekannt sind, benutzt werden, um das Hb-Eluat von Sauerstoff zu befreien. Derartige andere Mittel können z. B. ein Spülen des Hb-Eluats mit Stickstoff; oder eine Photolyse durch Licht; eine chemische Reinigung mit Reduktionsmitteln wie Sulfhydrylverbindungen, wie z. B. N-Acetyl-L-cystein (NAC), D,L-Cystein, γ-Glutamylcystein, Glutathion, 2-Mercapotethanol, 2,3-Dimercapto-1-proponal, 1,4-Butandithiol, Thioglycalat, Dithioerythrit, Ditherythrit und andere biologisch verträgliche Sulfhydrylverbindungen; Citatsalze, Citronensäure; reduziertes Nikotinamidadenindinukleotid (NADH&sub2;); reduziertes Nikotinamidadenindinukleotidphosphat (NADPH&sub2;); reduziertes Flavinadenindinukleotid (FADH&sub2;) und andere biologisch verträgliche Reduktionsmittel umfassen.
Um auf Fig. 1B zurückzukommen: die Befreiung von Sauerstoff wird innerhalb des Hb-Deoxydierungs-Untersystems 78 erreicht. Das Hb-Deoxydierungs- Untersystem 78 umfasst einen Behälter 76, eine Pumpe 80, eine Rückführungsleitung 82, eine Phasentransfermembran 86 sowie eine Abzugsleitung 90. Die Pumpe 80 saugt das Hb-Eluat im Behälter 76 ab und zieht es durch die Umlaufleitung 82 oder durch die Abflussleitung 90 ab. Durch die Pumpe 80 vom Behälter 76 durch die Umlaufleitung 82 abgepumptes Hb-Eluat fließt sodann durch den Ultrafilter 84 und/oder die Phasentransfermembran 86, welche parallel angeordnet sind, und kehrt danach zum Behälter 76 zurück. Nach der Elution aus der Chromatographiesäule 70 wird das Hb-Eluat vorzugsweise eingeengt, um die Wirksamkeit des Verfahrens zu verbessern. Das Hb-Eluat wird durch den Ultrafilter 84 zum Einengen des Hb-Eluats unter Bildung einer konzentrierten Hb-Lösung im Umlauf geführt. Geeignete Ultrafilter umfassen z. B. Ultrafilter von 30.000 Dalton oder weniger (wie z. B. Millipore Helocon, Cat # CDUF 050 G1. Amicon Cat # 540430).
Typischerweise ist die Konzentration des Hb-Eluats vollständig, wenn die Konzentration an Hb zwischen etwa 100 bis etwa 120 g/Liter liegt. Beim Einengen des Hb-Eluats wird die Temperatur desselben vorzugsweise bei etwa 8-12ºC im Behälter 76 gehalten. Die Temperatur des Behälters 76 wird durch geeignete Vorrichtungen reguliert, wie z. B. durch Kühlen der Außenseite des Behälters 76 unter Verwendung eines Mantelkühlsystems mit Ethylenglycol (nicht gezeigt).
Sodann wird der Puffer durch die Pumpe 88 in den Behälter 76 für die Hb- Lösung geleitet, welche vorzugsweise konzentriert ist, um die Ionenstärke der Hb- Lösung zur Erhöhung der Befreiung des Hb von Sauerstoff einzustellen. Es wird bevorzugt, dass die Ionenstärke auf mehr als etwa 150 Milliäquivalent/Liter eingestellt wird, um die Sauerstoffaffinität des Hb in der Hb-Lösung zu verringern. Geeignete Puffer umfassen Puffer mit einem pH-Wert, der nicht zu einer signifikanten Denaturierung des Hb-Proteins führt, sondern der eine Ionenstärke hat, welche ausreichend hoch ist, um eine Sauerstoffbefreiung von Hb zu fördern. Beispiele geeigneter Puffer umfassen Kochsalzlösungen mit einem pH-Wertbereich von etwa 6,5 bis etwa 8, 9. Ein bevorzugter Puffer ist eine wässerige, 1,0 molare NaCl-, 20 mM Tris-Lösung mit einem pH-Wert von etwa 8,9.
Vorzugsweise wird die gepufferte Hb-Lösung sodann durch den Ultrafilter 84 im Umlauf geführt und zum Behälter 76 rückgeführt, um die Hb-Lösung abermals zur Verbesserung der Wirksamkeit des Verfahrens zu konzentrieren. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die Konzentration vollständig, wenn die Hb- Konzentration etwa 100 g/Liter bis etwa 120 g/Liter beträgt.
Während der Befreiung der Hb-Lösung von Sauerstoff wird diese durch die Pumpe 80 vom Behälter 76 durch eine Phasentransfermembran 86 und dann zurück zum Behälter 76 gefordert. Geeignete Phasentransfermembranen umfassen z. B. einen Mikrofilter mit 0,05 um Propylenhohlfasern (wie z. B. Hoechst-Celanese Cat # 5PCM-107). Gleichzeitig wird durch die Phasentransermembran 86 ein Gegenstrom eines Inertgases geführt. Geeignete Inertgase umfassen z. B. Stickstoff, Argon und Helium. Der Gasaustausch durch die Phasentransfermembran 86 hindurch strippt den Sauerstoff von der Hb-Lösung ab.
Die Sauerstoffbefreiung wird fortgesetzt, bis eine geringe Sauerstoffkonzentration erreicht wird, welche geeignet ist, eine signifikante Methhämoglobinbildung zu begrenzen und die zu einem großen Anteil von Hb-Molekülen führt, welche eine strukturelle Anordnung besitzen, welche zu einer niederen Sauerstoffaffinität führt, wenn das Hb vernetzt wird, wodurch die Sauerstoff-Abgabekapazität des Hämoglobins erhöht wird. Typischerweise wird die Befreiung von Sauerstoff durchgeführt, bis die HbO&sub2;-Konzentration weniger als 20%, vorzugsweise weniger als etwa 10%, beträgt.
Während der Befreiung von Sauerstoff wird die Temperatur Hb-Lösung typischerweise auf einem Niveau gehalten, welches die Rate der Deoxidation gegen die Rate der Bildung von Methämoglobin ins Gleichgewicht bringt. Die Temperatur wird aufrechterhalten, um den Methämoglobingehalt auf weniger als 20% zu begrenzen. Eine optimale Temperatur führt zu einem Gehalt an Methämoglobin von weniger als etwa 5%, vorzugsweise weniger als etwa 2,5%, während die Hb-Lösung noch von Sauerstoff befreit wird. Typischerweise wird die Temperatur der Hb- Lösung wärhend der Befreiung von Sauerstoff zwischen etwa 19ºC und etwa 31ºC gehalten.
Während der Deoxidation und nachfolgend die ganzen restlichen Stufen des erfindungsgemäßen Verfahrens hindurch wird das Hb in einer Umgebung mit geringem Sauerstoff gehalten, um die Sauerstoffabsorption durch die Hb-Lösung auf ein Minimum herabzusetzen. Geeignete Umgebungen mit geringem Sauerstoffgehalt umfassen z. B. diejenigen Umgebungen, welche zu einem mit Sauerstoff angereicherten Hb (Oxyhämoglobin oder HbO&sub2;) von weniger als etwa 20 in der Hb-Lösung führt.
Das Deoxy-Hb wird sodann mit einem geeigneten, von Sauerstoff befreiten Lagerungspuffer und einem Vernetzungsmittel vermischt. Es wird darauf hingewiesen, dass der Lagerungspuffer und das Vernetzungsmittel gleichzeitig zum Deoxy-Hb zugegeben werden können, oder das Vernetzungsmittel kann nach Zugabe des Lagerungspuffers zu Deoxy-Hb zugegeben werden. Es wird bevorzugt, dass der Lagerungspuffer und das Vernetzungsmittel nacheinander zum Deoxy-Hb gegeben werden.
Bei einer Ausführungsform wird der Lagerungspuffer vor Vermischen mit dem Depxy-Hb filtriert. Ein geeigneter Filter für einen Lagerungspuffer ist in der Lage, diesen pyrogenfrei zu machen, wie typischerweise ein Filter von 10.000 Dalton oder weniger oder eine Membran. Beispiele für geeignete Filter für Lagerungspuffer umfassen "Millipore Helicon, Cat, CDUF 050 G1" der AG Technology Maxcell, Cat # UFP-10-C-75" d. h. pyrogenfrei-machende Filter mit Ausschlussgrenzen von 10.000 Dalton.
Bei einer Ausführungsform enthält der Lagerungspuffer auch einen Puffer zur Stabilisierung des pH-Werts, um die Ionenstärke des Deoxy-Hb nieder genug zu halten, damit sie das intramolekulare Vernetzen während der Polymerisation nicht wesentlich stört. Typischerweise ist die Ionenstärke des oxidationsstabilisierten Deoxy-Hb weniger als etwa 50 mOsm vor der Polymerisation.
Ein geeigneter deoxidierter Lagerungspuffer enthält eine Menge an einem nicht-toxischen Reduktionsmittel, die geeignet ist, die Deoxy-Hb-Lösung gegen Oxidation zu stabilisieren. Geeignete Reduktionsmittel umfassen Sulfhydrylverbindungen wie N,N-Acetyl-L-cystein (NAC), D,L-Cystein, γ-Glutamylcystein, Glutathion, 2-Mercaptoethanol, 2,3-Dimercapto-1-proponal, 1,4-Butandithiol, Thioglycalat, Dithioerythrit, Dithothreit, und andere biolgisch verträgliche Sulfhydrylverbindungen; Citratsalze, Citronensäure; reduziertes Nikotinamid-adenindinoklueotid (NADH&sub2;); reduziertes Nikotinamidadenin-Dinukleotidphosphat (NADPH&sub2;); reduziertes Flavinadenin-Dinukleotid (FADH&sub2;); und andere biologisch verträgliche Reduktionsmittel. Der Sauerstoffgehalt eines Lagerungspuffers mit geringem Sauerstoffgehalt muss tief genug sein, dass er die Konzentration des Reduktionsmittels im Puffer nicht signifikant vermindert und den Gehalt an Oxyhämoglobin im Oxidations-stabilisierten Deoxy-Hb auf etwa 20% oder weniger begrenzt. Typischerweise hat der Lagerungspuffer einen Sauerstoffpartialdruck pO&sub2; von weniger als etwa 50 Torr. Die Funktionen der Sulfidrylverbindung umfassen das Befreien des verbleibenden mit Sauerstoff angereicherten Hb im Deoxy-Hb von Sauerstoff, das Reduzieren von Methämoglobin im Deoxy-Hb, das Aufrechterhalten des Deoxy-Hb (und einen Hb-Blutersatz-Endprodukts in einem oxidationsstabilisierten (d. h. von Sauerstoff befreiten bzw. deoxidierten) Zustand bei Raumtemperatur durch Reinigung von Sauerstoff, sowie das Erleichtern einer optimalen Hb-Polymerisation zur bevorzugten Bildung eines modifizierten tetrameren Hb. Ein modifiziertes tetrameres Hb ist gemäß vorliegender Definition ein tetrameres Hb, welches intramolekular vernetzt wurde, um eine wesentliche Dissoziation des Hb-Tetrameren in Hb-Dimere auszuschließen.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform sollte der Lagerungspuffer einen pH- Wert aufweisen, der die Hb-Polymerisation und die Bildung von Methämoglobin ins Gleichgewicht bringt, typischerweise zwischen etwa 7,6 und 7,9.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Lagerungspuffer annähernd 25-35 mM Natriumphosphatpuffer (pH-Wert 7,7-7,8) und enthält ferner eine derartige Menge an NAC, dass die Konzentration von NAC im oxidationsstabilsierten Deoxy-Hb zwischen etwa 0,003 Gew.-% und etwa 0,3 Gew.-% liegt. Bevorzugter wird eine NAC-Konzentration im Oxidations-stabilisierten Deoxy-Hb zwischen etwa 0,05 Gew.-% und etwa 0.2 Gew.-%.
Der pH-Wert und Sauerstoffgehalt des Lagerungspuffers sollte geeignet sein, zu gewährleisten, dass das oxidationsstabilisierte Deoxy-Hb einen pH-Wert hat, der geeignet ist, die Hb-Polymerisation und die Bildung von Methämoglobin ins Gleichgewicht zu setzen, vorzugsweise sollte er von 7,6 bis etwa 7,9 betragen, und der Sauerstoffgehalt sollte nach der Stabilisierung weniger als etwa 20% HbO&sub2;, vorzugsweise ≤ 10% HbO&sub2;, auch zur Begrenzung der Methämoglobinbildung betragen.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das Deoxy-Hb mit einer Menge N-Acetylcystein-Lagerungspuffer (NAC-Puffer) derart versetzt, dass das oxidationsstabilisierte Deoxy-Hb vor der Polymerisation etwa 0,003 Gew.-% bis etwa 0,3 Gew.-% NAC enthält.
Bei einer bevorzugteren Ausführungsform wird das Deoxy-Hb mit einer solchen Menge eines NAC-Lagerungspuffers versetzt, dass das oxidationsstabilisierte Deoxy-Hb vor der Polymerisation etwa 0,03 Gew.-% bis etwa 0,3 Gew.-% NAC enthält, oder gleichwertige Molprozentsätze bei anderen Sulfhydrilverbindungen.
Bei einer noch mehr bevorzugten Ausführungsform enthält das oxidationsstabilisierte Deoxy-Hb zwischen etwa 0,05 Gew.-% und 0,2 Gew.-% NAC vor der Einleitung der Polymerisation.
Um auf Fig. 1B zurückzukommen: Der Lagerungspuffer wird zum Deoxy-Hb im Behälter 76 durch eine geeignete Vorrichtung, wie z. B. eine Pumpe 88, zugegeben. Gleichzeitig wird durch Umlauf vom Behälter 76 durch die Pumpe 80 durch den Ultrafilter 84 das Deoxy-Hb diafiltriert. Typischerweise ist die Pumpe 80 (z. B. Albin Sanitary Pump Model 325, Albin Pump. Inc. Atlanta, GA) so ausgebildet, dass sie eine Druckströmung durch die Pumpe 80, während sie nicht im Betrieb ist, erlaubt. Der Lagerungspuffer wird kontinuierlich oder absatzweise zum Behälter 76 in einer Menge zugegeben, die in der Regel ausreicht, um den Flüssigkeitsverlust durch den Ultrafilter 86 durch Hatten der Flüssigkeit im Behälter 76 bei einem annähernd »konstanten Niveau auszugleichen. Vorzugsweise wird das Abgleichen fortgesetzt, bis das Volumen der durch die Diafiltration durch den Ultrafilter 86 verlorene Flüssigkeit etwa das Dreifache des Anfangsvolumens des Deoxy-Hb im Behälter 76 beträgt. Das Volumen des aus dem Ultrafilter 84 abgelassenen Filtrats kann durch eine bekannte Vorrichtung gemessen werden, beispielsweise durch einen Strömungsmesser in der Ablaufleitung.
Wie in Fig. 1B und 1C gezeigt, wird die oxidationsstabilisierte Deoxy-Hb sodann vom Hb-Deoxidations-Subsystem 78 durch die Abflussleitung 90 durch Druckbeaufschlagung des Behälters 76 mit einem Inertgas wie Stickstoff transportiert.
Bei einer Ausführungsform fließt das oxidationsstabilisierte Deoxy-Hb sodann von der Abflussleitung 90 durch einen wahlweisen Filter 92 in den Lagerungsbehälter 94. Geeignete Filter umfassen einen 0,5 um Polypropylenvorfilter (Pall Provile II, Cat # ABIY005Z7) und einen 0,2 um sterilen Mikrofilter (Gelman Supor). Der Lagerungsbehälter 94 wird unter einer Umgebung mit geringem Sauerstoffgehalt gehalten, wie z. B. durch Reinigen und Spülen mit einem Inertgas wie Stickstoff vor einem Füllen mit oxidationsstabilisiertem Deoxy-Hb. Nach dem Füllen mit oxidationsstabilisiertem Deoxy-Hb wird der Lagerungstank 94 mit einem Inertgas wie Stickstoff gespült und verschlossen, um eine bakterielle und oxidative Verunreinigung zu minimieren. Der Lagerungsbehälter 94 wird typischerweise bei etwa Raumtemperatur gehalten. Sodann wird das oxidationsstabilisierte Deoxy-Hb aus dem Lagerungstank 94 durch Druckbeaufschlagung des Lagerungstankes 94 mit einem Inertgas wie Stickstoff zur Deoxidationsschleife 96 des Polymerisations- Untersystems 98 transportiert.
Bei einer anderen Ausführungsform fließt das oxidationsstabilisierte Deoxy- Hb sodann direkt von Abflussleitung 90 durch die Lagerungs-Nebenleitung 95 in die Deoxidationsschleife 96 durch Druckbeaufschlagung des Behälters 76 mit einem Inertgas wie Stickstoff.
Das Polymerisations-Untersystem 98 umfasst die Deoxidationsschleife 96, die Konzentrationsschleife 100 und den Polymerisationsreaktor 102. In der Deoxidationsschleife 96 führt die Pumpe 104 das oxidationsstabilisierte Deoxy-Hb vom Polymerisationsreaktor 102 durch den statischen Mischer 106 und sodann durch die Phasentransfermembran 108 im Kreislauf. Die Konzentrationsschleife 100 umfasst die Pumpe 110, welche den Polymerisationsreaktor 102 absaugt und das oxidationsstabilisierte Deoxy-Hb durch einen Ultrafilter 102 oder durch eine parallel geschaltete Nebenschluss-Leitung 114 und danach durch den statischen Mischer 116 im Umlauf führt. Ein Beispiel für einen akzeptablen Ultrafilter ist eine 30.000 Dalton Ultrafiltrationsmembran, wie z. B. Millipore Helicon CDUF 050 LT oder Amicon S40Y30). Geeignete Phasentransfermembranen umfassen z. B. einen 0,05 um Polypropylen-Mikrofilter (z. B. Hoechst-Celanese Corporation Cat # 5PCM-108, 80 sq. ft.).
Gegebenenfalls wird vor der Überführung des oxidationsstabilisierten Deoxy- Hb zum Polymerisations-Untersystem 98 eine geeignete Wassermenge zu Polymerisationsreaktor 102 zugegeben. Bei einer Ausführungsform ist eine geeignete Wassermenge diejenige Menge, welche zu einer Lösung mit einer Konzentration von etwa 10 bis etwa 100 g/Liter Hb führt, wenn das oxidationsstabilisierte Deoxy-Hb zum Polymerisationsreaktor 102 zugegeben wird. Vorzugsweise ist das Wasser arm an Sauerstoff.
Das Wasser wird durch die Pumpe 104 durch das Polymerisations- Untersystem 28 im Umlauf geführt, um die Befreiung des Wassers von Sauerstoff durch Fließen durch die Phasentransfermembran 108 zu unterstützen. Ein Gegenstrom eines unter Druck stehenden Inertgases, wie z. B. Stickstoff, wird durch die entgegengesetzte Seite der Phasentransfermembran 108 geleitet, um das Wasser weiter von Sauerstoff zu befreien.
Nachdem der Sauerstoffpartialdruck pO&sub2; des Wassers im Polymerisations- Untersystem 98 auf ein Niveau vermindert ist, das ausreicht, den HbO&sub2;-Gehalt auf etwa 20%, typischerweise weniger als etwa 50 Torr, zu begrenzen, wird der Polymerisationsreaktor 102 mit einem Inertgas wie Stickstoff gespült. Das oxidationsstabilisierte Deoxy-Hb wird sodann von dem Lagerungstank 94 durch Druckbeaufschlagung desselben mit einem Inertgas (wie z. B. Stickstoff) in den Polymerisationsreaktor 102 oder durch direktes Ablassen von der Abflussleitung 90 durch die Lagerungs-Nebenleitung 95 in den Polymerisationsreaktor 102 übergeführt, welcher gleichzeitig mit einem geeigneten Strom eines Inertgases gespült wird.
Die Temperatur der oxidationsstabilisierten Deoxy-Hb-Lösung im Polymerisationsreaktor 102 wird erhöht, um die Polymerisation des oxidationsstabilisierten Deoxy-Hb beim Kontakt mit einem Vernetzungsmittel zu erhöhen. Die Bedingungen für die Polymerisation des Hämoglobins umfassen ein Erwärmen des Polymerisationsgemischs im Polymerisationsreaktor 102 auf eine Temperatur, die hoch genug ist, um ein intramolekulares Vernetzen von Hb zu bewirken, und ausreichend nieder ist, um eine wesentliche Denaturierung von Hb zu vermeiden. Typischerweise wird das Polymerisationsgemisch auf eine Temperatur von etwa 25ºC bis 45ºC während 2-6 Stunden erwärmt. Jedoch polymerisiert zumindest ein Teil des Polymerisationsgemisches bei Temperaturen unterhalb von 25ºC.
Bevorzugte Polymerisationsbedingungen umfassen ein Erwärmen des Reaktionsgemischs für die Polymerisation auf etwa 40ºC bis etwa 44ºC während annähernd 4-6 Stunden. Ein Beispiel für eine annehmbare Wärmeübertragungsvorrichtung (nicht gezeigt) zur Erwärmung des Polymerisationsreaktors 102 ist ein Mantelerwärmungssystem, das durch Durchleitung von warmem Ethylenglycol durch den Mantel erwärmt wird.
Beispiele für geeignete Vernetzungsmittel umfassen polyfunktionale Mittel, die Hb-Proteine vernetzen, wie z. B. Glutaraldehyd, Succindialdehyd, aktivierte Formen von Polyoxyethylen und Dextran, α-Hydroxyaldehyde wie Glycolaldehyd, N- Maleimid-6-aminocaproyl-(2'-nitro, 4'-sulfonsäure)phenylester, m-Maleimidobenzoesäure-N-hydroxysuccinimidester, Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1- carboxylat, Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat, m- Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester, m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysulfosuccinimidester, N-Succinimidyl(4-iodacetyl)aminobenzoat, Sulfosuccinimidyl(4- iodacetyl)aminobenzoat, Succinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrat, Sulfosuccinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrat, 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid, N,N'-Phenylendimaleimid sowie Verbindungen, welche der Bisimidat-Klasse, der Acyldiazid-Klasse oder der Klasse Aryldihalogenid angehören, um einige zu nennen.
Eine geeignete Menge eines Vernetzungsmittels ist diejenige Menge, welche eine intramolekulare Vernetzung ermöglicht, um das Hb zu stabilisieren, und auch eine intermolekulare Vernetzung unter Bildung von Hb-Polymeren zu gestatten, um hierdurch ein Verweilen innerhalb der Gefäße zu erhöhen. Typischerweise ist eine geeignete Menge eines Vernetzungsmittels diejenige, bei der das Molverhältnis von Vernetzungsmittel zum Hb oberhalb von etwa 2 : 1 liegt. Vorzugsweise liegt das Molverhältnis des Vernetzungsmittels zum Hb zwischen etwa 20 : 1 bis 40 : 1.
Vorzugsweise wird die Polymerisation in einem Puffer mit einem pH-Wert zwischen etwa 7,6 bis etwa 7,9, der eine Chloridkonzentration weniger als oder gleich etwa 35 mM aufweist, durchgeführt.
Um auf Fig. 1C zurückzukommen: eine geeignete Menge des Vernetzungsmittels wird zum oxidationsstabilisierten Deoxy-Hb durch eine Öffnung (nicht gezeigt) zugegeben, während das oxidationsstabilisierte Deoxy-Hb vom Polymerisationsreaktor 102 durch die Nebenschlussleitung 114 rückgeführt wird. Das Vernetzungsmittel und das oxidationsstabilisierte Deoxy-Hb werden sodann mit einer Vorrichtung zum Vermischen unter geringer Scherkraft vermischt. Eine geeignete Mischvorrichtung geringer Scherkraft umfasst die statische Mischvorrichtung 116. Beispielsweise ist eine geeignete statische Mischvorrichtung ein "Kenics"-statischer Mischer, erhältlich von der Firma Chemineer Inc..
Bei einer Ausführungsform bewirkt die Rückführung des oxidationsstabilisierten Deoxy-Hb und des Vernetzungsmittels durch den statischen Mischer 116 Bedingungen einer turbulenten Strömung mit einem in der Regel gleichmäßigen Vermischen des Vernetzungsmittels mit dem oxidationsstabilisierten Deoxy-Hb, wodurch das Potenzial für die Bildung von Nestern aus hohe Konzentrationen des Vernetzungsmittels enthaltendem Deoxy-Hb vermindert wird. In der Regel vermindert ein gleichmäßiges Vermischen des Vernetzungsmittels mit dem Deoxy- Hb die Bildung von Hb-Polymeren hohen Molekulargewichts, d. h. von Polymeren mit einem Gewicht von mehr als 500.000 Daltons, und ermöglicht auch ein schnelleres Vermischen des Vernetzungsmittels mit dem Deoxy-Hb während der Polymerisation.
Ferner ergibt sich während der Polymerisation von Hb infolge der Anwesenheit der Sulfhydrylverbindung, vorzugsweise NAC, eine wesentliche intramolekulare Vernetzung von Hb, wenn das Reduktionsmittel eine Sulfhydrylverbindung ist. Während der exakte Mechanismus der Wechselwirkung der Sulfhydrylverbindung mit dem Vernetzungsmittel und/oder Hb unbekannt ist, wird jedoch angenommen, dass die Sulfhydrylverbindung die chemische Bindung von Hb/Vernetzungsmittel auf eine Weise beeinflusst, dass sie mindestens teilweise die Bildung von Hb-Polymerer hohen Molekulargewichts hemmt und vorzugsweise stablisiertes tetrameres Hb bildet.
Die Menge der mit dem Deoxy-Hb vermischten Sulfhydrylverbindung ist eine Menge, die hoch genug ist, um eine intramolekulare Vernetzung von Hb während der Polymerisation zu erhöhen, und nieder genug, um die intermolekulare Vernetzung von Hb-Molekülen infolge einer hohen Ionenstärke nicht wesentlich herabzusetzen. Typischerweise ist etwa ein Mol funktioneller Sulfhydrylgruppen (- SH) erforderlich, um etwa 0,25 Mol bis etwa 5 Mol Deoxy-Hb zu oxidationsstabilisieren. Wenn das Reduktionsmittel keine Sulfhydrylverbindung ist, wird das Polymerisationsgemisch mit einer Sulfhydrylverbindung in einer Menge versetzt, die ausreichend ist, um das intramolekulare Vernetzen zu erhöhen. Geeignete Sulfhydrylverbindungen umfassen die zuvor aufgelisteten Verbindungen. Die ausreichende Menge der Sulfhydrylverbindung schwankt; in der Regel liegt sie zwischen etwa 0,003% und 0,3%.
Poly(Hb) ist so definiert, dass es eine wesentliche intramolekulare Vernetzung aufweist, wenn ein wesentlicher Teil der Hb-Moleküle im Poly(Hb) chemisch gebunden ist, und nur eine geringe Menge, wie z. B. weniger als 15%, in den polymerisierten Hämoglobinketten hohen Molekulargewichts enthalten ist. Poly(Hb- Moleküle hohen Molekulargewichts sind Moleküle mit z. B. einem Molekulargewicht von mehr als etwa 500.000 Daltons.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird als Vernetzungsmittel Glutaraldehyd verwendet. Typischerweise werden pro kg oxidationsstabilisiertes Deoxy-Hb etwa 10 bis etwa 70 g Glutaraldehyd verwendet. Bevorzugter wird Glutaraldehyd innerhalb eines Zeitraums von 5 Stunden zugegeben, bis etwa 29-31 g Glutaraldehyd pro kg oxidationsstabilisiertes Deoxy-Hb zugegeben sind. Es wird auch bevorzugt, dass die Polymerisation in einem Puffer mit einer Chloridionenkonzentration von weniger als oder gleich etwa 35 mM durchgeführt wird. Ein Beispiel für einen geeigneten Puffer ist ein 12 mM Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,8.
Nach der Polymerisation wird die Lösung von Poly(Hb) im Polymerisationsreaktor 102 typischerweise auf eine Temperatur erniedrigt, welche ein wesentliches Ausmaß weiterer Umsetzungen mit dem Vernetzungsmittel hemmt, nämlich auf etwa 15ºC bis etwa 25ºC, vorzugsweise etwa 18ºC bis etwa 20ºC. Ein Beispiel für eine akzeptable Wärmeübertragungsvorrichtung zur Kühlung des Polymerisationsreaktors 102 ist ein mit einem Wärmeaustauscher ummantelter Polymerisationsreaktor (nicht gezeigt), der durch Ethylenglycolströmung gekühlt wird.
Wenn das benutzte Vernetzungsmittel kein Aldehyd ist, ist das gebildete Poly(Hb) ein stabiles Poly(Hb). Wenn das benutzte Vernetzungsmittel ein Aldehyd ist, ist das gebildete Poly(Hb) nicht stabil, bis es mit einem geeigneten Reduktionsmittel zur Reduzierung von weniger stabilen Bindungen im Poly(Hb) unter Bildung stabilerer Bindungen vermischt ist. Beispiele für geeignete Reduktionsmittel umfassen Natriumborhydrid, Natriumcyanborhydrid, Natriumdithionit, Trimethylamin, tert-Butylamin, Morpholinboran und Pyridinboran.
Vor der Zugabe eines Reduktionsmittels wird die Poly(Hb)-Lösung gegebenenfalls konzentriert, indem sie durch einen Ultrafilter 112 im Umlauf geführt wird, bis die Konzentration der Lösung auf etwa 75 bis etwa 85 g/Liter erhöht ist. Ein Beispiel für einen geeigneten Ultrafilter ist ein 30.000 Dalton Filter (wie z. B. Millipore Helicon, Cat # CDUF 050 LT Amicon 540430).
Wenn das Reduktionsmittel Borhydrid ist, wird der pH-Wert der Poly(Hb)- Lösung sodann auf einen pH-Wert im alkalischen Bereich eingestellt, um das Reduktionsmittel haltbar zu machen und eine Wasserstoffgasbildung zu vermeiden, welche Hb während der nachfolgenden Iminreduktion denaturieren kann. Bei einer Ausführungsform wird der pH-Wert auf mehr als 10 eingestellt. Der pH-Wert wird durch Zugabe einer Pufferlösung zur Lösung von Poly(Hb) im Polymerisationsreaktor 102 eingestellt, während gleichzeitig die Poly(Hb)-Lösung diafiltriert wird. Die Poly(Hb)-Lösung wird diafiltriert, indem man sie durch die Pumpe 110 vom Polymerisationisreaktor 102 durch den Ultrafilter 112 in Umlauf führt. Ein Beispiel für einen geeigneten Filter für den Natriumboratpuffer ist eine 10.000 Dalton Ultrafiltrationsmembran. Der pH-Wert kann aber auch durch direkte Zugabe eines alkalischen Puffers eingestellt werden.
Nach der Einstellung des pH-Werts wird zum Polymerisationsreaktor 102, typischerweise durch die Deoxidationsschleife 96, mindestens ein Reduktionsmittel, vorzugsweise eine Natriumborhydridlösung, zugegeben. Typischerweise werden etwa 5 bis etwa 18 Mole Reduktionsmittel pro Mol Hb-Tetramer (pro 64.000 Daltons von Hb) im Poly(Hb) zugegeben. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird für jeweils 9 Liter der Poly(Hb)-Lösung im Polymerisations-Untersystem 98 ein Liter einer 0,25 molaren Natriumborhydridlösung mit einer Rate von 0,1 bis 0,12 Liter pro Minute zugegeben.
Die Menge des Reduktionsmittels, als Flüssigkeit, eine Lösung und/oder eine Aufschlämmung, wird dem Polymerisationsreaktor 102 durch eine Öffnung (nicht gezeigt) zugegeben und sodann durch die statische Mischvorrichtung 106 und Phasenmembran 108 im Umlauf geführt, um zu Bedingungen einer turbulenten Strömung zu führen, welche ein schnelles, wirksames Vermischen des Reduktionsmittels mit der Poly(Hb)-Lösung im Polymerisationsreaktor 102 zu führen. Während der Zugabe des Reduktionsmittels wird durch die Pumpe 104 die Poly(Hb)- Lösung im Polymerisationsreaktor 102 kontinuierlich durch die statische Mischvorrichtung 102 und Phasentransfermembran 108 im Umlauf geführt, um aufgelösten Sauerstoff und Wasserstoff zu entfernen. Nach Abschluss der Zugabe des Reduktionsmittels setzt sich die Reduktion im Polymerisationsreaktor 102 fort, während ein hierin enthaltener Rührer (nicht gezeigt) das Vermischen der Poly(Hb)- Lösung mit dem Reduktionsmittel etwa 0,5 bis 2 Stunden unter Bildung eines stabilen Poly(Hb) weiter fortsetzt.
Stabiles Poly(Hb) im Polymerisations-Untersystem 98 wird sodann erforderlichenfalls auf eine Konzentration von typischerweise etwa 10 g Hb/Liter bis etwa 250 g Hb/Liter konzentriert. Die stabile Poly(Hb)-Lösung wird mittels der Pumpe 110 durch Rückführung vom Polymerisationsreaktor 102 durch den Ultrafilter 112 konzentriert.
Der pH-Wert und die Elektrolyten des stabilen Poly(Hb) werden sodann wieder auf physiologische Werte eingestellt, unter Bildung eines stabilen polymerisierten Hämoglobin-Blutersatzes, indem man das stabile Poly(Hb) mit einer Diafiltrationslösung mit einem geeigneten pH-Wert und physiologischen Elektrolytspiegeln diafiltriert. Vorzugsweise ist die Diafiltrationslösung eine Pufferlösung.
Wenn das Poly(Hb) durch ein Reduktionsmittel reduziert wurde, hat die Diafiltrationslösung einen sauren pH-Wert, vorzugsweise von etwa 4 bis etwa 6.
Die stabile Poly(Hb)-Lösung wird auch mit einem nicht-toxischen Reduktionsmittel als Sauerstoffreinigungsmittel versetzt, um die Stabilität des endgültigen polymerisierten Hämoglobin-Blutersatzes zu erhöhen. Das Reduktionsmittel kann als Teil der Diafiltrationslösung und/oder getrennt zugegeben werden. Es wird eine Menge an Reduktionsmittel zugegeben, um eine Konzentration einzustellen, welche von Sauerstoff reinigt, um einen Methämoglobingehalt von weniger als etwa 15% während des Lagerungszeitraums aufrechtzuerhalten. Vorzugsweise ist das Reduktionsmittel eine Sulfhydrylverbindung, und bevorzugter ist es NAC. Typischerweise ist die zugegebene Menge des Reduktionsmittels eine solche, die ausreicht, um eine Sulfhydrylkonzentration von etwa 0,05 Gew.-% bis etwa 0,2 Gew.-% einzurichten.
Die Diafiltration wird fortgesetzt, bis der Volumenaustausch ausreichend wurde, um einen physiologisch annehmbaren pH-Wert und physiologisch annehmbare Elektrolytspiegel in der stabilen Poly(Hb)-Lösung einzustellen, wobei sich ein stabiler Blutersatz aus polymerisiertem Hämoglobin bildet. In Fig. 1C ist das Volumen der Flüssigkeit, das typischerweise durch die Diafiltration durch den Ultrafilter 102 verloren geht, etwa das 6- bis 10fache des Volumens des stabilen Poly(Hb) im Polymerisations-Untersystem 98.
Bei einer anderen Ausführungsform wird nach Bildung eines stabilen Blutersatzes aus polymerisiertem Hämoglobin der Blutersatz zur Entfernung von unmodifiziertem und modifiziertem tetrameren Hb vom Blutersatz dieser diafiltriert. Der Blutersatz wird typischerweise auf eine Konzentration von etwa 30 g/Liter bis etwa 50 g/Liter mit der physiologischen Lösung verdünnt. Das verdünnte Hb wird sodann durch Umlauf durch den Polymerisationsreaktor 102 mittels der Pumpe 104 durch die statische Mischvomchtung 106 und den Reinigungsfilter 120 diafiltriert. Der verdünnte Blutersatz wird sodann mit einer physiologischen Lösung, in der Regel ein von Sauerstoff befreiter Puffer mit einem physiologisch annehmbaren pH- Wert und physiologisch akzeptablen Elektrolytspiegeln diafiltriert, um den Gehalt an Anteilen von modifiziertem tetrameren und unmodifiziertem tetrameren Hb auf etwa 10% oder weniger zu vermindern, wie durch Gelpermeationschromatographie, durchgeführt unter dissoziierenden Bedingungen, bestimmt wird. Modifiziertes tetrameres Hb ist als tetrameres Hb definiert, welches intramolekular vernetzt wurde, um eine wesentliche Dissoziation der Hb-Tetrameren in Hb-Dimere zu verhindern. Der Reinigungsfilter 120 hat einen bevorzugten Molekulargewichtsschnitt, der ausreicht, um modifiziertes und unmodifiziertes Hb-Tetramer aus dem Blutersatz zu entfernen, typischerweise ist er ein Filter Filtron Ex. Omega, Cat # 05100C05 mit etwa 100.000 Daltons. Nach Entfernung des modifizierten und unmodifizierten tetrameren Hb wird erforderlichenfalls die Rückführung des Blutersatzes durch den Ultrafilter 112 fortgesetzt, bis die Konzentration des Hb-Produkts etwa 10 g Hb/Liter bis etwa 250 g Hb/Liter, vorzugsweise etwa 120 g Hb/Liter bis etwa 140 g Hb/Liter, beträgt.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird der Blutersatz unter aseptischen Handhabungsbedingungen abgepackt, während der Druck mit einer inerten, im wesentlichen Sauerstofffreien Atmosphäre im Polymerisationsreaktor und der restlichen Transportvorrichtung aufrechterhalten wird.
Die Einzelvorschriften für einen geeigneten stabilen Blutersatz aus polymerisiertem Hämoglobin, hergestellt nach dem erfindungsgemäßen Verfahren, sind in folgender Tabelle I zusammengefasst. Tabelle I
a - gemessen in Hb vor der Polymerisation
M. W. - Molekulargewicht
Ein Beispiel für einen physiologischen pH-Wert ist ein solcher von etwa 7,2 bis etwa 7,9 bei 18 bis 22ºC. Ein bevorzugter physiologischer pH-Wert liegt zwischen etwa 7,6 und etwa 7,9 bei 18 bis 22ºC.
Um auf die Fig. 1C zurückzukommen: der Polymerisationsreaktor 102 wird sodann mit einem Inertgas druckbeaufschlagt, um den Blutersatz aus stabilisiertem polymerisierten Hämoglobin durch aseptische Handhabungsverfahren in einen Lagerungsbehälter zu transportieren. Gegebenenfalls wird der Blutersatz durch einen Vor- und Mikrofilter (nicht gezeigt) vor dem Lagern geleitet. Als Vor- und Mikrofilter sind ein Polypropylen-Vorfilter von 0,5 um oder weniger bzw. ein steriler Filter von 0,2 um brauchbar.
Der stabile Blutersatz wird sodann in einem Kurzzeit-Lagerungsbehälter (nicht gezeigt) oder in sterilen Lagerungsbehältern von denen jeder eine Umgebung geringen Sauerstoffgehalts aufweist, gelagert. Der Lagerungsbehälter muss auch für den Durchtritt von Wasserdampf ausreichend undurchlässig sein, um eine wesentliche Konzentration des Blutersatzes durch Verdampfung innerhalb des Lagerungszeitraums zu verhindern. Eine wesentliche Konzentration des Blutersatzes ist eine Konzentration, welche zu einem oder mehreren Parametern des Blutersatzes führt, die von den Einzelvorschriften wesentlich abweichen.
Bei einer bevorzugten Ausführungform wird die Stabilität eines Hämoglobin- Blutersatzes gewahrt, indem man den Hämoglobin-Blutersatz in einer von Sauerstoff im wesentlichen freien Atmosphäre hält. Dieses Verfahren kann erreicht werden, wenn man den Blutersatz in einem für Sauerstoff undurchlässigen Behälter aufrecht erhält, wie z. B. in einer Umhüllung aus einem Film mit Sauerstoffschranke (wie z. B. einem Beutel), einem Glasbehälter (wie z. B. einer Ampulle) oder einem Stahlbehälter. Wenn der Behälter eine Umhüllung mit Sauerstoffschranke ist, kann er aus den verschiedensten Materialien, einschließlich Polymerfilmen (wie z. B. einem im wesentlichen Sauerstoff undurchlässigen Polyester, Ethylenvinallaminat (EVOH), Polyvinylidendichlorid (PVDC) oder einem Polyamid wie Nylon und Laminaten, wie z. B. einem Folienlaminat (wie z. B. einem Silber- oder Aluminiumfolienlaminat) hergestellt werden. Wenn die Umhüllung ein Film ist, wie z. B. ein Polyesterfilm, kann der Film im wesentlichen Sauerstoff-undurchlässig durch die verschiedensten geeigneten Verfahren gemacht werden. Bei einer Ausführungsform ist der hergestellte Film im wesentlichen Sauerstoff-undurchlässig.
Wenn jedoch das Polymermaterial nicht ausreichend Sauerstoff-undurchlässig ist, um die gewünschten Anforderungen zu erfüllen, kann der Film zur Verminderung oder Ausschaltung der Sauerstoffdurchlässigkeit laminiert oder sonst behandelt werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Metallfolienlaminat verwendet, bei dem die Folie aus Aluminium, Silber, Gold oder einem anderen Metall besteht. Die Folienschicht weist vorzugsweise eine Dicke von etwa 0,0001 bis etwa 0,01 inches auf, vorzugsweise etwa 0,003 inches. Das Laminat enthält üblicherweise eine oder mehrere Polymerschichten. Das Polymer kann eines der verschiedensten Polymemnaterialien sein, einschließlich z. B. einer Polyesterschicht (z. B. ein Polyester von 48 gauge), Polypropylen, Nylon usw..
Die Behälter können von verschiedenster Bauart sein, einschließlich Ampullen, Zylinder. Boxen usw.. Bei einer bevorzugten Ausführungsform liegt, der Behälter in Form eines Beutels vor. Ein geeigneter Beutel kann durch kontinuierliches Binden von einer oder mehreren (z. B. 2) Folien an dessen Umfang bzw. deren Umfängen unter Bildung einer dicht verschlossenen, Sauerstoff undurchlässigen Konstruktion mit einem füllbaren Zentrum gebildet werden. Die Form des Beutels kann von üblicher Art sein. Das Verbinden kann mit jedem geeigneten Material erreicht werden. Im Falle eines Polyester/Metallfolienlaminats als Material kann ein Polyesterklebstoff z. B. verwendet werden.
Die Behälter haben vorzugsweise eine Sauerstoffdurchlässigkeit von weniger als etwa 1,0 cm³ pro 100 square inches pro 24 Stunden pro Atmosphäre bei Raumtemperatur, vorzugsweise weniger als 0,6 cm³ pro square inch unter diesen Bedingungen. Behälter, welche diese Kriterien erfüllen, umfassen Kunststoffbehälter mit einer Umhüllung, wie z. B. die Cryovac-Produkte, wie Cryovac BYV200, und KAPAK-Produkte, wie KAPAK 50303 (KAPAK Corporation, Minneapolis, MN, USA). Diese mit einem Metall- oder Polymerverbundfilm umhüllten Kunststoffbeutel werden unter Verwendung einer Verschlussvorrichtung AUDIONVAC (von Audion Electro B. V., Weesp-Holland) versiegelt. KAPAK 50303 ist ein Metallfolienlaminat-Behälter, gebildet aus einem 48 gauge Polyester/Metallfolien/Sclair-Laminat. Die Metallfolienschicht ist eine Aluminiumfolie mit einer Dicke von etwa 0,0003". Die Sclair-Schicht (ein Polyethylenfilm) besitzt eine Dicke von 0,003". Jede Schicht ist durch einen Klebstoff verbunden. Andere geeignete KAPAK-Produkte umfasen KAPAK 50703, KAPAK 50353 und KAPAK 60N32. Cryovac BYV200 ist auch ein Laminatprodukt mit einer 0,6 mm dicken Schicht aus Polyethylen niederer Dichte (LLDPE), einer beiderseitig mit Saran beschichteten 0,6 mm dicken Polyvinylalkohol-Schicht und 2,2 mm LLDPE als Dichtungsmasse. Die Sauerstoffdurchlässigkeit beträgt etwa 0,02 cm³/100 sq. in./24 Stdn./Atm./72ºF/0% Feuchtigkeit und etwa 0.4 cm³/100 sq. in./24 Stdn./Atm./72ºF/100% Feuchtigkeit.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird der Blutersatz unter einer Atmosphäre abgepackt, die im wesentlichen von Sauerstoff frei ist. Beispiele für geeignete Atmosphären umfassen Stickstoff, Argon und Helium.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Pumpen umfassen peristaltische Pumpen, Diaphragma-, Getriebe-, Kolben- und Kreisel-Plügel- Pumpen. Diaphragma-Pumpen sind von Bran & Luebbe Inc. Buflalo Grove, Illinois erhältlich. Geeignete Kreisel-Flügel-Pumpen umfassen die Pumpe, "Albin SLP 110 P51 B1 sanitary lobe-rotary pump" von Albin Pump Inc., Atlanta, GA., U.S.A. Kreisel-Flügel-Pumpen können auch von Waukesha Pumps. Waukesha, Wisconsin, oder G & H Corporation, Kenosha, Wisconsin, USA. erhalten werden.
Die Herstellung eines stabilen Blutersatzes aus polymerisierten Hämoglobin ist ferner im Beispiel 1 beschrieben.
Stabile Blutersatz-Zusammensetzungen aus polymerisiertem Hämoglobin gemäß vorliegender Erfindung, welche bei Säugetieren und Menschen brauchbar sind, sind in den Tabellen IV und V des Beispiels 3 beschrieben. Ferner ist in den Beispielen 5 bis 6 die Verwendung eines Hb-Blutersatzes in der Veterinärmedizin bei Hunden beschrieben. Ferner ist die Verwendung eines stabilen Blutersatzes aus polymerisiertem Hämoglobin bei Menschen ohne signifikante Nebenwirkungen in den Beispielen 7 bis 8 beschrieben. Die Hämoglobinlösungen können in das Kreislaufsystem eingeführt werden, um die Sauerstoffanreicherung in einem Gewebe, das durch eine Verminderung der Strömung roter Blutzellen (RBC) zum Gewebe affiziert ist, zu erhöhen. Eine Verminderung des RBC-Flusses kann von einer partiellen Blockierung des RBC-Flusses, von einer Verminderung der Population von Blutgefäßen, die mit einem Gewebebereich verbunden sind, und/oder von einer kardiogenen Dysfunktion herrühren.
Der Sauerstofftransfer durch eine Kapillare zum zugehörigen Gewebe wird typischerweise als Sauerstofffluss gekennzeichnet, der als die Sauerstoffmasse definiert ist, welche durch die Kapillare pro Zeiteinheit transportiert wird. Klassischerweise wurde der Sauerstofffluss zuerst mit dem Fluss roter Blutzellen in Verbindung gebracht, da RBC's normalerweise 98% des Sauerstoffe im arteriellen Blut tragen. Infolgedessen ist, wenn die RBC-Strömung durch eine Kapillare wesentlich vermindert ist, der Sauerstofffluss herabgesetzt, was zu einem geringeren Sauerstofftransfer zu dem zugehörigen Gewebe und möglicherweise zu einer Gewebehypoxie oder Gewebeanoxie führt.
Das erfindungsgemäße Verfahren macht vom Vermögen des Hämoglobins Gebrauch, getrennt von den RBC's innerhalb der Plasmaphase des Kreislaufsystems Sauerstoff zu tragen und diesen ins Gewebe zu transportieren. Infolgedessen hängt bei einem Wirbeltier, dem Hämoglobin durch Einführung desselben in sein Kreislaufsystem verabreicht wurde, der Sauerstofffluss auch vom Anstieg des durch das verabreichte Hämoglobin transportierten Sauerstoff ab, wenn dieses durch das Kreislaufsystem des Wirbeltiers zirkuliert.
Die Sauerstoffübertragungskapazität von Hämoglobin, das im Kreislaufsystem zirkuliert, ist im Beispiel 9 gezeigt, worin eine anämische Hypoxie innerhalb von Muskelgewebe, definiert durch eine gemessene Verminderung des Gewebesauerstoff-Drucks, die durch eine isovolämische Blutverdünnung mit Hetastärke bewirkt wurde, durch intravaskuläre Verabreichung geringer Dosen einer Hämoglobinlösung an die Testpersonen wirksam behandelt wurde.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren tritt die Sauerstoffanreicherung im Gewebe mindestens teilweise als Ergebnis der Übertragung von Sauerstoff vom Hämoglobin, das in der Plasmaphase des Kreislaufsystems zirkuliert, auf ein Gewebe eines Wirbeltiers auf. Das mit Sauerstoff anzureichernde Gewebe kann ein kleiner lokalisierter Gewebebereich; ein regionalisierter Gewebebereich, wie z. B. ein Körperglied oder Organ; und/oder ein Gewebe durch den Körper des Wirbeltiers hindurch sein. Ein Gewebe mit einer verminderten Sauerstoffzufuhr, die sich aus einer verminderten RBC-Strömung zum affektierten Gewebe ergibt, kann hypoxisch werden, wie gemessen durch eine Verminderung des Sauerstoffdrucks im Gewebe gemessen, und unter extremen Bedingungen sogar anoxisch werden, wie z. B. bei einer längeren vollständigen Beschränkung der Sauerstoffzufuhr.
Die Gewebehypoxie ist ein Abfall des Sauerstoffdrucks (Partialdruck von Sauerstoff) unterhalb normaler Pegel innerhalb des Gewebes. Eine Gewebeanoxie ist ein Zustand mit keinem messbaren Sauerstoffpartialdruck innerhalb des Gewebes.
Die Anreicherung des Gewebes mit Sauerstoff, welche als Sauerstoffdruck (Sauerstoffpartialdruck) innerhalb des Gewebes gemessen wird, wird wie Beispiel 9 beschrieben bestimmt.
Ein Wirbeltier mit einer lokalisierten, regionalen oder systemischen Verminderung des RBC-Flusses kann Sauerstofftransportsysteme haben, welche sonst normal sind, oder kann zusätzliche Abnormalitäten aufweisen, welche den Sauerstofftransport und die Sauerstoffübertragung in einen Körperteil oder durch den Körper als Ganzes nachteilig beeinflussen.
Ferner hat beim vorliegenden Verfahren das Wirbeltier vor der Verabreichung des Hämoglobins ein normovolämisches Blutvolumen. Ein nomovolemisches Blutvolumen ist als ein Blutvolumen innerhalb des Kreislaufsystems des Wirbeltiers definiert, das nicht zu einem hypovolämischen Schock führt, der sich aus einer Haupthämorrhagie oder einem großen Flüssigkeitsverlust nach Erbrechen, Diarrhöe, Verbrennungen oder Wasserentzug ergeben kann. Typischerweise umfasst ein normovolämisches Blutvolumen mindestens etwa 90% des normalen Blutvolumens für das Wirbeltier. In manchen Fällen kann ein normovolämisches Volumen so wenig wie etwa 80% des normalen Blutvolumens enthalten, ohne dass sich hieraus ein hypovolämischer Schock ergibt.
Ferner enthält das Blut, welches das normovolämische Blutvolumen ergibt, mindestens etwa eine normale Konzentration an RBC's. Beispielsweise hat das Blut in einem normovolemischen Blutvolumen eines Menschen typischerweise einen Behälter-Haupthämatocritwert von mindestens etwa 30%.
Bei diesem Verfahren hat ein Wirbeltier auch einen normalen, oder höher als normalen systemischen Gefäßwiderstand im Kreislaufsystem vor Verabreichung des Hämoglobins. Ein normaler systemischer Gefäßwiderstand ist ein Gefäßwiderstand, welcher nicht zu einem distributiven Schock, wie z. B. einem septischen Schock, im Wirbeltier führt.
Eine verminderte Strömung von roten Blutzellen umfasst jede Verminderung des RBC-Flusses, entweder lokalisiert, regionalisiert und/oder systemisch, unter normalen RBC-Strömungsniveaus, umfassend eine Bedingung, keiner RBC- Strömung. Ein lokalisierter RBC-Fluss besteht aus einem RBC-Fluss durch eine oder mehrere Kapillarien innerhalb eines Kapillarbetts, wobei die Kappilarien normalerweise einen RBC-Fluss zur Anreicherung eines lokalisierten Gewebebereichs mit Sauerstoff bereitstellen. Ein regionalisierter RBC-Fluss stellt einen RBC-Fluss zur Anreicherung einer größeren Gewebefläche, wie z. B. einer Extremität oder eines Organs bereit. Ein systemischer RBC-Fluss ist ein solcher durch die Kreislaufhauptsysteme des Körpers, und stellt somit RBC's zur Sauerstoffanreicherung des Körpers als Ganzes zur Verfügung.
Bei einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird Hämoglobin einem Wirbeltier verabreicht, das eine partielle Blockierung des Kreislaufsystems hat oder haben wird, wie z. B. eine Stenose oder vaskuläre Blockade, in einem Ausmaß, das nach der partiellen Blockade einen RBC-Fluss vermindert oder ausschließt, durch die jedoch mindestens etwas Plasma fließen kann. Die Verabreichung von Hämoglobin erhöht eine Sauerstoffanreicherung im Gewebe distal zu einer lokalisierten oder regionalisierten partiellen Blockade und/oder zur Erhöhung der Sauerstoffanreicherung im Gewebe durch den ganzen Körper hindurch, um eine partielle systemische Blockade zu behandeln.
Bei diesem Verfahren hat die partielle Blockade zumindest eine Öffnung, durch die eine Plasmakomponente, wie z. B. molekulares Hämoglobin, zum befallenen Gewebe fließen kann, wobei die Plasmakomoponente ein Molekulargewicht von etwa 16.000 Daltons oder mehr besitzt. Vorzugsweise hat die partielle Blockade zumindest eine Öffnung, durch die Plasmakomponenten mit einem Molekulargewicht von etwa 32.000 Daltons oder mehr (wie z. B. dimeres Hb) zum befallenen Gewebe strömen kann. Bevorzugter können Plasmakomponenten mit einem Molekulargewicht von etwa 64.000 Daltons oder mehr, wie z. B. intramolekular vernetztes tetrameres Hb, nach der partiellen Blockade des befallenen Gewebes fließen.
RBC's sind wesentlich größer als Hämoglobin und weisen typischerweise einen Durchmesser von 7 bis 10 Mikron auf, weshalb sie wesentlich größere vaskuläre Öffnungen erfordern als Hämoglobin (mit einem Durchmesser von 40-100 nm), um nach einer partiellen Blockade zu fließen.
Partielle Blockaden können an allen Gewebestellen und in allen Blutgefäßen, wie z. B. Arterien, Venen und Kapillarien, auftreten. Ferner können Klappen innerhalb des Kreislaufsystems, wie z. B. die Aorta-, Mitral- und Trikuspidalklappen, auch partial blockiert sein. Ferner kann die Herzkammer oder Teile derselben partiell blockiert sein, wie z. B. ventrikuläre Ausflüsse und die Ventrikelöffnung zur Pulmonararterie.
Eine partielle Blockierung des Kreislaufsystems kann vorübergehend, andauernd oder sich wiederholend sein. Eine teilweise Blockierung des Kreislaufsystems kann durch verschiedene Ursachen bewirkt werden, wie z. B. Gefäßwanddefekte, Erkrankung, Verletzung, Aggregation von Blutkomponenten, Neoplasmen, Raum einnehmende Verletzungen, Infektionen, Fremdkörper, Kompression, Arzneimittel, mechanische Vorrichtungen, Vasokonstriktion und Gefäßkrämpfe.
Eine Stenose des Kreislaufsystems, wie im vorliegenden definiert, ist eine Verengung irgend eines Kanals oder Lumens im Kreislaufsystem. Typischerweise kann eine Stenose von einer Erkrankung, wie z. B. einer Arterosklerose; einer Gefäßwandabnormalität, wie z. B. einer Nahtlinie von einem arteriellen Transplantat, einem Verbindungspunkt der Befestigung für ein Transplantat oder einen Stent, einem Knick oder einer Deformierung in einem Gefäß, Transplantat oder Stent, einem verheilten oder narbigen Gewebe von einer Verletzung oder einem invasiven Verfahren (wie z. B. einer Katheterisierung, Angioplastie, Einsetzen eines Stents, einer Gefäßtransplantation mit Prothese, halogenem Gewebe und/oder autologem Gewebe); einer Gefäßprothese, wie z. B. eine künstliche Klappe oder ein künstliches Gefäß; einer Kompression, wie z. B. durch eine neoplastische Masse, ein Hämatom oder mechanische Vorrichtungen (wie z. B. eine Klammer, Aderpresse oder Manschetteneinrichtung); einer chemischen Vergiftung oder Arzneimittelnebenwirkungen; einer Vasokonstriktion; sowie Vasospasmen herrühren.
Beispiele für Stenosen innerhalb von Kerzklappen oder Herzabschnitten umfassen Aortastenose, Knopflochstenose, Verkalkungs-Knotenstenose, ostiale Koronarstenose, doppelte Aortastenose, Fischmaul-Mitralstenose, idiopathische, hypertrophe Subaorta-Stenose, eine infundibuläre Stenose, muskuläre Subaorta- Stenose, Pulmonarstenose, Subaorta-Stenose, eine Stenose oberhalb oder unterhalb der Herzklappen, und eine Trikuspidalklappen-Stenose. Eine Gefäßblockade ist im vorlienden definiert als eine Blockade innerhalb eines Kanals oder Lumens des Kreislaufsystems. Typische Beispiele von Blockaden innerhalb eines Kanals oder Lumens umfassen in sit oder embolisiertes atheromatöses Material oder Plaques, Aggregationen von Blutkomponenten wie Blutplättchen, Fibrin und/oder anderen Zellkomponenten zu Klümpchen als Folge von Erkrankung oder Verletzung oder an der Stelle der Wundheilung. Klümpchen umfassen Thrombosen, Embolien und im Extremfall abnormale Koagulationszustände.
Andere Gefäßblockaden umfassen Blockaden, welche von einer Infektion durch einen Mikroorganismus oder Makroorganismus innerhalb des Kreislaufsystems herrühren, wie z. B. bei Pilz- oder Herzwurm-Infektionen.
Ferner können sich Gefäßblockaden aus Fremdkörpern ergeben, welche innerhalb irgend eines Kanals oder Lumens im Kreislaufsystem enthalten sind, wie z. B. ein absorbierbarer steriler Gelatineschwamm "GELFOAM®" zur Blockierung der Blutströmung während eines medizinischen Eingriffs oder eine abgebrochene Katheterspitze.
Bei einer anderen Auführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird Hämoglobin einem Wirbeltier verabreicht, das eine Herabsetzung der Population funktionierender, RBC's an einem Gewebebereich zu zuführender Blutgefäße aufweist, mit einer darauffolgenden Verminderung des RBC-Flusses zum befallenen Gewebe, wobei das verabreichte Hämoglobin die Sauerstoffanreicherung im befallenen Gewebe erhöht. Eine Verringerung der Population von Blutgefäßen ist typischerweise das Ergebnis einer Verbrennung (thermisch, chemisch oder durch Strahlung) oder eines medizinischen Eingriffs, wie z. B. einer Entfernung oder Kaustik von Blutgefäßen.
Bei einer noch anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Hämoglobin einem Wirbeltier verabreicht, welches einen verminderten systemischen Blutfluss und somit eine verminderte RBC-Strömung infolge einer kardiogenen Dysfunktion hat, wobei das verabreichte Hämoglobin die Anreicherung von Sauerstoff im Gewebe des gesamten Körpers erhöht. Kardiogene Dysfunktionen sind Erkrankungen oder Verletzungen des Herzens oder beeinflussen das Herz, was zu Bedingungen einer niederen Blutströmung, wie z. B. einem Myocardinfarkt, einer Myocardischemie, einer Myocardverletzung, Arrhytmie, Cardiomyopathie, Cardioneucopathie und einem periakardialen Erguss führt.
Bei diesem Verfahren ist eine partielle Blockade des Kreislaufsystems eine prenatalen Wirbeltiers typischerweise das Ergebnis einer Erkrankung oder eines Defekts, welche die Entwicklung vor der Geburt während der Schwangerschaft beeinflussen, oder einer Behandlung einer Erkrankung oder eines Defekts (wie z. B. bei der Gebärmutterchirurgie).
Die Verbesserung des Sauerstofftransports zum befallenen Gewebe durch verminderten RBC-Fluss durch intravaskuläre Verabreichung einer Hämoglobinlösung wird durch bedeutende Zunahmen der Sauerstoffanreicherung im Gewebe belegt, welche in den Beispielen 9 und 10 beobachtet wurden, nach einer intravaskulären Infusion ausreichender Dosen einer Hämoglobinlösung, um die Sauerstoffdrucke im Gewebe auf Grundlinienwerte wieder zu erlangen.
Das Hämoglobin ist, wenn es beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, nicht in natürlichem RBC enthalten, sondern liegt typischerweise in einem physiologisch annehmbaren Träger vor. Es wird bevorzugt, dass der Träger in flüssigem Zustand vorliegt. Es wird auch bevorzugt, dass das Hämoglobin innerhalb einer physiologisch annehmbaren Lösung oder Suspension von Hämoglobin innerhalb eines physiologisch akzeptablen Trägers vorliegt. Geeignete Hämoglobine umfassen die im vorliegenden beschriebenen Hämoglobinlösungen oder andere Formen von Hämoglobin, wie z. B. dimeres Hämoglobin, tetrameres Hämoglobin, intramolekular vernetztes Hämoglobin, polymerisiertes Hämoglobin, gefriergetrocknetes Hämoglobin und/oder chemisch modifiziertes Hämoglobin, bei dem ein wesentlicher Teil des Hämoglobins eines Transports und einer Übertragung von Sauerstoff fähig ist. Hämoglobin hat eine bedeutende Fähigkeit, Sauerstoff zu transportieren und überzuführen, wenn seine Verabreichung in das Kreislaufsystem eines Wirbeltiers zu einem meßbaren Anstieg des Sauerstoffdrucks im Gewebe bei hypoxischem Gewebe im Körper des Wirbeltiers führt. Vorzugsweise sind mindestens 85% des Hämoglobins in der Lage, Sauerstoff zu transportieren und zu übertragen.
Beispiele für andere geeignete Hämoglobinlösungen umfassen Hämoglobinlösungen, welche einen stabilisierten 2,3-Diphosphorglycerat-Spiegel aufweisen, wie im U.S.-Patent 3.864.478, erteilt an Bonhard beschrieben; ein vernetztes Hämoglobin, wie im U.S.-Patent Nr. 3.925.344. erteilt an Mazur, oder in den U.S.- Patenten Nrn. 4.001.200, 4.001.401 und 4.053.590, erteilt an Bonsen u. a., oder im U.S.-Patent 4.061.736, erteilt an Morris u. a., oder im U.S.-Patent Nr. 4.473.496, erteilt an Scannon, beschrieben ist; stroma-freies Hämoglobin, wie im U.S.-Patent Nr. 3 991.181, erteilt an Doczi, oder im U.S.-Patent-Nr. 4.401.652, erteilt an Simmonds u. a., oder im U.S.-Patent-Nr. 4.526.715, erteilt an Kothe u. a. beschrieben; Hämoglobin, gekoppelt an ein Polysaccharid, wie im U.S.-Patent-Nr. 4.064.118, erteilt an Wong, beschrieben, mit Pyridoxalphosphat kondensiertes Hämoglobin, wie im U.S.-Patent-Nr. 4.136.093, erteilt an Bonhard u. a., beschrieben; Dialdehyd-gekoppeltes Hämoglobin, wie im U.S.-Patent Nr. 4.336.248, erteilt an Bonhard u. a., beschrieben; mit Inulin kovalent gebundenes Hämoglobin, wie im U.S.-Patent 4.377.512, erteilt an Ajisaka u. a., beschrieben; Hämoglobin oder ein Hämoglobinderivat, das an ein Polyalkylenglycol oder an Polyalkylenoxid gekoppelt ist, wie im U.S.-Patent-Nr. 4.412.989, erteilt an Iwashita u. a., oder im U.S.-Patent-Nr. 4.670.417, erteilt an Iwasaki u. a. oder aber im U.S.-Patent Nr. 5.234.903, erteilt an Nho u. a. beschrieben; eine Pyrogen- und Stroma-freie Hämoglobinlösung, wie im U.S-Patent 4.439.357, erteilt an Bonhard u. a.; beschrieben; das Stroma-freie, im U.S.-Patent Nr. 4.473.494 beschriebene Hämoglobin, erteilt an Tye, modifiziertes vernetztes Stroma-freies Hämoglobin, wie im U.S.-Patent 4.529.719. erteilt an Tye; beschrieben, Stroma-freies, vernetztes Hämoglobin, wie im U.S.-Patent-Nr. 4.584.130, erteilt an Bucci u. a., beschrieben; ein α-vernetztes Hämoglobin, wie im U.S.-Patent 4.598.064 und Re. 34271, erteilt an Walder u. a., beschrieben; Tetramerfreies polymerisiertes, pyridoxyliertes Hämoglobin, wie in den U.S.-Patenten Nrn. 4.826.811 und 5.194.590, erteilt an Sehgal u. a., ein stabiles Alehyd-polymerisiertes Hämoglobin, wie im U.S.-Patent-Nr. 4.857.636, erteilt von Hsia, beschrieben; an sulfatierte Glycosaminoglycane kovalent gebundenes Hämoglobin, wie im U.S.- Patent 4.900.780, erteilt an Feller u. a., beschrieben; modifiziertes, mit einem Polymeren hohen Molekulargewichts umgesetztes Hämoglobin mit reaktionsfähigen Aldehyd-Bestandteilen, wie im U.S.-Patent 4.920.194, erteilt an Cerny; beschrieben; in Gegenwart von Natriumtripolysulfat vernetztes Hämoglobin, wie im U.S.-Patent 5.128.452, erteilt an Hai u. a.; beschrieben; stabiles, mit Polyaldehyd polymerisiertes Hämoglobin, wie im U.S.-Patent-Nr. 5.189.146, erteilt an Hsia; beschrieben; sowie β- vernetztes Hämoglobin, wie im U.S.-Patent-Nr. 5.250.665, erteilt an Kluger u. a., beschrieben.
Hämoglobin-Suspensionen umfassen Hämoglobin in Emulsionen oder emulgierte Hämoglobin-Lösungen. Beispiele für Hämoglobin-Suspensionen umfassen Hämoglobin-Lösungen, die eine Hämoglobin-Fraktion aufweisen, welche in mit Wasser nicht mischbaren amphiphylischen Membranen eingekapselt sind, wie im U.S.-Patent 4.543.130, erteilt an Djordjevich u. a. eingkapselt sind, eine Emulsion von zwei wässerigen Phasen, denen Stroma-freies Hämoglobin zugesetzt ist, wie in U.S.-Patent Nr. 4.874.742, erteilt an Ecanow u. a., beschrieben; sowie eine Wasser- in-Öl-in-Wasser-Mehrfachemulsion einer Hämoglobinlösung in einem physiologisch verträglichen Öl, wie in den U.S.-Patenten 5.061.688 und 5.217.648, erteilt an Beissinger u. a., beschrieben.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform liegt das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Hämoglobin in Form eines Blutersatzes aus polymerisiertem Hämoglobin, wie im vorliegenden beschrieben, vor.
Die Zusammensetzung der Hämoglobinlösungen oder Blutersatzstoffe die bevorzugt werden, sind sterile Lösungen mit weniger als 0,5 Endotoxineinheiten/ml, einem Methämoglobingehalt, der nicht zu einer wesentlichen Verminderung der Sauerstofftransport-Übertragungskapazität einer Hämoglobin-Gesamtkonzentration zwischen etwa 2 bis etwa 20 g Hb/dl und einem physiologischen pH-Wert führt. In einer noch mehr bevorzugten Ausführungsform hat die Hb-Lösung eine Hämoglobin- Gesamtkonzentration von etwa 12 bis etwa 14 g Hb/dl. Beispiele für die bevorzugten Hb-Lösungen und Blutersatzstoffe sind in den nachfolgenden Beispielen beschrieben.
Typischerweise ist eine geeignete Dosis oder Kombination von Dosen von Hämoglobin eine Menge Hämoglobin, die, wenn sie im Blutplasma enthalten ist, zu einer Erhöhung der Hämoglobin-Gesamtkonzentration in dem Blut eines Wirbeltiers von etwa 0,1 bis etwa 10 g Hb/dl führt. Eine bevorzugte Dosis für Menschen erhöht das gesamte Hämoglobin auf etwa 0,5 bis etwa 2 g Hb/dl. Eine bevorzugte Dosis für Hunde erhöht das gesamte Hämoglobin auf etwa 3,5 bis etwa 4,5 g Hb/kg des Körpergewichts.
Hämoglobin kann in das Kreislaufsystem durch seine direkte und/oder indirekte Injektion in das Kreislaufsystem des Wirbeltiers nach einer oder mehreren Injektionsmethoden verabreicht werden. Beispiele für direkte Injektionen umfassen intravaskuläre Injektionen, wie z. B. intravenöse und intraarterielle Injektionen sowie Injektionen ins Herz. Beispiele für indirekte Injektionen umfassen intraperitonale Injektionen, subkutane Injektionen, so dass das Hämoglobin durch das Lymphsystem in das Kreislaufsystem transportiert wird, und Injektionen in das Knochenmark mittels eines Trokars oder Katheters. Vorzugweise wird das Hämoglobin intravenös verabreicht.
Das unter Behandlung stehende Wirbeltier kann vor, während und/oder nach der Infusion der Hb-Lösung hypovolämisch, normovolämisch, hypervolämisch sein. Das Hämoglobin kann in das Kreislaufsystem nach Verfahren eingeleitet werden, wie einer Beladung von oben (top loading) und durch Austauschverfahren.
Zur Behandlung eines hypoxischen Gewebes in einem Wirbeltier, das von einem verminderten RBC-Fluss in einem Teil des Kreislaufsystems oder im ganzen Kreislaufsystem herrührt, kann Hämoglobin therapeutisch verabreicht werden. Fener kann Hämoglobin prophylaktisch verabreicht werden, um eine Erschöpfung des Wirbeltiergewebes an Sauerstoff zu verhindern, die sich aus einer möglichen oder erwarteten Verminderung des RBC-Flusses zu einem Gewebe oder durch das Kreislaufsystem des Wirbeltiers ergeben kann. Eine weitere Diskussion der Verabreichtung von Hämoglobin zur therapeutischen oder prophylaktischen Behandlung einer partiellen Arterienblockade oder einer partiellen Blockade des Mikrokreislaufs wird in Beispielen 10 bzw. 11 bereitgestellt.

BEISPIEL 1

Synthese eines stabilen polymerisierten Hb-Blutersatzes

Wie in U.S.-Patent-Nr. 5.296.465 beschrieben, wurden Proben von Rindervollblut gesammelt, mit Natriumcitrat als Antikoagulationismittel unter Bildung einer Blutlösung vermischt und sodann auf die Endotoxinspiegel analysiert.
Jede Blutlösungsprobe wurde nach Sammeln bei einer Temperatur von etwa 2ºC gehalten und sodann zur Entfernung großer Aggregate und Teilchen mit einem Sieb von 600 mesh gesiebt.
Vor dem Vereinen wurden in jeder Blutlösung der Penicillinspiegel mit einem Testkit, der von Difco, Detroit, Michigan, USA, vertrieben wird, unter Anwendung des Verfahrens mit dem Titel »Rapid Detection of Penicillin in Mil" ("Schnellnachweis von Penicillin in Milk"), um zu gewährleisten, dass die Penicillinspiegel in den Blutlösungen ≤ 0,008 Einheiten/ml waren.
Die Blutlösungsproben wurden sodann vereint und mit sterilisierter wässeriger Natriumcitratlösung unter Bildung einer 0,2 gew.%igen Lösung von Natriumcitrat in Rindervollblut (im folgenden als "0,2%ige Natriumcitrat-Blutlösung" bezeichnet) zu bilden.
Die 0,2% Natriumcitrat-Blutlösung wurde sodann durch in Reihe geschaltete 800 um und 50 um Polypropylenfilter geleitet, um große Trümmer in der Blutlösung mit einem Durchmesser von annähernd 500 um oder mehr zu entfernen.
Die RBC's wurden sodann gewaschen, um extrazelluläre Plasmaproteine abzutrennen, wie z. B. BSA oder IgG von den RBC's abzutrennen. Zum Waschen der in der Blutlösung enthaltenen RBC's wurde das Volumen der Blutlösung im Diafiltrationsbehälter anfänglich durch Zugabe eines gleichen Volumens einer filtrierten isotonischen Lösung zum Diafiltrationsbehälter verdünnt. Die isotonische Lösung wurde mit einer Millipore 10.000 Dalton-Ultrafiltrationsmembran (Cat # CDUF 050 G1) filtriert. Die isotonische Lösung setzte sich aus 6,0 g/Liter Natriumcitratdihydrat und 8,0 g/Liter Natriumchlorid in Wasser zur Injektion (WFI) zusammen.
Die verdünnte Blutlösung wurde sodann auf ihr ursprüngliches Volumen durch Diafiltration durch einen 0,2 um Hohlfaser-Diafilter (Microgon Krosflo II microfiltration cartridge) zurück konzentriert. Gleichzeitig wurde kontinuierlich eine filtrierte isotonische Lösung als Ausgleich mit einer Rate zugegeben, welche der Rate des Filtratverlustes durch den 0,2 um Diafilter gleich war. Während der Diafiltration gingen die Komponenten der verdünnten Blutlösung, welche einen wesentlich kleineren Durchmesser als die RBC's hatten, oder welche Flüssigkeiten wie Plasma sind, durch die Wände des 0,2 um Diafilters mit dem Filtrat. Die RBC's, Blutplättchen und größere Körper der verdünnten Blutlösung, wie z. B. weiße Blutzellen, wurden mit kontinuierlich zugegebener isotonischer Lösung unter Bildung einer dialysierten Blutlösung zurückgehalten.
Während des Waschens der RBC's wurde die verdünnte Blutlösung bei einer Temperatur von annähernd 10ºC bis 35ºC mit einem Flüssigkeitsdruck am Einlass des Diafilters zwischen etwa 25 psi und etwa 30 psi gehalten, um die Verfahrenswirksamkeit zu verbessern.
Das RBC-Waschen war vollständig, wenn das Volumen des aus dem Diafilter abgeflossenen Filtrats etwa 600% des Blutvolumens vor dem Verdünnen mit filtrierter isotonischer Lösung gleich war.
Die dialysierte Blutlösung wurde sodann kontinuierlich mit einer Rate von annähernd vier Liter/Minute zu einer Zentrifuge "Sharples Super Centrifuge, Model # AS-156" gepumpt, welche mit einem Ringdamm # 28 versehen war. Die Zentrifuge wurde betrieben, während gleichzeitig dyalisierte Blutlösung eingespeist wurde, um die RBC's von den weißen Blutzellen und Blutplättchen abzutrennen. Während des Betriebs drehte sich die Zentrifuge mit einer Geschwindigkeit, welche ausreichte, um die RBC's in eine schwere RBC-Phase zu trennen, während auch ein wesentlicher Teil der weißen Blutzellen (WBC's) und Blutplättchen in eine leichte WBC-Phase getrennt wurde, im speziellen bei etwa 15.000 UpM. Eine Fraktion der RBC-Phase und der WBC-Phase wurde getrennt und kontinuierlich aus der Zentrifuge während des Betriebs abgezogen.
Nach Trennung der RBC's wurden diese unter Bildung einer hämoglobinhaltigen Lösung lysiert. Ein wesentlicher Teil der RBC's wurde mechanisch lysiert, während die RBC's aus der Zentrifuge abflössen. Die Zellmembranen der RBC's zerrissen beim Aufprall auf die Wand der Abzugsleitung für die RBC-Phase mit einem Winkel zur Strömung der aus der Zentrifuge ausströmenden RBC-Phase, wodurch von den RBC's in die RBC-Phase Hämoglobin (Hb) freigesetzt wurde.
Die lysierte RBC-Phase strömte sodann durch die Abzugsleitung für die RBC- Phase in einen statischen Mischer (Kenics ¹/&sub2; inch mit 6 Elementen, Chemineer, Incl.). Gleichzeitig mit der Übertragung der RBC-Phase auf die statische Mischvorrichtung wurde auch eine gleiche Menge WFI in die statische Mischvomchtung eingespritzt, worin WFI mit der RBC-Phase vermischt wurde. Die Strömungsraten der RBC-Phase und von WFI in den statischen Mischer sind jeweils etwa 0,25 Liter pro Minute.
Das Vermischen der RBC-Phase mit WFI in der statischen Mischvorrichtung führte zu einem lysierten RBC-Kolloid. Das lysierte RBC-Kolloid wurde sodann von dem statischen Mischer in eine Zentrifuge Sharples Super Centrifuge (Model # AS- 16, Sharples Division of Alfa-Laval Separation, Inc.) übergeführt, welche zur Abtrennung des Hb von RBC-Komponenten, die sich von Hb unterscheiden, geeignet war. Die Zentrifuge drehte sich mit einer Geschwindigkeit, welche ausreichte, das lysierte RBC-Kolloid in eine leichte Hb-Phase und eine schwere Phase zu trennen. Die leichte Phase setzte sich aus Hb zusammen und enthielt auch Komponenten, die sich von Hämoglobin unterschieden, mit einer Dichte, welche der Dichte von Hb annähernd gleich oder geringer als diese war.
Die Hb-Phase wurde kontinuierlich von der Zentrifuge durch einen 0,45 um Mikrofilter "Millipore Pellicon Cassette, Cat # HVLP 000 C5 microfilter", in einen Lagerungstank zur Vorbereitung für die Reinigung von Hb abgezogen. Zellstrom wurde sodann mit dem Rückstand von Mikrofilter zum Lagerungsbehälter rückgeführt. Während der Mikrofiltration wurde die Temperatur innerhalb des Lagerungsbehälters bei 10ºC oder weniger gehalten. Zur Verbesserung der Wirksamkeit, war die Mikrofiltration vollständig, wenn der Flüssigkeitsdruck am Einlass des Mikrofilters von einem Anfangsdruck von etwa 10 psi auf etwa 25 psi angestiegen war. Das Hb-Mikrofiltrat wurde sodann vom Mikrofilter in den Mikrofilterbehälter übergeführt.
Sodann wurde das Hb-Mikrofiltrat durch einen Ultrafilter "100.000 Minipore Cat # CDUF 050 H1" gepumpt. Ein wesentlicher Teil von Hb und Wasser, der im Hb- Mikrofiltrat enthalten war, durchdrang den 100.000 Dalton Ultrafilter unter Bildung eines Hb-Ultrafiltrats, während größere Zelltrümmer, wie z. B. Proteine mit einem Molekulargewicht oberhalb etwa 100.000 Dalton zurückgehalten und in den Mikrofilterbehälter rückgeführt wurden. Gleichzeitig wurde WFI kontinuierlich zum Mikrofilterbehälter als Ergänzung von Wasser, das im Ultrafiltrat verloren ging, zugegeben. In der Regel umfassen die Zelltrümmer alle ganzen und fragmentierten Zellkomponenten mit Ausnahme von Hb, kleineren Zellproteinen, Elektrolyten, Coenzymen und organischen Stoffwechsel-Zwischenprodukten. Die Ultrafiltration wurde fortgesetzt, bis die Konzentration an Hb im Mikrofiltratbehälter weniger als 8 g/Liter betrug. Während das Hb ultrafiltriert wurde, wurde die Innentemperatur des Mikrofiltratbehälters bei etwa 10ºC gehalten.
Das Hb-Ultrafiltrat wurde in einen Ultrafiltratbehälter übergeführt, indem das Hb-Ultrafiltrat sodann durch einen 30.000 Dalton Ultrafilter "Millipore Cat # CDUF 050 T1" rückgeführt wurde, um kleinere Zellkomponenten, wie z. B. Elektrolyte, Coenzyme, Stoffwechsel-Zwischenprodukte und Proteine von weniger als etwa 30.000 Daltons Molekulargewicht, und Wasser aus dem Hb-Ultrafiltrat zu entfernen, wobei eine konzentrierte Hb-Lösung mit einem Gehalt an etwa 100 g Hb/Liter anfiel. Die konzentrierte Hb-Lösung wurde sodann von dem Ultrafiltratbehälter auf die in parallelen Chromatographiesäulen (einer Länge von 2 feet und eines Innendurchmessers von 8 inch) enthaltene Medien geleitet, um durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie das Hb abzutrennen. Die Chromatographiesäulen enthielten ein Anionenaustauschmedium, das zur Abtrennung von Hb von Proteinen, die kein Hämoglobin waren, geeignet war. Die Anionenaustauschmedien waren aus Silicagel gebildet. Das Silicagel wurde zur Bildung aktiver Epoxidgruppen γ-Glycidoxypropyltrimethoxysilan und sodann Dimethylaminoethanol (HOCH&sub2;CH&sub2;N(CH&sub3;)&sub2;) ausgesetzt, um ein quartäres Ammonium-Anionenaustauschmedium zu bilden. Dieses Verfahren der Silicagel- Behandlung ist in Journal of Chromatography, 120: 321-333 (1976) beschrieben.
Jede Chromatographiesäule wurde durch Spülen mit einem ersten Puffer, der die Hb-Bindung erleichterte, vorbehandelt. Sodann wurden 4,52 Liter der konzentrierten Hb-Lösung auf jede Chromatographiesäule gegeben. Nach Auftragen der konzentrierten Hb-Lösung wurden die Chromatographiesäulen gewaschen, indem man nacheinander drei verschiedene Puffer durch die Chromatographiesäulen leitete, um ein Hb-Eluat herzustellen, indem man einen pH- Gradienten innerhalb der Säulen anstellte. Die Temperatur jeden Puffers währen der Verwendung war etwa 12,4ºC. Die Puffer wurden durch eine Ultrafiltrationsmembran von 10.000 Dalton vorfiltriert, bevor sie auf die Chromatographiesäulen gebracht wurden.
Der erste Puffer, 20 mM Trishydroxymethylaminomethan (Tris) (pH-Wert etwa 8,4 bis etwa 9,4), transportierte die konzentrierte Hb-Lösung in die Medien in den Chromatographiesäulen zur Bindung von Hb. Der zweite Puffer, ein Gemisch des ersten Puffers mit einem dritten Puffer, wobei der zweite Puffer einen pH-Wert von etwa 8,3 hatte, stellte sodann den pH-Wert innerhalb der Chromatographiesäulen ein, um verunreinigende, sich von Hämoglobin unterscheidende Komponenten aus den Chromatographiesäulen zu eluieren, während Hb zurückgehalten wurde. Das Abgleichen mit dem zweiten Puffer wurde etwa 30 Minuten bei einer Strömungsgeschwindigkeit von etwa 3,56 Liter/Minute und Kolonne fortgesetzt. Das Eluat aus dem zweiten Puffer wurde verworfen. Der dritte Puffer, 50 mM Tris (mit einem pH-Wert von etwa 6,5 bis etwa 7,5) eluierte sodann das Hb aus den Chromatographiesäulen.
Das Hb-Eluat wurde dann durch einen Filter 0,22 M Sartobran Cat # 5232507 G1PH zu einem Behälter geleitet, in dem das Hb-Eluat gesammelt wurde. Die ersten 3 bis 4% des Hb-Eluats und die letzten 3-4% des Hb-Eluats wurden verworfen.
Sodann wurde das Hb-Eluat auf annähernd 100 g Hb/Liter konzentriert. Das Hb-Eluat wurde ferner verwendet, wenn das Eluat weniger als 0,05 EU/ml Endotoxin und weniger als 3,3 nMol/ml Phospholipide enthielt. Zu 60 Litern konzentriertes ultrareines Eluat, das eine Konzentration von 100 g Hb/Liter hatte, wurden 9 Liter eines Puffers aus 1,0 M NaCl, 20 mM Tris-Puffer (pH-Wert 8,9) zugegeben, wobei sich eine Hb-Lösung mit einer Ionenstärke von 160 mM bildete, um die Sauerstoffaffinität des Hb in der Hb-Lösung herabzusetzen. Die Hb-Lösung wurde sodann bei 10ºC konzentriert, indem man sie durch den Ultrafilter, in speziellen den 10.000 Dalton Filter "Millipore Helicon, Cat # CDUF 050 G1" rückführte, bis die Hb- Konzentration 110 g/Liter betrug.
Die Hb-Lösung wurde sodann von Sauerstoff befreit, bis der Sauerstoff- Partialdruck (pO&sub2;) der Lösung auf das Niveau gesenkt war, wo der HbO&sub2;-Gehalt etwa 10% betrug, und zwar durch Rückführung der Hb-Lösung bei 12 Litern pro Minute durch eine Polypropylenmikrofilter-Phasentransfermembran (0,05 um Cat # G-240/40 der Hoechst-Celanese Corporation) unter Bildung einer von Sauerstoff befreiten ("deoxydierten") Hb-Lösung (im vorliegenden als "Deoxy-Hb" bezeichnet). Gleichzeitig wurde ein Stickstoffgasstrom mit 60 Liter/Minute durch die Gegenseite der Phasentransfermembran geleitet. Während der Sauerstoffbefreiung wurde die Temperatur der Hb-Lösung zwischen etwa 19ºC und etwa 31ºC gehalten.
Auch während der Befreiung von Sauerstoff und danach während des Verfahrens wurde das Hb in einer Umgebung mit geringen Sauerstoffgehalt gehalten, um die Sauerstoffabsorption durch das Hb auf einem Minimum zu halten und einen Gehalt an mit Sauerstoff angereichertem Hb (Oxyhämoglobin, HbO&sub2;) von weniger als etwa 10% im Deoxy-Hb aufrechtzuerhalten.
Das Deoxy-Hb, 60 Liter, wurde sodann durch einen Ultrafilter mit 180 Liter eines Lagerungspuffers mit einem Gehalt an 0,2 Gew.-% N-Acetylcystein, 33 mM Natriumphosphatpuffer (pH-Wert 7,8) mit einem pO&sub2; von weniger als 50 Torr diafiltriert, unter Bildung eines oxidationsstabilisierten Deoxy-Hb. Vor dem Vermischen mit dem Deoxy-Hb wurde der Lagerungspuffer mit einem sterilisierenden Filter 10.000 Dalton Millipore Helicon, Cat # CDUF 050 G1 sterilisiert. Der Lagerungspuffer wurde mit einer Rate kontinuierlich zugegeben, welche dem Flüssigkeitsverlust durch den Ultrafilter annähernd äquivalent war. Die Diafiltration wurde fortgesetzt, bis das Volumen der durch die Diafiltration durch den Ultrafilter verlorenen Flüssigkeit etwa das Dreifache des Anfangsvolumen von Deoxy-Hb war. Das Material kann an dieser Stelle gelagert werden.
Vor der Übertragung des oxidationsstabilisierten Deoxy-Hb in eine Polymerisationsvorrichtung, wurde Sauerstoffarmes WFI dem Polymerisationsreaktor zugegeben, um die Polymeriationsvorrichtung von Sauerstoff zu reinigen, um eine Sauerstoffanreichung des oxidationsstabilisierten Deoxy-Hb zu verhindern. Die zur Polymerisationsvorrichtung zugegebene WFI-Menge war diejenige Menge, welche zu einer Hb-Lösung mit einer Konzentration von etwa 40 g Hb/Liter führte, wenn das oxidationsstabilisierte Deoxy-Hb dem Polymerisationsreaktor zugegeben wurde. WFI wurde sodann durch die Polymerisationsvorrichtung im Umlauf geführt, um es durch Strömung durch eine 0,05 um Polypropylenmikrofilter- Phasentransfermembran (Hoechst-Celanese Corporation cat #ä 5PCM-108. 80 sq. ft.) gegen eine Gegenströmung von Stickstoff unter Druck von Sauerstoff zu befreien. Die Strömungsgeschwindigkeiten von WFI und Stickstoffgas durch die Phasentransfermembran waren etwa 18-20 Liter/Minute bzw. 40 bis 60 Liter/Minute.
Nachem der pO&sub2; von WFI in der Polymerisationsvorrichtung auf weniger als etwa 2 Torr pO&sub2; herabgesetzt war, wurde der Polymerisationsreaktor mit Stickstoff durch eine Strömung von etwa 20 Liter/Minute Stickstoff in den Kopfraum des Polymerisationsreaktors gespült. Das oxidationsstabilisierte Deoxy-Hb wurde sodann in den Polymerisationsreaktor übergeführt.
Die Polymerisation wurde in einem 12 mM Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,8 durchgeführt, der eine Chloridkonzentration aufwies, die geringer als etwa 35 millimolar oder gleich war, die durch Vermischen der Hb-Lösung mit WFI gebildet wurde.
Das oxidationsstabilisierte Deoxy-Hb, und N-Acetylcystein sodan langsam mit Glutaraldehyd als Vernetzungsmittel, im speziellen 29,4 g Glutaraldehyd für jedes Kilogramm Hb, innerhalb eines fünfstündigen Zeitraums unter Erwärmen auf 42ºC und Rückführung der Hb-Lösung durch eine Kenics 1¹/&sub2; inch statische Mischvorrichtung mit 6 Elementen (Chemineer, Inc.) unter Bildung einer Lösung polymerisiertem Hb [Poly(Hb)] vermischt.
Die Rückführung des oxidationsstabilisierten Deoxy-Hb und des Glutaraldehyds durch die statische Mischvorrichtung verursachte Bedingungen einer turbulenten Störmung mit einem in der Regel gleichmäßigen Vermischen des Glutaraldehyds mit dem oxidationsstabilisierten Deoxy-Hb, wodurch das Potenzial für die Bildung von Nester des Deoxy-Hb mit einem Gehalt an hohen Konzentrationen von Glutaraldehyd vermindert wurde. In der Regel verminderte das gleichförmige Vermischen von Glutaraldehyd und Deoxy-Hb die Bildung von Poly(Hb) hohen Molekulargewichts (mit einem Molekulargewicht oberhalb von 500.000 Daltons) und erlaubte auch ein schnelleres Vermischen von Glutaraldehyd und Deoxy-Hb während der Polymerisation. Ferner ergab sich während der Polymerisation von Hb eine wesentliche intramolekulare Vernetzung von Hb als eine Wirkung der Anwesenheit von N-Acetylcystein bei der Hb-Polymerisation.
Nach Polymerisation wurde die Temperatur der Poly(Hb)-Lösung im Polymerisationsreaktor auf etwa 15ºC bis etwa 25ºC gesenkt.
Die Poly(Hb)-Lösung wurde sodann durch ihre Rückführung durch den Ultrafilter konzentriert, bis die Konzentration an Poly(Hb) auf etwa 85 g/Liter erhöht war. Ein geeigneter Ultrafilter ist ein 30.000 Dalton Filter (z. B. Millipore Helicon, Cat # CDUF 050 LT).
Sodann wurde die Poly(Hb)-Lösung mit 66,75 g Natriumborhydrid vermischt und abermals durch den statischen Mischer im Umlauf geführt. Im speziellen wurden für jeweils 9 Liter der Poly(Hb)-Lösung 1 Liter einer 0,25 molaren Natriumborhydridlösung mit einer Rate von 0,1 bis 0,12 Liter/Minute zugegeben.
Vor Zugabe von Natriumborhydrid zur Poly(Hb)-Lösung wurde deren pH-Wert durch Einstellung des pH-Werts auf etwa 10 basisch gemacht, um das Natriumborhydrid zu erhalten und die Bildung von Wasserstoffgas zu vermeiden. Der pH-Wert der Poly(Hb)-Lösung wurde durch Diafiltrieren derselben mit annähernd 215 Liter eines sterilen, von Sauerstoff befreiten 12 mM Natriumboratpuffers mit einem pH-Wert von etwa 10,4 bis etwa 10,6 eingestellt. Die Poly(Hb)-Lösung wurde diafiltriert, indem man sie vom Polymerisationsreaktor durch den 30 kD Ultrafilter im Umlauf führte. Der Natriumboratpuffer wurde zur Poly(Hb)- Lösung mit einer Rate zugegeben, welche annähernd der Rate des Flüssigkeitsverlusts durch den Ultrafilter bei der Diafiltration äquivalent war. Die Diafiltration wurde fortgesetzt, bis das Volumen der durch den Ultrafilter bei der Diafiltration verlorenen Flüssigkeit etwa das Dreifache des ursprünglichen Volumens der Poly(Hb)-Lösung im Polymerisationsreaktor war.
Nach der pH-Einstellung wurde die Natriumborhydridlösung zum Polymerisationsreaktor zugegeben, um Imidbindungen in der Poly(Hb)-Lösung zu Ketiminbindungen zu reduzieren und stabiles Poly(Hb) in Lösung zu bilden. Während der Zugabe von Natriumborhydrid wurde die Poly(Hb)-Lösung im Polymerisationsreaktor kontinuierlich durch die statische Mischvorrichtung und die 0,05 um Polypropylenmikrofilter-Phasentransfermembran zur Entfernung aufgelösten Sauerstoffs und Wasserstoffs im Umlauf geführt. Die Strömung durch eine statische Mischvorrichtung führte auch zu den Bedingungen einer turbulenten Strömung von Natriumborhydrid, welche Natriumborhydrid mit der Poly(Hb)-Lösung schnell und wirksam vermischte. Die Strömungsraten von Poly(Hb)-Lösung und Stickstoffgas durch die 0,05 um Phasentransfermembran waren zwischen etwa 2,0 bis 4,0 Liter/Minute bzw. etwa 12 bis 18 Liter/Minute. Nach Abschluss der Zugabe von Natriumborhydrid wurde im Polymerisationsreaktor die Reduktion fortgesetzt, während ein in diesem enthaltener Rührer sich mit etwa 75 UpM drehte.
Etwa eine Stunde nach der Natriumborhydridzugabe wurde die stabile Poly(Hb)-Lösung von dem Polymerisationsreaktor durch den 30.000 Dalton Ultrafilter im Umlauf geführt, bis die Konzentration der stabilen Poly(Hb)-Lösung 110 g/Liter betrug. Nach der Konzentration wurden der pH-Wert und die Elektrolyten der stabilen Poly(Hb)-Lösung wieder auf physiologische Spiegel eingestellt, unter Bildung eines stabilen Blutersatzes aus polymerisiertem Hb, indem man die stabile Poly(Hb)-Lösung durch den 30.000 Dalton Ultrafilter mit einem filtrierten, von Sauerstoff befreiten Puffer niedrigen pH-Werts mit einem Gehalt an 27 mM Natriumlactat, 12 mM NAC, 115 mM NaCl, 4 mM KCl und 1,36 mM CaCl&sub2; in WFI (pH-Wert: 5,0) diafiltrierte. Die Diafiltration wurde fortgesetzt, bis das Volumen der bei der Diafiltration durch den Ultrafilter verlorenen Flüssigkeit etwa das Sechsfache des Volumens vor der Diafiltration des konzentrierten Hb-Produkts war.
Nach Wiedereinstellung des pH-Werts und der Elektrolyte auf physiologische Spiegel wurde der stabile polymerisierte Hb-Blutersatz auf eine Konzentration von 5,0 g/dl durch Zugabe des filtrierten, von Sauerstoff befreiten Puffers niederen pH- Werts zum Polymerisationsreaktor verdünnt. Der verdünnte Blutersatz wurde sodann durch Umlauf vom Polymerisationsreaktor durch die statische Mischvorrichtung und einen 100.000 Dalton Reinigungsfilter gegen einen filtrierten, von Sauerstoff befreiten Puffer mit einem Gehalt an 27 mM Natriumlactat, 12 mM NAC, 115 mM NaCl, 4 mM KCl und 1,36 mM CaCl&sub2; in WFI (vom pH-Wert 7,8) diafiltriert. Die Diafiltration wurde fortgesetzt, bis der Blutersatz weniger als oder gleich etwa 10% modifiziertes Tetrameres und unmodifiziertes Tetrameres, bestimmt durch GPC unter dissoziierenden Bedingungen, enthielt.
Der Reinigungsfilter wurde unter Bedingungen eines geringen Transmembrandrucks mit einer beschränkten Permeatlinie betrieben. Nach Entfernung wesentlicher Mengen von modifiziertem tetrameren Hb und unmodifizierten tetrameren Hb wurde die Rückführung des Blutersatzes durch den 30.000 Dalton Ultrafilter fortgesetzt, bis die Konzentration des Blutersatzes etwa 130 g/Liter betrug.
Der stabile Blutersatz wurde sodann in einem geeigneten Behälter mit einer Umgebung geringen Sauerstoffgehalts und einer geringen Sauerstoff-Undichtigkeit gelagert.

BEISPIEL 2

Lagerung des Hämoglobin-Blutersatzes

Der wie in Beispiel 1 hergestellte Hämoglobin-Blutersatz, abgepackt in eine 600 ml Stericon-Verpackung, wurde in eine Verpackung aus einem Metallfolienlaminat (KAPAK 50303, weiter unten als Metallfolie bezeichnet), Cryovac BYV200 oder Cryovac P640B als Verpackung eingehüllt. Die Konstruktion von Kapak 50303 und Cryovac BYV200, die als Behälter verwendet wurden, ist weiter oben in Einzelheiten diskutiert. Cryovac P640b ist ein Laminat, umfassend eine 0,6 mm mit Saran beschichtete, biaxial gereckte Nylonschicht, eine 0,1 mm dicke Klebstoffschicht und eine 2,0 mm dicke Versiegelungsschicht aus linearem Polyethylen niederer Dichte. Die Sauerstoffdurchlässigkeit des Materials ist etwa 8 bis 15 cm³/100 sq. in 24 Stdn./Atm./72ºF/0% feuchtigkeit. Die abgepackten Blutersatzstoffe wurden etwa 418 Tage bei Raumtemperatur unter periodischer Prüfung der Konzentration und/oder der Spiegel von N-Acetyl-L-cystein (NAC), Bls- N-acetyl-L-(HbO&sub2;) und Methämoglobin (MetHb) gehalten. Die Ergebnisse sind in folgender Tabelle II dargelegt. Tabelle II Stabilitätsdaten bei klaren Umhüllungen (Verbindung 800)
Anm.: N. D. = nicht nachgewiesen
Der obige Versuch wurde im wesentlichen wiederholt, wobei ein Hämoglobin- Blutersatz in eine Verpackung aus einem Metallfolienlaminat (KAPAK 50303) eingehüllt wurde. Die abgepackten Blutersatzstoffe wurden bei Raumtemperatur etwa 24 Monate gehalten, wobei die Konzentration und/oder die Spiegel von N- Acetyl-L-cystein (NAC), Bis-N-acetyl-L-cystein (NAC&sub2;), von Gesamt-Hb (THb), des mit Sauerstoff angereicherten Hämoglobins (HbO&sub2;) sowie von Methämoglobin (MetHb) gemessen wurden. Die Ergebnisse sind in folgender Tabelle III angegeben. Tabelle III Stabilitätsdaten bei klaren Umhüllungen (Verbindung 800)

BEISPIEL 3

Analyse des polymerisierten Hämoglobins

Die Endotoxin-Konzentration im Hämoglobinprodukt wird nach dem Verfahren ("Kinetic/Turbidimetric LAL 5000 Methodology", entwickelt von Associates of Cape Cod, Woods Hole, Massachusetts. U.S.A., J. Levin u. a. J. Lab Clin. Med., 75 : 903-911 (1970) bestimmt. Zum Testen von irgend welchen Spuren an Stroma wurden verschiedene Verfahren angewandt, beispielsweise ein Ausfällungstest, das Immunoblotten und ein Enzym-gebundener Immunosorbens-Test (ELISA) für ein spezielles Zellmembranprotein oder Glycolipid, wie dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt.
Die Teilchenzählung wurde nach dem Verfahren "Particulate Matter in Injections: Large Volume Injections for Single Dose Infusions", U.S. Arzneimittelbuch, 22: 1596, 1990 durchgeführt.
Zur Bestimmung der Glutaraldehyd-Konzentration wurde eine repräsentative Probe des Hämoglobin-Produkts von 400 ul mit Dinitrophenylhydrazin derivatisiert, wonach ein gleicher Teil von 100 ul der Derivatlösung auf eine Säule YMC AQ-303 ODS bei 27ºC mit einer Rate von 1 ml/Min., zusammen mit einem Gradienten, aufgebracht wurde. Der Gradient bestand aus zwei mobilen Phasen. 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) in Wasser und 0,08% TFA in Acetonitril. Die Gradientenströmung bestand aus einer Konstanten zu 60% der 0,08%igen TFA- Lösung in Acetonitril für 6,0 Min., einem linearen Gradienten zu 85% einer 0,08%igen TFA-Lösung in Acetonitril innerhalb 12 Minuten, einem linearen Gradienten zu 100% der 0,08%igen TFA-Lösung in Acetonitril innerhalb 4 Minuten, gehalten bei 100% der 0,08%igen TFA-Lösung in Acetonitril für 2 Minuten und wieder ins Gleichgewicht gebracht bei 45% der 0,1%igen TFA-Lösung in Wasser. Die Ultraviolettbestimmung erfolgte bei 360 nm.
Zur Bestimmung der NAC-Konzentration wurde ein aliquoter Teil des Hämoglobinprodukts mit entgastem Natriumphosphat in Wasser auf 1 : 100 verdünnt, und 50 ul wurden auf eine Säule YMC AQ-303 ODS mit einem Gradienten aufgebracht. Die Gradientenpuffer bestanden aus einer Lösung. von Natriumphosphat in Wasser und einem Gemisch aus 80% Acetonitril in Wasser mit 0,05% TFA. Die Gradientenströmung bestand aus 100% Natriumphosphat in Wasser während 15 Minuten, dann aus einem linearen Gradienten zu 100% eines Gemischs von 80% Acetonitril und der 0,05%igen Lösung von TFA innerhalb 5 Minuten, bei einer Verweilzeit von 5 Minuten. Das System wurde sodann bei 100% Natriumphosphat für 20 Minuten wieder ins Gleichgewicht gebracht.
Die Phospholipidanalyse wurde nach einem Verfahren auf Grundlage von Verfahren vorgenommen, welche in folgenden zwei Druckschriften enthalten sind: Kolarovic u. a. "A Comparison of Extraction Methods für the Isolation of Phospholipids from Biological Sources", Anal. Biochem., 156: 244-250, 1986 und Duck-Chong, C. G., "A Rapid Sensitive Method for Determining Phospholipid Phosphorus Involving Digestion With Magnesium Nitrate", Lipids, 14: 492-497, 1979.
Die Osmolarität wurde durch Analyse mit einem "Advanced Cryomatic Osmometer, Model # 3C2", Advanced Instruments, Inc., Needham, Massachusets, U.S.A. bestimmt.
Die Konzentrationen an Gesamthämoglobin, Methämoglobin und Oxyhämoglobin wurden mit einem Messgerät "Co-Oximeter Model # 482", Instrumentation Laboratory, Lexington, Massachusets, U.S.A. bestimmt.
N-&spplus;, K&spplus;, Cl-, Ca&spplus;&spplus;, und der Sauerstoff-Partialdruck (pO2) wurde durch das Messinstrument "Novastat Profile 4", Nova Biomedical Corporation, Waltham, Massachusetts ermittelt.
Die Sauerstoffbindungskonstante P30 wurde mit einer Analysenvorrichtung "Hennox-Analyzer", TCS Corporation, Southhampton, Pensylvania bestimmt.
Die Temperatur und der pH-Wert wurden nach dem Fachmann bekannten Standardverfahren bestimmt.
Das Molekulargewicht (M. W.) wurde ermittelt, indem man die Hämoglobin- Produkte unter dissoziierenden Bedingungen einer Gelpermeationschromatographie (GPC) unterzog. Eine repräsentative Probe des Hämoglobinprodukts wurde auf seine Molekulargewichtsverteilung analysiert. Das Hämoglobinprodukt wurde auf 4 mg/ml mit einer mobilen Phase von 50 mM Bis-Tris (pH-Wert: 6,5), 750 mM MgCl&sub2; und 0,1 mM EDTA verdünnt. Dieser Puffer dient zur Dissoziierung des Hb- Tetrameren in Dimere, welche nicht durch intra- oder intermolekulare Vernetzungen zu anderen Hb-Dimeren von dem Poly(Hb) vernetzt worden waren. Die verdünnte Probe wurde auf eine Säule TosoHaas G3000SW aufgebracht. Die Fließgeschwindigkeit betrug 0,5 ml/Min., und der Ultraviolettnachweis wurde bei 280 nm aufgezeichnet.
Die Ergebnisse der obigen Tests des tiermedizinischen Hb-Blutersatzes (OXYGLOBIN®) und menschlichen Hb-Blutersatzes (HEMOPURE®, 2), hergestellt nach dem erfindungsgemäßen Verfahren, sind in den Tabellen IV bzw. V zusammengefasst. Tabelle IV
a = gemessen im Hb vor der Polymerisation Tabelle V
a = gemessen in Hb vor der Polymerisation
Ferner zeigte die Bewertung des Blutersatzes, hergestellt nach vorliegendem Verfahren, dass der Blutersatz auch einen allgemeinen Sicherheitstest befriedigend bestand. In diesem Sicherheitstest wurden zwei Mäuse und zwei Meerschweinchen mit dem Blutersatz injiziert, wonach die Testtiere sieben Tage überwacht wurden. Keines der mit dem Blutersatz injiziierten Tiere erlitt eine Gewichtserhöhung, ein Gewichtsverlust oder den Tod, wodurch die allgemeine Sicherheit des Blutersatzes belegt wird.

BEISPIEL 4

Stabilitätsanalyse eines stabilen Blutersatzes aus polymerisiertem Hämoglobin

Die Stabilität des nach den erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Blutersatzes aus polymerisiertem Hämoglobin wurde über einen Zeitraum von 24 Monaten bei verschiedenen Lagerungstemperaturen bewertet. Die speziellen bewerteten Lagerungstemperaturen waren 2-8ºC, Raumtemperatur (etwa 25ºC) und 37ºC. Für eine Lagerung bei 2-8ºC und Raumtemperatur (RT) zeigen die Stabilitätsergebnisse (vgl. Tabelle VI), dass der Blutersatz zwei Jahre mit minimalen Veränderungen der Zusammensetzung des Blutersatzes stabil war. Ferner war bei einer Lagerung bei 37ºC der Blutersatz über ein Jahr stabil. Bei 37ºC 18 Monate gelagerter Blutersatz zeigte jedoch < 5 Teilchen/ml von 25 p und mehr als 11% Hb mit einem Molekulargewicht von mehr als 500.000 Daltons.
Bei diesen Analysen wurden die Hämoglobin-Gesamtkonzentration und die Konzentrationen von Methämoglobin und Oxyhämoglobin mit einer Messvorrichtung "Co-Oximeter Modell # 482", von Instrumentation Laboratory, Lexington, MA, U.S.A. bestimmt. Tabelle VII
N. D. = nicht nachgewiesen
best. = bestanden
Ferner wurde das Molekulargewicht durch Durchführung einer Hochleistungs- Größenausschlusschromatographie (HPSEC) mit dem Blutersatz bestimmt. Eine repräsentative Probe des Blutersatzes wurde auf die Molekulargewichtsverteilung analysiert. Das Hämoglobinprodukt wurde auf 4 mg/ml mit einer mobilen Phase von 50 mM Bis-Tris (pH-Wert 6,5), 750 mM MgCl&sub2; und 0,1 mM EDTA verdünnt. Die verdünnte Probe wurde auf eine HPLC-Säule (TosoHaas G3000SW) aufgebracht. Die Strömungsrate war 0,5 ml/Minute, und der Ultraviolettnachweis wurde auf 280 nm eingestellt.
Die Unversehrtheit der Verpackung wurde bewertet, indem man eine visuelle Inspektion der Verpackungen, welche den Blutersatz enthielten, auf Undichtigkeiten durchführte.

BEISPIEL 5

Ermittlung onkotischer Wirkungen in vivo bei Hunden

Der Zweck dieser Untersuchung war die Ermittlung der onkotischen Wirkungen in vivo, speziell des in den intravaskulären Raum gezogenen Wasservolumens pro Gramm verabreichtes Hämoglobin des in der Veterinärmedizin verwendeten Hb-Blutersatzes (OXYGLOBIN®) bei Hunden der Rasse Beagle, deren Milz entfernt war, durch Messen der Ausdehnung des Plasmavolumens nach einer Toploading-Dosis. Ferner wurde auch eine vergleichbare Dosis von RHEOMACRODEX®-Kochsalzlösung, hergestellt von Pharmacia, bestimmt, welche aus 10% Dextran 40 und 0,9% Kochsalzlösung besteht.
Es wurden zwei Hunde nach einem Routine-Gesundheitsscreenen und einem Akklimationszeitraum von mindestens vier Wochen in diese Untersuchung einbezogen. Mindestens drei Tage vor der Behandlung wurde den Hunden die Milz entfernt. Sie wurden mit einer Kombination von Atropin und Meperidin-HCl voranästhesiert und auf dem Weg der Inhalation von Isofluran anästhesiert. Während des chirurgischen Eingriffs wurde mit Lactat versetzte Ringer-Lösung mit 10-20 ml/kg/Std. infundiert.
Die Hunde erhielten den Hb-Blutersatz (40 ml/kg) zu 20 ml/kg/Std. über einen Kopf-Wegwerfkatheter. Der Hamatokritwert wude vor der Dosierung und eine Viertelstunde, eine halbe Stunde, 1, 2, 3, 4 Stunden nach der Dosierung oder länger gemessen, bis sich der Tiefpunkt des Hämatokritwerts einstellte.
Aus den Hunden wurde die Milz entfernt, um ein konstantes Plasmavolumen und eine RBC-Masse zu gewährleisten, um eine genaue Messung der Veränderung des Plasmavolumens nach der Dosierung zu ermöglichen.
Die Berechnung der Veränderung des Plasmavolumens wurde unter Verwendung folgender Gleichung gemacht:
worin PV das Plasmavolumen, Hct&sub1; der Hämatokrit-Anfangswert und Hct&sub2; der Hämatokrit-Endwert sind. Dieser Berechnung lag die Veränderung des Hämatokrit- Werts zugrunde, unter der Annahme, dass die Anzahl von RBC's im Kreislauf- Blutvolumen, und das mittlere Korpuskularvolumen konstant blieben.
Wie in Tabelle VII gezeigt wird, trat der Tiefpunkt des Hämatokrit-Werts zwei Stunden nach Verabreichung bei beiden Hunden auf. Das, mittlere Korpuskularvolumen (MCV) blieb die ganze Untersuchung hindurch stabil. Tabelle VII
Das Volumen der nach der Dosierung intravaskulär abgezogenen Flüssigkeit war 6 ml/g Hämoglobin und 9 ml/g Hämoglobin für die Hunde 3503 C bzw. 14, männlich. Die Dosis der synthetischen kolloiden Lösung (Rheomacrodex®- Kochsalzlösung) wurde unter Zugrundelegung einer Dosis berechnet, welche eine ähnliche onkotische Wirkung verursachte. Rheomacrodex zieht entwa 22 ml Flüssigkeit aus dem Interstitium pro Gramm, wenn es intravenös verabreicht wird.
Die berechnete vergleichbare Dosis von Rheomacrodex war 14 ml/kg und 7 ml/kg für 30 ml/kg bzw. 15 ml/kg Hb-Blutersatz.
Das Volumen der intravaskulär durch den Hb-Blutersatz Oxyglobin® abgezogenen Flüssigkeit war 8 ml H&sub2;O/g Hämoglobin. Da das Volumen der Dosis 30 ml/kg betrug, und die Konzentration des Hämoglobins in der Dosis 13 g/dl war, betrug die Hämoglobin-Gesamtmenge pro Dosis 3,9 g/kg, und das Gesamtvolumen der durch den Hb-Blutersatz in den intravaskulären Raum abgeogenen Flüssigkeit betrug 31,2 ml.
Die synthetische kolloide Lösung zieht etwa 22 ml Wasser/Gramm Dextran hinein. Die Gesamtmenge von Dextran in der kolloiden Lösung pro vergleichbare Dosis des Hb-Blutersatzes ist 1,4 g. Somit ist das Gesamtvolumen in den intravaskulären Raum/vergleichbare Dosis der kolloiden Lösung abgezogenen Flüssigkeit 14 ml.

BEISPIEL 6

Untersuchung der Reaktion auf eine Dosis beim Hund

Diese Untersuchung wurde durchgeführt, um die Arzneimittelwirkung und die Reaktion auf eine Dosis des in der Veterinärmedizin verwendeten Blutersatzes OXYGLOBIN® gemäß vorliegender Erfindung zu ermitteln, im Vergleich zu einer synthetischen kolloiden Lösung von RHEOMACRODEX®-Kochsalzlösung der Firma Pharmacia, die 10% Dextran 40 und 0,9% Kochsalzlösung ist, bezüglich des arteriellen Sauerstoffgehalts von rotem Blutzellen-Hämoglobin beim Hund und der Sauerstofflieferung in Beagle-Hunden mit entfernter Milz 60 Minuten und 24 Stunden nach einer akuten normovolämischen Blutverdünnung.
Die akute normovolämische Blutverdünnung ist ein Versuchsmodell, welches einem klinischen Zustand der Anämie infolge eines chirurgischen Blutverlustes nachahmt. Eine schwere Anämie (Hct = 9%, Hb = 3 g/dl) wurde nach diesem Verfahren herbeigeführt, um ein absolutes Erfordernis einer Sauerstoff tragenden Unterstützung zu bewirken. Die Sauerstofflieferung und der Sauerstoffgehalt fallen beim massiven Bluten steil ab.
Bei der Entwicklung des normovolämischen Blutverdünnungsmodells wurde gefunden, dass die Behandlung zur Wiedererlangung der Sauerstofflieferung entweder durch Volumenexpansion allein, wie sie bei den Kontrollhunden vorgenommen wurde, oder durch Volumenexpansion zusammen mit einer Erhöhung des arteriellen Sauerstoffgehalts, wie sie bei den mit Hämoglobin-Lösung behandelten Hunden auftrat, innerhalb von etwa 10 Minuten des Erreichens eines Hämatokrit-Wertes von 9% stattzufinden hatte, um irreversible Erniedrigungen des Blutdrucks und des Herzvolumens, welche sonst zum Tod führen, zu vermeiden.
Zwei von zwölf Kontrollhunden in dieser Untersuchung starben während oder nach der Dosierung, obgleich ihr Gefäßvolumen mit einer Lösung von Dextran 40 innerhalb von 5 Minuten nach Erreichen des Hämatokrit-Sollwerts expandiert wurde. Der Tod dieser Hunde ist ein Spiegelbild der Exaktheit des Versuchsmodells, das seinerseits denklinischen Zustand eines schweren akuten Blutverlusts porträtriert.
30 Hunde wurden in diese Untersuchung nach einem Gesundheits- Routinescreenen und einem Akklimatisierungszeitraum von mindestens vier Wochen einbezogen. Die Behandlung wurde unter Verwendung von drei Replikaten von Hunden (A, B und C) gestaffelt, wobei jedes Replikat ein Hund/Geschlecht/Gruppe enthielt. Die Hunde wurden willkürlich den fünf Gruppen zugeordnet (6 Hunde/Gruppe von drei Männchen und drei Weibchen), und zwar 32 Tage vor dem ersten Behandlungstag. Die Hunde wurden ihren jeweiligen Gruppen durch eine Blockrandomisierung auf Grundlage des Körpergewichts unter Anwendung einer Methode zugeordnet, welche eine gleiche Verteilung unter Gruppen gewährleistete. Männchen und Weibchen wurden getrennt der willkürlichen Auswahl unterzogen.
Jeder Hund mit unakzeptablen Vorbehandlungsdaten, wie z. B. mit abnormalen klinischen Anzeichen oder pathologischen klinischen Daten wurde durch einen unter den gleichen Umweltbedingungen gehaltenen Ersatzhund ersetzt. Die Test/Kontrollobjekte wurde durch eine einzige intravenöse Infusion verabreicht. Die Infusionsrate wurde durch eine Infusionspumpe reguliert. Das pro Stunde infundierte aktuelle Volumen hing von dem neuesten Körpergewicht eines jeden Hundes ab.
Die Höchstdosis der Hämoglobinlösung basierte auf der sicheren Obergrenze der akuten kardiovaskulären Wirkungen infolge Volumenexpansion bei normovolämischen Hunden. Um die Form der Dosisreaktions-Kurve zu definieren, wurde die Mittelbereichs-Dosis ausgewählt. Die geringste Dosis basierte auf der Untergrenze einer klinisch relevanten Dosierung, wie durch das Volumen und die hämodynamischen Wirkungen beim Hund definiert.
Jedem Hund wurde mindestens sieben Tage vor der Behandlung die Milz entnommen, um Wirkungen auf das Versuchsmodell einer erhöhten Kreislauf-RBC- Masse infolge einer Milzkontraktion zu vermeiden. An dem Behandlungstag mit der Hämoglobinlösung wurde jeder Hund durch Einatmen von Isofluran anästhesiert und unter Verwendung von Raumluft mit einem Atemvolumen von 20 bis 25 ml/kg mechanisch belüftet. Die Belüftungsrate wurde während des Verfahrens zur Aufrechterhaltung eines arteriellen CO&sub2;-Partialdrucks (pCO&sub2;) bei etwa 40 mmHg eingestellt. Die ausgeatmete Endkonzentration an Isofluran wurde gemessen und gesteuert, um einen gültigen Vergleich der Anästhesieebene von Hund zu Hund bereitzustellen. Die Hunde waren mit Instrumenten zur Überwachung der hämodynamischen Funktion und des Sauerstofftransports als Parameter versehen. Das Einbringen eines Strömungs-gerichteten Katheters in die Pulmonararterie wurde durch Analyse der Drucke und Druckaufzeichnungen bestätigt. In die Femoralarterie wurde ein Katheter mit zwei Lumina mit der Fähigkeit eines Thermodilution- Herzvolumens eingebracht, um eine arterielle Leitung zur Überwachung des Blutdrucks und der Blutabfuhr bereitzustellen. In die Kopfvene oder erforderlichenfalls eine andere Vene wurde ein Katheter zum Volumenersatz und zur Verabreichung des Test/Kontrollobjektes eingeführt.
Jeder Hund erhielt eine intramuskuläre Injektion von Antibiotika einmal täglich (Procain-penicillin G) prophylaktisch einen Tag vor dem chirurgischen Eingriff, am Tag des Eingriffs und drei Tage nach der Milz-Ektomie. V-Sporin, ein topisches Antibiotikum (Polymyxin B, Bacitracin, Neomycin) wurde einmal täglich auf die chirurgische Stelle erforderlichenfalls aufgebracht.
Nach dem Anlegen der Instrumente wurden eine hämodynamische Stabilisierung, um einen pCO&sub2; von etwa 40 mm Hg und eine Zusammenstellung von Grundlinien-Messungen durchgeführt. Sodann wurde ein Modell einer akuten normovolämischen Blutverdünnung durch Blutentnahme aus den Hunden und gleichzeitigen Ersatz des 1,6 bis 2,3 fachen der abgezogenen Volumina durch mit Lactat versetzte Ringer-Lösung zur Aufrechterhaltung eines isovolämischen Zustands gebildet. Der isovolämische Zustand wurde erreicht, indem man den Pulmonararterien-Keildruck bei etwa den Grundlinienwerten hielt. Die Blutentnahme/Volumenersetzung dauerte etwa 45 bis 90 Minuten, bis die Hämoglobin-Konzentration etwa 30 g/Liter (3,0 g/dl) betrug. Die mit Lactat versetzte Ringer-Lösung wurde unter Verwendung eines intravenösen Schwerkraftgeräts und einer Druckmanschette um den Infusionsbeutel schnell infundiert. Der arterielle systolische Blutdruck war mehr als 5 Minuten ≤ 50 mmHg nach der Bewirkung einer akuten Anämie, und vor Beginn der Dosierung wurde der Hund zurückgezogen und durch einen unter den gleichen Umweltbedingungen gehaltenen Ersatzhund ersetzt.
Die Dosen der Kolloid-Kontrolle und Hämoglobin-Lösung wurden, wie in Tabelle VIII angegeben, verabreicht. Die hämodynamischen Messungen wurden vor der Blutentnahme, vor der Dosierung, unmittelbar nach der Dosierung und 60 Minuten bzw. 24 Stunden nach der Dosierung durchgeführt. Nach der Messung bei 60 Minuten wurde der Hund von der Anästhesie befreit und abermals für hämodynamische Messungen, die 24 Stunden nach dem Dosieren durchgeführt wurden, mit Instrumenten versehen. Tabelle VIII
Alle hämodynamischen Parameter wurden statistisch entweder durch Varianzanalyse (ANOVA) oder Covarianzanalyse (ANCOVA) mit entweder dem Wert vor der Blutentnahme oder dem Wert vor der Dosierung als Covariante analysiert. Spezielle lineare Kontraste wurden konstruiert, um auf die Wirkungen des Volumens der verabreichten Lösung, die Wirkung des Hb-Blutersatzes (Arzneimittelwirkung) und die Dosisreaktion des Hb-Blutersatzes (Dosiswirkung) zu testen. Diese Tests wurden lediglich für Parameter durchgeführt, für die der Unterschied zwischen Versuchsgruppen beim Niveau 0,05 statistisch signifikant war. Vergleiche spezieller Variablen zu ausgewählten Zeitpunkten wurden durch gepaarte t-Tests in jeder Gruppe durchgeführt.
In dieser Untersuchung war der arterielle Sauerstoffgehalt eines der Kriterien für die Wirksamkeit. Der arterielle Sauerstoffgehalt ist ein Maß für die Sauerstofftragende Kapazität zellularen Hämoglobins und von Plasma-Hämoglobin und für im Plasma aufgelösten Sauerstoff. In Abwesenheit von Plasma-Hämoglobin wird der arterielle Sauerstoffgehalt aus der Menge Sauerstoff, die durch das gesättigte zellulare Hämoglobin getragen wird, und dem Partialdruck des eingeatmeten Sauerstoffs berechnet. Weil erwartet wurde, dass Plasma-Hämoglobin wesentlich zum Sauerstoffgehalt bei dieser Untersuchung beiträgt, wurde der Sauerstoffgehalt direkt unter Verwendung eines Instruments LexO2Con-K (Chestnur Hill, MA, U.S.A.) direkt gemessen, während des Versuchs wurde keine mit Sauerstoff angereicherte Luft verabreicht, weil es unnötig war, und um die Verwechslungswirkungen einer erhöhten eingeatmeten Sauerstoffkonzentration auf die Messung des arteriellen Sauerstoffgehalts zu vermeiden.
Die mittleren arteriellen und venösen Sauerstoffgehalte fielen um etwa das Vier- bzw. Achtfache in allen Gruppen nach Herbeiführung der Anämie ab. 60 Minuten nach der Dosierung stieg der arterielle Sauerstoffgehalt im Vergleich zu den Werten vor der Dosierung bei allen mit Hb-Blutersatz behandelten Gruppen signifikant an und blieb 24 Stunden nach der Dosierung in den Gruppen der mittleren und hohen Dosis signifikant erhöht. In den Kontrollgruppen veränderte sich der arterielle oder venöse Sauerstoffgehalt nach der Dosierung nicht.
Wie in Fig. 2 gezeigt, war in mit Hb-Blutersatz behandelten Gruppen im Vergleich zu Kontrollgruppen 60 Minuten und 24 Stunden nach der Dosierung der arterielle Sauerstoffgehalt signifikant erhöht. Eine lineare Dosisreaktion war 60 Minuten und 24 Stunden nach der Dosierung festzustellen. 60 Minuten nach der Dosierung wurde eine signifikante Volumenwirkung für den arteriellen Sauerstoffgehalt nachgewiesen.
In den mit Hb-Blutersatz behandelten Gruppen erhöhte sich im Vergleich zu den Kontrollen 60 Minuten und 24 Stunden nach der Dosierung auch der venöse Sauerstoffgehalt. Die Erhöhung zeigte eine lineare Dosisreaktion 60 Minuten nach der Dosierung, jedoch nicht nach 24 Stunden. Die Dosiswirkung, welche für mit Hb- Blutersatz behandelte Gruppen im Unterschied des arteriellen-venösen (A-V) Sauerstoffgehalts beobachtet wurde, wurde signifikanten Volumenwirkungen aufgrund der Abwesenheit einer Arzneimittelwirkung und ähnlicher Beobachtungen der Volumenwirkungen in Kontrollgruppen 60 Minuten nach der Dosierung zugeschrieben. Die mit Hb-Blutersatz behandelten Gruppen zeigten einen signifikanten Anstieg des A-V-Sauerstoffunterschieds nach 24 Stunden im Vergleich zu kolloiden Kontrollen, mit einer signifikanten linearen Dosisreaktion. Der Unterschied zwischen A und V muss im Hinblick auf das Herzvolumen interpretiert werden. 24 Stunden nach der Dosierung war der Unterschied A zu V in den Kontrollgruppen signifikant geringer als derjenige bei den Gruppen, welche mit dem Hb-Blutersatz behandelt wurden. Eine mögliche Erklärung für diesen Unterschied ist, dass die Hunde der Kontrollgruppe auf ein höheres Herzvolumen angewiesen waren, um die Bedürfnisse des Sauerstoffverbrauchs der peripheren Gewebe zu erfüllen. Die mit dem Hb-Blutersatz behandelten Gruppen hielten einen genügend großen A-V-Unterschied 24 Stunden nach der Dosierung aufrecht, um die Bedürfnisse des peripheren Gewebes zu erfüllen, ohne ein erhöhtes Herzvolumen zu bewirken.
Zusätzlich zum arteriellen Sauerstoffgehalt wurde in dieser Untersuchung der arterielle Sauerstoff-Gesamtgehalt, bezüglich der Beisteuerung des Hunde-RBC- Hämoglobins (CaO&sub2;/g RBC-Hb) normalisiert, geprüft. Dieser Vergleich wurde vorgenommen, um die Unterschiede im arteriellen Sauerstoffgehalt zwischen Dosierungsgruppen zu belegen, da das RBC-Hämoglobin in allen Gruppen konstant war. Eine mögliche Wechselbeziehung von Plasma- oder Gesamthämoglobinkonzentration und arteriellem Sauerstoffgehalt würde ein brauchbares klinisches Maß der Wirksamkeit bereitstellen. Wie in Fig. 3 gezeigt, zeigten alle mit Hb- Blutersatz behandelte Gruppen 60 Minuten und 24 Stunden nach der Dosierung (mit Ausnahme der Gruppe geringer Dosis nach 24 Stunden) einen signifikanten Anstieg von CaO&sub2;/g RBC-Hämoglobin auf Werte vor der Dosierung. Der arterielle Sauerstoffgehalt bezüglich desjenigen, der vom RBC-Hämoglobin beigetragen wird, unterschied sich bei den Kolloid-Kontrollen nicht signifikant zwischen der Vordosis und 60 Minuten oder 24 Stunden nach dem Dosieren.
Der arterielle Sauerstoff-Gesamtgehalt bezüglich desjenigen, der durch das RBC-Hämoglobin beigesteuert wird, erhöhte sich signifikant in den mit Hb-Blutersatz behandelten Gruppen im Vergleich zu den Kolloid-Kontrollen 60 Minuten nach der Dosierung mit einer signifikanten linearen Dosisreaktion. 24 Stunden nach Dosierung trat auch eine signifikante Dosiswirkung mit einer signifikanten linearen Dosisreaktion auf, jedoch war die Arzneimittelwirkung nicht völlig signifikant (P < 0,06).
Ein anderes Kriterium der Wirksamkeit war die Sauerstofflieferung. Die Sauerstofflieferung wird auf Basis des arteriellen Sauerstoffgehalts und des Herzvolumens berechnet. Infolgedessen wird die Sauerstofflieferung durch all die physiologischen Faktoren beeinflusst, welche das Herzvolumen beeinflussen. Die für diese Untersuchung ausgewählte Kontrolle war das synthetische Kolloid "RHEOMACRODEX®-Kochsalzlösung der Fa. Pharmacia, das 10% Dextran 40 und 0,9% Kochsalzlösung ist, da es das intravaskuläre Volumen ausdehnt und es nicht bekannt ist, dass es Sauerstoff trägt. Die Kontrolle gewährte einen Vergleich einer den kolloidalen Eigenschaften des Hämoglobins im Hb-Blutersatz äquivalente Volumenexpansion.
Weil jede Dosis des Hb-Blutersatzes erwartungsgemäß eine unterschiedliche Volumenwirkung zeigt, wurden als Kontrollen für die Volumenwirkung zwei Dosierungen der Dextranlösung verwendet, so dass die Daten lediglich die Arzneimittelwirkung verschiedener Dosen wiedergeben. Dieser Vergleich wurde für die mittleren und niederen Dosen vorgenommen. Die Dosen der Kolloid-Kontrollen wurden auf Basis der Dosen von Dextran 40 ausgewählt, welche einen äquivalenten Vergleich der onkotischen Wirkungen in vivo der Testobjekte niederer und mittlerer Dosis lieferte, wie sich aus den Ergebnissen des Beispiels 5 ergibt.
Die Volumenwirkung wurde statistisch unter Anwendung des Unterschieds im Mittel zwischen dem Kolloid mittlerer Dosis (14 ml/kg) und dem Kolloid geringer Dosis (7 ml/kg) statistisch definiert. Die Arzneimittelwirkung wurde durch Vergleich jeder mit Hb-Blutersatz behandelten Gruppe mit ihrer entsprechenden Kolloid- Kontrolle ermittelt. Wenn ein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den mit einer niederen und einer hohen Dosis des Hb-Blutersatzes behandelten Gruppen zu sehen war, wurde eine lineare Dosisreaktion festgestellt.
Die Sauerstofflieferung wurde gemäß der Gleichung: DO&sub2; = CO · CaO&sub2; · 10/kg, worin CO das Hervolumen, und CaO&sub2; der arterielle Sauerstoffgehalt sind. Wie erwartet trat in allen Gruppen nach Herbeiführung der Anämie bei allen Behandlungsgruppen eine zwei- bis dreifacher mittlerer Abfall von DO&sub2; auf. Der Sauerstoffgehalt fiel ausreichend ab, so dass von einem Abstieg des Herzvolumens und einer erhöhten Sauerstoffextraktion das Aufrechterhalten eines Grundliniensauerstoffverbrauchs zu folgern war, was zu einem geringeren venösen Sauerstoffgehalt führt. Wie in Fig. 4 gezeigt, erhöhte sich die Sauerstofflieferung um annähernd 30% in der mit einer geringen Dosis Hb-Blutersatz behandelten Gruppe, und um mehr als 100% in den mit mittlerer und hoher Dosis des Hb-Blutersatzes behandelten Gruppen 60 Minuten nach der Dosierung, im Vergleich zu den Werten vor dem Dosieren. Der Unterschied war für alle drei Dosierungsgruppen signifikant (p < 0,05). Die Kontrolgruppen zeigten keine signifikanten Unterschiede innerhalb dieser Zeit. 60 Minuten nach der Dosierung unterschied sich unter allen Gruppen signifikant mit signifikanten Arzneimittel- und Dosiswirkungen mit einer linearen Dosisreaktion. Unter den Gruppen wurde nach 24 Stunden kein Unterschied in der Sauerstofflieferung festgestellt. Die Verbesserung der Sauerstofflieferung 60 Minuten nach dem Dosieren war bei allen mit dem Hb-Blutersatz behandelten Gruppen im Vergleich zu ihren entsprechenden Kolloid-Kontrollen in erster Linie aufgrund eines Dosis bezogenen Anstiegs des arteriellen Sauerstoffgehalts zusätzlich zu einem bescheidenen Anstieg des Herzvolumens.
Der Sauerstoffverbrauch wurde gemäß der Gleichung: VO&sub2; = CO · CaO&sub2; · 10 kg. Nach der Bewirkung der Anämie trat in allen Gruppen ein zwei- bis dreifacher mittlerer Abfall von DO&sub2; auf. Auf den mit Hb-Blutersatz behandelten Gruppen oder Kontrollgruppen oder innerhalb einer Gruppe, wenn die Werte vor der Dosierung mit den Werten nach der Dosierung verglichen werden, wurden keine statistisch signifikanten Unterschiede festgestellt.
Das Sauerstoff-Extraktionsverhältnis (VO&sub2;/DO&sub2;) für alle Gruppen zeigte einen annähernd dreifachen Anstieg nach Bewirken der Anämie. Die Sauerstoff- Extraktionsverhältnisse waren auf eine von der Dosis abhängige Weise bei allen mit Hb-Blutersatz behandelten Gruppe 60 Minuten nach dem Dosieren im Vergleich zu den Kontrollgruppen signifikant herabgesetzt. Zwischen mit Hb-Blutersatz behandelten Gruppen und den Kontrollgruppen wurden 24 Stunden nach der Dosierung keine signifikanten Unterschiede festgestellt.
Nach Herbeiführung der Anämie erhöhte sich das mittlere Herzvolumen um 10% bis 39% in allen Gruppen. Das Herzvolumen war 24 Stunden nach Dosierung im Vergleich zu den Werten vor der Blutentnahme in den Kolloid-Kontrollgruppen, jedoch nicht in den mit Hb-Blutersatz behandelten Gruppen signifikant erhöht. Eine signifikante Volumenwirkung, welche zu signifikanten Unterschieden im Herzvolumen zwischen den Kolloid-Gruppen niederer und mittlerer Dosis war 60 Minuten nach der Dosierung augefällig. Die Erhöhung des Herzvolumens war wahrscheinlich mit einem erhöhten Schlagvolumen infolge Ausdehnung des intravaskulären Volumens nach der Dosierung oder eines erhöhten sympatischen Turnus infolge des Stresses der schweren Anämie. 60 Minuten, jedoch nicht 24 Stunden nach der Dosierung war eine signifikante Dosisreaktion zwischen den mit Hb-Blutersatz in niederer und hoher Dosis behandelten Gruppen offensichtlich. Zwischen den mit Hb-Blutersatz behandelten Gruppen und den mit Kolloid behandelten Gruppen war 60 Minuten oder 24 Stunden nach der Dosierung kein Unterschied im Herzvolumen festzustellen.
Während der Herbeiführung der Anämie veränderte sich der Pulmonararterien-Keildruck (PAWP) nicht signifikant. In der Kolloid-Gruppe niederer Dosis fiel der PAWP signifikant ab und blieb in der Kolloid-Gruppe mittlerer Dosis 60 Minuten nach der Dosierung im Vergleich zu den Werten vor der Dosierung unverändert. Der PAWP in dem mit Hb-Blutersatz in hoher Dosis behandelten Gruppen stieg in einer linearen Dosisreaktion im Vergleich zu den Werten vor der Dosierung 60 Minuten nach der Dosierung signifikant an. Der erhöhte PAWP gibt einen Dosis-abhängigen Anstieg des intravaskulären Volumens 60 Minuten nach der Dosierung wieder. 60 Minuten oder 24 Stunden nach der Dosierung keine signifikante Arzneimittelwirkung von hier zwischen den Hb-Blutersatz behandelten Gruppen und den Kontrolll-Gruppen ermittelt. In den Kolloid-Kontrollgruppen wurde 60 Minuten nach der Dosierung eine signifikante Volumenwirkung festgestellt.
In allen Gruppen sank nach Herbeiführung der Anämie der systolische, diastolische und mittlere arterielle Blutdruck signifikant ab, und stieg unmittelbar nach der Dosierung signifikant an. Der Abfall des systolischen arteriellen Blutdrucks nach Herbeiführung der Anämie war wahrscheinlich mit einem Abfall des peripheren Gefäßwiderstands infolge verminderter Blutviskosität verbunden, eine Folge der Anämie. 60 Minuten nach der Dosierung unterschieden sich der systolische, diastolische und mittlere arterielle Blutdruck beider Kolloid-Kontrollgruppen nicht signifikant von den Werten vor der Dosierung. Der systolische, diastolische und mittlere Blutdruck der mit dem Kolloid in geringer Dosis behandelten Kontrollgruppe erhöhte sich im Vergleich zu den Werten vor der Dosierung 24 Stunden nach der Dosierung signifikant. Im Gegensatz hierzu war die Erhöhung des systolischen, diastolischen und mittleren Blutdrucks in allen mit Hb-Blutersatz behandelten Gruppen 60 Minuten und 24 Stunden nach der Dosierung im Vergleich zu den Werten vor der Dosierung statistisch signifikant. Der systolische, diastolische und niedere Blutdruck von mit Hb-Blutersatz behandelten Gruppen war signifikant höher als bei den entsprechenden Kolloid-Kontrollgruppen 60 Minuten nach der Dosierung, Jedoch nicht 24 Stunden danach.
Bei den mit Hb-Blutersatz in hoher Dosis behandelter Gruppen wurde eine signifikante Erhöhung des systolischen diastolischen und mittleren Pulmonararteriendrucks 60 Minuten nach der Dosierung im Vergleich zu den Werden vor der Dosierung beobachtet. Die Erhöhungen hielten 24 Stunden nach der Dosierung in der mit Hb-Blutersatz in mittlerer Dosis behandelter Gruppe hinsichtlich des diastolischen Pulmonararteriendrucks an. Ferner zeigte die mit Kolloid in niederer Dosis behandelte Kontrollgruppe einen stastisch signifikanten Anstieg 24 Stunden nach der Dosierung im Vergleich zu den Werten vor der Dosierung beim mittleren Pulmonararteriendruck. Dieser Anstieg wurde als klinisch signifikant erachtet. Die Erhöhungen des systemischen arteriellen systolischen und diastolischen Blutdrucks 60 Minuten nach der Dosierung des Hb-Blutersatzes im Vergleich zu den Werten vor der Dosierung war eine direkte Arzneimittelwirkung des Hb-Blutersatzes. Der diastolische Druck blieb in den Kolloid-Kontrollgruppen unverändert, was wahrscheinlich das Ergebnis eines herabgesetzten peripheren Gefäßwiderstands war.
Zwischen mit Hb-Blutersatz behandelten Gruppen und Kontrollgruppen war hinsichtlich des systolischen Pulmonararteriendrucks weder 60 Minuten noch 24 Stunden nach der Dosierung signifikante Unterschiede festzustellen. Im Gegensatz hierzu waren der diastolische und der mittlere Pulmonararteriendruck hinsichtlich der Volumen-, Arzneimittel- und Dosiswirkung 60 Minuten nach dem Dosieren, jedoch nicht 24 Stunden danach, signifikant verschieden.
Das Gesamthämoglobin fiel um etwa das Vierfache oder mehr beim Bluten ab. Die mit Hb-Blutersatz behandelten Gruppen zeigten einen Dosis-abhängigen Anstieg des Gesamthämoglobins im Vergleich zu entsprechenden Kolloid- Kontrollgruppen 60 Minuten und 24 Stunden nach der Dosierung.
Die Plasmahämoglobin-Konzentrationen stiegen auf eine Dosis abhängige Weise in den mit Hb-Blutersatz behandelten Gruppen im Vergleich zu entsprechenden Kolloid-Kontrollgruppen 60 Minuten und 24 Stunden nach der Dosierung signifikant an. Die Erhöhungen der Plasma- und Gesamthämoglobin- Konzentrationen nach der Dosierung in allen mit Hb-Blutersatz behandelten Gruppen im Vergleich zu ihren entsprechenden Kolloid-Kontrollen waren dem Hämoglobingehalt des Hb-Blutersatzes zuzuschreiben. Der Dosis abhängige signifikante Anstieg hielt 24 Stunden an/was mit dem anhaltenden Anstieg des arteriellen Sauerstoffgehalts übereinstimmt.
Zusammenfassend war die Reaktion auf die Behandlung mit dem Hb- Blutersatz linear, d. h., 60 Minuten nach der Dosierung; je höher die Dosis des Hb- Blutersatzes war, desto größer war die Verbesserung der Sauerstofflieferung und der Hämodynamik im Vergleich zu entsprechenden Kolloid-Kontrollen. Ein anhaltender arterieller Sauerstoffgehalt und normale klinische Anzeichen beim Einatmen von Raumluft unterstützen eine vorteilhafte biologische Wirkung des Hb- Blutersatzes, welche in den getesteten Gruppen mit einer Dosis von 30 ml/kg und 45 ml/kg mit dem Hb-Blutersatz behandelten Gruppen 24 Stunden anhielt. Die Clearance des Hb-Blutersatzes ist wahrscheinlich für bei der Sauerstofflieferung und den hämodynamischen Wirkungen 24 Stunden nach der Dosierung festgestellten Veränderungen verantwortlich. Als Schlussfolgerung stützen die Ergebnisse dieser Untersuchung die Auswahl einer Dosis im Bereich von 30-45 ml/kg. Beide Dosierungsgruppen zeigten statistisch signifikante Unterschiede von den entsprechenden Kolloid-Kontrollgruppen in den Parametern der Wirksamkeit, und die Dosisreaktion war linear.
Die klinische vernunftmäßige Erklärung dieses Bereichs basiert auf der Tatsache, dass ein schwer anämischer Hund (z. B. mit einem Hämatokritwert von < 15% mit ausgepräften klinischen Anzeichen) aus einer höheren Dosis Nutzen zieht, wie durch die lineare Dosisreaktion des verbesserten arteriellen Sauerstoffgehalts und der Sauerstofflieferung belegt wird. Jedoch ist eine konservativere Dosis für einen Hund angezeigt, der für eine intravaskuläre Volumenüberlastung vordisponiert ist. Der Dosis abhängige vorübergehende Anstieg des Pulmonararterien-Keildrucks und der arteriellen Pulmonard rucke, der 60 Minuten nach der Dosierung in mit Hb- Blutersatz behandelten Gruppen festzustellen ist, begrenzt die Anwendung einer höheren Dosis in dieser Hundepopulation. Infolgedessen ist eine Dosierung im Bereich von 30-45 ml/kg bei einer breiten Population von Hunden wirksam, bei denen der Grad der Anämie und der Status des intravaskulären Volumens definiert sind.

BEISPIEL 7

Untersuchung der Dosisreaktion beim Menschen

Diese Untersuchung wurde durchgeführt, um die Sicherheit und Toleranz ansteigender Raten der intravenösen Verabreichung von Hb-Blutersatz (im folgenden als HBOL bezeichnet) hinsichtlich der hämodynamischen, neuroendokrinen und hämatologischen Parameter im Menschen zu bewerten. Die Testpersonen waren normale gesunde erwachsene Männer (70-90 kg) im Alter von 18-45 Jahren. Während der Untersuchung erhielten die Testpersonen eine kontrollierte Diät mit gleichen Kalorien aus 55% Kohlehydraten, 30% Fett (Verhältnis von mehrfach ungesättigten zu gesättigten Fettsäuren von 2 : 1), 15% Protein und 150 Milliäquivalente Natrium pro Tag. Die Flüssigkeitsaufnahme war mindestens 3.000 ml/Tag, wobei Koffein enthaltende Getränke vermieden wurden. Auch wurde eine begleitende Anwendung einer Medikation vermieden. Ferner wurden von den Testpersonen während der Untersuchung weder Alkohol noch Tabak genommen.
Die 12 untersuchten Personen wurden in drei Testgruppen unterteilt. In jder Testgruppe erhielten 3 Personen HBOL, während eine als Kontrolle diente und Ringer's Lactat erhielt. Jede Testgruppe hatte unterschiedliche Raten der HBOL- Infusion. Die Untersuchung wurde als Ratenexkalation-Blindversuch über einen Zeitraum von 30 Tagen durchgeführt. Am Tag 1 der Untersuchung, während der stationären Phase hatte jede Person einen arteriellen Katheder geringen Umfangs der in die Radialarterie der nicht-dominierenden Hand eingebracht war. Der Ort der Einführung wurde mit einer antiseptischen Lösung (Alkohol und/oder Iod) gespült, wonach eine geringe Menge einer anästhetischen Lösung mit 1% mit 2% Lidocain über der Stelle der Radialarterie subtukan injiziert wurde. Der arterielle Katheter wude eingefügt, um den Blutdruck zu überwachen und die Bewertung von Blutgasen zu erleichtern. 1-2 Stunden später hatten alle Personen einen intravenösen Katheter großen Kalibers (Kaliber 16-Nadel in einer antekubitalen fossa), platziert in eine Armvene. Jede Person hatte sodann eine Phlebotomie von 750 ml (1,5 Einheiten) Vollblut, abgezogen in weniger als 15 Minuten, gefolgt von einer isovolemischen Blutverdünnung von 2.250 ml Ringels Lactat innerhalb eines zweistündigen Zeitraums.
45 g (346 ml) HBOL wurden sodann unter Anwendung eines sterilen Verfahrens durch einen in Reihe geschalteten 80 Mikrometer Standardblutfilter, einen 5 Mikrometer Filter und den intravenösen Katheter in der Armvene in jede der Testgruppen 1, 2 und 3 in den Raten von 0,5 g/Minute, 0,75 g/Minute bzw. 1,0 g/Minute intravenös infundiert.
Gleichzeitig hatte jede Person eine invasive Überwachung durch den Radialarterienkatheter, Lungen-Reihenfunktionstest, eine Bewertung der Herzfunktion und mehrfache Hämathologie, Chemie- und Urinanalyse-Labortests, welche routinemäßig und häufig während der ersten 48 Stunden nach Beginn der HBOL- Infusion durchgeführt wurden.
Sodann wurden täglich in der außerstationären Phase (Tage 2-29) während der ersten vier Tage nach täglich, und sodann während eines Monats wöchentlich Laboruntersuchungen, Lebensanzeichen, Elektrokardiogramme und medizinische Vorgänge aufgenommen. Während des Tags 1 waren die hämodynamischen Tage aufgrund im allgemeinen höherer Werte für den systolischen, diastolischen und mittleren arteriellen Druck bei den HBOL-behandelten Gruppen (nach Infusion) als bei den Großkontrollen bemerkenswert. Obgleich es eine ausgesprochene Schwankung der Blutdruckdaten entsprechend der Aktivität des Patienten (beispielsweise während der Marktzeiten oder bei Benutzung des Baderaums) und dem Tagesrhythmus gab, hatten mit HBOL behandelte Personen in der Regel Werte des systlischen Blutdrucks (etwa 5-50 mmHg), des diastolischen Blutdrucks (etwa 5-10 mmHg) und des mittleren arteriellen Drucks (etwa 10 mmHg), die lediglich während des Verlaufs des Tags 1 größer als diejenigen der Kontrollen waren. Die Werte neigten dazu, Spitzenwirkungen zwischen den Stunden 8-12 zu erreichen, wobei sie während des Schlafe und nach Entfernung des arteriellen Katheters auf die Grundlinie zurückkehrten. Der Puls war in der Regel um etwa 10 Schläge geringer bei allen Personen der HBOL-behandelten Gruppen im Vergleich zu den Kontrollen während des Tags 1. Der Nullpunkt des Pulsabfalls wurde innerhalb der ersten 15 Minuten der Infusion festgestellt. Die Werte waren in allen Testgruppen nach der Stunde 24 ähnlich.
Der Herzindex fiel während der ersten Stunde der Infusion auf etwa 1-2 Liter/Minute/m² ab, blieb bis zu 1 Liter/Minute/m² unter demjenigen der Kontrollen bis zur Stunde 4, wonach er zur Stunde 4 auf die Grundlinie zurückkehrte. Der Herzindex stieg auch während Zeiten an, wo der Patient aktiv war (vgl. oben).
Der periphere Gesamtwiderstand verlief parallel zu den Blutdruckveränderungen, jedoch kehrten innerhalb von zwei Stunden die Werte auf die Grundlinie zurück. Der vorübergehende Anstieg des systemischen Blutdrucks mit einer Erhöhung des peripheren Gesamtwiderstands und einer Erniedrigung des Herzindex ist nicht unerwartet. Es ist wichtig, festzustellen, dass es keinen Unterschied in der Rate der Verabreichung und der Größenordnung dieser hämodynamischen Reaktionen gab, und dass kein Eingriff injiziiert war. Die Lungenfunktionstests (welche mehrfache Bestimmungen der Spirometrie und der Lungenvolumina umfassten) und die arteriellen Blutgasmessungen waren nicht bemerkenswert. Hingegen war die erhöhte Diffusionskapazität, welche bie den HBOL-behandelten Gruppen festgestellt wurde, bemerkenswert, der 10-15%ige Anstieg der Diffusionskapazität war im Vergleich zu einem 10%igen Abfall bei den Kontrollen bis zu 24 Stunden statistisch signifikant. Diese Ergebnisse sind aufgrund der Größenordnung der Phlebotomie und Blutverdünnung, denen alte Gruppen unterzogen wurden.
Bei den hämatologischen Untersuchunen waren, anders als der erwartete vorübergehende Abfall von Hämoglobin, des Hämatokrit-Werts und der Zählung roter Zellen sowie der Serumproteine bei den Verfahren der Phlebotomie und Blutverdünnung, die Hämatologie- und Serumchemie-Labortest nicht bemerkenswert. Ausnahmen waren das Serumeisen und Ferritin, welche Spitzenwerte zur Stunde 6 bzw. 48 nach Verabreichung von HBOL zeigten.
Die Messungen der Serumchemie waren nicht bemerkenswert, mit der Ausnahme einer Person (Nr. 10), welche vorübergehende Erhöhungen der Serumtrasnaminasen und der Serum-Lipase zeigte. Es ist wichtig, anzumerken, dass diese Person keine klinisch signifikanten medizinischen Begleitvorgänge (wie z. B. eine Dysphagie oder Bauchschmerzen) hatte, entsprechend der Zeit der Erhöhung dieser Enzyme. Die genaue Äthiologie dieser Laborabnormalitäten ist unklar, jedoch legen vorherige Untersuchungen nahe, dass vorübergehende subklinische Spasmen des Sphincters von Oddi oder andere Teile der hepatobiliären und pankreatischen Ductalsysteme einbezogen sein können. Es ist wichtig, festzustellen, dass diese Veränderungen vorübergehend (und nicht von abdominalem Unbehagen begleitet) und ohne offensichtlich Folgekrankheiten waren. Bei Ultraschalluntersuchung der Gallenblase der Person Nr. 10 nach der Dosis wurde keine signifikante Veränderunge festgestellt. Während der ganzen Untersuchung war der Urinstatus nicht bemerkenswert. Während der Untersuchung war bei den Personen kein nachweisbares Hämoglobin im Urin. Ferner war die Kreatin-Clearance etwas höher wie erwartet während des Zeitraums der Blutverdünnung, was urinäres Adenosin-Deaminase bindende Protein die Elektrolyten (Natrium, Kalium, Chlorid), Eisen, Mikroalbumin, NAG (N-Acetyl-betaglucosaminidase) und der Harnstoffstickstoff im Urin waren, nicht bemerkenswert.
In der Mehrheit der pharmakokinetischen Paramter wurden keine offensichtlichen Veränderungen als Funktion der Verabreichungsrate beobachtet. Sequentielle Blutproben und kumulative Urinproben wurden vor und nach Einleitung der Infusion von HBOL für die Grobanalyse der Größenausschluss-Chromatographie (SEC) (Gelfiltrationschromatographie) des Gesamthämoglobins und der scheinbaren Molekulargewichtsfraktionen von Hämoglobin gesammelt. Es wurden lediglich gelegentliche Plasmadimmerfraktion-Konzentrationen unter Ausschluss jeglicher Pharmakokinetischen Analyse beobachtet. Dier einzigen statistisch signifikanten Unterschiede (p < 0,05) wurden in dem Tetramer-Volumen der Verteilung (das mit Erhöhungen der Rate abfällt) der maximal erreichten Tetramer-Konzentration (die sich bei Erhöhung der Rate erhöht) und der Zeit des Auftretens der Tetramer- Maximalkonzentration (die bei Erhöhungen der Rate abfällt).
Die beobachteten medizinischen Vorgänge stimmten mit den zu erwarteten Befunden überein, die mit der Phelobotomie (eine vasovagale Episode), mehrfachen Lungenfunktionstests (Aerophagie-Aufstoßen oder abdominales Gas), dem Einfügen in die arterielle Leitung (wie z. B. Schmerz oder Kribbeln oberhalt der Einfügungsstelle) oder einem abdominalen Unbehagen verbunden ist (wie z. B. bie der Einnahme der Eisenergänzung), obgleich es schien, dass es ein Hintergrund für das unspezifische, vorübergehende abdominale "Gas" gab, trtenkeine Fälle eines offensichtlich Bauchschmerzes oder einer Dysphagie auf. Ferner gab es keinen Zusammenhang dieser Symptome mit irgend welchen Veränderungen der Serumtransaminasen oder der Serumlipase.
Zusammengefasst wurde HBOL gut vertragen. Obgleich es geringe vorübergehende Erhöhungen des Blutdrucks und des peripheren Gesamtwiderstands entsprechend dem Abfall des Herzindexes während der ersten zwei Stunden der Infusion gab, waren die hämodynamischen Daten unbeachtlich. Der Anstieg der Diffusionskapazität war signifikant höher in denmit HBOL behandelten Gruppen als bei den Kontrollen während der ersten 24 Stunden.

BEISPIEL 8

Wirkungen von HBOL auf Menschen beim abgestuften Radsporttest

Diese Untersuchung wurde durchgeführt, um die Sportkapazität von Personen zu bewerten, denen eine autologe Transfusion von HBOL gegeben worden war. Spezielle Endpunkte umfassten die Lungenfunktion (wie z. B. die Diffusionskapazität und Milchsäurespiegel sowie den Sauerstoffpartialdruck (pO&sub2;), hämodynamsiche Daten (Herzrate, Herzindex und Blutdruck) "sowie die Sporttoleranz (z. B. Dauer, Arbeitslast und anaerobische Schwelle). Die Personen waren sechs normale gesunde Männer im Alter von 18-45 Jahren. Eine Person wurde bei der Untersuchung ersetzt, weil sie nicht das Volumen der Phelobotomie in weniger als 15 Minuten erhielt. Diese Untersuchung wurde als ein eine zufällige Auswahl treffender Zweiwegeüberkreuzungs-Blindversuch durchgeführt.
Alle Personen hatten eine Phelobotomie von 750 ml, gefolgt von Ringer's- Lactat [3 : 1] und entweder eine autologe Transfusion (ATX) oder 45 g HBOL. Die ATX oder das HBOL 90 Minuten zu 0,5 g/Min, gegeben. An dem Tag vor der Phlebotomie und etwa 45 Minuten nach der Infusion von ATX oder HBOL wurden die Radsport-Stresstests vorgenommen. Die gleichen Verfahren wurden eine Woche später wiederholt, und die Personen wurden zur entgegengesetzten Behandlung ausgetauscht.
An dem Tag der Dosierung (Tage 1 und 8) hatten alle Personen eine Einfügung einer arteriellen Leitung in eine Radialarterie und den Anschluss an eine Cardialtelemetrie und Inpedanzkardiographie und anschließend Phlebotomie (BBX) von 750 ml Vollblut (> 15 Minuten). Daran schloss sich eine Infusion von 2.250 ml Ringer's-Lactats (RL) innerhalb von zwei Stunden an (die isovolemische Blutverdünnungsphase). Die Personen enthielten sodann entweder HBOL (45 g [etwa 346-460 ml] in einer Rate von 0,5 g/Min, innerhalb von 90 Minuten) oder eine ATX (110-120 g Hämoglobin [etwa 750 ml] in der gleichen Rate und Dauer wie das HBOL). Der Test wurde etwa 45 Minuten nach dem Ende jeder Infusion gemacht. Während des 24stündigen Zeitraums wurden an den Tagen 1 und 8 Serienmessungen der arteriellen Blutgase, sowie Hämatologie-Chemie- und Harntests intensiv vorgenommen. Eine Reihennachbehandlung wurde auf außerstationärer Grundlage zwischen der Dosierung und für einen Monat, nachdem die gesamte Dosierung abgeschlossen war, vorgenommen.
Die Personen waren in der Lage, während der HBOL- und ATX-Zeiträume auf ähnlichem Niveau zu trainieren. Die Sauerstoffaufnahme (VO&sub2;) und die Bildung von Kohlendioxid (VCO&sub2;) an der anaerobischen Schwelle waren nahezu identisch. Auch waren die aktuelle Nutzlast in METS, Watt, der Puls (als Prozentsatz des maximalen Pulses), die Zeit bis zur anaerobischen Schwelle, das Atmungsvolumen (VT) und die Minutenventilation (VE) ähnlich. Während der HBOL- und ATX-Periode waren die Blutgaswerte ähnlich. Die kleineren Verringerungen im pH- und Bicarbonat-Wert mit einem Milchsäureanstieg stimmen mit den erwarteten Befunden an der anaerobischen Schwelle überein. Die Ergebnisse dieser Radfahrtests zeigten, dass die Trainingskapazität (definiert als die Zeit und Nutzlast, um die anaerobische Schwelle zu erreichen) an der Basislinie und nach Infusionen von einer autologen Transfusion oder von HBOL ähnlich war. Im speziellen waren die hämodynamischen Daten für leicht höhere Werte (annähernd 5 ml Hg) während der HBOL-Periode für den systolischen dyastolischen und mittleren arteriellen Druck bemerkenswert. Verbunden mit dem Anstieg des Blutdrucks war ein Anstieg des peripheren Gesamtwiderstands, in der Regel innerhalb der ersten vier Stunden. Während des HBOL-Zeitraums sank der Herzindex (-0,5 l/Min/M²). Der Puls war etwa 5-10 Schläge geringer, während des HBOL-Zeitraums als während des ATX-Zeitraums. Diese Befunde wurden bei den HBOL-Untersuchungen und haben wenig klinische Bedeutung.
Die Lungenfunktionstests waren unbeachtlich, mit Ausnahme eines 14%igen Anstiegs der Diffusionskapazität über die Grundlinie nach den ATX- und HBOL- Infusionen. Die Personen waren fähig, eine ähnliche Trainingskapazität während der HBOL- und ATX-Zeiträume zu erreichen. Arterielle Blutgasmessungen während des Spitzentrainings (anaerobische Schwelle) waren in beiden Zeiträumen ähnlich, jedoch neigte der arterielle pO&sub2;-Wert dazu, während des HBOL-Zeitraums höher zu sein. Die Plasmaspiegel der Milchsäure waren während des HBOL-Zeitraums niederer als während des ATX-Zeitraums. Stoffwechselmessungen in Ruhelage zeigten, dass der Sauerstoffverbrauch, die Kohlendioxidbildung und der Aufwand an Stoffwechselenergie während des HBOL-Zeitraums größer als während des ATX- Zeitraums waren. Der zuvor genannte Vergleich ist grob 1 g HBOL zu 3 g ATX, die mit den Beobachtungen von VO&sub2; und VCO&sub2; verbundene Diffusionskapazität zeigt, dass mehr Sauerstoff an den Gewebespiegel pro Gramm HBOL als Programm ATX abgegeben wird. Es wird allgemein angenommen, dass die Diffusionskapazität direkt mit dem Hämoglobinspiegel schwankt; jedoch gibt es einen Hinweis, dass 1 Gramm Plasmahämoglobin die Diffusionskapazität so viel wie 3 Gramm RBC- Hämoglobin erhöhen kann.
Die Laboruntersuchungen waren beachtenswert für kleine, jedoch vorübergehende Erhöhungen von ALT, AST, 5'-Nucleotide, Lipase und Creatinkinase während der HBOL-Periode. Es gab keine abnormalen Urinbefunde.
Die hämatologischen Untersuchungen stimmten mit denjenigen des Beispiels 7 überein.
Die beobachteten medizinischen Vorgänge stimmten mit den zu erwartenden Befunden überein, welche mit der Phlebotomie (vasovogale Episode), mehrfachen Lungenfunktionstest (Aufstoßen oder abdominales "Gas"), Einfügung in die arterielle Leitung (z. B. Schmerz oder Kribbeln oberhalb der Einfügungsstelle) oder zahlreichen täglichen Beschwerden verbunden sind, die man bei normalen Personen innerhalb des Verlaufs eines Monats beobachten kann (z. B. Kopfschmerz, Infektion oder Erkältung des oberen Atmungstrakts). Die eine Personen (Nr. 105), welche abdominales "Gas" und Druck in dem mittleren Oberbauch hatte, jedoch ohne Dysphagie, legt andere gastrointestinale Beschwerden nahe, welche bei vorhergehenden HBOL-Untersuchungen beobachtet wurden. L-Arginin wurde als therapeutische Maßnahme unter Zugrundelegung der Anschauung verwendet, das Hämoglobin eine endogene Stickoxidfunktion (Stickoxid ist bei der Entspannung der gastrointestinalen Plattenmuskulator unerlässlich, insbesondere in der Speiseröhre und den Därmen) stören kann. L-Arginin ist das Substrat, auf dem Stickoxid- Synthase Stickoxid bildet. Theoretisch kann, wenn man eine Verminderung des Stickoxids aus dem Hämoglobin hat, (vielleicht durch Bindung des Hämoglobins an Stickoxid), kann die Verabreichung von L-Arginin von Vorteil sein. Offensichtlich wurde die Person durch eine vorübergehende Entlastung von Ihren Symptomen von L-Arginin etwa zwei Stunden gekennzeichnet. Dies ist kein unerwarteter Befund, weil die Plasma-Halbwertszeit von L-Arginin etwa eine Stunde ist. Leider traten einige der Nebenwirkungen (Schwindet und Erbrechen) auf, und die Infusion wurde abgebrochen. Wir entschieden uns, ihr zwei Dosen Hyoscyamin, ein anticholinergisches, krampflösendes Arzneimittel, zu verabreichen. Dieses verminderte die Symptome des abdominalen "Gases" und Drucks weiter, die Person hatte keine weiteren Beschwerden oder Folgeerscheinungen.
Zusammengefasst war HBOL mit einer verbesserten Sauerstoffzufuhr und einer verbesserten Verwendung während des Trainings und bei Ruhepausen verbunden. HBOL führte zu einem Spektrum hämodynamischer Daten, Sicherheits- Laborergebnissen, pharmacokinetischen Daten und medizinischen Vorgängen, das dem denjenigen, das zuvor beobachtet wurde, ähnlich war. Das Eingreifen mit L- Arginin kann zu einer Umkehr von gastroindestinalen Symptomen führen, jedoch war sein Gebrauch durch Schwindel und Erbrechen begrenzt. Jedoch kann die Anwendung einer anticholinergischen Therapie bei der Behandlung der auftretenden gastroindestinalen Symptome von Wert sein.

BEISPIEL 9

Untersuchung der Sauerstoffanreicherung im Gewebe bei Infusion einer Lösung aus polymerisierten Hämoglobin nach Blutverdünnung

Bei dieser Untersuchung wurden die Grade einer Sauerstoffanreicherung in regionalen Gewebe im linken hinteren Extremitätenmuskel (Muskulusgastrocnemius) innerhalb einer Versuchsgruppe von acht Hunden gemessen, um die Wirkungen einer Infusion einer polymerisierten Hämoglobin-Lösung auf Tiere, welche durch isovolemische Blutverdünnung mit einer keiner Sauerstoff tragenden Lösung anhämisch gemacht waren.
Es wurden die Sauerstoffpartialdrucke im regionalen Gewebe unter Verwendung eines Sigma-pO2-Histographe (Modell-Nr. KIMOC 6650, Eppendorf- Netherler-Hinz GmbH, Hamburg, Deutschland), bestimmt zur Messung von mindestens 200 lokalen pO2-Werten in der zur freigelegten Femoralarterie distalen Skelettmuskulatur und anschließenden Aufzeichnung der pO&sub2;-Werte in einem Histogramm für jeden Messpunkt.
Bei jedem Messpunkt nahm der Eppendorf pO&sub2;-Histograph Messungen des Sauerstoffpartialdrucks polarographisch mit einer Sauerstoff-Nadelsonde mit Federstahlgehäuse, das eine Glas-isolierte, mit Teflon beschichtete Goldmikrokathode enthielt, vor. Die Sauerstoff-Nadelsonde wurde mit -700 mV zu einer Ag/AgCl-Anode polarisiert die an der Haut in Nähe der Stelle der Einfügung der Sauerstoff-Nadelsonde angebracht war. Der resultierende Strom war zum Sauerstoffpartialdruck an der Elektrodenspitze proportional, womit sich eine Messung der Sauerstoffanreicherung des lokalen Gewebes ergab.
Messungen der regionalen Sauerstoffanreicherung wurden mit Hilfe eines durch einen Mikroprozessor gesteuerten Manipulators erhalten, welcher die Sauerstoff-Nadelsonde durch das Gewebe in einer Reihe von "Pilerstufen" bewegte, welche jeweils typischerweise aus einer Vorwärtsbewegung von 1 mm, gefolgt von einer Rückwärtsbewegung von 0,3 mm bestanden, um den Druck des Gewebes aus der Vorwärtsbewegung zu entlasten, wobei nachfolgende der pO&sub2;-Wert gemessen wurde. Am Ende jeder Messung der Sauerstoffanreicherung im Gewebe wurde die Nadelsonde an einen neuen Gewebeort bewegt, so dass jede Messung nur in einem ungestörten, nicht-traumatisierten Muskelgewebe durchgeführt wurde.
Bei dieser Untersuchung wurden acht Hunden durch intramuskuläre Injektion von 5 mg/kg Ketamin (Ketanest®, Parke-Davis, Deutschland) und 2 mg/kg Xylazin (Rompun®, Bayer, Deutschland) zur Herbeiführung der Anästhesie 30 Minuten vor der endotrachealen Intubation verabreicht. Eine mechanische Belüftung wurde mit 70% Stickoxid im Sauerstoff und 1,0% Isofluran durchgeführt. Die Ventilation wurde eingestellt, um einen pCO&sub2;-Atmungs-Endwert zwischen 34 und 38 mmHg aufrecht zu erhalten.
In die linke Femoralarterie wurde zur invasiven Messung des arteriellen Blutdrucks eine Kanüle eingeführt, und das Blut wurde gemessen. Über die rechte Femoralvene wurde in die Pulmonararterie ein 7-Swan-Ganz Katheter platziert, zur Überwachung des Pulmonararteriendrucks, des zentravenösen Drucks und des Pulmonarcapillarkeil-Drucks. In die rechte äußere Jugularvene und die line Femoralvene wurde für einen Blutaustausch und die Infusion der polymerisierten Hämoglobinlösung ein 3 ml Kathetder platziert.
Nach der chirurgischen Vorbereitung wurde die Anästhesie durch kontinuierliche Infusion von 0,025 mg/kg/Std. Fentanyl (Janssen, Deutschland) und 0,4 mg/kg/Std. Midazolam (Dormicum®, Röche, Deutschland) aufrechterhalten. Die Muskelenspannung wurde mit 0, m2 mg/kg/Std. Vecuronium (Norcuron®, der Firma Organon, Deutschland) erreicht. Die Ventilation wurde auf 30% Sauerstoff in der Luft eingestellt.
Man ließ sich die Hunde 40 Minuten ins Gleichgewicht bringen, bevor die Ablesungen der Grundlinie vorgenommen wurden. Nach den Ablesungen der Grundlinie wurde das Blut eines jeden Hundes isovolemisch mit Hetastärke von einem Grundlinien-Hematokrit-Wert von etwa 35-45% auf einen Hematokrit-Wert von etwa 25%, und sodann stufenweise in Inkremeten von etwa 5% auf Hematokrit- Endwerte von etwa 10% verdünnt. Bei Hematokrit-Werten von etwa 25%, 20%, 15% und 10% wurden die damit verbundenen hämodynamischen Daten und die Sauerstoffpartialdrucke im Gewebe gemessen.
Nach Erreichen eines Hematokrit-Werts von etwa 10%, der einer RBC- Hämoglobin-Konzentration im Blut von etwa 3 g Hb/dl Blut äquivalent war, wurde jedem Hund eine Lösung von polymerisertem Hämoglobin (HBOC-201, auch als Lösung von Hempure 2® der Bipure Corporation, Boson, MA, U.S.A. bekannt) in drei Zuwachsdosen infundiert, die ausreichten, um das gemessene Gesamthämoglobin (Hb von RBC's plus Hb von der Lösung des polymerisierten Hb) um etwa 0,6-1,0 g/dl pro Dosis zu erhöhen, eine weitere Beschreibung der Lösung von Hemopure 2® ist in den vorherigen Beispielen enthalten.
Nach einen Gleichgewichtseinstellungszeitraum von 20 Minuten wurden alle Parameter aufgezeichnet. Die Zeiträume zwischen den jeweiligen Gesamthämoglobinspiegel waren 60 Minuten.
Fig. 5 zeigt, dass die Infusion der Lösung von polymerisiertem Hämoglobin im wesentlichen die Sauerstoffspiegel im regionalen Muskelgewebe bei anhämischen Hunden nach der ersten Dosis der Lösung des polymerisierten Hämoglobins wesentlich erhöhte und zwar von einem mittleren pO&sub2; von 16 Torr, verbunden mit einer RBC-Hämoglobin-Konzentration von 3,0 g/dl, auf einen normalen mittleren pO&sub2; von 35 Torr durch Erhöhung der Hämoglobin-Gesamtkonzentration um etwa 0,6 g/dl aus der Infusion der Lösung aus polymerisiertem Hämoglobin. Die Versuchshunde dieser Untersuchung hatten mittlere Sauerstoffdrucke im Muskelgewebe von 33 Torr vor der Blutverdünnung, was mit einer RBC-Hämoglobin-Konzentration von etwa 15,8 g/dl verbunden war. Infolgedessen zeigt diese Studie, dass verringerte Sauerstoffdrucke im Muskelgewebe, welche sich aus einer herabgesetzten Verfügbarkeit von RBC's zur Sauerstoffübertragung auf das Gewebe ergaben, verbessert und sogar auf normale Werte rückgeführt werden können oder aber auf solche oberhalb der Normalwerte, indem man geringe Mengen Hämoglobin in die Kreislaufsysteme der Tiere infudiert. Beispielsweie belegt Fig. 5, dass eine Erhöhung des Gesamthämoglobins von etwa 0,6 Hb/dl Plasma aus einer Infusion von polymerisiertem Hämoglobin den Sauerstoffdruck um 19 Torr erhöhte, was der Verminderung des Sauerstoffdrucks im Gewebe äquivalent war, welche mit einem Abfall der RBC-Hämoglobin-Konzentration von etwa 12,8 g Hb/dl Plasma aus der Blutverdünnung verbunden ist.

BEISPIEL 10

Untersuchung der Sauerstoffanreicherung, distal zu einer arteriellen RBC-Fluss- Blockade

Bei dieser Untersuchung wurden die Sauerstoffdrucke im Gewebe in dem hinteren Körperglied-Muskel (m. gastrocnemius) an Punkten, distal zu einer 90-93%igen Femoralarterien-Stenose in einer Kontrollgruppe (6 Hudne) und einer 94%igen Femoralarterien-Stenose in der Versuchsgruppe A (7 Hunde) gemessen gefolgt von einer Infusion einer Lösung von polymerisiertem Hämoglobin (Hemopure 2®-Lösung, Biopure Corporation, Boson, MA) mit ansteigenden Spiegeln nach der Stenose. Diese Untersuchung umfasste auch eine Messung der Sauerstoffdrucke im Gewebe in dem hinteren Körperglied-Muskel an zu einer 94%igen Femoralarterien- Stenose bei der Versuchsgruppe B (6 Hunde), wobei die Lösung polymersierten Hämoglobins (HBOC-201) vor der Herbeiführung der Stenose infundiert wurde.
Alte Parameter wurden an der Grundlinie nach einem 30minütigen Zeitraum zur Gleichgewichtseinsteltung nach der Stenose, 45 Minuten nach der Stenose (nur bei der Versuchsgruppe B) und 15 Minuten nach der Dosierung mit der Lösung aus polymerisiertem Hämoglobin oder der Hetastärke (2-Hydroxyethylether) (nur bei der Kontrollgruppe und der Versuchsgruppe A) aufgezeichnet.
Die Hunde in der Kontroll- und den Versuchsgruppen wurden anästhesiert und, wie im Beispiel 9 beschrieben, überwacht. Nach Herbeiführung der Anästhesie wurden Grundlinien-Messungen aufgezeichnet. Die Grundlinien-Sauerstoffdrucke im regionalen Gewebe für den hinteren Körperglied-Muskel der Kontrollgruppe und der Versuchsgruppe A sind in Fig. 6 gezeigt. Sodann wurde jeder der Hunde der Versuchsgruppe B intravenös mit einer Menge der Lösung von polymerisiertem Hämoglobin intravenös infundiert, welche ausreichte, den bei jedem Hund gemessenen Hämoglobin-Gesamtgehalt (Hb aus RBC's plus Hb aus der polymerisierten Hb-Lösung im Plasma), um etwa 2,0 g/dl zu erhöhen. Die Bedingungen für die Gruppe B der Hunde ließ man sich danach etwa 15-30 Minuten ins Gleichgewicht bringen, und die Sauerstoffdrucke im Gewebe wurden als Grundlinien-Werte für die Versuchsgruppe B aufgezeichnet (Fig. 7).
Sodann wurde die Femoralarterie, für ein Hinterbein eines jeden Hundes in jeder Gruppe, chirurgisch freigelegt und mit einer veränderbaren arteriellen Klammer geklammert, bis der Blutfluss um etwa 90-95% vermindert war. Der Blutfluss wurde durch eine distal zur Stenose gelegene Sonde mit Umfangsströmung gemessen. In den Fig. 2 bzw. 3 sind die mittleren Sauerstoffdrucke im Regionalgewebe für die hinteren Körperglied-Muskel distal zur Stenose bei den unten der Kontrollgruppe und der Versuchsgruppe A und der Versuchsgruppe B, 30 Minuten nach der Stenose, dargestellt. Diese Figuren zeigen einen starken äquivalenten Abfall der Sauerstoffdrucke im Gewebe (pO&sub2;-Spiegel) als Ergebnis einer regionalen Hypoxie in dem distalen hinteren Körperglied-Muskel bei den Hunden der Kontrollgruppe und Versuchsgruppe A (Fig. 6). Im speziellen, wie in Fig. 2 gezeigt, sank der mittlere Sauerstoffdruck im Gewebe bei der Kontrollgruppe von einem mittleren Grundlinien- Wert von 23 ± 2,2 Torr auf einen Mittelwert nach der Stenose von 8 ± 0,9 Torr. Ferner sank, wie in Fig. 6 gezeigt, der mittlere Sauerstoffdruck im Gewebe bei der Versuchsgruppe A von einem mittleren Grundlinien-Wert von 27 ± 2,9 Torr auf einen Mittelwert nach der Stenose von 11 ± 1,1 Torr. Zusätzlich zeigte zu dieser Zeit das distale Muskelgewebe bei Hunden der Kontrollgruppe und Versuchsgruppe A eine hellgraue Farbe.
Jedoch wurde bei den Hunden der Versuchsgruppe B, welche vor der Herbeiführung der 95%igen Stenose mit der Lösung aus polymerisiertem Hämoglobin infundiert worden waren, 30 Minuten nach der Stenose kein signifikanter Abfall des mittleren Sauerstoffdrucks im Muskelgewebe beobachtet. Wie in Fig. 7 gezeigt, fiel der mittlere Saurstoffdruck im Gewebe bei der Versuchsgruppe B von einem mittleren Grundlinien-Wert von 35 ± 6,9 Torr auf einen Mittelwert nach der Stenose von 32 ± 4,5 Torr ab.
Ferner war 45 Minuten nach der Stenose der mittlere Sauerstoffdruck im Gewebe bei der Versuchsgruppe B von 36 ± 4,5 Torr nicht von dem Grundlinien- Wert signifikant verschieden.
Die Ergebnisse in den Fig. 6 und 7 zeigen, dass die Herbeiführung einer Stenose von "≥ 90%" bei einem Tier eine ernsthafte hypoxische Bedingung im zur Stenose distalen Gewebe schuf, ausgenommen die Fälle, wo dem Tier prophylaktisch vor Herbeiführung der Stenose eine Lösung von polymerisiertem Hämoglobin verabreicht worden war. Wie in Fig. 7 gezeigt, behielten Tiere, denen eine Lösung von polymerisiertem Hämoglobin prophylaktisch verabreicht worden war, normale Gewebe-Sauerstoffdrucke im zur Stenose distalen Muskelgewebe bei, was die Wirksamkeit der prophylaktischen Verabreichung von Hämoglobin zur Verhinderung einer Gewebehypoxie nach einer partiellen Blockierung des Flusses von RBC zum Gewebe belegt. Sodann wurde nach den Messungen des Sauerstoffdrucks 30 Minuten nach der Stenose jedem Hund der Kontrollgruppe eine Hetastärke in zwei anwachsenden Dosen von 200 ml infundiert, welche in der Regel in ihrem Volumen dem Volumen der Lösung polymerisierten Hämoglobins entsprechen, welches zur Erhöhung des Gesamt-Hb bei einem Hund um etwa 0,5 bis etwa 0,7 g/dl pro Dosis benötigt wurde. Gleichzeitig wurde jeder Hund der Versuchsgruppe A mit der Lösung des polymerisierten Hämoglobins in zwei anwachsenden Dosen infundiert, welche ausreichten, das gemessene Gesamthämoglobin bei jedem Hund (Hb von RBC's plus Hb aus der polymerisierten Hb-Lösung) um etwa 0,5 bis etwa 0,7 g/dl pro Dosis zu erhöhen.
In Fig. 2 sind die Regionalgewebe-Sauerstoffdrucke für die stenotischen hinteren Körperglied-Muskeln der Kontrollgruppe nach der Infusion von 200 ml bzw. 400 ml Hetastärke dargestellt. Die beobachteten mittleren Sauerstoffdrucke im Gewebe waren 10 ± 1,6 Torr für die 200 ml Hetastärke-Infusion bzw. 10 ± 1,2 Torr für die 400 ml Hetastärke-Infusion. Diese Abbildung zeigt, dass die Infusion von Hetastärke nach der Stenose die Sauerstoffanreicherung im Gewebe distal zur Stenose im Vergleich zum Wert von 8 ± 0,9 Torr nicht verbesserte, wobei der distale hintere Körperglied-Muskel hypoxisch und in seiner Farbe hellgrau blieb.
In Fig. 2 sind auch Regionalgewebe-Sauerstoffdrucke für die stenotischen hinteren Körperglied-Muskeln der Versuchsgruppe A nach der Infusion einer 0,5 g/dl und 1,2 g/dl Hb-Lösung gezeigt. Die beobachteten mittleren Sauerstoffdrucke im Gewebe waren 20 ± 2,4 Torr, verbunden mit einem Anstieg von Plasma-Hb (und Gesamt-Hb)von 0,5 g/dl, bzw. 29 ± 2,8 Torr, verbunden mit einem Anstieg des Plasma-Hb (und des Gesamt-Hb) von 1,2 g/dl. Diese Figur zeigt, dass die Infusion der Hämoglobin-Lösung nach der Stenose den Gewebe-Sauerstoffdruck für den hinteren Körperglied-Muskel distal zur Stenose im Vergleich zum mittleren Sauerstoffdruck nach der Stenose von 11 ± 1,1 torr signifikant erhöhte und somit den hypoxischen Zustand erleicherte.
Eine verbesserte Sauerstoffanreicherung im Gewebe wurde auch durch die Farbveränderung des stenotischen Muskels von hellgrau zu einer rötlichen Farbe nach Infusion der Hämoglobin-Lösung belegt.
Es gab keine Unterschiede zwischen den Grundlinien- und Gewebesauerstoffdrucken nach der Stenose beim Vergleich der Kontrollgruppe und der Versuchsgruppe A. Jedoch gab es einen im hohen Maß signifikanten Anstieg des Gewebe-Sauerstoffdrucks der Versuchsgruppe A nach der ersten Hb-Dosis (p < 0,01) und nach der zweiten Hb-Dosis (p < 0,001) beim Vergleich mit der Kontrollgruppe, welche äquivalente Volumina Hetastärke erhielt.
Ein Vergleich der mittleren Sauerstoffdrucke ist in Fig. 1 dargestellt, welche die relative Wirksamkeit der Behandlung hypoxischen Gewebes, distal zu einer Stenose, mit einem keinen Sauerstoff tragenden Plasmaexpander, im speziellen Hetastärke, im Vergleich zur Behandlung mit dem Blutersatz aus polymerisiertem Hämoglobin zeigt. Dadurch wird belegt, dass die Infusion von Hetastärke den mittleren Gewebe-Sauerstoffdruck im zu einer Stenose distalen Muskelgewebe nicht verbesserte. Im Gegensatz hierzu verbesserte die Infusion einer Lösung polymerisieren Hämoglobins den Gewebe-Sauerstoffdruck in zu einer Stenose distalen Muskelgewebe signifikant auf einen Normalwert im Vergleich zur Grundlinie.

BEISPIEL 11

Untersuchung des Flusses einer Hämoglobinlösung im Mikrogefäßsystem mit einer Blockade des RBC-Flusses

Nach der Herbeiführung einer Anästhesie wurde der Bauch einer Sprague- Dawley-Ratte chirurgisch geöffnet, um den Dünndarm und das damit verbundne Mesenterium freizulegen.
Sodann wude unter einem Videomikroskop der Mikrokreislauf innerhalb des Mesenteriums beobachtet. Innerhalb des Mesenteriums wurde eine Kapillare mit einer Thrombose identifiziert, mit einer damit verbundenen vollständigen Behinderung der RBC-Strömung. Die Messung der RBC-Strömung durch dies Kapillare ergab einen Doppler-Wert von Null, wobei man ein optisches Doppier- Geschwindigkeitsmessgerät (Texas A&M Microvascular Research Inst.), benutzte, das keine RBC-Bewegung durch diese Kapillare zeigte.
Eine Lösung polymerisierten Hämoglobins (HBOC-201, Biopure Corporation, Boson, MA) wurde mit einem fluoreszierenden Farbstoff, speziell mit Fluoreszinisothiocyanat, markiert und sodann an einem von der Bauchhöhle entfernten Stelle intravenös injiziiert.
Das Hämoglobin in der Lösung des polymerisierten Hämoglobins wurde mit Fluoreszinisothiocyanat (im folgenden als "FITC" bezeichnet) unter Anwendung einer Modifikation des von Wilderspin in Anal. biochem., 132: 449 (1982) und Ohshiata in Anal. biochem., 215 : 17-23 (1993) beschriebenen Verfahrens markiert. Durch Auflösen von 6,6 g FITC in 615 ml eines 100 mM Boratpuffers (pH-Wert: 9,5) wurde eine Vorratslösung der FITC-Markierung zubereitet. Eine Lösung von polymerisiertem Hämoglobin (923 ml zu 13 g Hb/dl) wurde in einen mit Stickstoff gespülten Behälter gefüllt und mit 512 ml Boratpuffer ins Gleichgewicht gebracht. Die FITC-Boratpuffer-Lösung wurde sodann mit einer Rate von 11,8 ml/Min. durch eine statische Mischerschleife zum Hämoglobin-Boratgemisch zugegeben. Die Umsetzung verlief zwei Stunden bei Raumtemperatur in einer Stickstoffumgebung unter kontinuierlichem Rühren. Restliches FITC wurde durch Diafiltration mit einer 30 kD-Membran (Millipore Pellicon, 5 sq. ft.) für 7 Voluminaaustausche mit einer Lactat-Magerlösung (pH-Wert: 7,7) entfernt. Nach dem letzten Austausch wurde das System auf 8,6 g/dl Hämoglobin konzentriert, und das Material wurde mit 60 ml Injektionsspritzen unter Anwendung von anaeroben Verfahren in unter Stickstoff evakuierte 10 ml Vacutainer-Röhren verteilt. Die Röhren wurden in eine dünne Folie gehüllt und bei 4ºC bis zur Verwendung gelagert. Ein Molverhältnis von FITC : Hb von 10 : 1, das bei der Umsetzung verwendet wurde, ergab ein Verhältnis von FITC : Hb in dem markierten Hb-Produkt von 5 : 1. < ;
Nach Injektion des markierten Hämoglobins wurde innerhalb von einer Minute beobachtet, dass das markierte Hämoglobin in die thrombotische Kapillare eintrat und diese durchfloss, vorbei an der stillstehenden und übereinander geschichteten Aggregation der roten Blutzellen.
Die Ergebnisse dieser Untersuchung belegen, dass Hämoglobin das Mikrogefäßsystem (microvasculature), durch das der RBC-Fluss beschränkt oder ausgeschlossen ist, schließen kann, wodurch ein erhöhter Sauerstofftransport durch das Hämoglobin zum Gewebe möglich wird, das mit der thrombotischen Kapillare, in der kein RBC-Fluss stattfindet, verbunden ist.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung einer stabilen, polymerisierten Hämoglobinlösung aus einer desoxidierten polymerisierten Hämoglobinlösung mit den Schritten:

a) zur Verfügung stellen einer desoxidierten polymerisierten Hämoglobinlösung, die unter Verwendung eines Dialdehyd-Vernetzungsmittels polymerisiert wurde,

b) in Kontakt bringen der deoxidierten polymerisierten Hämoglobinlösung mit einer alkalischen Lösung, wobei die deoxidierte polymerisierte Hämoglobinlösung basisch gemacht wird,

c) in Kontakt bringen der basischen deoxidierten polymerisierten Hämoglobinlösung mit Natriumborhydrid, wobei eine stabile, reduzierte polymerisierte Hämoglobinlösung gebildet wird und

d) Diafiltration des stabilen, reduzierten polymerisierten Hämoglobins mit einer ersten physiologischen Lösung (zum Beispiel bei einem pH von 7,9 oder geringer), wobei die reduzierte polymerisierte Hämoglobinlösung physiologisch akzeptabel gemacht wird und dabei eine stabile polymerisierte Hämoglobinlösung bildet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, welches weiterhin einen Schritt der Diafiltration der stabilen polymerisierten Hämoglobinlösung mit einer zweiten physiologischen Lösung mit einem pH zwischen 7,6 und 7,9 durch einen Filter aufweist, der dazu geeignet ist, nicht polymerisiertes Hämoglobin von polymerisiertem Hämoglobin zu trennen und wobei beispielsweise die alkalische Lösung ein alkalischer Boratpuffer ist und die erste physiologische Lösung 27 mM Natriumlactat, 12 mM NAC, 115 mM NaCl, 4 mM KCl, sowie 1,36 mM CaCl&sub2; enthält und einen pH von etwa 5 hat.

3. Eine polymerisierte Hämoglobinlösung, hergestellt nach dem oder herstellbar durch das Verfahren gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2.

4. Stabile polymerisierte Hämoglobinlösung, die Säugetierhämoglobin mit einer Konzentration zwischen 10 und 250 Gramm Hämoglobin pro Liter Lösung aufweist, mit den folgenden Merkmalen:

a) einem Met-Hämoglobingehalt von weniger als 15 Gew.-%,

b) einem Oxyhämoglobingehalt von weniger oder gleich 10 Gew.-%,

c) einer Endotoxinkonzentration von weniger als 0,5 Endotoxineinheiten pro ml,

d) weniger als oder gleich 15 Gew.-% polymerisiertes Hämoglobin mit einem Molekulargewicht von mehr als 500.000 Dalton,

e) weniger als oder gleich 10 Gew.-% polymerisiertes Hämoglobin mit einem Molekulargewicht von weniger als 65.000 Dalton, sowie

f) weniger als oder gleich 5 Gew.-% Hämoglobin mit einem Molekulargewicht von weniger als 32.000 Dalton.

5. Die Hämoglobinlosung aus Anspruch 3 oder 4 zur Verwendung in der Therapie, zum Beispiel als Blutersatz zur Behandlung oder Vorbeugung von Hypoxie.

6. Verwendung der polymerisierten Hämoglobinlösung gemäß Anspruch 3 oder 4 zur Herstellung eines Medikaments zur Verbesserung der Gewebesauerstoffanreicherung im Gewebe eines Gliedertieres, welches ein normovolemisches Blutvolumen hat und zumindest eine normale systemische vaskulare Widerstandsfähigkeit, wobei das Gewebe einen reduzierten Fluß von roten Blutzellen hat aufgrund von

a) zumindest einer teilweisen Verstopfung im Kreislaufsystem des Gliedertieres,

b) einer Abnahme in der Bevölkerung mit Blutgefäßen, die dem Gewebe zugeordnet sind, oder

c) einer kardiogenen Dysfunktion des Herzens des Gliedertieres.

7. Verwendung der polymerisierten Hämoglobinlösung aus Anspruch 3 oder 4 für die Herstellung eines Medikamentes für die Verbesserung der Sauerstoffanreicherung im Gewebe oder der Vorbeugung einer Sauerstoff Verarmung im Gewebe eines Gliedertieres, welches ein normovolemisches Blutvolumen und zumindest eine normale systematische vaskuläre Widerstandsfähigkeit hat, als Prophylaxe gegen verringerten Fluß von roten Blutzellen aufgrund von

a) zumindest einer teil weisen Verstopfung im Kreislaufsystem des Gliedertieres,

b) einer Abnahme in der Bevölkerung von Blutgefäßen, die dem Gewebe zugeordnet sind, oder

c) einer kardiogenen Dysfunktion des Herzens des Gliedertieres.