CN110128531B - 一种无碳酸酐酶血红蛋白的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种无碳酸酐酶血红蛋白的制备方法，其包括如下步骤：a、新鲜抗凝牛血，用0.9％NaCl洗涤血液，用水溶解红细胞，离心去除细胞碎片和未溶解的细胞，得到上清液待纯化的血红蛋白溶液；b、在步骤a得到待纯化血红蛋白溶液中加入填充剂Na2SO4，得到待纯化的血红蛋白溶液样品；c、上样前，用平衡液0.1‑0.3M Na2SO4/25‑50mM Tris‑HCl平衡亲和层析色谱的介质，然后将步骤b得到的血红蛋白溶液样品上样，得到流穿液，即为纯化后的血红蛋白。本发明能够去除血红蛋白溶液中的碳酸酐酶，且可以有较高的回收率，在得到高纯度的血红蛋白的同时也得到了高纯度的碳酸酐酶，一举二得，双重收益。
Description
技术领域
本发明涉及一种血红蛋白的制备方法，特别是涉及一种无碳酸酐酶血红蛋白的制备方法。
背景技术
随着医疗临床用血刚性需求以10-15％的速度增加，而献血人数相对增长缓慢，使得供需缺口逐年拉大。另外在面对战争、自然灾害等应急突发事件中，血液保障的重要性也凸显出来。由于血液自身的特殊性，如保存期短、运输条件苛刻、血型配合、安全风险等，所以血液代用品作为药物，有了不可替代的优势。
血液代用品是指具有血液有形成分和无形成分功能的人工制剂，可分为红细胞代用品、血小板代用品和血浆代用品等。鉴于红细胞代用品的特殊功效和重要作用，通常所说的血液代用品实际上就是红细胞代用品。它包括化学合成氟碳化合物类和血红蛋白氧载体类。其中，血红蛋白氧载体是以天然或重组血红蛋白为基础进行化学改构或包裹而获得的具有携/放氧功能的一类产品，即狭义的红细胞代用品，也是几十年来国内外红细胞代用品研究的热点。特别是随着对天然氧载体(即血红蛋白)结构与性能的清晰认识，已使它成为血液代替品的最佳候选，而制备出高纯度的血红蛋白是保证该研究成功的基础。
血红蛋白是红细胞的主要成分，约占细胞重量的32％，每个血红蛋白分子由1个珠蛋白和4个血红素(又称亚铁原卟啉)组成。每个血红素又由4个吡咯基组成一个环，其中心为一个亚铁离子。珠蛋白有4条多肽链，每条多肽链与1个血红素相连接，构成血红蛋白的单体或亚单位。血红蛋白是由4个单体构成的四聚体。通常情况下血红蛋白分子以二聚体和四聚体平衡状态存在，四聚体的分子量约为68Kd，二聚体的分子量约为34Kd,理论等电点(PI)约为6.7-6.9；碳酸酐酶(EC 4.2.1.1)是一种锌酶，具有催化碳酸分解成二氧化碳和水的可逆反应，是红细胞的主要蛋白质成分之一，地位仅次于血红蛋白。分子量约为30kD，由单一肽链组成，包含约260个氨基酸残基，每个酶分子包含一个锌离子，理论等电点(PI)约为6.3-6.5。与血红蛋白的等电点、二聚体分子量等都很接近，很难用分子筛、离子交换等通用方法分离它们，同时由于高浓度血红蛋白的干扰，采用简单的亲和层析纯化方式也很难达到理想的分离效果。因此，急需研发一种能够将无碳酸酐酶分离的高纯度血红蛋白的制备方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种无碳酸酐酶血红蛋白的制备方法，以去除血红蛋白溶液中的碳酸酐酶，且可以有较高的回收率，在得到高纯度的血红蛋白的同时也得到了高纯度的碳酸酐酶，一举二得，双重收益。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种无碳酸酐酶血红蛋白的制备方法，其包括如下步骤：
a、新鲜抗凝牛血，用0.9％NaCl洗涤血液，用水溶解红细胞，离心去除细胞碎片和未溶解的细胞，得到上清液待纯化的血红蛋白溶液；
b、在步骤a得到待纯化血红蛋白溶液中加入填充剂Na2SO4，得到待纯化的血红蛋白溶液样品；
c、上样前，用平衡液0.1-0.3M Na2SO4/25-50mM Tris-HCl平衡亲和层析色谱的介质，然后将步骤b得到的血红蛋白溶液样品上样，得到流穿液，即为纯化后的血红蛋白。
上述无碳酸酐酶血红蛋白的制备方法，其中，所述步骤b中，所述填充剂Na2SO4的加入量为每100ml待纯化血红蛋白溶液中加入1.4-4.3g Na2SO4。
上述无碳酸酐酶血红蛋白的制备方法，其中，所述步骤b中，所述填充剂Na2SO4的加入量为每100ml待纯化血红蛋白溶液中加入2.85g Na2SO4。
上述无碳酸酐酶血红蛋白的制备方法，其中，所述亲和层析色谱的介质为CMSephadex-Sulfanilamid。
上述无碳酸酐酶血红蛋白的制备方法，其中，所述步骤c中，上样前，用平衡液0.2MNa2SO4/25mM Tris-HCl平衡亲和层析色谱的介质。
本发明还提供了一种碳酸酐酶的制备方法，其包括如下步骤：
a、新鲜抗凝牛血，用0.9％NaCl洗涤血液，用水溶解红细胞，离心去除细胞碎片和未溶解的细胞，得到上清液待纯化的血红蛋白溶液；
b、在步骤a得到待纯化血红蛋白溶液中加入填充剂Na2SO4，得到待纯化的血红蛋白溶液样品；
c、上样前，用平衡液0.1-0.3M Na2SO4/25-50mM Tris-HCl平衡亲和层析色谱的介质，然后将步骤b得到的血红蛋白溶液样品上样，得到流穿液，即为纯化后的血红蛋白；
d、用亲和层析色谱第一洗脱液20-40mM Na2SO4/5-8mM Tris-HCl洗脱掉非特异性吸附的杂质；
e、用亲和层析色谱第二洗脱液继续洗脱，该第二亲和层析色谱洗脱液包括氧化型离子强度剂和CH3COONa，第二洗脱液中离子强度剂的浓度为0.4-0.8M，CH3COONa的浓度为0.2-0.3M，洗脱掉特异吸附的碳酸酐酶，得到纯化的碳酸酐酶。
上述碳酸酐酶的制备方法，其中，所述步骤e中，所述氧化型离子强度剂为NaClO3、MgO2和NaClO4。
上述碳酸酐酶的制备方法，其中，所述步骤e中，所述氧化型离子强度剂为NaClO4。
上述碳酸酐酶的制备方法，其中，所述步骤e中，所述第二洗脱液为0.6M NaClO4/0.2M CH3COONa。
上述碳酸酐酶的制备方法，其中，所述步骤d中，所述第一洗脱液为30mM Na2SO4/5mM Tris-HCl。
本发明的无碳酸酐酶血红蛋白的制备方法具有如下有益效果：
1、本发明的无碳酸酐酶的血红蛋白制备方法，是在特异性亲和层析色谱分离的基础上，通过优化相间接触，以达到彻底纯化的目的，经过大量实验，发现在待纯化的血红蛋白溶液中加入优化相间接触的填充剂Na2SO4可明显提高碳酸酐酶的吸附，同时也降低血红蛋白的非特异性的吸附，能够得到高纯度的血红蛋白，纯度可以达到99.99％，同时也得到了高纯度的碳酸酐酶，纯度可以达到99.8％以上，一举两得、双重收益；
2、本发明无碳酸酐酶血红蛋白的制备方法，洗脱时加入离子强度剂NaClO4，可以更彻底洗脱掉碳酸酐酶，能够显著提升碳酸酐酶的收率，收率高达95％，同时也达到了介质的良好复性，缩短了填料复性操作时间；
3、本发明无碳酸酐酶血红蛋白的制备方法是一种简单、可放大的除去待纯血红蛋白中的碳酸酐酶的新方法，且介质复性快速简单，方便了其重复利用，降低了生产成本，不需要投入复杂的设备，便于推广应用。
附图说明
附图1为本发明实施例1的血红蛋白的亲和层析540nm光谱图；
附图2为本发明实施例1的血红蛋白的亲和层析收获品的SDS-PAGE图；
附图3为本发明实施例1的血红蛋白的亲和层析收获品的Western blot图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例详细描述本发明。
实例1
1、制备高纯度血红蛋白
取新鲜抗凝牛血，用0.9％NaCl洗涤血液三次，用冷水溶解红细胞。在4℃条件下，离心30分钟，去除细胞碎片和未溶解的细胞，上清液即为待纯化的血红蛋白溶液；向待纯化的血红蛋白溶液中加入填充剂Na2SO4，按100ml待纯血红蛋白溶液加入2.85g填充剂Na2SO4，得到待纯化血红蛋白样品；上样前，用平衡液0.2M Na2SO4/25mM Tris-HCl平衡亲和层析色谱的介质，亲和层析所用介质为CM Sephadex-Sulfanilamide，然后将制备好的待纯化血红蛋白样品上样，直至与介质层面齐平,得到流穿液，即为纯化的血红蛋白。
2、制备高纯度碳酸酐酶
用亲和层析色谱第一洗脱液30mM Na2SO4/5mM Tris-HCl洗掉非特异性吸附的杂质物质；用第二洗脱液0.6M NaClO4/0.2M CH3COONa继续洗脱，洗掉吸附的碳酸酐酶，即得到纯化的碳酸酐酶，同时也复性了介质；用平衡液0.2M Na2SO4/25mM Tris-HCl平衡层析柱后即可进入下个纯化循环。
本实施例中通过紫外检测仪监测并收集各峰蛋白，具体光谱结果见图1；通过血气分析仪测定血红蛋白浓度，并以此计算的血红蛋白的收率为95.2％；通过还原性SDS-PAGE方法测定各收集峰的蛋白成分及含量，参见图2，结果显示：收集的血红蛋白纯度可达到99.99％，纯化前血红蛋白溶液内约30kD蛋白条带，纯化后消失，在第二洗脱液中出现约30KD的单一蛋白条带，并此条带显示的分子量与碳酸酐酶一致，初步判断应为碳酸酐酶，其收率为95.6％，纯度为99.91％；进一步通过Western blot方法定性检测约30kD条带的产物，参见图3，结果显示：纯化前的约30kD条带为碳酸酐酶，在第二洗脱液中出现的约30kD条带也为碳酸酐酶。综上检测结果表明：碳酸酐酶与血红蛋白在经过亲和层析后得到了彻底的分离，在得到高纯度的血红蛋白的同时，也得到了高纯度的碳酸酐酶，一举二得，双重收益，效果非常理想。
实施例2
1、制备高纯度血红蛋白
取新鲜抗凝牛血，用0.9％NaCl洗涤血液三次，用冷水溶解红细胞。在4℃条件下，18000g离心30分钟，去除细胞碎片和未溶解的细胞，上清液即为待纯化的血红蛋白溶液；向待纯化的血红蛋白溶液中加入填充剂Na2SO4，按100ml待纯血红蛋白溶液加入1.40g填充剂Na2SO4，得到待纯化血红蛋白样品；上样前，用平衡液0.1M Na2SO4/25mM Tris-HCl平衡亲和层析色谱的介质，亲和层析所用介质为CM Sephadex-Sulfanilamide，然后将制备好的待纯化血红蛋白样品上样，直至与介质层面齐平,得到流穿液，即为纯化的血红蛋白。
2、制备高纯度碳酸酐酶
用亲和层析色谱第一洗脱液20mM Na2SO4/5mM Tris-HCl洗掉非特异性吸附的杂质物质；用第二洗脱液0.4M NaClO4/0.2M CH3COONa继续洗脱，洗掉吸附的碳酸酐酶，即得到纯化的碳酸酐酶，同时也复性了介质；用平衡液0.1M Na2SO4/25mM Tris-HCl平衡层析柱后即可进入下个纯化循环。
采用与实施例1相同的方法进行检测，血红蛋白收率为92.3％，血红蛋白的纯度为99.92％；碳酸酐酶的纯度为99.87％，收率为94.3％。
实施例3
1、制备高纯度血红蛋白
取新鲜抗凝牛血，用0.9％NaCl洗涤血液三次，用冷水溶解红细胞。在4℃条件下，18000g离心30分钟，去除细胞碎片和未溶解的细胞，上清液即为待纯化的血红蛋白溶液；向待纯化的血红蛋白溶液中加入填充剂Na2SO4，按100ml待纯血红蛋白溶液加入4.30g填充剂Na2SO4，得到待纯化血红蛋白样品；上样前，用平衡液0.3M Na2SO4/50mM Tris-HCl平衡亲和层析色谱的介质，亲和层析所用介质为CM Sephadex-Sulfanilamide，然后将制备好的待纯化血红蛋白样品上样，直至与介质层面齐平,得到流穿液，即为纯化的血红蛋白。
2、制备高纯度碳酸酐酶
用亲和层析色谱第一洗脱液40mM Na2SO4/8mM Tris-HCl洗掉非特异性吸附的杂质物质；用第二洗脱液0.8M NaClO4/0.3M CH3COONa继续洗脱，洗掉吸附的碳酸酐酶，即得到纯化的碳酸酐酶，同时也复性了介质；用平衡液0.3M Na2SO4/50mM Tris-HCl平衡层析柱后即可进入下个纯化循环。
采用与实施例1相同的方法进行检测，血红蛋白收率为94.7％，血红蛋白的纯度为99.89％；碳酸酐酶的纯度为99.85％，收率为95.2％。
实施例4
与实施例1的制备高纯度血红蛋白和高纯度碳酸酐酶的方法相同，不同之处在于，在制备高纯度碳酸酐酶时，第二洗脱液中采用的氧化型离子强度剂不同，本实施例中采用的氧化型离子强度剂为NaClO3，制得的碳酸酐酶纯度和收率见表1。
实施例5
与实施例1的制备高纯度血红蛋白和高纯度碳酸酐酶的方法相同，不同之处在于，在制备高纯度碳酸酐酶时，第二洗脱液中采用的氧化型离子强度剂不同，本实施例中采用的氧化型离子强度剂为MgO2，制得的碳酸酐酶纯度和收率见表1。
表1
通过表1可知，不同的离子强度剂对碳酸酐酶纯度的影响不大，但从对收率的影响上看，选择NaClO4作为离子强度剂能够显著提升碳酸酐酶的收率。
对比例1
与实施例1制备高纯度血红蛋白和高纯度碳酸酐酶的方法相同，不同之处在于，在待纯化血红蛋白溶液和平衡液中加入的填充剂为CaSO4，血红蛋白的收率和纯度见表2。
对比例2
与实施例1制备高纯度血红蛋白和高纯度碳酸酐酶的方法相同，不同之处在于，在待纯化血红蛋白溶液和平衡液中加入的填充剂为CaHPO4，血红蛋白的收率和纯度见表2。
对比例3
与实施例1制备高纯度血红蛋白和高纯度碳酸酐酶的方法相同，不同之处在于，在待纯化血红蛋白溶液中不加入填充剂，血红蛋白的收率和纯度见表2。
对比例4
与实施例1制备高纯度血红蛋白和高纯度碳酸酐酶的方法相同，不同之处在于，在待纯化血红蛋白溶液中不加入填充剂Na2SO4，并且在平衡液中不加入填充剂Na2SO4，血红蛋白的收率和纯度见表2。
表2
通过表2可知，对比例1和对比例2中采用了CaSO4和CaHPO4作为填充剂，而实施例1采用Na2SO4作为填充剂，采用不同的填充剂得到的血红蛋白收率相差不多，但采用Na2SO4作为填充剂，显著提升了血红蛋白的纯度，可以得到纯度为99.99％的血红蛋白。对比例3中在待纯化的血红蛋白样品中未加入填充剂，与实施例1相比，收率相差不大，但加入填充剂Na2SO4后显著提升了血红蛋白的纯度。对比例4中在待纯化的血红蛋白样品中未加入填充剂，并且也没有在平衡液中加入填充剂，与实施例1相比，收率略有下降，但加入填充剂Na2SO4后，实施例1得到的血红蛋白纯度得到了显著提升，可以达到99.99％。对比例3与对比例4相比，平衡液中加入填充剂略微提升了血红蛋白的收率和纯度，而实施例1进一步在待纯化血红蛋白样品中加入填充剂Na2SO4，显著提升了血红蛋白的纯度。因此，通过上述对比实验，本发明选择Na2SO4作为上样待纯化血红蛋白样品和平衡液的填充剂，能够有效提高血红蛋白的纯度。
Claims (8)
1.一种无碳酸酐酶血红蛋白的制备方法，其包括如下步骤：
a、新鲜抗凝牛血，用0.9％NaCl洗涤血液，用水溶解红细胞，离心去除细胞碎片和未溶解的细胞，得到上清液待纯化的血红蛋白溶液；
b、在步骤a得到待纯化血红蛋白溶液中加入填充剂Na2SO4，得到待纯化的血红蛋白溶液样品，所述填充剂Na2SO4的加入量为每100ml待纯化血红蛋白溶液中加入2.85g Na2SO4；
c、上样前，用平衡液0.2M Na2SO4/25-50mM Tris-HCl平衡亲和层析色谱的介质，然后将步骤b得到的血红蛋白溶液样品上样，得到流穿液，即为纯化后的血红蛋白。
2.如权利要求1所述的无碳酸酐酶血红蛋白的制备方法，其中，所述亲和层析色谱的介质为CM Sephadex-Sulfanilamid。
3.如权利要求1所述的无碳酸酐酶血红蛋白的制备方法，其中，所述步骤c中，上样前，用平衡液0.2M Na2SO4/25mM Tris-HCl平衡亲和层析色谱的介质。
4.一种碳酸酐酶的制备方法，其包括如下步骤：
a、新鲜抗凝牛血，用0.9％NaCl洗涤血液，用水溶解红细胞，离心去除细胞碎片和未溶解的细胞，得到上清液待纯化的血红蛋白溶液；
b、在步骤a得到待纯化血红蛋白溶液中加入填充剂Na2SO4，得到待纯化的血红蛋白溶液样品，所述填充剂Na2SO4的加入量为每100ml待纯化血红蛋白溶液中加入2.85g Na2SO4；
c、上样前，用平衡液0.2M Na2SO4/25-50mM Tris-HCl平衡亲和层析色谱的介质，然后将步骤b得到的血红蛋白溶液样品上样，得到流穿液，即为纯化后的血红蛋白；
d、用亲和层析色谱第一洗脱液20-40mM Na2SO4/5-8mM Tris-HCl洗脱掉非特异性吸附的杂质；
e、用亲和层析色谱第二洗脱液继续洗脱，该第二亲和层析色谱洗脱液包括氧化型离子强度剂和CH3COONa，第二洗脱液中离子强度剂的浓度为0.4-0.8M，CH3COONa的浓度为0.2-0.3M，洗脱掉特异吸附的碳酸酐酶，得到纯化的碳酸酐酶。
5.如权利要求4所述的碳酸酐酶的制备方法，其中，所述步骤e中，所述氧化型离子强度剂为NaClO3和NaClO4。
6.如权利要求5所述的碳酸酐酶的制备方法，其中，所述步骤e中，所述氧化型离子强度剂为NaClO4。
7.如权利要求6所述的碳酸酐酶的制备方法，其中，所述步骤e中，所述第二洗脱液为0.6M NaClO4/0.2M CH3COONa。
8.如权利要求4所述的碳酸酐酶的制备方法，其中，所述步骤d中，所述第一洗脱液为30mM Na2SO4/5mM Tris-HCl。
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