DE69611524T2

DE69611524T2 - Alkalische cellulase und verfahren zu deren herstellung

Info

Publication number: DE69611524T2
Application number: DE69611524T
Authority: DE
Inventors: Pieter Van Solingen
Original assignee: Genencor International Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 1995-04-28
Filing date: 1996-04-26
Publication date: 2001-05-31
Anticipated expiration: 2016-04-27
Also published as: EP0828840A2; BR9608071A; CA2222141A1; DK0828840T3; ZA963347B; PT828840E; AR001731A1; CA2222141C; JPH11503902A; US6313081B1; CN1185179A; DE69611524D1; AU703309B2; US20040097393A9; EP0828840B1; KR100423670B1; JP3791622B2; GR3035573T3; US6767879B2; EP0739982A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

A. Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige Cellulase-Zusammensetzungen. Ferner betrifft die Erfindung neuartige Cellulase-Zusammensetzungen, die vorzugsweise von Bacillus sp. abgeleitet sind. Außerdem betrifft die Erfindung die Verwendung der neuartigen Cellulase in auf dem Gebiet bekannten Zusammensetzungen, die günstigerweise zugesetzte Cellulase aufweisen, z. B. als Additiv in einer Detergenszusammensetzung, bei der Behandlung von Cellulose-hältigen Textilien, bei der Behandlung von Pulpe und Papier und bei der Behandlung von Stärke zur Herstellung von Maissirup mit hohem Fructose-Gehalt oder Ethanol.

B. Stand der Technik

Cellulasen sind Enzyme, die zur Hydrolyse der 1,4-β-D-glucosidischen Bindungen in Cellulosen fähig sind. Cellulolytische Enzyme werden traditionellerweise in drei Hauptkategorien einteilt: Endoglucanasen, Exoglucanasen oder Cellobiohydrolasen und β- Glucosidasen (Knowles, J. et al., TIBTECH 5, 255-261 (1987)); es ist bekannt, dass sie von zahlreichen Bakterien, Hefen und Pilzen produziert werden.
Die EMBL-Datenbank-Zugriffsnummer Z33876.1 (Sanchez Torres et al.) offenbart einen Teil der Aminosäuresequenz einer Cellulase von Bacillusstamm N186-1.
Die primären Anwendungen zellulolytischer Enzyme sind jene, die den Abbau von (Holz-) Cellulosepulpe in Zucker für die (Bio-) Ethanol-Produktion, Textilbehandlungen wie etwa "Stone washing" und "Biopolieren" und Detergenszusammensetzungen umfassen. Es ist demnach bekannt, dass sich Cellulasen in Detergenszusammensetzungen zur Schmutzentfernung, d. h. zur Reinigung eignen. Die GB-A-2.075.028, 2.095.275 und 2.094.826 beispielsweise beschreiben eine verbesserte Reinigungsleistung, wenn Detergenzien Cellulase umfassen. Außerdem offenbart die GB-A-1.358.599 die Verwendung von Cellulase in Detergenzien zur Verringerung der Rauheit baumwollhältiger Textilien.
Ein weiteres nützliches Merkmal von Cellulasen bei der Behandlung von Textilien ist ihre Fähigkeit, abgenutzte Gewebe zu "erneuern", indem ihre Farben leuchtender gemacht werden. Beispielsweise führt wiederholtes Waschen baumwollhältiger Textilien zu einem Grauschleier der Textilie, der vermutlich auf aufgebrochene oder in Unordnung geratene Fibrillen infolge mechanischer Einwirkung (manchmal als "Pillen" bezeichnet) zurückzuführen ist. Dieser Grauschleier ist besonders auf färbigen Textilien auffällig. Daher ist die Fähigkeit von Cellulase, die ungeordnete Deckschicht des Gewebes zu entfernen und somit dessen Gesamtaussehen zu verbessern, von großer Bedeutung.
Trotz des auf dem Gebiet der Erfindung vorhandenen Wissens über zahlreiche Cellulase-Zusammensetzungen mit einigen oder allen der obigen Eigenschaften besteht nach wie vor die Notwendigkeit, neue Cellulasen mit einem breiten Spektrum an Charakteristika zu entwickeln, die sich beispielsweise zur Behandlung von Textilien, als Komponente von Detergenszusammensetzungen, bei der Behandlung von Pulpe und Papier und bei der Umwandlung von Biomasse eignen. Die Anmelder haben bestimmte Cellulasen entdeckt, die solche zusätzliche Eigenschaften aufweisen und sich für bekannte Anwendungen von Cellulase eignen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine neuartige Cellulase mit Eigenschaften bereitzustellen, die bei der Verwendung in Detergenzien, bei der Behandlung von Textilien und bei der Herstellung von Pulpe und Papier vorteilhaft sind.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine Cellulase aus Bacillus sp. CBS 670.93 erhalten oder abgeleitet werden. CBS 670.93 wurde im Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS), Baarn, Niederlande, unter der Zugriffsnummer CBS 670.93, am 23. Dezember 1993 ("CBS 670.93") hinterlegt. Die neuartige Cellulase umfasst eine Aminosäuresequenz gemäß Fig. 2 (Seq.-ID Nr. 2).
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, die DNA umfasst, die für eine Aminosäuresequenz gemäß Fig. 2 (Seq.-ID Nr. 2) kodiert.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Transformation eines geeigneten Mikroorganismus mit DNA, die für eine Aminosäuresequenz der Erfindung kodiert, bereitgestellt. Ferner wird ein mit erfindungsgemäßer DNA transformierter Mikroorganismus bereitgestellt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Cellulase eine Cellulase, die von Bacillus sp. CBS 670.93 abgeleitet ist und ein berechnetes Molekulargewicht von etwa 50 kD aufweist. Die Cellulase mit etwa 50 kD besitzt einen berechneten isoelektrischen Punkt von etwa 4 und ein pH-Wert-Qptimum im. Falle von CMC von etwa 6-10 bei 40ºC und von etwa 7 bei 60ºC.

KURZBESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN

Fig. 1 zeigt die pH-Profil-Aktivität einer Cellulase mit etwa 50 kD aus CBS 670.93 bei 40ºC und bei 60ºC.
Fig. 2 zeigt die DNA-Sequenz (Seq.-ID Nr. 1) und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2) für die 50 kD-Cellulase von CBS 670.93, wobei die Leader-Peptidsequenz unterstrichen ist, die nach Sekretion gespalten wird, um das reife Enzym zu ergeben.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Eine Cellulase kann von Bacillus 670.93 "erhalten" werden, wenn eine solche Cellulase eine Aminosäuresequenz besitzt, die der Aminosäuresequenz einer Cellulase entspricht, die aus diesem Organismus erhalten werden kann. Somit könnte man sagen, dass Cellulase mit einer identischen Aminosäuresequenz zur 50 kD-Cellulase der Erfindung, die von einem anderen Bacillus abgeleitet ist, von Bacillus 670.93 "erhalten werden kann".
"Wirtszelle" ist eine Zeile, welche die Fähigkeit besitzt, als Wirt und Expressionsvehikel für einen rekombinanten DNA-Vektor der Erfindung zu dienen. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung bezieht sich "Wirtszelle" auf Bacillus-Zellen.
"DNA-Konstrukt" oder "DNA-Vektor" ist eine Nukleotidsequenz, die eine oder mehrere DNA-Fragmente umfasst, die für beliebige der neuartigen, oben beschriebenen Cellulasen oder Cellulase-Derivate kodieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Cellulase vom Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, Niederlande, unter der Mikroorganismus-Hinterlegungsnummer CBC 670.93 (beschrieben in PCT/EP 94/04312), hinterlegt gemäß der Budapester Konvention vom 23. Dezember 1993, beziehbar. Die hinterlegte Spezies wird hierin als CBS 670.93 bezeichnet. In einer bevorzugteren Ausführungsform ist die Cellulase der Erfindung eine Cellulase mit etwa 50 kD (berechnet auf der Basis der Aminosäuresequenz des reifen Proteins), die von CBS 670.93 abgeleitet ist (hierin als "50 kD-Cellulase" bezeichnet). Die Cellulase mit etwa 50 10 besitzt einen berechneten pl für das reife Protein von etwa 4 und ein pH-Wert-Optimum im Falle von CMC von etwa 6-10 bei 40 ºC und von etwa 7 bei 60ºC.
Das Gen, das für die Aminosäuresequenz der Cellulase mit etwa 50 kD kodiert, wurde durch Vergleich mit den verfügbaren Sequenzdaten in verschiedenen Bibliotheken (GenBank, Swiss-Prot, EMBL und PIR) unter Anwendung von des CAOS/CAMM-Centers, Universität von Hijmengen, Niederlande, analysiert. Eine Suche in Datenbanken nach einem Vergleich der Cellulase, für welche die DNA-Sequenz der Erfindung kodiert, mit Cellulasen, für die veröffentlichte oder bekannte Cellulase-Gensequenzen kodieren, zeigt, dass das größte Ausmaß an Aminosäure-Identität bei der Cellulase CelA von Bacillus sp. N-4 (Fukumori et al.,). Bacter. 168, 479-485 (1986)) zu beobachten ist.
Es wurde unter Einsatz des TFastA-Proramms von Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 2444-2448 (1988), gezeigt, dass die Cellulase mit etwa 50 kD gegenüber der verwandtesten veröffentlichten Cellulase-Sequenz zu 89% sequenzidentisch und zu 92,5 0/ sequenzähnlich ist. Das TFastA-Datensuchprogramm ist im Handel im Sequence Analysis Software Package, Version 6.0 (Genetic Computer Group, Univ. Wisconsin Biotechnology Center, Madison, Wisconsin 53705, USA) erhältlich.
Die vorliegende Erfindung offenbart auch ein Verfahren zur Herstellung der Cellulase. In einer Ausführungsform kann die Cellulase durch Kultivieren eines geeigneten Organismus, z. B. Bacillus sp. CBS 670.93, unter zur Produktion von Cellulase günstigen Bedingungen erzeugt werden. Vorzugsweise sind solche Bedingungen jene, die allgemein zur Kultivierung von Bacillus vorgeschlagen wurden, um die Cellulase-Produktion zu maximieren und die Verwendung eines von Cellulose abgeleiteten Substrats als Energiequelle in Kombination mit notwendigen Salzen, Ionen und anderen bekannten Komponenten vorzusehen. Im Allgemeinen kann das Medium zum Kultivieren der Zellen jedes herkömmliche Medium sein, das sich zum Züchten von Bakterien eignet. Die Zellen können unter aeroben Bedingungen in einem Nährstoffmedium kultiviert werden, das assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff zusammen mit anderen essentiellen Nährstoffen enthält. Geeignete Kohlenstoffquellen sind Kohlenhydrate wie etwa Saccharose, Glucose und Stärke, oder kohlenhydrathältige Materialien wie etwa Getreide, Malz, Reis und Sorghum. Die Kohlenhydrat-Konzentration im Medium kann stark variieren, z. B. von 1-5% bis zu 25%, üblicherweise reicht sie jedoch von 8-10%, wobei die Prozentsätze als Glucose-Äquivalente berechnet sind. Die Stickstoffquelle im Nährstoffmedium kann anorganisch oder organisch sein. Geeignete anorganische Stickstoffquellen sind Nitrate und Ammoniumsalze. Unter den organischen Stickstoffquellen, die regelmäßig in Fermentationsprozessen verwendet werden, welche die Kultivierung von Bakterien umfassen, finden sich Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Erdnussmehl, Casein, Mais, Maisquellflüssigkeit, Hefeextrakt, Harnstoff und Albumin. Außerdem sollte das Nährstoffmedium auch die üblichen Spurensubstanzen enthalten.
Die Cellulase kann durch konventionelle Verfahren aus dem Medium gewonnen werden, z. B. Abtrennen der Zellen vom Medium durch Zentrifugation oder Filtration, gegebenenfalls nach Zerstörung der Zellen, Fällen der proteinhältigen Komponenten des Überstands oder Filtrats mittels eines Salzes, z. B. Ammoniumsulfat, gefolgt von der Reinigung durch eine Vielzahl chromatographischer Vorgangsweisen, z. B. Ionenaustausch- Chromatographie, Affinifätschromatographie oder ähnliche auf dem Gebiet bekannte Verfahren. Beid er Produktion der alkalischen Cellulase der Erfindung ist es vorzuziehen, die Kultivierung unter alkalischen Bedingungen unter Verwendung von Medien durchzuführen, die eine Energiequelle auf Cellulose-Basis-enthalten.
Vorzugsweise wird die erfindungsgemäße Cellulase unter Anwendung gentechnischer Verfahren erzeugt, indem eine geeignete Wirtszelle mit einem für die Cellulase kodierenden Gen transformiert und unter Bedingungen exprimiert wird, welche die Wirtszellvermehrung und die Cellulase-Expression begünstigen. Als erster Schritt kann die chromosomale DNA aus dem Donor-Bakterienstamm gemäß dem Verfahren von Saito und Miura (Saito & Miura, Biochim. Biophys. Acta. 72, 619 (1963)) oder gemäß einem ähnlichen Verfahren erhalten werden. Restriktionsenzym-Spaltung der so erhaltenen chromosomalen DNA liefert DNA-Fragmente, die das alkalische Cellulase-Gen enthalten. Zu diesem Zweck kann jedes Restriktionsenzym verwendet werden, sofern es nicht die Region des Gens spaltet. Als Alternative kann ein Restriktionsenzym verwendet werden, welches das Gen spaltet, wobei jedoch eine reduzierte Enzymkonzentration oder Inkubationszeit eingesetzt werden, um nur eine Teilspaltung zu ermöglichen. Eine bevorzugte Restriktions-Endonuclease ist Sau3A. Aus dem resultierenden Spaltungsgemisch können geeignete Fragmente (2-6 kb) isoliert und dazu verwendet werden, eine geeignete Wirtszelle mit einem DNA-Konstrukt zu transformieren, z. B. mit einem DNA-Konstrukt, welches das DNA-Fragment mit etwa 1,9 kb enthält, das für die SO kD-Cellulase der Erfindung kodiert, die in eine geeignete Vektorsequenz ligiert wurde. Das Ligationsgemisch wird dann in einen geeigneten Wirt transformiert.
Das für die erfindungsgemäße Cellulase kodierende Gen kann mittels λ-Phagen- (Expressions-) Vektoren und E. coli-Wirtszellen kloniert werden. (Alternativ dazu kann PCR- Klonierung unter Einsatz von auf konservierten Domänen konstruierten Konsensprimern angewandt werden.) Die Anmelder haben entdeckt, dass die Transformation des für die Cellulase der Erfindung kodierenden Gens und die Expression in E. coli zu einem aktiven Protein führen. Nach einem ersten Klonierungsschritt in E. coli kann ein erfindungsgemäßes Cellulase-Gen auf einen bevorzugteren industriellen Expressionswirt wie etwa Bacillus oder Streptomyces-Spezies, einen Fadenpilz wie etwa Aspergillus oder Trichoderma oder eine Hefe wie z. B. Saccharomyces übertragen werden. Hochgradige Expression und Sekretion, die in diesen Wirten möglich sind, ermöglichen die Akkumulierung der Cellulase im Fermentationsmedium, aus dem sie anschließend gewonnen werden kann.
Vorzugsweise umfasst die Expressionswirtszelle Bacillus sp., noch bevorzugter Bacillus licheniformis oder Bacillus subtilis. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird der Transformationswirt für Protease-Gene deletiert, um sicherzustellen, dass das Cellulase-Produkt keiner Proteolyse in der Fermentationsbrühe oder Konzentraten davon unterliegt. Eine bevorzugte allgemeine Transformations- und Expressions-Arbeitsvorschrift wird von Ferrari et al. in der US-A-5.264.366 dargelegt. Vorzugsweise erfolgt die Fermentation des transformierten Bacillus-Wirts bei einem pH-Wert von etwa 6,9. Transformation und Expression in Aspergillus werden z. B. von Berka et al. in der US-A- 5.364.770 beschrieben. Ein bevorzugter Promotor ist der aprE-Promotor, wenn die Transformationswirtszelle Bacillus ist.
Die erfindungsgemäße Cellulase mit etwa 50 kD von CBS 670.93 eignet sich - wie gezeigt wurde - in Puffersystemen, die Glycin, Ammoniumacetat, Borax und/oder Tris umfassen. Diese Cellulase wird auch durch die Gegenwart von Magnesium auf CMC aktiviert und durch die Gegenwart von Calcium gehemmt. Ein Calcium-Magnesium-Verhältnis von etwa 750 : 250 ppm stellte sich als aktivitätsfördernd heraus.
Gemäß vorliegender Erfindung können die oben beschriebenen Cellulase-Zusammen- Setzungen auch in Detergenszusammensetzungen nach auf dem Gebiet bekannten Verfahren zur Verwendung von Cellulasen in Detergenzien eingesetzt werden. Die hervorragende Aktivität der erfindungsgemäßen Cellulase bei alkalischem pH-Wert sollte dazu führen, dass sie sich besonders für Detergenzien mit hohem pH-Wert eignet.
Es folgt eine ausführliche Beschreibung der Erfindung anhand von Beispielen, die lediglich veranschaulichen und die Erfindung keinesfalls einschränken sollen.

BEISPIEL 1

Screenen und Isolieren von Cellulase aus alkalischen Boden- und Wasserproben

Zur Isolierung von Ceflulase-produzierenden Mikroorganismen aus alkalischen Boden- und Wasserproben wurden zwei Verfahren angewandt. In einem Verfahren wurden die Boden- und Wasserproben in 0,85%-iger Kochsalzlösung suspendiert und direkt im Carboxymethylcellulose- (CMC-) Agardiffusionsassay verwendet, um Cellulase-produzierende Kolonien zu detektieren. In einem zweiten Verfahren wurden die Boden- und Wasserproben durch Inkubation in einem Cellulase-hältigen flüssigen Minimalmedium oder GAM-Medium 1 bis 3 Tage lang bei 40ºC an Cellulase-hältigen Stämmen angereichert. Kulturen, die bakterielles Wachstum zeigten, wurden mittels des CMC-Agardiffusionsassays hinsichtlich Cellulase-Aktivität analysiert, um Cellulase-produzierende Kolonien zu detektieren. Der CMC-Agardiffusionsassay und das Anreicherungsverfahren verwendeten ein Minimalmedium-Präparat bei einem pH-Wert von etwa 9,7, umfassend 1% KNO&sub3;, 0,1% Hefeextrakt (Difco), 0,1% KH&sub2;PO&sub4;, 0,02% MgSO&sub4;·7H&sub2;O, 1% Na&sub2;CO&sub3;, 4% NaCl und 0,25% CMC (Sigma C-488888). Zur Verfestigung wurde 1,5% Agar zugesetzt.
Eines von zwei Verfahren wurde für den CMC-Agardiffusionsassay angewandt, wobei die Auswahl davon abhing, ob Kolonien oder flüssige Fraktionen untersucht wurden. Beim Testen von Kolonien wurden Zeilsuspensionen in 0,850/-iger Kochsalzlösung auf CMC-hältigem Minimalmedium plattiert. Nach 1 bis 3 Tage dauernder Inkubation bei 40ºC wurden die Platten mehrfachplattiert und die Stammplatte mit 0,1% Kongorot 15 Minuten lang geflutet. Die Platten wurden 30 Minuten lang mit 1 M NaCl entfärbt. Die Stämme, die eine Clearingzone rund um die Kolonie aufwiesen, wurden als potenzielle Cellulase-produzierende Mikroorganismen isoliert. Flüssige Fraktionen wurden durch Einpipettieren von 40 ul-Aliquoten von Enzymlösung oder Fermentationsbrühe in Näpfe untersucht, die aus einer Schicht von 5 mm Minimalmedium in einer Petrischale ausgestanzt waren. Nach 16-stündiger Inkubation bei 40ºC wurde Cellulase-Aktivität durch Kongorot/NaCl-Behandlung detektiert. Der Durchmesser der Clearingzone ist ein Maß für die CMCase-Aktivität.
Stämme, bei denen Clearingzonen unter Anwendung eines der beiden Screeningverfahren identifiziert wurden, wurden zur Kultivierung und Isolierung von Cellulase ausgewählt. Die Kolonien wurden in 25 ml GAM-Medium in 10 ml-Schüttelflaschen in einem Inkubatorschüttler (New Brunswick Scientific, Edison, NJ, USA) bei 250 U/min und 40 ºC 72 Stunden Lang fermentiert. CMCase-Aktivität wurde in der Kulturlösung bei pH 9 und 40ºC bestimmt, um die Gegenwart von Cellulase in der Fermentationslösung zu verifizieren. Das zur Enzymproduktion verwendete komplexe Medium (GAM) bestand aus 0,5% Pepton (Difco), 0,5% Hefeextrakt (Difco), 1% Glucose H&sub2;O, 0,1% KH&sub2;PO&sub4;, 0,02% MgSO&sub4;·7H&sub2;O, 1% Na&sub2;CO&sub3;, 4% NaCl. Der pH-Wert wurde mit 4 M HCl auf 9,5 eingestellt und danach 1% CMC zugegeben.
Unter Anwendung des oben beschriebenen Verfahrens wurde ein Cellulase-produzierender Mikroorganismus isoliert, der als kleine, langgestreckte Stäbchen, die gelegentlich paarweise auftreten und beweglich sind, näher charakterisiert wurde. Die terminalen bis subterminalen Sporen waren ellipsenförmig und wiesen ein klar quellendes Sporangium auf. Kolonien auf GAM-Agar waren cremig weiß und matt (d. h. nicht glänzend) und wiesen eine unregelmäßige Oberfläche mit filamentösem Rand auf. Auf der Basis der 16S rmA-Sequenzanalyse wurde der Mikroorganismus als Spezies der Gattung Bacillus klassifiziert. Der hierin als CBS 670.93 bezeichnete Organismus ist im Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baam, Niederlande, unter dieser Zugriffsnummer hinterlegt.

BEISPIEL 2

Isolierung von DNA, Transformation und Expression von Cellulase

Der alkaliphile Bacilli-Stamm C8S 670.93 wurde als Donorstamm zur Expressionsklonierung von E. coli ausgewählt. Chromosomale DNA wurde nach dem Verfahren von Saito & Miura, Biochim. Biophys. Acta 72, 619-629 (1963), isoliert.
Die isolierte chromosomale DNA wurde mit dem Restriktionsenzym Sau3A mittels reihenverdünnter Enzymlösungen 1 Stunde lang bei 37ºC unter Einsatz von React-Puffern (Gibco BRL Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA) unter den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen partiell gespalten. Die gespaltene DNA wurde durch Agarosegel-Elektrophorese fraktioniert, und geeignete Fraktionen (2-6 kb) wurden mittels des QlAquick Gel Extraction-Sets gemäß der vom Hersteller (QIAGEN Inc. Chatsworth, CA, USA) beschriebenen Arbeitsvorschrift isoliert.
Die Sau3A-Fragmente chromosomaler DNA dienten dazu, genomische Genbanken in einem mit BamH1 gespaltenen CIAP behandelten ZAP-Express-Vektor gemäß der vom Hersteller (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, USA) beschriebenen Arbeitsvorschrift zu konstruieren. pBK-CMV-Phagmide, welche die klonierten DNA-Inserts enthalten, wurden aus dem ZAP-Express -Vektor geschnitten und in E. coli-Stamm XLOLR transformiert.
Rekombinante Klone wurden durch Agardiffusion gemäß dem Verfahren von Wood et al., Meth. Enzym. 160, 59-74 (1988), gescreent. Stämme, die um die Kolonien Clearingzonen aufwiesen, wurden isoliert. Die CMCase-Aktivität der isolierten Rekombinanten wurde nach 48-stündiger Fermentation in 4·YEP-Medium, bestehend aus 4% Hefeextrakt (Difco), 8% Pepton (Difco), 0,2% Lactose, 100 ug/ml Ampicillin, bestimmt. Das rekombinante Protein wurde gereinigt (Beispiel 3) und die Aminosäuresequenz bestimmt (Seq.-ID Nr. 2).
Plasmid-DNA der Cellulase-produzierenden Rekombinante wurde unter Einsatz des QIApep Plasmid-Sets gemäß der vom Hersteller (QIAGEN Inc.) beschriebenen Arbeitsvorschrift isoliert. Das Plasmid enthielt ein Insert chromosomaler DNA mit etwa 1,9 kb. Die Nukleotidsequenz eines Fragments mit 1.933 bp wurde unter Verwendung einer Gruppe degenerierter Oligonukleotide aus der N-terminalen Aminosäuresequenz als Primer bestimmt, um das Gen auf dem 1,9 kb-Insert zu lokalisieren. Das Fragment mit 1.933 bp enthielt einen offenen Leserahmen aus 1.422 bp, aus dem ein Protein aus 467 Aminosäuren einschließlich einer 26 Aminosäuren umfassenden Leadersequenz abgeleitet werden kann. Die Nukleotidsequenz des Gens (Seq.-ID Nr. 1), das für die Cellulase kodiert, und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2) der isolierten einzelnen Cellulase können dann bestimmt werden und sind in Fig. 2 dargestellt.

BEISPIEL 3

Reinigung von Cellulase

Die Cellulase-produzierenden Klone aus Beispiel 2 wurden auf einem komplexen Medium (4·YEP), bestehend aus 4% Hefeextrakt (Difco), 8% Pepton (Difco), 0,2% Lactose, 100 ug/ml Ampicillin, gezüchtet. Die Fermentationsbrühe wurde durch Zentrifugation (8.000 U/min) von der Kulturflüssigkeit getrennt. Die Cellulase im Überstand wurde mit Ammoniumsulfat (65% Sättigung) gefällt. Der Niederschlag wurde in 25 mM Phosphatpuffer, pH 7, mit 5 mM EDTA gelöst, bis eine Leitfähigkeit von 7 mS/cm erreicht wurde. Diese Lösung wurde auf eine Q-Sepharose FF-Anionenaustauschsäule (Durchmesser 5 cm, Länge 10 cm) aufgebracht und die Säule danach mit 25 mM Phosphatpuffer, pH 7,5 mM EDTA gewaschen, bis ein Absorptionsvermögen von 0,2 AU erreicht wurde. Ein Gradient von 0 → 0,5 M NaCl in 25 mM Phosphat, pH 7, wurde 80 Minuten lang durch die Säule geleitet, gefolgt von einem Gradienten von 0,5 → 1 M NaCl über 10 Minuten. Die Elution erfolgte im ersten Gradienten. Nach der Elution wurde die Säule (Upflow) mit 1 M NaOH gereinigt und erneut mit 25 mM Phosphat, pH 7,5 mM EDTA äquilibriert. Je nach Elutionsprofil wies die erhaltene Cellulase eine Reinheit von bis zu 80% auf.

BEISPIEL 4

Eigenschaften der erfindungsgemäßen Cellulase

Um das pH/Temperatur-Profil der erfindungsgemäßen Cellulase mit etwa 50 kD zu bestimmen, wurde die Cellulase-Aktivität im Falle von CMC bei verschiedenen pH- und Temperaturwerten gemessen. Eine Lösung, die Cellulase mi·t etwa 50 kD umfasste, wurde in einem mit 10 mM Phosphatpuffer (pH 7) verdünnten Puffer kombiniert. (Der pH- Wert wurde unter Verwendung von Puffer gesteuert, der ein Gemisch aus 100 ml 1 M Phosphorsäure, 100 ml Citronensäure und 600 ml destilliertem Wasser umfasste, wobei sein pH-Wert mittels 4 M NaOH auf 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 eingestellt wurde; danach wurde das Gemisch mit destilliertem Wasser auf 1 l aufgefüllt). Die Enzymlösung wurde verdünnt, bis 0,05 U/ml bei pH 7 und 40ºC erreicht wurden. Jedes Puffersystem wurde untersucht, um den tatsächlichen pH-Wert nach dem Mischen von 0,5 ml Puffer, 0,5 ml Substrat (1% CMC) und 0,1 ml 10 mM Phosphatpuffer zu ermitteln. Der tatsächliche pH-Wert für die Lösungen mit pH 4, 5, 6, 7, 8, 9 und 10 betrug 5,2, 6,2, 7,8, 8,7 bzw. 9,9.
Die Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt, aus der die hervorragende alkalische Aktivität der Cellulase ersichtlich ist. Der Anstieg der Eichkurve hängt vom pH-Wert des Enzymsubstratgemisches ab, weshalb zwei Glucose-Standards bei jedem pH-Wert herangezogen werden (500 mg Glucose·H&sub2;)/100 ml 10- und 25fach verdünnt.
Cellulase-Aktivität kann wie folgt unter Anwendung eines modifizierten PAHBAH-Verfahrens untersucht werden (M. Lever, Anal. Biochem. 47, 273-279 (1972), und M. Lever, Anal. Biochem. 81, 21-27 (1977)). Die pH/Temperatur-Profile können unter Verwendung einer fixen Enzymkonzentration, die in den linearen Bereich des bei pH 7 und 40ºC gemessenen Dosis-Response-Profils passt, ermittelt werden. Die Enzymkonzentration kann für die Messung der Aktivitäten unter allen anderen bestimmten Zuständen herangezogen werden. Ein Reagenzglas wird mit 250 ul 2,5% CrMC in 50 mM Glycinpuffer, pH 9 (CMC niedriger Viskosität bei Sigma erhältlich) und 250 ul-Aliquoten der 50 kD-Cellulase, verdünnt im geeigneten Puffer, gefüllt. Das Reagenzglas wird 30 Minuten lang bei 40ºC in einem Wasserbad inkubiert; anschließend werden 1,5 ml einer täglich frisch zubereiteten PAHBAH-Lösung (1% PAHBAH in 100 ml 0,5 M NaOH mit 100 ml Wismutlösung; enthält 48,5 g Wismutnitrat, 28,2 g Kaliumnatriumtartrat und 12,0 g NaOH in 100 ml) zugegeben. Das Gemisch wird 10 Minunten lang auf 70ºC erhitzt und anschließend 2 Minuten lang auf Eis gekühlt. Die Absorption wird bei 410 nm gemessen. Um Mintergrund-Absorption der Enzymproben auszuschalten, wurde ein Vergleichstest wie folgt durchgeführt: ein Röhrchen mit Substrat wird unter den gleichen Bedingungen wie das Reagenzglas inkubiert. Nach der Inkubation werden 1,5 ml PAH- BAH und das Enzympräparat in dieser Reihenfolge zugegeben. Eine Einheit (U) ist als Enzymmenge definiert, die 1 uMol Glucose aus CMC-Äquivalent produziert, bestimmt als reduzierende Zucker pro Minute pro Gramm Produkt.

SEQUENZAUFLISTUNG

(1) ALLGEMEINE INFORMATIONEN:
(i) ANMELDER:
(A) NAME: Gist-brocades
(B) STRASSE: Wateringseweg 1
(C) STADT: Delft
(E) LAND: Niederlande
(F) POSTLEITZAHL: 2611 XT
(iii) TITEL DER ERFINDUNG: Neuartige Cellulase und ihre Anwendungen
(iii) ANZAHL AN SEQUENZEN: 2
(iv) COMPUTERLESBARE FORM:
(A) MEDIUMTYP: Diskette
(8) COMPUTER: IBM PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentln Release #1,0, Version #1,25 (EPO)
(2) INFORMATIONEN ZU SEQ.-ID Nr. 1:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 1.404 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGEIGENSCHAFT: doppelt
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iii) ANTI-SENSE: NEIN
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE:
(A) ORGANISMUS: Bacillus sp.
(C) INDIVIDUELLES ISOLAT: CBS 670.93
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: sig_peptid
(B) STANDORT: 1..78
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: mat_peptid
(B) STAN DORT: 79..1404
(D) ANDERE INFORMATIONEN: /Funktion = "Endoglucanase"
/EC_Nummer: 3.2.1.4
/Produkt = "BCE103 Cellulase"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) STANDORT: 1..1404 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 1:
(2) INFORMATIONEN ZU SEQ.-ID Nr. 2:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 467 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 2:

Claims

1. Zusammensetzung, umfassend eine Cellulase, die eine Aminosäuresequenz wie in Seq.-ID Nr. 2 dargelegt umfasst.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin die Cellulase aus Bacillus sp. CBS 670.93 erhalten wird.

3. Zusammensetzung, umfassend DNA, die für die Cellulase nach Anspruch 1 kodiert.

4. Expressionsvektor, umfassend die DNA nach Anspruch 3.

5. Mit der DNA nach Anspruch 3 transformierte Wirtszelle.

6. Verfahren zum Exprimieren einer Cellulase, wobei das Verfahren umfasst:

(a) das Transformieren eines geeigneten Mikroorganismus mit DNA, die für eine Cellulase nach Anspruch 1 oder 2 kodiert;

(b) das Herstellen einer Fermentationsbrühe, die den geeigneten Mikroorganismus enthält, unter Bedingungen, die für die Expression der DNA geeignet sind;

(c) das Halten der Fermentationsbrühe für eine Zeit und unter Bedingungen, um die Expression einer gewünschten Menge der Cellulase zu ermöglichen; und

(d) das Sammeln der die Cellulase enthaltenden Fermentationsbrühe.

7. Detergenszusammensetzung, umfassend die Cellulase nach Anspruch 1 oder 2.

8. Verfahren zur Behandlung von Textilien, welches das Kontaktieren der Textilien mit der Cellulase nach Anspruch 1 oder 2 umfasst.

9. Verfahren zur Behandlung von Pulpe auf Cellulosebasis, welches das Kontaktieren der Pulpe auf Cellulosebasis mit der Cellulase nach Anspruch 1 oder 2 umfasst.