DE69611331T2

DE69611331T2 - Verfahren zur Herstellung von S-Phenyl-L-Cystein

Info

Publication number: DE69611331T2
Application number: DE69611331T
Authority: DE
Inventors: Nobuhiro Fukuhara; Kazuhiro Fukuta
Original assignee: Mitsui Chemicals Inc
Current assignee: Mitsui Chemicals Inc
Priority date: 1995-07-18
Filing date: 1996-07-15
Publication date: 2001-04-26
Anticipated expiration: 2016-07-16
Also published as: KR970006316A; DE69611331D1; EP0754759A1; US5756319A; KR100249084B1; EP0754759B1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von S-Phenyl-L-cystein und speziell ein Verfahren zur Herstellung von S-Phenyl-L-cystein durch Reaktion von Thiophenol und L-Serin unter Einwirkung von Tryptophansynthase.
Man geht davon aus, daß S-substituierte Cysteinderivate Verwendung als Zwischenprodukte für Medikamente und Agrochemikalien finden, so daß ihre Syntheseverfahren untersucht wurden. Bisher wurde jedoch noch kein Verfahren im industriellen Maßstab durchgeführt, und die Entwicklung eines ökonomischen Herstellungsverfahrens ist deshalb wünschenswert. Kürzlich wurde festgestellt, daß S-Phenyl-L-cystein als Struktur eines HIV- Proteaseinhibitors, ein Anti-AIDS-Medikament, und als eine Aminosäure eines Bestandteils eines Hydroxyethylamindipeptidisosters von Asparagin- Proteaseinhibitoren verwendbar ist. Demzufolge besteht ein Bedarf an der Entwicklung eines Verfahrens zur ökonomischen Herstellung von hochreinem S-Phenyl-L-cystein.
Bekanntermaßen ist S-Phenyl-L-cystein durch eine Enzymreaktion von L- Serin und Thiophenol unter Einwirkung von Cysteindesulfhydrase (japanische Patentveröffentlichung Nr. 13154/1983) synthetisch zugänglich. In diesem Fall jedoch ist die Reaktionsgeschwindigkeit extrem niedrig, so daß die praktische Anwendung schwierig ist.
Von S-Phenyl-L-cystein ist auch bekannt, daß es durch eine Enzymreaktion von L-Serin und Thiophenol unter Einwirkung von Tryptophansynthase (japanische Patentveröffentlichung Nr. 54077/1990) synthetisch zugänglich ist. Auch hier ist die Reaktionsausbeute gering, und das Verfahren kann keine ausreichende Ausbeute liefern, um eine Übertragung in den industriellen Maßstab zu rechtfertigen.
Wie oben beschrieben, wurde das Verfahren zur Herstellung von S-Phenyl- L-cystein aus L-Serin und Thiophenol unter Verwendung von Cysteindesulfhydrase oder Tryptophansynthase nicht über den Labormaßstab hinaus weiterentwickelt und hat keine Ausbeute erzielt, die für eine industrielle Anwendung ausreicht.
Ebenso relevant für das Gebiet der vorliegenden Erfindung sind die folgenden Druckschriften:
D1: Derwent Biotech Abstract AN: 84-00221, XP002016581 und JP-A- 58/146287;
D2: Derwent WPI Abstract AN: 84-316062, XP002016582 und JP-A- 59/198986;
D3: Chemical Abstracts Bd. 107, Nr. 19, Abstract Nr. 174390 v, Seite 584 und JP-A-62/143690 und Derwent WPI Abstract AN: 87-217622.
D1 beschreibt die Herstellung von S-Phenyl-L-cystein durch Reaktion von Phenylmercaptan und L-Serin in Gegenwart von Tryptophansynthase bei einem pH-Wert von 8,0, wobei geeignete Enzyme durch E. coli MT-10238 (FERM BP-6145) und Neurospora crassa ATCC 14692 hergestellt werden.
D2 beschreibt die Herstellung von S-Carboxymethyl-L-cystein durch Reaktion von Thioglycolsäure mit L-Serin in Gegenwart von Tryptophansynthase bei einem pH-Wert von 6,0 bis 10,0 und 8,0-8,5 in den Ausführungsbeispielen. Das Enzym wird von E. coli ATCC 15491 oder Neurospora crassa ATCC 14692 produziert.
D3 beschreibt die enzymatische Herstellung von schwefelhaltigen L- Aminosäuren durch Reaktion von L-Serin und schwefelhaltigen Verbindungen (speziell NaS) in Gegenwart von Tryptophansynthase bei einem pH- Wert, der auf 8,5 gehalten wird. JP-A-62/143690 beschreibt allgemein einen pH-Bereich von 6 bis 10, wobei jedoch in den spezifischen Beispielen die pH-Bereiche 8,5 und 8,2 bis 8,4 betragen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, welches S-Phenyl-L-cystein in hoher Ausbeute liefern kann.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben mit einer umfangreichen Untersuchung an einem Verfahren zur Herstellung von S-Phenyl-L-cystein unter Verwendung von Tryptophansynthase gearbeitet. Im Ergebnis wurde überraschenderweise festgestellt, daß die Ausbeute an S-Phenyl-L-cystein enorm gesteigert werden kann, indem eine Enzymreaktion in einer alkalischen wässrigen Lösung mit einem ausgewählten pH-Bereich durch Reaktion von Thiophenol und L-Serin unter Einwirkung von Tryptophansynthase durchgeführt wird, was zur Vollendung der vorliegenden Erfindung führt.
Die vorliegende Erfindung stellt somit ein Verfahren zur Herstellung von S- Phenyl-L-cystein durch Reaktion von Thiophenol und L-Serin unter der Einwirkung von Tryptophansynthase zur Verfügung, wobei diese Reaktion in einer wässrigen Lösung bei einem pH-Wert im Bereich von 9,0 bis 10,5 durchgeführt wird.
In der Industrie kennt man Tryptophansynthase normalerweise als Enzym zur Synthese von L-Tryptophan aus Indol und L-Serin. In diesem Fall ist allgemein bekannt, daß der optimale pH-Wert im Bereich von 8,0 bis 8,5 liegt; vgl. beispielsweise D1 bis D3.
Im Falle der Enzymreaktion für die Synthese von S-Phenyl-L-cystein aus Thiophenol und L-Serin haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung jedoch festgestellt, daß, obgleich es sich um eine Enzymreaktion handelt, die die gleiche Tryptophansynthase verwendet, weder eine ausreichende Reaktionsgeschwindigkeit noch ausreichende Ausbeute erzielt werden kann, wenn die Reaktion nicht unter alkalischen Bedingungen bei einem pH-Wert von 9,0 bis 10,5 durchgeführt wird, was außerhalb des oben genannten, gut bekannten optimalen pH-Bereichs (pH 8,0 bis pH 8,5) liegt.
Ein Verfahren gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zur Herstellung von S-Phenyl-L-cystein umfaßt einen Schritt, in dem Thiophenol und L-Serin unter der Einwirkung von Tryptophansynthase in einer wässrigen Lösung bei einem pH-Wert im Bereich von 9,0 bis 10,5 umgesetzt werden, um S-Phenyl-L-cystein zu bilden.
Ein Verfahren gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zur Herstellung von S-Phenyl-L-cystein umfaßt die folgenden Schritte:
(a) Bereitstellen eines enzymatischen Reaktionsgemisches durch Reaktion von Thiophenol und L-Serin unter Einwirkung von Tryptophansynthase in einer wässrigen Lösung mit einem pH-Wert im Bereich von 9,0 bis 10,5, wobei ein Reaktionsgemisch erhalten wird, das Kristalle von S-Phenyl-L-cystein enthält;
(b) Einstellen des pH-Wertes des enzymatischen Reaktionsgemisches, das die Kristalle von S-Phenyl-L-cystein enthält, auf einen sauren Bereich, so daß die Kristalle von S-Phenyl-L-cystein, die aus diesem Reaktionsgemisch ausgefallen sind, aufgelöst werden;
(c) Zugabe von Aktivkohle zum Reaktionsgemisch, in welchem S-Phenyl-Lcystein gelöst ist, und nachfolgendes Belüften des erhaltenen Reaktionsgemisches mit einem sauerstoffhaltigen Gas, wodurch die Feststoffe und unumgesetztes Thiophenol an der Aktivkohle adsorbiert werden, und unumgesetztes Thiophenol, das nicht an der Aktivkohle adsorbiert wird, unlöslich gemacht wird;
(d) Abtrennen der Aktivkohle und der unlöslich gemachten Feststoffe aus dem Reaktionsgemisch, um eine S-Phenyl-L-cystein-Lösung zu erhalten; und
(e) Zugabe von Alkali, um den pH-Wert dieser S-Phenyl-L-cystein-Lösung zu erhöhen, vorzugsweise auf einen Bereich von 2,5 bis 6,0, um Kristalle von S- Phenyl-L-cystein auszufällen, und nachfolgende Gewinnung dieser Kristalle von S-Phenyl-L-cystein.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann S-Phenyl-L-cystein in hoher Ausbeute erhalten werden, wodurch die Herstellung im industriellen Maßstab ermöglicht wird.
Die bevorzugte Anwendung der vorliegenden Erfindung wird nun in der folgenden nicht einschränkenden Beschreibung in Verbindung mit den anhängigen Zeichnungen erklärt, wobei
Fig. 1 eine Diagrammdarstellung der pH-Effekte auf individuelle Enzymaktivitäten, erhalten in Experiment 1, ist; und
Fig. 2 eine Diagrammdarstellung von Temperatureffekten auf die optischen Reinheiten, erhalten in Experiment 2, ist.
Ein Mikroorganismus zur Herstellung für die Tryptophansynthase, die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt wird, kann ein prokaryotischer Mikroorganismus, wie beispielsweise Escherichia coli, oder ein transformierter Mikroorganismus sein, der durch Anwendung der rekombinanten DNA- Technologie hergestellt wurde und mit einer verbesserten Enzymproduktivität ausgestattet ist. Alternativ kann die Tryptophansynthase auch eine sein, die erhalten wird aus Saccharomyces cerevisiae oder einem eukaryotischen Mikroorganismus, wie beispielsweise einem Pilz, oder einem transformierten Mikroorganismus, der durch Anwendung der rekombinanten DNA-Technologie erzeugt wurde, um die Enzymproduktivität des eukaryotischen Mikroorganismus zu verbessern.
Bevorzugt sind Escherichia coli MT-10242 (FERM BP-20) und Neurospora crassa ATCC 14692, welche aus der amerikanischen Kulturtypensammlung öffentlich zugänglich sind. Noch bevorzugter ist ein Mikroorganismus mit einer Tryptophansynthaseaktivität, die ausreicht, um 1 Gramm Tryptophan in einer Stunde pro Gramm trockener Zellen des Mikroorganismus zu synthetisieren.
Escherichia coli MT-10242 (FERM BP-20) wurde in den erteilten japanischen Patentanmeldungen, d. h. in den japanischen Patentveröffentlichungen (Kokoku) Nrn. 25353/87 und 55669/92 beschrieben, und Proben sind vom Na tional Institute of Biosdence and Human-Technology der Agency of Industrial Science and Technology; 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibarakiken, 305, Japan, öffentlich zugänglich.
Als Medium für das Kultivieren eines Mikroorganismus, der Tryptophansynthase produziert, ist entweder ein synthetisches Kulturmedium oder ein natürliches Kulturmedium verwendbar, vorausgesetzt, daß es eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Substanzen und bei Bedarf kleine Mengen an Spurenelementen enthält. Es ist jedoch im allgemeinen erforderlich, Tryptophan, Anthranilsäure oder Indol in einer kleinen Menge zum Kulturmedium zuzugeben. Jede Kohlenstoffquelle oder Stickstoffquelle kann im Kulturmedium verwendet werden, sofern sie vom Mikroorganismus assimiliert wird. Verwendbare Beispiele für die Kohlenstoffquelle umfassen verschiedene Kohlenwasserstoffe, wie beispielsweise Glucose, Glycerin, Fructose, Saccharose, Maltose, Mannose, Stärke, Stärkehydrolysat und Zuckerlösung. Verwendbare Beispiele für die Stickstoffquelle umfassen Ammoniak; verschiedene anorganische oder organische Ammoniumsalze, wie beispielsweise Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumacetat; und natürliche organische Stickstoffquellen, wie beispielsweise Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maiseinweichlösung, Kaseinhydrolysat, Fischmehl oder dessen Aufschluß, und entfettetes Sojabohnenmehl oder dessen Aufschluß. Viele natürliche organische Stickstoffquellen können sowohl als Stickstoffquelle als auch als Kohlenstoffquelle dienen. Als anorganische Substanzen können bei Bedarf Kaliummonohydrogenphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid und Eisen(II)sulfat verwendet werden.
Das Kultivieren wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt, beispielsweise mittels einer Schüttelkultur oder Submerskultur, die belüftet und gerührt wird. Die Temperatur liegt im allgemeinen im Bereich von 20 bis 50ºC, üblicherweise im Bereich von 30 bis 37ºC. Während des Kultivierens ist es wünschenswert, den pH-Wert des Kulturmediums in der Nähe des neutralen Bereichs zu halten. Die Kultivierungszeit liegt im allgemeinen im Bereich von 1 bis 3 Tagen.
Ein Verfahren zur Extraktion von Tryptophansynthase aus den Kulturzellen von Escherichia coli ist in The Journal of Biological Chemistry, 252(19), 6594-6599, 1977, offenbart, während ein Extraktionsverfahren des gleichen Enzyms aus Kulturzellen von Neurospora crassa in derselben Zeitschrift, 250(8), 2941-2946, 1975, beschrieben ist. Es ist jedoch anzumerken, daß die Tryptophansynthase, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden soll, nicht unbedingt rein sein muß. D. h., ein Kulturmedium eines Mikroorganismus, der Tryptophansynthase produziert, lebensfähige Zellen, die durch Zentrifugieren oder ähnliches aus einem solchen Kulturmedium gewonnen werden, getrocknete Zellen, die durch Trocknen solcher lebensfähiger Zellen erhalten werden, eine verarbeitete oder behandelte produzierte Zelle, die dadurch erhalten wird, daß solche Zellen einer Disruption, Autolyse oder Ultraschallbehandlung unterzogen werden, ein Extrakt solcher Zellen und ein Rohprodukt des Enzyms, das aus solchem Extrakt erhalten wird, sind alle verwendbar. Sie können jeweils in Form eines immobilisierten Enzyms oder von immobilisierten Zellen vorliegen.
In der vorliegenden Erfindung sind die Ausgangsubstanzen für die Synthese von S-Phenyl-L-cystein durch die Enzymreaktion L-Serin und Thiophenol, welche beide kommerziell erhältlich und leicht zugänglich sind.
Obgleich die Konzentration von L-Serin im Reaktionsgemisch nicht besonders eingeschränkt ist, liegt dessen Konzentration vorzugsweise im Bereich von 1 bis 10 Gew.-%.
Die Konzentration von Thiophenol im Reaktionsgemisch muß in einem solchen Bereich liegen, der die Enzymreaktion nicht nachteilig beeinflußt. Thiophenol wird vorzugsweise in einer Konzentration von 10 Gew.-% oder weniger verwendet. Im übrigen kann das Thiophenol nach und nach in Anteilen während des Verlaufs der Reaktion zugegeben werden.
Um die Reaktion durchzuführen, ist es wünschenswert, zusätzlich zum Substrat Pyridoxalphosphat ("PLP") im Bereich von 0,1 bis 100 ppm zuzugeben.
Die Menge an Tryptophansynthase, die zum Reaktionsgemisch zugegeben werden soll, kann wie erforderlich und in Abhängigkeit von der Konzentration des Substrats, der Reaktionszeit und anderen Bedingungen variiert werden.
Die Enzymreaktion zur Synthese von S-Phenyl-L-cystein gemäß der vorliegenden Erfindung wird unter alkalischen Bedingungen in einem pH-Bereich von 9,0 bis 10,5 durchgeführt. Besonders bevorzugt ist der pH-Bereich von 9,0 bis 10,0. Verwendbare Beispiele eines Alkalis umfassen Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid und wässriges Ammoniak.
Wenn der pH-Wert niedriger als 9,0 ist, ist die Geschwindigkeit der Enzymreaktion zur Synthese von S-Phenyl-L-cystein extrem niedrig, so daß L- Serin, eine der Ausgangssubstanzen, nicht ausreichend zu S-Phenyl-Lcystein umgesetzt werden kann. Insbesondere wenn die Tryptophansynthase nicht in reiner Form verwendet wird, führt die Verwendung eines pH-Wertes, der niedriger als 9,0 ist, zu einer Abbaugeschwindigkeit von L-Serin, die höher ist als die Synthesegeschwindigkeit von S-Phenyl-L-cystein, weil ein Mikroorganismus eines oder mehrere Enzyme mit L-Serin-Abbauaktivität enthält.
Der Abbau von L-Serin als eine der Ausgangsubstanzen schreitet deshalb bevorzugt voran, was dazu führt, daß S-Phenyl-L-cystein in geringer Ausbeute produziert wird. Im übrigen kann die Zugabe eines Ammoniumsalzes die L-Serin-Abbauaktivität reduzieren, ist aber nicht besonders effektiv, da die Geschwindigkeit der Enzymreaktion zur Synthese von S-Phenyl-Lcystein niedrig ist, wenn der pH-Wert niedriger als 9,0 ist.
Im pH-Bereich von 9,0 bis 10,5 erhöht sich die Geschwindigkeit der Enzymreaktion zur Synthese von S-Phenyl-L-cystein erheblich, und andererseits sinkt die Abbaugeschwindigkeit von L-Serin vorteilhafterweise, wodurch die Bildung von S-Phenyl-L-cystein bevorzugt voranschreitet. Demgemäß wird bei der Reaktion bei einem pH-Wert von 9,0 bis 10,5 die Reaktionsausbeute von S-Phenyl-L-cystein erheblich verbessert. Wenn jedoch der pH-Wert 10,5 überschreitet, verringert sich die Geschwindigkeit der Enzymreaktion zur Synthese von S-Phenyl-L-cystein, so daß dessen Ausbeute wiederum abnimmt.
Sogar wenn die Enzymreaktion bei einem pH-Wert von 9,0 oder höher durchgeführt wird, ist die Zugabe eines Ammoniumsalzes zum Zwecke der Verringerung der L-Serin-Abbauaktivität des Enzyms oder der Enzyme hinsichtlich der Erhöhung der Reaktionsausbeute bevorzugt. Verwendbare Beispiele für das Ammoniumsalz umfassen Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat und Ammoniumacetat.
Die Enzymreaktion gemäß der vorliegenden Erfindung wird üblicherweise bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 60ºC durchgeführt. Hinsichtlich der Enzymstabilität und der Reaktionsgeschwindigkeit beträgt die Reaktionstemperatur vorzugsweise 30 bis 40ºC.
Weiter ist es im Hinblick auf die Vermeidung einer Oxidation des Thiophenols bevorzugt, die Reaktion in einer anaeroben Atmosphäre durchzuführen. Die Reaktion kann ohne Rühren oder unter Rühren mittels eines Batch- Verfahrens oder mittels eines kontinuierlichen Verfahrens, bei dem das Enzym in immobilisierter Form eingesetzt wird, durchgeführt werden. Wenn die Reaktion bei einer Thiophenolkonzentration von 5 Gew.-% oder höher durchgeführt wird, führt ein mäßiges Rühren zu einer besseren Reaktionsausbeute.
Wenn die Reaktion bei einer Thiophenolkonzentration von 5 Gew.-% bis 10 Gew.-% durchgeführt wird, ist es wünschenswert, die Reaktion so durchzuführen, daß die Rührkraft für das Reaktionsgemisch 20 KW/m³ oder weniger beträgt, vorzugsweise innerhalb eines Bereiches von 5 KW/m³ bis 16 KW/m³ liegt.
Die Reaktionszeit liegt üblicherweise zwischen 5 und 40 Stunden.
S-Phenyl-L-cystein weist eine geringe Löslichkeit in Wasser auf, so daß es normalerweise mit fortschreitender Enzymreaktion zunehmend in Form von Kristallen aus dem Reaktionsgemisch ausfällt.
Um S-Phenyl-L-cystein in gereinigter Form aus dem Reaktionsgemisch nach Beendigung der Enzymreaktion zu erhalten, wird der pH-Wert des Reaktionsgemisches mit einer geeigneten Säure, wie beispielsweise Salzsäure oder Schwefelsäure, auf einen sauren Bereich eingestellt, so daß die ausgefallenen Kristalle im Reaktionsgemisch aufgelöst werden. Das Reaktionsgemisch wird dann einer Adsorptionsbehandlung mit Aktivkohle unterzogen, wodurch die Mikroorganismuszellen oder das Enzym und das unumgesetzte Thiophenol abgetrennt werden. Eine nachfolgende pH-Verschiebung mit einem geeigneten Alkali bewirkt das Ausfällen von S-Phenyl-L-cystein in Form von Kristallen, so daß das S-Phenyl-L-cystein, beispielsweise durch Filtration, leicht isoliert werden kann.
Wenn das Reaktionsgemisch nach Beendigung der Reaktion angesäuert wird, um die Kristalle von S-Phenyl-L-cystein aufzulösen, ist es bevorzugt, den pH-Wert auf saure Bedingungen von pH 1,5 oder niedriger einzustellen, um die Löslichkeit von S-Phenyl-L-cystein zu verbessern; beispielsweise kann dessen Konzentration 1 Gew.-% oder höher sein, und der volumetrische Wirkungsgrad kann verbessert werden.
Um das Enzym oder die Mikroorganismuszellen oder die Zellbestandteile aus dem Mikroorganismus und unumgesetztes Thiophenol abzutrennen, nachdem die aus dem Reaktionsgemisch ausgefallenen Kristalle von S- Phenyl-L-cystein aufgelöst wurden, wird eine Adsorptionsbehandlung mit Aktivkohle durchgeführt. In diesem Fall können das Enzym oder die Mikroorganismuszellen oder die Zellbestandteile aus dem Mikroorganismus und das unumgesetzte Thiophenol aus der Lösung von S-Phenyl-L-cystein abgetrennt werden, indem Aktivkohle zu der Lösung, in der das S-Phenyl-Lcystein unter sauren Bedingungen aufgelöst wurde, zugegeben wird, und das erhaltene Gemisch vorzugsweise auf 20 bis 60ºC erwärmt wird, um das Enzym oder die Mikroorganismuszellen oder die Zellbestandteile aus dem Mikroorganismus und das unumgesetzte Thiophenol an der Aktivkohle zu adsorbieren, und indem anschließend ein Trennverfahren, wie beispielsweise Filtration oder Zentrifugieren, durchgeführt wird. Verwendbare Beispiele für die Aktivkohle umfassen "PM-SX", "PM-PA", "PM-KI", "PM-KS" und "PM- AA" (Handelsnamen, Produkte von Mitsui Pharmaceutical, Inc.); "WPH", "PCB-G" und "ADP" (Handelsnamen, Produkte von Calgon Far East Co., Ltd.); "Shirasagi A", "Shirasagi M", "Shirasagi C" und "Carbolaphin" (Handelsnamen, Produkte von Takeda Pharmaceutical Industries, Ltd.); und "Taiko S Type" und "Taiko K Type" (Handelsnamen; Futamura Chemical Industries Co., Ltd.). Aktivkohle wird üblicherweise in einer Menge von 0,5 bis 6 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht des Reaktionsgemisches, zugegeben. Es ist jedoch möglich, die Menge an Aktivkohle in Übereinstimmung mit der Menge an Enzymen oder Mikroorganismuszellen, die als Tryptophansynthasequelle in der Enzymreaktion verwendet werden, und mit der Menge an unumgesetztem Thiophenol zu variieren.
Es ist bevorzugt, die Aktivkohle in einer Menge von bis zur 3-fachen Menge an S-Phenyl-L-cystein zum Reaktionsgemisch zuzugeben. Wenn die Menge an Aktivkohle höher ist als die 3-fache Menge an S-Phenyl-L-cystein, tritt auch eine merkliche Adsorption von S-Phenyl-L-cystein an Aktivkohle ein.
Unumgesetztes Thiophenol verbleibt noch in der Lösung, in der die während der Enzymreaktion ausgefallenen Kristalle von S-Phenyl-L-cystein unter sauren Bedingungen aufgelöst wurden. Ein Teil des unumgesetzten Thiophenols wird bei der Aktivkohlebehandlung an der Aktivkohle adsorbiert, wobei aber das unumgesetzte Thiophenol nicht vollständig durch Adsorption abgetrennt wird. Es ist jedoch möglich, das verbleibende unumgesetzte Thiophenol abzutrennen, wenn die Lösung während der Aktivkohlebehandlung mit Luft oder Sauerstoff belüftet wird, da das Thiophenol, das nicht an der Aktivkohle adsorbiert ist, zu einem unlöslichen Feststoff oxidiert wird, und somit durch Filtrieren abgetrennt werden kann. Insbesondere kann die Belüftung bei einer Temperatur von 20ºC oder höher als 20ºC eine höhere Effizienz bei der Oxidation von Thiophenol bewirken. Die bevorzugte Belüftungsrate des Gases in die Lösung kann im Bereich von 0,01 bis 6,0 Vol./Vol. pro Stunde liegen.
Hinsichtlich der Temperatur während der Aktivkohlebehandlung ist es weiterhin bevorzugt, die Aktivkohlebehandlung bei 20 bis 60ºC durchzuführen, da die Racemisierung von S-Phenyl-L-cystein signifikant wird, wenn die Temperatur 60ºC übersteigt. Insbesondere ist es erforderlich, einen unnötig langen Kontakt mit Aktivkohle in der Wärme zu vermeiden, da die Racemisierung gefördert wird, wenn in Gegenwart von Aktivkohle erwärmt wird. Aus dem oben genannten Grund liegt die Kontaktzeit mit Aktivkohle vorzugsweise bei 12 Stunden oder weniger.
Um S-Phenyl-L-cystein als Kristalle aus der sauren Lösung von S-Phenyl-Lcystein, aus der das Enzym oder die Mikroorganismuszellen oder die Zellbestandteile aus dem Mikroorganismus und das unumgesetzte Thiophenol abgetrennt wurden, zu erhalten, kann eine Kristallisation durch Zugabe eines geeigneten Alkalis durchgeführt werden. Wenn der pH-Wert während der Kristallisation auf 2,5 bis 6,0 eingestellt wird, werden rein weiße Kristalle erhalten. Wenn die Kristallisation bei pH 6 bis pH 7 durchgeführt wird, können die erhaltenen Kristalle eine leicht graue bis gelbe Farbe aufweisen. Verwendbare Beispiele für das Alkali für die pH-Verschiebung umfassen Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, wässriges Ammoniak, Kaliumpyrophosphat und Natriumpyrophosphat.
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend mit Hilfe der folgenden Beispiele im einzelnen beschrieben.
Im übrigen wurden die quantitativen Bestimmungen von S-Phenyl-L-cystein und L-Serin mit Hilfe der HPLC durchgeführt. Bedingungen für die HPLC- Analyse von S-Phenyl-L-cystein:
Säule: "Inertsil ODS-2" (Handelsname, Produkt von GL Sciences Inc.).
Mobile Phase: 8,6 mM KH&sub2;PO&sub4; (eingestellt mit Phosphorsäure auf pH 4)/CH&sub3;OH = 7/3
Temperatur: 40ºC
Flußrate: 1,0 ml/min
Nachweis: 254 nm UV
Bedingungen für die HPLC-Analyse von L-Serin:
Säule: "Shodex RSpak NN-814" (Handelsname, Produkt von Showa Denko K. K.).
Mobile Phase: 10 mM NH&sub2;PO&sub4; + 1,2 mM Phosphorsäure
Temperatur: 40ºC
Flußrate: 1,0 ml/min
Nachweis: Ortho-Phthalaldehyd("OPA")-Reagens
Ex = 365 nm, Em = 455 nm
Experiment 1
Escherichia coli MT-10242 (FERM BP-20), ein die Tryptophansynthase produzierendes Bakterium, wurde in einen mit Ansatz versehenen 500 ml- Kolben (Sakaguchi-Kolben) eingebracht, welcher 150 ml eines Kulturmediums mit der in Tabelle 1 gezeigten Zusammensetzung enthielt. Das Bakterium wurde dann 24 Stunden lang bei 30ºC unter Schütteln kultiviert. Das kultivierte Medium (600 ml - entspricht 4 Kolben) wurde in einen 20 I- Gefäßfermenter gegeben, in dem sich 10 l eines Kulturmediums mit der in Tabelle 2 gezeigten Zusammensetzung befanden, und anschließend wurde unter Belüftung bei 30ºC und pH 6,8 (kontrolliert mit konzentriertem wässrigem Ammoniak) 40 Stunden lang kultiviert, wobei nach und nach Glucose zugegeben wurde. Nach Beendigung der Kultivierung wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen, und die so erhaltenen feuchten Zelten wurden als Tryptophansynthasequelle verwendet.
Die L-Tryptophan-Bildungsaktivität, die S-Phenyl-L-cystein-Bildungsaktivität und die L-Serin-Abbauaktivität der Zellen wurden jeweils durch Veränderung des pH-Wertes des Reaktionsgemisches gemessen.
Diese Aktivitäten bei verschiedenen pH-Werten sind in Fig. 1 gezeigt. 1.

I. Verfahren zur Messung der L-Tryptophan-Bildungsaktivität

Hergestelltes Reagens 1: L-Serinlösungen
L-Serinlösungen mit verschiedenen pH-Werten im Bereich von 7 bis 11 wurden jeweils hergestellt, indem 10,6 g L-Serin in etwa 450 ml gereinigtem Wasser aufgelöst wurden, der pH-Wert der erhaltenen Lösung mit einer wässrigen Lösung von Kaliumhydroxid auf den entsprechenden pH-Wert eingestellt wurde, und anschließend gereinigtes Wasser zugegeben wurde, um ein Gesamtvolumen von 500 ml zu erhalten.
Hergestelltes Reagens 2: Pyridoxalphosphat("PLP")-Lösungen.
PLP-Lösungen mit verschiedenen pH-Werten im Bereich von 7 bis 11 wurden jeweils hergestellt, indem 50 mg Pyridoxalphosphat in etwa 950 ml gereinigtem Wasser aufgelöst wurden, der pH-Wert der erhaltenen Lösung mit einer wässrigen Lösung von Kaliumhydroxid auf den entsprechenden pH- Wert eingestellt wurde, und anschließend gereinigtes Wasser zugegeben wurde, um ein Gesamtvolumen von 1000 ml zu erhalten.
Zellsuspension:
Feuchte Zellen (1 g) wurden in 10 ml einer PLP-Lösung, deren pH-Wert auf 8,5 eingestellt worden war, suspendiert.
Meßverfahren:
Indol (0,4 g) wurde in einen 100 ml-Erlenmeyer-Kolben eingewogen. "Triton X-100" (1 ml) wurde zugegeben und anschließend erhitzt, um das Indol aufzulösen. Das erhaltene Gemisch wurde mit 18 ml einer der L-Serinlösungen und 0,5 ml einer der PLP-Lösungen versetzt. Nachdem das so erhaltene Gemisch 5 Minuten lang bei 35ºC inkubiert wurde, wurden 0,5 ml Zellsuspension zugegeben, und anschließend wurde unter Schütteln 60 Minuten lang inkubiert. Sechzig Minuten später wurden 10 ml 5 mol/l (5 N) NaOH zugegeben, um die Reaktion zu beenden, und 0,5 ml Phosphorsäure wurde zugegeben, um das Reaktionsgemisch zu neutralisieren. Ein Teil (1 ml) der Lösung wurde als Probe in ein Mikroröhrchen gegeben. Dichlormethan (1 ml) wurde zugegeben, und anschließend wurde gründlich durchgemischt. Das erhaltene Gemisch wurde dann zentrifugiert, um eine wässrige Phase und eine organische Phase zu erhalten. Die Konzentration von L-Tryptophan in der wässrigen Lösung wurde mittels HPLC quantitativ bestimmt. Die Bedingungen für die HPLC-Analyse von L-Tryptophan waren die gleichen wie die, die für die HPLC-Analyse von S-Phenyl-L-cystein angewandt wurden. Die Menge (g) an L-Tryptophan, die in einer Stunde pro Gramm getrockneter Zellen gebildet wurde, wurde als L-Tryptophan-Bildungsaktivität definiert.

II. Verfahren zur Messung der S-Phenyl-L-cystein-Bildungsaktivität

Hergestelltes Reagens 1: L-Serinlösungen
L-Serinlösungen mit verschiedenen pH-Werten im Bereich von 7 bis 11 wurden jeweils hergestellt, indem 15,5 g L-Serin und 5,6 g Ammoniumchlorid in ungefähr 450 ml gereinigtem Wasser aufgelöst wurden, der pH-Wert der erhaltenen Lösung mit einer wässrigen Lösung von Natriumhydroxid auf den entsprechenden pH-Wert eingestellt wurde, und anschließend gereinigtes Wasser zugegeben wurde, um ein Gesamtvolumen von 500 ml zu erhalten.
Hergestelltes Reagens 2: PLP-Lösungen
PLP-Lösungen mit verschiedenen pH-Werten im Bereich von 7 bis 11 wurden jeweils hergestellt, indem 50 mg Pyridoxalphosphat in etwa 15 ml gereinigtem Wasser aufgelöst wurden, der pH-Wert der erhaltenen Lösung mit einer wässrigen Lösung von Natriumhydroxid auf den entsprechenden pH- Wert eingestellt wurde, und anschließend gereinigtes Wasser zugegeben wurde, um ein Gesamtvolumen von 20 ml zu erhalten.
Zellsuspension:
Feuchte Zellen (1 g) wurden in 10 ml einer PLP-Lösung, deren pH-Wert auf 8,5 eingestellt worden war, suspendiert.
Meßverfahren:
In einen 100 ml-Erlenmeyer-Kolben wurden 19 ml einer der L-Serinlösungen und 0,2 ml einer der PLP-Lösungen gegeben. Thiophenol (0,5 ml) wurde zugegeben, und anschließend wurde 5 Minuten lang bei 35ºC inkubiert. Die Zellsuspension (0,5 ml) wurde zugegeben, und anschließend wurde 60 Minuten lang unter Schütteln inkubiert. Sechzig Minuten später wurde 1 ml 35%-ige Salzsäure zugegeben, um die Reaktion zu beenden, und die Konzentration an S-Phenyl-L-cystein in der Lösung wurde mittels HPLC quantitativ bestimmt. Die Menge (g) an S-Phenyl-L-cystein, die in einer Stunde pro Gramm getrockneter Zellen gebildet wurde, wurde als S-Phenyl-L-cystein- Bildungsaktivität definiert.

III. Verfahren zur Messung der L-Serin-Abbauaktivität

Hergestelltes Reagens 1: L-Serinlösungen
L-Serinlösungen mit verschiedenen pH-Werten im Bereich von 7 bis 11 wurden jeweils hergestellt, indem 15,5 g L-Serin in etwa 450 ml gereinigtem Wasser aufgelöst wurden, der pH-Wert der erhaltenen Lösung mit einer wässrigen Lösung von Natriumhydroxid auf den entsprechenden pH-Wert eingestellt wurde, und anschließend gereinigtes Wasser zugegeben wurde, um ein Gesamtvolumen von 500 ml zu erhalten.
Hergestelltes Reagens 2: PLP-Lösungen
PLP-Lösungen mit verschiedenen pH-Werten im Bereich von 7 bis 11 wurden jeweils hergestellt, indem 50 mg Pyridoxalphosphat in etwa 15 ml gereinigtem Wasser aufgelöst wurden, der pH-Wert der erhaltenen Lösung mit einer wässrigen Lösung von Natriumhydroxid auf den entsprechenden pH- Wert eingestellt wurde, und anschließend gereinigtes Wasser zugegeben wurde, um ein Gesamtvolumen von 20 ml zu erhalten.
Zellsuspension:
Feuchte Zellen (1 g) wurden in 10 ml einer PLP-Lösung, deren pH-Wert auf 8,5 eingestellt worden war, suspendiert.
Meßverfahren:
In einen 100 ml-Erlenmeyer-Kolben wurden 19 ml einer der L-Serinlösungen und 0 2 ml einer der PLP-Lösungen gegeben, und anschließend wurde 5 Minuten lang bei 35ºC inkubiert. Die Zellsuspension (0,5 ml) wurde zugegeben und anschließend wurde 60 Minuten lang unter Schütteln inkubiert. Sechzig Minuten später wurde 1 ml 35%-ige Salzsäure zugegeben, um die Reaktion zu beenden, und die Konzentration an L-Serin in der Lösung wurde mittels HPLC quantitativ bestimmt. Die Menge (g) an L-Serin, die in einer Stunde pro Gramm getrockneter Zellen abgebaut wurde, wurde als L-Serin- Abbauaktivität definiert.

Tabelle 1

Rindfleischextrakt 10 g
Polypepton 10 g
NaCl 5 g
destilliertes Wasser 11 g
mit KOH auf pH 7 eingestellt Tabelle 2
Experiment 2
Zu einer sauren Lösung von S-Phenyl-L-cystein, die durch Auflösen von 4,5 g S-Phenyl-L-cystein in 100 ml 3%-iger Salzsäure erhalten wurde, wurde Aktivkohle "PMSX" (Handelsname, Produkt von Mitsui Pharmaceuticals, Inc.) in einer Konzentration von 1,7% zugegeben, um ein Gemisch mit zugegebener Aktivkohle herzustellen. Dieses Verfahren wurde noch zweimal wiederholt, um insgesamt drei Gemische mit zugegebener Aktivkohle zu erhalten. Diese wurden 20 Stunden lang jeweils auf 50ºC, 70ºC und 80ºC erhitzt. Weiterhin wurde eine Lösung, welche genauso, aber ohne Aktivkohle hergestellt wurde, in gleicher Weise 20 Stunden lang auf 80ºC erhitzt. Ein Teil eines jeden Gemisches oder einer jeden Lösung wurde regelmäßig als Probe entnommen, um die optische Reinheit von S-Phenyl-L-cystein zu messen. Veränderungen in der optischen Reinheit mit der Zeit sind in Fig. 2 gezeigt. Verfahren zur Analyse der optischen Reinheit von S-Phenyl-L-cystein Ausgehend von den Peakflächen des D-Isomers und L-Isomers von S- Phenyl-L-cystein in einer HPLC-Analyse, die unter Verwendung einer Racemattrennungs-Chromatographiesäule "TSKgel Enantio L1" (Handelsname, Produkt von TOSOH CORPORATION) durchgeführt wurde, wurde die optische Reinheit gemäß der folgenden Formel bestimmt:
Optische Reinheit (%) = L(Fläche) - D(Fläche) / L(Fläche) + D(Fläche) · 100
Bedingungen für die HPLC-Racemattrennung:
Säule: "TSKgel Enantio L1" (Handelsname, Produkt von TOSOH CORPORATION)
Mobile Phase: 0,5 mM CuSO&sub4;/Acetonitril = 80/20
Temperatur: 40ºC
Flußrate: 0,7 ml/min
Nachweis: 254 nm UV

Beispiel 1

Eine Zellmasse von Escherichia coli MT-10242 wurde in gleicher Weise wie in Experiment 1 erhalten. Die so erhaltenen Zellen hatten eine Tryptophansynthaseaktivität, die ausreichte, um 5 g Tryptophan in einer Stunde pro Gramm trockener Zellen zu synthetisieren.
Zu 500 g einer wässrigen Lösung, die 3% L-Serin, 3,1% Thiophenol, 1% Ammoniumchlorid und 25 ppm Pyridoxalphosphat enthielt und einen pH- Wert von 9,0 (eingestellt mit NaOH) hatte, wurden die zentrifugierten Zellen in einer Konzentration von 0,7%, berechnet auf der Grundlage der trockenen Zellen, zugegeben.
Das erhaltene Gemisch wurde 15 Stunden lang unter Stickstoffatmosphäre bei 35ºC gerührt. Die molare Ausbeute des so gebildeten S-Phenyl-Lcysteins betrug 85%, bezogen auf L-Serin.
Nach Beendigung der Reaktion wurde konzentrierte Salzsäure zum Reaktionsgemisch zugegeben, um dessen pH-Wert auf 0,5 einzustellen. 10 g Aktivkohle ("PM-SX", Handelsname, Produkt von Mitsui Pharmaceuticals, Inc.) wurden zugegeben, und anschließend wurde 3 Stunden lang auf 50ºC erhitzt. Während des Erhitzens wurde das Reaktionsgemisch bei einer mittleren Belüftungsrate von 0,1 l/h mit Luft begast. Es wurde dann filtriert, und das Filtrat wurde mit NaOH auf pH 3 eingestellt. Nach dem Abkühlen des Filtrats auf WC wurde filtriert, um die Kristalle von S-Phenyl-L-cystein abzutrennen. Nach dem Trocknen der Kristalle wurden 20 g S-Phenyl-L-cystein erhalten.
Eine Elementaranalyse der so erhaltenen Kristalle wurde durchgeführt. Gefunden: C: 54,48%, H: 5,69%, N: 7,64%, S. 15,57% (berechnet: C: 54,82%, H: 5,58%, N: 7,11%, S. 16,24%).
Im Ergebnis einer Massenspektrum-Analyse wurde m/z = 197 als Molekülpeak nachgewiesen. Bei einer IR-Spektrum-Analyse wurden Streckschwingungen von NH&sub3;&spplus; und COOH bei 2900 cm&supmin;¹ und höher beobachtet.
Bei etwa 1620-1200 cm&supmin;¹ wurden Streck- und Deformationsschwingungen von NH&sub3;&spplus;, COO&supmin; und Alkylgruppen beobachtet, wobei diese Schwingungen für eine Aminosäure spezifisch sind. Weiterhin wurden out-of-plane- Deformationsschwingungen eines monosubstituierten Benzols bei 735 und 689 cm&supmin;¹ beobachtet.
Die Ergebnisse der Signalzuordnung eines NMR-Spektrums waren in Übereinstimmung mit der Struktur von S-Phenyl-L-cystein.
Weiterhin wurde das Vorliegen einer C-S-Bindung mit Hilfe einer Ramanspektrum-Analyse bestätigt.
Darüber hinaus wurde mit Hilfe der HPLC-Analyse unter Verwendung der Racemattrennungs-Chromatographiesäule "TSKgel Enantio L1" (Handelsname; Produkt von TOSOH CORPORATION) bestätigt, daß die Kristalle die Stereostruktur des L-Isomers aufwiesen und eine optische Reinheit von 100% hatten.
Nach den Ergebnissen der oben genannten instrumentellen Analysen wurde bestätigt, daß die so erhaltenen Kristalle S-Phenyl-L-cystein waren.

Beispiel 2

Eine Zellmasse von Escherichia coli MT-10242 wurde in gleicher Weise wie in Experiment 1 erhalten. Zu 500 g einer wässrigen Lösung, die 6% L-Serin, 6,2% Thiophenol und 25 ppm Pyridoxalphosphat enthielt und einen pH-Wert von 9,5 (eingestellt mit NaOH) hatte, wurden Zellen bis zu einer Konzentration von 0,8%, berechnet auf der Grundlage der trockenen Zellen, zugegeben. Das erhaltene Gemisch wurde 20 Stunden lang bei 35ºC unter Stickstoffatmosphäre gerührt. Während des Rührens wurde die Rührkraft auf 16 W pro Liter des Reaktionsgemisches eingestellt. Die molare Ausbeute des so gebildeten S-Phenyl-L-cysteins betrug 87%, bezogen auf das eingesetzte L-Serin.
Nach Beendigung der Reaktion wurde konzentrierte Salzsäure zum Reaktionsgemisch zugegeben, um dessen pH-Wert auf 0,5 einzustellen. Gereinigtes Wasser (500 g) wurde anschließend zugegeben, um die ausgefallenen Kristalle von S-Phenyl-L-cystein vollständig aufzulösen. 10 g Aktivkohle ("PM-SX", Handelsname, Produkt von Mitsui Pharmaceuticals, Inc.) wurden zugegeben, und anschließend wurde 3 Stunden lang auf 50ºC erhitzt. Wäh rend des Erhitzens wurde das Reaktionsgemisch mit Luft bei einer mittleren Belüftungsrate von 1,0 l/h begast. Anschließend wurde filtriert, und das Filtrat wurde mit NaOH auf pH 3 eingestellt. Nach Abkühlen des Filtrats auf 10ºC wurde filtriert, um die Kristalle von S-Phenyl-L-cystein abzutrennen. Nach dem Trocknen der Kristalle wurden 40 g S-Phenyl-L-cystein erhalten. Die optische Reinheit betrug 100%.

Beispiel 3

Eine Zellmasse von Escherichia coli MT-10242 wurde in gleicher Weise wie in Experiment 1 erhalten.
Zu 500 g einer wässrigen Lösung, die 10% L-Serin, 10% Thiophenol und 25 ppm Pyridoxalphosphat enthielt und einen pH-Wert von 10,0 (eingestellt mit NaOH) hatte, wurden die Zellen bis zu einer Konzentration von 0,9%, berechnet auf der Grundlage der trockenen Zellen, zugegeben. Das erhaltene Gemisch wurde 20 Stunden lang bei 35ºC unter Stickstoffatmosphäre gerührt. Während des Rührens wurde die Rührkraft auf 10 W pro Liter des Reaktionsgemisches eingestellt. Die molare Ausbeute des so gebildeten S- Phenyl-L-cysteins betrug 85%, bezogen auf das eingesetzte L-Serin.

Beispiel 4

Eine Zellmasse von Escherichia coli MT-10242 wurde in gleicher Weise wie in Experiment 1 erhalten.
Zu 500 g einer wässrigen Lösung, die 3% L-Serin, 3,1% Thiophenol und 25 ppm Pyridoxalphosphat enthielt und einen pH-Wert von 10,5 (eingestellt mit NaOH) hatte, wurden die Zellen bis zu einer Konzentration von 0,7%, berechnet auf der Grundlage der trockenen Zellen, zugegeben. Das erhaltene Gemisch wurde 15 Stunden lang bei 35ºC unter Stickstoffatmosphäre gerührt. Die molare Ausbeute des so erhaltenen S-Phenyl-L-cysteins betrug 70%, bezogen auf das eingesetzte L-Serin.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von S-Phenyl-L-cystein durch Reaktion von Thiophenol und L-Serin unter der Einwirkung von Tryptophansynthase, wobei diese Reaktion in wäßriger Lösung bei einem pH-Wert im Bereich von 9,0 bis 10,5 durchgeführt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei diese Reaktion in einer wäßrigen Lösung bei einem pH-Wert von 9,0 bis 10,0 durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei diese Reaktion bei einer Temperatur von 20 bis 60ºC durchgeführt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Tryptophansynthase diejenige ist, die aus Escherichia coli, wie beispielsweise Escherichia coli PERM BP-20, oder aus Neurospora crassa, wie beispielsweise Neurospora crassa ATCC 14692 erhalten wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Konzentration von L-Serin in dieser wäßrigen Lösung 1 bis 10 Gew.-% beträgt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Konzentration von Thiophenol in dieser wäßrigen Lösung nicht mehr als 10 Gew.-% beträgt.

7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei diese Reaktion in Gegenwart von 0,1 bis 100 ppm Pyridoxalphosphat durchgeführt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei diese Reaktion in Gegenwart eines Ammoniumsalzes bei einer Konzentration von 0,1 bis 5 Gew.-% durchgeführt wird.

9. Verfahren zur Herstellung von S-Phenyl-L-cystein, welches die folgenden Schritte umfaßt:

(a) Bereitstellen eines enzymatischen Reaktionsgemisches durch Reaktion von Thiophenol und L-Serin unter der Einwirkung von Tryptophansynthase in einer wäßrigen Lösung mit einem pH-Wert im Bereich von 9,0 bis 10,5, wobei ein Reaktionsgemisch erhalten wird, das Kristalle von S-Phenyl-L-cystein enthält;

(b) Einstellen des pH-Wertes des enzymatischen Reaktionsgemisches, das die Kristalle von S-Phenyl-L-cystein enthält, auf einen sauren Bereich, so daß die Kristalle von S-Phenyl-L-cystein, die aus diesem Reaktionsgemisch ausgefallen sind, aufgelöst werden;

(c) Zugabe von Aktivkohle zu diesem Reaktionsgemisch, in welchem das S-Phenyl-L-cystein gelöst ist, und anschließendes Belüften des erhaltenen Reaktionsgemisches mit einem sauerstoffhaltigem Gas, wobei Feststoffe und unumgesetztes Thiophenol an der Aktivkohle adsorbiert werden und unumgesetztes Thiophenol, das nicht an der Aktivkohle adsorbiert ist, unlöslich gemacht wird;

(d) Abtrennen der Aktivkohle und der unlöslich gemachten Feststoffe aus dem Reaktionsgemisch, um eine Lösung von S-Phenyl-L-cystein zu erhalten; und

(e) Zugabe von Alkali zur Lösung von S-Phenyl-L-cystein, um Kristalle von S-Phenyl-L-cystein auszufällen, und nachfolgende Gewinnung der Kristalle von S-Phenyl-L-cystein.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei der pH-Wert der Lösung von S-Phenyl- L-cystein im Schritt (e) auf einen Bereich von 2, 5 bis 6,0 eingestellt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 9, wobei in Schritt (b) der pH-Wert auf 1, 5 oder niedriger eingestellt wird.