DE69608462T2

DE69608462T2 - Mikrosatellitensequenzen zur bestimmung des genotyps von hunden

Info

Publication number: DE69608462T2
Application number: DE69608462T
Authority: DE
Inventors: Jan Dvorak; Joy Halverson; Tamara Stevenson
Original assignee: Perkin Elmer Corp
Current assignee: Applied Biosystems Inc
Priority date: 1995-09-28
Filing date: 1996-09-27
Publication date: 2000-09-14
Anticipated expiration: 2016-09-28
Also published as: JP2001512961A; EP0857219A1; AU7248196A; CA2233319C; CA2233319A1; WO1997013876A1; JP2009005698A; JP2007330260A; DE69608462D1; AU699308B2; EP0857219B1; ATE193061T1

Description

MIKROSATELLITEN-SEQUENZEN ZUR BESTIMMUNG DES GENOTYPS VON HUNDEN

Diese Erfindung betrifft die Bestimmung des Genotyps von Hunden.
Die zunehmende Möglichkeit, die genetische Zusammensetzung einzelner Lebewesen unterschiedlicher Spezies zu untersuchen, ermöglichte die Entwicklung einer Anzahl neuer Techniken. Der Nachweis des genetischen Polymorphismus dient der Unterscheidung von Individuen, dem Abstammungsnachweis, der gerichtsmedizinischen Untersuchung, der Analyse von Verwandtschaftsbeziehungen zwischen Individuen und der Kartierung von interessierenden Genen, die mit den Mikrosatelliten-Repeats verbunden sind.
Mikrosatelliten sind vollkommene, unvollkommene oder vermischte Anordnungen von hintereinanderliegenden wiederholten Nukleotidsequenzen, die zwischen sonst einzigartigen Nukleotidsequenzen liegen. Mikrosatelliten-Repeats sind typischerweise 1 bis 6 Basenpaare (bp) lang. Die Mikrosatelliten-Repeat-Anordnungen unterscheiden sich in der Anzahl an Wiederholungen von 6 bis 30 oder mehr im Menschen. Jedoch sind die längeren Repeat- Anordnungen weniger häufig isoliert. Mikrosatelliten können aus einfachen Wiederholungen mit nur einer nicht-unterbrochenen wiederholten Sequenz, unvollkommenen Wiederholungen mit zwei identischen Wiederholungen, die durch einen kleinen Zwischenraum von nichtwiederholten Nukleotiden getrennt sind, oder aus vermischten Wiederholungen mit mehreren verschiedenen wiederholten Sequenz-Typen bestehen (Weber, 1990). In einem Individuum kann jeder spezifische chromosomale Mikrosatelliten-Locus in der Anzahl an vorhandenen Wiederholungen abweichen.
Im allgemeinen verwendete Verfahren zur genetischen Kartierung mittels Mikrosatelliten genießen den Vorteil der Längenunterschiede unter den Individuen (Weber und May, 1989). Unter Zuhilfenahme der Nukleotidsequenz des klonierten Mikrosatellitenbereichs und seiner flankierenden Regionen werden Oligonukleotid-Primer für die PCR entworfen, die an einzigartige, die Repeats flankierende Sequenzen hybridisieren. Die Primer können so nah oder fern wie gewünscht von den Mikrosatelliten gewählt werden, wobei die einzige Beschränkung die sich ergebende Größe des PCR-Produkts für die nachfolgende Analyse ist.
Ein Nachweis und eine Größenbestimmung der PCR-Produkte eines spezifischen Mikrosatelliten-Locus kann auf verschiedene Weise erfolgen. Bei dem zuerst beschriebenen Verfahren werden die PCR-Produkte mit ³²P markiert, mittels denaturierender Polyacrylamid-Gelelektrophorese fraktioniert und durch Autoradiographie sichtbar gemacht. Alternativ werden die PCR-Produkte mit einem Fluorochrom markiert und auf einem automatisierten DNA- Sequenziergerät aufgetrennt. Ein weiteres Verfahren trennt die PCR-Produkte durch Kapillarelektrophorese, was den Vorteil einer viel größeren Geschwindigkeit im Vergleich zur Acrylamid-Gelelektrophorese bietet, während die Genauigkeit der Größenbestimmung erhalten bleibt (Buttler et al., infra).
Welches Verfahren auch zur Größenbestimmung der DNA-Fragmente verwendet wird, es gibt eine Grenze für die erreichbare Auflösung. Es wird noch schwieriger, eine Auflösung von 1-2 bp zu erhalten, falls die Fragmente größer als 500 bp sind, da der Größenunterschied zwischen den Produkten prozentual zur Größe des gesamten Fragments klein ist. Daher müssen PCR-Primer derartig konzipiert sein, daß die Produkte der Reaktion leicht voneinander unterscheidbar sind und ihre Größe genau bestimmt werden kann. Primer sind gewöhnlicherweise für die Schaffung von PCR-Produkten einer Größe von 50 bis 500 bp konzipiert. In Zukunft könnten Verfahren entwickelt werden, um Fragmente einer Größe von 1 kb oder noch größer genau aufzutrennen.
Bisher wurden viele polymorphe Dinukleotid-Mikrosatelliten, gewöhnlicherweise mit dem (CA)n-Motiv aus dem Genom von Hunden Isoliert (Holmes et al., 1993; Ostrander et al., 1993). Jedoch wurden außer den auf Dinukleotid-Motiven basierenden nur wenig polymorphe Milkrosatelliten isoliert. Im Zusammenhang mit der Verwendung von auf Dinukleotid- Motiven basierenden Mikrosatelliten gibt es mehrere Schwierigkeiten. Ein Problem ist die inhärente Schwierigkeit der reproduzierbaren Größenbestimmung, aufgrund der hohen Auflösung, die für eine genaue Bestimmung der Größe der von den Dinukleotid-Repeats abstammenden PCR-Produkten nötig ist. Ein weiteres Hindernis ist das Auftreten von sogenannten "Stotter"-Banden, die während der PCR aufgrund der "slipped-strand"-Fehlpaarung gebildet werden, was sich besonders bemerkbar macht, wenn Mikrosatelliten mit Dinukleotid-Motiven verwendet werden. Diese künstlichen Banden, die in 2 bp-Intervallen unter der Bande mit der richtigen Größe auftreten, können eine Bestimmung der Allelgröße in vielen Fällen schwierig machen.
Aufgrund der inhärenten Schwierigkeiten der Bestimmung mit Dinukleotid-Repeats gibt es einen Bedarf für Trinukleotid- und Tetranukleotid-Repeat-Polymorphismen. Die Charakterisierung derartiger Polymorphismen könnte bei der automatisierten und standardisierten Bestimmung des Genotyps hilfreich sein.

Relevante Literatur

Die Erstellung einer genetischen Kopplungskarte beim Menschen mit Hilfe von Restriktions- Fragment-Längen-Polymorphismen wird in Botstein et al., 1980, Amer. J. Hum. Genet. 32: 314-331, beschrieben. DNA-Bestimmung und genetische Kartierung mit trimeren und tetrameren Tandern-Wiederholungen wird von Edwards et al., 1991, Amer. J. Hum. Genet. 49: 746-756, beschrieben. Der Informationsgehalt menschlicher (dC-dA)n(dG-dT)n-Polymorphismen wird von Weber, 1990, Genomics 7: 524-530, erörtert.
Intragenerische Amplifikation von Pferde-Mikrosatelliten-Markern mit Schwerpunkt auf dem Przewalski-Pferd wird von Breen et al., 1994, Anim. Genet. 25: 401-405, beschrieben. Marklund et al., 1994, Anim. Genet. 25: 19-23, beschreiben einen Abstammungstest und eine Kopplungsanalyse beim Pferd mit Hilfe eines Sets von hoch-polymorphen Mikrosatelliten.
Holmes und Sampson, 1993, Anim. Genet. 24: 289-292, und Rothuizen et al., 1994, Theor. Appl. Genet. 89: 403-406, beschreiben die Isolierung und Charakterisierung von Mikrosatelliten des Hundegenoms. Shibuya et al., 1993, Anim. Genet. 24: 245-348, beschreiben polymorphe Mikrosatelliten in einem kodierenden Segment des Androgenrezeptor-Gens beim Hund. Ostrander et al., 1993, Genomics 16: 207-213, identifizieren und charakterisieren Dinukleotid-Repeat (CA)n-Marker für eine genetische Kartierung von Hunden. Primmer und Matthews, 1993, Anim. Genet. 24: 332, identifizieren einen Tetranukleotid-Repeat-Polymorphismus am VIAS-D10-Locus bei Hunden. Shibuya et al., 1994, Anim. Genet. 25: 122, beschreiben eine polymorphe (AGGAAT)n-Tandem-Wiederholung in einem Intron des von Willebnand-Faktor-Gens beim Hund. Die Effektivität der Verwendung ko-dominanter polymorpher alleler Serien zur Untersuchung von Stammbäumen und der Unterscheidung von Geschwistern wird in Jamieson, 1994, Anim. Genet. 25: 37-44, erörtet.
Die schnelle Analyse einer kurzen Tandern-Wiederholung durch Kapillarelektrophorese wird von Buttler et al., 1994, BioTechniques 17: 1062-1070, beschrieben. Hague und Litt, 1993, Hum. Mol. Genet. 2: 411-415, untersuchen den Ursprung von "Schattenbanden", die bei der Typisierung von Dinukleotid-Repeat-Polymorphismen durch PCR auftreten. Knowles et al. 1992, Amer. J. Hum. Genet. 51: 905-909, beschreiben Techniken der Genkartierung mit Mikrosatelliten-Markern. Moore et al., 1991, Genomics 10: 654-660, beschreiben die Verwendung von heterologen PCR-Primer-Paaren in nahe verwandten Arten. Weber und May, 1989, Amer. J. Hum. Genet. 44: 388-396, beschreiben eine häufig auftretende Klasse menschlicher DNA-Polymorphismen, die mit der Polymerase-Kettenreaktion typisiert werden kann. Ziegle et al., 1992, Genomics 14: 1026-1031, stellen eine Anwendung der automatisierten DNA-Größenbestimmungstechnologie für die Bestimmung des Genotyps von Mikrosatelliten-Loci bereit.
Verfahren und Zusammensetzungen zur Durchführung diagnostischer Tests an Hundearten zur Unterscheidung von Individuen, für eine Abstammungsbestimmung, für gerichtsmedizinische Untersuchung, für die Analyse von Verwandtschaftsbeziehung zwischen Individuen und zur Kartierung interessierender Gene werden bereitgestellt. Einzigartige DNA-Sequenzen von Hunden mit internen Trinukleotid- und Tetranukleotid-Mikrosatelliten-Wiederholungen sind polymorphe Marker, die leicht auf Unterschiede zwischen Individuen getestet werden können. Der Nachweis dieser Polymorphismen erlaubt eine genotypische Bestimmung.
Erfindungsgemäß werden Verfahren zur genotypischen Bestimmung von Hunden mittels Analyse der Polymorphismen in der Anzahl an Mikrosatelliten-DNA-Wiederholungen bereitgestellt. Oligonukleotid-Primer, die zu den die Wiederholungen flankierenden Regionen komplementär sind, werden zur Amplifikation der internen Wiederholungssequenz verwendet. Die Anzahl der Repeats und daher der Abstand zwischen den Primern ist in einer Population hoch variabel. Der Längenpolymorphismus an einem einzigen Locus kann zur Kartierung von interessierenden Genen verwendet werden. Spezifische Primer und Sequenzen der Mikrosatelliten-Loci werden bereitgestellt, wobei die Loci einen hohen PIC-Wert in den Hunde-Populationen aufweisen. Die zusammengefaßte Information aus vielen Loci stellt ein Mittel zur Unterscheidung von Individuen bereit, selbst für durch Inzucht erzeugte Hunderassen, für eine Abstammungsanalyse, gerichtsmedizinische Untersuchung und die Analyse der Verwandtschaftsbeziehungen von Individuen.
Die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendbaren Mikrosatelliten-Loci besitzen die allgemeine Formel:
U(R)n U', worin
U und U' nicht-repetitive flankierende Sequenzen sind, die in einzigartiger Weise den jeweiligen Locus kennzeichnen, R ein Wiederholungsmotiv ist und n die Anzahl an Repeats darstellt. Der Locus wird auf einem Hundechromosom vorkommen. Spezifische Beispiele werden im Sequenzprotokoll in SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 20 gegeben.
Das Wiederholungsmotiv wird eine Länge von wenigstens 3 Nukleotiden besitzen, vorzugsweise 4 Nukleotide. Die interne Sequenz kann eine einfache Wiederholung sein wie (R)n oder eine komplexe Wiederholung wie (R)n(R')n'; (R)n(R')n'(R)n; (R)n'(R')n'(R")n", usw. In manchen komplexen Wiederholungen können ein oder mehrere Motive 6 Nukleotide lang sein. Die Motivsequenz wird im allgemeinen aus drei A oder drei T-Resten bestehen, wobei der vierte Rest G, C, A oder T ist. Spezifische Wiederholungssequenzen mit dieser Formel beinhalten AAAG, GAAA, AAAT, TTTC, CTTT und TTTA. Andere Wiederholungsmotive sind AAGG, GAAT, GAAG, GAAAA, AAAAAG, TGC und TTC.
Die flankierenden Sequenzen U und U' identifizieren in einzigartiger Weise den Mikrosatelliten-Locus im Hundegenom. U und U' werden wenigstens etwa 18 Nukleotide lang sein und können sich über mehrere Tausend Basen erstrecken. Die DNA mit U- und U'-Sequenzen kann im wesentlichen rein als Restriktionsfragmente, Amplifikationsprodukte, usw. erhalten werden und wird nicht als Sequenz eines intakten Chromosoms erhalten werden. Im allgemeinen wird die DNA im wesentlichen frei von anderen Nukleinsäuren erhalten, die keine Mikrosatelliten-Sequenz oder ein Fragment davon enthalten und wird im allgemeinen wenigstens etwa 50%, gewöhnlich wenigstens etwa 90% rein sein und wird typischerweise "rekombinant" sein, d. h. flankiert von einem oder mehreren Nukleotiden, mit denen sie normalerweise nicht auf einem natürlichen Chromosom verbunden sind.
Innerhalb der flankierenden Sequenzen U und U' werden Sequenzen für die Amplikations- Primer P und P' ausgewählt. Die genaue Zusammensetzung der Primer-Sequenzen ist nicht von entscheidender Bedeutung für die Erfindung, jedoch müssen sie unter stringenten Bedingungen an die flankierenden Sequenzen U bzw. U' hybridisieren. Bedingungen für eine stringente Hybridisierung sind bekannt, z. B. kann eine Lösung aus 5XSSC und 50% Formamid, inkubiert bei 42ºC, verwendet werden. Um die Auflösung der Größendifferenzen an dem Locus zu maximieren, ist eine Primer-Sequenz bevorzugt, die nahe an der Wiederholungssequenz liegt, gewöhnlich innerhalb wenigstens etwa 100 nt von der Wiederholung, insbesondere wenigstens etwa 50 nt und am besten wenigstens etwa 25 nt. Algorithmen für die Auswahl der Primer-Sequenzen sind bekannt und in käuflich erhältlichen Softwarepakten verfügbar. Die Primer werden an die komplementären Stränge der chromosomalen DNA hybridisieren und werden einen Ansatzpunkt in Richtung der Wiederholungssequenzen bilden, so daß die Wiederholungen amplifiziert werden. Die Primer werden gewöhnlich wenigstens etwa 18 nt lang sein und gewöhnlich nicht länger als etwa 35 nt. Primer können chemisch gemäß konventioneller Verfahren synthetisiert oder als Fragmente durch Restriktionsenzymverdau isoliert werden, usw.
Die Anzahl an Wiederholungen an einem spezifischen Locus, n, wird in einer Population polymorph sein, wodurch einzelne Unterschiede in der Länge der DNA gebildet werden, die zwischen U und U' liegt. Die Anzahl wird von wenigstens 1 Wiederholung bis etwa 150 Wiederholungen variieren. Nützliche Marker für die genotypische Bestimmung sind polymorph in der zu testenden Population. Der Polymorphismus an einem spezifischen Mikrosatelliten- Locus ist proportional zu der Variabilität der Werte n in der Population. Der PIC-Wert entspricht der Allel-Häufigkeit. Die Formel für die Berechnung des PIC-Wertes ist wie folgt:
worin pi und pj Allel-Häufigkeiten und n die Anzahl an Allelen darstellen. Der PIC-Wert eines in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Mikrosatelliten-Locus wird wenigstens etwa 0,35 für die zu testende Population betragen, gewöhnlich wenigstens etwa 0,5 für die Population:
Die Familie Canidae beinhaltet die Arten Hund, Wolf, Kojote, Fuchs und Schakal. Der Grad der Homologie zwischen diesen Arten ist hoch und in den meisten Fällen können die erfindungsgemäßen Verfahren mit irgendeiner der Hundespezies verwendet werden. Verschiedene Subpopulationen, wie Hunderassen, isolierte Wildpopulationen, usw. können durch starke Inzucht entstanden sein. Durch Inzucht entstandene Populationen besitzen eine geringere Anzahl an polymorphen Loci im Vergleich zu einer nach außen gezüchteten Population. Die Analyse vieler Loci ist einfach und falls ein spezifischer Mikrosatelliten-Locus innerhalb der Population unzureichende Information liefert, z. B. weil er einen PIC-Wert von weniger als etwa 0,25 in der zu testenden Population besitzt, werden die Daten aus diesem Locus nicht in die abschließende Bestimmung des Genotyps einbezogen.
Genomische DNA wird von dem zu testenden Individuum oder Individuen isoliert. DNA kann aus irgendeiner zellulären Quelle mit einem Zellkern isoliert werden, wie Blut, Haarschafte, Speichel, Schleim, Biopsiematerial, Feces, usw. Eine Amplifikation kann mit der DNA auseiner einzigen Zelle durchgeführt werden, obwohl es gut ist, wenigstens etwa 10&sup5; Zellen zu verwenden.
Die Primer werden zur Amplifikation der Region der genomischen DNA verwendet, die die Wiederholungen enthält. Zur Amplifikation kann Polymerase-Kettenreaktion, Ligase-Kettenreaktion, usw. verwendet werden. Geeignete Reaktionsbedingungen für eine PCR sind in Saiki, et al., 1985, Science 239: 487, und Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press 1989, Seiten 14.2-14.33, beschrieben. Verwendbare bekannte thermostabile Polymerasen beinhalten die aus Thermus aquaticus, Thermococcus litoralis, Pyrococcus furiosis und Thermus thermophilus isolierten. Eine Beschreibung der Ligase-Kettenreaktion (LCR) findet sich in der internationalen Patentanmeldung WO 93/02215.
Einfachheitshalber wird die Amplifikationsreaktion einen nachweisbaren Marker beinhalten. Geeignete Marker umfassen Fluorochrome wie Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Rhodamin, Texasrot, Phycoerythrin, Allophycocyanin, 6-Carboxyfluorescein (6-FAM), 2',7'-Dimethoxy- 4'5'-dichlor-6-carboxyfluorescein (JOE), 6-Carboxy-X-rhodamin (ROX), 6-Carboxy- 2',4',7',4,7-hexachlorfluorescein (HEX), 5-Carboxyfluorescein (5-FAM) oder N,N,N',N'- Tetramethyl-6-carboxyrhodamin (TAMRA), radioaktive Marker wie ³²P, ³&sup5;S, ³H, usw. Der Marker kann ein Zwei-Stufen-System sein, wobei die amplifizierte DNA mit Biotin, Haptenen, usw. verbunden wird, die einen Bindepartner mit einer hohen Affinität wie Avidin, spezifische Antikörper, usw. besitzen, der mit einem nachweisbaren Marker verbunden ist. Der Marker kann mit einem oder mehreren Primern verbunden sein. Alternativ können die in der Amplifikation verwendeten Nukleotide markiert sein und der Marker wird in das Amplifikationsprodukt eingebaut.
Mehrfache Amplifikation kann durchgeführt werden, wobei mehrere Primer-Sets im gleichen Reaktionsgefäß kombiniert werden. Dies ist besonders vorteilhaft, falls begrenzte Mengen der Proben-DNA für die Analyse erhältlich sind. Im allgemeinen wird jedes der Primer-Sets mit einem anderen Fluorochrom markiert sein.
Nach der Amplifikation werden die Produkte größenfraktioniert. Eine Größenfraktionierung kann mittels Gelelektrophorese erfolgen, insbesondere denaturierender Acrylamid- oder Agarose-Gelelektrophorese. Ein geeignetes System verwendet denaturierende Polyacrylamidgele in Kombination mit einem automatischen DNA-Sequenziergerät, vgl. Hunkapillar et al., 1991, Science 254: 59-74. Das automatische Sequenziergerät ist besonders nützlich bei einer vielfachen Amplifikation. Kapillarelektrophorese kann ebenfalls für die Fraktionierung verwendet werden. Ein Überblick über Kapillarelektrophorese findet sich in Landers et al., 1993, Bio Techniques 14, 98-111.
Die Größe des Amplifikationsprodukts ist proportional zur Anzahl der Wiederholung(en), die an dem durch die Primer spezifizierten Locus vorkommen. Die Größe wird in der Population polymorph sein und ist daher ein allelischer Marker für diesen Locus. In vielen Anwendungen wird eine Reihe von Loci analysiert, im allgemeinen wenigstens etwa 5, insbesondere wenigstens etwa 10. Die zusammengefaßte Information für die Reihe von Loci dient als ein "DNA-Fingerabdruck" für das Individuum.
Der DNA-Fingerabdruck erlaubt die Identifikation von verlorengegangenen oder gestohlenen Tieren und eine Bestätigung der Identität, wie sie für Ausstellungs- oder Zuchthunde erforderlich sein kann. Die Genotypen können zur Bewertung des Verwandtschaftsgrades zwischen zwei Individuen verglichen werden. Nahe verwandte Individuen besitzen mit einer höheren Wahrscheinlichkeit gleiche Allele als nicht verwandte Individuen (vgl. Chakraborti und Lin, 1993, Hum. Biol. 65: 875-895, und Hammond, 1994, Am. J. Hum. Genet. 55: 175- 189). Das Wissen über die Verwandtschaftsbeziehung ist für die Verbesserung von Zuchtprogrammen hilfreich und für die Erhöhung einer genetischen Diversität in einer Population. Hunde-DNA-Proben von Tatorten können für die Bereitstellung von gerichtlichen Beweismitteln verwendet werden.
Die Genotypen können für eine Abstammungsanalyse verwendet werden. Individuen können als mögliche Vater- oder Muttertiere eines in Frage stehenden Nachkommens durch Vergleich ihrer Genotypen ausgeschlossen werden. Jedes Individuum muß ein Allel aus seiner Mutter und eines aus seinem Vater an jedem Locus erhalten, so daß mögliche Eltern, die nicht an jedem Locus ein Allel mit dem in Frage stehenden Individuum teilen, von der Elternschaft ausgeschlossen werden können. Falls ein Set von Mikrosatelliten-Markern für eine Abstammungsanalyse verwendet wird, ist es wichtig zu wissen, wie gut sie in Bezug auf den Nachweis einer falschen Elternschaft sind. Die Formel für Elternschafts-Ausschluß (PE) ergibt die Möglichkeit, daß eine gegebene Serie von ko-dominanten Allelen falsche Eltern nachweisen würde, Jamieson, 1994, Anim. Genet. 25: 37-44. Der PE kann für jeden Locus errechnet werden und für alle der zusammengefaßten Loci.
Weitere Verwendungen der erfindungsgemäßen Verfahren beinhalten die Kartierung von interessierenden Genen wie Gene, die Erbkrankheiten, erwünschte Merkmale, usw. steuern, die genetisch mit den Marker-Loci verbunden sind. Die Isolierung und Kartierung von vielen Mikrosatelliten-Markern kann zur Erstellung einer genetischen Karte des Hundegenoms verwendet werden; diese Karte wird bei der Aufklärung der Genetik der Morphologie und des Verhaltens bei Hundezüchtungen und zum Verständnis genetischer Erkrankungen, die bei Menschen und Hunden auftreten, beitragen. Menschen, die am Tierschutz beteiligt sind, können die Information über die Genotypen verwenden, um die genetische Diversität für Spezies mit einer begrenzten Populationsgröße zu maximieren.
Ein Kit kann zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren bereitgestellt werden. Ein derartiger Kit wird wenigstens ein Set der spezifischen Primer, die für die Amplifikation der Mikrosatelliten-DNA-Wiederholungen verwendet werden, enthalten, und wird vorzugsweise eine Reihe von Primern enthalten. Die Primer können mit einem detektierbaren Marker verbunden werden, gewöhnlich wird eine Gruppe von vier Primern vier unterschiedliche Marker tragen, um eine vielfache Amplifikation zu ermöglichen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Gruppe der Primer aus den im experimentellen Teil mit SEQ ID NO: 21 bis SEQ ID NO: 60 beschriebenen ausgewählt sein.
Die nachstehenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung und sind nicht begrenzend aufzufassen.

Isolierung genomischer DNA und Konstruktion der Bibliothek

Isolierung genomischer DNA: Ein Hoden eines Haushundes mit einem Gewicht von etwa 5 g wurde in flüssigem Stickstoff eingefroren und mit einem Mörser und Pistill zu einem feinen Pulver vermahlen. 30 ml Extraktionspuffer (10 mM Tris 8,0, 0,1 M EDTA 8,0, 20 mg/ml RNAse A und 0,5% SDS) wurden zu dem zermahlenen Gewebe in einem sterilen 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen hinzugefügt. Es wurde gut durchmischt und 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Proteinase K wurde in einer Endkonzentration von 100 mg/ml hinzugefügt, gemischt und 3 Stunden bei 50-55ºC auf einer Schütteloberfläche inkubiert. Das Röhrchen wurde dann auf Raumtemperatur abgekühlt und 5 mal mit einem gleichen Volumen an Phenol : Chloroform : Isoamylalkohl (1 : 1 : 24) extrahiert. Ein Zehntel des Volumens und 2 Volumina 3 M Natriumacetat bzw. 95% Ethanol wurden hinzugefügt. Die Lösung wurde gut durchmischt und die DNA auf einem Glasstab erhalten. Die DNA wurde mit 70% Ethanol gewaschen und in TE durch über Nacht-Schütteln bei 50-55ºC resuspendiert.
Herstellung der Bibliothek: 10 mg der genomischen Hunde-DNA wurden vollständig mit AluI verdaut. Die verdaute DNA wurde in einem 2%igen niedrig schmelzenden Agarosegel fraktioniert, Fragmente zwischen 200-500 bp Gel-aufgereinigt und mit pBluescriptSK+ (Stratagene, La Jolla, CA) ligiert, der mit SmaI verdaut und in alkalischer Kalbsdarm-Phosphatase behandelt worden war. Die Ligationen wurden in einem Volumen von 10 ml bei 15ºC über Nacht durchgeführt. Ligationen wurden 15 Minuten auf 75ºC erhitzt, das Plasmid mit Ethanol gefällt, getrocknet und in Wasser resuspendiert. Die Ligation wurde sodann mit SmaI verdaut, um den Vektor-Hintergrund zu beseitigen. Top10F'-kompetente Zellen (Invitrogen, San Diego, CA) wurden sodann mittels Elektroporation transformiert und auf 15 große Petrischalen ausplattiert. Die erhaltene genomische Bibliothek enthielt 472.000 Primär-Rekombinanten. Die Bibliothek wurde als Glycerin-Stammlösung aufbewahrt.
Screening der Bibliothek: Kleine Mengen der Glycerin-Stammlösung mit der Genbank wurden in LB-Medien mit Ampicillin (100 mg/ml) auf 1 : 10&sup6; oder 1 : 10&sup7; verdünnt. 50 ml der verdünnten Genbank wurden ausplattiert. Einzelne Kolonien wurden ausgewählt und bei einer Dichte von 100 pro Platte auf 9 cm Petrischalen transferiert. Zwei Replica-Plattierungen von jeder Platte wurden für ein Screening erstellt. Kolonien von jeder der zwei Replica-Platten wurden mit Nitrocellulosemembranen (S&S, Keene, NH) abgehoben. Jede Membran wurde mit der die Kolonien enthaltenden Seite nach oben in etwa 3 ml Denaturierungslösung (0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl) auf einem Blatt Saranfolie für 5 Minuten gegeben, dann in die gleiche Menge Neutralisierungslösung (0,5 M Tris, 1,5 M NaCl, pH 7,0) für 5 Minuten transferiert und schließlich in eine Lösung von 2 · SSC gegeben und 5 Minuten gelinde geschüttelt. Die Filter wurden sodann vorsichtig abgerieben, um überschüssigen Niederschlag zu beseitigen, auf Whatman 3 mm-Papier trockengeblottet und 1 Stunde bei 80ºC gebacken. Sie wurden sodann 2 Minuten mit UV-Licht bestrahlt und in 6 · SSPE, 5 · Denhardts und 0,2% SDS wenigstens 30 Minuten bei 60ºC prähybridisiert. Endmarkierte Sondenmoleküle wurden sodann zur über Nacht-Hybridisierung bei 60ºC hinzugefügt. Die für die Verwendung als Sonden markierten Oligonukleotide (BIOS Laboratories, New Haven, CT) waren wie folgt: (AAG)9, (AAC)9, (AAT)12, (AAAC)7A, (AAAG)7A und (AAAT)9. Die Filter wurden mit einer der vorstehenden Sonden für eine Zeit, die zur einfachen Identifikation von Mikrosatelliten- Wiederholungsmotiven geeignet war, hybridisiert. Nach der Hybridisierung wurden die Filter einmal bei Raumtemperatur 15 Minuten in 6 · SSPE und 0,2% SDS und sodann zweimal jeweils 15 Minuten bei 60ºC in 6 · SSPE und 0,2% SDS gewaschen. Die Filter wurden in Saranfolie eingewickelt und ein Röntgenfilm über Nacht bei -80ºC aufgelegt. Die mit einer Sonde hybridisierenden Kolonien wurden ausgewählt und Plasmid-DNA wurde isoliert.
Sequenzierung von positiven Klonen und Entwurf von PCR-Primern: Plasmid-DNA wurde mit dem Qiagen tip-20-Kit (Qiagen, Chatsworth, CA) isoliert und DNA wurde auf einem Applied Biosystems 373A Strech Automated Sequencer mit dem PRISM Dye Deoxy Terminator Sequencing Kit (Perkin Elmer, Norwalk, CT) sequenziert. Die PCR-Primer, die die Mikrosatelliten-Wiederholung flankieren, wurden für jeden Klon so entworfen, daß sie amplifizierte DNA mit einer Größe von 75-350 bp ergeben. Primer wurden von Operon Technologies (Alameda, CA) synthetisiert und in jedem Fall wurde ein Primer mit einem der drei Fluoreszenzfarbstoffe (FAM, JOE oder TAMRA) endmarkiert, während der andere Primer nicht markiert war. Die Primer-Paare besaßen die nachstehenden Sequenzen:
Die Bezeichnung eines Locus in den Tabellen entspricht der Sequenz ID-Nummer, somit besitzt Locus 1 die Sequenz SEQ ID NO: 1, usw.
Test der PCR-Primer für den Nachweis von Polymorphismus: Eine PCR wurde mit genomischer Hunde-DNA durchgeführt, unter Verwendung von 10 umol eines jeden Primers, 3 mM MgCl&sub2;, 1 · Perkin Elmer PCR-Puffer, 175 mM eines jeden dNTPs (Pharmacia, Uppsala, Schweden) und 1 Einheit AmpliTaq DNA-Polymerase (Perkin Elmer, Norwalk, CT) pro 50 ml Reaktion. DNA wurde in einem GeneAmp 9E300 Thermocycler (Perkin Elmer, Norwalk, CT) amplifiziert, mit 1 Minute bei 94ºC, gefolgt von 30 Zyklen für 15 Sekunden bei 94ºC, 15 Sekunden bei 58ºC und 30 Sekunden bei 72ºC, gefolgt von einer abschließenden Verlängerung für 10 Minuten bei 72ºC. 1-5 ml des PCR-Produkts wurden auf einem 6%igen denaturierenden Acrylamidgel (12 oder 24 cm gut zu lesen) mit einem Applied Biosystems 373A Stretch Automated Sequencer größenfraktioniert. Genescan 350ROX-Marker (Perkin Elmer; Norwalk, CT) waren in jeder Spur als interner Größenstandard vorhanden. Die Größe der PCR-Produkte wurde mit Hilfe der Genescan-Software (Perkin Elmer, Norwalk, CT) bestimmt und Genotyp-Tabellen mit der Genotyper-Software (Perkin Elmer, Norwalk, CT) erstellt.
Anfänglich wurde die DNA von 23 Hunden verschiedener Rassen und ein Kontrollplasmid mit dem klonierten Mikrosatelliten mit jedem Primer-Paar amplifiziert. Primer-Paare, die im Hinblick auf einen Polymorphismus vielversprechend waren, wurden mit DNAs von etwa 75 weiteren Hunden getestet, um die Allel-Häufigkeiten in der Hundepopulation zu berechnen. Manche der Primer-Paare wurden für einen Test einer Population von nahe verwandten Deutschen Schäferhunden für genetischen Polymorphismus verwendet. Die Anzahl und der Größenbereich der Allele wurde in einer Tabelle zusammengestellt und eine beobachtete Heterozygotie (Anzahl von heterozygoten Hunden an einem Locus/gesamte Anzahl an getesteten Hunden) wurde berechnet. PIC-Werte wurden ebenfalls gemäß der von Botstein et al. beschriebenen Formel berechnet.
Herstellung von genomischen DNA-Proben aus Individuen: DNA-Proben wurden entweder aus Blut oder von Mundabstrichen erhalten. DNA wurde aus Blut mit dem QiaAmp Blood Kit (Qiagen, Chatsworth, CA) gemäß den Anleitungen des Herstellers isoliert. 5 ml der erhaltenen DNA wurden für jede PCR-Reaktion verwendet. DNA wurde aus Mundabstrichen isoliert, die durch Reiben einer käuflich erhältlichen zytologischen Bürste gegen die Wangeninnenseite des Hundes für 15-30 Sekunden entnommen worden waren. Die Abstriche können mehrere Monate trocken in der Papierumwicklung vor der Verwendung aufbewahrt werden. Der Bürstenkopf wird in ein 1 ml-Mikrotiterröhrchen (Bio-Rad, Hercules, CA) mit 600 ml 50 mM NaOH getaucht und die Bürste vorsichtig gewirbelt. Das Röhrchen (mit der Bürste) wird 5 Minuten auf 95-100ºC erhitzt. Die Bürste wird dann vorsichtig herausgenommen und 60 ml 1 M Tris, pH 8,0, zu dem Röhrchen hinzugegeben. Das Röhrchen wird sodann gevortext und 5 ml der DNA werden für jede PCR-Reaktion verwendet.

Analyse von Hundepopulationen

Tabellen 1 und 2 zeigen die Eignung der PCR-Primer, die anhand der bereitgestellten Nukleotidsequenzen entworfen worden waren. Der PIC-Wert (Botstein et al., 1980) zeigt den Informationsgehalt eines jeden Mikrosatelliten. Anhand des PIC-Wertes sind 19 der 20 dargestellten Marker hoch-informativ (PIC > 0,5) und einer ist durchschnittlich informativ (0,25 < PIC < 0,5) in der allgemeinen Hundepopulation (Tabelle 1). In einer Population nahe verwandter Deutscher Schäferhunde waren 9 Marker hoch-informativ, 8 waren durchschnittlich informativ und 3 Marker waren nicht besonders informativ (Tabelle 2). Beobachtete Heterozygotie ist der Anteil der Hunde, die für einen spezifischen Marker heterozygot waren. 19 der 20 Marker zeigen eine beobachtete Heterozygotie von mehr als 0,5 und 10 der 20 zeigen eine beobachtete Heterozygotie von mehr als 0,7 in der allgemeinen Hundepopulation (Tabelle 1). In der Population der Deutschen Schäferhunde zeigen 11 der Marker Heterozygotie von mehr als 0,5 und 5 Marker zeigen Heterozygotie von mehr als 0,7 (Tabelle 2).
Die Daten über die Population Deutscher Schäferhunde wurden von Hunden zweier ortsansässiger Züchter erhalten, die eine extensive Linienzüchtung durchführen, was zu einer Inzucht und einer Verringerung der genetischen Variabilität führt. Trotz dieser Inzucht zeigen die Mehrzahl der beanspruchten Marker immer noch einen signifikanten Polymorphismus unter den Individuen. Daher dienen diese Marker einer Unterscheidung zwischen selbst sehr nahe verwandten Individuen in der Hundepopulation. TABELLE 1 Charakteristika von bereitgestellten Mikrosatelliten an den angegebenen Hunde-Loci in einer Hundepopulation verschiedener Rassen TABELLE 2 Charakteristika von bereitgestellten Mikrosatelliten an den angegebenen Hunde-Loci in einer Population nahe verwandter Deutscher Schäferhunde
Ein Beispiel eines Abstammungstests in zwei Familien ist nachstehend in Tabelle 3 dargestellt. Zum einfacheren Zählen der Genotypen wurden verschiedene Buchstaben jeder Allelgröße an jedem Locus zugeordnet. In der ersten Familie ist eine Verwandtschaftsbeziehung nicht ausgeschlossen, da alle Nachkommen ein Allel enthalten, das in dem Muttertier vorkommt und das andere Allel im Vater auftritt. In der zweiten Familie gibt es zwei mögliche Muttertiere, wovon eines (Dam 2A) als Muttertier des in Frage stehenden Welpen an den 5 Loci (Marker mit einem Stern) ausgeschlossen ist, da der Welpe mit Dam 2A keine Allele an diesen Loci gemeinsam hat. Jedoch ist Dam 2B als Muttertier des Welpen nicht ausgeschlossen, da der Welpe ein Allel mit dem Muttertier und eines mit dem Vater an jedem Locus teilt. In der allgemeinen Hundepopulation ist bei der Verwendung der gleichen Allel- Häufigkeiten, die zur Berechnung der PIC-Werte für Tabelle 1 verwendet worden waren, die Wahrscheinlichkeit des Nachweises einer falschen Abstammung bei Verwendung aller Loci 0,999999998. Für die Population Deutscher Schäferhunde in Tabelle 2 beträgt die Wahrscheinlichkeit 0,999613. Diese Daten weisen darauf hin, daß diese Marker für das Testen der Verwandtschaftsbeziehung sehr gut geeignet sind, da sogar in der Population nahe verwandter Deutscher Schäferhunde die Wahrscheinlichkeit des Nachweises einer falschen Verwandtschaftsbeziehung weniger als 1 : 1000 beträgt. TABELLE 3 Abstammungstest in zwei Hundefamilien

Bestimmung des Genotyps einer Wildtyp-Population

Tabelle 4, nachstehend, verdeutlicht die Verwendung von einigen Markern für die Bestimmung des Genotyps von Wüstenfüchsen. Füchse A-D stammen aus einer Wildtyp-Population, die einige Geschwister enthalten könnte. TABELLE 4 Bestimmung des Genotyps von Wüstenfüchsen
Obwohl die Füchse gemäß dieser Marker bemerkenswert genetisch ähnlich sind, können sie alle mit Hilfe von nur 8 Markern voneinander unterschieden werden. Die genetische Ähnlichkeit könnte auf dem hohen Grad der Verwandtschaftsbeziehungen untereinander in dieser kleinen Probengröße beruhen.
Aus Vorstehendem wird deutlich, daß die vorliegende Erfindung wertvolle Mittel zur Bestimmung des Genotyps von Hunden liefert. Die Mikrosatelliten-Marker liefern selbst in stark ingezüchteten Hundepopulationen und in Wildhunde-Populationen Informationen. Die Bestimmung des Genotyps stellt ein einfaches Verfahren zur Erstellung eines Fingerabdrucks eines einzelnen Tieres bereit. Eine Abstammungsanalyse kann mit den erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführt werden, genauso wie ein genetisches Mapping in Hundepopulationen.
Alle in dieser Beschreibung zitierten Publikationen und Patentanmeldungen sind in den Umfang der Erfindung einbezogen.
Obwohl die Erfindung detailliert durch Veranschaulichung und Beispiele zum Zwecke des besseren Verständnisses beschrieben wurde, wird dem Fachmann klar sein, daß im Lichte der erfindungsgemäßen Lehre bestimmte Veränderungen und Modifikationen durchgeführt werden können, ohne von dem Sinn der Erfindung und dem Umfang der beigefügten Ansprüche abzuweichen.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:

(i) ANMELDER:
(A) NAME: The Perkin-Elmer Corporation
(B) STRASSE: 850 Lincoln Center Drive
(C) ORT: Foster City
(D) BUNDESLAND: CA
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL: 94404
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Mikrosatelliten-Sequenzen zur Bestimmung des Genotyps von Hunden
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 60
(iv) COMPUTERLESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: FastSEQ Version 2.0
(v) DATEN DER JETZIGEN ANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER: EP 96 933 941.5
(B) ANMELDEDATUM: 27. September 1996

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 252 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 1..28
(D) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide 1-28 sind eine einzigartige flankierende Sequenz"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 29 .. 103
(D) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide 29-103 sind eine Wiederholungssequenz"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 104 .. 252
(D) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide 104 .. 252 sind eine einzigartige flankierende. Sequenz"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 234 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 1 .. 119
(D) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide 1-119 sind eine einzigartige flankierende Sequenz"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 120 .. 163
(D) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide 120-163 sind eine Wiederholungssequenz"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 164 .. 234
(D) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide 164-234 sind eine einzigartige flankierende Sequenz"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 279 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜL S. DNA (genomisch)
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 1 .. 111
(D) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide 1-111 sind eine einzigartige flankierende Sequenz"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 112 .. 204
(D) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide 112-204 sind eine Wiederholungssequenz"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 205 .. 279
(D) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide 205-27ß sind eine einzigartige flankierende Sequenz"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 475 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 1 .. 280
(D) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide 1-280 sind eine einzigartige flankierende Sequenz"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 281 .. 315
(D) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide 281-315 sind eine Wiederholungssequenz"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 316 .. 475
(D) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide 316-475 sind eine einzigartige flankierende Sequenz"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 427 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 1 .. 182
(D) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide 1-182 sind eine einzigartige flankierende Sequenz"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 183 .. 240
(D) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide 183-240 sind eine Wiederholungssequenz"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 241 .. 427
(D) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide 241-427 sind eine einzigartige flankierende Sequenz"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 454 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 1 .. 133
(D) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide 1-133 sind eine einzigartige flankierende Sequenz"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 134 .. 307
(D) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide 134-307 sind eine Wiederholungssequenz"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 308 .. 454
(D) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide 308-454 sind eine einzigartige flankierende Sequenz"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 394 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA(genomisch)
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 1 .. 233
(D) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide I-233 sind eine einzigartige flankierende Sequenz"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 234 .. 349
(D) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide 234-349 sind eine Wiederholungssequenz"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 350 .. 394
(D) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide 350-394 sind eine einzigartige flankierende Sequenz"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 344 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 1 .. 41
(D) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide 1-41 sind eine einzigartige flankierende Sequenz"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 42 .. 120
(D) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide 42-120 sind eine Wiederholungssequenz"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 121 .. 344
(D) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide 121-344 sind eine einzigartige flankierende Sequenz"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 9:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 334 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 1 .. 153
(D) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide 1-153 sind eine einzigartige flankierende Sequenz"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 154 .. 269
(D) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide 154-269 sind eine Wiederholungssequenz"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 270 .. 334
(D) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide 270-334 sind eine einzigartige flankierende Sequenz"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 10:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 206 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 1 .. 61
(D) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide 1-61 sind eine einzigartige flankierende Sequenz"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 62 .. 123
(D) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide 62-123 sind eine Wiederholungs sequenz"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 124 .. 206
(D) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide 124-206 sind eine einzigartige flankierende Sequenz"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 11:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 460 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 1 .. 362
(D) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide 1-362 sind eine einzigartige flankierende Sequenz"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 363 .. 414
(D) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide 363-414 sind eine Wiederholungssequenz"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 415 .. 460
(D) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide 415-460 sind eine einzigartige flankierende Sequenz"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 12:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 335 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 1 .. 151
(D) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide 1-151 sind eine einzigartige flankierende Sequenz"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 152 .. 200
(D) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide 152-200 sind eine Wiederholungssequenz"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 201 .. 335
(D) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide 201-335 sind eine einzigartige flankierende Sequenz"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 13:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 388 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 1 .. 131
(D) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide 1-131 sind eine einzigartige flankierende Sequenz"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 132 .. 235
(D) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide 132-235 sind eine Wiederholungssequenz"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 236 .. 388
(D) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide 236-388 sind eine einzigartige Flankierende Sequenz"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 14:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 348 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 1 .. 21
(D) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide 1-21 sind eine einzigartige Flankierende Sequenz"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 22 .. 156
(D) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide 22-156 sind eine Wiederholungssequenz"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 157 .. 348
(D) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide 157-348 sind eine einzigartige flankierende Sequenz"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 15:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 497 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 1 .. 363
(D) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide 1-363 sind eine einzigartige flankierende Sequenz"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 364 .. 406
(D) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide 364-406 sind eine Wiederholungssequenz"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 407 .. 497
(D) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide 407-497 sind eine einzigartige flankierende Sequenz"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 15:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 16:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 251 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 1 .. 131
(D) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide 1-131 sind eine einzigartige flankierende Sequenz"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 132 .. 186
(2) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide 132-186 sind eine Wiederholungssequenz"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 187 .. 251
(D) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide 187-251 sind eine einzigartige flankierende Sequenz"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 16:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 17:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 350 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 1 .. 109
(D) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide 1-109 sind eine einzigartige flankierende Sequenz"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 110 .. 195
(D) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide 110-195 sind eine Wiederholungssequenz"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 196 .. 350
(D) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide 196-350 sind eine einzigartige flankierende Sequenz"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 17:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 18:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 376 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 1 .. 79
(D) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide 1-79 sind eine einzigartige flankierende Sequenz"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 80 .. 229
(D) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide 80-229 sind eine Wiederholungssequenz"
(ix) MERKMAL:
(A) NAHE/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 230 .. 375
(D) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide 230-376 sind eine einzigartige flankierende Sequenz"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 18:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 19:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 299 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 1 .. 128
(D) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide 1-128 sind eine einzigartige flankierende Sequenz"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 129 .. 199
(D) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide 129-199 sind eine Wiederholungssequenz"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 200 .. 299
(D) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide 200-299 sind eine einzigartige flankierende Sequenz"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 19:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 20:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 475 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 1 .. 366
(D) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide 1-366 sind eine einzigartige flankierende Sequenz"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 367 .. 438
(D) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide 367-438 sind eine Wiederholungssequenz"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal
(B) LAGE: 439 .. 475
(D) SONSTIGE ANGABEN: "Nukleotide 439-475 sind eine einzigartige flankierende Sequenz"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 20:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 21:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 21:
CACTTCTCAT ACCCAGACTC 20

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 22:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 22:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 23:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 23:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 24:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 24:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 25:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 25:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 26:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 26:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 27:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 27:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 28:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 28:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 29:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 27 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 30:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 31:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 30:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 31:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 31:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 32:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 32:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 33:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 33:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 34:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 34:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 35:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 35:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 36:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare.
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 36:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 37:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 37:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 38:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 38:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 39:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 39:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 40:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 40:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 41:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 41:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 42:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 42:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 43:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 43:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 44:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 44:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 45:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 45:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 46:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 46:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 47:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 47:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 48:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 48:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 49:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 49:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 50:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 50:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 51:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 51:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 52:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 52:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 53:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 53:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 54:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 54:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 55:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 55:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 56:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 56:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 57:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 57:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 58:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 58:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 59:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 59:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 60:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 60:

Claims

1. Verfahren zur Genotypisierung eines Hundes an einem Mikrosatelliten- Locus, umfassend:

Amplifizieren eines Bereichs chromosomaler DNA mit für diesen Locus spezifischen Oligonukleotid-Primern, wobei der DNA-Bereich ein wiederholtes Tetranukleotid-Motiv umfaßt, das aus AAA oder TTT besteht, wobei der vierte Rest einer der Reste G, C, A oder T ist;

Größenfraktionieren des Amplifikationsprodukts, um ein Größenmaß des zwischen den Primern gelegenen chromosomalen DNA-Abschnitts bereitzustellen;

wobei die Größe des zwischen den Primern gelegenen chromosomalen DNA- Abschnitts ein allelischer Marker für den Locus ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Amplifizierung ferner die Kennzeichnung des Produkts mit einer nachweisbaren Markierung umfaßt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Amplifizierung mittels Polymerase-Kettenreaktion erfolgt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei wenigstens etwa S der Mikrosatelliten- Loci genotypisiert werden und wobei die allelischen Marker der Loci einen genetischen Fingerabdruck zur Identifikation des Hundes liefern.

5. Verfahren zur Genotypisierung eines Hundes an einem Mikrosatelliten- Locus, umfassend:

Amplifizieren eines Bereichs chromosomaler DNA mit für diesen Locus spezifischen Oligonukleotid-Primern, wobei der DNA-Bereich ein wiederholtes Motiv ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus AAAG, GAAA, AAAT, TTTC, CTTT, TTTA, AAGG, GAAT, GAAG, GAAAA, AAAAAG, TGC und TTC umfaßt;

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Amplifizierung ferner die Kennzeichnung des Produkts mit einer nachweisbaren Markierung umfaßt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Amplifizierung mittels Polymerase-Kettenreaktion erfolgt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei wenigstens etwa 5 der Mikrosatelliten- Loci genotypisiert werden und wobei die allelischen Marker der Loci einen genetischen Fingerabdruck zur Identifikation des Hundes liefern.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die für den Locus spezifischen Oligonukleotid-Primer aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 21 und 41; 22 und 42; 23 und 43; 24 und 44; 25 und 45; 26 und 46; 27 und 47; 28 und 48; 29 und 49; 30 und 50; 31 und 51; 32 und 52; 33 und 53; 34 und 54; 35 und 55; 36 und 56; 37 und 57; 38 und 58; 39 und 59; und 40 und 60 ausgewählt sind.

10. Zusammensetzung, umfassend ein isoliertes DNA-Fragment, wobei die Sequenz der DNA aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 20 ausgewählt ist.

11. Ein Oligonukleotid-Primer einer Länge von wenigstens etwa 18 nt, wobei der Primer unter stringenten Bedingungen zur Hybridisierung an eine DNA fähig ist, die die Sequenz der flankierenden Bereiche einer Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 20 hat.

12. Oligonukleotid-Primer nach Anspruch 11, wobei die Sequenz des Primers aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 21 bis SEQ ID NO: 60 ausgewählt ist.

13. Ein Kit zur Genotypisierung von Hunden, umfassend:

ein Paar von Oligonukleotid-Amplifikations-Primern, wobei die Sequenz der Primer komplementär zur Sequenz der flankierenden Bereiche der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 20 ist.

14. Kit nach Anspruch 13, wobei wenigstens einer der Primer mit einer nachweisbaren Markierung gekoppelt ist.

15. Kit nach Anspruch 14, wobei die nachweisbare Markierung ein Fluorochrom ist.

16. Kit nach Anspruch 15, wobei der Kit wenigstens etwa 5 der Oligonukleotid-Amplifikations-Primer-Paare umfaßt.

17. Kit nach Anspruch 16, wobei die Sequenz der Oligonukleotid- Amplifikations-Primer aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 21 und 41; 22 und 42; 23 und 43; 24 und 44; 25 und 45; 26 und 46; 27 und 47; 28 und 48; 29 und 49; 30 und 50; 31 und 51; 32 und 52; 33 und 53; 34 und 54; 35 und 55; 36 und 56; 37 und 57; 38 und 58; 39 und 59; und 40 und 60 ausgewählt ist.