DE69232726T2

DE69232726T2 - Genetische analyse

Info

Publication number: DE69232726T2
Application number: DE69232726T
Authority: DE
Inventors: Joseph Abraham; Letts Dawkins
Original assignee: Immunogenetics Research Foundation Inc
Current assignee: Genetic Technologies Ltd
Priority date: 1991-11-01
Filing date: 1992-10-30
Publication date: 2003-04-30
Anticipated expiration: 2012-10-31
Also published as: EP0660877A1; EP0660877A4; EP0660877B1; DE69232726D1; WO1993009249A1

Description

Diese Erfindung betrifft im weitesten Sinne das Gebiet der Molekulargenetik. Insbesondere betrifft die Erfindung Verfahren zur genetischen Analyse von DNA-Sequenzen, die anzestralen Haplotypen von Multigenkomplexen, wie dem menschlichen Haupthistokompatibilitätskomplex und Fragmenten davon, entsprechen.
Der menschliche Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) ist ein Bereich der chromosomalen DNA, der eine Schlüsselrolle im Immunsystem spielt und verschiedene Funktionen und Erkrankungen beeinflußt. Der MHC ent hält mehrere polymorphe und duplizierte Gene (Zhang et al., 1990). Am Centromerende des menschlichen Chromosoms, auf dem man den MHC findet, sind Gene, wie HLA-DR, -DQ und -DP, welche die Klasse-II- Produkte codieren, die an der spezifischen Antigenpräsentation beteiligt sind. Am Telomerende des Chromosoms befinden sich mehrere Gene, wie HLA-A, -B und -C, welche die von cytotoxischen T-Zellen erkannten Klasse-I-Produkte codieren. Im zentralen Bereich liegen Gene für Amplifikatoren und Mediatoren, wie C4, C2, Bf und Tumornekrosefaktoren (TNF-α, TNF-β), zusammen mit einer heterogenen Ansammlung von mindestens zehn weiteren Genen (Sargent et al., 1989; Spies et al., 1989). Obwohl nur einige dieser Gene sequenziert wurden, ist bereits deutlich, daß keine einzelne Genfamilie vorliegt, weil die Produkt in ihrer Struktur erheblich variieren. Gene, wie Hitzeschockprotein 70, spielen möglicherweise eine Rolle bei der Antigenprozessierung vor der Präsentation. Die Produkte einiger der übrigen Gene sind möglicherweise an der interzellulären Adhäsion beteiligt, und einige können vielleicht. Immunantworten als akzessorische Moleküle beeinflussen (Banerji et al., 1990). Das B144-Gen spielt möglicherweise zusammen mit den Komplement- und TNF-Genen eine Rolle bei der Regulation der Antikörperproduktion (French und Dawkins, 1990). Obwohl genauere Informationen notwendig sind, ist es möglich, daß man sich den MHC als eine Chromosomenregion mit heterogenen Genen vorstellen kann, die auf unterschiedliche Weise Immunantworten, ob durch Antikörper, T-Zellen oder andere Effektormechanismen vermittelte, regulieren und steuern.
Seit vielen Jahren ist bekannt, daß der MHC Gene enthält, welche die Empfänglichkeit für viele Erkrankungen beeinflussen (Dawkins et al., 1983). Produkte des menschlichen MHC sind auch eng mit der Gewebeabstoßung verbunden, wobei durch das Immunsystem transplantierte Gewebe als fremd erkannt und abgestoßen werden, die MHC-Produkte tragen, die mit dem Transplantatempfänger nicht identisch sind.
Aufgrund der praktischen Bedeutung der Transplantation galten große Anstrengungen det "Gewebstypisierung" (tissue typing) innerhalb des MHC, um zu bestimmen, ob Kandidaten- Gewebe für die Transplantation den gleichen anzestralen MHC-Haplotyp tragen, wie der geplante Empfänger. Der größere Teil dieser Typisierung erfolgte mittels serologischer Analyse mit besonderer Beachtung der Klasse-II-Genprodukte HLA-DR und -DQ, der Klasse-I-Genprodukte HLA-B sowie anderer Marker.
Gegenwärtige Gewebstypisierungstechniken leiden an einer bestimmten Ungenauigkeit, die in den serologischen Bestimmungen begründet ist, sowie an Zeitverzögerungen in Verbindung mit der Analyse. Zudem besteht ein Bedarf an weiteren "Markern", um die Verträglichkeit oder anderes von Gewebe für die Transplantation zu untersuchen.
"Gewebstypisierung" ist, wie vorstehend erwähnt, auch zur Bestimmung der Empfänglichkeit und Widerstandsfähigkeit gegenüber einer Erkrankung wichtig. Wenn die Empfänglichkeit eines Patienten für eine Autoimmunerkrankung oder andere Krankheiten in einem frühen Stadium nachgewiesen werden kann, können geeignete Therapieschemata und Ratschläge vor dem Voranschreiten der Erkrankung einsetzen, woraus sich Vorteile ergeben.
Anzestrale Haplotypen sind DNA-Sequenzen aus Multigenkomplexen, wie dem MHC. Die anzestralen Haplotypen des MHC reichen von HLA-B bis HLA-DR und sind en bloc konserviert. Diese anzestralen Haplotypen und Rekombinationen zwischen beliebigen zwei von ihnen machen etwa 73% des anzestralen Haplotypen in unserer kaukasischen Population aus. Das Vorliegen anzestraler Haplotypen legt die Konservierung großer Chromosomenabschnitte nahe. Diese anzestralen Haplotypen tragen viele andere MHC-Gene als HLA, die für Antigenpräsentation, Autoimmunantworten und Transplantatabstoßung relevant sein können. Die Gewebstypisierung ist eine Analyse der Kombination von Allelen, die im MHC codiert sind. Viele dieser Allelkombinationen können als anzestrale Haplotypen erkannt werden. Andere Multigenkomplexe, die anzestrale Haplotypen enthalten, sind u. a. der Lipoproteingenkomplex und der RCA-Komplex.
Diese Erfindung stammt aus der Charakterisierung von DNA, die anzestralen Haplotypen entspricht. Die Erfinder haben überraschenderweise gefunden, daß die DNA-Sequenzen, die einem bestimmten anzestralen Haplotyp entsprechen, innerhalb des anzestralen Haplotyps identisch sind, wohingegen DNA-Sequenzen zwischen anzestralen Haplotypen sehr polymorph sind. Daher besitzt jeder anzestrale Haplotyp eine einzigartige Nukleotidsequenz, die zur Zuordnung von anzestralen Haplotypen ausgenutzt werden kann. Folglich können genetische Analyse und Zuordnung des anzestralen Haplotyps gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren leicht durchgeführt werden. Dies ist besonders wichtig, wenn die Identität auf Ebene der genomischen Sequenz für den besten Ausgang nach Transplantaten notwendig sein kann, wie bei der Knochenmarkstransplantation (Christiansen et al., 1991). Die erfindungsgemäße genetische Analyse stellt die Fähigkeit bereit, anzestrale Haplotypen zwischen Individuen "in Übereinstimmung zu bringen" ("match") oder anzestrale Haplotypen durch Vergleich mit einer Referenzgruppe anzestraler Haplotypen "zu typisieren".
Die Erfindung ist in den beigefügten Ansprüchen 1-17 definiert.
Unter dem ersten Aspekt dieser Erfindung wird ein Verfahren zum in-Übereinstimmung-Bringen (matching) eines bestimmten anzestralen Haplotyps im Genom von zwei oder mehr Individuen eines höheren Organismus bereitgestellt, wobei das Verfahren das Kontaktieren bzw. Zusammenbringen einer Region des Genoms oder eines Fragments oder Teils davon aus jedem Individuum mit einer Oligonukleotid-Sonde oder einem Primer umfaßt, die bzw. der mit mindestens einer komplementären Sequenz hybridisiert, die mindestens eine polymorphe Region innerhalb des anzestralen Haplotyps flankiert, wobei die flankierende Sequenz zwischen anzestralen Haplotypen konserviert ist und die polymorphe Region stabile Abfolgen von Nukleotiden aufweist, die sich zwischen anzestralen Haplotypen unterscheiden, und das Vergleichen des Ausmaßes oder Profils der Hybridisierung oder des Profils der genomischen Amplifikationspcodukte oder der Nukleotidsequenz solcher Amplifikationsprodukte, um die Nicht-Identität oder Identität des anzestralen Haplotyps zu bestimmen,
wobei die polymorphe Region eine Region ist, die als "haplospezifisches geometrisches Element" bezeichnet wird und für einen individuellen anzestralen Haplotyp kennzeichnend (d. h. "haplospezifisch") ist und die weiterhin dadurch kennzeichnet ist, daß
(a) sie insofern geometrisch ist, daß eine mathematische Beziehung zwischen der Basenanzahl besteht, die ein Merkmal jedes anzestralen Haplotyps ist, und dadurch, daß eine Symmetrie um das Zentrum der Region besteht;
(b) sie eine nicht zufällige Verwendung von Nukleotiden aufweist; und
(c) sie Di- und Trinukleotid-Iterationen aufweist.
Unter einem weiteren Aspekt wird ein Verfahren bereitgestellt, um zu bestimmen, ob ein Genom eines Individuums eines höheren Organismus im wesentlichen den gleichen anzestralen Haplotyp wie das Genom eines anderen Individuums des höheren Organismus aufweist, wobei das Verfahren das Zusammenbringen bzw. Kontaktieren einer Region des Genoms oder eines Fragments oder Teils davon des ersten Individuums mit mindestens einer Oligonukleotid-Sonde und/oder einem Primer zur Amplifikation umfaßt, die bzw. der mit mindestens einer komplementären Sequenz hybridisieren kann, die mindestens eine polymorphe Region innerhalb des anzestralen Haplotyps flankiert, wobei die flankierende Sequenz zwischen anzestralen Haplotypen konserviert ist und die polymorphe Region stabile Abfolgen von Nukleotiden aufweist, die sich zwischen anzestralen Haplotypen unterscheiden, und das Vergleichen des Ausmaßes und/oder Profils der Hybridisierung oder der Nukleotidsequenz von Amplifikationsprodukten mit einer Referenzgruppe anzestraler Haplotypen,
wobei die polymorphe Region eine Region ist, die als "haplospezifisches geometrisches Element" bezeichnet wird und wie vorstehend definiert ist.
Unter einem weiteren Aspekt wird ein Verfahren zum Identifizieren eines anzestralen Haplotyps im Genom eines Individuums eines höheren Organismus bereitgestellt, wobei das Verfahren das Amplifizieren des anzestralen Haplotyps oder von Teilen davon unter Verwendung eines Primers umfaßt, der mit komplementären Sequenzen hybridisieren kann, die mindestens einmal innerhalb des anzestralen Haplotyps vorliegen und mindestens eine polymorphe Region innerhalb des anzestralen Haplotyps flankieren, wobei die flankierende Sequenz zwischen anzestralen Haplotypen konserviert ist und die polymorphe Region stabile Abfolgen von Nukleotiden aufweist, die sich zwischen anzestralen Haplotypen unterscheiden, und das Vergleichen der resultierenden Amplifikationsprodukte oder von deren Nukleotidsequenz mit einer Referenz von Amplifikationsprodukten aus einem bekannten anzestralen Haplotyp unter Verwendung von im wesentlichen dem gleichen Primer, um dadurch eine Identität oder Nicht-Identität zwischen beiden festzustellen,
wobei die polymorphe Region eine Region ist, die als "haplospezifisches geometrisches Element" bezeichnet wird und wie vorstehend definiert ist.
So kann das erfindungsgemäße Verfahren bei Verfahren zur genetischen Analyse eingesetzt werden, umfassend das Vergleichen einer ersten DNA-Sequenz, die einem anzestralen Haplotyp oder einer Rekombinante davon entspricht, aus einem Multigenkomplex, wie dem MHC, mit einer oder mehreren Referenz-DNA-Sequenz(en), die jeweils einem anderen anzestralen Haplotyp entsprechen, um eine Identität oder Nicht-Identität zwischen ihnen festzustellen und somit eine Zuordnung des anzestralen Haplotyps der ersten DNA-Sequenz vorzunehmen.
DNA-Sequenzen, die bei der Zuordnung eines anzestralen Haplotyps verglichen werden können, können die DNA-Sequenz eines beliebigen Multigenkomplexes umfassen, wie, aber nicht beschränkt auf den Lipoproteingenkomplex, den RCA- Komplex und den MHC-Komplex. Vorzugsweise ist der Multigenkomplex der MHC, z. B. HLA-C zwischen HLA-B und TNF + B144.
Die vorliegende Erfindung betrifft die genetische Analyse der Genome höherer Organismen, z. B. aus Säugern, Pflanzen und Insekten. Bevorzugte Säuger sind Menschen, Vieh, Haustiere und Wildtiere. Am meisten bevorzugt ist der Säuger ein Mensch.
DNA-Sequenzen, die anzestralen Haplotypen oder Rekombinanten davon entsprechen, können leicht durch eine Reihe von Techniken analysiert werden, wie DNA-Sequenzanalyse, Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP), Reaktion mit haplospezifischen Oligonukleotid-Sonden, Heteroduplex- Analyse, primergesteuerte Amplifikation und andere im Fachgebiet bekannte Verfahren. Das Genom selbst kann der Analyse unterworfen werden oder über cDNA oder mRNA analysiert werden.
Unter den oben genannten Aspekten der vorliegenden Erfindung erfolgt der Vergleich durch Verwendung von Oligonukleotid-Sonden, die auch mit einem Reportermolekül oder einem Primer zur Steuerung der Amplifikation markiert werden können.
Unter einem bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren nach Anspruch 1 bereitgestellt, wobei die Oligonukleotid-Sonde mit mehrfachen komplementären Sequenzen innerhalb des anzestralen Haplotyps hybridisiert.
Eine DNA-Probe kann aus einem Individuum isoliert und dann einer Charakterisierung, wie vorstehend erläutert, unterworfen werden, um den anzestralen Haplotyp zuzuordnen. Beispielsweise kann eine DNA-Probe isoliert und hinsichtlich ihrer spezifischen Hybridisierung mit einer für einen anzestralen Haplotyp spezifischen Sonde, wie sie erfindungsgemäß bereitgestellt wird, analysiert werden.
Alternativ können anzestrale Haplotyp-Sequenzen innerhalb einer DNA-Probe zum Beispiel unter Verwendung herkömmlicher Techniken, wie lineare Amplifikation, mit einem einzigen Primer, der mit anzestralen Haplotyp-Sequenzen hybridisiert, oder durch Amplifikation unter Verwendung von Primerpaaren amplifiziert werden. Amplifizierte Sequenzen können dann direkt mittels visueller Analyse aufgetrennter Fragmente oder durch Reaktion mit für einen anzestralen Haplotyp spezifischen oder nicht für einen anzestralen Haplotyp spezifischen Sonden nachgewiesen werden.
Als weiteres Beispiel kann eine DNA-Probe von einem Individuum mit einer oder mehreren Restriktionsendonukleasen umgesetzt und die erhaltenen Fragmente können aufgetrennt werden, z. B. mittels Gelelektrophorese, gefolgt von anschließender Analyse der Restriktionsfragmente unter Verwendung einer relevanten bzw. entsprechenden MHC- spezifischen Sonde mittels Southern-Analyse (Sambrook et al., 1989). Die erhaltenen Restriktionsfragmentmuster können dann mit Restriktionsfragmentmustern verglichen werden, die von Referenzproben bekannter anzestraler Haplotypen hergestellt wurden. Durch Vergleich von Restriktionsfragmentpolymorphismen mit Referenzproben kann eine Zuordnung eines anzestralen Haplotyps erfolgen. Dies ist aufgrund der absoluten Konservierung von anzestralen Haplotyp-Sequenzen innerhalb eines spezifischen anzestralen Haplotyps möglich.
Durch Vergleich von Nukleotidsequenzen anzestraler Haplotypen haben die Erfinder überraschenderweise polymorphe Regionen innerhalb des anzestralen Haplotyps identifiziert, der stabile Abfolgen von Nukleotiden umfaßt, die sich zwischen anzestralen Haplotypen unterscheiden. Diese polymorphen Regionen sind haplotypische geometrische Elemente (HGEs).
Es werden etwa 50 anzestrale Haplotypen in der menschlichen kaukasischen Population selektiert, wobei jeder anzestrale Haplotyp haplospezifische geometrische Elemente besitzt. Die HGEs sind dahingehend geometrisch, daß es einen mathematischen Zusammenhang zwischen der Anzahl Basen gibt, die ein Merkmal jedes anzestralen Haplotyps ist. Eine Geometrie besteht auch in dem Sinne, daß eine Symmetrie um das Zentrum der Region vorliegt, das sich von den Begrenzungen unterscheidet, die für verschiedene anzestrale Haplotypen mehr oder weniger gleich sind. HGEs sind auch dahingehend einzigartig bzw. unterscheidungskräftig, daß eine nicht zufällige Verwendung von Nukleotiden mit Iteration bestimmter Komponenten der Sequenz vorliegt. Diese Komponenten können zwar einfache Sätze enthalten (z. B. Di- und Trinukleotid- Iterationen), aber diese definieren die Elemente nicht selbst und ermöglichen keine Erkennung von Haplospezifität oder geometrischen Mustern.
Wie nachstehend beschrieben, ist gezeigt worden, daß HGEs an verschiedenen Stellen im MHC vorkommen. Elemente an jeder dieser Stellen können miteinander dahingehend verwandt sein, daß sie die gleiche oder eine vorhersagbare Geometrie besitzen.
Es sollte beachtet werden, daß der Nachweis von HGEs und tatsächlich auch die Charakterisierung von DNA-Sequenzen, die anzestralen Haplotypen oder Rekombinanten davon entsprechen, nicht von der Verwendung einer spezifischen Technik abhängen. Wie hier beschrieben, kann eine Vielzahl von Techniken zur Identifizierung und Charakterisierung von Sequenzen mit für einen anzestralen Haplotyp spezifischer Sequenz verwendet werden.
Zwar sind HGEs für jeden einzelnen anzestralen Haplotyp charakteristisch und ihre Charakterisierung liefert daher direkte Informationen über den anzestralen Haplotyp, aber auch Nukleotidsequenzen außerhalb der HGEs können zur Unterscheidung zwischen anzestralen Haplotypen verwendet werden. Die Erfinder haben entdeckt, daß sich Sequenzen anzestraler Haplotypen über ihre gesamte Länge voneinander unterscheiden, obwohl eine deutliche Variation innerhalb der HGEs auftritt. Folglich kann die Nukleotidsequenz verschiedener anzestraler Haplotypen bestimmt und die entsprechenden Unterschiede zwischen ihnen dazu verwendet werden, Polynukleotid-Sonden zu konstruieren, die zwischen anzestralen Haplotypen unterscheiden. Vorzugsweise hybridisieren die Sonden mit komplementären Sequenzen in einer Region, welche die HGEs flankiert, und hybridisieren an komplementäre Stellen, die mindestens zweimal vorliegen.
Unter einem Aspekt dieser Erfindung wird ein Verfahren zur genetischen Analyse bereitgestellt, umfassend die Schritte:
(a) Hybridisieren eines oder mehrerer Polynukleotid-Primer mit einer komplementären Nukleotidsequenz zu Nukleotidsequenzen, die HGEs flankieren, mit einer Probe, die eine DNA-Sequenz enthält, die einem Multigenkomplex, wie dem MHC, entspricht;
(b) Amplifizieren der HGEs innerhalb des Multigenkomplexes durch mehrfache Zyklen der Primerverlängerung; und
(c) Nachweisen der amplifizierten Produkte, die aus der Primerverlängerung der HGEs resultieren, wobei die Produkte für anzestrale Haplotypen oder Rekombinanten davon charakteristisch sind.
Zur Amplifizierung können einzelne Primersequenzen eingesetzt werden (wie bei linearer Amplifikation), wonach die amplifizierten Produkte durch Hybridisierung mit Sonden nachgewiesen werden können, die in ihrer Sequenz zu dem amplifizierten HGE komplementär sind.
Gepaarte Nukleotidsequenzen, die HGEs flankieren, können zur Amplifizierung der HGEs nach mehrfachen Zyklen der Primerverlängerung eingesetzt werden. Die amplifizierten Produkte können durch direkte visuelle Analyse nach Auftrennung auf einem Gel oder einem anderen Trennmedium nachgewiesen werden.
HGEs oder auch andere Regionen des anzestralen Haplotyps des menschlichen MHC können durch direkte Amplifikation von einzelsträngiger RNA oder denaturierter doppelsträngiger DNA amplifiziert werden. Diese Verfahren, die T7-RNA- Polymerase zur Herstellung einer großen Anzahl Kopien von jedem Matrizenmolekül einsetzen, sind von Compton, 1991, beschrieben.
Die erfindungsgemäßen Verfahren können in einem Verfahren zum Nachweis eines anzestralen Haplotyps verwendet werden, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt:
(a) Vergleichen von Nukleotidsequenzen von einem oder mehreren anzestralen Haplotypen, um Polymorphismen zwischen den anzestralen Haplotyp-Sequenzen festzustellen;
(b) Konstruieren von Polynukleotiden aus jeder Sequenzregion zwischen anzestralen Haplotyp-Sequenzen, die zwischen verschiedenen anzestralen Haplotypen unterscheiden;
(c) Verwenden der Polynukleotide von Schritt (b) zum Nachweis eines anzestralen Haplotyps eines Multigenkomplexes, wie des MHC, aus dem Genom einer Probe eines höheren Organismus durch Hybridisieren des Polynukleotids an das Genom und anschließendes Nachweisen der Polynukleotid-Bindung oder von deren Fehlen.
Bei diesem Verfahren können Polynukleotide zur Amplifikation ausgewählter Sequenzen anzestraler Haplotypen verwendet werden, wobei die Erzeugung von amplifizierten Sequenzen der Identifikation des anzestralen Haplotyps entspricht.
Die vorstehend genannten HGEs eignen sich besonders als Ersatzmarker für HLA-B. HGEs liegen neben HLA-B auf dem MHC und etwa 30 bis 50 Kilobasen in Richtung des Centromerendes des menschlicher. Chromosoms 6. Folglich ermöglicht die Charakterisierung von HGEs einen direkten Rückschluß auf den anzestralen Haplotyp am HLA-B-Locus. Angenommen, eine Rekombination zwischen HGEs und dem. HLA-B ist ein seltenes Ereignis, dann sollte die Zuordnung eines anzestralen Haplotyps auf der Grundlage der Charakterisierung des HGE, insbesondere innerhalb des CL-1-Locus, auch für das HLA-B- Allel gelten, mit Ausnahme der Situation, wenn eine Rekombination zwischen den HGEs und dem HLA-B-Allel erfolgt.
Unter einem weiteren Aspekt dieser Erfindung wird ein Verfahren zur Ersatztypisierung am HLA-B-Allel bereitgestellt, wobei das Verfahren die Charakterisierung der Nukleotidsequenz eines HGE umfaßt.
Die Nukleotidsequenz von HGEs kann durch im Fachgebiet bekannte Verfahren zur Charakterisierung beliebiger Nukleotidsequenzen durchgeführt werden.
Unter einem weiteren Aspekt dieser Erfindung wird ein Verfahren zur genetischen Analyse bereitgestellt, umfassend die Schritte:
(a) Spalten einer DNA-Probe, die einem ersten menschlichen anzestralen Haplotyp oder einer Rekombinante davon entspricht, mit einer oder mehreren Restriktionsendonukleasen, wobei die Restriktionsendonukleasen nicht innerhalb der HGEs eines Multigenkomplexes, wie des MHC, spalten;
(b) Auftrennen und Analysieren der so hergestellten DNA- Restriktionsfragmente und Vergleichen dieser mit einer oder mehreren Referenzproben, die anzestrale Haplotypen eines bekannten anzestralen Haplotyps oder Rekombinanten davon umfassen und mit den ein oder mehreren Restriktionsendonukleasen von Schritt (a) gespalten wurden, um eine Identität oder Nicht-Identität zwischen ihnen festzustellen.
Die erfindungsgemäßen Verfahren ermöglichen die Bereitstellung genomischer DNA, die einem anzestralen Haplotyp eines Multigenkomplexes, wie des MHC oder eines Fragments davon, entsprechen. Als Beispiel kann genomische DNA bereitgestellt werden, die den anzestralen Haplotypen 57.1, 7.1, 8.1, 18.2, 46.1 und 62.1 des MHC entspricht. Diese anzestralen Haplotypen sind für etwa 50 anzestrale Haplotypen repräsentativ, von denen etwa 22 für etwa 72% der anzestralen Haplotypen des menschlichen MHC in der kaukasischen Population repräsentativ sind. Nach den erfindungsgemäßen Verfahren kann jede genomische DNA eines anzestralen Haplotyps oder ein Fragment davon unter Verwendung von Hybridisierungsonden isoliert werden, die gemeinsame Sequenzen zwischen anzestralen Haplotypen erkennen. Diese konservierten Sequenzen flankieren HGEs.
Insbesondere kann eine genomische DNA-Sequenz bereitgestellt werden, die einem Fragment des anzestralen Haplotyps 57.1 mit einer in Fig. 1 dargestellten Nukleotidsequenz entspricht. Diese Erfindung ermöglicht zudem die Bereitstellung einzigartiger Fragmente einer solchen Sequenz, die gewöhnlich mehr als 30 bis 50 Nukleotide umfassen. Es sollte beachtet werden, daß leicht Suchen in DNA-Datenbanken durchgeführt werden können, um die Einzigartigkeit von Fragmenten festzustellen, die für anzestrale Haplotypen charakteristisch sind. Proteinprodukte, die von einem oder mehreren der von dieser Nukleotidsequenz codierten Gene codiert werden, können ebenfalls bereitgestellt werden. Die von dem einen oder mehreren Genen oder Fragmenten davon codierten Proteinprodukte können als therapeutische immunregulatorische Mittel besonders nützlich sein.
In der Anmeldung beschrieben ist ein HGE eines Multigenkomplexes, wie des MHC.
HGEs mit charakteristischer Nukleotidsequenz liegen in jedem anzestralen Haplotyp vor. Folglich sind HGEs für jeden anzestralen Haplotyp, beispielsweise des MHC, charakteristisch. Wie zuvor erwähnt, besitzen HGEs Geometrie in dem Sinne, daß eine Symmetrie um das Zentrum der Region vorliegt, die sich von den Begrenzungen unterscheidet, die bei verschiedenen anzestralen Haplotypen mehr oder weniger gleich sind. HGEs unterschieden sich auch darin, daß eine nicht zufällige Verwendung von Nukleotiden mit Iteration bestimmter Komponenten der Sequenz, nämlich Di- und Trinukleotid-Iterationen, vorliegt.
HGEs sind dadurch gekennzeichnet, daß sie konservierte Sequenzen an ihren Begrenzungen und eine variable Anzahl von Di- und Trinukleotidwiederholungen in der zentralen Region besitzen.
Beispiele für HGEs haben die folgenden Sequenzen: TABELLE 1
. = Konsensusequenz
X: 5' - ACAAGCCCCCAGCAGAATTCTGCTTTTCAAA
Y: 5' - CAAGTCTCAATATTCAGTAGCTCTGACTTCTGGATAGTC
Z: 5' - CAAGTCTCAATATTGAGTAGCTGTGACTTCTGGATAGTC
P: 5' - CAAGTCTCAATACTGAGTAGCTGTGACTTCTGGATAGTC
Es ist wichtig zu beachten, daß die Sequenzen, die HGEs flankieren, gewöhnlich zwischen den verschiedenen anzestralen Haplotypen hochkonserviert sind. Somit ermöglichen diese Regionen die Herstellung von Polynukleotid-Sonden, welche die Charakterisierung von HGEs durch Amplifikation solcher Sequenzen unter Verwendung von im Fachgebiet bekannten und hier vorstehend beschriebenen Techniken ermöglichen.
Ein Polynukleotid, das die Identifikation und/oder Amplifikation von HGEs des MHC ermöglicht, ist eine Oligonukleotid-Sonde oder ein Primer, die bzw. der mit komplementären Sequenzen hybridisieren kann, die mindestens einmal innerhalb eines anzestralen Haplotyps vorliegen und mindestens eine polymorphe Region innerhalb des anzestralen Haplotyps flankieren, wobei die flankierende Sequenz zwischen anzestralen Haplotypen konserviert ist und die polymorphe Region stabile Abfolgen von Nukleotiden umfaßt, die sich zwischen anzestralen Haplotypen unterscheiden,
wobei die polymorphe Region eine Region ist, die als "haplospezifisches geometrisches Element" bezeichnet wird und für einen individuellen anzestralen Haplotyp kennzeichnend (d. h. "haplospezifisch") ist und die weiterhin dadurch kennzeichnet ist, daß
(a) sie insofern geometrisch ist, daß eine mathematische Beziehung zwischen der Basenanzahl besteht, die ein Merkmal jedes anzestralen Haplotyps ist, und dadurch, daß eine Symmetrie um das Zentrum der Region besteht;
(b) sie eine nicht zufällige Verwendung von Nukleotiden aufweist; und
(c) sie Di- und Trinukleotid-Iterationen aufweist.
Polynukleotide gemäß diesem Aspekt der Erfindung können von konservierten Sequenzen stammen, die HGEs des MHC flankieren. Die Anzahl Nukleotide, die das Polynukleotid umfassen, ist nicht von Bedeutung, solange die Polynukleotide zur Identifikation und/oder Amplifikation von HGEs in der Lage sind. Dies kann zum Beispiel durch Hybridisierungsanalyse oder den Nachweis von Amplifikationsprodukten leicht bestätigt werden. Polynukleotid-Primer, die gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren zur Identifikation und/oder Amplifikation von HGEs des MHC verwendet werden können, sind u. a.:
Ein Polynukleotid, das diese Nukleotidsequenz umfaßt, oder ein Fragment oder Derivat davon, das an Sequenzen hybridisieren kann, die HGEs des MHC flankieren, kann ebenfalls verwendet werden, ist aber nicht Teil der Erfindung.
Bevorzugte erfindungsgemäße Primer sind die nachstehend dargestellten in 5'-3'-Richtung:
Diese Erfindung ermöglicht außerdem die Bereitstellung eines rekombinanten Vektors, der einen menschlichen anzestralen Haplotyp, eine Rekombinante davon oder ein Fragment davon, wie ein HGE, enthält. Rekombinante Vektoren können Plasmide, Bakteriophagensequenzen oder jedes andere DNA- und/oder RNA-Konstrukt umfassen, wie im Fachgebiet zur Erhaltung und Replikation von Nukleotidsequenzen in einer Wirtszelle, nämlich einer prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszelle, bekannt ist.
Rekombinante Vektoren umfassen gewöhnlich einen Selektionsmarker, zum Beispiel ein oder mehrere Gene, die einer Antibiotika- oder Arzneistoffresistenz entsprechen, oder ein oder mehrere Gene, die einem oder mehreren Faktoren, wie Enzymen, entsprechen, die für die Lebensfähigkeit der Wirtszelle Voraussetzung sind. Rekombinante Vektoren umfassen zudem gewöhnlich einen Replikationsursprung, der eine Replikation des Vektors in einer Wirtszelle ermöglicht, sowie eine oder mehrere Restriktionsstellen, damit gewünschte Gene oder Nukleotidsequenzen in den Vektor eingebracht werden können. Myriaden von Wirtszellen sind im Stand der Technik bekannt und zum Beispiel in Sambrook et al. (1989) beschrieben.
Bei einer spezifischen Ausführungsform kann der Vektor ein YAC-Vektor sein, wie beschrieben, der eine genomische DNA- Sequenz umfaßt, die einem anzestralen Haplotyp des MHC, einem Fragment davon oder einem HGE, wie hier vorstehend beschrieben, entspricht.
Zudem kann eine menschliche Zelllinie bereitgestellt werden, die für einen menschlichen anzestralen Haplotyp des MHC homozygot ist.
Für menschliche anzestrale Haplotypen des MHC homozygote menschliche Zellinien können immortalisierte Lymphozyten oder andere immortalisierte menschliche Zelltypen umfassen. Die Immortalisierung kann zum Beispiel durch Transformation mit einem Virus, wie dem Epstein-Barr-Virus (EBV), erfolgen.
Bei noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann die Identifizierung eines anzestralen Haplotyps durch mehrfaches Priming mit einem Primer oder einem Satz von Primern erfolgen. Unter diesem Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, wie vorstehend definiert, zur Identifizierung eines anzestralen Haplotyps auf dem Genom eines Individuums, umfassend das Amplifizieren mehrerer Regionen innerhalb des Haplotyps mit einem einzelnen Primer oder einem Satz von Primern und Vergleichen der Amplifikationsprodukte mit einer Referenzgruppe von anzestralen Haplotypen oder mit den Amplifikationsprodukten eines anderen Individuums. Wie zudem in Fig. 13 gezeigt ist, wurde das mehrfache Priming im HLA-Delta-Block demonstriert.
Diese Erfindung wird jetzt ausschließlich beispielhaft anhand der folgenden nicht beschränkenden Figuren und Beispiele beschrieben. In den Figuren zeigt:
Fig. 1 die DNA-Sequenz eines 6,5 kb BamHI-Fragments des anzestralen Haplotyps 57.1;
Fig. 2 die extrahierte DNA aus 12 homozygoten Zellinien, die drei Beispiele für anzestrale Haplotypen (AH) darstellen: 46.1 (Spuren 2-4), 18.2 (Spuren 5-7), 8.1 (Spuren 8- 10) und 7.2 (Spuren 11-13). Die Amplifikation unter Verwendung von Primern, welche die geometrischen Elemente flankieren, zeigt reproduzierbare Haplotypmuster für alle 4 anzestralen Haplotypen nach Elektrophorese in einem 3% Nusieve-, 1% Agarose-Gel. Der Molekulargewichtsmarker (M) in den Spuren 1 und 14 war mit HaeIII gespaltenes pGEM-3;
Fig. 3 zeigt einen Densitometerscan des in Fig. 2 dargestellten Elektrophoreseprofils im Hinblick auf den anzestralen Haplotyp 8.1 (Spuren 8 und 10). Die Fragmentintensität ist gegen das Molekulargewicht (Anzahl der Nukleotide) der gescannten Fragmente aufgetragen.
Fig. 4 zeigt einen Densitometerscan von DNA-Proben einer repräsentativen Familie (väterlich 4A, mütterlich 4B, Nachkommen 4C), die unter Verwendung der Primer CTREP 3 und CTREP 4 amplifiziert, auf einem Agarosegel aufgetrennt und mit einem Densitometer (Biorad) gescannt wurden. Die Fragmentintensität ist gegen das Molekulargewicht (Nukleotide) aufgetragen. Die väterlichen Sequenzen sind mit "ab", die mütterlichen mit: "cd" und Nachkommensequenzen mit "ac" bezeichnet.
Fig. 5 zeigt einen Doppelverdau von DNA, die aus für anzestrale Haplotypen homozygoten Zellinien isoliert wurde, mit den Restriktionsendonukleasen TagI und RsaI. Die Spaltungen wurden mittels Agarosegel-Elektrophorese aufgetrennt, auf Nylonmembranen übertragen und mit einem ³²P- markierten Fragment hybridisiert, das den Nukleotiden 1552 bis 1823 der Fig. 1 entspricht. Die Autoradiographie erfolgte dann für 1 Tag bei -70ºC.
Fig. 6 zeigt die Ergebnisse der Typisierung der gleichen Zelle (R85-1518) bei drei verschiedenen Gelegenheiten. Die auf der Y-Achse dargestellte Intensität hängt von der DNA- Konzentration ab, und die Größen in Basenpaaren sind auf der X-Achse dargestellt. Das Profil von Lauf 1 enthält fünf Hauptfragmente bei etwa 106, 152, 166, 193 und 214 bp. Die Profile bleiben ähnlich, aber nicht identisch, wenn man sie übereinander legt, wie das untere Bild zeigt. Die Bilder zeigen einige der Wirkungen, die aufgrund von Variationen in der Gesamt-DNA-Konzentration erwartet werden. Es gibt auch kleinere Unterschiede in den Fragmentpositionen, die auf kleine Abweichungen zwischen getrennten Elektrophoreseläufen zurückzuführen sind.
Die genomische DNA wurde in einem 341-Nukleinsäure- Reinigungssystem - Genepure (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA-ABI) aus lymphoblastoiden B-Zellinien extrahiert, die in RPMI-Medium, angereichert mit 15% fötalem Kälberserum, gezüchtet wurden.
Polymerasekettenreaktionen (PCR) wurden in einem 20-ul- Volumen durchgeführt, das 200 ng genomische DNA der Zellinien enthielt. Die Reaktionsgemische enthielten jeweils 400 uM dATP, dTTP, dCTP und dGTP, 2,0 mM Tris-HCl (pH 8,3), 20 mM MgCl&sub2;, 50 mM KCl, jeweils 50 pmol mit FAM oder JOE (ABI) markierte CTREP-3- und CTREP-4-Primer und 1,6 Einheiten Taq-DNA-Polymerase (Amplitaq, Cetus Corp., Emeryville, CA). Die Reaktion erfolgte in einem FTS-1-Thermal-Sequencer (Corbett Research, Mortlake, NSW, Australien). Die DNA wurde 2 Minuten bei 95ºC denaturiert, gefolgt von 35 Thermozyklen (95ºC-10 s, 55ºC-10x, 72ºC-20 s).
Die aus diesen Reaktionen erhaltenen Amplifikationsprodukte wurden an einem 362-Fluoreszenz-Fragmentanalysator- Genescanner (ABT) analysiert, wobei ein 3%iges Gel aus Seaplaque-Agarose mit niedriger Geliertemperatur (FMC Corp., Rockland, MA) in 1 · TBE²³ bei konstanter Spannung von 100 Volt für 8 Stunden verwendet wurde. Der Kamm befand sich 4 cm von der mittels Laser gescannten Region. ROX-markierte interne Längenstandards (Genescan 2500, ABI) wurden mit jeder Probe aufgetrennt.
Fig. 7 zeigt die Profile genotypisch identischer Nachkommen und ihrer Eltern. Nachkommen mit den gleichen nukleären anzestralen Haplotypen (a und c) ergeben sehr ähnliche Profile unter Berücksichtigung einer gewissen Variation in der Gesamt-DNA-Konzentration nach PCR-Amplifikation (Bild 1). Die Profile zeigen die gleiche Anzahl Fragmente der gleichen Größe. Jeder Elternteil (ab-Vater: Bild 2) und (cd- Mutter: Bild 3) kann von seinen Nachkommen unterschieden werden, was zeigt, daß es möglich ist, Individuen zu unterscheiden, die sich nur in einem anzestralen Haplotyp unterscheiden. Zum Beispiel trägt in Bild 2 der anzestrale Haplotyp b zu den Fragmenten bei etwa 154 bp und 211 bp und zur Veränderung der Intensität des Fragments bei etwa 195 bp bei. Ebenfalls ist ersichtlich, daß der anzestrale Haplotyp a und b nicht zu dem Peak bei etwa 128 bp beiträgt. Wie in der dritten Abbildung gezeigt ist, unterscheidet sich der anzestrale Haplotyp d von b erheblich durch seinen hauptsächlichen Beitrag zu den Peaks bei etwa 128 und 215 bp.
Fig. 8 zeigt die CL-Typisierung beim in-Übereinstimmungbringen von Spender/Empfänger-Paaren für die Knochenmarkstransplantation. Die Spender und Empfänger in den Bildern a und b waren an HLA-A, B serologisch identisch und an DRB1 aufgrund von SSO-Typisierung identisch. Die CL-Muster von Spender und Empfänger unterschieden sich in beiden Fällen. Interessanterweise versagte in beiden Fällen die Transplantation nach 14 Tagen. Gleiche CL-Typisierungsmuster bei Spendern und Empfängern in den Bildern c und d gingen mit erfolgreichen Transplantationsergebnisen einher.
Fig. 9 zeigt die Ergebnisse nach Auswahl von vier Zellinien aufgrund dessen, daß sie gemäß einer anderen MHC- Typisierung im anzestralen Haplotyp 8.1 homozygot waren. Das Übereinanderlegen der Profile zeigt, daß die vier zumindest sehr ähnlich sind. Einige kleinere Unterschiede können zumindest teilweise durch die unterschiedlichen relativen DNA-Konzentrationen nach Amplifikation erklärt werden.
Fig. 10 zeigt die CL-Analyse homozygoter Zellinien, die zeigt, daß beim Vergleich von sieben verschiedenen anzestralen Haplotypen unterschiedliche Muster erhalten werden. Tatsächlich wurde jedes dieser Profile bei mindestens einem anderen Beispiel des gleichen anzestralen Haplotyps beobachtet, was darauf hindeutet, daß die Muster reproduzierbar sind. Obwohl die Profile von 7.1, 46.1 und 62.1 scheinbar sehr ähnlich sind, sind kleine Unterschiede in den Peakpositionen ersichtlich (siehe Tabelle 4).
Fig. 11 zeigt, daß die CL- und DRB-Muster Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen verwandten anzestralen Haplotypen aufdecken. Wie gezeigt, gibt es zwischen 7.1 und 7.2 sowie zwischen 46.1 und 46.2 die gleichen Beta-Blöcke (schattiert), wobei Marker verwendet werden, die auf serologischer und DNA-Ebene definiert sind. Wie erwartet, zeigten die Muster der CL-Typisierung eine Identität beim Vergleich von 7.1 mit 7.2 und zwischen 46.1 und 46.2. Die Unterschiede in den Delta-Blöcken der beiden Gruppen können gezeigt werden, wenn die DRB-Muster innerhalb beider Gruppen verglichen werden.
Die DRB-Typisierung erfolgte unter Verwendung der gleichen Reaktionszusammensetzung mit DRB-spezifischen Primern und des gleichen PCR-Schemas, wie bei der CL-Typisierung. Die für die DRB-Typisierung spezifischen Primer wurden anhand veröffentlichter Sequenzen²&sup4; gestaltet. Jeweils 50 pmol FAM- (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) markierter DRB2.a61 (5' X-TGG AAC AGC CAG AAG GAC 3') und ODRBrep (5' GAT AGA GAG GAT TCT AAA TG 3')²&sup4; wurden eingesetzt. Wie bei der CL-Typisierung wurden die PCR-Produkte auf 3% Seaplaque (1 · TBE) (FMC Corp., Rockland, MA) mittels Elektrophorese (100 Volt während 8 Std.) im ABI-362-Genescanner aufgetrennt.
Fig. 12 zeigt eine vergleichende Sequenzanalyse von 6,4 kb aus CL1 der anzestralen Haplotypen 8.1, 18.2 und 57.1. (Die CL1-Sequenz ist in der Genbank unter der Zugangsnummer L04965 hinterlegt.). Paarweise Histogramme veranschaulichen die Anzahl der Nukleotidaustausche pro 50-bp-Intervall (obere Bilder) und die Anzahl inserierter oder deletierter Nukleotide pro 100-bp-Intervall (untere Bilder) zwischen 8.1 und 18.2, 57.1 und 18.2 sowie 57,1 und 8.1.
Fig. 13 zeigt ein Diagramm des Haplotyp-Priming im HLA- Delta-Block.

BEISPIEL 1

Herstellung von Zellinien, die für anzestrale Haplotypen des menschlichen Haupthlstokompatibilitätskomplexes homozygot sind:
B-Lymphozyten wurden unter Verwendung von Vollblut, das in Dimethylsulfoxid eingefroren wurde, mit Epstein-Barr-Virus (EBV) transformiert.

Materialien:

1. RPMI 1640-Medium (GIBCO)
2. Fötales Kälberserum (FCS)
3. Penicillin-Gentamycinsulfat (PGS) - verwendet wurden 200 Einheiten/ml und 10 ug/ml Endkonzentration
4. EBV - hergestellt aus der B95-8-Zellinie
5. NUNC-Röhrchen (Handelsname)
6. Costar-Gewebekulturflaschen 3055 (50 ml)
7. Dimethylsulfoxid (DMSO) Analar

Verfahren:

A. Probennahme:

1. Sammeln von 10 ml Blut in Natriumcitrat- oder heparinisierte Antikoagulanzröhrchen. Zentrifugieren bei 500 g/10 min. Sammeln von 1,5 ml Buffy Coat. Herstellung von 0,25-ml-Buffy-Coat-Aliquoten in NUNC-Röhrchen und Unterbringen für 30 min bei 4ºC.
2. Zugeben von 0,025 ml DMSO (10% Vol./Vol.) zu jedem 0,25-ml-Buffy-Coat-NUNC-Röhrchen.
3. Unterbringen von NUNCs bei -70ºC bis -80ºC in Kunststoffständer oder Karton für mindestens zwei Stunden. Aufbewahren in flüssigem Stickstoff.
Buffy Coat liefert die besten Ergebnisse, aber es kann auch Vollblut verwendet werden. Es wird das obige Protokoll verwendet, mit Ausnahme der Zugabe von 0,05 ml DMSO zu einem 0,5-ml-Aliquot Vollblut.

B. Transformation:

1. Am nächsten Tag oder anschließend wird ein 0,25-ml- Aliquot im Wasserbad bei 37-41ºC schnell aufgetaut.
2. Resuspendieren in 10 ml RPMI und dann Zentrifugieren für 2 min bei 2500 U/min.
3. Resuspendieren in 0,5 ml 10% FCS in RPMI-PGS (Wachstumsmedium)
4. Infizieren mit 0,1-1,0 ml EBV-Überstand und Zugeben von 2,5 ml Wachstumsmedium
5. Zugeben von 1 ml Wachstumsmedium nach 3-4 Tagen.
6. Überführen in 50-ml-Kulturflaschen nach 5-7 Tagen.
Verfahren zum Herstellen, Einfrieren und Auftauen von EBV- Zellinien:
Lebensfähige Zellen werden langsam mit einer Abnahme von 1- 2ºC/Minute eingefroren, wobei die Eiskristallbildung minimal gehalten wird. Schnelles Auftauen in warmem Wasser optimiert die Rückgewinnung lebensfähiger Zellen.

Reagenzien:

20% fötales Kälberserum (FCS) in RPMI 1640
15% Dimethylsulfoxid (DMSO) in RPMI 1640
Beckman-Röhrchen oder Nunc-Röhrchen steril

Verfahren: (aseptisch)

1. Resuspendieren der einzufrierenden Zellen in RPMI mit 20% fötalem Kälberserum in einer Konzentration von 10 · 10&sup6;/ml.
2. Abkühlen der Zellsuspension in einem Bad mit schmelzendem Eis.
3. Tropfenweises Zugeben eines gleichen Volumens vorgekühltes 15% DMSO in RPMI zur gekühlten Zellsuspension. Ausreichendes Mischen während der DMSO-Zugabe gewährleisten. Eine Alternative ist die Zugabe eines Gefriercocktails (10% DMSO, 15% FCS, 75% RPMI 1640) direkt zum Zellsediment.
4. Füllen der Röhrchen mit Zellen in Gefriercoktail und Aufbewahren bei 4ºC bis alle Röhrchen gefüllt sind.
5. Überführen der Röhrchen in eine Gefriertruhe bei -70ºC, um das Einfrieren mit einer Abnahme von 1-2ºC/Minute zu erleichtern.
6. Überführen der Röhrchen in flüssigen Stickstoff innerhalb von zwei Tagein.
Es wurden Familienstudien mittels HLA-Typisierung an immortalisierten Lymphozyten durchgeführt, die gemäß den vorstehenden Verfahren hergestellt wurden. Die HLA-Typisierung erfolgte gemäß herkömmlichen Verfahren (Terasaki et al., 1976), und alle Mitglieder einer Familie wurden allgemein typisiert. Individuen, die bezüglich eines bestimmten anzestralen Haplotyps als homozygot oder für zwei anzestrale Haplotypen oder Rekombinanten davon als heterozygot typisiert wurden, wurden für eine weitere Analyse ausgewählt.
Ein erster, als R85 1518 bezeichneter Patient, wurde wie folgt typisiert: Anzestrale Haplotypen:
Dieses Individuum wurde als anzestraler Haplotyp 8.1 typisiert und war für diesen anzestralen Haplotyp homozygot.
Ein zweites, als R85 5054 bezeichnetes Individuum, wurde wie folgt typisiert:
Dieses Individuum wurde als anzestraler Haplotyp 18.2 typisiert, und durch die vorstehende serotypische Analyse wurde gezeigt, daß es für diesen anzestralen Haplotyp homozygot war.
Gemäß den vorstehend genannten Verfahren wurden menschliche Zellinien hergestellt, die für die folgenden menschlichen anzestralen Haplotypen homozygot waren:
7.1, 7.2, 18.1, 13.1, 18.1, 18.2, 35.1, 42.1, 44.1, 45.2, 44.3, 46.1, 46.2, 47.1, 52.1, 54.1, 57.1, 60.3, 62.1, 62.2 und 65.1

BEISPIEL 2

Konstruktion genomischer Banken von haplospezifischen Zellinien

Analyse genomischer Klone:

Eine Polynukleotid-Sonde, die an den menschlichen Haupthistokompatibilitätskomplex hybridisieren kann und nachstehend als Y bezeichnet wird, wurde von Klon M20A (Spies et al., 1989) erhalten. Die Position dieser Sonde ist etwa 36 kb in Centromerrichtung von HLA-B. Diese Sonde wurde mittels Zufallspriming mit α-[³²P]-dCTP markiert (Sambrook et al., 1989). Genomische Lambda-Klone der Region wurden von den 4 anzestralen Haplotypen 8.1, 18.2, 57.1 und 7.1 isoliert. Die Restriktionsanalyse der 8.1-, 57.1- und 7.1- Klone mit BamHI zeigte, daß 2 Populationen mit überlappenden Klonen vorlagen. Die beiden klonierten Regionen wurden als CL1 und CL2 bezeichnet, und es wurde festgestellt, daß sie ein hybridisierbares 6,5-kb- bzw. 4,5-kb-BamHI-Fragment trugen. Die Ergebnisse wurden mittels Southern- Hybridisationsanalyse von genomischer DNA bestätigt. Nach Spaltung mit BamHI wurden zwei Fragmente (6 kb und 4,5 kb) mit gleicher Intensität in den anzestralen Haplotypen 8.1, 57.1, 7.1 und 18.2 beobachtet. Die Southern-Analyse bestätigte, daß die hybridisierenden Regionen bei allen 4 anzestralen Haplotypen dupliziert waren und durch zwei BamHI- Fragmente von 6,5 kb und 4,5 kb markiert wurden. Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE) zeigte, daß die 6,5- und 4,5-kb- Fragmente innerhalb von etwa 30 kb voneinander im MHC- Intervall zwischen TNF und HLA-B liegen. Das 6,5-kb- und das 4,5-kb-BamHI-Fragment der 4 anzestralen Haplotypen (ausgenommen 4,5-kb-BamH von 18.2) wurden entweder in pGEMTZf(+) oder pBCKS(+) subkloniert und nach Präparation von durch Exonuklease III erzeugten Deletionsklonen oder Primer-Walking sequenziert (Sambrook et al., 1989). Die Sequenzanalyse erfolgte unter Verwendung von mit Fluoreszenzfarbstoff markierten M13-Primern und einem Cycle- Sequencing-Kit (Applied Biosystems Inc.). Die mit Fluoreszenzfarbstoff markierten Verlängerungsprodukte wurden an einem Modell-373-DNA-Sequenziergerät (Applied Biosystems Inc.) analysiert. Editieren und Ausrichten der Sequenzdaten erfolgten unter Verwendung des SeqEd-Programms (ABI) an einem Macintosh CI (Apple Computer Inc., Cupertino, Ca.)
Die Sequenzanalyse des 6,5-kb-BamHI-Fragments von 57.1 ist in Fig. 1 gezeigt. Die Sequenzanalyse der übrigen anzestralen Haplotypen wurde bestimmt, ist aber nicht dargestellt. Aus einem Vergleich der Nukleotidsequenzen der 6,5- und 4,5-kb-BamHI-Fragmente der verschiedenen anzestralen Haplotypen wurden Regionen mit extremem, abgegrenztem Polymorpilismus zwischen den anzestralen Haplotypen erkannt und als HGEs bezeichnet.
In Tabelle 1 sind die Nukleotidsequenzen von haplotypspezifischen geometrischen Elementen (HGEs) für entsprechende anzestrale Haplotypen angegeben. Es ist leicht ersichtlich, daß die Sequenz reiterierte Dinukleotide und möglicherweise andere nicht zufällige Muster enthält (aber nicht notwendigerweise darauf beschränkt ist). Es gibt zudem eine leichte scheinbare Symmetrie um die Region, die deletiert oder inseriert ist (Tabelle 1). Nukleotidsequenzen, welche die verschiedenen HGEs flankieren, sind über mindestens 100 Basenpaare konserviert. Lies ist ein wichtiger Befund, da von diesen konservierten Regionen hergestellte Sonden zum Nachweisen/Charakterisieren von HGEs verwendet werden können, die für einen bestimmten anzestralen Haplotyp des menschlichen Haupthistokompatibilitätskomplexes charakteristisch sind.
Die Daten der Tabelle 1 werden in Tabelle 2 auf unterschiedliche Weise dargestellt (Hinweis: schattierte Abschnitte in Tabelle 2 stehen für "TGTGTGTGTGTG" bzw. "TGTGTG").
Aus Tabelle 2 ist ersichtlich, daß die HGE-Sequenzen zwischen den einzelnen anzestralen Haplotypen Insertions- /Deletions-Variation zeigen. Diese Variationen sind der effizienteste Weg zur Erzeugung von Polymorphismus.
Es sollte beachtet werden, daß die nachstehenden Verfahren zum Nachweis des anzestralen Haplotyps unter Verwendung von haplospezifischen geometrischen Elementen sich auf Variationen innerhalb nicht-konservierter Bereiche konzentriert, was mit Deletionen/Insertionen korreliert, welche die Länge oder Anzahl der Nukleotide innerhalb eines haplospezifischen geometrischen Elements verändern.
Haplospezifische geometrische Elemente des menschlichen MHC scheinen zwar der hauptsächliche Brennpunkt von Variationen zu sein, die größtenteils durch Nukleotiddeletionen und in gewissem Ausmaß -insertionen repräsentiert sind, aber Variationen zwischen anzestralen Haplotypen treten entlang der gesamten übrigen Sequenz der anzestralen Haplotypen auf (und sind durch Nukleotiddeletionen, -insertionen und Nukleotidsubstitutionen repräsentiert - Fig. 12). Daher lassen sich auch Sequenzvariation außerhalb der haplospezifischen geometrischen Elemente zur Unterscheidung zwischen anzestralen Haplotypen nutzen.
Es sollte beachtet werden, daß CL1 jedes anzestralen Haplotyps eine Duplikation der CL2-Region ist. TABELLE 2 Die haplospezifischen geometrischen Elemente in der CL-Region zeigen einen Grad an Geometrie und Symmetrie.
. = Konsensussequenz Anzahl deletierter Nukleotide

BEISPIEL 3

Nachweis des anzestralen Haplotyps unter Verwendung von primerspezifischer Amplifikation

Oligonukleotidprimer, welche die HGE-Sequenz flankieren, wie im Beispiel 2 beschrieben, werden gemäß Standardverfahren synthetisiert (Applied Biosystems Anwenderinformation, Ausgabe 13,1. April (1987)).
Die PCR-Primer CTREP 3 und CTREP 4 (nachstehend beschrieben) begrenzen eine HGEL-Sequenz, die sich in der CL1-Region befindet. Sie wurden unter Verwendung von Phosphoramidit- Chemie an einem Modell-391-DNA-Synthesegerät (Applied Biosystems, Inc.) synthetisiert, und nach Entfernung der Schutzgruppen gereinigt. Die Primersequenzen sind in Tabelle 3 dargestellt. TABELLE 3 Sequenzbezeichnung
Die ersten 18 Nukleotide der vorstehenden Primer stellen M13-Universal- (CTREP 3) und M13-Rück- (CTREP 4) Sequenzierprimer dar. Demnach können die ersten 18 Nukleotide von diesen Sequenzen entfernt werden.

Amplifikation von HGE-Sequenzen:

Eine Gruppe von 29 EBV-transformierten menschlichen B- Zellinien wurde analysiert. Diese Zellen wurden aus einer EBV-Transformation peripherer Blutlymphozyten (PBL) oder aus der Referenzzellgruppe des 10. Internationalen Histokompatibilitäts-Workshop erhalten. Bei den Zellinien wurde der Genotyp für HLA-Klasse-I-, -II- und Komplementloci mittels Serologie, Komplementallotypisierung oder RFLP-Analyse bestimmt. Zellinien, die für einen bestimmten anzestralen Haplotyp homozygot waren, wurden ausgewählt und in die Gruppe eingeschlossen. Aus 12 homozygoten Zellinien wurde DNA unter Verwendung eines Proteinase K/Phenolextraktions- Protokolls, wie beschrieben (Dawkins et al., J. Immunogenetics 14: 89 (1987), isoliert.

PCR und Analyse der Produkte:

Polymerasekettenreaktionen (PCR) wurden in einem Volumen von 100 ul mit 500 ng genomischer DNA aus einzelnen EBVtransformierten B-Zellinien, je 200 uM dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 2,0 mM Tris-HCl (pH 8,3), 2,0 mM Magnesiumchlorid, 50 mM KCl, je 50 umol CTREP-3- und CTREP-4-Primer und 2 Einheiten Taq-DNA-Polymerase (Amplitaq, Cetus Corp.) durchgeführt. Die Proben wurden mit Mineralöl (Sigma) überschichtet und Thermozyklen unterworfen (30 Zyklen mit 90ºC für 30 s, 55ºC für 30 s, 72ºC für 60 s), gefolgt von einer abschließenden Verlängerung für 10 Minuten bei 72ºC. Die Produkte wurden mittels Elektrophorese in 3% Nusieve/1% Seakem-Agarose (FMC Corp., Rockland, Ma), 1 · TBE analysiert.
Die amplifizierten Produkte wurden mittels Agarosegelelektrophorese aufgetrennt, und das erhaltene Muster ist in Fig. 2 anhand von Proben gezeigt, die vier anzestrale Haplotypen repräsentieren.
Aus Fig. 2 ist sofort ersichtlich, daß jeder anzestrale Haplotyp ein wiederholbares, charakteristisches Bandenmuster sowohl hinsichtlich Größe als auch relativer Intensität besitzt. Es ist ebenfalls ersichtlich, daß Primer zur Amplifikation verschiedener Loci entlang des gesamten anzestralen MHC-Haplotyps von HLA-A bis HLA-DQ hergestellt werden konnten.
Wie Fig. 2 zeigt, ist es möglich, die CL1- und CL2- Elemente in genomischer DNA aus Zellinien zu amplifizieren, die für anzestrale Haplotypen homozygot sind, für die Daten der CL-Region nicht verfügbar sind, und daß Gelmuster erhalten werden, die für verschiedene anzestrale Haplotypen charakteristisch sind. Zum Beispiel würde man für den anzestralen Haplotyp 8.1 mindestens zwei Banden mit 173 Basenpaaren und 213 Basenpaaren Vorhersagen, welche die Addition der Primerlängen plus die Abstände zwischen den Primerpositionen in CL1 bzw. CL2 darstellen. Das in allen Fällen beobachtete komplizierte Muster kann das Vorliegen zusätzlicher hybridisierender Regionen oder Wechselwirkungen zwischen spezifischen PCR-Produkten widerspiegeln. In jedem Fall sind die Muster für einen bestimmten anzestralen Haplotyp typisch und müssen daher aus den MHC-Loci stammen.
Fig. 2 wurde unter Verwendung eines Densitometers (Biorad) gescannt, und der für den anzestralen Haplotyp 8.1 erhaltene Scan ist in Fig. 3 gezeigt. Diese Abfolge von Peaks ist für den anzestralen Haplotyp 8.1 einzigartig. Jeder anzestrale Haplotyp ergibt einen besonderen Scan, der leicht von den Scans anderer anzestraler Haplotypen unterschieden werden kann. Also ermöglicht eine direkte Analyse von gescannten Amplifikationsprodukten eine schnelle Identifikation des anzestralen Haplotyps durch Vergleich mit Bezugsstandards von bekannten anzestralen Haplotypen.
Bei einer ähnlichen Reihe von Experimenten wurden DNA- Proben aus EBV-transformierten Zellinien einer repräsentativen Familie isoliert. Die DNA-Amplifikation wurde wie vorstehend unter Verwendung der Primer CTREP 3 und CTREP 4 durchgeführt, und die amplifizierten Fragmente wurden auf einem Agarosegel fraktioniert und mit einem Densitometer (Biorad) gescannt. Der Densitometerscan ist in den Fig. 4A bis 4C gezeigt, die mehrere Vergleiche zwischen Eltern und Nachkommen darstellen. Aus Fig. 4A ist ersichtlich, daß die väterlichen und mütterlichen Scans eine HLA-Nicht- Identität nachweisen. Es gibt zwar einige gleiche Fragmente, aber die Scans überlappen eindeutig nicht. Die Nachkommen waren haploidentisch, wie Fig. 4B anhand der überlappenden Aufzeichnungen zeigt. Die Nachkommen besitzen die anzestralen Haplotypen ac, die eine Kombination des väterlichen anzestralen Haplotyps a und des mütterlichen anzestralen Haplotyps c sind. Fig. 4C zeigt einen Scan, der den väterlichen anzestralen Haplotyp (ab) und den anzestralen Haplotyp (ac) eines Nachkommen vergleicht. Dieser Scan zeigt eine Zwischenform, bei dem eine Reihe Peaks übereinstimmen und andere eindeutig unterschiedlich sind.
Die in den Fig. 4A bis 4C gezeigten verschiedenen Scans von Amplifikationsprodukten zeigen, daß sich der anzestrale Haplotyp durch Vergleich von anzestralen Haplotyp-Sequenzen zuordnen läßt. Jeder anzestrale Haplotyp ergibt einen charakteristischen und einzigartigen Scan, der Variationen in der Länge der HGE-Sequenz jedes anzestralen Haplotyps widerspiegelt.

RFLP-Analyse:

Eine DNA-Sonde, die den CL1 flankierenden Sequenzen entspricht und zwischen anzestralen Haplotypen konserviert ist, (umfassend die Nukleotide 1552 bis 1823 der Fig. 1) wurde zur RFLP-Analyse gespaltener DNA aus 50 EBV- transformierten menschlichen Zellinien eingesetzt. Die Zellgruppe deckte 21 verschiedene anzestrale Haplotypen ab, wie in Tabelle 3 dargestellt ist.

Elektrophorese und Southern-Blot-Analyse:

Genomische DNA (10 ug) wurde mit TaqI (Promega, Madison, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers vollständig gespalten. Bei einigen Biots wurden Doppelspaltungen mit TaqI und RsaI (Promega, Madison, USA) verwendet, weil mit der Sonde weitere Fragmente und bessere Muster erhalten wurden. Die Spaltungen wurden auf 1,1% Agarosegelen bei 25 V 62 Std. (oder auf 0,8% Agarosegelen bei 40 V 18 Std.) in 1 · TBE-Puffer bei Raumtemparatur (RT) elektrophoretisch aufgetrennt und durch das Verfahren von Reed et al. unter Verwendung von 0,4 M NaOH als Transfermedium auf Nylon- Membranen (GeneScreenPlus, DuPont, USA) übertragen. Vorhybridisierung und Hybridisierung der Membranen erfolgten in Hybridisierungsflaschen (Hybaid, Middlesex, GB) bei 42ºC. Die Membranen wurden zweimal für 10 min mit 2 · SSPE bei RT, einmal für 10 min bei 65ºC in 2 · SSPE + 0,5% SDS und einmal für 5-10 min bei 65ºC in 0,5 · SSPE gewaschen. Die Membranen wurden mit Kodak-X-OMAT-Filmen bei -70ºC 1-10 Tage gemäß Standardverfahren exponiert. Die Größen der Restriktionsfragmente wurden anhand einer 1-kb-DNA-Leiter (BRL, Gaithersburg, USA) bestimmt. Die Sonden wurden durch Behandlung mit 0,4 M NaOH von den Membranen gewaschen. Das Waschen wurden durch Exponieren mit frischen Filmen sorgfältig überprüft, und die Membranen wurden dann erneut mit Sonden behandelt.
Der erhaltene Blot ist in Fig. 5 gezeigt (Spaltung mit TaqI und RsaI), und ein deutlicher Polymorphismus zwischen den anzestralen Haplotypen ist ersichtlich. Einige der beobachteten Muster sind spezifisch für einen bestimmten anzestralen Haplotyp. Zum Beispiel trägt nur der anzestrale Haplotyp 65.1 das Muster F.

BEISPIEL 4

Muster der haplospezifischen Typisierung für den Beta-Block und den Delta-Block des MHC

Es scheint mindestens vier verschiedene Polymorphismus- Blöcke innerhalb des MHC-Intervalls zu geben (Fig. 11). Ein Block trägt das HLA-A-Gencluster (Alpha-Block). Der zweite Block trägt HLA-C, HLA-B, EC-1 und CL (Beta-Block). Ein dritter Block enthält C4, C2, Bf und Cyp21 (Gamma- Block), und der vierte Block (Delta) trägt die DR- und DQ- Gencluster. Die Erfinder glauben daher, das es ausreicht, jeden dieser polymorphen, festen Blöcke zu typisieren, um anzestrale Haplotypen und deren Rekombinanten zu identifizieren. Es ist ebenfalls möglich festzustellen, wo eine Rekombination zwischen anzestralen Haplotypen aufgetreten ist. Dann ist es möglich, Funktionen und Krankheiten auf bestimmten polymorphen, festen Blöcken zu kartieren und eine bessere klinische Nutzung, zum Beispiel in Zusammenhang mit Transplantation, zu entwickeln.
In diesem Beispiel zeigen die Erfinder, daß es möglich ist, haplospezifische Typisierungsmuster für den Beta-Block und auch für die Delta-Blöcke zu erkennen.

Reproduzierbarkeit für jede Zelle

Im ersten Fall wurde die Variation, die beobachtet wurde, wenn die gleiche Zelle bei zwei verschiedenen Gelegenheiten typisiert wurde, d. h. zwischen einzelnen Läufen, bestimmt. Wie Fig. 6 zeigt, waren bei jeder Gelegenheit die Anzahl der Fragmente, die Größe der Fragmente und die gesamten Profile im wesentlichen identisch. Scheinbare Variationen sind vernachlässigbar und lassen sich auf Unterschiede in der DNA-Konzentration und in geringerem Maße auf die Elektrophoresebedingungen zurückführen.

Reproduzierbarkeit zwischen genotypisch identischen Nachkommen

Die Typisierung von nukleären Familien sollte es ermöglichen, den Nutzen des Verfahrens abzuschätzen und ein Mittel bereitstellen, mit dem bestimmt werden kann, ob die Profile nur auf Sequenzen innerhalb des MHC zurückzuführen sind. Wie Fig. 7 zeigt, haben Nachkommen, welche die gleichen mütterlichen und väterlichen anzestralen Haplotypen geerbt haben, sehr ähnliche Profile mit der gleichen Anzahl vorliegender Fragmente. Wiederum sind die Unterschiede klein und durch die DNA-Konzentration erklärbar.
Ein Vergleich genotypisch unterschiedlicher Nachkommen sowie von Nachkommen und Eltern sollte es ermöglichen, den Einfluß beider anzestraler Haplotypen, die jedes Individuum aufweist, zu identifizieren. Wie Fig. 7 zeigt, müssen sich die anzestralen Haplotypen b und c erheblich unterscheiden, da ab und ac sehr unterschiedlich sind. Ebenso ist ac recht verschieden von cd, was zeigt, daß a und d unterschiedliche Profile erzeugen. Solange nicht sehr große nukleäre Familien typisiert worden sind, ist es nicht möglich, den genauen Beitrag jedes nukleären anzestralen Haplotyps zum Gesamtprofil zu bestimmen.

Untersuchung der Identität

Unter der Voraussetzung, daß die Erfinder zeigten, daß die Muster genotypisch identischer Nachkommen zumindest sehr ähnlich sind und daß die Muster kompliziert sind, wie für Heterozygote erwartet, wurden dann die CL-Muster von Knochenmarksspender/-empfänger-Paaren verglichen (Fig. 8). Bei drei Nachkommenpaaren mit identischem MHC-Genotyp stimmten die CL-Profile jedes Empfängers genau mit dem Profil des Spenders überein; die anzestralen Haplotyp- Sequenzen waren aufgrund von direkter Abstammung identisch. Wie erwartet, verliefen die Knochenmarkstransplantationen gut. Bei fünf weiteren Paaren stimmten Spender und Empfänger in HLA-A, -B, -C, -DR und -DQ überein, aber weil sich aus Familienstudien keine Haploidentität ableiten ließ, war ungewiß, ob die Übereinstimmung vollständig war. Nicht verwandte Paare können anscheinend hinsichtlich der HLA-Allele übereinstimmen, aber in Bezug auf anzestrale Haplotypen und daher die genomische Sequenz nicht harmonieren.
Da einige HLA-Allele bei mehr als einem anzestralen Haplotyp vorkommen und die HLA-Typisierung keine rekombinanten anzestralen Haplotypen identifiziert, können nicht verwandte Paare gemäß HLA-Typisierung scheinbar übereinstimmen, aber auf Sequenzebene tatsächlich nicht harmonieren. In der Tat stimmten alle fünf Paare in Bezug auf HLA-A und -B gemäß Serologie und gemäß PCR-SSO-Typisierung von DRB perfekt überein, aber die CL-Typisierung zeigte, daß zwei der fünf sich im Beta-Block unterscheiden. Die übrigen drei stimmten genau überein, als wären sie verwandt, was Sequenzidentität aufgrund von entfernter Abstammung von gemeinsamen Vorfahren nahe legt. Die beiden nicht übereinstimmenden Empfänger verloren ihre Knochenmarkstransplantate innerhalb von 14 Tagen, wohingegen die anderen drei sich nach erfolgreicher Transplantation und ausgezeichneter Funktion während Nachsorge-Zeiträumen von 3 Wochen bis mehr als 1 Jahr gut erholten. Betrachtet man alle 8 Paare, gibt es eine perfekte Korrelation zwischen der CL-Übereinstimmung und dem Ergebnis (p < 0,004 nach Fischers Exact Test). Somit stellt das vorliegende verfahren einen Ansatz zum in-Übereinstimmungbringen bereit, das anscheinend der herkömmlichen HLA- Typisierung überlegen ist.

Beziehung zum anzestralen Haplotyp

Die Erfinder untersuchten die Möglichkeit, daß die Muster in Bezug zu anzestralen Haplotypen interpretiert werden können. Das Ziel war, die zwanzig oder möglicherweise fünfzig Muster abzugrenzen, die in einer bestimmten Rassengruppe am Beta-Block auftreten. Auf diese Weise ist es möglich, die Ergebnisse in Bezug auf anzestrale Familien anstelle von kleinen nukleären Familien mit unzureichender verfügbarer Anzahl zu analysieren. Wie Fig. 9 zeigt, wurden vier nicht verwandte Individuen verglichen, von denen bekannt war, daß sie für den anzestralen Haplotyp 8.1 homozygot sind. Somit werden tatsächlich acht verschiedene anzestrale Haplotypen verglichen, wobei Identität erwartet wird (in Fig. 9 gezeigt). Bei jedem Individuum ist die Anzahl Peaks gleich, und die Profile sind sehr ähnlich, wobei die Unterschiede größtenteils oder völlig auf Unterschiede in der DNA-Konzentration zurückzuführen sind. Also ergeben sowohl nukleäre als auch anzestrale Haplotypen spezifische Muster, und die anzestralen Haplotypen sollten eine geeignete Basis zur Typisierung zufällig ausgewählter Heterozygoter bereitstellen.

Unterschiede zwischen verschiedenen anzestralen Haplotypen

Die erfindungsgemäße Strategie beruht auf der Annahme, daß es reproduzierbare Unterschiede zwischen allen anzestralen Haplotypen gibt. Einige Beispiele sind in Fig. 10 gezeigt. Es ist ersichtlich, daß sieben verschiedene anzestrale Haplotypen unterschiedliche Muster ergeben. Obwohl in allen Fällen homozygote Zellinien verwendet werden und daher die Komplexität in Bezug auf Heterozygote verringert ist, scheinen die Unterschiede auszureichen, daß Unterscheidungen zwischen allen sieben möglich sind. Wie in Tabelle 4 gezeigt, sind tatsächlich viel mehr anzestrale Haplotypen verglichen worden, und mit nur zwei Ausnahmen wurden die Unterschiede gefunden. Bei beiden Fällen (46.1 verglichen mit 46.2 und 7.1 verglichen mit 7.2) gibt es die gleichen HLA-Allele. Bei diesen beiden Fällen sind die spezifischen, durch das B-Allel gekennzeichneten. Sequenzen seit der Trennung von Kaukasiern und Japanern (7.1 verglichen mit 7.2) und Chinesen und Japanern (46.1 verglichen mit 46.2) beibehalten worden. Wie erwartet, sind jedoch in beiden Fällen die DRB-Muster unterschiedlich (Fig. 11).
Dagegen kann sich bei anderen anzestralen Haplotypen, die scheinbar das gleiche HLA-B-Allel tragen (18.1 und 18.2), das B-Allel serologisch und mittels isoelektrischer Fokussierung (IEF) "aufspalten", und jeder hat ein eigenes CL- Muster und somit ipso facto einzigartige Beta-Blöcke.

Muster der haplospezifischen Typisierung für den Beta-Block und die Delta-Blöcke des MHC

Es scheint mindestens vier verschiedene Polymorphismus- Blöcke innerhalb des MHC-Tntervalls zu geben (siehe auch Fig. 11). Ein Block trägt das HLA-A-Gencluster (Alpha- Block). Der zweite Block trägt HLA-C, HLA-B, EC-1 und CL (Beta-Block). Ein dritter Block enthält C4, C2, Bf und Cyp21 (Gamma-Block), und der vierte Block (Delta) trägt die DR- und DQ-Gencluster. Die Erfinder glauben daher, daß es ausreicht, jeden dieser polymorphen, festen Blöcke zu typisieren, um anzestrale Haplotypen und deren Rekombinanten zu identifizieren. Es ist ebenfalls möglich festzustellen, wo eine Rekombination zwischen anzestralen Haplotypen aufgetreten ist. Dann ist es möglich, Funktionen und Krankheiten auf bestimmten polymorphen, festen Blöcken zu kartieren und eine bessere klinische Nutzung, zum Beispiel in Verbindung mit Transplantation, zu entwickeln. An diesem Beispiel sahen die Erfinder, daß es möglich ist, haplospezifische Typisierungsmuster für den Beta-Block und auch für die Delta- Blöcke zu erkennen.

BEZUGSSTELLEN:

Banerji [1990], Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2374
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Zhang et al. [1990], J. Exp. Med. 171: 2101 Tabelle 4: Größe und Peakhöhen von Fragmenten aus der "CL"-Typisierung verschiedener anzestraler Haplotypen

Claims

1. Verfahren zum in-Übereinstimmung-Bringen (matching) eines bestimmten anzesuralen Haplotyps in dem Genom von zwei oder mehr Individuen eines höheren Organismus, wobei das Verfahren das Kontaktieren einer Region des Genoms oder eines Fragments oder Teils davon aus jedem Individuum mit einer Oligonukleotid-Sonde oder einem Primer umfaßt, die bzw. der mit mindestens einer komplementären Sequenz hybridisiert, die mindestens eine polymorphe Region innerhalb des anzestralen Haplotyps flankiert, wobei die flankierende Sequenz zwischen anzestralen Haplotypen konserviert ist und die polymorphe Region stabile Abfolgen bzw. Erweiterungen von Nukleotiden aufweist, die sich zwischen anzestralen Haplotypen unterscheiden, und das Vergleichen des Ausmaßes oder des Profils der Hybridisierung oder des Profils der genomischen Amplifikationsprodukte oder der Nukleotidsequenz solcher Amplifikationsprodukte, um die Nicht- Identität oder Identität des anzestralen Haplotyps zu bestimmen bzw. in Übereinstimmung zu bringen,

wobei die polymorphe Region eine Region ist, die als "haplospezifisches geometrisches Element" bezeichnet wird, die für einen individuellen anzestralen. Haplotyp kennzeichnend ist (d. h. "haplospezifisch" ist) und die weiterhin dadurch kennzeichnet ist, daß

(a) sie insofern geometrisch ist, daß eine mathematische Beziehung zwischen der Basenanzahl besteht, die ein Merkmal jedes anzestralen Haplotyps ist, und dadurch, daß eine Symmetrie um das Zentrum der Region besteht;

(b) sie eine nicht zufällige Verwendung von Nukleotiden aufweist; und

(c) sie Di- und Trinukleotid-Iterationen aufweist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Oligonukleotid- Sonde mit einem Reportermolekül markiert ist.

3. Verfahren zur Bestimmung, ob ein Genom eines Individuums eines höheren Organismus im wesentlichen den gleichen anzestralen Haplotyp wie das Genom eines anderen Individuums des höheren Organismus aufweist, wobei das Verfahren das Kontaktieren einer Region des Genoms oder eines Fragments oder eines Abschnitts davon des ersten Individuums mit mindestens einer Oligonukleotid-Sonde und/oder einem Primer für eine Amplifikation umfaßt, die bzw. der dazu in der Lage ist, mit mindestens einer komplementären Frequenz zu hybridisieren, die mindestens eine polymorphe Region innerhalb des anzestralen Haplotyps flankiert, wobei die flankierende Sequenz zwischen anzestralen Haplotypen konserviert wird und die polymorphe Region stabile Abfolgen bzw. Erweiterungen von Nukleotiden aufweist, die sich zwischen anzestralen Haplotypen unterscheiden, und das Vergleichen des Ausmaßes und/oder des Profils der Hybridisierung oder der Nukleotidsequenz der Amplifikationsprodukte mit einer Referenzgruppe anzestraler Haplotypen,

wobei die polymorphe Region eine Region ist, die als "haplospezifisches geometrisches Element" bezeichnet wird, die für einen individuellen anzestralen Haplotyp kennzeichnend ist (d. h. "haplospezifisch" ist) und die weiterhin dadurch gekennzeichnet ist, daß

(a) sie insofern geometrisch ist, daß eine mathematische Beziehung zwischen der Basenanzahl besteht, die ein Merkmal jedes anzestralen Haplotyps ist, und daß eine Symmetrie um das Zentrum der Region besteht;

(b) sie eine nicht zufällige Verwendung von Nukleotiden aufweist; und

(c) sie Di- und Trinukleotid-Iterationen aufweist.

4. Verfahren zum Identifizieren eines anzestralen Haplotyps in dem Genom eines Individuums eines höheren Organismus, wobei das Verfahren das Amplifizieren des anzestralen Haplotyps oder Teilen davon unter Verwendung eines Primers umfaßt, der dazu in der Lage ist, mit komplementären Sequenzen zu hybridisieren, die mindestens einmal innerhalb des anzestralen Haplotyps vorliegen und die mindestens eine polymorphe Region innerhalb des anzestralen Haplotyps flankieren, wobei die flankierende Sequenz zwischen anzestralen Haplotypen konserviert ist und die polymorphe Region stabile Abfolgen bzw. Erweiterungen von Nukleotiden aufweist, die sich zwischen anzestralen Haplotypen unterscheiden, und das Vergleichen der resultierenden Amplifikationsprodukte oder der Nukleotidsequenz davon mit einer Referenz von Amplifikationsprodukten aus einem bekannten anzestralen Haplotyp unter Verwendung von im wesentlichen dem gleichen Primer, um dadurch eine Identität oder Nicht-Identität zwischen beiden festzustellen,

(a) sie insofern geometrisch ist, daß eine mathematische Beziehung zwischen der Basenanzahl besteht, die ein Merkmal jedes anzestralen Haplotyps ist, und daß eine Symmetrie um das Zentrum der Region besteht,

(b) sie eine nicht zufällige Verwendung von Nukleotiden aufweist; und

(c) sie Di- und Trinukleotid-Iterationen aufweist.

5. Verfahren zum Identifizieren eines haplospezifischen geometrischen Elements innerhalb eines anzestralen Haplotyps, wobei das Verfahren das Vergleichen der Nukleotidsequenzen von verschiedenen anzestralen Haplotypen und das Identifizieren von Regionen auf jedem anzestralen Haplotypen umfaßt, die im wesentlichen polymorph zueinander sind und die durch Regionen gebunden sind, die weniger als einen Hintergrund-Polymorphismus aufweisen.

6. Verfahren zum Sicherstellen der Kompatibilität von Donorgewebe für einen Empfänger, wobei das Verfahren das Isolieren einer Nukleinsäuresequenz sowohl aus dem Donor als auch aus dem Empfänger umfaßt, die einen anzestralen Haplotyp oder ein Fragment davon aufweist, und das Bestimmen der Identität oder Nicht-Identität des anzestralen Haplotyps durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei ein kompatibler bzw. verträglicher Donor einen im wesentlichen identischen anzestralen Haplotyp in Bezug auf den Empfänger aufweisen wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Verfahren weiterhin eine Serotypbestimmung des Donors und des Empfängers umfaßt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der höhere Organismus ein Säugetier, eine Pflanze, ein Insekt oder eine Hefe ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Säugetier ein Mensch, ein Nutzvieh, ein Begleittier bzw. Haustier oder ein Wildtier ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Säugetier ein Mensch ist.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei der anzestrale Haplotyp innerhalb eines Multigen-Komplexes auf dem Genom liegt oder einen Multigen-Komplex umfaßt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei der Multigen-Komplex der Haupthistokompatibilitätskomplex, der Lipoproteingenkomplex oder der RCA-Komplex ist.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei der Multigenkomplex der Haupthistokompatibilitätskomplex ist.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die Region des Genoms, die der Hybridisierung oder Amplifikation unterzogen wird, cDNA ist.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Oligonukleotid-Sonde und/oder der Primer mit mindestens zwei komplementären Sequenzen innerhalb des anzestralen Haplotyps hybridisiert.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Oligonukleotid-Sonde und/oder der Primer mit mehreren komplementären Sequenzen innerhalb des anzestralen Haplotyps hybridisiert.

17. Primer, der eine der folgenden Sequenzen in der 5'→3'-Richtung aufweist: