Gebiet der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung bestimmter Verbindungen zur
Herstellung eines Medikaments zum Hemmen der Metastasenbildung von Krebszellen, und
sie zielt darauf ab, eine Medizin bereitzustellen, die einen Krebs vollständig heilen
kann, indem sie die Metastasenbildung der Krebszellen hemmt.
Stand der Technik
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Zur Behandlung von Krebs wurden in letzter Zeit Chemotherapie unter Einsatz
verschiedener krebshemmender Mittel, Immuntherapie zur Förderung der Produktion von
Antikörpern gegen Krebszellen, chirurgische Therapie zum Extrahieren von Krebszellen,
Strahlentherapie zum Abtöten von Krebszellen durch Bestrahlung usw. eingesetzt. Diese
Therapien wurden zwar weiterentwickelt, aber chirurgische Operationen oder
Strahlentherapie unterliegen technischen Einschränkungen und können die Metastasenbildung
bei Krebs nicht wirksam hemmen. Anderseits wirkt zwar die Chemotherapie direkt unter
Einsatz von krebshemmenden Mitteln auf die Krebszellen, aber viele der
krebshemmenden Mittel rufen schädliche Nebenwirkungen auch an normalen Zellen eines Wirts
hervor. Daher ist Chemotherapie nicht notwendigerweise wirksam gegen die
Krebsmetastasenbildung. Weiters sind im Fall von Immuntherapie zur Behandlung von Krebs keine
guten Wirkungen gegen Krebsmetastasenbildung festzustellen. Die therapeutischen
Wirkungen gegen den ursprünglichen Krebs wurden zwar stark verbessert, aber nicht
wenige Patienten sterben durch Krebsmetastasen, die durch die Metastasenbildung von
Krebszellen entstehen, selbst wenn der ursprüngliche Krebs vollständig geheilt wird.
Um die Krebsmetastasenbildung zu hemmen, besteht starker Bedarf an der Entwicklung
von Medikamenten zur Hemmung der Metastasenbildung von Krebszellen. Es wird
angenommen, dass Krebszellen über einen weiten Bereich Metastasen bilden, indem sie
an Zellmembranen von Geweben, wie z. B. dem Mesenterium, anhaften.
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Es ist zwar anerkannt, dass ein Medikament zum Hemmen der Metastasenbildung von
Krebszellen die Wirkung hat, die Metastasenbildung der Krebszellen zu hemmen, wenn
Sizofiran in Kombination mit einem Chemotherapeutikum verwendet wird, es war
jedoch bisher kein Medikament im Handel erhältlich, um die Metastasenbildung von
Krebszellen zu hemmen, wenn es allein verwendet wird. Weiters offenbaren zwar die
JP-A-60-190.791, die JP-A-61-83.125 und die JP-A-62-223.124 Krebsmetastasenbildung
hemmende Wirkungen mit Sialsäurederivaten, sie beschreiben jedoch nicht die
Verwendung von Sialsäure oder ihren Derivaten, die gemäß vorliegender Erfindung als
Wirkbestandteil verwendet werden, ebenso wenig wie deren Metastasenbildung
hemmende Wirkung.
Zusammenfassung der Erfindung
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In Anbetracht der obigen Probleme zielt die vorliegende Erfindung darauf ab, ein
krebshemmendes Mittel bereitzustellen, das die Metastasenbildung von Krebszellen hemmen
kann, wenn es allein verwendet wird. Außerdem zielt die vorliegende Erfindung auch
darauf ab, ein krebshemmendes Mittel bereitzustellen, das die Metastasenbildung von
Krebszellen hemmen kann, während es geringe Nebenwirkungen und sehr niedrige
Toxizität aufweist, selbst wenn es über längere Zeit verabreicht wird.
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Die vorliegende Erfindung wurde gemacht, indem Medikamente gescreent wurden, die
fähig sind, die Metastasenbildung von Krebszellen aus dem natürlichen Umfeld heraus
zu hemmen, und sie betrifft die Verwendung von Sialsäure und/oder ihrer Salze zur
Herstellung eines Medikaments, das Krebsmetastasenbildung hemmende Wirkung
aufweist.
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Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung eines Sialsäurepolymers und/
oder eines Salzes des Polymers zur Herstellung eines Medikaments, das
Krebsmetastasenbildung hemmende Wirkung aufweist.
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Vorzugsweise ist das Sialsäurepolymer ein Polymer, das aus 2 bis 13 Mol Sialsäure
besteht. Der Grund, weshalb die Obergrenze auf ein 13-Molekül-Polymer festgelegt ist,
besteht darin, dass es möglich ist, Polymere mit bis zu 13 Molekülen zu fraktionieren
und aufzutrennen. Es wird erwartet, dass Sialsäurepolymere, die aus 2 bis 13 Sialsäure-
Molekülen bestehen, und deren Salze eine pharmakologische Wirkung zeigen, die jener
von Sialsäure und ihren Salzen ähnlich ist. Als Salze von Sialsäure und ihren Polymeren
können verschiedene pharmazeutisch annehmbare Salze verwendet werden. Als Salze
des Sialsäuremonomers können das Natriumsalz, Kaliumsalz, Kalziumsalz und
Magnesiumsalz verwendet werden. Als Salze der Sialsäurepolymere können Natriumsalze
verwendet werden. "Sialsäure" wie in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen
verwendet, bedeutet "N-Acetylneuraminsäure".
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Als pharmazeutische Präparate gemäß vorliegender Erfindung können Präparate zur
oralen Verabreichung, wie z. B. Tabletten, Kapseln, Pulver usw., Präparate zur perkutanen
Verabreichung, wie z. B. Zäpfchen, Vaginal-Zäpfchen usw., und Injektionspräparate zur
subkutanen Injektion, intraperitonalen Injektion, intravenösen Injektion usw. genannt
werden. Die Präparate zur oralen Verabreichung werden am meisten bevorzugt, um
gegen Erkrankungen vorzubeugen, während die Injektionspräparate in Notfällen am
meisten bevorzugt werden.
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Die Präparate zur oralen Verabreichung, die Präparate zur perkutanen Absorption und
die Injektionspräparate können nach herkömmlichen Verfahren zum Formulieren von
Medikamenten formuliert werden. Formulierungsbeispiele für ein Präparat zur oralen
Verabreichung und ein Injektionspräparat können wie folgt genannt werden:
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1) Formulierungsbeispiel für das Injektionspräparat:
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Nachdem 50 g Sialsäure oder eines Polymers davon in 1.000 ml destilliertem Wasser
(Pyrogen-frei) gelöst worden waren, wurde der pH-Wert der Lösung unter Verwendung
einer Natronlaugelösung auf 7,0 eingestellt. Das Resultat wurde nach herkömmlichen
Verfahren filtriert und sterilisiert. Das sterilisierte Filtrat wurde abgedichtet und aseptisch
in eine 20 ml-Ampulle gefüllt, wodurch ein Injektionspräparat erhalten wurde.
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2) Formulierungsbeispiel für das Präparat zur oralen Verabreichung:
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Ein Kapsel-Präparat wurde hergestellt, indem 280 mg Sialsäure oder eines Polymers
davon nach Passieren eines 60 Mesh-Siebs in Gelatinekapseln Nr. 3 gefüllt wurden.
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Die Dosierung variiert je nach dem Alter, dem Geschlecht und der Schwere der
Erkrankung usw. eines Patienten und kann nicht allgemein angegeben werden. Sialsäure oder
das Natriumsalz eines Polymers davon, enthalten in einem Injektionspräparat, kann in
einer Dosis von 1 bis 2.000 mg/kg, vorzugsweise 10 bis 500 mg/kg pro Tag an einen
Erwachsenen verabreicht werden, und die Häufigkeit der Verabreichung ist 1- bis 6-mal
täglich. Verabreichung durch intravenöse Tropfinfusion ist ebenfalls eine wirksame
Maßnahme.
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Da Sialsäure eine Substanz ist, die weitgehend in Endgruppen von Sacchariden, die in
einer Oberflächenschicht von Zellen vorhanden sind, die den menschlichen Körper
bilden, und in Endgruppen von Sacchariden von Glykoproteinen enthalten sind, die im
Blut und in Körperflüssigkeiten enthalten sind, handelt es dabei um eine Medizin, das
extrem geringe negative Auswirkungen auf den menschlichen Körper hat.
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Sialsäure und ihre Polymere, wie gemäß vorliegender Erfindung verwendet, können
beliebige aus chemisch synthetisierten Produkten, enzymatisch katalysierten
synthetisierten Produkten, die unter Verwendung von Sialsäure-Aldolase oder
Cytosinmonophosphat-N-acetylneuraminsäure- (CMP-NANA-) Syntheseenzym oder
CMP-NANA-Transferase erhalten werden, und hydrolysierten Sialsäureprodukten sein, die durch Zersetzen
von Sialsäure mit einer Säure erhalten werden. Sialsäure und ihre Polymere sind jedoch
nicht darauf beschränkt.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
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Fig. 1 zeigt die die Haftung von Krebszellen an Ratten-M-Zellen hemmende Wirkung
von Sialsäure; und
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Fig. 2 zeigt den Einfluss von Sialsäure auf die die Haftung von Krebszellen an den
Ratten-M-Zellen hemmende Wirkung eines LFA-1-Antikörpers.
Beste Art der Durchführung der Erfindung
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Gemäß vorliegender Erfindung hemmt Sialsäure, ein Sialsäuresalz, ein Sialsäurepolymer
und/oder ein Salz des Sialsäurepolymers, die bzw. das als Wirkbestandteil im
krebshemmenden Mittel enthalten ist, das Anhaften von Krebszellen an Zellmembranen, wie z. B.
Mesenterium, wodurch die Metastasenbildung der Krebszellen gehemmt wird.
Sialsäure, das Sialsäuresalz, das Sialsäurepolymer und das Salz des Sialsäurepolymers können
einzeln als Wirkbestandteil zugegeben werden, oder zwei oder mehr Arten davon
können in Kombination verwendet werden.
Beispiele
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Die Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes haben als Modellsystem zur
Messung der Metastasenbildung hemmenden Wirkung auf die Krebszellen ein System
eingesetzt, bei dem Ratten-Bauchwasser-Hepatom als extrem bösartige Krebszellen dazu
gebracht wurde, am Mesenterium einer Ratte zu haften. Sie haben als einfachere
Technik auch ein Zellsystem verwendet. Als erstere Krebszellen wurden AH66F-Zellen
verwendet, während M-Zellen als letztere Mesenterium-Zellen verwendet wurden.
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Die Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes haben verschiedene
Substanzen, die in der natürlichen Umgebung vorhanden sind, überprüft, indem sie das oben
genannte Messsystem eingesetzt haben. Als Ergebnis haben sie festgestellt, dass
Sialsäure und ihre Polymere die Wirkung aufweisen, die Haftung von Krebszellen an
Bauchwasser-Hepatomen zu hemmen, und dass bei Tierversuchen, bei denen Ratten
verwendet wurden, die AH66F-Bauchwasser-Hepatom aufwiesen, beträchtliche
lebensverlängernde Wirkung beobachtet wurde. In der Folge wird die vorliegende Erfindung
detaillierter unter Bezugnahme auf die Beispiele veranschaulicht.
Beispiel 1
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Mesenterium-Zellen (M-Zellen), die von einer Ratte stammten, wurden in einer
Zellkultivierungsnapfplatte mit Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM), das 5%
Kalbsfötenserum (FCS) enthielt, kultiviert. Als sich die Zellen über die gesamte Fläche
des Napfs ausgebreitet hatten, wurden sie mit DMEM gewaschen, das kein FCS enthielt.
Weiters wurden die Zellen bei 37ºC mit DMEM kultiviert, das 10 ug/ml oder 100
ug/ml Sialsäure enthielt. Nachdem 45 min vergangen waren, wurde der Napfmit DMEM
gewaschen, und Ratten-AH66F-Zellen (4 · 10&sup4; Zellen/Napf) und Sialsäure in der in Fig.
1 gezeigten Konzentration wurden gemeinsam mit DMEM hinzugefügt. Das Gemisch
wurde bei 37ºC für 1 h kultiviert. Nach dem Kultivieren wurde das Gemisch für 30 s
gerührt, und die Kultivierungsüberstandsflüssigkeit wurde in ein Probenröhrchen gefüllt.
In jeden Napf wurden 200 ul frisches DMEM hinzugefügt, und Waschen wurde auf
ähnliche Weise unter Rühren für 15 s durchgeführt. Dieser Waschvorgang wurde zwei
weitere Male durchgeführt, und die verwendete Waschflüssigkeit wurde mit der
Kultivierungsüberstandsflüssigkeit kombiniert. Die Resultierende wurde
Zentrifugierungstrennung bei 12.000 U/min für 5 min unterzogen. Nachdem die Überstandsflüssigkeit
entfernt worden war, wurden 100 ul frisches DMEM hinzugefügt, um die Zellen zu
suspendieren. Dann wurde die Anzahl der Zellen mit einem Hämocytometer unter einem
Mikroskop gemessen (die Anzahl der nicht-haftenden Zellen).
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Als Vergleich wurden nur Krebszellen kultiviert, die gleichen Verfahren wie oben
erwähnt wurden durchgeführt, und die Anzahl der Zellen (die Anzahl der Zellen im
Vergleich) wurde gemessen.
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Die Haftungsrate (%) der Krebszellen wurde nach der folgenden Berechnungsformel
berechnet. Die Ergebnisse werden in Fig. 1 gezeigt, in der die mittleren Haftungsraten bei
verschiedenen Konzentrationen von Sialsäure usw. über vier Näpfe angeführt sind.
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Haftungsrate =
[1 - (Anzahl der nicht-haftenden Zellen)/(Anzahl der Zellen im Vergleich)] · 100
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Wie in Beispiel 1 gezeigt hemmten 10 ug/ml- und 100 ug/ml-Konzentrationen der
Sialsäure das Anhaften der Krebszellen an den Mesenterium-Zellen um 27% bzw. 31%.
Beispiel 2
Wirkung der Hemmung der Haftung von Krebszellen mit Sialsäure usw. bei
gleichzeitiger Gegenwart von Anti-LFA-1-Antikörper
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Beispiel 2 wurde genau auf die gleiche Art wie Beispiel 1 untersucht, mit der
Ausnahme, dass Sialsäure in einer Konzentration von 0 oder 100 ug/ml gleichzeitig mit 10 ug/-
ml Anti-LFA-1-Antikörper bei der Kultivierung vorlag, um die M-Zellen mit dem AH66F-
Zellen zu kontaktieren.
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Die Ergebnisse werden in Fig. 2 gezeigt.
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Bei gleichzeitigem Vorliegen von Ratten-Anti-LFA-1-Antikörper (Antikörper gegen
β-Ketten von Leukozytenfunktion-assoziiertem Antigen), von dem allgemein bekannt ist, dass
es die Haftungswirkung der Krebszellen hemmt, zeigte kein Zusatz von Sialsäure 40%
Hemmung, während die Zugabe von 100 ug/ml 7% Haftungshemmung ergab. Das
zeigt, dass sich der Haftungshemmungsmechanismus von Sialsäure auf die Krebszellen
von jenem des Anti-LFA-1-Antikörpers unterscheidet und dass von beiden Substanzen
eine synergistische Wirkung erzielt wird.
Beispiel 3
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In den Modelltests wurde gezeigt, dass Sialsäure die Wirkung hat, die Haftung der
Krebszellen zu hemmen. Demgemäß wurden die Wirkungen von Sialsäure und einem
Polymer davon auf Ratten, die an Krebs mit Metastasenbildung litten (AH66F)
untersucht.
Lebensverlängernde Wirkung von Sialsäure usw. auf an Krebs leidende Ratten
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AH66F-Krebszellen (1 · 10&sup6; Zellen) wurden jeweils peritoneal an männliche Donryu-
Ratten (Alter: 6 Wochen, 100 bis 120 g, 6 Ratten pro Gruppe) verabreicht. Unmittelbar
danach wurde ein Sialsäurelösung (Dosierung: 100 mg/kg und 10 mg/kg) oder
physiologische Salzlösung peritoneal in einer Dosis von 0,5 ml (Vergleichsgruppe) verabreicht.
Dann, nachdem Sialsäure oder physiologische Salzlösung über 2 Tage peritoneal
verabreicht worden war, wurden die Überlebensdaten der Ratten beobachtet.
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Die prozentuelle Lebensverlängerung wurde nach der folgenden Formel berechnet. Die
Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt.
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Prozentuelle Lebensverlängerung = [(Überlebensdaten der behandelten Gruppe) -
(Überlebensdaten der Vergleichsgruppe)/(Überlebensdaten der Vergleichsgruppe] · 100
Tabelle 1: Lebensverlängerungswirkung von Sialsäure
auf mit AH66F-Krebszellen behandelte Ratten
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Als Ergebnis wurde bestätigt, dass die Vergleichsgruppe, der keine Sialsäure usw.
verabreicht wurde, Überlebensdaten von 7,3 ± 0,3 aufwies, die Gruppe, der 10 mg/kg
Sialsäure verabreicht wurde, eine 1,6-mal so starke Lebensverlängerungswirkung zeigte als
erstere, und die Gruppe, der 100 mg/kg Sialsäure verabreicht wurde, eine 1,8-mal so
starke Lebensverlängerungswirkung zeigte.
Test der akuten Toxizität
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Es wurde die LD50 im Fall der intravenösen Verabreichung an Wister-Stamm-Ratten
(Männchen) bestimmt, wonach die Natriumsalze von Sialsäure und ihres Trimers (pH
7,0) beide eine LD50 von nicht weniger als 2.000 mg/kg aufwiesen.