DE3787866T2

DE3787866T2 - Alkalische Cellulasen und Mikroorganismen zu deren Herstellung.

Info

Publication number: DE3787866T2
Application number: DE3787866T
Authority: DE
Inventors: Shigeo Inoue; Susumu Ito; Kenzo Koike; Kikuhiko Okamoto; Yuichi Ota; Katsuya Ozaki; Tomokazu Sato; Shitsuw Shikata; Akira Takei
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 1986-10-28
Filing date: 1987-10-21
Publication date: 1994-05-19
Anticipated expiration: 2007-10-22
Also published as: US4945053A; DK561687A; MY102251A; DK561687D0; EP0265832A3; HK100194A; DE3787866D1; ES2060590T3; EP0265832A2; EP0265832B1

Description

Hintergrund der Erfindung

1) Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft eine neue Cellulase, eine aus der Cellulase isolierte CMCase und einen Mikroorganismus, der in der Lage ist, die Cellulase zu erzeugen.

2) Beschreibung des Standes der Technik

Cellulasen bestehen aus einem komplizierten enzymatischen System, das als Katalysator für eine enzymatische Umsetzung dient, bei der Cellulose und ähnliche Polysaccharide in Glucose, Cellobiose oder Cellooligosaccharide gespalten werden. Cellulasen werden als allgemeiner Begriff für Enzyme angesehen, die in Abhängigkeit von- ihrem Wirkungsmechanismus C&sub1;-Enzym, Cx-Enzym und β-Glucosidase oder exo-β-Glucanase, endo-β-Glucanase, Cellobiase und dergleichen genannt werden. Lange Zeit wurden Cellulasen überwiegend für den Zweck der wirksamen Ausnutzung von Biomasseressourcen untersucht. Zum Beispiel ist die Cellulaseherkunft hauptsächlich auf Pilze angewiesen, die zur Gattung Trichoderma, Asparaqillus, Acremonium und Humicola gehören. Die von Mikroorganismen, einschließlich Pilzen, abgeleiteten Cellulasen beinhalten jedoch eine Vielzahl von Wirkungsspezifitäten und physikochemischen Eigenschaften der sie ausmachenden Enzymgruppen, die bislang noch nicht vollständig aufgeklärt wurden.
Von diesen Cellulasen werden jene Cellulasen, die eine hohe Wirkung auf Carboxymethylcellulose (CMC) oder eine Cx-enzymatische Wirkung aufweisen, allgemein CMCasen genannt. In den letzten Jahren wurden neue industrielle Verwendungen der Cellulasen, einschließlich CMCasen, entwickelt, teilweise als Additiv zur Verwendung in Textilwaschmitteln. Sofern die Cellulasen jedoch von Mikroorganismen im natürlichen Bereich erzeugt wurden, insbesondere in Hinblick auf die vorstehend genannten Cellulasen, die von Mikroorganismen herrühren, sind sie in den meisten Fällen so instabil, daß sie ihre Aktivität im alkalischen pH-Bereich verlieren und sind sogenannte saure oder neutrale Cellulasen (deren optimaler Arbeits-pH im Bereich von 4 bis 6 liegt). Sogenannte alkalische Cellulasen, die den Erfordernissen eines Textilwaschmittels genügen, d. h. die eine maximale Aktivität und Beständigkeit im alkalischen Bereich aufweisen, sind rar.
Bezüglich alkalischer Cellulasen, die in Textilwaschmitteln verwendbar sind, sind zum Beispiel nur einige Verfahren zur Herstellung von alkalischen Cellulasen bekannt, die von alkalophilen Mikroorganismen herrühren. Diese Verfahren schließen ein Verfahren ein, bei dem Mikroorganismen gezüchtet werden, die zur Gattung Bacillus gehören, und bei dem die Cellulase A aus dem Medium gewonnen wird (Japanische Patentveröffentlichung Nr. 50-28515), ein Verfahren, bei dem alkalophile Bakterien gezüchtet werden, die zur Gattung Cellulomonas gehören, zur Herstellung von alkalischer Cellulase 301-A (Japanische Patentanmeldung Offenlegungsschrift Nr. 58- 224686), ein Verfahren zur Herstellung von CMCase durch Züchtung eines alkalophilen Bacillus Nr. 1139 (Horikoshi et al., J. Gen. Microbiol., Bd. 131, Seite 3339 (1985)) und ein Verfahren zur Herstellung einer alkalischen Cellulase unter Verwendung eines Stammes, zugehörig zur Gattung Streptomyces (Japanische Patentanmeldung Offenlegungsschrift Nr. 61- 19483).
Es gibt daher einen Bedarf für eine alkalische Cellulase, die einen optimalen pH-Wert und eine Eignung als Enzym für Textilwaschmittel im alkalischen Bereich aufweist.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Autoren der vorliegenden Erfindung führten Untersuchungen durch, um in natürlicher Umgebung Mikroorganismen zu finden, die alkalische Cellulasen erzeugen, und fanden einen Mikroorganismus, der aus einer Bodenprobe von Haga-gun Tochigi-ken, Japan gewonnen wurde und zur Gattung Bacillus gehört (Stamm KSM-635, hinterlegt als FERM BP-1485), der in der Lage war, eine neue alkalische Cellulase K zu erzeugen, die als Additiv für Textilwaschmittel wirksam ist. Darüber hinaus wurde auch gefunden, daß wenn die alkalische Cellulase weiter gereinigt wurde, neue CMCasen I und II als Hauptkomponenten erhalten wurden.
Die Erfindung stellt daher ein neues alkalisches Cellulase K-Enzym bereit, definiert gemäß Anspruch 1, mit einem optimalen pH-Wert im alkalischen Bereich.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung neuer CMCase I- und II-Enzyme, definiert gemäß Anspruch 3 und 4.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Mikroorganismus, der in der Lage ist, diese neuen Enzyme zu erzeugen und ein Verfahren zur Herstellung alkalischer Cellulase K durch Züchten des Mikroorganismus und Gewinnen der erhaltenen alkalischen Cellulase K aus dem Kulturprodukt.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt eine Kurve des Züchtungstemperaturbereichs von Bacillus sp KSM-635 (FERM BP-1485);
Fig. 2 zeigt eine Kurve mit dem Züchtungs-pH-Bereich;
Fig. 3 zeigt eine Kurve mit dem Arbeits-pH-Bereich von CMCase und alkalischer Cellulase K;
Fig. 4 zeigt eine Kurve der pH-Stabilität;
Fig. 5 zeigt eine Kurve mit dem Arbeits-pH-Bereich von CMCase der alkalischen Cellulase K;
Fig. 6 zeigt eine Kurve der thermischen Stabilität;
Fig. 7 zeigt eine Kurve der Beziehung zwischen eluierter Fraktion und Aktivität bei der Gelchromatografie;
Fig. 8 zeigt eine Kurve der Beziehung zwischen dem pH-Wert, bei dem CMCase I reagiert und der relativen Aktivität;
Fig. 9 zeigt eine Kurve der Beziehung zwischen dem pH-Wert, bei dem CMCase I behandelt wird und der Restaktivität;
Fig. 10 zeigt eine Kurve der Beziehung zwischen der Reaktionstemperatur (pH 9,0) von CMCase I und der relativen Aktivität;
Fig. 11 zeigt eine Kurve der Beziehung zwischen der Behandlungstemperatur von CMCase I (pH 9,0) und der Restaktivität;
Fig. 12 ist ein UV-Absorptionsspektrum von CMCase I der Erfindung;
Fig. 13 ist eine Kurve, die die Beziehung zwischen dem Reaktions-pH-Wert und CMCase II und der relativen Aktivität zeigt;
Fig. 14 ist eine Kurve, die die Beziehung zwischen dem Behandlungs-pH-Wert von CMCase II und der Restaktivität zeigt;
Fig. 15 ist eine Kurve, die die Beziehung zwischen der Reaktionstemperatur von CMCase II (pH 9,0) und der relativen Aktivität zeigt;
Fig. 16 ist eine Kurve, die die Beziehung zwischen der Behandlungstemperatur für CMCase II (pH 9,0) und der Restaktivität zeigt;
Fig. 17 ist ein UV-Absorptionsspektrum von CMCase II; und
Fig. 18 ist eine Ansicht, die die Ergebnisse der Natriumdodecylsulfatelektrophorese von CMCase I und II der Erfindung zeigt.

Beschreibung der Erfindung im einzelnen und bevorzugte Ausführungsformen

Die Mikroorganismen, die zur Erzeugung der neuen Enzyme gemäß der Erfindung verwendet werden, haben die nachstehenden mykologischen Eigenschaften. Die zur Klassifizierung der Stämme verwendeten Medien sind jene Medien 1 bis 24 und diese enthalten eine geeignete Menge einer sterilisierten 1,0 gew.-%-igen Natriumcarbonat (Na&sub2;CO&sub3;)-Lösung, sofern nicht anders ausgewiesen.
Zusammensetzungen der Testmedien für die Klassifizierung (Gew.-%):
Medium 1: Bacto pepton 0,5; Fleischextrakt 0,3; Bacto Agar-Agar 1,5
Medium 2: Bacto pepton 0,5; Fleischextrakt 0,3
Medium 3: Bacto pepton 0,5; Fleischextrakt 0,3; NaCl 7,0
Medium 4:- Bacto pepton 0,5; Fleischextrakt 0,3; Bacto Gelatine 20,0
Medium 5: Bacto Lackmusmilch 10,5
Medium 6: Bacto pepton 0,5; Fleischextrakt 0,3; KNO&sub3; 0,1
Medium 7: Bacto pepton 0,7; Glucose 0,5; NaCl 0,5
Medium 8: Bacto pepton 3,0; Fleischextrakt 0,3; Natriumthiosulfat 0,005; Cysteinhydrochlorid 0,02; Eisenammoniumcitrat 0,05; Bacto Agar-Agar 0,5
Medium 9: Bacto pepton 1,5; Fleischextrakt 0,4; Lactose 1,0; Saccharose 1,0; Glucose 1,0; NaCl 0,5; Natriumthiosulfat 0,008; Natriumsulfit 0,04; Eisen(II)sulfat 0,02; Phenolrot 0,002; Bacto Agar-Agar 1,5
Medium 10: Bacto pepton 1,5; Hefeextrakt 0,5; lösliche Stärke 2,0; K&sub2;HPO&sub4; 0,1; Bacto Agar-Agar 1,5; MgSO&sub4;·7H&sub2;0 0,02
Medium 11: Ammoniumphosphat 0,1; KCl 0,02; Hefeextrakt 0,05; MgSO&sub4;·7H&sub2;0 0,02; Zucker 1,0 (getrennt sterilisiert durch Filtrieren)
Medium 12: Kaliummonohydrogenphosphat 0,1; Ammoniumdihydrogenphosphat 0,1; Natriumcitrat 0,2; MgSO&sub4;·7H&sub2;O 0,03; NaCl 0,5; Bromthymolblau 0,0024; Bacto Agar- Agar 1,5
Medium 13: Hefeextrakt 0,05; Cysteinhydrochlorid 0,01; Natriumcitrat 0,3; NaCl 0,5; Natriumthiosulfat 0,008; Eisenammoniumcitrat 0,04; Glucose 0,02; Kaliumdihydrogenphosphat 0,15; Phenolrot 0,0012; Bacto Agar-Agar 1,5
Medium 14: Ammoniumphosphat 0,1; Kaliumdihydrogenphosphat 0,05; Natriumcitrat 0,2; Bacto Agar-Agar 1,5; MgSO&sub4;·7H&sub2;0 0,02
Medium 15: Hefeextrakt 0,05; Na&sub2;SO&sub4; 0,1; KH&sub2;PO&sub4; 0,1; Glucose 1,0; anorganische Stickstoffquellen in geeigneten Mengen *
* Natriumnitrat wurde in 0,25%, Natriumnitrit wurde in 0,2025%, Ammoniumchlorid wurde in 0,158% und Ammoniumphosphat wurde in 0,195% (jeweils entsprechend 0,0412 N-%) zugegeben.
Medium 16: Hefeextrakt 0,05; Na&sub2;SO&sub4; 0,1; KH&sub2;PO&sub4; 0,1; Glucose 1,0; anorganische Stickstoffquellen in geeigneten Mengen **; CaCl&sub2;·2H&sub2;O 0,05; MnSO&sub4;·4-6H&sub2;O 0,001;
FeSO&sub4;·7H&sub2;O 0,001 (getrennt sterilisiert durch Filtrieren); MgSO&sub4;·7H&sub2;O 0,02 (getrennt sterilisiert durch Filtrieren)
** Natriumnitrat wurde in einer Menge von 0,25%, Natriumnitrit wurde in einer Menge von 0,2025%, Ammoniumchlorid wurde in einer Menge von 0,158% und Ammoniumphosphat wurde in einer Menge von 0,195% (jeweils entsprechend 0,0412 N-%) zugegeben.
Medium 17: King A-Medium "Eiken" (erhältlich von Eiken Chem. Co., Ltd.), ausgewiesene Mengen
Medium 18: King B-Medium "Eiken" (erhältlich von Eiken Chem. Co., Ltd.), ausgewiesene Mengen
Medium 19: Kartoffel-Glucose Agar-Agar-Medium "Eiken" (erhältlich von Eiken Chem. Co., Ltd.), ausgewiesene Mengen
Medium 20: Bacto pepton 0,25; Salz 0,25; Hefeextrakt 0,25; Mannit 0,5; Bacto Agar-Agar 2,0
Medium 21: Harnstoffmedium "Eiken" (erhältlich von Eiken Chem. Co., Ltd.), ausgewiesene Mengen
Medium 22 Bacto pepton 0,1; NaCl 0,5; KH&sub2;PO&sub4; 0,2; Hefeextrakt 0,05; Glucose 0,1; Harnstoff 2,0; Phenolrot 0,001
Medium 23: Bacto pepton 0,5; Hefeextrakt 0,5; KH&sub2;PO&sub4; 0,1; Glucose 1,0; MgSO&sub4;·7H&sub2;O 0,02
Medium 24: Hefeextrakt 0,5; Glucose 1,0; Kasein (Hammerstein, Merc Inc.) 0,5; KH&sub2;PO&sub4; 0,1; MgSO&sub4;·7H&sub2;O 0,02; Bacto Agar-Agar 1,5 (Mykologische Eigenschaften)

1. Ergebnisse der mikroskopischen Beobachtung

Der Bacillus hat eine Größe von 0,5 bis 1,2 um · 1,5 bis 4,0 um und liefert eine Endospore (0,7 bis 1,2 um · 1,0 bis 2,0 um) an dem einen Ende des Körpers des Bacillus. Periflagela-Motilität: positiv. Gramfärbung: positiv.

2. Wachstumstadium in verschiedenen Medien

(1) Fleischbrühe und Agar-Agar-Medium (Medium 1)
Die Kolonie ist kreisförmig und flach auf der Oberfläche. Die Kolonie ist weiß oder gelb und halbtransparent und glänzend.
(2) Fleischbrühenmedium (Medium 2)
Aufwuchs und Trübwerden.
(3) 7% Salzfleischbrühenflüssigmedium (Medium 3)
Aufwuchs und Trübwerden.
(4) Fleischbrühe-Gelatine-Stich-Kultur (Medium 4) Kein Wachstum.
(5) Lackmusmilchkultur (Medium 5)
Koagulation und Peptonisieren der Milch: negativ. Aufgrund der Alkalität von Medium 5, war kein Farbwechsel von Lackmus erkennbar.

3. Physiologische Eigenschaften

(1) Reduktion von Nitraten und Denitrifizierungsreaktion Reduktion von Salpetersäure: positiv.
Denitrifizierung: negativ (Medium 6).
(2) MR-Test (Medium 7)
Aufgrund der Alkalität des Mediums unter lag Methylrot keiner Änderung, so daß eine Bewertung nicht möglich war.
(3) VP-Test (Medium 7)
Positiv.
(4) Bildung von Indol (Medium 8)
Negativ hinsichtlich der Reaktion gegen einen Indol- Filterpapiertest ("Nissan", hergestellt von Nissui Seiyaku K.K.) und auch hinsichtlich der Farbänderung mit Kovacs Indolreagenz.
(5) Bildung von Schwefelwasserstoff (Medium 9)
Negativ.
(6) Hydrolyse von Stärke
Eine Platte Agar-Agar-Medium, d. h. Medium 10, das unter Verwendung von 4 N HCl angesäuert wurde, ist negativ, wenn es mit einem gewöhnlichen Bestimmungsverfahren unter Verwendung der Jodreaktion bestimmt wird. Im flüssigen Medium 11 ist die Bildung löslicher Stärke negativ.
(7) Verwendung von Zitronensäure
Medium 11: positiv.
Medium 12 (Koser's (Simons)Zitronensäure/Agar-Agar- Plattenmedium): negativ. Ein flüssiges Medium, das durch Entfernen von Agar-Agar aus dem Medium 12 erhalten wurde und dem anstelle davon 0,05 Hefeextrakt zugegeben wurde, ist positiv.
Medium 13 (Christensens Agar-Agar-Plattenmedium):
positiv, jedoch keine Änderung von Phenolrot wurde aufgrund der Alkalität beobachtet.
Medium 14: negativ (kein Wachstum). Positiv hinsichtlich eines flüssigen Mediums, das nach Entfernen des Agar-Agar aus dem Medium 14 und Zugabe von 0,05% Hefeextrakt erhalten wird.
(8) Verwendung von anorganischen Stickstoffquellen
Medium 15: negativ bis pseudopositiv für alle die von Salpetersäure, salpetriger Säure und Ammoniak stammen.
Medium 16: das vorliegende Medium, das geringe Mengen an Metallsalzen enthielt, ist hinsichtlich Salpetersäure und salpetriger Säure positiv. Ammoniumchlorid: pseudopositiv. Ammoniumphosphat: positiv.
(9) Bildung von Farbstoffen
Nicht wachsend auf King A-Medium (Medium 17) und daher nicht bewertbar.
Hellgelb (ohne Fluoreszenz) im King B-Medium (Medium 18). Wuchs in einem Kartoffel/Glucose/Agar-Agar-Medium (Medium 19) und in einem Mannit/Hefeextrakt/Agar-Agar-Medium (Medium 20), jedoch negativ hinsichtlich der Bildung von Farbstoffen.
(10) Urease
Medium 21: kein Wachstum, negativ, wenn die Bildung von Ammoniak mit Nesslers Reagenz nach Entfernen von Phenolrot aus dem Medium 21 bestätigt wurde und Züchten des vorliegenden Organismus.
Medium 22 (Christensens Harnstoffmedium, zu dem Hefeextrakt gegeben wurde): negativ, wenn die Bildung von Ammoniak mit Nesslers Reagenz nach Entfernen von Phenolrot aus dem Medium 21 bestätigt wurde und Züchten des vorliegenden Organismus. Negativ, wenn bei Änderung der Harnstoffkonzentration in dem Medium 22 auf 0,1, 0,2, 0,5, 1,0 und 2,0% bei Präsupposition von Cytotoxin geprüft.
9
(11) Oxidase
"Positiv" oder "negativ" ist nicht klar.
(12) Katalase Positiv.
(13) Wachstumsbereich (Medium 23)
Ein Temperaturgradienteninkubator wurde zum Schütteln der Kultur in einem L-Typ-Teströhrchen für 3 Tage verwendet. Der Wachstumstemperaturbereich betrug 20 bis 45ºC und ein optimaler Wachstumstemperaturbereich betrug 29 bis 37ºC (Fig. 1).
Zur Bestimmung des pH-Bereichs für das Wachstum, wurde ein Versuch ausgeführt, bei dem die Konzentration von Na&sub2;CO&sub3; in dem Medium 23 geändert wurde, um den anfänglichen pH-Wert des Mediums zu verändern. Im Ergebnis wurde gefunden, daß der Wachstums-pH-Bereich 8 bis 11 betrug und einen optimalen Wachstums-pH-Bereich von 9,5 bis 10,2 (Fig. 2) aufwies. Andererseits, wenn der pH-Wert des Mediums unter Verwendung von K&sub2;CO&sub3; eingeregelt wurde, wurde gefunden, daß die Wachstumsmenge sehr viel geringer war und der optimale Wachstums-pH-Wert betrug etwa 9.
(14) Verhalten gegen Sauerstoff
Aerob.
(15) O-F-Test
Unterlag keiner Änderung in der Farbe, aufgrund der Alkalität und des Wachstums nur unter lediglich aeroben Bedingungen.
(16) Verarbeitung von Zuckern (Medium 11)
Nutzbare Kohlenstoffquellen D-Ribose, L-Arabinose, D-Xylose, D-Glucose, D-Mannose, D-Fructose, Maltose, Saccharose, Trehalose, Mannit, Inosit und Glycerin.
Keine nutzbaren Kohlenstoffquellen sind: D-Galactose, Lactose, Sorbit, Stärke, Dextrin und Raffinose.
(17) Hydrolyse von Kasein (Medium 24) Mikroorganismen wuchsen auf einer Agar-Agar-Plattenkultur auf, auf die 30% Trichloressigsäure zur Bewertung gegossen wurde. Es zeigte sich, daß um die Bacilluskolonien keine transparente Zone gebildet wurde, wodurch diese als negativ beurteilt wurden.
10
(18) Bedarf an Nährstoffen
Wie in Tabelle I gezeigt, ist Biotin (Desthiobiotin) für das Wachstum wesentlich. Tabelle I Konzentration von Vitamin Biotin Desthiobiotin Grad des Wachstums von Bacillus sp KSM-635 (Extinktion, 600 nm/6 Tage)
Es wird auf Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Ausg., bezüglich der vorstehenden mykologischen Eigenschaften hingewiesen mit dem Ergebnis, daß der vorliegende Stamm als sporenbildender Mikroorganismus, zugehörig zur Gattung Bacillus angesehen wird. Da jedoch der vorliegende Stamm nicht in einem neutralen pH-Bereich wächst, sondern nur im stark alkalischen pH-Bereich, kann er vorbehaltlich als alkalophiler Mikroorganismus ermittelt werden, von dem kürzlich Horikoshi und Akiba in "Alkalophilic Microorganisms" berichteten, Japan Scientific Society Press (Tokio), 1982 und ist von den bekannten Bacilli, die in neutralem Medium aufwachsen, unterscheidbar.
Da die mykologischen Eigenschaften des vorliegenden Stamms nicht mit jenen der bekannten alkalophilen Bacilli einhergehen, wurde der vorliegende Stamm als neuer Stamm bezeichnet und Bacillus sp KSM-635 genannt und nun als FERM Nr. 8872 bei Fermentation Research Institute of Japan hinterlegt.
Zur Erzeugung von alkalischer Cellulase K durch die Verwendung des vor stehend genannten neuen Mikroorganismus Bacillus sp KSM-635 wird der Stamm von Bacillus sp KSM-635 oder eine Variante davon, in einem Medium gezüchtet unter Herstellung alkalischer Cellulase K. Dieses Produkt wird einem üblichen Enzymreinigungsverfahren unterzogen, um es zu gewinnen und zu reinigen.
Zur Herstellung der alkalischen Cellulase K durch Fermentation wird ein geeignetes Medium beispielsweise durch Erhitzen sterilisiert, und der Stamm Bacillus sp KSM-635 (FERM BP-1485) wird in das Medium geimpft, gefolgt von Schütteln oder Belüftungszüchten bei 22 bis 40ºC, vorzugsweise bei 26 bis 37ºC, für 1 bis 4 Tage. Gute Ergebnisse werden erhalten, wenn der pH-Wert auf 8 bis 11 eingestellt wird. Da das Erzeugungs-durch-Fermentations- Medium alkalischer Natur ist, schäumt es manchmal auf, was man durch Zugabe einer geeigneten Menge eines Antischäumungsmittels zur geeigneten Zeit löst.
Die Herstellung von alkalischer Cellulase K erfordert eine geeignete Kombination von Stickstoffquellen und Kohlenstoffquellen, die in einem Kulturmedium enthalten sind. Diese Nährstoffquellen sind nicht maßgebend. Zum Beispiel schließen Stickstoffquellen anorganische Quellen wie Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Natriumnitrat und dergleichen und Maisglutenmehl, Bohnenmehl, Maisquellwasser, Casaminosäure, Hefeextrakt, Pharmamedia, Sardinenmehl, Fleischextrakt, Pepton, Hypro, Ajipower, Maissojabohnenmehl, Kaffeeschrot, Baumwollsamenölmehl, Cultivater, Amiflex, Ajipron, Zest, Ajix und dergleichen ein. Beispiele für Kohlenstoffquellen sind Pflanzenfasern wie Spreu, Kleie, Filterpapier, gewöhnliche Papiere, Sägespäne und dergleichen und Abfallmelassen, Invertzucker CMC, Avicel, Cellulosebaumwolle, Xylan, Pektin und dergleichen. Weitere nutzbare Kohlenstoffquelle, sind zum Beispiel Ribose, Arabinose, Xylose, Glucose, Mannose, Fructose, Maltose, Saccharose, Threhalose, Mannit, Inosit, Glycerin und dergleichen und organische Säuren wie Essigsäure, Zitronensäure und dergleichen. Beliebige Medien, die Kombinationen dieser Stickstoff- und Kohlenstoffquellen verwenden, können angewendet werden und die Nährstoffquellen sollten nicht auf die speziellen angeführten eingeschränkt werden. Neben diesen Bestandteilen können Phosphorsäure und anorganische Salze wie Mg²&spplus;, Ca²&spplus;, Mn²+, Zn²&spplus;, Co²&spplus;, Na&spplus;, K&spplus; organische spurenförmige Nährstoffquellen in geeigneter Weise dem Medium zugegeben werden.
Die alkalische Cellulase K kann aus dem so erhaltenen Kulturprodukt gemäß beliebigen bekannten Verfahren zur Isolierung und Reinigung üblicher Enzyme erhalten werden und wird, insbesondere in den nachstehend aufgeführten Beispielen, beschrieben.
Zum Beispiel kann das Kulturprodukt einer Zentrifugaltrennung oder Ultrafiltration unterzogen werden, um die Bacillenzellen abzutrennen. Die erhaltene Kulturbrühe wird üblichen Isolierverfahren, einschließlich zum Beispiel Aussalzen, isoelektrischer Fällung, Lösungsmittelfällung (unter Verwendung von Methanol, Ethanol, Isopropanol oder dergleichen) unterzogen, wodurch das Protein als Niederschlag abgetrennt wird. Alternativ dazu kann z. B. die Diaflow Membran YC (erhältlich von Amicon Co., Ltd.) zum Aufkonzentrieren und zur Isolierung der alkalischen Cellulase K verwendet werden. Nach der Fällung in Ammoniumsulfat (30 bis 70%-ige gesättigte Fraktion) für die Aussalzmethode oder 75%-igem Ethanol für die Lösungsmittelfällungsmethode kann das Enzym filtriert werden, durch Zentrifugieren abgetrennt oder entsalzt werden unter Erhalt eines gefriergetrockneten Pulvers. Das Entsalzen kann mit einem üblichen Verfahren wie Dialyse oder Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-25 oder dergleichen erfolgen. Darüberhinaus ist die Reinigung der Enzyme durch eine geeignete Kombination von zum Beispiel Hydroxyapatitchromatografie, Ionenaustauschchromatografie unter Verwendung von DEAE-Sephadex oder DEAE-Cellulose und Molekularsiebgelchromatografie unter Verwendung von Sephadex oder Biogel möglich.
Die erhaltene alkalische Cellulase K der Erfindung weist die nachstehenden physikalischen und chemischen Eigenschaften auf.
(1) Aktivität
Das vorliegende Enzym hat eine Cx-enzymatische Aktivität hinsichtlich CMC. Sie wirkt jedoch auch auf phosphorsäuregequollene Cellulose und weist solche Wirkungsspezifitäten auf, wie sie ein Enzym zeigt, das auf kristalline Cellulose (Cellulosebaumwolle) oder Avicel, einer Cellulose mit hoher Kristallinität (d. h. Avicelase), wirkt und hat eine Aktivität eines C&sub1;-Enzyms, wofür eine filterpapierabbauende Aktivität typisch ist (FPDase) und eine β- Glucosidaseaktivität auf Cellobiose und Cellooligosaccharid. Zusätzlich wirkt das Enzym etwas auf das künstliche Substrat PNPC unter Freisetzung von p-Nitrophenol.
(2) Substratspezifität
Die alkalische Cellulase K weist keine Abbauaktivität für Xylan, Amylose, Dextrin, Pektin, Inulin und Cardolan auf. Die Avicelase- und FPDaseaktivitäten sind etwa 0,3% der CMCaseaktivität. Die Abbauaktivität für das künstliche Substrat p-Nitrophenolcellobiosid (PNPC) betrug etwa 1,5 bis 1,8% der CMCaseaktivität (Tabelle II)

Tabelle II

Enzymwirkung Spezifische Aktivität (Einheiten/g Enzym)
β-Glucosidase 0,7
PNPCase* 5,2
CMCase 298
FPDase 1,2
Avicelase 1,1
* PNPC abbauende Aktivität
(3) Arbeits-pH-Wert und optimaler Arbeits-pH-Wert
Der Arbeits-pH-Wert des vorliegenden Enzyms beträgt 4 bis 12 und der optimale Arbeits-pH-Wert beträgt etwa 9 bis 10. Bei etwa pH 10,5 scheint eine Schulter vorzuliegen (Fig. 3).
(4) pH-Stabilität
Stabile pH-Werte, die durch Belassen in Pufferlösungen bei verschiedenen pH-Werten bei 40ºC für 10 Minuten und für 30 Minuten bestimmt wurden, sind 4,5 bis 10,5 bzw. 6,8 bis 10 (Fig. 4). Wenn bei 5ºC belassen, beträgt der pH- Wert 4 bis 11 und ist für mindestens 1 Monat stabil.
(5) Arbeitstemperaturbereich und optimaler Arbeitstemperaturbereich
Das vorliegende Enzym arbeitet in einem breiten Temperaturbereich von 10 bis 65ºC. Wenn die Reaktion in Glycinpufferlösung (pH 9) für 20 Minuten stattfindet, wird eine optimale Arbeitstemperatur von etwa 40ºC gefunden (Fig. 5).
(6) Thermische Stabilität
Wenn das vorliegende Enzym in einer Glycinpufferlösung (pH 9) bei verschiedenen Temperaturen für 20 Minuten thermisch behandelt wird, ist es bei etwa 40ºC noch nicht inaktiviert und hat eine Restaktivität von etwa 50% bei 60ºC und etwa 25% bei 70ºC (Fig. 6).
(7) Meßmethoden der Enzymaktivitäten und Proteine
(i) CMCaseaktivität
0,1 ml einer Enzymlösung wurden zu einer Substratlösung, zusammengesetzt aus 0,2 ml CMC (2,5%), 0,1 ml einer 0,5 M Glycinpufferlösung (pH 9,0) und 0,1 ml desionisiertem Wasser, gefolgt durch Umsetzung bei 40ºC für 20 Minuten, gegeben. Nach Ablauf der Reaktion wurde der reduzierende Zucker quantitativ mit der 3,5-Dinitrosalicylsäure (DNS)- Methode bestimmte. Insbesondere wurden 1 ml eines DNS-Reagenz zu 0,5 ml Reaktionslösung zugegeben und bei 100ºC für 5 Minuten bis zur Farbentwicklung erhitzt, gefolgt von Kühlen und Verdünnen mit 4,5 ml desionisiertem Wasser. Dieses wurde bei einer Wellenlänge von 535 nm colorimetriert. Der bestimmte Enzymtiter als eine Einheit ist die Menge des Enzyms, das in der Lage ist, den reduzierenden Zucker entsprechend 1 uMol Glucose in einer Minute unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen zu erzeugen.
(ii) Zersetzungswirkung hinsichtlich PNPC
Eine geeignete Menge CMCase wurde bei 30ºC auf 1,0 ml einer Reaktionslösung, enthaltend 100 uMol einer Phosphatpufferlösung (pH 7,0) und 0,1 uMol PNPC (Sigma Co., Ltd.) einwirken lassen, wonach 0,3 ml 1 M Na&sub2;CO&sub3; und 1,7 ml desionisiertes Wasser in dieser Reihenfolge zugegeben wurden, gefolgt von Colorimetrieren des erhaltenen freien p-Nitrophenols bei 400 nm. Die Enzymmenge, die in der Lage ist 1 uMol freies p-Nitrophenol in 1 Minute unter den vorstehenden Bedingungen freizusetzen, wurde als eine Einheit festgelegt.
(iii) Avicelase und FPDaseaktivitäten
2 ml einer Reaktionslösung zur Messung einer CMCaseaktivität wurden bereitgestellt, worin anstelle von CMC-Substrat 20 mg Avicel (Merk Inc.) oder ein Stück Filterpapier mit einer Breite von 0,5 cm und einer Länge von 5 cm (Filterpapier zur Bestimmung der Cellulaseaktivität, Toyo Nr. 51-Specific) verwendet wurde, wonach Avicelase- und FPDaseaktivitäten bestimmt wurden. Eine Menge des Enzyms, das in der Lage ist, 1 uMol reduzierenden Zucker freizusetzen, berechnet als Glucose in 1 Minute unter den vorstehenden Bedingungen, wurde als eine Einheit festgelegt.
(iv) Die quantitative Bestimmung von Proteinen erfolgte unter Verwendung des Bio Lab Protein Assay Kit (Bio Lad Co., Ltd.) und Rinderserumalbumin wurde zur Berechnung als Standardprotein verwendet.
(8) Einfluß von chelatbildenden Mitteln Die Widerstandsfähigkeit eines Enzyms für Waschmittel gegenüber chelatbildenden Mitteln in einem Builder, verwendet als Reaktionsmittel, ist ein höchst wichtiger Faktor. Alkalische Cellulase K wurde mit EDTA (0,5 mM), EGTA (0,5 mM), NTA (0,5 mM), Natriumtripolyphosphat (STPP, 50 mg/ml) und Zeolith (5 mg/ml) zur Bestimmung der Restaktivität vorbehandelt, jedoch war kein Einfluß erkennbar.
(9) Einfluß von Proteinasen
Proteinasen dienen der Verbesserung der Detergenzwirkung von Waschmitteln. Folglich ist es natürlich, die Detergenzwirkung durch Zugabe von Cellulasen zu proteinasehaltigen Detergenzien zu verbessern. Zu diesem Zweck ist es erforderlich, daß die Cellulase für das Waschmittel dem Erfordernis genügt, daß sie durch die Proteinase nicht hydrolysiert wird und stabil die Aktivität aufrecht erhalten kann. Alkalische Cellulase K hat eine gute Widerstandsfähigkeit zu tatsächlich angewendeten Proteinasen für Waschmittel (z. B. API-21, Maxatase, Alkanase und dergleichen) und gegenüber gewöhnlichen Proteinasen (z. B. Pronase) (Tabelle III). Tabelle III Zugegebene Proteinase Konzentration Relative Restaktivität API-21 (Showa Denko) Maxatase (Gist) Alkanase (Novo) Pronase (Sigma)
* Behandelt mit den entsprechenden Proteinasen bei 15ºC für 12 Stunden. Die Aktivität eines nicht behandelten Enzympräparats wurde mit 100% festgelegt und die Aktivität der entsprechenden behandelten Präparate wurde als Index für das nicht behandelte Präparat ausgewiesen.
(10) Einfluß von Metallen
Zweiwertige Metallionen (Hg²&spplus;, Cu²&spplus; und dergleichen) liefern bei geeigneter Konzentration eine Hemmwirkung. Ein leichter Inhibierungsgrad wird mit Hilfe von Monojodessigsäure und p-Chlormercuribenzoat erreicht.
(11) Einfluß von Tensiden
Alkalische Cellulase K leidet kaum unter der Aktivität bei Einwirkung verschiedener Tenside wie LAS, AS, ES, AOS, α-SFE, SAS, Polyoxyethylen-sekundäre Alkylether, Fettsäuresalze (Natriumsalze) und Dimethyldialkylammoniumchlorid.
(12) Molekulargewicht (Gelchromatografie unter Verwendung von Sephadex G100) Peakmaximum bei 180000 ± 10000 (Fig. 7).
Die alkalische Cellulase K der Erfindung weist, verglichen mit bekannten Cellulasen, die nachstehenden Eigenschaften auf.
Die vorliegende alkalische Cellulase hat einen optimalen pH-Wert in einem hohen pH-Bereich und ist daher von Cellulasen, die einen optimalen pH-Wert im sauren Bereich aufweisen und von Schimmelpilzen oder Keimen stammen, die zu den Gattungen Trichoderma, Penicillium, Aspergillus ("Cellulases" von Kazutoshi Nishizawa, Tokio Nankodo, 1974), Acremonium (Japanische Patentveröffentlichung Nr. 59-166081), Humicola (Japanische Patentveröffentlichung Nr. 61-16316) und dergleichen gehören, klar unterscheidbar.
Verglichen mit der alkalischen Cellulase, die in der Japanischen Patentveröffentlichung Nr. 50-28515 offenbart ist, weist die vorliegende alkalische Cellulase ein Molekulargewicht mit einem molekularen Peak vom 180 000 ± 10 000 auf. Andererseits hat die bekannte Cellulase ein Molekulargewicht von 15 000 bis 30 000. Die Cellulase von Bacillus Nr. 1139 hatte ein Molekulargewicht von 92 000. Darüberhinaus sind andere physikalische und chemische Eigenschaften von diesen oder jenen bekannten Cellulasen unterschiedlich. Die vorliegende Cellulse ist somit klar von diesen Cellulasen unterscheidbar.
Um CMCase I und CMCase II aus der alkalischen Cellulase K zu erhalten, wird die alkalische Cellulase K mit präparativer Hochdruckflüssigchromatografie, Hydroxyapatitchromatografie und DEA-Toyo-Pearl-Chromatografie und dergleichen gereinigt, wodurch die entsprechenden Bestandteile isoliert werden. CMCase I und CMCase II haben unterschiedliche Molekulargewichte und die elektrischen Ladungseigenschaften unterscheiden sich einwenig. Zum Beispiel können sie voneinander durch Elution unter Verwendung eines linearen NaCl-Konzentrationsgradienten mit der DEAE-Toyo- Pearl-Chromatografie voneinander getrennt werden.
Die so erhaltene CMCase I und CMCase II haben die nachstehenden Eigenschaften.
CMCase I:
(1) Aktivität
Das vorliegende Enzym hat eine Cx-enzymatische Aktivität mit Wirkung auf CMC. Das Enzym wirkt auch auf Phophorsäure-gequollene Cellulose und hat eine solche Aktivität wie sie ein Enzym zeigt, das auf kristalline Cellulose (Cellulosebaumwolle) oder Avicel, einer Cellulose mit hoher Kristallinität, wirkt (d. h. Avicelase) und eine Aktivität des C&sub1;-Enzyms, wofür eine filterpapierabbauende Aktivität typisch ist (FPDase) und eine β-Glucosidaseaktivität auf Cellobiose und Cellooligosaccharid. Zusätzlich wirkt das Enzym etwas auf das künstliche Substrat PNPC unter Freisetzung von p-Nitrophenol.
(2) Substratspezifität
Die Hauptaktivität des vorliegenden Enzyms ist die CMCaseaktivität und diese beträgt etwa 0,3%, bezogen auf die Hauptaktivität von Avicelase- und FPDaseaktivitäten (C&sub1;- Aktivität). Die Aktivität zum Abbau künstlichen PNPC beträgt etwa 1,5 bis etwa 1,8% (Tabelle IV). Andererseits wird keine Abbauaktivität von Xylan, Amylose, Dextrin, Pectin, Inulin und Curdlan festgestellt.
(3) Arbeits-pH-Wert und optimaler Arbeits-pH-Wert
Der Arbeits-pH-Wert des vorliegenden Enzyms beträgt 3 bis 12,5 und der optimale Arbeits-pH-Wert beträgt 6 bis 11,5 (Fig. 8). Der pH-Wert, bei dem die Wirkung am höchsten ist, beträgt etwa 9,5.
Der Arbeits-pH-Bereich hinsichtlich PNPC ist von 4 bis 11 und das Optimum liegt bei etwa 7.
(4) pH-Stabilität
Stabile pH-Werte wurden durch Belassen des vorliegenden Enzyms bei unterschiedlichen pH-Werten bei 30ºC für 1 Stunde und Messen der Restaktivität ermittelt. Im Ergebnis war das Enzym bei einem pH-Wert von 5 bis 12 stabil und wurde nicht inaktiviert (Fig. 9).
(5) Meßmethoden der enzymatischen Aktivitäten und von Protein
Die CMCaseaktivität, die PNPC-Abbau-Aktivität, Avicelase- und FPDaseaktivität und der Gehalt an Proteinen wurden gemäß dem gleichen Verfahren wie bei der alkalischen Cellulase K vorgenommen.
(6) Arbeitstemperaturbereich und optimale Arbeitstemperatur
Der Arbeitstemperaturbereich von CMCase I liegt im Bereich von 10 bis 60ºC. Der bevorzugte Temperaturbereich beträgt 22 bis 53ºC. Die optimale Arbeitstemperatur des vorliegenden Enzyms beträgt 40ºC. Das vorliegende Enzym hat eine gute Beständigkeit bei geringer Temperatur und hat etwa 50% Aktivität bei einer geringen Temperatur von 20ºC (Fig. 10).
(7) Thermische Stabilität
Bei der thermischen Behandlung bei 50ºC für 30 Minuten weist das Enzym eine Restaktivität von etwa 50% auf (in Glycinpufferlösung: pH 9,0).
(8) Einflüsse von Metallen
Metalle und Ionen üben Einflüsse auf die physikochemischen Eigenschaften, insbesondere auf die Viskosität von CMC, aus. Es ist selbstverständlich, daß wenn die Aktivität der enzymatischen Bestandteile der vorliegenden Erfindung unter Verwendung eines CMC-Substrats gemessen wird, die Faktoren der Reaktionskinetik der alkalischen Cellulase K nicht korrekt wiedergegeben werden.
Folglich wurden auf der Basis der Feststellung, daß die CMCase I eine Zersetzungsaktivität zu PNPC aufweist, Einflüsse von Metallen auf die enzymatische Aktivität bestimmt. Im Ergebnis wurde gefunden, daß Zn²&spplus;, Co²&spplus;, Ni²&spplus;, Cu²&spplus; und Hg²&spplus; die Aktivität von CMCase I inhibieren, andererseits aktivieren Mn²&spplus; und Ba²&spplus; die Aktivität leicht.
(9) Einfluß von chelatisierenden Mitteln
Wenn CMC als Substrat verwendet wurde, erlitt CMCase I keine Inhibierung durch EDTA, EGTA, NTA, STPP und Zeolith.
(10) Einfluß von Zuckern
Ähnlich zu (8) wurde PNPC als Substrat für CMCase I verwendet, um die Einflüsse verschiedener Zucker zu bestimmen. Cellobiose inhibiert beide enzymatischen Bestandteile und zeigt daher den Mechanismus der Produktinhibierung, jedoch gaben andere Disaccharide z. B. Lactose und Maltose keinen Einfluß. Die Aktivität wurde nicht durch Mono-saccharide, einschließlich Glucosamin, N-Acetylglucosamin, Ribose, Arabinose, Sorbose, Xylose, Fructose, Galactose, Glucose und deren Derivate wie 3-O-Methyl-β-D-glucose, α-Methyl-β-D-glucose, α- Methyl-β-D-glucosid, α-Methyl-β-mannosid und 2-Desoxyglucose und andere Saccharide wie Rhamnose inhibiert.
(11) Einfluß der Salzkonzentration
Eine Phosphatpufferlösung, eine Bicin-Na-Pufferlösung und eine Tris-HCl-Lösung wurden verwendet und Salz (0 bis 250 mMol) wurde verwendet als ionenstärkeeinstellendes Mittel. Die Zersetzungsaktivität von PNPC wurde als Index verwendet, um die Wirkung der Ionenstärke auf CMCase I zu bestimmen. Im Ergebnis wurde gefunden, daß die Ionenstärke keine Beziehung zur enzymatischen Aktivität hinsichtlich Förderung oder Inhibierung aufweist.
(12) Einfluß von Tensiden
Die Aktivität wurde kaum inhibiert durch LAS, AS, ES, LAOS, α-SFE, SAS, Polyoxyethylen-sekundäre Alkylether, Fettsäuresalze (Natriumsalze), Dimethyldialkylammoniumchlorid und Taurocholinsäure.
(13) Molekulargewicht
Das mit Gelchromatografie bestimmte Molekulargewicht (Toyo-Pearl-55S, erhältlich von Toyo Soda Co., Ltd.) betrug 145 000 ± 10 000.
(14) UV-Absorptionsspektrum
Das vorliegende Enzym wurde in einer Bicin-Natrium- Pufferlösung gelöst und das UV-Absorptionsspektrum auf genommen, das ein Maximum bei etwa 280 nm mit einer Schulterabsorption bei 290 nm im Differentialabsorptionsspektrum aufweist (Fig. 12).
(15) Bestimmung von Zuckern
Das gereinigte Enzymprotein wurde einem Farbentwicklungstest unter Verwendung einer Phenol/Schwefelsäuremethode unterzogen, mit dem Ergebnis, daß eine maximale Absorption bei 480 nm auftrat. Dieses Ergebnis bedeutet, daß das vorliegende Enzym einen Zucker enthält. Der Zucker wurde durch Gaschromatografie unter Verwendung einer Alditol/ Essigsäuremethode bestimmt und zeigte an, daß (N-Acetyl) glucosamin als Zucker enthalten war. Das vorliegende Enzym hatte einen Zuckergehalt von 1,3 bis 4,0 Gew.-%.
(16) Beständigkeit gegen Proteinasen
Proteinasen für Detergenzien, z. B. API (Showa Denko), Maxatase (Gist Co., Ltd.) und Alkalase (Novo Co., Ltd.) (0,0002 bis 1,0 Gew.-%) wurden zusammen mit dem vorliegenden Enzym verwendet und die Restaktivität der Präparate, vorinkubiert bei 15ºC für 12 Stunden, wurde gemessen. Inaktivierung wurde nicht festgestellt. Somit wurde gefunden, daß das vorliegende Enzym eine starke Beständigkeit gegenüber Proteinasen aufweist (Tabelle V). Tabelle V Zugegebene Proteinase Konzentration Relative Restaktivität Vergleich (keine Zugabe) API-21 (Showa Denko) Maxatase (Gist) Aalkalase (Novo)
CMCase II:
(1) Aktivität
Das vorliegende Enzym hat eine Cx-enzymatische Aktivität mit Wirkung auf CMC. Das Enzym wirkt auch auf Phosphorsäure-gequollene Cellulose und hat eine solche Aktivität wie sie ein Enzym zeigt, das auf kristalline Cellulose (Cellulosebaumwolle) oder Avicel, eine Cellulose mit hoher Kristallinität, wirkt (d. h. Avicelase) und eine Aktivität des C&sub1;-Enzyms, wofür eine filterpapierabbauende Aktivität typisch ist (FPDase) und eine β-Glucosidaseaktivität auf Cellobiose und Cellooligosaccharid. Zusätzlich wirkt das Enzym etwas auf das künstliche Substrat PNPC unter Freisetzung von p-Nitrophenol.
(2) Substratspezifität
Die Hauptaktivität des Enzyms ist die CMCaseaktivität und diese beträgt etwa 0,3%, bezogen auf die Hauptaktivität von Avicelase- und FPDaseaktivitäten (C&sub1;-Aktivität). Die Aktivität zum Abbau künstlicher PNPC beträgt etwa 1,5 bis etwa 2,0% (Tabelle VI). Andererseits wird keine Abbauaktivität von Xylan, Amylose, Dextrin, Pectin, Inulin und Curdlan festgestellt.

Tabelle VI

Umzusetzendes Substrat Enzymatische Aktivität (spezifische Aktivität, Einheiten/mg Protein) von CMCase II
CMC 7,06
Filterpapier 0,022
Avicel 0,020
Cellobiose 0,010
PNPC 0,140
(3) Arbeits-pH-Wert und optimaler Arbeits-pH-Wert
Der Arbeits-pH-Wert des vorliegenden Enzyms beträgt 3 bis 12 und der optimale Arbeits-pH-Wert beträgt 6 bis 11,5 (Fig. 13). Der pH-Wert, bei dem die Wirkung am höchsten ist, beträgt etwa 9,5.
Der Arbeits-pH-Bereich hinsichtlich PNPC ist von 4 bis 11 und das Optimum liegt bei etwa 7.
(4) pH-Stabilität
Stabile pH-Werte wurden durch Belassen des vorliegenden Enzyms bei unterschiedlichen pH-Werten bei 30ºC für 1 Stunde und Messen der Restaktivität ermittelt. Im Ergebnis war das Enzym bei einem pH-Wert von 5 bis 12 stabil und wurde nicht inaktiviert (Fig. 14).
(5) Meßmethoden der enzymatischen Aktivitäten und von Protein
Die CMCaseaktivität, die PNPC-Abbau-Aktivität, Avicelase- und FPDaseaktivität und der Gehalt an Proteinen wurden gemäß dem gleichen Verfahren wie bei der alkalischen Cellulase K vorgenommen.
(6) Arbeitstemperaturbereich und optimale Arbeitstemperatur
Der Arbeitstemperaturbereich von CMCase II liegt im Bereich von 5 bis 58ºC. Der bevorzugte Temperaturbereich beträgt 14 bis 45ºC. Die optimale Arbeitstemperatur des vorliegenden Enzyms ist 30 bis 40ºC. Bei 15ºC hat das vorliegende Enzym eine Aktivität von etwa 50%, im Fall von 30 bis 40ºC wird das Maximum an Aktivität gezeigt (Fig. 15).
(7) Thermische Stabilität
Bei der thermischen Behandlung bei 40ºC für 30 Minuten weist das Enzym eine Restaktivität von etwa 75% auf (in Glycinpufferlösung pH 9,0) (Fig. 16).
(8) Einflüsse von Metallen
Metalle und Ionen üben Einflüsse auf die physikochemischen Eigenschaften, insbesondere auf die Viskosität von CMC, aus. Es ist selbstverständlich, wenn die Aktivität der enzymatischen Bestandteile der vorliegenden Erfindung unter Verwendung eines CMC-Substrats gemessen wird, daß die Faktoren der Reaktionskinetik der alkalischen Cellulase K nicht korrekt wiedergegeben werden.
Folglich wurden auf der Basis der Feststellung, daß die CMCase II eine Zersetzungsaktivität zu PNPC aufweist, Einflüsse von Metallen auf die enzymatische Aktivität bestimmt. Im Ergebnis wurde gefunden, daß Zn²+, Co²+, Ni²+, Cu²&spplus;, Hg²&spplus; und Ca²&spplus; die Aktivität inhibieren. Andererseits aktivieren Mg²&spplus;, Mn²&spplus;, Ca²&spplus;, Ba²&spplus;, Fe²&spplus;, Li&spplus;, K&spplus; und Na&spplus; das vorliegende Enzym auf das 1,1- bis 2,4-fache der ursprünglichen Aktivität.
(9) Einfluß von chelatisierenden Mitteln
Wenn CMC als Substrat verwendet wurde, erlitt das vorliegende Enzym keine Inhibierung durch EDTA, EGTA, NTA, STPP und Zeolith.
(10) Einfluß von Zuckern
Ähnlich zu (8) wurde PNPC als Substrat für CMCase II verwendet, um die Einflüsse verschiedener Zucker zu bestimmen. Cellobiose inhibiert beide enzymatischen Bestandteile und zeigt daher den Mechanismus der Produktinhibierung, jedoch gaben andere Disaccharide z. B. Lactose und Maltose keinen Einfluß. Die Aktivität wurde nicht durch Monosaccharide, einschließlich Glucosamin, N-Acetylglucosamin, Ribose, Arabinose, Sorbose, Xylose, Fructose, Galactose, Glucose und deren Derivate wie 3-O-Methyl-β-D-glucose, α-Methyl-β-D- glucose, α-Methyl-D-glucosid, α-Methyl-β-mannosid und 2-Desoxyglucose und andere Saccharide wie Rhamnose inhibiert.
(11) Einfluß der Salzkonzentration
Eine Phosphatpufferlösung, eine Bicin-Na-Pufferlösung und eine Tris-HCl-Lösung wurden verwendet und Salz (0 bis 250 mMol) wurde verwendet als ionenstärkeeinstellendes Mittel. Die Zersetzungsaktivität von PNPC wurde als Index verwendet, um die Wirkung der Ionenstärke auf CMCase II zu bestimmen. Im Ergebnis wurde gefunden, daß die Ionenstärke keine Beziehung zur enzymatischen Aktivität hinsichtlich Förderung oder Inhibierung aufweist.
(12) Einfluß von Tensiden
Die Aktivität wurde kaum inhibiert durch LAS, AS, ES, AOS, -SFE, SAS, Polyoxyethylen-sekundäre Alkylether, Fettsäuresalze (Natriumsalze), Dimethyldialkylammoniumchlorid und Taurocholinsäure.
(13) Molekulargewicht
Das mit Gelchromatografie bestimmte Molekulargewicht (Toyo-Pearl-55s, erhältlich von Toyo Soda Co., Ltd.) betrug 170 000 ± 20 000.
(14) UV-Absorptionsspektrum
Das vorliegende Enzym wurde in einer Bicin-Natrium- Pufferlösung gelöst und das UV-Absorptionsspektrum- aufgenommen, das ein Maximum bei etwa 280 nm mit einer Schulterabsorption bei 290 nm nach Differentialabsorptionsspektrum aufweist (Fig. 17).
(15) Bestimmung von Zuckern
Das gereinigte Enzymprotein wurde einem Farbentwicklungstest unter Verwendung einer Phenol/Schwefelsäuremethode unterzogen, mit dem Ergebnis, daß eine maximale Absorption bei 480 nm auftrat. Dieses Ergebnis bedeutet, daß das vorliegende Enzym einen Zucker enthält. Der Zucker wurde durch Gaschromatografie unter Verwendung einer Alditol/ Essigsäuremethode bestimmt und zeigte an, daß (N-Acetyl)glucosamin als Zucker enthalten war. Das vorliegende Enzym hatte einen Zuckergehalt von 1,3 bis 4,0 Gew.-%.
(16) Beständigkeit gegen Proteinasen
Proteinasen für Detergenzien, z. B. API (Showa Denko), Maxatase (Gist Co., Ltd.) und Alkalase (Novo Co., Ltd.) (0,0002 bis 0,1 Gew.-%) wurden zusammen mit dem vorliegenden Enzym verwendet und die Restaktivität der Präparate, vorinkubiert bei 15ºC für 12 Stunden, wurde gemessen. Inaktivierung wurde nicht festgestellt. Somit wurde gefunden, daß das vorliegende Enzym eine hohe Beständigkeit gegenüber Proteinasen aufweist (Tabelle VII). Tabelle VII Zugegebene Proteinase Konzentration Relative Restaktivität (%) von CMCase II Vergleich (keine Zugabe) API-21 (Showa Denko) Maxatase (Gist) Alkalase (Novo)
Der Vergleich der Eigenschaften zwischen CMCase I und II und jenen einer bekannten Cellulase ist wie nachstehend.
Die vorliegenden Enzyme haben einen optimalen pH-Wert in einem hohen pH-Bereich und sind daher von Cellulasen, die einen optimalen pH-Wert im sauren Bereich aufweisen von Schimmelpilzen oder Keimen, die den Gattungen Trichoderma, Penicillium, Aspergillus ("Cellulases" von Kazutoshi Nishizawa, Tokio Nankodo, 1974), Acremonium (Japanische Patentveröffentlichung Nr. 59-166081), Humicola (Japanische Patentveröffentlichung Nr. 61-16316) und dergleichen angehören, klar unterscheidbar.
Verglichen mit der alkalischen Cellulase, die in der Japanischen Patentveröffentlichung Nr. 50-28515 offenbart ist, und der Cellulase, berichtet in J. Gen. Microbiol., Bd. 131, Seite 3339 (1985), wurde gefunden, daß CMCase I ein Molekulargewicht von 145 000 ± 10 000 und die CMCase II ein Molekulargewicht von 170 000 ± 20 000 aufweist, während die alkalische Cellulase der Japanischen Patentveröffentlichung Nr. 50-28515 ein Molekulargewicht von 15000 bis 30000 und das Molekulargewicht von Bacillus Nr. 1139 92000 ist.
Außerdem unterscheiden sich die Enzyme der vorliegenden Erfindung offenbar von diesen bekannten Cellulasen in verschiedenen reaktionskinetischen Eigenschaften und der Existenz der Zucker darin.
Die alkalische Cellulase K und CMCase I und II, erhalten gemäß der Erfindung, sind spezifische Enzyme, die stabil über einen breiten Bereich arbeiten, einschließlich der alkalischen Seite.
Zum Beispiel hat die alkalische Cellulase K bei einem pH-Wert von 11 eine relative Aktivität von etwa 75 bis 80%, bezogen auf die Aktivität des pH-Optimums. Obwohl das pH- Optimum auf der stark alkalischen Seite ist, wird auch Aktivität auf der stark sauren Seite bei etwa pH 4 oder weniger angezeigt.
Außerdem hat die CMCase I eine relative Aktivität von etwa 75 bis 80% bei einem pH von 11, bezogen auf die Aktivität bei einem optimalen pH-Wert und zeigt eine Aktivität auch bei einem pH-Wert von etwa 3,5. Die CMCase II hat eine relative Aktivität von etwa 70% bei einem pH-Wert von 11, bezogen auf die Aktivität bei einem pH-Optimum und zeigt Aktivität bei einem pH-Wert von etwa 3.
Aus dem Vorstehenden wird ersichtlich, daß die alkalische Cellulase K und die CMCase I und II der vorliegenden Erfindung Enzymgruppen sind, die eine gute Aktivität auf der stark alkalischen Seite unter den bisher bekannten alkalischen Cellulasen zeigen.
Darüber hinaus gibt es Beispiele für diese Enzyme, daß sie bereits bei niederen Temperaturen Aktivität zeigen und daß sie eine hohe Beständigkeit gegen Tenside, chelatisierende Mittel und Proteinasen aufweisen. Folglich können die alkalische Cellulase K und die CMCasen I und II der vorliegenden Erfindung nicht nur wirksam als Additiv für Waschmittel verwendet werden, sondern auch für Biomasse und auf anderen Gebieten.
Die vorliegende Erfindung wird nun im einzelnen durch Vergleiche und Beispiele beschrieben.

Beispiel 1

Eine Bodenprobe, entnommen bei Itachikai-machi, Hagagun, Tochigi-ken, Japan, wurde in einer sterilisierten Salzlösung suspendiert und für 30 Minuten bei 80ºC thermisch behandelt.
Die thermisch behandelte Lösung wurde in geeigneter Weise verdünnt und auf einer Platte verteilt (bestehend aus 1 % Fleischextrakt (Oxoid Co., Ltd.), 1% Bacto pepton (Difco Co., Ltd.), 1% NaCl, 0,1% KH&sub2;PO&sub4;, 0,5% Na&sub2;CO&sub3; (getrennt sterilisiert) und 1,5% Bacto Agar-Agar, gefolgt von Kultivieren bei 30ºC für 3 Tage, wobei sich Kolonien bilden. Überführen auf eine 2%-ige CMC-haltige vorstehend genannte Platte, gemäß einem Replica-Verfahren wurde durchgeführt zur erneuten Bildung von Kolonien, gefolgt von Aufgießen einer Kongorotfarbstofflösung, um jene Kolonien zu erhalten, deren Peripherie transparent war. Die so erhaltenen Kolonien wurden von der Platte entnommen und Bacilli mit einem hohem CMCase- Titer wurden ausgewählt.
Durch das vorstehende Verfahren wurde Bacillus sp KSM-635 (FERM BP-1485) der Erfindung isoliert.

Beispiel 2

Der Stamm Bacillus sp KSM-635 (FERM BP-1485) wurde aerob in einem flüssigen Medium, bestehend aus 1,5% Fleischextrakt, 0,5% Hefeextrakt, 1% CMC, 0,1% KH&sub2;PO&sub4; und 0,75% Na&sub2;CO&sub3; bei 34ºC für 2 Tage gezüchtet. 3 Liter gekühltes Ethanol (-10ºC) wurden langsam zu einem Liter der Überstandslösung des Kulturprodukts zur Fällung der Proteine zugegeben.
Das Präzipitat wurde in einer minimalen Menge sterilisierten desionisierten Wassers gelöst und mit verdünnter Essigsäure neutralisiert, gefolgt von Dialyse unter fließendem Wasser für 15 Stunden ,und Gefriertrocknen unter Erhalt von 8,2 g alkalischer Cellulase K. Die so erhaltene Cellulase K hatte die nachstehenden in Tabelle VIII gezeigten enzymatischen Aktivitäten.

Tabelle VIII

Enzymart Spezifische Aktivität (Einheiten/g Enzympulver)
β-Glucosidase 0,6
PNPCase* 7
CMCase 325
FPDase 1,2
Avicelase 1,1
* PNPC-Abbauaktivität

Beispiel 3

100 ml eines Mediums (pH 8,4 bis 8,6) mit 1% CMC, 2% Polypepton, 0,1% KH&sub2;PO&sub4;, 0,1% Hefeextrakt und 0,75% Na&sub2;CO&sub3; wurden in einen 500 ml-Erlenmeyerkolben gegeben und in üblicher Weise sterilisiert, gefolgt von Beimpfen mit einem Stamm Bacillus sp KSM-635 (FERM BP-1485) und Schütteln der Kultur bei 30ºC für 4 Tage. Nach Ablauf der Züchtung wurden die Bacillenzellen mit einer Zentrifuge entfernt und die erhaltene Überstandslösung wurde einer Messung hinsichtlich der CMCaseaktivität unterzogen. Die Aktivität betrug 3100 Einheiten/Liter. Die Überstandsflüssigkeit wurde in gleicher Weise wie im Beispiel 2 unter Erhalt von 9,2 g alkalischer Cellulase K behandelt.

Beispiel 4

Der Stamm Bacillus sp KSM-635 (FERM BP-1485) wurde in ein Medium von Beispiel 2 geimpft, in dem 1,5% Fleischextrakt anstelle von Bacto Pepton zugegeben wurde, gefolgt von Schütteln der Kultur bei 30ºC für 3 Tage. Nach der Züchtung wurde die überstehende Flüssigkeit mit einer Zentrifuge getrennt und der CMCase-Aktivitätsmessung unterzogen. Es wurde eine Aktivität von 3200 Einheiten/Liter gefunden.

Beispiel 5

Ein Liter der in Beispiel 4 erhaltenen überstehenden Flüssigkeit wurde gemäß nachstehendem Verfahren unter Erhalt von CMCasen I und II gereinigt. Die Reinigung bestand aus (1) Behandlung mit Streptomycin, (2) Fraktionieren mit Ammoniumsulfat (30 bis 73%-ige gesättigte Fällungsfraktion), (3) präparative Hochdruckflüssigchromatografie (z. B. eine SW 3000 G-Säule (Toyo Soda Co., Ltd.), (4) DEAE-Toyo-Pearl- Chromatografie (Toyo Soda Co., Ltd.), (5) Hydroxyapatitchromatografie (Seikagaku Ind. Co., Ltd.) und (6) DEAE-Toyo- Pearl-Chromatografie. Bei der 6. Stufe der Reinigung, wenn Elution mit einem linearen NaCl-Gradienten (von 0,25 M NaCl bis 0,35 M NaCl) durchgeführt wurde, wurden CMCase I und CMCase II in der Reihenfolge der Elution unter Erhalt von 24 mg CMCase I und 15 mg CMCase II eluiert. Die so erhaltenen CMCasen I und II wurden gemäß dem Verfahren von Davis elektrophoretisch untersucht (Davis D.J., Ann.N.Y. Acad. Sci., Bd. 121, Seite 404 (1964)), gefolgt von Anfärben mit Coomassie Brillant Blau. Im Ergebnis wurde gefunden, daß von den betreffenden Enzymen eine einzelne Bande erhalten wurde.

Beispiel 6

Die in Beispiel 5 erhaltenen CMCasen I und II wurden Elektrophorese unter Verwendung von Natriumdodecylsulfat gemäß üblichen Verfahren unterzogen. Die Ergebnisse sind in Fig. 18 dargestellt. In den Ergebnissen wurde gefunden, daß die CMCasen I und II assoziierte Produkte unterschiedlicher Molekülarten mit einem unteren Molekulargewicht von 30000 ± 2000 und einem höchsten Molekulargewicht von 120000 ± 15000 waren. Von CMCasen I und II wird angenommen, daß sie assoziierte Produkte von Enzymproteinen sind, die stark durch physikalische und chemische Wechselwirkungen miteinander verbunden sind und die ein unterstes Molekulargewicht von 30000 ± 2000 aufweisen. Derzeitig ist jedoch nicht bekannt, wie das Protein assoziiert ist. Es wird angenommen, daß das Hauptprotein der CMCase I ein Molekulargewicht von 55000 bis 65000, das der CMCase II ein Molekulargewicht von 95000 bis 120000 aufweist. Die in diesem Beispiel erhaltenen Produkte sind folglich lediglich ein Beispiel der Ergebnisse der Natriumdodecylsulfatelektrophorese und sollten nicht als begrenzend für die exakten Untereinheitsstrukturen von CMCasen I und II aufzufassen sein.

Claims

1. Alkalische Cellulase K, erhältlich aus einem Kulturprodukt von Bacillus sp KSM-635, hinterlegt als FERM BP-1485, mit den nachstehenden physikalischen und chemischen Eigenschaften:

(1) Aktivität

Cx-enzymatische Aktivität auf Carboxymethylcellulose zusammen mit einer schwachen C&sub1;-enzymatischen Aktivität und einer schwachen β-Glucosidaseaktivität;

(2) Spezifität auf Substrate

Wirkung auf Carboxymethylcellulose (CMC), kristalline Cellulose, Avicel, Cellobiose und p-Nitrophenylcellobiosid (PNPC);

(3) Arbeits-pH-Wert und optimaler pH-Wert

Mit einem Arbeits-pH-Wert im Bereich von 4 bis 12 und einem optimalen pH-Wert im Bereich von 9 bis 10;

(4) pH-Wert-Stabilität

Stabil bei pH-Werten von 4,5 bis 10,5 und 6,8 bis 10, wenn bei 40ºC für 10 Minuten bzw. 30 Minuten belassen;

(5) Arbeitstemperaturbereich und optimale Arbeitstemperatur

Wirkt in einem breiten Temperaturbereich von 10 bis 65ºC mit einer optimalen Temperatur bei etwa 40ºC;

(6) Einflüsse von chelatbildenden Mitteln

Die Aktivität ist nicht von Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Ethylenglycol-bis-(β-aminoethylether)-N,N,N',N''-tetraessigsäure (EGTA), N,N-Bis(carboxymethyl)glycin (Nitrilotriessigsäure) (NTA), Natriumtripolyphosphat (STPP) und Zeolith beeinflußt.

(7) Einflüsse von Tensiden

Unterliegt kaum Inhibierung der Aktivität durch Tenside wie lineare Natriumalkylbenzolsulfonate (LAS), Natriumalkylsulfate (AS), Natriumpolyoxyethylenalkylsulfate (ES), Natrium-α-olefinsulfonate (AOS), Natrium-a-sulfonierte aliphatische Säureester (α-SFE), Natriumalkylsulfonate (SAS), Polyoxyethylen-sekundäre Alkylether, Fettsäuresalze (Natriumsalze) und Dimethyldialkylammoniumchlorid.

(8) Einfluß von Proteinasen

Mit hoher Beständigkeit gegenüber Proteinasen.

(9) Molekulargewicht (bestimmt durch Gelchromatografie unter Verwendung von Sephadex® G 100) Mit einem maximalen Peak bei 180000 ± 10000.

2. Verfahren zur Herstellung alkalischer Cellulase K mit den in Beispiel 1 definierten Merkmalen, umfassend das Züchten von alkalische Cellulase K erzeugendem Bacillus sp KSM-635, hinterlegt als FERM BP-1485, und Gewinnen der alkalischen Cellulase K aus dem erhaltenen Kulturprodukt.

3. CMCase I, erhältlich aus einem Kulturprodukt von Bacillus sp KSM-635, hinterlegt als FERM BP-1485, mit den nachstehenden physikalischen und chemischen Eigenschaften:

(1) Aktivität

Cx-enzymatische Aktivität auf CMC zusammen mit einer schwachen C&sub1;-enzymatischen Aktivität und einer schwachen β- Glucosidaseaktivität.

(2) Spezifität auf Substrate

Wirkt auf CMC, kristalline Cellulose, Avicel, Cellubiose und PNPC.

(3) Arbeits-pH-Wert und optimaler pH-Wert

Mit einem Arbeits-pH-Wert in dem Bereich von 3 bis 12,5 und einem optimalen pH-Wert im Bereich von 6 bis 11,5.

(4) pH-Wert-Stabilität

Nicht inaktiviert bei einem pH-Wert von 5 bis 12, wenn bei 30ºC für 1 Stunde belassen.

(5) Arbeitstemperatur und optimale Arbeitstemperatur

Wirkt in einem Temperaturbereich von 10 bis 60ºC mit einer optimalen Temperatur von 22 bis 53ºC.

(6) Einflüsse von chelatbildenden Mitteln

Die Aktivität wird nicht von EDTA, EGTA, NTA, STPP und Zeolith beeinflußt.

(7) Einflüsse von Tensiden

Unterliegt kaum Inhibierung der Aktivität durch LAS, AS, ES, AOS, α-SFE, SAS, Polyoxyethylen-sekundäre Alkylether, Fettsäuresalze (Natriumsalze), Dimethyldialkylammoniumchlorid und Taurocholinsäure.

(8) Beständigkeit gegen Proteinasen

Mit hoher Beständigkeit gegen Proteinasen

(9) Molekulargewicht (bestimmt durch Gelchromatografie unter Verwendung von Toyopearl® 55S) Dies es Enzym weist ein Molekulargewicht von 145000 I 10000 auf.

(10) UV-Absorptionsspektrum

Das Enzym weist eine maximale Absorption bei 280 nm oder eine Schulterabsorption bei 290 nm auf, somit sind Zuckerbestandteile enthalten.

4. CMCase II, erhältlich aus einem Kulturprodukt von Bacillus sp KSM-635, hinterlegt als FERM BP-1485, mit den nachstehenden physikalischen und chemischen Eigenschaften:

(1) Aktivität

Cx-enzymatische Aktivität auf CMC zusammen mit einer schwachen Cx-enzymatischen Aktivität und einer schwachen β- Glucosidaseaktivität.

(2) Spezifität auf Substrate

Wirkt auf CMC, kristalline Cellulose, Avicel, Cellubiose und PNPC.

(3) Arbeits-pH-Wert und optimaler pH-Wert

(4) pH-Wert-Stabilität

Nicht aktiviert bei einem pH-Wert von 5 bis 12, wenn bei 30ºC für 1 Stunde belassen.

(5) Arbeitstemperatur und optimale Arbeitstemperatur

Wirkt in einem Temperaturbereich von 5 bis 58ºC mit einer optimalen Temperatur von 14 bis 45ºC.

(6) Einflüsse von chelatbildenden Mitteln

Die Aktivität wird nicht von EDTA, EGTA, NTA, STPP und Zeolith beeinflußt.

(7) Einflüsse von Tensiden

Unterliegt kaum Inhibierung der Aktivität durch LAS, AS, ES, AOS, α-SFE, SAS, Polyoxyethylen-sekundäre Alkylether, Fettsäuresalze (Natriumsalze) und Dimethyldialkylammoniumchlorid

(8) Beständigkeit gegen Proteinasen

Mit hoher Beständigkeit gegen Proteinasen

(9) Molekulargewicht (bestimmt durch Gelchromatografie unter Verwendung von Toyopearl® 55S)

Das Molekulargewicht von CMCase II ist 170000 ± 20000.

(10) UV-Absorptionsspektrum

Das Enzym weist eine maximale Absorption bei 280 nm oder eine Schulterabsorption bei 290 nm auf.

5. Bacterien Bacillus sp KSM-635, hinterlegt als FERM BP-1485, die in der rage sind, alkalische Cellulase K zu erzeugen, mit den nachstehenden enzymatischen Eigenschaften:

(1) Aktivität

Cx-enzymatische Aktivität auf CMC zusammen mit einer schwachen C&sub1;-enzymatischen Aktivität und einer schwachen (3- Glucosidaseaktivität.

(2) Spezifität auf Substrate

Wirkt auf CMC, kristalline Cellulose, Avicel, Cellobiose und PNPC.

(3) Arbeits-pH-Wert und optimaler pH-Wert

Mit einem Arbeits-pH-Wert in dem Bereich von 4 bis 12 und einem optimalen pH-Wert im Bereich von 9 bis 10 (Fig. 3).

(4) pH-Wert-Stabilität

Stabil bei pH-Werten von 4,5 bis 10,5 und 6,8 bis 10, wenn bei 40ºC für 10 Minuten bzw. 30 Minuten belassen (Fig. 4).

(5) Arbeitstemperatur und optimale Arbeitstemperatur

Wirkt in einem weiten Temperaturbereich von 10 bis 65ºC mit einer optimalen Temperatur von etwa 40ºC (Fig. 5).

(6) Einflüsse von chelatbildenden Mitteln Die Aktivität wird nicht von EDTA, EGTA, NTA, STPP und Zeolith beeinflußt.

(7) Einflüsse von Tensiden

Unterliegt kaum Inhibierung der Aktivität durch Tenside, wie LAS, AS, ES, AOS, α-SFE, SAS, Polyoxyethylensekundären Alkylethern, Fettsäuresalzen (Natriumsalze) und Dimethyldialkylammoniumchlorid

(8) Beständigkeit gegen Proteinasen

Mit hoher Beständigkeit gegen Proteinasen

(9) Molekulargewicht (bestimmt durch Gelchromatografie unter Verwendung von Sephadex® G 100) Mit einem maximalen Peak bei 180000 ± 10000 (Fig. 7).