DE68926784T2 - Verfahren zur charakterisierung von hla dp - Google Patents

Description

• Die Erfindung betrifft ein Verfahren und Zusammensetzungen zur Bestimmung des HLA DP-Genotyps eines Individuums. In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung der in den US-Patenten mit den Nrn. 4,683,195 und 4,683,202 offenbarten und beanspruchten Verfahren zur Amplifikation von Genen und das Dot-Blot-Verfahren und die Allel-spezifische Oligonucleotidsonden-Technologie, wie sie im US-Patent 4,683,194 offenbart und beansprucht werden. Die erfindungsgemäßen Verfahren und Sonden betreffen speziell den Nachweis der polymorphen HLA DP-Gene der Klasse II. Die Erfindung betrifft die Bereiche der Molekularbiologie, diagnostischen Medizin und Gerichtsmedizin.
• Die Klasse II-Loci des menschlichen Haupthistokompatibilitätskomplexes codieren die HLA D-Zelloberflächenglykoproteine, die auf B-Lymphocyten, aktivierten T- Lymphocyten, Makrophagen und dendritischen Zellen exprimiert werden. Diese Proteine, die individuell als DR, DQ und DP bezeichnet werden, bestehen aus einer alpha- und einer hoch polymorphen beta-Untereinheit und sind flir die Präsentation von Antigenen flir T-Zellen verantwortlich. Die Variabilität in der hoch polymorphen beta- Untereinheit ist auf die aminoterminale extrazelluläre Domäne begrenzt, die mit dem T- Zellrezeptor und Antigenpeptidfragmenten interagieren soll. Die die HLA-Proteine der Klasse II codierenden Gene liegen beim Menschen auf dem kurzen Arm von Chromosom sechs. Die die HLA DP-alpha- und DP-beta-Ketten codierenden Gene bilden am zentromemahen Ende dieses Bereichs einen Cluster und waren wahrscheinlich aufgrund von niedrigen Expressionsniveaus die letzten aufgeflindenen HLA D-Gene und sind daher am schlechtesten charakterisiert. Die Strukturen, Sequenzen und Polymorphismen im HLA D-Bereich wurden von Trowsdale et al., Immunol. Rev. 85 (1985), 5- 43, zusammengefaßt, deren Veröffentlichung hier durch Bezugnahme mit eingeschlossen ist.
• Der Polymorphismus der Genprodukte des HLA D-Bereichs wurde üblicherweise durch Reagenzien zur serologischen Typisierung und durch die gemischte Lymphocytehkultur (MLC)-Reaktion, bei der die T-Zellproliferation als Antwort auf homozygote Typisierungszellen (HTC) in Kultur gemessen wird, definiert. Die HLA DP-Antigene wurden ursprünglich durch ihre Fähigkeit zur Stimulierung einer starken sekundären Antwort in spezifisch sensibilisierten T-Zellen definiert, ein Verfahren, das als sensibilisierte Lymphocyten-Typisierung (PLT) bekannt ist und von Mawas et al Tissue Antigens 15 (1981), 458-466, Wank et al., Immunogenetics 6 (1978), 107-115, und Shaw et al., J. Exp. Med. 152 (1980), 565-580, beschrieben wird. Die HLA DP- Antigene erzeugen nur eine schwache Antwort in einer primären MLC und im Unterschied zu den Untersuchungen des HLA DR- und HLA DQ-Polymorphismus wurde die Analyse der allelen Variabilität im HLA DP-Bereich durch die Nicht- Verfügbarkeit von serologischen Reagenzien und Typisierungszellen erschwert. Ferner sind die im PLT-Test verwendeten spezifischen Zellinien schwer zu erzeugen, und der Typisierungstest ist langsam und von Labor zu Labor etwas unterschiedlich.
• Die Analysen des zellulären (vgl. Odum et al., Tissue Antigens 29 (1987), 101-109) und biochemischen (vgl. Lotteau et al., Immunogenetics 25 (1987), 403-407) Polymorphismus und des Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP, vgl. Hyldig-Nielsen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 1644-1648) zeigten daß der Grad des Polymorphismus im DP-Bereich größer als in den bisher serologisch im. munologisch oder durch PLT definierten DPw1- bis DPw6-Typen sein kann. Das RFLP-Verfahren zeigte, daß der RFLP des DP-Bereichs relativ groß war und daß einige der Fragmente mit bestimmten DP-Antigenen stark assoziiert waren. Das RFLP- Verfahren weist jedoch bestimmte Einschrähkungen auf. Ein eine variable Sequenz tragendes Allel kann nur identifiziert werden, wenn das variable Nucleotid innerhalh dei Erkennungsstelle eines zur Analyse verwendeten Restriktionsenzyms liegt oder sich eine polymorphe Restriktionsstelle mit einer Variation einer spezifischen codierenden Sequenz im Kopplungsungleichgewicht befindet. Die RFLP-Analyse liefert ferner nur den Nachweis, daß eine Variation bei einer codierenden Sequenz vorliegt, sie liefert jedoch keine Information über die genaue Art der Variation. Ferner müssen relativ große Fragmente der genomischen Nucleinsäure zur Analyse verwendet werden. Diese letzte Bedingung schließt häufig die Verwendung von Proben aus, die unter genomische DNA abbauenden Bedingungen gehalten wurden.
• Eine genaue DP-Typisierung kann flir mehrere medizinische Anwendungen wichtig sein. Eine genetische Rekombination zwischen den DP-Loci und den serologisch typisierten DR-Loci kann so erfolgen, daß serologisch identische Geschwister im DP Bereich nicht übereinstimmen. Die HLA DP-Unterschiede wurden durch RFLP-Analyse in mehreren Fällen von akuter Transplantat-anti-Wirt-Reaktion zwischen den scheinbar HLA-identischen Spender-Empfängerpaaren, wie von Amar et al., J. Immunology 138 (1987), 1947-1953, beschrieben, nachgewiesen. Ferner wurde gezeigt, daß mehrere Autoimmunerkrankungen wie die Zöliakie-Krankheit mit bestimmten DP-Arten, die entweder durch PLT-Analyse, Odum et al., Tissue Antigens 28 (1986), 245-250, oder durch RFLP-Analyse, Howell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 222-226 definiert wurden, in Zusammenhang stehen.
• Eine signifikante Verbesserung der DNA-Amplifikation, das Polymerase- Kettenreaktions (PCR)-Verfahren, wurde von Mullis im US-Patent Nr.4,683,195 offenbart, und Verfahren zur Verwendung der PCR zur Clonierung und zum Nachweis von Nucleinsäuren wurden von Mullis et al. im US-Patent Nr.4,683,202 offenbart Beim PCR-Verfahren werden kurze Oligonucleotidprimer hergestellt, die zu den entgegengesetzten Enden der zu amplifizierenden Sequenz passen. Die Sequenz zwischen den Primern muß nicht bekannt sein. Eine Probe der Nucleinsäure (DNA oder RNA, obwohl RNA im PCR-Verfahren zunächst in cDNA umgewandelt wird) wird extrahiert und vorzugsweise durch Hitze denaturiert und mit in molarem Überschuß vorhandenen Oligonucleotidprimern hybridisiert. Die Polymerisation wird durch eine Polymerase in Gegenwart von Desoxynucleosidtriphosphaten (dNTPs) katalysiert. So werden zwei "lange Produkte" erhalten, die die jeweiligen Primer an ihren 5'-Termini enthalten wobei die Primer an die neu synthetisierten, zu den ursprünglichen Strängen komplementären Stränge kovalent gebunden sind. Die replizierte DNA wird erneut denaturiert, mit Oligonucleotidprimern hybridisiert, erneut Polymerisationsbedingungen unterworfen und ein zweiter Replikationszyklus initiiert. Der zweite Zyklus liefert die zwei Originalstränge, die beiden langen Produkte von Zyklus 1 und zwei lange Produkte von Zyklus 2 und zwei "kurze Produkte", die von den in Zyklus 1 produzierten langen Produkten repliziert wurden. Die kurzen Produkte enthalten Sequenzen (Sense oder Antisense), die von der Zielsequenz stammen und am 5'-Ende von einem Primer und am 3'-Ende von einer zu einem Primer komplementären Sequenz flankiert werden. Bei jedem weiteren Zyklus werden die kurzen Produkte exponentiell repliziert. So werden durch das PCR-Verfahren eine spezifische Zielsequenz amplifiziert, und anfänglich in einer Probe in nur extrem kleinen Mengen vorhandene Sequenzen können nachgewiesen werden.
• Allele Sequenzänderungen in dem das beta-Globin im Hämoglobin codierenden Gen und im HLA DQalpha-codierenden Gen wurden unter Verwendung von Allelspezifischen Oligonucleotiden (ASO) nachgewiesen, die sich nur an vollständig kornplementäre Sequenzen anlagern, wie von Saiki et al., Nature 324 (1986), 163-166, beschrieben. Diese Untersuchungen verwendeten ebenfalls das PCR-Verfahren zur Amplifikation der in den Proben vorhandenen DNA-Sequenzen und ein Dot-Blot- Verfahren zum Nachweis der Hybridisierung der Sonde an die Probe.
• EP-A-0 237 362 offenbart Verfahren zum Nachweis von spezifischen Nucleotidänderungen und genetischen Polymorphismen in Nucleinsäuren unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion. In Beispielen für diese Verfahren werden unter anderem sequenzspezifische Oligonucleotidsonden zum Nachweis von HLA DQalpha-, HLA DPbeta- und HLA Drbeta-Polymorphismen verwendet. EP-A- 0 237 362 offenbart ferner die Amplifikation von HLA DPalpha- und HLA DPbeta- Sequenzen unter Verwendung der bekannten Polymorphismen, die von Trowsdale et al (Immunol. Reviews 85 (1985), 5-43) beschrieben werden, nämlich die DPbeta-Allele DPB2.1, DPB3 und DPB4. Obwohl erwähnt wird, daß weitere Polymorphismen existie ren können, werden keine Sequenzen von möglichen weiteren Allelen beschrieben.
• Kappes et al. 2985-2993] beschreiben Polymorphismen in den hier als HLA DPbeta bezeichneten HLA-Klasse II-SB-Genen für die leichte Kette, während ein biochemisches Typisierungsverfahren zur Analyse des Polymor phismus der HLA DP-Gene für die schwere Kette von Letteau et al. [Immunogenetics 25 (1987), 403-407] beschrieben wird, ohne jedoch eine Sequenzinformation zu geben.
• Ando et al. beschreiben in Hum. Immunol. 21 (1988), 239-248, [Chem Abstr. 109, S.175, 1766k] eine von der Zellinie AKIBA stammende Sequenz eines clonierten DPbeta-Allels mit der Bezeichnung pdabetas, wobei das Allel in der Offenbarung der vorliegenden Patentanmeldung als DPB12 bezeichnet wird. Spätere Arbeiten zeigten, daß die Zellinie AKIBA tatsächlich das DPB9-Allel enthält.
• Ein Zusammenhang zwischen den HLA DP-Genen und der Anfälligkeit für oligoartikuläre juvenile rheumatoide Arfhritis wurde von Hoffmann et al. [Arthritis and Rheumatism 29 (1986), 1057-1061] beschrieben.
• Die vorliegende Erfindung betrifft den Bereich der HLA DP-Typisierung und liefert ein relativ schnelles, bequemes, praktisches, genaues und reproduzierbares Verfahren zur Ermittlung der HLA DPbeta-Genotypen. Das Verfahren beruht teilweise auf der Erkenntnis, daß es eine große Zahl von zuvor nicht beschriebenen DPbeta Allelen gibt. Auf der Basis der Sequenzinformation von allen gefundenen DPbeta Allelen konnten solche Bereiche des DPbeta-Gens identifiziert werden, die für die Unterscheidung der unterschiedlichen DP-Allele am informativsten waren. Es wurde festgestellt, daß die Unterschiede zwischen diesen Allelen sehr groß sind.
• Die vorliegende Erfindung liefert daher ein Verfahren zur Bestimmung des HLA DPbeta-Genotyps eines Individuums in einer Nucleinsäure-enthaltenden Probe wie es in dem angefügten Satz von Ansprüchen definiert ist. Die vorliegende Erfindung stellt ferner eine Reihe von Oligonucleotidsonden, sequenzspezifischen Oligonucleotid sonden sowie Primern zur Verwendung in diesem Verfahren bereit. Ein Kit zur Bestimmung des HLA DPbeta-Genotyps eines Individuums in einer Nucleinsäure- enthaltenden Probe sowie ein bestimmtes Verfahren zur Bestimmung des Zusammenhangs des Genotyps eines Individuums mit einer Autoimmunkrankheit werden ebenfalls bereitgestellt.
• Die vorstehend beschriebenen sequenzspezifischen Oligonucleotidsonden können zur eindeutigen Identifizierung eines Allels verwendet werden. Aufgrund der Streuung der Unterschiede zwischen den DPbeta-Allelen kann kaum eine einzelne Sonde nur ein bestinuntes DPbeta-Allel identifizieren. Stattdessen wird die Identität eines Allels gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren aus dem Bindungsmuster einer Reihe von Sonden abgeleitet, wobei jede einzelne Sonde des Spektrums für andere Abschnitte des HLA DP-Gens spezifisch ist. Die Sonden umfassen eine Nucleotidsequenz, die zu einer variablen Sequenz eines variablen Abschnitts eines DP-Gens vollständig komplementär ist. Die komplementäre Sequenz der Sonden weist vorzugsweise 10 bis 30 Nucleotide, stärker bevorzugt 17 bis 23 Nucleotide und meistens 17 bis 19 Nucleotide auf.
• Wie vorstehend beschrieben, ist PCR ein ziemlich wichtiges Hilfsmittel für auf Nucleinsäuren beruhenden Diagnoseverfahren. Die erfindungsgemäßen neuen Sonden können selbstverständlich zum Nachweis von spezifischen Sequenzen in PCR- amplifizierter DNA verwendet werden. Zur Durchführung der auf der PCR beruhenden HLA DP-DNA-Typisierung stellt die vorliegende Erfindung die die Amplifikation von informativen DP-Bereichen durch PCR ermöglichenden Oligonucleotidprimer bereit.
• Daher ist ein erfindungsgemäßer Gesichtspunkt ein Verfahren zur Ermittlung des HLA DP-Genotyps eines Individuums in einer vom Individuum stammenden Nucleinsäure-enthaltenden Probe, das umfaßt: (a) Amplifikation einer Zielregion dieser Nucleinsäure, die einen polymorphen Bereich eines HLA DP-Gens enthält, (b) Hybridisierung der amplifizierten Nucleinsäure mit einer Reihe von sequenzspezifischen Oligonucleotid (SSO)-Sonden, die für variable Abschnitte der HLA DP-Gene unter Bedingungen, bei denen diese SSO-Sonden und amplifizierten Nucleinsäuren stabile Hybridduplexe bilden können, spezifisch sind und (c) Nachweis der zwischen den amplifizierten Nucleinsäuren und den SSO-Sonden gebildeten Hybride.
• Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft Kits, die zur Bestimmung des HLA DP-Genotyps eines Individuums verwendet werden können; diese Kits umfassen (a) eine Reihe von SSO-Sonden für variable allele Sequenzen in diesem Zielbereich und (b) eine Anleitung zur Bestimmung des Genotyps unter Verwendung von Kitbestandteilen.
• Zum besseren Verständnis der Erfindung werden nachstehend mehrere Begriffe definiert.
• Der Begriff "Genotyp" meint die Genotypvarianten eines in einem Individuum (oder einer Probe) vorhandenen Allels. Der Genotyp eines Individuums kann beispielsweise mit serologischen Reagenzien, Typisierungszellen, durch RFLP-Analyse des Genoms und, wie nachstehend beschrieben, mit SSOs bestimmt werden.
• Der Begriff "HLA DP-Bereich" oder "DP" meint den von Trowsdale et al. a.a.O beschriebenen Bereich des HLA D-Komplexes, der auf der zentromernahen Seite des HLA D-Bereichs liegt und zwei alpha- und zwei beta-Gene enthält, von denen ein Paar Pseudogene sind.
• Der Begriff "Oligonucleotid" meint Primer, Sonden, nachzuweisende Nu cleinsäurefragmente, Nucleinsäurekontrollen und nicht-markierte blockierende Oligomere und ist als ein Molekül definiert, das zwei oder mehrere Desoxyribonucleotide oder Ribonucleotide umfaßt. Die genaue Größe eines Oligonucleotids hängt von vielen Faktoren und der letztendlichen Funktion oder Verwendung des Oligonucleotids ab. Die Oligonucleotide können durch ein beliebiges geeignetes Verfahren hergestellt werden Diese Verfahren schließen beispielsweise die Clonierung und Restriktion von geeigneten Sequenzen ein und eine direkte chemische Synthese durch ein Verfahren wie dem Phosphotriester-Verfahren von Narang et al., Meth. Enzymol. 68 (1979), 90, Phosphodiester-Verfahren von Brown et al., Meth. Enzymol. 68 (1979), 109 Diethylphosphoramidit-Verfahren von Beaucage et al., Tetrahedron Lett. 22 (1981), 1859-1862, und Festträger-Verfahren im US-Patent Nr.4,458,066.
• "Polymorphisch" oder "DNA-Polymorphismus" meint den Zustand, in dem zwei oder mehr Varianten einer spezifischen DNA-Sequenz in der gleichen gekreuzten Population coexistieren.
• "Primer" meint ein natürliches oder synthetisches Oligonucleotid, das als Initiationspunkt einer DNA-Synthese wirken kann unter Bedingungen, bei denen die Synthese eines zu einem Nucleinsäurestrang komplementären Primerextensionsproduktes induziert wird, d. h., in Gegenwart von vier verschiedenen Nucleosidtriphosphaten und einem Polymerisationsmittel (d. h. DNA-Polymerase oder reverse Transkriptase) in einem geeigneten Puffer und bei einer geeigneten Temperatur. Ein Primer ist vorzugsweise ein Oligodesoxyribonucleotid und für eine maximal effiziente Amplifikation einzelsträngig, kann jedoch auch doppelsträngig sein. Ein doppelsträngiger Primer wird zunächst vor der Verwendung zur Herstellung von Extensionsprodukten in Einzelstränge getrennt. Die genaue Länge eines Primers hängt von vielen Faktoren ab, ist jedoch üblicherweise im Bereich von 15 bis 25 Nucleotiden. Kurze Primermolekiile erfordern üblicherweise niedrigere Temperaturen zur Bildung von ausreichend stabilen Hybridkomplexen mit der Matrize. Ein Primer braucht nicht exakt komplementär zur Sequenz der Matrize sein, sondern muß eine ausreichende Komplementarität zur Hybridisierung mit der Matrize aufweisen. Eine im Primer möglicherweise enthaltene, nicht-komplementäre Sequenz codiert beispielsweise eine Restriktionsenzymerkennungsstelle (vgl. US-Patent Nr 4,800,159).
• Der Begriff "Primer" kann hier mehr als einen Primer meinen, besonders dann, wenn ein oder beide Enden der zu amplifizierenden Zielregion nicht genau bekannt sind. Wenn beispielsweise eine Nucleinsäuresequenz von einer Proteinsequenz abgeleitet wird, ist "ein Primer" eigentlich eine Ansammlung von Primeroligonucleotiden, die Sequenzen enthalten, die aufgrund der Degeneration des genetischen Codes alle möglichen Codonvariationen repräsentieren. Ein Primer-Oligonucleotid in dieser Ansammlung wird mit dem Ende der Zielsequenz homolog sein. Wenn ein "konservierter" Bereich in einer Population einen signifikanten Polymorphismus zeigt, können in ähnlicher Weise benachbarte Sequenzen amplifizierende Primer-Gemische hergestellt werden. Ein Primer kann, falls gewünscht, durch Einschluß eines Markers, der durch spektroskopische, photochemische, biochemische, immunchemische oder chemische Verfahren nachgewiesen werden kann, markiert werden. Geeignete Marker schließen beispielsweise ³²P, fluoreszierende Farbstoffe, Reagenzien mit hoher Elektronendichte, Enzyme (wie sie üblicherweise in ELISAs verwendet werden), Biotin oder Haptene oder mit Antiseren oder monodonalen Antikörpern nachweisbare Proteine ein. Ein Marker kann auch zum "Fangen" des Primers verwendet werden, um entweder die Immobilisierung des Primers oder der amplifizierten DNA auf einem festen Träger zu erleichtern.
• Die Begriffe "Restriktionsendonucleasen" und "Restriktionsenzyme" betreffen normalerweise von Bakterien stammende Enzyme, die doppelsträngige DNA am oder nahe einer spezifischen Nucleotidsequenz spalten.
• Der Begriff "Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus" oder "RFLP" meint Unterschiede in den DNA-Nucleotidsequenzen, die zufällig über das ganze Genom verteilt sind und unterschiedliche Restriktionsmuster für verschiedene Individuen nach einer Spaltung von genomischer DNA liefern.
• Der Begriff "sequenzspezifisches Oligonucleotid" oder "SSO" betrifft Oligonucleotide, die eine genau komplementäre Sequenz zu der nachzuweisenden Sequenz, die üblicherweise eine für ein bestimmtes DP-Allel charakteristische Sequenz ist, aufweisen und unter "sequenzspezifischen Hybridisierungsbedingungen" nur an die exakt komplementäre Zielsequenz hybridisieren. Die Hybridisierung erfolgt unter stringenten Bedingungen. Stringente Hybridisierungsbedingungen sind auf dem Fachgebiet bekannt und werden beispielsweise in Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) beschrieben. Je nach den zu analysierenden Sequenzen können für jede Sequenz ein oder mehrere sequenzspezifische Oligonucleotide verwendet werden. Die Begriffe "Sonde" und "SSO-Sonde" werden austauschbar mit SSO verwendet.
• Der Begriff "Zielregion" meint einen üblicherweise polymorphe DNA- Sequenzen enthaltenden Bereich einer zu analysierenden Nucleinsäure.
• Der Begriff "thermostabiles Polymeraseenzym" betrifft ein Enzym, das relativ hitzestabil ist und die Polymerisation von Nucleotiden katalysiert, wobei zu einem dei Nucleinsäurestränge der Zielsequenz komplementäre Primer-Extensionsprodukte gebildet werden. Üblicherweise initiiert das Enzym die Synthese unter Verwendung des Primers am 3'-Ende der Zielsequenz und fährt fort in 5'-Richtung entlang der Matrize bis zum Ende der Synthese. Ein gereinigtes thermostabiles Polymeraseenzym wird vollständiger in der hier unter Bezugnahme eingeschlossenen Veröffentlichung 258,017 des europäischen Patentamtes (EPO) offenbart und ist im Handel von Perkin-Elmer Cetus Instruments erhältlich.
• Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und Reagenzien zur Bestimmung des HLA DP-Genotyps eines Individuums bereit. Teilweise beruht die Erfindung auf dem Auffinden von Polymorphismen im variablen zweiten Exon der HLA DPbeta-Gene durch die kombinierten Verfahren der PCR-Amplifikation, Clonierung und DNA- Sequenzierung. So wurden 22 DPbeta (DPB)-Allel-Varianten gefunden. Ausgehend von der neuen Sequenz dieser DP-Gene werden SSO-Sonden zum Nachweis der variablen Genotypen bereitgestellt. Die Variationen zwischen den verschiedenen DP-Allelen sind verteilt. Daher kann eine Sonde allein kaum ein bestimmtes DPbeta-Allel identifizieren. Die Identität eines Allels wird dagegen aus dem Bindungsmuster einer Reihe von Sonden abgeleitet, wobei jede einzelne Sonde für unterschiedliche Abschnitte eines DP- Gens spezifisch ist.
• In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform besteht das Verfahren für die auf DNA beruhende Typisierung von HLA DP-Genotypen aus der Amplifikation einer einen variablen Teil eines HLA DP-Gens enthaltenden Nucleinsäuresequenz, Bestimmung der vorhandenen variablen HLA DP-Sequenz mit SSO- Sonden und Ableitung des HLA DP-Genotyps aus dem Bindungsmuster der SSO-Sonden an der amplifizierten Zielsequenz. Zur Erleichterung der Durchführung dieser bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Primer bereit, die zur Amplifikation der HLA DP-Zielregion durch PCR verwendet werden können.
• In diesem bevorzugten Verfahren wird eine Nucleinsäure enthaltende Probe von einem Individuum erhalten, dessen HLA DP-Genotyp bestimmt werden soll. Jede Art von HLA DP-Nucleinsäure enthaltendem Gewebe kann für den erfindungsgemäßen Zweck verwendet werden. Da die vorliegende Erfindung auch mit amplifizierten Nucleinsäuren kompatibel ist und das PCR-Verfahren extrem kleine Mengen an Nucleinsäure amplifizieren kann, können verschwindend kleine Mengen an Nucleinsäure enthaltende Proben durch das erfindungsgemäße Verfahren auf die Gegenwart bestimmter HLA DP-Varianten typisiert werden. Selbst ein einziges Haar enthält beispielsweise genug DNA zur Durchführung der vorliegenden Erfindung, wie von der von Higuchi et al., Nature 332 (1988), 543-546, beschriebenen Untersuchung von DQalpha nachgewiesen wurde.
• Normalerweise ist die Nucleinsäure in der Probe DNA, meistens genomische DNA. Die vorliegende Erfindung kann jedoch auch mit anderen Nucleinsäuren wie Messenger-RNA oder clonierter DNA durchgeführt werden, und die Nucleinsäure kann entweder einzeisträngig oder doppelsträngig in der Probe sein und trotzdem für den erfindungsgemäßen Zweck geeignet. Der Fachruann weiß, daß ungeachtet der Natur der Nucleinsäure die Nucleinsäure einfach durch Ergreifen geeigneter Schritte in der entsprechenden Phase des Verfahrens durch das erfindungsgemäße Verfahren typisiert werden kann. Bei der Verwendung der PCR zur Amplifikation der Nucleinsäure in der Probe enthält die Probe bei der Typisierung mit den neuen erfindungsgemäßen Sonden üblicherweise doppelsträngige DNA.
• Wie vorstehend beschrieben, werden in einer bevorzugten Ausführungsform das erfindungsgemäße Verfahren der HLA DP-Typisierung und die erfindungsgemäßen Sonden zusammen mit der PCR-amplifizierten Ziel-DNA verwendet. Bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung muß man sich jedoch bewußt sein, daß die Amplifikation von HLA DP-Zielsequenzen in einer Probe durch jedes bekannte Verfahren durchgeführt werden kann, das die Zielsequenz ausreichend amplifiziert, um sie durch Nucleinsäurehybridisierung mit einer SSO-Sonde nachweisen zu können. Obwohl das PCR-Verfahren auf dem Fachgebiet gut bekannt ist (vgl. US-Patente mit den Nrn. 4,683,195 und 4,683,202) und eine Reihe von kommerziellen Anbietern wie Perkin-Elmer/Cetus-Instruments PCR-Reagenzien verkaufen und PCR-Protokolle veröffentlichen, werden nachstehend einige allgemeine Informationen über das PCR- Verfahren zur Klarstellung und zum besseren Verständnis der Erfindung für die, die mit dem PCR-Verfahren nicht vetraut sind, geliefert.
• Zur Amplifikation einer Zielnucleinsäuresequenz in einer Probe durch PCR muß die Sequenz für die Bestandteile des Amplifikationssystems zugänglich sein. Üblicherweise wird diese Zugänglichkeit durch Isolierung der Nucleinsäuren aus der Probe sichergestellt. Eine Reihe von Verfahren zur Extraktion von Nucleinsäuren aus biologischen Proben sind auf dem Fachgebiet bekannt. Vgl. beispielsweise die von Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982), beschriebenen Verfahren. Wenn die Probe ziemlich leicht aufzubrechen ist, muß alternativ die Nucleinsäure vor der Amplifikation durch das PCR- Verfahren nicht gereinigt werden, d.h., wenn die Probe aus Zellen, besonders periphere Blutlymphocyten oder Amniocyten, besteht, können Lyse und Dispersion der intrazellulären Bestandteile durch bloße Suspension der Zellen in einem hypotonischen Puffer erreicht werden.
• Da die Nucleinsäure in der Probe zu Beginn des PCR-Verfahrens zunächst denaturiert wird (vorausgesetzt, daß die Nucleinsäure in der Probe doppelsträngig ist) und einfaches Erwärmen einiger Proben die Zellen aufbricht, kann die Isolierung der Nucleinsäure aus der Probe gelegentlich zusammen mit der Strangtrennung erreicht werden. Die Trennung der Stränge kann jedoch durch jedes geeignete Denaturierungsverfahren wie physikalische, chemische oder enzymatische Verfahren durchgeführt werden. Die übliche Hitze-Denaturierung schließt Temperaturen im Bereich von etwa 80ºC bis 105 ºC etwa 1 bis 10 Minuten ein. Eine Strangtrennung kann auch durch eine Helicase, einem Enzym, das eine Helicase-Aktivität zeigen kann, induziert werden. Das Enzym RecA weist beispielsweise in Gegenwart von ATP eine Helicase-Aktivität auf. Die für eine Strangtrennung durch Helicasen geeigneten Reaktionsbedingungen sind auf dem Fachgebiet bekannt (vgl. Kuhn Hoffman-Berling, CSH-Quantitative Biology 43 (1978), 63 und Radding, Ann. Rev. Genetics 16 (1982), 405-436).
• Wie vorstehend beschrieben, kann die Strangtrennung zusammen mit der Isolierung der Nucleinsäure aus der Probe oder in einem separaten Schritt durchgeführt werden. Ferner kann eine Strangtrennung gleichzeitig mit dem nächsten Schritt im PCR- Verfahren durchgeführt werden: dem Anlagern der Primer und der Synthese der Primer- Extensionsprodukte. In dieser Ausführungsform des PCR-Verfahrens wird die Temperatur sehr sorgfältig kontrolliert, so daß die Strangtrennung und die Primeranlagerung und Extension im Gleichgewicht erfolgen. In dieser Ausführungsform des PCR- Verfahrens wird die Reaktion durch eine hitzestabile Polymerase katalysiert und bei einer erhöhten Temperatur durchgeführt. Bei dieser Temperatur ist das Enzym thermostabil und die Nucleinsäuren liegen in einem Gleichgewicht von Einzel- und Doppelsträngungen vor, so daß sich eine für eine vernünftige Polymerisationsrate ausreichende Zahl an Primern an die Matrizenstränge anlagern kann. In der bevorzugten Ausführungsform des PCR-Verfahrens wird die Strangtrennung jedoch durch ausreichend langes Erhitzen des Reaktionsgemisches auf eine ausreichend hohe Temperatur erreicht, bei der der Duplexstrang denaturiert, ohne daß die Polymerase irreversibel denaturiert (vgl. EP Nr.0 258 017).
• Ungeachtet der Art der Strangtrennung schließt der nächste Schritt des PCR- Verfahrens nach der Trennung der Stränge die Hybridisierung der getrennten Stränge mit den die Zielsequenz flankierenden Primern ein. Die Primer werden anschließend verlängert, um komplementäre Kopien der Zielstränge zu erhalten, und der Zyklus der Denaturierung, Hybridisierung und Extension wird so oft, wie es zum Erhalt der gewünschten Menge an amplifrzierter Nucleinsäure erforderlich ist, wiederholt.
• Wie vorstehend beschrieben, stellt die vorliegende Erfindung PCR-Primer für die HLA DP-DNA-Amplifikation und -Typisierung bereit. Diese Primer sind zu Sequenzen in den konservierten Bereichen, die die Zielsequenzen in den variablen Bereichen der HLA DP-Loci flankieren, komplementär. Für den Zweck der vorliegen den Erfindung ist der bevorzugte variable Bereich der HLA DP-Loci das zweite Exon der DPalpha- und DPbeta-Gene. Für eine erfolgreiche PCR-Amplifikation sind die er findungsgemäßen Primer so konstruiert, daß jeder Primer entlang einer Duplexsequenz mit einer Stelle hybridisiert, so daß ein von einem Primer synthetisiertes Extensionsprodukt nach seiner Trennung von seiner Matrize (Komplement) als Matrize zur Extension des anderen Primer dient, wobei ein amplifizierter Abschnitt der Nucleinsäure von definierter Länge erhalten wird. Es werden ferner Primer bereitgestellt, die unter selektiven Anlagerungsbedingungen vorzugsweise an den HLA DP-Bereich binden.
• Die Matrizen-abhängige Extension der Primer im PCR wird durch ein Polymerisationsmittel in Gegenwart von geeigneten Mengen der vier Desoxyribonucleosidtriphosphate (DATP, DGTP, DCTP und DTTP) in einem geeignete Salze, Metallkationen und ein pH-Puffersystem enthaltenden Reaktionsmedium katalysiert. Geeignete Polymerisationsmittel sind Enzyme, von denen bekannt ist, daß sie die Matrizen-abhängige DNA-Synthese katalysieren. Bei einer RNA-Matrize ist ein geeignetes Polymerisationsmittel zur Umwandlung der RNA in die komplementäre DNA (cDNA)-Sequenz beispielsweise die reverse Transkriptase (RT) wie die RT des Vogel- Myeloblastose-Virus. Wenn DNA amplifiziert werden soll, schließen geeignete Polymerasen, beispielsweise die E. coli-DNA-Polymerase 1 oder ihr Klenowfragment, T4-DNA-Polymerase und Taq-Polymerase, eine hitzestabile DNA-Polymeraseq die von Thermus aquaticus isoliert wird und im Handel von Perkin-Elmer/Cetus Instruments (PECI) erhältlich ist, ein. Das letztere Enzym wird häufig zur Amplifikation und Sequenzierung von Nucleinsäuren verwendet. Die Reaktionsbedingungen für die Verwendung von DNA-Polymerasen sind auf dem Fachgebiet bekannt und werden beispielsweise in der Abhandlung in Methods in Enzymology und in Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, a.a.O., beschrieben.
• Das PCR-Verfahren kann schrittweise durchgeführt werden, wobei nach jedem Schritt neue Reagenzien zugesetzt werden, oder so, daß alle Reagenzien gleichzeitig zugesetzt werden, oder in einer partiellen schrittweisen Art, wobei frische oder andere Reagenzien nach einer bestimmten Zahl von Schritten zugesetzt werden. Wenn beispielsweise die Strangtrennung durch Hitze induziert wird und die Polymerase hitzeempfindlich ist, dann muß die Polymerase nach jeder Strangtrennung zugesetzt werden. Wenn jedoch beispielsweise eine Helicase zur Denaturierung oder eine thermostabile Polymerase zur Extension verwendet wird, dann können alle Reagenzien zu Beginn zugesetzt werden, oder in einer anderen Ausführungsform können bei einer Auswirkung der molaren Verhältnisse der Reagenzien auf die Reaktion die Reagenzien entsprechend ihrem Verbrauch in der Synthesereaktion periodisch aufgefüllt werden.
• Der Fachmann weiß, daß das PCR-Verfahren meistens als ein automatisches Verfahren mit einem thermostabilen Enzym durchgeführt wird. In diesem Verfahren wird das Reaktionsgemisch einer denaturierenden Phase, Primer-Anlagerungsphase und Reaktionsphase zyklisch unterworfen. Eine Maschine, die zur Verwendung eines thermostabilen Enzyms speziell ausgestattet ist, wird ausführlicher in der EP 0 236 069 of fenbart und ist im Handel von PECI erhältlich.
• Wie vorstehend beschrieben, ist ein Grund für die Bedeutung des PCR- Verfahrens im erfindungsgemäßen Verfahren, daß das PCR-Verfahren zur Amplifikation der Nucleinsäure in der Probe vor der HLA DP-DNA-Typisierung verwendet werden kann. Eine weitere wichtige Verwendung der PCR für den Zweck der vorliegenden Erfindung ist jedoch die Bestimmung der Nucleotidsequenz von zuvor unbekannten allelen Varianten, die im HLA DP-Bereich vorkommen, so daß Sonden für diese Varianten konstruiert und in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. In dieser Verwendung des PCR-Verfahrens werden polymorphe Bereiche der DPalpha- und DPbeta-Gene amplifiziert und die Nucleotidsequenzen dieser polymorphen Zielregionen wie dem zweiten Exon der DPalpha- und DPbeta-Gene bestimmt. Wie nachstehend erläutert, ist es für die eine bestimmte Variante enthaltenden Zellen auch nützlich, durch serologische Typisierung, gemischte Lymphocyten-Typisierung oder sensibilisierte Lymphocyten-Typisierung typisiert zu werden, um die Nucleotidsequenz einer bestimmten Variante mit dem durch bisher auf dem Fachgebiet verwendete Verfahren etablierten DP-Typ zu vergleichen.
• Eine Analyse der Nucleotidsequenz der Zielregion eines variablen DP-Allels kann leicht durch direkte Analyse der PCR-Produkte durchgeführt werden. Ein bevorzugtes Sequenzierprotokoll wird von Innis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 9436-9440, das hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist, beschrieben. Ein Verfahren zur direkten Sequenzanalyse von PCR-amplifizierten Produkten wird ferner von Saiki et al., Science 239 (1988), 487-491, beschrieben. Alternativ kann die amplifizierte Zielsequenz vor der Sequenzanalyse cloniert werden, wie von Scharf et al., Science 233 (1986), 1076-1078, beschrieben.
• Wie in den nachstehenden Beispielen beschrieben, wurde eine Reihe von eine große Zahl von verschiedenen Haplotypen repräsentierenden Zellen vom DPw-Typ durch die PCR und die Bestimmung der Nucleotidsequenz des zweiten Exons des DPbeta-Gens analysiert. Als Ergebnis dieses Versuchs und ähnlicher Versuche unter Verwendung von Proben, die von einer Reihe von an nachstehend genauer beschriebenen Autoimmunerkrankungen leidenden Individuen erhalten wurden, wurden 22 verschiedene allele Varianten in diesem Locus gefunden. Allgemein zeigten die Ergebnisse daß die spezifischen DPbeta-Sequenzen mit den Spezifitäten der durch das Standard- PLT-Verfahren definierten DPw1 bis DPw6 übereinstimmen. Die seltenen Ausnahmen zeigen die Schwierigkeit, ein standardisiertes und reproduzierbares PLT DPw- Typisierungssystem zu erhalten, wobei die Schwierigkeiten die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens deutlich machen. In dieser Hinsicht ist es wichtig zu erwähnen, daß die ursprünglich als DPw1 typisierte Zellinie Cox vor kurzem erneut als DPw3 typisiert wurde und das DPB3-Allel enthält.
• Weitere interessante und wesentliche Zusammenhänge wurden durch die erfindungsgemäßen Fortschritte zwischen den serologisch definierten DP-Typen und den variablen DP-Nucleotidsequenzen gefunden. Der Typ DPw4 des Standes der Technik kann beispielsweise durch das erfindungsgemäße Verfahren jetzt in zwei DPbeta- Subtypen (mit den Bezeichnungen DPB4. 1 und DPB4.2) unterteilt werden. Das DPB4.2-Allel wurde in zwei (APD und LBI) DPw4-homozygoten Typisierungszellen (HTCs), die bekanntermäßen einen ungewöhnlichen DPw4-Typ aufweisen, gefünden DPbeta-Subtypen (mit den Bezeichnungen DPB2.1 und DPB2.2) des DPw2-Typs wurden durch die vorliegende Erfindung ebenfalls gefunden.
• Ein weiterer signifikanter erfindungsgemäßer Fortschritt betrifft das Auffinden einer großen Zahl von variablen DPbeta-Allelen in einer Vielzahl von Zellen, die durch Verfahren im Stand der Technik als DP-"blank" (nicht identifiziert) typisiert wurden. Diese variablen Allele wurden mit DPB-Zahlen von 7 und mehr bezeichnet Eine weitere Analyse von DPw-blank-Haplotypen wird wahrscheinlich zur Identifizierung und Charakterisierung von weiteren DPbeta-Allelen führen, die anschließend durch das erfindungsgemäße Verfahren typisiert werden können. DPw-blank-Zellen sind die, die die vorhandenen Spektren von T-Zell-Reagenzien für das PLT-Verfahren nicht stimulieren. Anders als die serologische DQw-blank-Spezifität, die, wie von Horn et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 6012-6016, beschrieben, von einer einzigen DQB-Sequenz codiert wird, ist die DPw-blank-Spezifität heterogen. Da die haplotypische Häufigkeit der DPw-blank-Spezifität auf 40% geschätzt wird, ist die vorliegende Erfindung besonders wichtig, da sie erstmals die Subtypisierung dieses großen DPw-Typs ermöglicht.
• Die Verfügbarkeit von DPbeta-DNA-Sequenzen von Zellen vom DPw-Typ ermöglicht nicht nur die Unterteilung der serologischen DPw-Typen, sondern ermöglicht auch die Identifizierung der linearen Epitope, die durch serologische und zelluläre Typisierungsreagenzien definiert werden. Der Antikörper SP42 reagiert beispielsweise mit DPw2- und DPw4-Zellen. Die einzige für diese beiden Spezifitäten einmalige Sequenz ist die Sequenz GlyGlyProMet(GGPM) an den Positionen 84 bis 87, von der daher angenommen wird, daß sie das SP42-Epitop darstellt. In ahnlicher Weise reagiert der Antikörper SP3 mit DPw3- und DPw6-Zellen sowie mit einigen weiteren Zellen wie den DPw-blank-Linien Tok und Akiba. Diese Linien tragen die Spezifität Cp63 und enthalten die eng verwandten DPbeta-Allele DPB9 und DPB12. Die einzige Sequenz, die für die SP3-reaktiven Zellen einmalig ist, ist die saure AspGluAsp(DED)- Sequenz an den Positionen 55 bis 57. Das SP3-Epitop scheint daher an diesen Bereich der DPbeta-Kette zu kartieren.
• Ferner zeigt beispielsweise die Reaktion des Antikörpers DP11.1 mit DPw2- und DPw4-Zellen, wie mit den neuen erfindungsgemäßen DP-Sequenzen serologisch definierte Epitope kartiert werden können. Bodmer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 4596-4600, zeigten mit einer Western-Blot-Analyse, daß dieser Antikörper an die DPalpha-Kette bindet. Auf der Basis des Musters der DPbeta-Polymorphismen, die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt werden, läßt diese Beobachtung den Schluß zu, daß der DP11.1-Antikörper an eine Konformationsdeterminante bindet, die von der DPalpha-Kette und den DPbeta-Ketten gebildet wird, die die GlyGlyProMet (GGPM)-Sequenz an den Positionen 84 bis 87 enthalten.
• Die polymorphen Reste in der HLA DP-Region können auch von T-Zell- Clonen erkannte Epitope darstellen. Die Zellen von Clon 1666 reagieren mit DPw%- und einigen DPw2-Zellen. ABL (DPB2.2) ist positiv und WPV (DPB2.1) ist negativ, wie auf den Tenth International Histocompatibility Workshops vorgetragen wurde. Diese C1666-Zellen können die GluAlaGlu (EAE)-Reste an den Positionen 55 bis 57 erkennen, da diese Sequenz für die DPB2.2- und DPB5-Allele einmalig ist. Ein Leu (im Gegensatz zu einem Phe)-Rest in der Position 35 ist ebenfalls einmalig für mit C1666 reagierende Zellen.
• Das gleiche Verfahren der Korrelation von spezifischen polymorphen Resten mit DPw-Spezifitäten kann zur Kartierung der durch PLT-Typisierung definierten Epitope verwendet werden. Der einzige Unterschied zwischen den DPB2.1- und DPB4.2-Allelen ist beispielsweise der Austausch von Glu gegen Lys an Position 69. Da diese Allele enthaltende Zellen im PLT-System voneinander unterschieden werden, wird angenommen, daß die Ladung des polymorphen Restes an Position 69 am Epitop, das von PLT-Typisierungszellen erkannt wird, beteiligt ist. In ähnlicher Weise ist der einzige Unterschied zwischen den DPB3- und DPB6-Allelen der Austausch von Lys gegen Glu an Position 69 sowie der Austausch von Val gegen Met an Position 76.
• Wie vorstehend beschrieben, beruht auf den neuen erfindungsgemäßen DPbeta-Sequenzen nicht nur ein sehr nützliches DPbeta-DNA-Typisierungsverfahren, sondern es können auch viele nützliche Informationen zur Interpretation von Ergebnissen der serologischen DPbeta-Typisierung erhalten werden. Mit der vorliegenden Erfindung kann auch eine HLA-DNA-Typisierung nicht nur am DPbeta-Locus sondern auch noch am DPalpha-Locus durchgeführt werden. Wie nachstehend beschrieben, ist gegenwärtig nur bekannt, daß zwei variable Allele im zweiten Exon des DPalpha-Locus vorhanden sind (vgl. Trowsdale et al., a.a.O.). Die Proteinsequenzen die vom zweiten Exon dieser beiden Allele (diese Allele werden als DPA1 und DPA2 bezeichnet) codiert werden, unterscheiden sich nur durch drei Aminosäuren voneinander, und diese Unterschiede stehen anscheinend nicht mit einem bestimmten PLT-definierten Typ in Zusammenhang. Die DPalpha-Variabilität ist daher viel weniger ausgeprägt als durch die RFLP-Variabilität, die mit DPalpha-Sonden nachgewiesen wurde, vorhergesagt (vgl. Hyldig-Nielson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 1644- 1648), was den Schluß zuläßt, daß die meisten durch RFLP-Analyse im DPalpha-Gen nachgewiesenen Polymorphismen entweder in nicht-codierenden Sequenzen oder in einem nahen DPbeta-Locus liegen. Die beobachteten Zusammenhänge zwischen den DPw-Typen und den DPalpha-RFLP-Markern zeigen daher wahrscheinlich ein Bindungsungleichgewicht zwischen der DPbeta-Sequenz-Variabilität und den polymorphen Restriktionsstellen, die mit der DPalpha-Sonde nachgewiesen werden, wie das auch der Zusammenhang zwischen Dralpha-RFLP-Markern und den DR-Spezifitäten zeigt (vgl. Stetler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985), 8100-8104).
• Die DNA-Sequenzen der DPalpha- und DPbeta-Gene dienen als nützliche Basis für die Entwicklung der erfindungsgemäßen sequenzspezifischen Oligonucleotidsonden. Diese Sonden werden so entwickelt, daß die Sonden unter stringenten Hybridisierungsbedingungen nur mit genau komplementären Sequenzen in variablen Abschnitten der DPalpha- und DPbeta-Allele spezifisch hybridisieren. Diese SSO- Sonden können alle Längen aufweisen, die die variablen Sequenzen in einem variablen Bereich überspannen und eine sequenzspezifische Hybridisierung ermöglichen, der hybridisierende Bereich der Sonde ist jedoch vorzugsweise kurz, im Bereich von 10 bis 30 Basen und stärker bevorzugt von etwa 17 bis 19 Basen. Zur Immobilisierung kann die Sonde auch eine lange poly T-Sequenz enthalten, die durch Bestrahlung an einen festen Träger immobilisiert werden kann.
• Die erfindungsgemäßen SSO-Sonden werden ferner entwickelt, um mit einem bestimmten variablen Abschnitt eines DP-Allels spezifisch zu hybridisieren und destabilisierende Fehlpaarungen mit den anderen für den bestimmten Abschnitt bekannten variablen Sequenzen einzugehen. Die Sonden sind vorzugsweise für variable DNA- Abschnitte in den variablen zweiten Exons der DPalpha- und DPbeta-Gene und noch stärker bevorzugt für DNA-Abschnitte spezifisch, die Reste nahe den Positionen 8 bis 11, 36, 55 bis 57, 65 bis 69, 76 und 84 bis 87 des zweiten Exons codieren.
• Oligonucleotidsonden, die zur spezifischen Hybridisierung mit den zweiten Exons der DPbeta- und DPalpha-Allele konstruiert wurden, werden nachstehend und in den Beispielen genauer beschrieben.
• Die erfindungsgemäßen Sonden können unter Verwendung der vorstehend in der Beschreibung der PCR-Primer beschriebenen Verfahren synthetisiert und markiert werden. Die Sonde kann beispielsweise durch Inkubation der Sonde mit ³²P-ATP und Kinase am 5'-Ende mit 32p markiert werden. Ein geeigneter nicht-radioaktiver Marker für SSO-Sonden ist die Meerrettich-Peroxidase (HRP). Verfahren zur Herstellung und zum Nachweis von diesen Marker enthaltenden Sonden sind in den nachstehenden Beispielen beschrieben. Wegen weiterer Informationen zur Verwendung dieser markierten Sonden siehe US-Patent Nr.4,789,630, Saiki et al., N. Eng. J. Med. 319 (1988), 537-541, und Bugawan et al., Bio/Technology 6 (1988), 943-947, die hier durch Bezugnahme mit eingeschlossen sind. Beispiele für geeignete Chromogene sind der rote Leuco-Farbstoff und TMB.
• Die erfindungsgemäßen Sonden können zur Identifizierung von allelen Sequenzen in einer Probe verwendet werden, indem ermittelt wird, welche SSO-Sonden an die in der Probe vorhandenen HLA DP-Sequenzen binden. Geeignete Testverfahren für den erfindungsgemäßen Zweck zum Nachweis von Hybriden, die sich zwischen den SSO-Sonden und den Nucleinsäuresequenzen in einer Probe bilden, sind auf dem Fachgebiet bekannt. Der Nachweis kann beispielsweise unter Verwendung einer Dot- Blot-Versuchsanordnung, wie in den Beispielen beschrieben, durchgeführt werden. In der Dot-Blot-Versuchsanordnung wird die nicht-markierte amplifizierte Probe an eine Membran gebunden, die Membran mit der markierten Sonde unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen ihkubiert, die nicht-hybridisierte Sonde durch Waschen entfernt und das Filter auf die Gegenwart einer gebundenen Sonde untersucht. Wenn multiple Proben mit wenigen Sonden analysiert werden, erfordert ein bevorzugtes Verfahren hoch stringente Hybridisierungs- und Waschbedingungen, wobei nur vollständig komplementäre Hybride existieren können.
• Ein alternatives Verfahren ist eine "reverse" Dot-Blot-Versuchsanordnung, bei der die amplifizierte Sequenz einen Marker enthält. Bei dieser Versuchsanordnung sind die nicht-markierten SSO-Sonden an die Membran gebunden und werden gegen die markierte Probe unter geeignet stringenten Hybridisierungsbedingungen exponiert. Die nicht-hybridisierte markierte Probe wird anschließend durch Waschen unter geeignet stringenten Bedingungen entfernt und das Filter anschließend auf die Gegenwart von gebundenen Sequenzen überprüft. In einer anderen Version der "reversen" Dot-Blot- Versuchsanordnung wird die SSO-Sonde markiert, und die Nucleinsäure in der Probe ist nicht markiert. Nach Hybridisierung und Waschen wird die markierte Sonde oder ein markiertes Fragment der Sonde von der Membran freigesetzt und nachgewiesen, um zu ermitteln, ob eine Sequenz in der Probe mit dem markierten Oligonucleotid hybridisiert. Die Freisetzung des Markers kann durch Spaltung mit einem Restriktionsenzym, das eine Restriktionsstelle im Duplexhybrid erkennt, erreicht werden. Das als Oligomer- Restriktion bezeichnete Verfahren wird nachstehend im US-Patent Nr.4,683,194 und in der entsprechenden Patent-Veröffentlichung EP-0 164 054 genauer beschrieben.
• Welches Verfahren auch verwendet wird, um die erfindungsgemäßen DP SSO-Sonden, die an DP-Sequenzen in einer Probe hybridisieren, zu ermitteln, das zentrale Merkmal des DP DNA-Typisierungsverfahrens ist die Identifizierung der in der Probe vorhandenen HLA DP-Allele durch Analyse des Bindungsmusters einer Reihe von SSO-Sonden. Obwohl natürlich einzelne erfindungsgemäße Sonden zur Bereitstellung geeigneter Informationen verwendet werden können, ist die Variation der DPbeta-Allele in der Natur verteilt, als daß eine Sonde eine spezifische DP-Variante allein identifizieren könnte. Wie in den Beispielen beschrieben, wird daher die Identität eines Allels aus dem Bindungsmuster einer Reihe von SSO-Sonden abgeleitet, die für verschiedene Abschnitte der DPalpha- und DPbeta-Gene spezifisch sind.
• Die DNA-Typisierung von HLA DP-Allelen ist für viele verschiedene Zwecke nützlich. Der DPbeta-Polymorphismus ist an der Gewebeabstoßung von Allotransplantaten beteiligt. Untersuchungen von Knochenmarktransplantationen zeigten, daß drei anscheinend HLA-identische Spender-Empfänger-Paare, die eine akute Transplantat-anti-Wirt-Reaktion und eine schwache MLC-Reaktivität zeigten, nach einer RFLP-Analyse alle eine unterschiedliche DP-Region aufwiesen, wie von Amar et al., J. Immunology 138, 1947, beschrieben. Geeignete Verfahren zur Verhinderung einer Transplantatabstoßung umfassen daher einen Abgleich der HLA DP-Typen des Spenders und des Empfängers durch Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens der HLA DP-DNA-Typisierung: Ableitung der HLA-Allele von Spender und Wirt aus dem Muster der Hybridisierung von SSO-Sonden mit DPbeta- und/oder DPalpha- Nucleinsäuresequenzen, die in den sowohl vom Spender als auch vom Wirt erhaltenen Proben vorhanden sind.
• Eine weitere Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens der HLA DP- DNA-Typisierung ist die Bestimmung einer Anfälligkeit eines Individuums für mit bestimmten HLA DP-Allelen zusammenhängenden Autoimmunerkrahkungen. Der Zusammenhang von bestimmten DP-Allelen mit einer Autoimmunerkrankung kann durch das erfindungsgemäße Verfahren nachgewiesen werden, indem die Häufigkeit, mit der ein bestimmtes Allele in Individuen mit einer Autoimmunerkrankung vorhanden ist, ermittelt und diese Häufigkeit mit der bei gesunden Individuen einer Kontrollgruppe ermittelten Häufigkeit verglichen wird, wie es bei anderen HLA-Typisierungssystemen durchgeführt wurde. Howell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 222-226, berichten beispielsweise von einem signifikanten Zusammenhang zwischen der Zölialeie Krankheit (CD) und einem Paar von HLA DPalpha- und HLA DPbeta-RFLPs. Diese Untersuchungen sind ferner von Vorteil, da durch sie häufig zuvor nicht-charakterisierte DP-Allele sowohl in Patienten als auch in Kontrollgruppen gefunden werden können. Beispielsweise wurden die DPB13- bis DPB19-Allele, deren Sequenzen einen wichtigen erfindungsgemäßen Gesichtspunkt darstellen, im Verlauf der Untersuchungen an Patienten mit Autoimmunerkrankungen und Kontrollgruppen gefunden.
• So zeigte eine anfängliche Untersuchung von vier CD-Patienten, die durch das erfindungsgemäße Verfahren typisiert wurden, daß das DPB4.2-Allel eine CD- Anfälligkeit verleiht. Eine umfangreichere Untersuchung auf der Basis von Proben von Italienern zeigte ferner, daß das berechnete relative Risiko (RR) einer CD-Erkrankung eines Patienten mit dem DPB4.2-Allel 9,3 ist und daß sechs der elf CD-Patienten, die durch das erfindungsgemäße Verfahren typisiert wurden, das DPB3-Allel trugen. Etwa 78% der durch das erfindungsgemäße Verfahren untersuchten CD-Patienten tragen entweder die DPB4.2- oder die DPB3-Allele, so daß das RR der Gegenwart eines dieser Allele 13,5 ist. In einer weiteren Untersuchung von US-Amerikanern mit CD wurde bei emem Vergleich mit der Häufigkeit dieser Allele in einer Kontrollgruppe eine erhöhte Häufigkeit des DPB1-Allels sowie eine erhöhte Häufigkeit des DPB4.2-Allels beobachtet. Diese Untersuchungen zeigten auch, daß bestimmte Kombinationen von DQbeta- Allelen (DQB2), DQalpha-Allelen (DQA4) und DPbeta-Allelen (DPB4.2, DPB1, DPB13 oder DPB3) mit einem erhöhten Risiko einer CD-Anfälligkeit verbunden ist.
• Wie vorstehend beschrieben, stellt die vorliegende Erfindung wichtige neue Verfahren zur Bestimmung der CD-Anfälligkeit eines Individuums bereit, wobei durch die Verfahren auch ermittelt wird, ob ein Individuum ein DP-Allel trägt, das mit der CD-Anfälligkeit in Zusammenhang steht. Wie hier gezeigt, schließen solche Anfälligkeits-verleihenden Allele die DPB4.2, DPB3 und DPB1-Allele ein und da DPB4. 1 ein relativ weit verbreitetes Allel ist, gibt es eine erhöhte Häufigkeit des Genotyps DPB4. 1/4.2 in CD-anfälligen Individuen.
• Wie bei CD-Krankheit stellt die vorliegende Erfindung ähnliche Fortschritte im Hinblick auf andere ernste Autoimmunkrankheiten bereit. Untersuchungen, die die allele Häufigkeit mit einer Erkrankung korrelieren, zeigen beispielsweise, daß die Häufigkeit von bestimmten DPbeta-Allelen bei Insulin-abhängigen Diabetes mellitus (IDDM)- und Myasthenia gravis (MG)-Patienten anscheinend höher als in ansonsten HLA übereinstimmenden Kontrollen ist. Bei MG zeigen die die Sequenz DEAV am 3'- Ende des zweiten Exons codierenden DP-Allele wie DPB3 und DPB5 eine erhöhte Häufigkeit. Ferner ist die Häufigkeit des DPB4.1-Allels in MG-Patienten (relativ zu gesunden Kontrollindividuen) dramatisch verringert, was den Schluß zuläßt, daß DP4.1 einen Schutz vor MG verleihen kann. Bei IDDM ist die Häufigkeit der DPbeta-Allele DPB2.1, DPB1, DPB4.1 und DPB13 erhöht. Viele der untersuchten, das DPB13-Allel tragenden IDDM-Patienten trugen auch die HLA-Allele B18 und DR3.
• Die erfindungsgemäßen DP-Typisierungsverfahren stellten ferner wichtige Fortschritte bei der Ermittlung der Anfälligkeit eines Individuums flir bestimmte Formen von Arthritis bereit. Patienten mit der klassischen rheumatoiden Alters-Arthritis (ARA) mit einem positiven rheumatoiden Faktor zeigen beispielsweise eine erhöhte Häufigkeit des DPB4.2-Allels, obwohl mehr Untersuchungen durchgeführt werden müssen, um sicherzustellen, daß diese Erhöhung statistisch signifikant ist. Ferner war Wissenschaftlern lange bekannt, daß der serologische DPw2-Typ mit einer Anfälligkeit für die oligoartikuläre juvenile rheumatoide Arthritis (JRA) in Zusammenhang steht. Wie vorstehend beschrieben, konnte durch die vorliegende Erfindung erstmals der serologische DPw2-Typ in zwei DPB-DNA-Typen unterteilt werden, und die erfindungsgemäßen Typisierungsverfahren zur Ermittlung der Erkrahkungsanfälligkeit zeigen, daß die bekannte mit DPw2 zusammenhängende Anfälligkeit für JRA insbesondere mit dem DPB2.1-Allel zusammenhängt. Etwa 55% der untersuchten JRA-Patienten waren für DPB2.1 positiv, während nur 16% der Kontrollindividuen dieses Allel aufwiesen, was ein RR von 6,3 für JRA in Individuen mit dem DPB2.1-Allel ergibt. Der Zusammenhang zwischen JRA und dem DPB2.1-Allel ist unabhängig von der Bindung an zuvor definierte Marker des HLA DP-Bereichs, und die Bedeutung dieses Zusammenhangs von DPB2.1 und JRA kann leichter verstanden werden, wenn man bedenkt, daß sich die DPB2.1-Sequenz vom DPB4.2-Allel (hängt anscheinend nicht mit der Anfälligkeit für JRA zusammen) nur durch eine Aminosäure an Position 69 der B1- Domäne unterscheidet. Es sollte gesagt werden, daß die meisten JRA-Patienten mit dem DPB2.1-Allel auch einen mit der Krankheit zusammenhängenden DR-Marker wie DRw8, DR5 oder DRw6 aufwiesen.
• Die vorliegende Erfindung stellt daher ferner ein Verfahren zum Nachweis der Anfälligkeit für JRA bereit, das die Behandlung der genomischen HLA DP-DNA eines Individuums, vorzugsweise nach der Amplifikation, mit für das DPB2.1-Allel spezifischen Oligonucleotidsonden und den Nachweis einer Hybridisierung umfaßt. Bei der allgemeinen Durchführung der Erfindung wird jedoch das vollständige Spektrum an DPbeta-Sonden verwendet. Wie vorstehend beschrieben, kann das erfindungsgemäße Verfahren bei der Ermittlung des Zusammenhangs von DP mit einer großen Vielzahl von Autoimmunerkrahkungen, nicht nur JRA, verwendet werden. Diese Tatsache kann bei Verwendung der nachstehenden Tabelle leichter verstanden werden, in der die allele Häufigkeit (Zahl der Allele des angegebenen DP-Typs geteilt durch die Gesamtzahl an vorhandenen DP-Allelen und anschließende Multiplikation mit 100) für die unterschiedlichen DP-Allele in einer Reihe von Patientengruppen und einer Kontrollgruppe dargestellt ist. In der Tabelle zeigt MS Patienten mit multipler Sklerose an. Häufigkeit des HLA DP-Allels in ausgewählten Patientengruppen
• n = Zahl an typisierten Individuen; 2n ist die Zahl an getesteten Chromosomen; Kontrollen waren Individuen von Nordkalifornien.
• Diese Untersuchungen von Autoimmunkrankheiten läßt allgemein den Schluß zu, daß die Ladung von polymorphen Resten an den Positionen 55, 56 und 69 der DPbeta-Kette an der genetischen Anfälligkeitkeit für Autoimmunkrankheiten beteiligt ist. Der Austausch von Alanin gegen Aspartat an Position 55 erfolgt beispielsweise sowohl in dem DPB2.1-Allel als auch in dem DPB4.2-Allel; jedoch gibt es bei IDDM, das anscheinend mit DPB2.1 zusammenhängt, auch einen Austausch der Arninosäure an Position 69. Es sollte allerdings bemerkt werden, daß es das vollständige Allel und nicht nur eine Arninosäure an einer Position in einem Allel ist, das anscheinend anfällig macht.
• Der Wirkung der HLA DP-Allele auf die Anfälligkeit für Autoimmunkrankheiten entsprechen ähniiche Erkenntnisse für die HLA DR- und HLA DQ-Loci. Scharf et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 3504-3508, und Horn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 6012-6016, berichten beispielsweise, daß polymorphe Reste an Position 57 der DQbeta-Kette und an Position 70 der Drbetal-Kette an der genetischen Anfälligkeit für die Autoimmunkrankheiten Pemphigus vulgaris (PV) und IDDM beteiligt sind.
• Wie vorstehend beschrieben, wird angenommen, daß mit der Entwicklung der medizinischen Technologie von weiteren Krankheits- oder zu einer Krankheit neigenden Zuständen wie Grave-Krankheit, systemischer Lupus erythematodes und Sjögren- Syndrom bekannt wird, daß sie mit verschiedenen DP-Allelen zusammenhängen. Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Unterscheidung solcher Allele von anderen Allelen bereit und liefert so ein Mittel zur Identifizierung von Individuen mit einem hohem Risiko für eine Autoimmunkrankheit. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Individuum, dessen Anfälligkeit bestimmt werden soll, auf den HLA DP-Typ analysiert, indem zunächst das PCR-Verfahren zur Amplifikation der Zielregion des HLA DP-Locus verwendet wird. Anschließend werden die SSO-Sonden mit der amplifizierten Zielregion hybridisiert, und das in der amplifizierten DNA vorhandene spezifische DP- Allel wird aus dem Bindungsmuster der SSO-Sonden ermittelt. Schließlich wird ermittelt, ob das in der amplifizierten DNA vorhandene Allel ein mit einer Autoimmunkrankheit zusammenhängendes Allel ist.
• Das erfindungsgemäße Verfahren hat jedoch nicht nur im Bereich der medizinischen Wissenschaft signifikante Vorteile. DNA-Typisierungsverfahren spielen nun auch eine signifikante Rolle im wichtigen Bereich der individuellen Identifikation, sei es zur Aufklärung von Straftaten, bei denen die Identität eines Straftäters oder Opfers ermittelt wird, indem ein Individuum mit dem am Tatort zurückbleibenden Beweismaterial in Verbindung gebracht wird, oder zur Lösung von anderen nicht-kriminellen Problemen, wenn das biologische Material zur Bestimmung der Mutterschaft oder Vaterschaft eines Individuums verwendet wird.
• Für welchen Zweck die vorliegende Erfindung auch verwendet wird, der Schlüssel zum Erfolg des Verfahrens sind Unterschiede zwischen verschiedenen DP- Allelen. Die signifikantesten Unterschiede zwischen DP-Allelen können ziemlich leicht nachgewiesen werden, wenn die verschiedenen Aminosäuresequenzen, die von den Allelen codiert werden, aneinander ausgerichtet und untersucht werden. Eine solche Ausrichtung ist nachstehend dargestellt, wobei ein Strich die Identität mit dem DPB4.1- Allel (für die verschiedenen DPbeta-Allele und dem DPbeta-Pseudogen mit der Bezeichnung SXB) oder mit dem DPA1-Allel (für das DPalpha-DPA2-Allel und dem DPalpha-Pseudogen mit der Bezeichnung SXA) anzeigt. In dieser Darstellung geben die numerierten Positionen die reifen Peptiduntereinheiten an, wobei die Bezeichnungen der Allele links und Beispiele für Zellen, aus denen sie gewonnen werden können, rechts aufgeführt sind. DPalpha-Allele DPbeta-Allele
• Zum Nachweis und zur Unterscheidung von DP-Allelen in einer praktischen und ökonomischen Art muß jedoch die Nucleotidsequenz der Allele bekannt sein. Teile der Nucleotidsequenzen von verschiedenen DPalpha- und DPbeta-Allelen sind nachstehend beschrieben die Sequenzen werden, wie vorstehend beschrieben, identifiziert. Beispiele von erfindungsgemäßen Primem ermöglichen die Produktion von DNA, deren Sequenz von den Codons 8 bis 90 ermittelt werden kann. Die Lage der Allel-Sequenzen, die die bevorzugten Zielsequenzen für die Hybridisierung mit den verschiedenen erfindungsgemäßen Sonden sind, wird durch -A- , -B- , -C- , -D- , -E- und -F- angezeigt.
• Die vorstehend bereitgestellten DNA-Sequenzen sind ein wichtiger erfindungsgemäßer Gesichtspurkt. Obwohl nur ein Strang der Sequenz dargestellt ist, ist dem Fachmann bewußt, daß der andere Strang der Sequenz aus der vorstehend dargestellten Information abgeleitet werden kann. Mit dieser Information können die erfindungsgemäßen Sonden konstruiert werden. Viele Beispiele für erfindungsgemäße Sonden werden in den nachstehenden Beispielen beschrieben. Geeignete SSO-Sonden zur Hybridisierungsanalyse der DPbeta-Allele enthalten jedoch bestimmte polymorphe Sequenzen (oder sind komplementär dazu). Sechs Sätze von beispielhaften erfindungsgemäßen Sonden sind nachstehend dargestellt; jeder Satz wurde zur Unterscheidung der Polymorphismen in einem bestimmten Abschnitt des zweiten Exons des HLA DPbeta- Gens konstruiert. Die Bezeichnung der Abschnitte ist wie vorstehend beschrieben. Die polymorphen Reste, die in der allelen Variante in dem Hybridisierungsbereich der Sonde codiert werden, sind im Ein-Buchstaben-Aininosäure-Code (der Strich bedeutet, daß prototypische Reste in diesen Positionen vorhanden sind) links von der Sondensequenz dargestellt. Die Sonden umfassen die die polymorphen Aininosäurereste codierenden Bereiche und weisen nachweislich eine Länge von etwa 18 Nucleotiden auf. Diese Sequenzen in der Sonde, die die polymorphen Aminosäurereste codieren und daher in einer Sonde zum Nachweis der Allele, die den bestimmten Abschnitt codieren, eingeschlossen sein müssen, liegen zwischen den Schrägstrichen in der Sequenz. Die DP-Allele, mit denen die Sonde hybridisiert, sind rechts der Sonde dargestellt. HLA DPbeta-SSO-Sonden
• Da die erfindungsgemäßen Sonden zur Verwendung bei der Hybridisierung einzeisträngig sind, ist es wichtig zu bemerken, daß neben einer Sonde, die beispielsweise zur Hybridisierung mit dem codierenden Strang konstruiert wurde, auch eine gleich nützliche Sonde entwickelt werden kann, die an die komplementäre Sequenz auf dem nicht-codierenden Strang hybridisiert.
• Die vorstehende Sequenzinformation betrifft auch andere wichtige erfindungsgemäße Gesichtspunkte. Die bevorzugten erfindungsgemäßen Primer wurden zur Amplifikation vieler verschiedener DP-Allele konstruiert. In vielen Fällen sind solche Primer sehr nützlich, wie es in den nachstehenden Beispielen gezeigt wird. Dem Fachmann ist es jedoch bewußt, daß die vorstehende DNA-Sequenz-Information auch verwendet werden kann, um Primer zu entwickeln, die für eine allelspezifische Amplifikation verwendet werden können. Solche allelspezifischen Primer amplifizieren nur ein einziges Allel oder einen bestimmten Subsatz von bekannten Allelen. Die erfindungsgemäßen "DEAV"-Sonden können beispielsweise als ein Primer eines Primerpaars verwendet werden, um eine allelspezifische Amplifikation der "DEAV"-DPbeta-Allele zu erhalten.
• Die vorliegende Erfindung betrifft auch Kits, die eine wesentliche Bestandteile zur Durchfllhrung der vorliegenden Erfindung enthaltende Multibehältereinheit umfassen. Der Kit kann beispielsweise Primer für die PCR enthalten, da solche Primer in der bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform erforderlich sind. Diese Primer amplifizieren mindestens das DPbeta-Gen, und gegebenenfalls, beispielsweise in der gerichtsmedizinischen Analyse, können Primer eingeschlossen werden, die auch das DPalpha-Gen amplifizieren. Der Kit muß ferner mindestens SSO- Sonden für das DPbeta-Gen und gegebenenfalls auch für das DPalpha-Gen enthalten. Die SSO-Sonden können gelegentlich an eine geeignete Trägermembran befestigt werden, die für die Hybridisierungsanalyse verwendet werden kann. Weitere fakultative in den Behältern im Kit enthaltene Bestandteile schließen beispielsweise einen Katalysator der Synthese der Primer-Extensionsprodukte, die Substrat-Nucleotide, zur Markierung verwendete Mittel (beispielsweise ein Avidin-Enzym-Konjugat und Enzymsubstrat und Chromogen, wenn der Marker Biotin ist) und die geeigneten Puffer für die PCR oder Hybridisierungsreaktionen ein. Neben den vorstehenden Bestandteilen kann der Kit auch eine Anleitung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens enthalten.
• In den nachstehend beschriebenen Beispielen waren, sofern nicht ausdrücklich anders angegeben, bestimmte verwendete Techniken Standardverfahren. Diese Verfahren schließen das PLT-Verfahren ein, das im wesentlichen gemäß Shaw et al., J. Exp. Med. 152 (1980), 565-580, durchgeführt wird. Üblicherweise wurden zur Sensibilisierung der Lymphocyten Responder- und Stimulatorzellen aufgetaut, gewaschen und in Glutamin und Antibiotika enthaltendem RPMI 1640-Medium (komplette Medien) resuspendiert. Die Responderzellen wurden mit bestrahlten Stimulatorzellen in einem Verhältnis von 2:1 vermischt und das Zellgemisch zehn Tage bei 37ºC inkubiert. Die sensibilisierten bestrahlten Stimulatorzellen wurden zusammen mit bestrahlten Stimulatorzellen in kompletten Medien gezüchtet. Nach 48 Stunden wurde der Kultur ³H-Thymidin zugesetzt. Die Zellen wurden nach 18 Stunden geerntet, und die Aufnahme von Tritium durch Zählen der beta-Emission ermittelt.
• Die DNA-Sequenzanalyse wurde gemäß Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) durchgeführt. Die zu analysierenden Sequenzen wurden üblicherweise in einen M13-Clonierungsvektor cloniert und entweder durch das Maxam-Gilbert-Verfahren oder das Didesoxy-Kettenabbruchverfahren analysiert. Die synthetischen Oligonueleotide, sowohl Primer als auch Sonden, wurden unter Verwendung von im Handel erhältlichen Instrumenten und im Stand der Technik bekannten Verfahren synthetisiert.
Beispiel 1 Analyse der DNA-Sequenzen von HLA DP-Allelen
• Die DNA-Sequenzen des variablen zweiten Exons einer Reihe von Allelen des DPalpha-Gens und des DPbeta-Gens wurden ermittelt. Die verwendeten DNA-Proben wurden so gewählt, daß sie ein möglichst weites Spektrum von PLT-definierten DP- Allelen repräsentierten. Die DNA wurde aus flir die sechs Standard-DPw-Typen homozygoten Zellinien, aus unübliche Typisierungsreaktionen zeigenden Zellen, und von DP- blank-Reaktionen zeigenden Zellen extrahiert. Die DNA-Extraktion wurde gemäß Standardverfahren, wie von Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, beschrieben, durchgeführt. Die variablen zweiten Exons der DPalpha- und DPbeta-Gene wurden, wie vorstehend beschrieben, durch das PCR-Verfahren amplifiziert. Die amplifizierten DNA-Sequenzen wurden in einen von M13 stammenden Vektor cloniert und die DNA-Sequenzen durch das Ketten-Abbruchverfahren ermittelt. Die verwendeten Zellinien, ihre DR-Serotypen, ihre PLT-definierten DPw-Typen und die auf Ebene der DNA definierten Allele sind nachstehend in tabellarischer Form aufgeführt (leere Stellen zeigen nicht ermittelte Daten an).
• DP "MAS" ist eine provisorische Bezeichnung für eine neu definierte DP-Spezifität im Zusammenhang mit dem DPB4.2-Allel. "CD"-Zellinien sind Proben von CD-Patienten.
• * - betrifft Zellen mit unüblichen DPw-pHänotypen.
• Wie vorstehend beschrieben, zeigt die DNA-Analyse der HLA DP-Subtypen, daß spezifische Sequenzen mit den bekannten PLT-definierten DPw-Typisierungen korrelieren, was anzeigt, daß polymorphe Epitope, die von den sensibilisierten T-Zellen erkannt werden, auf der DPbeta-Kette liegen. Für einige DP-Typen, z. B. DPw2 und DPw4, hat die Sequenzanalyse Subtypvarianten aufgezeigt. Die Varianten von DPw2 wurden als DPB2.1 und DPB2.2 bezeichnet; die Zellen, die für PLT als DPw4 "neu" (z. B. LB1) oder DPw4* (z. B. APD) typisiert wurden, enthalten den selteneren DPB4.2-Subtyp. Der DPB4.2-Subtyp ist von seiner Sequenz her mehr mit dem DPB2.1- Allel als mit dem DPB4.1-Allel verwandt. Die individuelle CD11-Zellinie wird durch PLT als DPw2 typisiert, enthält jedoch die eng verwandten DPB2.1- und DPB4.2- Allele.
• Die vorstehenden Ergebnisse zeigen ferner, daß die einmaligen DPbeta- Sequenzen den DPw1-, DPw3-, DPw5- und DPw6-Spezifitäten entsprechen, und diese Allele erhielten diesen Zusammenhang wiedergebende Bezeichnungen. Wenige Ausnahmen sind jedoch, daß die Zellinie DKY als DPwS typisiert wurde, obwohl sie das DPB2.1-Allel enthält, und daß die individuelle CD2-Zellinie durch PLT als DPw2 typisiert wurde, obwohl es die DPB4.2- und DPB1O-Allele enthält.
Beispiel 2 PCR-Amplifikation der DPalpha- und DPbeta-Gene
• Die DPalpha- und DPbeta-Gene von einigen in Beispiel 1 beschriebenen Zellen wurden durch PCR amplifiziert. Die verwendeten synthetischen Primer sind nachstehend beschrieben. In dieser Beschreibung sind die Primer der linken Seite, GH98 und DB01, vom oberen Strang und steuern die Polymerase so, daß sie nach rechts verlängert. Die Primer auf der rechten Seite, GH99 und DB03, sind vom unteren Strang und steuern die Synthese nach links. Die Bereiche der Gene, an die die Primer binden und die als Matrizen für die Primerextension dienen, sind ebenfalls dargestellt. Die kleinen Buchstaben zeigen Basen im Primer, die zur genomischen Ziel-DNA nicht komplementär sind (als entgegengesetzter Strang dargestellt). Diese Veränderungen in den Primern schließen Restriktionsstellen (BamHI oder PstI) an den Enden der amplifizierten DNA ein und erleichtern die Clonierung der amplifizierten DNA. Die Oligonucleotidprimer GH98 und GH99, die zur Amplifikation des zweiten Exons von DPalpha verwendet werden, amplifizieren einen 243 bp-Abschnitt. Die ersten beiden Basenpaare des PCR-Produkts sind von der intervenierenden Sequenz, die das Exon flankiert. Die Oligonucleotidprimer DB01 und DB03 amplifizieren einen 294 bp- Abschnitt des zweiten Exons von DPbeta. Die linken 13 bp und die rechten 17 bp des Produkts stammen von der intervenierenden Sequenz. DPalpha-Primer DPbeta-Primer
• Die Hybridisierung der Primer und die Synthese der den verlängerten Primer enthaltenden Produkte erfolgte im wesentlichen wie in EP-A-0 258 017 und in den Protokollen beschrieben, die vom Hersteller PECI des zur Durchführung der PCR verwendeten "Thermal Cyclers" geliefert wurden. Die Arnplifikation bestand aus 28 Zyklen; es können jedoch gelegentlich mehr, d. h. 35, Zyklen bessere Ergebnisse liefern.
• Zwei weitere Beispiele für erfindungsgemäße Primer zur Amplifikation des zweiten Exons der DPbeta-Allele werden als UG19 und UG21 bezeichnet. Die Sequenzen dieser Primer und die anderen Beispiele für erfindungsgemaße DPbeta- Primer sind nachstehend dargestellt. DPbeta-Primer
Beispiel 3 SSO-Sonden für die Hvbridisierungsanalyse von DPbeta-Allelen
• Beispiele für erfindungsgemäße Sonden, auf die in den restlichen Beispielen Bezug genommen wird, sind nachstehend in tabellarischer Form dargestellt. In der Tabelle sind die Bezeichnung der Sonde, Sequenz der Sonde, die im Bereich des Allels, mit dem die Sonde hybridisiert, codierte polymorphe Aininosäuresequenz, Bezeichnung des Bereichs und Hybridisierungs- und Waschbedingungen dargestellt. Sonden werden mit einem ³²P- oder "X"-Marker dargestellt, wobei X HRP bedeutet, wie in den nachstehenden Beispielen beschrieben. Bei einer Kennzeichnung durch ein X mit einer anschließenden Sondenbezeichnung ist die Sequenz der Sonde mit der Sequenz der nach dem X genannten Sonde identisch, ausgenommen, daß der ³²P-Marker gegen einen HRP-Marker ausgetauscht ist.
• Dem Fachmann ist bewußt, daß sich je nach verwendetem Marker die Hybridisierungs- und Waschbedingungen unterscheiden. Obwohl die Sonden in einer bevorzugten Ausführungsform nicht-isotopisch markiert werden (z. B. mit HRP), wurden einige Sonden mit isotopen (z. B. ³²P) Markern verwendet. Daher werden Hybridisierungs- und Waschbedingungen für die ³²P- und HRP-markierten Sonden aufgeführt, sofern solche Bedingungen empirisch ermittelt wurden (vgl. Bugawan et al., J. Immunol. 141(12) (1988), 4024-4030). In der Tabelle setzen die Bedingungen, auf die Bezug genommen wird, eine Hybridisierungslösung voraus, die aus 5 x Denhardts- Lösung, 0,5% SDS und der angegebenen Menge (d.h. 0,1 x, 3 x und 5 x) SSPE besteht. 5 x Denhardts-Lösung enthält 0,5 g Ficoll, 0,5 g Polyvinylpyrrolidon und 0,5 g BSA (Pentax-Fraktion V) pro 500 ml. Die Waschlösung enthält 0,1 x SSPE und 0,1 % SDS (für HRP-markierte Sonden, und 0,1 % Triton X-100 wurde anstelle von SDS verwendet); der Waschschritt wird zehn Minuten bei der angegebenen Temperatur durchgeführt. Wie in Beispiel 11 beschrieben, können jedoch Tetramethylammoniumchlorid oder ähnliche Salze für einheitlichere Hybridisierungs- und Waschbedingungen verwendet werden, ein bevorzugter Zustand, wenn eine Anzahl von Sonden in einer Reihe zur Bestimmung des DP-Allel-Typs in einer Probe verwendet wird. SSOs für die HLA DPbeta-Typisierung
• In bezug auf die vorstehend dargestellte Tabelle muß bemerkt werden, daß aufgrund der Kreuzhybridisierung von DB28 mit DB32 die vorstehenden Ergebnisse unter Verwendung der Sonden DB58 und DB59 anstelle von DB25 bzw. DB32 erhalten werden können. Die Sonde DB63 wird ferner der Sonde DB39 vorgezogen.
Beispiel 4 SSO-Sonden zur Hybridisierungsanalyse von DPalpha-Allelen
• Beispiele für geeignete SSO-Sonden für die Hybridisierungsanalyse von DPalpha-Allelen sind nachstehend beschrieben. Zwei Sätze von Sonden sind erläutert; jeder Satz wurde zur Unterscheidung zwischen den Polymorphismen in einem spezifischen Abschnitt des zweiten Exons des HLA DPalpha-Gens konstruiert. ASO1 und ASO2 binden an das DPA1-Allel in dem Bereich, der die Methionin (M) bzw. Glutamin (Q) enthaltenden polymorphen Abschnitte enthält. ASO3 und ASO4 binden an das DPA2-Allel an den Bereich, der die Glutatin bzw. Arginin (R) enthaltenden polymorphen Abschnitte enthält. ASO2 und ASO4 unterscheiden den Glutamin enthaltenden von dem Arginin enthaltenden polymorphen Abschnitt. Die Sonden überspannen die diese polymorphen Aminosäurereste codierenden Bereiche. Die Hybridisierung unter Verwendung dieser Sonden wird üblicherweise in einer 5 x SSPE, 5 x Denhardts- Lösung und 0,5% SDS enthaltenden Lösung mindestens 1 Stunde bei 42ºC durchgeführt. Die Waschbedingungen flir die Sonden sind ebenfalls dargestellt. HLA DPalpha-SSO-Sonden
Beispiel 5 Analyse von amplifizierten DPbeta-Seciuenzen durch Hybridisierung mit SSO-Sonden
• PCR-amplifizierte DPbeta-Sequenzen von 24 HTCs wurden mit einer Dot- Blot-Versuchsanordnung mit einer Reihe (n = 9) von ³²P-markierten SSO-Sonden analysiert, und der DP-Typ wurde aus dem Bindungsmuster der Sonden abgeleitet. Die Extraktion der DNA aus Zellen wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. Die Zielregionen des zellulären Genoms, d. h. das zweite Exon der DPbeta-Gene, wurden durch das PCR-Verfahren, wie in Beispiel 2 beschrieben, amplifiziert, ausgenommen, daß die DNA von den vorstehend in tabellarischer Form aufgelisteten Zellen stammte.
• Die amplifizierten DNAs wurden im Dot-Blot-Verfahren auf ein Filter aufgetragen, und ein separates Filter mit der Reihe der Proben wurde zur Hybridisierungsanalyse mit jeder SSO-Sonde hergestellt. Zur Durchführung des Dot- Blot-Verfahrens bei den Proben wurden jeweils 5 µl amplifizierte Probe mit 195 µl einer 0,4 N NaOH und 25 mmol/l EDTA enthaltenden Lösung verdünnt und auf 9 replizierbaren Genatran 45 (Plasco)-Nylonfiltern als Flecken aufgetragen, indem die Filter zunächst mit Wasser angefeuchtet, in ein Bio-dot-Gerät (Bio-Rad, Richmond, CA) zur Herstellung von Dot-Blots gegeben, die Proben aufgetragen und jede Vertiefüng mit 0,4 ml 20 x SSPE (3,6 mol/l NaCl, 200 mmol/l NaH&sub2;PO&sub4; und 20 mmol/l EDTA) gespült wurden. Die Filter wurden entfernt, mit 2 x SSPE gespült und 30 Minuten bei 80ºC in einem Vakuumofen gebacken.
• Die Proben auf den Filtern wurden mit den erfindungsgemäßen SSO-Sonden hybridisiert. Die Hybridisierung erfolgte mit 0,25 bis 0,5 pmol Sonde in 2 bis 5 ml Hybridisierungslösung. Die Hybridisierungs- und Waschbedingungen waren, wie in Beispiel 3 in tabellarischer Form beschrieben. Die Ergebnisse dieser DPbeta- Typisierung sind nachstehend beschrieben, wobei auch die Sonde, mit der die Proben auf dem Filter hybridisiert wurden, und die von der Sonde nachgewiesene codierte Aminosäuresequenz gezeigt wird. DPbeta-Oligonucleotidsonden
• Die auf der Hybridisierungsanalyse mit SSO-Sonden beruhende Bestimmung der DPbeta-Typen der Zellen wurde vorstehend beschrieben. Zur Bestimmung des DPbeta-Typs einer Probe wurde die Bindung der Sonden an die Probe untersucht. Die vorhandenen Allele wurden aus dem Bindungsmuster der Sonde abgeleitet. Die Probe 1 bildete beispielsweise Hybride mit den SSO-Sonden DB11, DB17 und DB20. Die von DB11, DB17 und DB20 codierten Aminosäuren sind VYQL, DED bzw. LEEK. Eine Untersuchung der Abschnitte A, C und D der DPbeta-allelen Aminosäuresequenzen zeigt, daß die Sequenz VYQL in DPB6, DPB11 und DPB13, die Sequenz DED in DPB17, DPB14, DPB12, DPB9, DPB6 und DPB3 und die Sequenz LEEK (L___K) in DPB18, DPB14, DPB4.1, DPB4.2, DPB5, DPB7, DPB3 und DPB1 vorhanden ist. Das einzige Allel, das die drei mit der Sonde hybridisierenden Sequenzen enthält, ist DPB3. Der DP-Typ von Probe 1 auf der Basis einer SSO-Typisierung ist daher DPB3.
• Die DPB-Typen der anderen Proben wurden durch die gleiche Analyseart abgeleitet, und die bestimmten Typen sind vorstehend dargestellt. In der Darstellung zeigt der Stern (*) Zellen an, deren DPbeta-Genotyp ebenfalls durch Sequenzanalyse ermittelt wurde. Der DPw-Typ der Zellinien COX (zuvor w1Tw3) und BM21 (zuvor w1Tblank) wurde kürzlich in den angegebenen Typ verändert. Das Symbol ± betrifft ein von einer Sonde erhaltenes schwaches Signal. In einigen Fällen (BM21 und TOK) reflektiert dieses schwache Signal die Gegenwart einer weiteren polymorphen Sequenz in dem die Aminosäurereste VHYL codierenden Bereich A, der mit der DB11-Sonde kreuzhybridisiert. Die Sequenz kann einfacher mit der Sonde des Bereichs A DB22 typisiert werden. Bei anderen Zellinien (BM92) gibt es anscheinend einen Hintergrund aufgrund einer Kreuzhybridisierung der DB11-Sonde an die durch die DB10-Sonde erkannten Sequenzen. In ähnlicher Weise können die Signale aufgrund einer Kreuzhybridisierung der DB19-Sonde an zur DB18-Sonde komplementäre Sequenzen auftreten.
• Das in diesem Beispiel verwendete Spektrum von SSO-Sonden weist lediglich in 3 der 5 polymorphen Regionen Variationen nach und zeigt nicht alle allelen Varianten in diesen 3 Regionen an. Das Typisierungssystem unter Verwendung des Verfahrens dieses Beispiels ist einfach und für HTCs eindeutig, kann jedoch unter den Umständen des "Patchwork"-Polymorphismusmusters gelegentlich zu einer unklaren Typisierung bei heterozygoten Individuen führen, wenn die Interpretation des Hybridisierungsmusters der verschiedenen Sonden mehr als ein einziges Paar von Allelen zuläßt. Diese Unklarheit entsteht durch die vielen verschiedenen Kombinationen der die verschiedenen DPbeta-Allele darstellenden DPbeta-Sequenzvarianten. Unter Verwendung von weiteren erfindungsgemäßen SSO-Sonden, die die verbleibenden polymorphen Regionen überspannen, können jedoch eindeutige Typisierungen bei hetero- Zygoten Individuen durchgeführt werden.
Beispiel 6 HLA DP-Typisierung von Patienten mit einer Zöliakie-Erkrankung durch DNA- Sequenzanalyse von PCR-amplifizierten Zielregionen
• Die Zellen von vier Patienten mit einer Zöliakie-Erkrankung (CD) wurden durch das PLT-Verfahren typisiert und die DNA-Sequenzen des zweiten Exons von DPbeta, wie in Beispiel 1 beschrieben, ermittelt. Die CD-Diagnose beruhte auf der klinischen Symptomatologie.
• Die Ergebnisse der Analyse, die durch DNA-Sequenzierung von DPbeta (zweites Exon) der CD-Zellen erhalten wurde, wurde vorstehend beschrieben. Diese Ergebnisse zeigen, daß es bei einem Vergleich von CD-Zellen mit nicht-CD-Zellen eine offensichtliche Erhöhung der Häufigkeit des DPB4.2-Allels gibt. Die DPB10-Allel- Sequenz ist ferner in zwei verschiedenen CD-Patienten vorhanden, wird jedoch nur in einer von 30 Non-CD-Zellinien beobachtet.
Beispiel 7 HLA DP-Typisierung von Patienten mit einer Zöliakie-Erkrankung durch Hybridisierungsanalyse mit SSO-Sonden
• Die Zellen von 19 Patienten mit CD und von 43 Non-CD-Kontrollen wurden durch Hybridisierung mit SSO-Sonden auf den HLA DP-Typ analysiert. Die CD- Diagnose beruhte auf der klinischen Symptomatologie; die CD-Patienten sowie die Kontrollindividuen stammten alle aus Italien. Die DNA-Extraktion war, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die PCR-Amplifikation der Proben war, wie in Beispiel 2 beschrieben. Die Analyse der amplifizierten Sequenzen war, wie in Beispiel 4 beschrieben.
• Die Ergebnisse der Analyse zeigten, daß es eine signifikant erhöhte Zahl an DPB4.2-Allelen in CD-Patienten im Vergleich zu Kontrollen ohne CD gab; dieses Allel war in 12 von 19 CD-Patienten vorhanden, jedoch nur in 3 von 43 Kontrollpatienten Die DPB4.2- und DPB3-Allele waren in 17 von 19 CD-Patienten und in 15 von 43 Kontrollen vorhanden. Der Genotyp DPB4.1/4.2 war in 10 von 19 CD-Patienten und in nur 1 von 43 Kontrollen vorhanden.
Beispiel 8 HLA DP-Typisierung von gerichtsmedizinischen Proben
• Genomische Nucleinsäuren des verdächtigen Individuums enthaltende Proben werden erhalten. Die Zielregionen des Genoms, d. h. die Regionen, die das zweite Exon der DPalpha- und DPbeta-Gene enthalten, werden durch das PCR-Verfahren, wie in Beispiel 2 beschrieben, amplifiziert, außer daß die Nucleinsäuren der Verdachtsperson diejenigen Zellen in dem Beispiel ersetzen und die amplifizierten Proben einen ³²P-Marker enthalten. Die amplifizierte Probe wird mit den erfindungsgemäßen Sonden hybridisiert, die durch das Dot-Blot-Verfahren auf das gleiche Filter aufgetragen und über poly-dT-Termini auf dem Filter immobilisiert wurden. Die Hybridisierungs- und Waschbedingungen für das Filter erlauben nur den perfekt zueinanderpassenden Hybriden im Duplex-Zustand zu bleiben. Die Filter werden untersucht, um zu ermitteln, welche Sonden mit der markierten Probe Hybride bilden.
• Eine Probe, die mit der von der Verdachtsperson erhaltenen verglichen werden soll, wird durch das gleiche Verfahren, d. h. durch PCR-Amplifikation und Hybridisierung mit den immobilisierten SSO-Sonden, auf den DP-Typ untersucht. Das Bindungsmuster der Probe der Verdachtsperson und der Vergleichsprobe an die SSO- Sonden wird untersucht, um die Ähnlichkeit oder den Unterschied in den Hybridisierungsmustern zu ermitteln.
Beispiel 9 HLA DP-Typisierung unter Verwendung von mit Meerrettich-Peroxidase markierten SSO-Sonden
• Ein Spektrum von Zellen von 39 Individuen wurde auf DPbeta-Allele unter Verwendung von SSO-Sonden für die Varianten des zweiten Exons typisiert. Die Sonden wurden mit der Meerrettich-Peroxidase (HRP) markiert und die Hybride in einer Dot-Blot-Versuchsanordnung nachgewiesen.
• Die analysierten Zellen waren von 14 IDDM-Patienten, 5 DR3-Non-IDDM- Kontrollpatienten und 19 HTCs, die durch das PLT-Verfahren als DP-blank typisiert wurden. IDDM-Patienten wurden durch ihre klinische Symptomatologie identifiziert. Die DNA wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, aus den Zellen isoliert. Die Zielregion, d. h. das zweite Exon der DPbeta-Allele, wurde unter Verwendung des PCR-Verfahrens in 200 µl Reaktionsgemisch, das 50 mmol/l Tris-HCl, pH 8,3, 2,5 mmol/l MgCl&sub2;, 100 µg/ml Gelatine, jeweils 0,75 mmol/l der vier Desoxynucleosidtriphosphate, die Primer DB01 und DB03 und die Taq-Polymerase enthielt, amplifiziert. Die Amplifikation wurde, wie nachstehend beschrieben, durchgeführt: 30 Sekunden langes Erhitzen auf 94ºC mit einer anschließenden 30 Sekunden langen Inkubation bei dieser Temperatur, 1-minütiges Abkühlen auf 55ºC mit einer anschließenden 30 Sekunden langen Inkubation bei dieser Temperatur, 30 Sekunden langes Erhitzen auf 72ºC mit einer anschließenden 45 Sekunden langen Inkubation bei dieser Temperatur. Dieser Kreisprozeß wurde über 42 Zyklen wiederholt. Nach der Amplifikation wurden den Reaktionsgemischen Proben entnommen und durch Gelelektrophorese auf 3% Nusieve und 1% Agarose enthaltenden Gelen untersucht, um festzustellen, ob alle DNA-Mengen vergleichbar waren.
• Filter, die die durch das Dot-Blot-Verfahren aufgetragenen Proben enthielten, wurden durch Blotten von 150 µl/Fleck an denaturierter amplifizierter DNA auf Genatran-Nylon-Membranen und 5-minütige UV-Behandlung der die Proben enthaltenden Filter hergestellt. Der letzte Behandlungsschritt fixiert die Probe an den Membranen. Die amplifizierten DNAs wurden durch Behandlung von 5 µl PCR- Reaktionsgemisch in einem Gesamtvolumen von 150 µl, das 0,4 N NaOH und 25 mmol/l EDTA enthielt, denaturiert. Acht Replika-Filter wurden zur Hybridisierung mit HRP-markierten ASO-Sonden hergestellt.
• Vor der Hybridisierung wurden die Proben-enthaltenden Filter 15 Minuten in Vorhybridisierungslösung (1 x SSPE, 5 x Denhardt-Lösung und 1% Triton X-100) ohne Sonde inkubiert. In der Vorhybridisierungslösung wurde Triton X-100 anstelle von SDS verwendet. Die Hybridisierung wurde in der gleichen Lösung durchgeführt, die zusätzlich 1 pMol Sonde/ml enthielt. Jedes Filter wurde 40 Minuten mit 2,5 ml Hybridisierungslösung, die eine der HRP-markierten Sonden enthielt, inkubiert. Die verwendeten Sonden waren DB27, DB28, DB29, DB30, DB31, DB32, DB33 und DB35. Die Sonden und Hybridisierungsbedingungen sind in tabellarischer Form in Beispiel 3 aufgelistet. Nach der Hybridisierung wurden die Filter, wie in Beispiel 3 beschrieben, unter geeignet stringenten Bedingungen, d. h. in 0,1 x SSPE und 0,1 % Triton X-100 5 Minuten bei 42ºC, gewaschen. Die HRP-markierten SSO-Sonden wurden im wesentlichen durch die Verfahren hergestellt, die in den hier durch Bezugnahme mit eingeschlossenen PCT-Veröffentlichungen 89/02931 und 89/02932 beschrieben sind.
• Diese Verfahren umfassen im wesentlichen die Derivatisierung der Nucleinsäuresonde unter Verwendung eines linearen verbindenden Moleküls, das eine hydrophile Polymerkette (z. B. Polyoxyethylen) mit einer Phosphoramidit-Einheit an einem Ende und einer geschützten Sulfhydryl-Einheit am anderen Ende umfaßt. Die Phosphoramidit-Einheit kuppelt an die Nucleinsäuresonde durch im Stand der Technik bekannte Reaktionen (z. B. Beaucage et al., Tetrahedron Lett. 22 (1988), 1859-1862), während die Sulfhydrylgruppe ohne Schutzgruppe Disulfid- oder andere kovalente Bindungen mit dem Protein, z. B. HRP, bilden kann. Das HRP wird an das verbindende Molekül durch eine N-Maleinimido-6-aminocaproyl-Gruppe konjugiert. Der Marker wird durch Veresterung von N-Maleinimido-6-aminocapronsäure mit Natrium-4-hydroxy-3-nitrobenzolsulfonat in Gegenwart eines Äquivalentes von Dicyclohexylcarbodiimid in Dimethylformamid hergestellt. Nach der Reinigung wird das Produkt dem Phosphatpuffer zugesetzt, der HRP in einem Gewichtsverhältnis von 8:1 HRP zu Ester enthält. Die Oligonucleotidsonde wird in einem DNA-Synthesizer synthetisiert und das verbindende Molekül mit der Struktur (C&sub6;H&sub5;)&sub3;CS-(CH&sub2;CH&sub2;O)&sub4;- P(CH&sub2;CH&sub2;CN)[N(i-PR)&sub2;] unter Verwendung von Phosphoramidit-Synthesebedingungen angefügt. Die Tritylgruppe wird entfernt, und das HRP-Derivat und das Sondenderivat werden vermischt und konnten unter Bildung der markierten Sonde reagieren. Eine Biotin-markierte Sonde oder Primer können durch ähnliche Verfahren hergestellt werden.
• Proben, die die hybridisierte Sonde enthielten, wurden unter Verwendung einer Farbentwicklungsreaktion nachgewiesen, wie von Sheldon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986), 9085-9089, beschrieben, in der TMB/H&sub2;O&sub2; verwendet wird. Das Nachweissystem wird nachstehend in Beispiel 10 beschrieben. Die HLA DP-Genotypen der amplifizierten DNA-Proben waren auf den Filtern leicht zu erkennen.
Beispiel 10 HLA DPbeta-Typisierung mit HRP-markierten SSO-Sonden A. PCR-Amplifikation
• Die DPB-Typisierung kann mit 14 oder mehr SSO-Sonden (sequenz- spezifische Oligonucleotide) durchgeführt werden, so daß die Amplifikation mit 0,5 bis 2 µg DNA in 200 µl Reaktionsvolumen durchgeführt wird, wenn die DNA nicht begrenzend ist. Auch kleinere Mengen DNA, d.h. 100 ng, können amplifiziert werden, es sollten jedoch mehr Amplifikationszyklen, d. h. 45 Zyklen, mit diesen Proben durch geführt werden.
• Die PCR-Reaktion wird durch Vermischen der nachstehend beschriebenen Bestandteile mit einem Vortexgerät für 1 bis 2 Sekünden begonnen.
• DNA 0,5 bis 2 µg
• 10 x Taq-Puffer 20 µl
• 100 mM dNTPs 1,5 µl
• DPB-Primer [10 µM UG19 oder DB01] 10 µl
• DPB-Primer [10 µM UG21 oder DB03) 10 µl
• Taq-Polymerase 5 E/µl 1,2 µl
• In einer Glasapparatur destilliertes H&sub2;O wird zu einem Endvolumen von 200 µl zugesetzt. 10 x Taq-Salze enthalten 500 mmol/l KCl, 100 mmol/l Tris, pH 8,3, 15 mmol/l MgCl&sub2; und 1 mg/ml Gelatine. Negative Kontrollen (d. h. keine DNA) müssen in jeden PCR-Zyklus eingeschlossen sein. Üblicherweise reichen 30 bis 35 Amplifikationszyklen in einem Perkin-Elmer/Cetus Instruments-DNA-Thermal-Cycler. Die Zyklen sind so aufgebaut, daß 30 Sekunden bei 96ºC denaturiert wird und 30 Sekunden bei 65ºC aneinandergelagert und verlängert wird. Wenn das Primerpaar DB01/DB03 verwendet wird, dauert das Aneinanderlagem 30 Sekunden bei 55ºC und die Verlängerung 30 Sekunden bei 72ºC. Analytische Gele können verwendet werden, um PCRs zu überprüfen und die DNA-Menge zur Verwendung für Dot-Blots zu quantifizieren.
B. Dot-Blot
• Üblicherweise enthalten 5 µl der amplifizierten DNA etwa 200 ng, mehr als für einen einzelnen Dot-Blot benötigt wird. Es muß jedoch beachtet werden, daß 14 oder mehr Flecken erforderlich sein können, d. h. etwa 70 µl der Amplifikationsreaktion müssen dann zur Herstellung der Dot-Blots verwendet werden. Zu jeweils 5 µl Amplifikationsreaktion werden 50 µl 0,4 N NaOH und 25 mM EDTA der DNA zugesetzt. Fünf Minuten reichen zur vollständigen Denaturierung der DNA. Die Genatran-Membran wird zunächst mit 2 x SSPE angefeuchtet, und anschließend werden die 150 µl denaturierte DNA in das Dot-Blot-Gerät geladen. Die Membran wird in 2 x SSPE gespült und die DNA an der Membran befestigt, indem sie fünf Minuten gegen UV-Licht exponiert wird, d.h. durch eine Exponierung gegen 55 ml/cm² in einer von Stratagen erhältlichen Stratalinker 1800 UV-Lichtbox.
C. Hybridisierung
• Die Membran wird erneut in 2 x SSPE angefeuchtet, und etwa 5 ml Hybridisierungslösung pro 8 x 12 cm Membran (Größe des Dot-Blot-Geräts) werden zugesetzt. Etwa 1 bis 1,5 pMol HRP-Sonde werden pro ml Hybridisierungslösung zugesetzt, und die Sonden können mindestens eine Stunde hybridisieren. Die Hybridisierungslösung ist SSPE (wie vorstehend angegeben), 5 x Denhardt-Lösung und 1 % Triton X-100. Die Membranen werden anschließend 10 Minuten mit 0,1 x SSPE und 0,2% Triton X-100 gewaschen. Andererseits waren die Hybridisierungs- und Waschbedingungen, wie in Beispiel 3 beschrieben. Die verwendeten Sonden waren DB27, DB29, DB30, DB31, DB33, DB34, DB35, DB37, DB38, DB40, DB41, DB58, DB59, DB62 und DB63.
D. Nachweis
• Die nachstehenden Schritte zum Nachweis von Sonden werden bei Raumtemperatur unter mäßigem Schütteln und gerade ausreichend Lösung zum vollständigen Bedecken der Membran durchgeführt, wie von Bugawan et al., Bio/Technology 6 (1988), 943-947, beschrieben. Der Nachweis wird durchgeführt, indem die Membran 5 Minuten in Puffer B inkubiert, 5 Minuten mit Puffer C gewaschen und 10 Minuten unter Lichtausschluß mit Puffer C und TMB (48 ml Puffer C und 2,5 ml 2 mg/ml TMB) inkubiert wird. Puffer B enthält 100 mmol/l NaCl, 1 mol/l Harnstoff, 5% Triton X-100 und 1 % Dextransulfat. Puffer C enthält 100 mmol/l Natriumcitrat, pH 5,0. TMB ist 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin. Etwa 23 µl 3% H&sub2;O&sub2; werden zu 50,5 ml Puffer C/TMB zugesetzt; die erhaltene Lösung wird zur Entwicklung der Farbe auf den Membranen (die Farbe erscheint innerhalb von 1 bis 5 Minuten) unter lichtausschließenden Bedingungen verwendet. Die Farbentwicklung wird durch Waschen in H&sub2;O mit einer kleinen Menge Puffer C beendet. Das Waschen wird zweimal 30 Minuten wiederholt. Die Membran wird photographiert und in Puffer C ohne Licht aufbewahrt.
• Die hier beschriebenen Verfahren sowie die SSO-Sonden und Primer und Kits, die diese enthalten, können zur genauen, relativ einfachen und ökonomischen Bestimmung des HLA DP-Genotyps eines Individuums verwendet werden. Die genaue DP-Typisierung wird sich in mehreren medizinischen Anwendungen als wichtig erweisen. Die genaue HLA DP-Übereinstimmung von Spendern und Empfängern ist bei der Prävention der Allotransplantatabstoßung und der Verhinderung einer Transplantat-anti- Wirt-Reaktion hilfreich. Da bestimmte HLA DP-Genotypen anscheinend mit bestimmten Autoimmunkrankheiten wie der Zöliakie-Krankheit, Myasthenia gravis und IDDM zusammenhängen, ist die HLA DP-DNA-Typisierung für eine frühe Diagnose der Krankheit vor der Manifestation aller klinischen Symptome nützlich.
• Die genaue HLA DP-Typisierung ist in der Gerichtsmedizin nützlich. Sie liefert beispielsweise den Nachweis, ob eine genomische Nucleinsäuren enthaltende Probe wie Blut, Haar oder Samen von einem Verdächtigen stammen. Sie kann auch zur Ermittlung der Vaterschaft oder Mutterschaft eines Individuums verwendet werden. Die letztere Verwendung ist von besonderer Wichtigkeit zur Analyse von historischen Proben.
Beispiel 11 Sondenhybridisierung in TMACL
• Wenn Tetramethylammoniumchlorid (TMACL) in einer Hybridisierungslösung vorhanden ist, beruht die Unterscheidung zwischen den Sonden auf der Länge der Sonde und nicht auf ihrer G, C, A oder T-Zusammensetzung. Daher können bei Verwendung von TMACL in der Hybridisierungslösung viele verschiedene Sonden bei einer einzigen Temperatur hybridisiert und gewaschen werden.
• Eine geeignete Hybridisierungslösung für diesen Zweck enthält 3 mol/l TMACL, 0,5% SDS, 10 mmol/l Tris-HCl, pH 7,5, und 0,1 mmol/l EDTA. Die 19- mer-Sonden DB27, DB28, DB29, DB35, DB34, DB37, DB38 und D862 werden 30 bis 60 Minuten bei 55ºC, die 17-mer-Sonden DB30, DB31, DB33 und DBS9 bei 50ºC und die DB40 und DB41 bei 60ºC hybridisiert. Die Waschlösung besteht aus 3 mol/l TMACL, 50 mmol/l Tris-HCL, pH 8, und 2 mmol/l EDTA. Das Waschen wird zunächst 20 Minuten bei 37ºC und anschließend 10 Minuten bei einer stärker stringenten Temperatur (der Hybridisierungstemperatur) durchgeführt. Der Nachweis der Hybridisierung wird, wie in Beispiel 10 beschrieben, durchgeführt.
• Weitere Sonden, die in dieser oder einer anderen Hybridisierungsversuchsanordnung für die erfindungsgemäßen Zwecke verwendet werden können, sind nachstehend beschrieben (X ist HRP).

Claims (11)

1. Ein Verfahren zur Bestimmung des HLA DPbeta Genotyps eines Individuums aus einer Nukleinsäure enthaltenden Probe, die vom Individuum stammt, umfassend:

(a) Amplifizierung einer Nukleinsäuresequenz aus dem variablen zweiten Exon des HLA DPbeta Gens in der Nukleinsäure der Probe;

(b) Mischung der amplifizierten Nukleinsäuresequenz mit einer Reihe von sequenzspezifischen Oligonukleotidsonden, wobei jede Sonde aus einer Nukleinsäure besteht, die eine Nukleotidsequenz hat, die sich über eine variable Region der HLA DPbeta Gensequenz erstreckt, die aus der Gruppe bestehend aus den variablen Regionen, die in den Codons 8-11, 33-36, 55-57, 65-69, 76 und 84-87 lokalisiert sind, ausgewählt ist und die die sequenzspezifische Hybridisierung an die HLA DPbeta Allele erlaubt, die aus der Gruppe der Mlele bestehend aus DPB1, DPB2.2, DP4.2, DPB5, DPB6, DPB8, DPB9, DPB10, DPB11, DPB13, DPB14, DPB15, DPB16, DPB17, DPB18, DPB19 und DPB20, wie sie auf Seite 20 der Beschreibung definieft sind, ausgewählt sind, unter Bedingungen worin die genannten sequenzspezifischen Oligonukleotidsonden an die amplifizierte Nukleinsäuresequenz binden und nur dann einen stabilen Hybridduplex bilden, wenn sie exakt komplementär zur Nukleotidsequenz des genannten HLA DPbeta Allels sind;

(c) Nachweis von Hybriden, die sich zwischen der amplifizierten Nukleinsäuresequenz und den sequenzspezifischen Oligonukleotidsonden gebildet haben; und

(d) Bestimmung des HLA DPbeta Genotyps eines Individuums aus der Anwesenheit oder der Abwesenheit der genannten Hybride.

2. Ein Verfahren gemäss Anspruch 1 worin die Amplifizierung die Behandlung der genannten Probe unter Bedingungen urnfasst, die geeignet sind eine Polymerase-Kettenreaktion durchzuführen, wobei die Polymerase- Kettenreaktion fakultativ in der Gegenwart der Primer

DBO1 5'-CAGGGATCCGCAGAGAATTAC-3' und oder und

durchgeführt wird.

3. Ein Verfahren gemäss Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin die komplementäre Sequenz der sequenzspezifischen Sonden 10 bis 30 Nukleotide lang ist, vorzugsweise 17 bis 23 Nukleotide lang ist, noch bevorzugter 17 bis 19 Nukleotide lang ist.

4. Ein Verfahren gemäss Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin die komplementäre Sequenz der sequenzspezifischen Sonden ausgewählt ist aus: und

5. Eine Reihe von sequenzspezifischen Oligonukleotidsonden zur Bestimmung des HLA DPbeta Genotyps eines Individuums aus einer Nukleinsäure enthaltenden Probe, die vom Individuum stammt, in einem Veffahren gemäss Anspruch 1, worin jede Sonde aus einer Nukleinsäure besteht, die eine Nukleotidsequenz hat, die sich über eine variable Region der HLA DPbeta Gensequenz erstreckt, die aus der Gruppe bestehend aus den variablen Regionen, die in den Codons 8-11, 33-36, 55-57, 65-69, 76 und 84- 87 lokalisiert sind, ausgewählt ist und die die sequenzspezifische Hybridisierung an die HLA DPbeta Allele erlaubt, die aus der Gruppe der Allele bestehend aus DPB1, DPB2.2, DP4.2, DPB5, DPB6, DPB8, DPB9, DPB10, DPB11, DPB13, DPB14, DPB15, DPB16, DPB17, DPB18, DPB19 und DPB20, wie sie auf Seite 20 der Beschreibung definiert sind, ausgewählt sind.

6. Eine Reihe von sequenzspezifischen Oligonukleotidsonden gemäss Anspruch 5, worin die Nukleotidsequenz, die sich über eine variable Region der HLA DPbeta Gensequenz erstreckt, ausgewählt ist aus: 56/1

7. Eine sequenzspezifische Oligonukleotidsonde zur Verwendung in einem Verfahren gemäss Anspruch 1, die eine Nukleotidsequenz hat, die ausgewählt ist aus: und

8. Ein Primer zu Verwendung in einem Verfahren gemäss Anspruch 1, der aus der Gruppe von Primern und oder

ausgewählt ist.

9. Ein Kit zur Bestimmung des HLA DPbeta Genotyps eines Individuums aus einer Nukleinsäure enthaltenden Probe, die vom Individuum stammt, enthaltend:

(a) eine Reihe von sequenzspezifischen Oligonukleotidsonden gemäss Anspruch 5 oder 6; und

(b) Anweisungen zur Bestimmung des Genotyps des Individuums unter Verwendung der Kit-Bestandteile; wobei der Kit fakultativ zusätzlich einen Behälter enthält, der Oligonukleotidprimer enthält, die zur Amplifikation der Zielregion eines HLA DPbeta Gens verwendet werden können.

10. Ein Kit gemäss Anspruch 9, der zusätzlich sequenzspezifische Oligonukleotidsonden zur Bestimmung des HLA DPbeta Genotyps eines Individuums enthält, worin jede Sonde aus einer Nukleinsäure mit einer Nukleotidsequenz besteht, die vorzugsweise im Bereich von 10 bis 30 Nukleotiden lang ist, vorzugsweise 17 bis 23 Nukleotide lang ist, noch bevorzugter 17 bis 19 Nukleotide lang ist, die sich über eine variable Region der HLA DPalpha Gensequenz erstreckt und eine sequenzspezifische Hybridisierung an eine variable Sequenz eines variablen Segments des HLA DPalpha Gens erlaubt, worin die genannte Nukleotidsequenz vorzugsweise ausgewählt ist aus: und

und wobei der Kit fakultativ zusätzlich einen Behälter umfasst, der Oligonukleotidprimer zur Amplifikation einer Zielregion eines HLA DPalpha Gens enthält, wie die Primer und

11. Ein Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4, das zusätzlich enthält entweder: (a) die Bestimmung ob ein Genotyp eines Individuums an eine Autoimmunkrankheit gekoppelt ist, wobei fakultativ die Autoimmunkrankheit juvenile rheumatoide Arthritis ist und der HLA DPbeta Genotyp des Individuums das DPB2.1 Allel, wie es auf Seite 20 der Beschreibung definiert ist, umfasst, oder worin die Autoimmunkrankheit ein Insulin-abhängiger Diabetes mellitus (IDDM) ist, oder worin die Autoimmunkrankheit Zöliakie (coeliac disease, CD) ist und der Genotyp positiv ist für ein Allel ausgewählt aus der Gruppe von DPB13, DPB1, DPB3 und DPB4.2, wie sie auf Seite 20 der Beschreibung definiert sind; oder (b) die Bestimmung des HLA DPbeta Genotyps einer unbekannten Probe gemäss dem Verfahren wie es in Anspruch 1 definiert ist und das Vergleichen des HLA DPbeta Genotyps und fakultativ des HLA DPalpha Genotyps des Individuums mit dem der Probe, und das Ableiten ob die unbekannte Probe vom Individuum stammt.