DE69704031T2 - Test zur diagnose eines erhöhten brustkrebs-risikos - Google Patents
Test zur diagnose eines erhöhten brustkrebs-risikosInfo
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Description
- Die Erfindung betrifft einen diagnostischen Assay zur Ermittlung der Suszeptibilität für Brustkrebs, der auf der Sequenz der 3'- untranslatierten Region des Prohibitin-Gens beruht.
- Brustkrebs ist die zweithäufigste Ursache von mit Krebs in Zusammenhang stehenden Todesfällen von Frauen in Nordamerika. Es muß jedoch zwischen sporadischem und familiär gehäuft auftretendem oder vererbtem Brustkrebs unterschieden werden.
- Ungefähr 10% aller Brustkrebserkrankungen werden gegenwärtig als streng familiär gehäuft auftretend eingestuft, wobei es sich erweist, dass viele von diesen durch Mutationen in den erblichen Brustkrebs-Genen BRCA1 oder BRCA2 verursacht werden. Jedoch ist mindestens ein Drittel der Brustkrebserkrankungen; die in Familien umzugehen scheinen, nicht mit BRCA1 oder BRCA2 verknüpft, was die Existenz eines zusätzlichen Gens für erblichen Brustkrebs oder mehrerer solcher Gene nahelegt. Unlängst haben Studien beruhend auf der Beobachtung einer Tumorsuppression bei Brustkrebszellen nach dem Einschleusen von normalem menschlichem Chromosom 17 ohne Hinzufügung von aktivem BRCA1 oder p53 die Möglichkeit nahegelegt, dass sich zusätzliche Gene, die für die Entwicklung von Brustkrebs von Bedeutung sind, auf Chromosom 17 befinden (Theile et al., "Suppression of tumorigenicity of breast cancer cells by transfer of human chromosome 17 does not require transferred BRCA1 and p53 genes", Oncogene 10: 439-443 (1995)).
- Das antiproliferativ wirkende Gen Prohibitin wurde entdeckt unter Einsatz einer Subtraktionshybridisierung, um mRNAs anzureichern, die präferentiell in normal proliferierenden Zellen im Vergleich zu sich regenerierenden Rattenleberzellen exprimiert werden (McClung et al., "Isolation of a cDNA that hybrid selects antiproliferative mRNA from rat liver", Biochem Biophys Res Corum 164: 1316-1322 (1989); Nuell et al., "Prohibitin, an evolutionarily conserved intracellular protein that blocks DNA synthesis in normal fibroblasts and HeLa cells", Mol Cell Biol 11: 1372-1381 (1991)). Das menschliche Prohibitin-Gen, das auf Chromosom 17 bei q21 kartiert (White et al., "Assignment of the human prohibitin gene (PHB) to chromosome 17 and identification of a DNA polymorphism", Genomics 11: 228-230 (1991)), war ein anfängliches Kandidatengen für den familiär gehäuft auftretender Brust- und Eierstockkrebs-Tumorsuppressor-Genort basierend auf einem häufigen Verlust von Heterozygotie in dieser Region bei familiär gehäuft auftretenden und sporadischen Brustkrebserkrankungen (Black et al., "A somatic cell hybrid map of the long arm of human chromosome 17, containing the familiar breast cancer locus (BRCA1)", Am J Hum Genet 52: 702-710 (1993); Nagai et al., "Detailed deletion mapping of chromosome segment 17q12-21 in sporadic breast tumors", Genes, Chromosome and Cancer 11: 58-62 (1994)). Darüber hinaus berichteten Sato et al., "The human prohibitin gene located on chromosome 17q21 is mutated in sporadic breast cancer", Cancer Res 52: 1643-1646 (1992), über vier Mutationen in einer hochkonservierten Region von Exon 4 von Prohibitin bei einer Analyse von 23 sporadischen menschlichen Brustkrebserkrankungen. Jedoch führten Positionsklonierungsuntersuchungen zu der Identifizierung von BRCA1 anstelle von Prohibitin (Miki et al., "A strong candidate for the breast and ovarian cancer susceptibility gene BRCA1", Science 266: 66-71 (1994)) als ein Gen für familiär gehäuft auftretenden Brustkrebs auf Chromosom 17.
- Frühere Untersuchungen des Prohibitin-Gens aus DNA, die aus Patienten mit familiär gehäuft auftretendem Brustkrebs gereinigt worden war, ergaben keinen Hinweis darauf, dass irgendwelche der Patienten eine Keimbahn-Veränderung der proteincodierenden Region der genomischen Prohibitin-DNA trugen. Es wurde dementsprechend geschlossen, dass es keinen Zusammenhang zwischem familiär gehäuft auftretendem/erblichem Brustkrebs und Mutationen in der das Prohibitin-Protein codierenden Region gibt. Tokino et al., Internat'l J Oncol 3: 769-772 (1993). Zusätzliche Untersuchungen identifizierten keinerlei somatische Mutationen in der das Prohibitin-Protein codierenden Region bei familiär gehäuft auftretenden/erblichen Brustkrebserkrankungen, was nahelegte, dass die proteincodiererde Region bei Brustkrebserkrankungen nicht häufig mutiert ist. Sato et al., Genomics 17: 762-764 (1993).
- Frühere Arbeiten durch Jupe et al. offenbarten einen diagnostischen Test für erhöhte Suszeptibilität für sporadischen Brustkrebs. Es wurde darüber berichtet, dass bei Personen, die hinsichtlich der zwei Prohibitin-Allele (die basierend auf Sequenzvariationen, die in Intron 2 und 5 gefunden werden, als " non-B" (" nicht-B") und " B" bezeichnet werden) heterozygot oder hinsichtlich des non-B-Allels homozygot sind, ein geringes Risiko, sporadischen Krebs zu entwickeln, bestehen würde. Die Wahrscheinlichkeit, Krebs zu entwickeln, würde für jene zunehmen, die hinsichtlich des B-Typ-Allels homozygot sind, und wieder für jene, die eine Mutation in der 3'-untranslatierten Region ("3'- UTR") von mindestens einem der B-Typ-Allele aufweisen. Es wurde über Analysen von von Brustkrebs abgeleiteten Zellliinien und primären Brustumoren, die Homozygotie hinsichtlich des B-Typ- Allels und somatische Mutationen in der 3'-UTR zeigten, berichtet.
- Volllängen-Prohibitin-cDNAs für die BT-20-, MCF7- und SK-BR-3- Brustkrebszelllinien wurden sequenziert und es wurden auf die 3'- UTR beschränkte Mutationen identifiziert. Diese drei Zelllinien wurden im Fortschreiten des Zellzyklus angehalten, wenn Volllängen-Prohibitin-Transkript durch Mikroinjektion eingeschleust wurde. Alle von diesen waren auch hinsichtlich des B-Allels homozygot. Verglichen mit der Sequenz der Wildtyp-Prohibitin-3'- UTR wurden zwei Punktmutationen für BT-20 identifiziert: G (Guanin) zu A (Adenin) an Position 758 und T (Thymin) zu C (Cytosin) an Position 814. MCF7 wies ebenfalls zwei Punktmutationen auf: G zu A an Position 236 und C zu T an Position 729. SK-BR-3 zeigte 26 Basenveränderungen einschließlich einer Veränderung von C zu T an Position 729. Folglich wiesen sowohl MCF7 als auch SK-BR-3 eine Veränderung von C zu T an Position 729 auf. Jupe et al., "Prohibitin in breast cancer cell lines: Loss of antiproliferative activity is linked to 3' untranslated region mutations", Cell Growth and Differentiation 7: 871-878 (1996). Es ist jetzt im Gegensatz zu den Lehren anhand der früheren Arbeiten über Prohibitin gefunden worden, dass diese Veränderung von C zu T an Position 729 nicht das Ergebnis einer somatischen Mutation, sondern vielmehr das Ergebnis einer natürlichen allelischen Variation an dieser Stelle ist, d. h. es handelt sich um einen Keimbahn-Polymorphismus. Darüber hinaus handelt es sich um einen Keimbahn-Polymorphismus, der als ein Suszeptibilitätsmarker für Brustkrebs verwendet werden kann. Daten weisen darauf hin, dass die Häufigkeit der Homozygotie hinsichtlich 729-T bei Brustkrebspatientinnen ungefähr 4-5-fach höher zu sein scheint als bei nicht erkrankten Frauen, dass 4% aller Brustkrebserkrankungen sich in Frauen entwickeln, die hinsichtlich T/T homozygot sind, (die wahrscheinlich weniger als 1% der nicht erkrankten Frauen ausmachen), und dass deren lebenslanges Risiko zur Entwicklung von Brustkrebs bzw. deren Risiko, während ihrer Lebenszeit Brustkrebs zu entwickeln, ungefähr 50% beträgt.
- Folglich ist jetzt gefunden worden, dass das Prohibitin-Gen, das sich auf Chromosom 17q21 nahe dem BRCA1-Genort befindet, einen Keimbahn-Polymorphismus in der 3'-UTR zeigt, der als ein Suszeptibilitätsmarker für Brustkrebs verwendet werden kann.
- Fig. 1A und Fig. 1B zeigen die auf Sequenzähnlichkeiten basierende gegenseitige Ausrichtung (" alignment") von mutierten Prohibitin-3'-UTR-Sequenzen, die aus durch Mikrodissektion präparierten Patiententumoren erhalten worden sind. Die Figuren zeigen den Sense-DNA-Strang eines häufig mutierten 140 bp-Abschnitts, der sich an dem 3'-Ende der 3'-UTR befindet, wobei die ersten 70 Basen in Fig. 1A angegeben sind und die letzten 70 Basen in Fig. 1B angegeben sind. Die Sequenzen der zwei Wildtyp (WT)-Allele, die sich nur an Position 729 unterscheiden, sind zuoberst gezeigt. Die mutierten Sequenzen aus Brustumoren (T) von sieben unterschiedlichen Patienten (TN-X) sind in Form eines Alignments den aus angrenzendem normalem (N) Gewebe erhaltenen Sequenzen gegenübergestellt. Diese angrenzenden normalen Sequenzen waren alle identisch ausser bei Position 729. Diese Position enthielt entweder ein C oder ein T (C/T). Die Sequenz aus der stark mutierten Brustkrebs-Zelllinie SK-BR-3 ist in der Mitte der Figuren gezeigt. Die kleinen Buchstaben geben Basenveränderungen bezogen auf die Wildtypsequenz an. Insertionen sind durch zusätzliche kleine Buchstaben gezeigt und Deletionen sind durch Gedankenstriche angegeben. Die variable Base bei UTR-729 ist in dem schattierten eingerahmten Bereich enthalten und die sechs Basen-AflIII-Erkennungsstelle ist in dem großen eingerahmten Bereich enthalten.
- Fig. 2 veranschaulicht die 5'-3'-Sense-Sequenz der Wildtyp- Prohibitin-3'-UTR und die Lage von Primern (unterstrichen), die für einen AflIII-Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP)- Assay für eine Genotypisierung eingesetzt werden können. Der Assay wird in zwei Schritten ausgeführt, wobei der anfängliche Primersatz P1/P2 für eine PCR-Amplifizierung verwendet wird. Die anfänglichen PCR-Reaktionsprodukte werden dann einer Elektrophorese auf einem 2,5%-igen Agarosegel unterworfen und die 852 bp-Bande wird ausgeschnitten und gereinigt. Das 852 bp-Fragment wird als Matrize in der PCR mit einem der Primersätze P3/P2 oder P4/P2 verwendet, um ein Unterfragment zu erzeugen. Dieses Unterfragment wird mittels Mikrospin-Säulen (Pharmacia) gereinigt und mit AflIII verdaut. Die Primer P1, P3 und P4 sind allesamt Sense-Primer. Primer P2 ist ein Antisense-Primer, dessen Sequenz 5'-GGAAGGTCTGGGTGTCATTT-3' (SEQ ID NO: 19) ist.
- Fig. 3 veranschaulicht die 5'-3'-Sense-Sequenz des Prohibitin- Gens, die in Intron 6 beginnt, die proteincodierende Region von Exon 7 enthält und sich bis zum Ende der 3' -UTR fortsetzt. Es werden die Primer P1' (SEQ ID NO: 23) (vorwärts) und P2 (SEQ ID N0 : 19) (rückwärts) verwendet, um das PCR-Fragment zu synthetisieren, das für einen AflIII-RFLP-Genotypisierungsassay verwendet wird. Das 1237 bp-Fragment (von Position 93 bis Position 1328 in Fig. 3), das synthetisiert wird, wird mit AflIII verdaut, um den Genotyp zu bestimmen. Das Symbol "*" markiert den Beginn der 852 bp-3' -UTR-kodierenden Sequenz (Fig. 2) und die Zahlen auf der rechten Seite der Sequenz geben die Basennummer für die 852 bp- 3' -UTR-kodierende Sequenz an. Das Symbol "++++++" zeigt die Lage der konstitutiven AflIII-Stelle an, während das Symbol "******" die Lage der polymorphen Stelle anzeigt. Eine Spaltung durch AflI II geht verloren, wenn die Stelle ATGTGT ist. Der C zu T- Polymorphismus tritt bei Position 729 in der 852 bp-UTR (Fig. 2) und Position 1205 in dieser Sequenz (Fig. 3) auf. Ebenfalls in dieser Figur gezeigt sind der P3'-Vorwärts-Primer (SEQ ID NO: 25) und der P4'-Rückwärts-Primer (SEQ ID NO: 26), die verwendet werden, um die 442 bp-Sonde, die in Southern-Blotting-Experimenten, wie in Beispiel 1 beschrieben, verwendet wird, zu synthetisieren.
- Fig. 4 veranschaulicht die diagnostischen Restriktionsfragmentlängenpolymorphismusanalyse (RFLP)-Muster, die mit dem PCR-Assay, wie in Fig. 3 beschrieben, erhalten wurden. Die veranschaulichten Genotypen sind, wie folgt: 1-C/C; 2-C/T; 3-T/T. Die Größen der beobachteten Fragmente sind auf der linken Seite der Figur gezeigt. Das 671 bp-Fragment ist allen Genotypen gemein. Das für die 566 bp- und 442 bp-Fragmente gezeigte Muster wird auch mit genomischen Southern-Blots, die die 442 bp-Sonde einsetzen, beobachtet.
- Basierend auf den Häufigkeiten der C/C-, C/T- und T/T-Keimbahn- Genotypen an Position 729 (wie in Fig. 2 der Anmeldung definiert) in der Prohibitin 3'-UTR unter Kontrollen und Brustkrebsfällen ist ein einfacher Test entwickelt worden, um die Suszeptibilität der Wahrscheinlichkeit, dass ein Individuum während seiner Lebenszeit Brustkrebs entwickelt, zu bestimmen. Angesichts der Tatsache, dass die insgesamte Wahrscheinlichkeit, dass eine Frau Brustkrebs entwickelt, in den Vereinigten Staaten 12,5% beträgt, wurde das Bayes-Theorem auf die Genotyp-Häufigkeiten, die bei 72 Brustkrebspatienten und 92 nicht erkrankten Frauen bestimmt wurden (Tabelle 1), angewendet und die resultierende Wahrscheinlichkeit, dass eine Frau mit einem bestimmten Genotyp im Verlauf ihres Lebens Brustkrebs entwickeln wird {Wahrscheinlichkeit = [(Häufigkeit von Brustkrebspatienten mit einem gegebenen Genotyp) x (insgesamte Wahrscheinlichkeit, dass eine Frau Brustkrebs entwickelt, d. h. 0,125)]. [Häufigkeit von nicht erkrankten Frauen mit einem gegebenen Genotyp] · 100}, ist, wie folgt: C/C, 10%; C/T, 17%; und T/T, ungefähr 50%. Obwohl die berechneten Prozentsätze abhängig von der Größe der zur Stichprobenerhebung herangezogenen Population variieren können, wird erwartet, dass die offenbarten Prozentsätze einen nützlichen Anhaltspunkt hinsichtlich des Risikos bereitstellen werden.
- Um die Wahrscheinlichkeit, dass eine Frau Brustkrebs entwickelt, zu bestimmen, ist nur eine Bestimmung des Prohibitin-Keimbahn- Genotyps der Frau hinsichtlich Position 729 der 3'-UTR erforderlich; d. h., ob die Frau an Position 729 homozygot Thymin (T/T) oder homozygot Cytosin (C/C) oder heterozygot (C/T) ist. Um den Genotyp eines Individuums an Position 729 zu bestimmen, kann genomische DNA aus einer großen Vielzahl von Patientenproben unter Einsatz von Standardtechniken isoliert werden. Vorzugsweise wird die genomische DNA entweder aus Blut oder Bukkalzellabstrichen, wie in Beispiel 1 beschrieben, isoliert. Nach der Präparation von genomischer DNA, kann die Region, die die Base 729 der Prohibitin-3'-UTR enthält, amplifiziert werden oder die genomische DNA kann direkt verdaut werden (Beispiel 1). Wie die Präparation von genomischer DNA kann auch dies durch eine große Vielzahl von Standardtechniken erfolgen. Vorzugsweise wird diese Region durch Polymerasekettenreaktion ("PCR")-Techniken, wie in Beispiel 1 beschrieben, amplifiziert.
- Vorzugsweise wird nach einer PCR-Amplifizierung eine Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus ("RFLP")-Analyse, wie in Beispiel 1 beschrieben, ausgeführt. Diese Analyse basiert auf der Tatsache, dass die Substitution eines C durch ein T an Position 729 in der 3'-UTR zu dem Verlust von Spaltbarkeit durch die Restriktionsendonuklease AflIII an deren sechs Basen umfassenden Erkennungssequenz, die Position 729 überspannt, führt.
- Alternativ könnte die mittels PCR amplifizierte Sequenz an Position 729 durch ein jegliches anderes Mittel zum Unterscheiden von Sequenzvarianten, wie durch direkte Sequenzierung unter Verwendung des AmpliCycleTM PCR-Kits (Perkin Elmer) oder Southern-Blotting, bestimmt werden.
- Die Wahrscheinlichkeit, dass ein bestimmter Genotyp zu Brustkrebs führt, ist wie zuvor angegeben. Für jene, die hinsichtlich des C-Allels an Position 729 homozygot sind (C/C), beträgt die Wahrscheinlichkeit, Brustkrebs zu entwickeln, 10%, für jene, die heterozygot (C/T) sind, beträgt die Wahrscheinlichkeit 17% und für jene, die hinsichtlich des T-Allels homozygot sind (T/T), beträgt die Wahrscheinlichkeit, dass eine Frau während ihrer Lebenszeit Brustkrebs entwickelt, ungefähr 50%. Diese Wahrscheinlichkeiten basieren auf den Prohibitin-Keimbahn-Genotypen von 92 Kontrollfrauen und 72 Brustkrebsfällen, wie in Tabelle 1 gezeigt.
- In der Lage zu sein, den Genotyp einer Frau hinsichtlich Position 729 genau zu bestimmen, dient einer ganzen Reihe von nützlichen Zwecken. Zuerst und am wichtigsten, wie bereits oben beschrieben, stellt dies ein Mittel bereit, durch welches die Wahrscheinlichkeit, dass eine Frau während ihrer Lebenszeit Brustkrebs entwickelt, bestimmt werden kann. Für jene, bei denen diagnostiziert wird, dass bei ihnen ein erhöhtes Risiko besteht, kann ein verstärktes Bewusstsein des erhöhten Risikos in Verbindung mit häufigeren Untersuchungen zu einer früheren Feststellung der Krebserkrankung und einer erhöhten Überlebenschance führen. Dies würde besonders nützlich sein für die Neugeborenen bis zu jenen im Alter von 40, die im allgemeinen noch nicht hinsichtlich der Entwicklung von Brustkrebs gescreent werden.
- Der Assay könnte auch im Rahmen einer genetischen Beratung verwendet werden. Wenn beide Eltern homozygot hinsichtlich des T-Allels sind, beträgt die Wahrscheinlichkeit, ein Kind mit dem T/T-Genotyp zu bekommen, 100%. Im Gegensatz dazu beträgt, wenn beide Eltern homozygot hinsichtlich des C-Allels sind, die Wahrscheinlichkeit, ein Kind mit dem T/T-Genotyp zu bekommen, 0%. Wenn nur ein Elternteil hinsichtlich des T-Allels homozygot ist oder wenn ein oder beide Elternteile an Position 729 heterozygot (C/T) sind, liegt die Wahrscheinlichkeit, ein Kind mit dem T/T- Genotyp zu bekommen, irgendwo zwischen diesen zwei Extremen und kann gemäß der klassischen Mendel-Genetik bestimmt werden.
- Abhängig von ihren Genotypen könnten die Eltern eines Kindes dann den Genotyp des Kindes als Neugeborenes oder sogar pränatal bestimmen. Diese Information könnte dann, wie oben beschrieben, verwendet werden, um einen optimalen Untersuchungsplan aufzustellen, um eine frühzeitige Feststellung und Behandlung sicherzustellen.
- Dieser Assay könnte auch für die Brustkrebsprognose, die Vorhersage eines erkrankungsfreien Intervalls, des Langzeit- Überlebens und die Festlegung der Therapie sowohl für Frauen als auch Männer verwendet werden.
- Bestimmung des Prohibitin-Polymorphismus an UTR-729 Eine sorgfältige Mutationsanalyse wurde zuerst an sieben individuellen Patienten, bei denen sämtliche analysierten Tumore durch Histopathologie als invasive duktale Karzinome diagnostiziert wurden, vorgenommen. Um eine Kreuzkontamination zu vermeiden, erfolgten diese Analysen an Tumorgewebe und normalem angrenzendem Gewebe, die separat durch Mikrodissektion aus mittels Hämatoxylin und Eosin (H&E) angefärbten Schnitten isoliert wurden. Unsere unveröffentlichten Untersuchungen der Prohibitin-3'-UTR in Brustkrebszelllinien und anderen Krebszelllinien zeigten, dass die letzten 200 Basen die antiproliferative Aktivität von Prohibitin enthielten und auch die am stärksten mutierten waren. Folglich wurden nur die letzten 140 bp der 3'- UTR untersucht. PCR-Amplifizierungsprodukte wurden in den TA- Klonierungsvektor kloniert und von jedem Patienteh wurden mindestens zwei Klone aus dem Tumor und zwei Klone aus normalem angrenzendem Gewebe sequenziert. Fig. 1A und 1B zeigen eine auf Sequenzähnlichkeiten beruhende gegenseitige Ausrichtung ("alignment") dieser sieben Tumorsequenzen [TN-56(T), SEQ ID NO: 2; TN- 78(T), SEQ ID NO: 4; TN-50(T), SEQ ID NO: 6; TN-1(T), SEQ ID NO: 9; TN-3(T), SEQ ID NO: 11; TN-31(T), SEQ ID NO: 13; und TN-94(T), SEQ ID NO: 5] und von angrenzendem normalem Gewebe [TN-56(N), SEQ ID N0 : 3; TN-78(N), SEQ ID NO: 5; TN-50(N), SEQ ID NO: 7; TN-1(N), SEQ ID NO: 10; TN-3(N), SEQ ID NO: 12; TN-31(N), SEQ ID NO: 14; und TN- 94(N), SEQ ID NO: 16] verglichen mit der Sequenz der Prohibitin- Wildtyp-3' -UTR (WT) (SEQ ID NO: 1) und der stark mutierten Sequenz der Brustkrebszelllinie SK-BR-3 (SEQ ID NO: 8) in einer 140 bp- Region nahe dem 3' -Ende der Prohibitin-Wildtyp 3' -UTR (SEQ ID NO: 17).
- Die am häufigsten und einzig konsistent veränderte Stelle war das Cytosin (C) an Position 729, das in sämtlichen Tumoren zu einem Thymin (T) verändert war. Die 3'-UTR-Sequenzen aus dem angrenzenden normalen Gewebe aus jedem der Patienten sind in Fig. 1A und 1B ebenfalls direkt unterhalb der Tumorsequenzen gezeigt. Diese Analyse zeigte, dass das gesamte normale Gewebe Wildtyp war mit der Ausnahme, dass es Heterozygotie an Position 729 der 3' - UTR zeigte.
- Die Feststellung, dass sieben von sieben normalen Gewebeproben angrenzend an Brusttumore Heterozygotie (C/T) an Position 729 in der Prohibitin-3'-UTR zeigten, war unerwartet, da vor diesem Zeitpunkt in normalem Gewebe oder von normalem Gewebe abgeleiteten Zellinien an dieser Position nur "C" gefunden worden war.
- Weitere Untersuchungen wurden dann ausgeführt, um zu bestimmen, ob das T eine " Initiator" -Mutation war, die, zumindest teilweise, für die Entwicklung des Tumors verantwortlich ist, aber auch in histologisch normalem angrenzendem Gewebe gefunden wird, was einen klonalen oder Feldeffekt anzeigt, oder ob das T eine allelische Keimbahnvariante (Polymorphismus), die in der normalen Bevölkerung vorhanden ist, darstellt. Um zwischen den zwei Möglichkeiten zu unterscheiden, wurden Tests ausgeführt, um zu bestimmen, ob es Thymine an Position 729 in Keimbahngewebe weit entfernt von dem Tumor bei Brustkrebspatienten und bei Kontrollindividuen gab. D. h., die Häufigkeit von T gegenüber C an Position 729 der 3'-UTR (UTR-729) wurde in Gewebe, das den Keimbahngenotyp repräsentierte, (Blutprobe und/oder Bukkalzellabstriche) aus diesen zwei Gruppen bestimmt.
- Die Region, die UTR-729 enthält, wird durch das Restriktionsenzym AflIII gespalten, wenn in der Wildtypsequenz Cytosin (C) vorhanden ist. Diese Schnittstelle geht verloren, wenn ein Thymin (T) vorhanden ist. Eine Sequenzierung ausgehend von Patientenproben identifizierte nur diese einzelne Veränderung innerhalb der AflIII-Erkennungsstelle (Fig. 1A und 1B). In einer AflIII- RFLP-Analyse waren 70% von 92 gesunden weiblichen Freiwilligen homozygot C/C, 29% waren heterozygot C/T und 1, 1% waren homozygot T/T (Tabelle 1). Dies steht im Gegensatz zu 72 Brustkrebspatienten, wo 4% T/T waren, 39% C/T waren und 57% C/C waren (xz = 3,672 und p < 0,159). Unter der Annahme, dass die Daten in Tabelle 1 genau die Genotyp-Häufigkeiten von Fällen und Kontrollen in der allgemeinen Bevölkerung reflektieren und dass das Brustkrebsrisiko über die gesamte Lebenszeit hinweg 12,5% beträgt, kann Bayes Theorem (Fleiss, J., Statistical Hethods for Rates and Proportions, 2. Auflage, John Wiley & Sons, New York, 1981, S. 1-17) verwendet werden, um die Wahrscheinlichkeit zu berechnen, dass eine Frau mit einem bestimmten Genotyp im Verlauf ihres Lebens Brustkrebs entwickeln wird. Diese Wahrscheinlichkeiten sind: 10% für C/C, 17% für C/T und ungefähr 50% für T/T. Darüber hinaus können, wenn 4% aller Brustkrebsfälle T/T sind, dann 4% der Frauen, die zu irgendeinem Zeitpunkt Brustkrebs bekommen werden, durch diesen einfachen Test identifiziert werden. Tabelle 1. Genotyp- und Allel-Häufigkeiten von 3'-UTR-Varianten bei Kontrollen und Brustkrebsfällen
- Das mittlere Alter ± Standardabweichung für die Kontrollen und die Krankheitsfälle betrugen 40 ± 12,9 bzw. 55 ± 11,5 Jahre. Die Hauptzahl der Krankheitsfälle und Kontrollen (95%) sind kaukasische Frauen, die in Oklahoma leben. Das potentielle relative Brustkrebsrisiko wurde auch hinsichtlich des Unterschiedsverhältnisses (" odds ratio"; OR) bestimmt. Das Unterschiedsverhältnis für Personen mit C/T und Personen mit T/T zusammen, d. h. T- Träger, wurde als ORT = [(Anzahl von Brustkrebspatienten mit C/T + Anzahl von Brustkrebspatienten mit T/T). (Anzahl von Brustkrebspatienten mit C/C)] ÷ [(Anzahl von nicht erkrankten Personen mit C/T + Anzahl von nicht erkrankten Personen mit T/T) ÷ (Anzahl von nicht erkrankten Personen mit C/C)] berechnet. Das Unterschiedsverhältnis für Individuen mit T/T, d. h. die homozygot T/T sind, wurde als ORT/T = [(Anzahl von Brustkrebspatienten mit T/T) (Anzahl von Brustkrebspatienten mit C/C + Anzahl von Brustkrebspatienten mit C/T)] ÷ [(Anzahl von nicht erkrankten Personen mit T/T) ÷ (Anzahl von nicht erkrankten Personen mit C/C + Anzahl von nicht erkrankten Personen mit C/T)] berechnet. Das nach Kombinieren von Personen, die entweder C/T oder T/T trugen, berechnete Unterschiedsverhältnis ist ungefähr 1,7. Wenn T/T separat mit C/T und C/C kombiniert berücksichtigt wird, beträgt das Unterschiedsverhältnis ungefähr 4,0. Obwohl die berechneten Unterschiedsverhältnisse abhängig von der Größe der für die Stichprobenerhebung herangezogenen Population variieren können, wird wieder erwartet, dass die offenbarten Verhältnisse einen nützlichen Anhaltspunkt hinsichtlich des Risikos bereitstellen werden.
- In den Vereinigten Staaten hat eine Frau ein 1 von 8-Risiko (12,5%), während ihres Lebens Brustkrebs zu entwickeln und ein 1 von 28-Risiko (3,6%) an der Krankheit zu sterben [Boring et al., "Cancer statistics", CA Cancer J Clin 44 : 7-26 (1994)]. Ungefähr 10% aller Brustkrebserkrankungen werden gegenwärtig als familiär gehäuft auftretend klassifiziert und viele von diesen scheinen durch Keimbahnmutationen in dem BRCA1-Gen auf Chromosom 17q21 (Hall et al., "Linkage of early onset familial breast cancer to chromosome 17q21", Science 250 : 1684-1689 (1990) oder dem BRCA2-Gen auf Chromosom 13q12-13 (Wooster et al., "Localization of a breast cancer susceptibility gene, BRCA2, to chromosome 13q12-13", Science 265: 2088-2090 (1994)) verursacht zu werden. Jedoch wird die große Mehrzahl von Brustkrebserkrankungen als sporadisch angesehen. Es wurde ursprünglich angenommen, dass viele dieser sporadischen Krebserkrankungen ebenfalls durch somatische Mutationen in Genen für familiär gehäuft auftretende Krebserkrankungen verursacht würden. Es hat sich erwiesen, dass dies nicht der Fall ist. Wenige, wenn überhaupt irgendwelche, somatische Mutationen von BRCA1 sind bei sporadischen Brusttumoren gefunden worden (Merajver et al., "Somatic mutations in the BRCA1 gene in sporadic ovarian tumours", Nat Genet 9: 439-443 (1995), Hosking et al., "A somatic BRCA1 mutation in an ovarian tumour", Nat Genet 9: 343-344 (1995); und Futreal et al., "BRCA1 mutations in primary breast and ovarian carcinomas", Science 266 : 120-122 (1994)). In anderen Studien wiesen nur einer von 70 (Lancaster et al., " BRCA2 mutations in primary breast and ovarian cancers", Nat Genet 13: 238-240 (1996)) und einer von 100 Brustkrebspatienten somatische Mutationen in BRCA2 auf (Miki et al., "Mutation analysis in the BRCA2 gene in primary breast cancers", Nat Genet 13: 245-247 (1996), Teng et al., "Low incidence of BRCA2 mutations in breast carcinoma and other cancers", Nat Genet 13: 241-244 (1996)). Folglich scheinen Mutationen an diesen Genorten bei der Mehrzahl von sporadischen Brustkrebserkrankungen nicht von Bedeutung zu sein.
- Tabelle 1 legt nahe, dass bei Frauen, die sogar ein einzelnes Prohibitin-Keimbahnallel mit dem 729-T-Polymorphismus tragen, ein ungefähr 2,0-fach erhöhtes Risiko für Brustkrebs im Vergleich zu jenen, die homozygot hinsichtlich 729-C sind (17% gegenüber 10%), besteht. Darüber hinaus sagt Bayes Theorem voraus, dass bei Frauen, die hinsichtlich 729-T homozygot sind, ein 50%-iges Risiko besteht, im Verlauf ihres Lebens Brustkrebs zu entwickeln. Wenn die Daten in Tabelle 1 für alle Brustkrebserkankungen repräsentativ sind, dann werden sich ungefähr 4% der Brustkrebsfälle bei T/T-Frauen entwickeln, sogar obwohl sie weniger als 1% der gesamten Bevölkerung ausmachen. Dementsprechend wird ein Screenen von Frauen in der allgemeinen Bevölkerung hinsichtlich dieses Polymorphismus die Identifizierung von bis zu 1% aller Frauen mit einem signifikant höheren als durchschnittlichen Risiko, zu irgendeinem Zeitpunkt Brustkrebs zu bekommen, ermöglichen. In ähnlicher Weise können Frauen, die homozygot C/C sind (70% der gesamten Bevölkerung) dahingehend beraten werden, dass ihre Wahrscheinlichkeit, im Verlauf ihres Lebens Brustkrebs zu entwickeln, ungefähr 10% beträgt oder nur geringfügig unter dem durchschnittlichen Risiko liegt. Darüber hinaus wird der 729- T-Polymorphismus vererbt, was nahelegt, dass eine substantielle Untergruppe von Brustkrebserkrankungen, die zuvor als sporadisch angesehen worden ist, (d. h. jene, die sich bei C/T- und T/T- Frauen oder insgesamt 43% entwickeln) eine Vererbungskomponente aufweist. Ausgehend von den relativen Anteilen von C/C-, C/T- und T/T-Individuen in der allgemeinen Bevölkerung (Tabelle 1) kann angenommen werden, dass die meisten homozygoten T/T-Frauen heterozygote C/T-Eltern haben. In diesem Fall beträgt die Wahrscheinlichkeit einer T/T-Frau mit Brustkrebs, einen Nachkommen zu bekommen, der ebenfalls T/T ist, 1 von 4. Dies genau das Risiko, Brustkrebs zu entwickeln, für Frauen, die Verwandte ersten Grades mit der Krankheit haben (Boring et al., CA Cancer J Clin 44: 7-26 (1994)).
- Nachfolgend wird der diagnostische Assay zum Bestimmen der Suszeptibilität für Brustkrebs, der auf der Sequenz der 3'-UTR des Prohibitin-Gens basiert, beschrieben.
- Blutproben (ungefähr 10 ml) wurden durch routinemäßige Venenpunktion in Röhrchen, die Antikoagulans enthielten, gesammelt.
- Bukkalzellabstriche wurden unter Verwendung von sterilen Zytologiebürsten (Typ H - Histobrush, 174-600; Spectrum Laboratories, Dallas, TX) gesammelt. Der Studienteilnehmer wurde dahingehend instruiert, die Bürste auf der inneren Wange auf jeder Seite 30 Sekunden schnell zu drehen. Dann wurde die Bürste in ein steriles Sammelröhrchen eingeführt, dicht verschlossen und vor der DNA-Matrizen-Präparation bei 4ºC gelagert.
- Die DNA aus Blutproben wurde unter Verwendung des PureGene Kit (Gentra, Minneapolis, MN) präpariert.
- Die DNA aus Bukkalzellabstrichen wurde unter Verwendung einer Methode isoliert, die von Horrigan et al., "Polymerase chain reaction-based diagnosis of Del (5q) in acute myeloid leukemia and myelodysplastic syndrome identifies a minimal deletion interval", Blood 88 : 2665-2670 (1996), die eine Modifizierung einer Methode, die ursprünglich von Richards et al., "Multiplex PCR amplification from the CFTR gene using DNA prepared from buccal brushes/swabs", Hum Mol Genet 2: 159-160 (1993) veröffentlicht wurde, ist, beschrieben wurde. Die Zytologiebürste wurde in ein 1,5 ml-Röhrchen, das 0,6 ml 50 mM sterile NaOH enthielt, transferiert. Der Griff der Bürste wurde abgeschnitten und der Deckel wurde verschlossen. Nach Vortexen für 30 Sekunden wurde die Probe 5 min auf 95ºC erwärmt. Das Röhrchen wurde erneut gevortext und man ließ die Bürste abtropfen, um restliche Flüssigkeit vor dem Entfernen aus dem Röhrchen rückzugewinnen. Die Lösung wurde durch Hinzufügen von 0,06 ml 1 mM Tris, pH = 8,0, neutralisiert. Nach sorgfältigem Mischen wurde die Probe bei -20ºC gelagert. Der Assay kann auch an DNA mit hoher relativer Molekülmasse, die aus Haut, Haarfollikeln und praktisch einer jeglichen anderen Gewebequelle wie auch aus Fibroblasten- oder Lymphoblastenzelllinien gereinigt worden ist, ausgeführt werden. In diesem Falle kann die DNA unter Verwendung des PureGene-Kit (Gentra, Minneapolis, MN) oder einer jeglichen anderen Methode gemäß den Anweisungen des Herstellers präpariert werden.
- PCR-Reaktionen wurden an 0,1 ug genomischer, aus Blut gereinigter DNA oder 0,010 ml Bukkalabstrichextrakt unter Verwendung von Taq Gold-Polymerase (Perkin Elmer, Foster City, CA) ausgeführt. Die eingesetzten Reaktionsbedingungen waren, wie folgt: 10 mM Tris- HCl, pH = 8,0, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl, jeweils 100-200 uM von dATP, dGTP, dTTP und dCTP, 0,1% Triton X-100, 0,5 bis 1,0 Einheiten Taq Gold-Polymerase und 100 ng von jedem Primer in einer 50 ul Reaktionsmischung.
- In einer Form des Assay, wie in Fig. 2 und SEQ ID NO: 17 veranschaulicht, wird eine 852 bp-3'-UTR, die mit den Primern 5' - CCCAGAAATCACTGTG-3' (Primer P1, sense) (SEQ ID NO: 20) und Primer P2 (SEQ ID NO: 19) synthetisiert worden ist, mittels eines Gels gereinigt und ein sekundäres PCR-Produkt wird unter Verwendung der Primer 5'-TGAGTCCTGTTGAAGACTTCC-3' (Primer P3, sense) (SEQ ID NO: 18) und 5'-GGAAGGTCTGGGTGTCATTT-3' (Primer P2, antisense) (SEQ ID NO: 19) synthetisiert.
- Die PCR-Produkte wurden mit dem Restriktionsenzym AflIII unter Verwendung des Puffers und der Bedingungen, die von dem Hersteller (New England Biolabs, Cambridge, MA) empfohlen wurden, verdaut. Alle Verdaue für eine Gruppe von individuellen Proben wurden unter Verwendung einer verdünnten Mastermischung ausgeführt. Kontrollen mit bestätigter Sequenz wurden in jede Reihe von Verdauen aufgenommen. Die Verdauungsprodukte wurden durch Elektrophorese auf 20%-igen Acrylamidgelen aufgetrennt, mit Ethidiumbromid angefärbt und durch ultraviolettes Licht sichtbar gemacht.
- Alternativ wurden unter Verwendung des PureGene-Kits gereinigte DNAs mit hoher relativer Molekülmase auf Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen durch Southern-Blotting analysiert. Im allgemeinen wurden 10-15 ug DNA mit dem Restriktionsenzym AflIII (New England Biolabs) bei 37ºC 16 h unter Verwendung des vom Hersteller gelieferten Puffers verdaut. Die Verdaue wurden beendet, indem die DNA durch Hinzufügen von 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat und 2 Volumen absolutem Ethanol präzipitiert wurde. Nach Resuspendierung in Wasser und Hinzufügen von Beladungspuffer (Promega 6X) wurden die Proben in ein 1%-iges Agarosegel geladen und es wurde eine Elektrophorese ausgeführt, bis der Bromphenolblau-Beladungsfarbstoff das Ende des Gels erreichte. Gele wurden dann in 0,5 M NaOH/l, 5 M NaCl 30 min denaturiert, gefolgt von einer Neutralisierung in 0,5 M Tris/1,5 M NaCl (pH = 7,0). Dann wurde ein Southern-Blot durch Kapillartransfer auf Hybond-Membran (Amersham, Arlington Heights, IL) ausgeführt. Die DNA wurde an der Membran entweder durch Backen bei 80ºC oder Vernetzen mit ultraviolettem Licht fixiert.
- Der RFLP wurde durch Hybridisierung mit einem Nukleinsäurefragment, das die Prohibitin-3'-UTR enthielt, detektiert. Die routinemäßig verwendete Sonde war ein 442 bp-Nukleinsäurefragment, das unmittelbar 5' zu der polymorphen AflIII-Schnittstelle liegt. Es wurde durch PCR unter Verwendung eines Volllängen 3'- UTR-Klons als Matrize und der Primer P3' und P4' (Fig. 3) synthetisiert. Die Sonde wurde unter Verwendung eines "random primer labeling"-Kit (Pharmacia, Piscataway, NJ) markiert. Die Membranen wurden mindestens 12 h bei 65ºC hybridisiert und bei der gleichen Temperatur unter hoher Stringenz gewaschen. Der Filter wurde dann gegenüber Röntgenfilmen oder einem Phosphoimager-Schirm exponiert, um den RFLP für eine Interpretation abzubilden. Alternativ können ein 124 bp-Fragment 3' zu der polymorphen AflIII-Stelle wie auch das 566 bp-Fragment, synthetisiert mit P3' - und P2-Primern (Fig. 3), als Sonde verwendet werden. Eine jede dieser Sonden wird einen RFLP abbilden, der die unterschiedlichen Genotypen unterscheidet. Southern-Blots, die mit der 442 bp-Sonde hybridisiert wurden, bildeten das in Fig. 4 gezeigte 566 bp- und 442 bp-Bandenmuster ab.
- Die Substitution eines C durch ein T an Position 729 (Fig. 2) in der 3'-UTR führt zu dem Verlust der Spaltbarkeit durch AflIII an dessen sechs Basen-Erkennungssequenz. Unsere Analysen von mutierten Brusttumoren (7), Brustkrebszelllinien (3) und Bukkalzellabstrichen von hinsichtlich T homozygoten Brustkrebspatienten (7) zeigten, dass das C-gegen-T an 729 die einzige bislang nachgewiesene Veränderung in der Erkennungsstelle ist, die für einen Verlust eines Schnitts durch AflIII verantwortlich ist. Bei hinsichtlich C homozygoten Personen werden beide Allele an der polymorphen Stelle geschnitten, während Allele von hinsichtlich T homozygoten Personen nicht geschnitten werden. Heterozygote Personen haben ein Allel von jedem, C und T.
- Ein alternativer Assay wurde ausgeführt, wie in Beispiel 1 angegeben, mit der Ausnahme, dass das sekundäre PCR-Produkt unter Verwendung des Sense-Primers P4,5'-GGATGGACTTGTATAG-3' (SEQ ID NO: 21) und des Antisense-Primers 5'-GGAAGGTCTGGGTGTCATTT-3' (Primer P2, antisense) (SEQ ID NO: 19) synthetisiert wurde.
- Ein alternativer Assay wurde ausgeführt, wie in Beispiel 1 angegeben, mit der Ausnahme, dass, wie in der in Fig. 3 und SEQ ID NO: 22 angegebenen genomischen 1237 bp-Sequenz veranschaulicht, die eingesetzten Primer 5'-AAGGTGGCTTTCTGGTGAAG-3' (Primer P1' sense) (SEQ ID NO: 2 3) und 5' -GGAAGGTCTGGGTGTCATTT-3' (Primer P2, antisense) (SEQ ID NO: 19) waren. In diesem Assay unter Verwendung von SEQ ID NO: 22 entspricht die Base an Position 1205 der Position 729 in SEQ ID NO: 17.
- Fig. 4 veranschaulicht das Muster von Banden, die in diesem Assay für jeden Genotyp erzeugt wurden. Unter Verwendung des Sense- Primers SEQ ID NO: 23 und des Antisense-Primers SEQ ID NO: 19 zeigt das RFLP-Muster für ein hinsichtlich C homozygotes Individuum (C/C), dass für beide DNA-Stränge die 566 bp, gemessen von der konstitutiven AflIII-Stelle bis zu dem Ende der 3'-UTR, an Position 729/1205 in zwei unterschiedliche Banden von 442 bp und 124 bp gespalten wurden. Ein hinsichtlich T homozygotes Individuum (T/T) produzierte eine Bande von 566 bp, gemessen von der konstitutiven AflIII-Stelle bis zu dem Ende der 3'-UTR, die auf beiden DNA-Strängen an Position 729/1205 nicht geschnitten war. Das heterozygote Individuum (C/T) lieferte drei unterschiedliche Banden, was zeigt, dass für einen DNA-Strang die 566 bp, gemessen von der konstitutiven AflIII-Stelle bis zu dem Ende der 3'-UTR, an Position 729/1205 in zwei unterschiedliche Banden von 442 bp und 124 bp geschnitten wurden und für den anderen DNA-Strang eine Bande von 566 bp, gemessen von der konstitutiven AflIII-Stelle bis zu dem Ende der 3'-UTR, an Position 729/1205 nicht geschnitten wurde. In diesem Assay ist eine bei allen Genotypen vorkommende Bande das 671 bp-Fragment, gemessen von dem 5'-Ende des PCR-Produkts bis zu der konstitutiven Schnittstelle.
- Diese Methode ist ein Einschrittverfahren, das 100%-ige Korrelation mit Southern-Blot-Ergebnissen zeigt.
- Der Wert dieses Assay für eine Vorhersage umfaßt eine Bestimmung des Keimbahn-Genotyps eines Individuums an Position 729 in der Prohibitin-3'-UTR. Es gibt viele potentielle spezifische Methoden, die eingesetzt werden können, um diese Aufgabe zu bewerkstelligen. Wir haben primär den in Beispiel 1 beschriebenen RFLP und eine DNA-Sequenzierung verwendet, um unsere Daten zu sammeln. Jedoch könnten jegliche anderen Methoden, basierend auf Einzelbasen-Oligonukleotid-Fehlpaarungs-Screening (Jupe, E. R., und Zimmer, E. A., nAssaying differential ribosomal RNA gene expression with allele-specific oligonucleotide probes", in Methods in Enzymology - Molecular Evolution: Producing the Biochemical Data, Academic Press, S. 541-552, 1993), Allelspezifischer PCR-Amplifizierung (Allen et al., Biorechniques 19: 454 (1995); Ault, G., J Virological Methods 46: 145-156 (1994); Tada, M., Cancer Research 53: 2472-2474 (1993); Huang, Nucleic Acids Research 20: 4567-4573 (1992), Sommer, BioTechniques 12: 82- 87 (1992); und Kwok, Nucleic Acids Research 18: 999-1005 (1990)), oder eine Methode, die eine thermostabile Ligase hoher Spezifität (Ampligase, Epicenter Technologies) einsetzt, für einen Nachweis des Polymorphismus angewendet werden. Zusätzlich könnte eine jegliche Methode, die gegenwärtig in Verwendung ist, wie Einzelstrangkonformationspolymorphismen oder denaturierende Gradientengelelektrophorese, oder eine jegliche Methode, die in der Zukunft entwickelt wird, um Einzelbasenveränderungen nachzuweisen, ebenfalls auf den Nachweis dieser Genotypen angewendet werden. Dieser Test könnte auch ausgehend von RNA ausgeführt werden. In diesem Falle würde die RNA direkt durch Sequenzierung analysiert werden oder in cDNA unter Verwendung von reverser Transkriptase (Castles et al., BioTechniques 21: 425-428 (1996) umgewandelt werden, gefolgt von PCR und einer jeglicheh Methode, die in der Lage ist, Einzelbasenveränderungen nachzuweisen.
- Der C/T-Polymorphismus an Position 729 in der Prohibitin-3'-UTR ist auch für die Diagnose der Suszeptibilität für Brustkrebs bei Männern nützlich.
- Ein Abschnitt von aus einem männlichen Patienten, bei dem ein Brustkrebs diagnostiziert worden war, isolierter genomischer DNA wurde gemäß dem in Beispiel 3 angegebenen Assay untersucht. Der Genotyp des Patienten wurde als T/T identifiziert, was einem erhöhten Risiko für Brustkrebs entspricht.
- (1) ALLGEMEINE INFORMATION:
- (i) ANMELDER:
- (A) NAME: OKLAHOMA MEDICAL RESEARCH FOUNDATION
- (B) STRASSE: 800 Research Parkway, Suite 100
- (C) ORT: Oklahoma City
- (D) STAAT: Oklahoma
- (E) LAND: Vereinigte Staaten von Amerika
- (F) POSTLEITZAHL: 73104
- (G) TELEPHON: (405) 271-7290
- (H) TELEFAX: (405) 271-8568
- (I) TELEX:
- (i) ANMELDER:
- (A) NAME: Jupe, Eldon R.
- (B) STRASSE: 2105 Harbor Drive
- (C) ORT: Norman
- (D) STAAT: Oklahoma
- (E) LAND: Vereinigte Staaten von Amerika
- (F) POSTLEITZAHL: 73071
- (G) TELEPHON: (405) 271-7290
- (H) TELEFAX: (405) 271-8568
- (I) TELEX:
- (i) ANMELDER:
- (A) NAME: Thompson, Linda R.
- (B) STRASSE: 1619 Westminster Place
- (C) ORT: Oklahoma City
- (D) STAAT: Oklahoma
- (E) LAND: Vereinigte Staaten von Amerika
- (F) POSTLEITZAHL: 73120
- (G) TELEPHON: (405) 271-7905
- (H) TELEFAX: (405) 271-8568
- (I) TELEX:
- (i) ANMELDER:
- (A) NAME: Resta, Regina (NMI)
- (B) STRASSE: 506 E. Sunnybrook Drive
- (C) ORT: Edmond
- (D) STAAT: Oklahoma
- (E) LAND: Vereinigte Staaten von Amerika
- (F) POSTLEITZAHL: 73034
- (G) TELEPHON: (405) 271-2894
- (H) TELEFAX: (405) 271-8568
- (I) TELEX:
- (i) ANMELDER:
- (A) NAME: Dell'Orco, Robert T.
- (B) STRASSE: 8030 Needwood, Apt. 101
- (C) ORT: Derwood
- (D) STAAT: Maryland
- (E) LAND: Vereinigte Staaten von Amerika
- (F) POSTLEITZAHL: 20855
- (G) TELEPHON: (301) 496-0477
- (H) TELEFAX: (301) 402-2117
- (I)
- (ii) TITEL DER ERFINDUNG: TEST ZUR DIAGNOSE EINES ERHÖHTEN BRUSTKREBS-RISIKOS
- (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 25
- (iv) KORRESPONDENZADRESSE:
- (A) ADRESSAT: SIDLEY & AUSTIN
- (B) STRASSE: 1201 Elm Street, Suite 4500
- (C) ORT: Dallas
- (D) STAAT: Texas
- (E) LAND: Vereinigte Staaten von Amerika
- (F) POSTLEITZAHL: 75270-2197
- (v) COMPUTER-LESBARE FORM:
- (A) DATENTRÄGER: Floppy disk
- (B) COMPUTER: IBM PC compatible
- (C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
- (D) SOFTWARE: PatentIn Release 111.0, Version 41.30
- (vi) DERZEITIGE ANMELDEDATEN:
- (A) ANMELDE NR:
- (B) ANMELDETAG:
- (C) KLASSIFIZIERUNG:
- (viii) INFORMATIONEN ZUM ANWALT:
- (A) NAME: Hansen, Eugenia S.
- (B) REGISTERNUMMER: 31,966
- (C) REFERENZ/AKTENZEICHEN: 11146/08302
- (ix) KOMMUNIKATIONSDATEN:
- (A) TELEFONNR: (214) 981-3300
- (B) TELEFAXNR: (214) 981-3400
- (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 1:
- (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 14 Basenpaare
- (B) ART: Nukleinsäure
- (C) STRANGFORM: doppelsträngig
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ü) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
- (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
- (A) ORGANISMUS: Homo sapiens
- (ix) MERKMALE:
- (A) NAMEjSCHLÜSSEL: misc feature
- (B) LAGE: 1..140
- (C) ANDERE INFORMATION: /Anmerkung: "Wildtyp (WT)"
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
- (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 2:
- (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 140 Basenpaare
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- (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
- (A) ORGANISMUS: Homo sapiens
- (ix) MERKMALE:
- (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc feature
- (B) LAGE: 1..140
- (C) ANDERE INFORMATION: /Anmerkung: "TN-56 (Tumor)"
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
- (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 3:
- (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 140 Basenpaare
- (B) ART: Nukleinsäure
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- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ü) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
- (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
- (A) ORGANISMUS: Homo sapiens
- (ix) MERKMALE:
- (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc feature
- (B) LAGE: 1..140
- (C) ANDERE INFORMATION: /Anmerkung: "TN-56 (normal)"
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
- (2) INFORMATION 2U SEQ ID NO: 4:
- (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 140 Basenpaare
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- (ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
- (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
- (A) ORGANISMUS: Homo sapiens
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- (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc feature
- (B) LAGE: 1..140
- (C) ANDERE INFORMATION: /Anmerkung: "TN-78 (Tumor)"
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
- (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 5:
- (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 140 Basenpaare
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- (C) STRANGFORM: doppelsträngig
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- (ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
- (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
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- (C) ANDERE INFORMATION: /Anmerkung: "TN-78 (normal)"
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- (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 6:
- (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
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- (ü) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
- (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
- (A) ORGANISMUS: Homo sapiens
- (ix) MERKMALE:
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- (C) ANDERE INFORMATION: /Anmerkung: "TN-50 (Tumor)"
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: fi:
- (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 7:
- (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 140 Basenpaare
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- (C) STRANGFORM: doppelsträngig
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
- (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
- (A) ORGANISMUS: Homo sapiens
- (ix) MERKMALE:
- (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc feature
- (B) LAGE: 1..140
- (C) ANDERE INFORMATION: /Anmerkung: "TN-50 (normal)"
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:
- (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 8:
- (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 137 Basenpaare
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- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ü) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
- (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
- (A) ORGANISMUS: Homo sapiens
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:
- (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 9:
- (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 142 Basenpaare
- (B) ART: Nukleinsäure
- (C) STRANGFORM: doppelsträngig
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ü) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
- (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
- (A) ORGANISMUS: Homo sapiens
- (ix) MERKMALE:
- (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc feature
- (B) LAGE: 1..142
- (C) ANDERE INFORMATION: (Anmerkung: "TN-1 (Tumor)"
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:
- (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 10:
- (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 140 Basenpaare
- (B) ART: Nukleinsäure
- (C) STRANGFORM: doppelsträngig
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
- (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
- (A) ORGANISMUS: Homo sapiens
- (ix) MERKMALE:
- (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc feature
- (B) LAGE: 1..140
- (C) ANDERE INFORMATION: /Anmerkung: "TN-1 (normal)"
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:
- (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 11:
- (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 135 Basenpaare
- (B) ART: Nukleinsäure
- (C) STRANGFORM: doppelsträngig
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
- (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
- (A) ORGANISMUS: Homo sapiens
- (ix) MERKMALE:
- (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc feature
- (B) LAGE: 1..135
- (C) ANDERE INFORMATION: /Anmerkung: "TN-3 (Tumor)"
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11:
- (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 12:
- (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 140 Basenpaare
- (B) ART: Nukleinsäure
- (C) STRANGFORM: doppelsträngig
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
- (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
- (A) ORGANISMUS: Homo sapiens
- (ix) MERKMALE:
- (A) NAMEJSCHLÜSSEL: misc feature
- (B) LAGE: 1..140
- (C) ANDERE INFORMATION: /Anmerkung: "TN-3 (normal)"
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:
- (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 13:
- (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 137 Basenpaare
- (B) ART: Nukleinsäure
- (C) STRANGFORM: doppelsträngig
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ü) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
- (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
- (A) ORGANISMUS: Homo sapiens
- (ix) MERKMALE:
- (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc feature
- (B) LAGE: 1..137
- (C) ANDERE INFORMATION: /Anmerkung: "TN-31 (Tumor)"
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13:
- (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 14:
- (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 140 Basenpaare
- (B) ART: Nukleinsäure
- (C) STRANGFORM: doppelsträngig
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ü) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
- (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
- (A) ORGANISMUS: Homo sapiens
- (ix) MERKMALE:
- (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc featute
- (B) LAGE: 1..140
- (C) ANDERE INFORMATION: /Anmerkung: "TN-31 (normal)"
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14:
- (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 15:
- (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 140 Basenpaare
- (B) ART: Nukleinsäure
- (C) STRANGFORM: doppelsträngig
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
- (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
- (A) ORGANISMUS: Homo sapiens
- (ix) MERKMALE:
- (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc feature
- (B) LAGE: 1..140
- (C) ANDERE INFORMATION: /Anmerkung: "TN-94 (Tumor)"
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 15:
- (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 16:
- (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 140 Basenpaare
- (B) ART: Nukleinsäure
- (C) STRANGFORM: doppelsträngig
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
- (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
- (A) ORGANISMUS: Homo sapiens
- (ix) MERKMALE:
- (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc feature
- (B) LAGE: 1..140
- (C) ANDERE INFORMATION: /Anmerkung: "TN-94 (normal)"
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 16:
- (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 17:
- (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 852 Basenpaare
- (B) ART: Nukleinsäure
- (C) STRANGFORM: doppelsträngig
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
- (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
- (A) ORGANISMUS: Homo sapiens
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 17:
- (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 18:
- (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 21 Basenpaare
- (B) ART: Nukleinsäure
- (C) STRANGFORM: einzel
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ü) ART DES MOLEKÜLS: andere Nukleinsäure
- (A) BESCHREIBUNG: Jdesc = "DNA Primer"
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 18:
- (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 19:
- (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
- (B) ART: Nukleinsäure
- (C) STRANGFORM: einzel
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: andere Nukleinsäure
- (A) BESCHREIBUNG: /desc = "DNA Primer"
- (iv) ANTI-SENCE: JA
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 19:
- (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 20:
- (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 16 Basenpaare
- (B) ART: Nukleinsäure
- (C) STRANGFORM: einzel
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: andere Nukleinsäure
- (A) BESCHREIBUNG: /desc = "DNA Primer"
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 20:
- (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 21:
- (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 16 Basenpaare
- (B) ART: Nukleinsäure
- (C) STRANGFORM: einzel
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: andere Nukleinsäure
- (A) BESCHREIBUNG: /desc = "DNA Primer"
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 21:
- (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 22:
- (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 1328 Basenpaare
- (B) ART: Nukleinsäure
- (C) STRANGFORM: doppelsträngig
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ü) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
- (ix) MERKMALE:
- (A) NAME/SCHLÜSSEL: 5'Clip
- (B) LAGE: 1..477
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 22:
- (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 23:
- (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
- (B) ART: Nukleinsäure
- (C) STRANGFORM: einzel
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ü) ART DES MOLEKÜLS: andere Nukleinsäure
- (A) BESCHREIBUNG: Jdesc = "DNA Primer"
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 23:
- (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 24:
- (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 19 Basenpaare
- (B) ART: Nukleinsäure
- (C) STRANGFORM: einzel
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ü) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 24:
- (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 25:
- (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
- (B) ART: Nukleinsäure
- (C) STRANGFORM: einzel
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: andere Nukleinsäure
- (A) BESCHREIBUNG: /desc = "DNA Primer"
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 25:
Claims (42)
1. Verfahren zur Ermittlung des Risikos eines erblichen
Brustkrebses, bei dem man:
a) die Basenidentität eines Abschnitts einer genomischen
DNA aus einer Patienten-Zellprobe bestimmt, wobei die
genomische DNA ein Prohibitin-Gen umfasst, das eine 3'-
untranslatierte Region umfasst, wobei der Abschnitt der
wie in SEQ ID NO: 17 definierten Position 729 des
Prohibitin-Gens in der 3'-untranslatierten Region
entspricht, und man
b) diese Basenidentität mit Keimbahn-Polymorphismen
korreliert, die auf ein Risiko für erblichen Brustkrebs
schließen lassen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem man die Basenidentität
der Position 729 bestimmt, indem man einen Abschnitt dieses
Abschnittes der 3'-untranslatierten Region des Prohibitin-
Gens, der diese Position 729 enthält, sequenziert.
3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem man die Basenidentität
der Position 729 bestimmt, indem man die Basenpaarungen oder
Basenfehlpaarungen einzelner Basen zwischen dem Abschnitt
der 3'-untranslatierten Region und dem C-Allel Prohibitin
nachweist.
4. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem man die Basenidentität
der Position 729 bestimmt, indem man den Abschnitt der 3'-
untranslatierten Region des Prohibitin-Gens mit einer
Restriktionsendonuklease verdaut, die geeignet ist, die
Basenidentität der Position 729 zu bestimmen.
5. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem die
Restriktionsendonuklease Afl III ist und bei dem man bestimmt, dass eine
Schnittstelle, die von Afl III betroffen ist, vorhanden ist,
wenn die Position 729 Cytosin ist.
6. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem man ferner
a) den verdauten Abschnitt der DNA-Stränge der
3'-untranslatierten Region auftrennt, man
b) die aufgetrennten, verdauten DNA-Stränge der
3'-untranslatierten Region auf einer Membran fixiert, man
c) diese aufgetrennten, verdauten DNA-Stränge der
3'-untranslatierten Region mit mindestens einer markierten
Nukleinsäuresonde hybridisiert, wobei die markierte
Nukleinsäuresonde komplementär an die fixierten,
aufgetrennten, verdauten DNA-Stränge der 3'-untranslatierten
Region binden kann und man nachweisen kann, ob die
Spaltung an der Position 729 erfolgt ist, und bei dem
man
d) nachweist, ob die markierte Nukleinsäuresonde an die
fixierten, aufgetrennten, verdauten DNA-Stränge der 3'-
untranslatierten Region gebunden hat, wobei der Patient
einem Risiko für erblichen Brustkrebs unterliegt, wenn
die markierte Nukleinsäuresonde, die an die fixierten,
aufgetrennten, verdauten DNA-Stränge der
3'-untranslatierten Region gebunden ist, zeigt, dass die Spaltung
an der Position 729 nicht erfolgt ist.
7. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem man die Basenidentität
durch Untersuchung einer RNA-Fraktion der Patientenzellprobe
bestimmt, wobei die Identität der genomischen DNA an der
Position 729 bestimmt werden kann.
8. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem ein lebenslanges Risiko
zur Entwicklung von Brustkrebs größer als das der
unbetroffenen relevanten Population eingeschätzt wird, wenn die
Basenidentität an der Position 729 homozygot für Thymin ist.
9. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem ein lebenslanges Risiko
zur Entwicklung von Brustkrebs größer als das der
unbetroffenen relevanten Population aber geringer als das eines
Individuums eingeschätzt wird, das für Thymin homozygot ist,
wenn die Basenidentität an der Position 729 heterozygot
Cytosin/Thymin ist.
10. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem ein lebenslanges Risiko
zur Entwicklung von Brustkrebs geringer als das oder gleich
dem der unbetroffenen relevanten Population eingeschätzt
wird, wenn die Basenidentität an der Position 729 homozygot
Cytosin ist.
11. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Abschnitt der
genomischen DNA synthetisierte doppelsträngige genomische DNA
umfasst, die durch die Methodik der Polymerasekettenreaktion
erhalten ist, bei der man
a) einen Abschnitt doppelsträngiger genomischer DNA aus
einer Patientenzellprobe isoliert, wobei die genomische
DNA ein Prohibitin-Gen umfasst, das eine
3'-untranslatierte Region umfasst; man
b) die doppelsträngige genomische DNA in einer ersten
Reaktionszone in eine erste einzelsträngige genomische
DNA und eine zweite einzelsträngige genomische DNA
aufteilt; man
c) in dieser Reaktionszone einen Sense-Primer
bereitstellt, wobei diese Reaktionszone für die
Hybridisierung zwischen der ersten einzelsträngigen genomischen
DNA und dem Sense-Primer günstige Bedingungen besitzt;
man
d) in dieser Reaktionszone simultan einen Antisense-Primer
bereitstellt, wobei diese Reaktionszone für die
Hybridisierung zwischen der zweiten einzelsträngigen
genomischen DNA und dem Antisense-Primer günstige
Bedingungen besitzt; und man
e) mehrere Kopien des Abschnitts der doppelsträngigen
genomischen DNA durch die Methodik der
Polymerasekettenreaktion macht, um synthetisierte doppelsträngige
DNA zu bilden.
12. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem der Sense-Primer SEQ ID
NO: 18 umfasst.
13. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem der Sense-Primer SEQ ID
NO: 20 umfasst.
14. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem der Sense-Primer SEQ ID
NO: 21 umfasst.
15. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem der Sense-Primer SEQ ID
NO: 23 umfasst.
16. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem der Antisense-Primer SEQ
ID NO: 19 umfasst.
17. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem der Antisense-Primer SEQ
ID NO: 19 umfasst.
18. Verfahren nach Anspruch 13, bei dem der Antisense-Primer SEQ
ID NO: 19 umfasst.
19. Verfahren nach Anspruch 14, bei dem der Antisense-Primer SEQ
ID NO: 19 umfasst.
20. Verfahren nach Anspruch 15, bei dem der Antisense-Primer SEQ
ID NO: 19 umfasst.
21. Verfahren nach Anspruch 18, bei dem man vor Stufe f) ferner
eine Reinigung vornimmt, um ein 842 bp-Fragment 2u bilden
und man eine zweite Polymerasekettenreaktion durchführt, bei
der man einen Sense-Primer, der SEQ ID NO: 18 umfasst, und
einen Antisense-Primer, der SEQ ID NO: 19 umfasst,
verwendet, um synthetisierte doppelsträngige DNA zu bilden.
22. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem die Basenidentität der
Position 729 durch Sequenzierung bestimmt wird.
23. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem man die Basenidentität
der Position 729 durch Nachweis von Basenpaarungen und
Basenfehlpaarungen einzelner Basen zwischen dem
synthetisierten doppelsträngigen DNA und C-Allel Prohibitin
bestimmt.
24. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem man die Basenidentität
der Position 729 durch
Restriktionsfragmentlänge-Polymorphismus bestimmt.
25. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem man ferner die
synthetisierte doppelsträngige DNA mit der Restriktionsendonuklease
AflIII verdaut, die die untranslatierte Region an der Base
729 spaltet, wenn diese Base Cytosin ist.
26. Verfahren nach Anspruch 21, bei dem man ferner die
synthetisierte doppelsträngige DNA mit der Restriktionsendonuklease
AflIII verdaut, die die untranslatierte Region an der Base
729 spaltet, wenn diese Base Cytosin ist.
27. Verfahren nach Anspruch 25, bei dem man ferner
h) die verdauten synthetisierten doppelsträngigen DNA-
Stränge auftrennt; man
i) die aufgetrennten, verdauten synthetisierten
doppelsträngigen DNA-Stränge auf einer Membran fixiert; man
j) die aufgetrennten, verdauten, synthetisierten
doppelsträngigen DNA-Stränge mit mindestens einer markierten
Nukleinsäuresonde hybridisiert, wobei die markierte
Nukleinsäuresonde komplementär an die fixierten,
aufgetrennten, verdauten, synthetisierten doppelsträngigen
DNA-Stränge binden kann und man nachweisen kann, ob die
Spaltung an der Position 729 eingetreten ist; und man
k) nachweist, ob die markiert Nukleinsäuresonde an die
fixierten, aufgetrennten, verdauten, synthetisierten
doppelsträngigen DNA-Stränge gebunden hat, wobei der
Patient einem Risiko für erblichen Brustkrebs
unterliegt, wenn die markierte Nukleinsäuresonde, die an die
fixierten, aufgetrennten, verdauten, synthetisierten
doppelsträngigen DNA-Stränge gebunden ist, anzeigt,
dass eine Spaltung an der Position 729 nicht
eingetreten ist.
28. Verfahren nach Anspruch 25, bei dem man ferner
h) die verdauten, synthetisierten doppelsträngigen DNA-
Stränge auftrennt; und man
i) das Fragmentmuster der verdauten, synthetisierten
doppelsträngigen DNA durch Ethidiumbromid-Färbung und
Ultraviolett-Photographie visualisiert.
29. Verfahren nach Anspruch 26, bei dem man ferner
h) die verdauten synthetisierten doppelsträngigen DNA-
Stränge auftrennt; man
i) die aufgetrennten, verdauten synthetisierten
doppelsträngigen DNA-Stränge auf einer Membran fixiert; man
j) die aufgetrennten, verdauten, synthetisierten
doppelsträngigen DNA-Stränge mit mindestens einer markierten
Nukleinsäuresonde hybridisiert, wobei die markierte
Nukleinsäuresonde komplementär an die fixierten,
aufgetrennten, verdauten, synthetisierten doppelsträngigen
DNA-Stränge binden kann und man nachweisen kann, ob die
Spaltung an der Position 729 eingetreten ist; und man
k) nachweist, ob die markiert Nukleinsäuresonde an die
fixierten, aufgetrennten, verdauten, synthetisierten
doppelsträngigen DNA-Stränge gebunden hat, wobei der
Patient einem Risiko für erblichen Brustkrebs
unterliegt, wenn die markierte Nukleinsäuresonde, die an die
fixierten, aufgetrennten, verdauten, synthetisierten
doppelsträngigen DNA-Stränge gebunden ist, anzeigt,
dass eine Spaltung an der Position 729 nicht
eingetreten ist.
30. Verfahren nach Anspruch 26, bei dem man ferner
h) die verdauten, synthetisierten doppelsträngigen DNA-
Stränge auftrennt; und man
i) das Fragmentmuster der verdauten, synthetisierten
doppelsträngigen DNA durch Ethidiumbromid-Färbung und
Ultraviolett-Photographie visualisiert.
31. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem der Abschnitt der
genomischen DNA SEQ ID NO: 22 ist.
32. Verfahren nach Anspruch 31, bei dem man Sense-Primer SEQ ID
NO: 23 verwendet, um SEQ ID NO: 22 zu amplifizieren.
33. Verfahren nach Anspruch 31, bei dem man Antisense-Primer SEQ
ID NO: 19 verwendet, um SEQ ID NO: 22 zu amplifizieren.
34. Verfahren nach Anspruch 32, bei dem man Antisense-Primer SEQ
ID NO: 19 verwendet, um SEQ ID NO: 22 zu amplifizieren.
35. Verfahren nach Anspruch 34, bei dem man die Basenidentität
der Position 729 durch Sequenzierung bestimmt.
36. Verfahren nach Anspruch 34, bei dem man die Basenidentität
der Position 729 durch Basenfehlpaarungen einzelner Basen
zwischen der synthetisierten doppelsträngigen DNA und C-
Allel Prohibitin bestimmt.
37. Verfahren nach Anspruch 34, bei dem man die Basenidentität
der Position 729 durch
Restriktionsfragmentlänge-Polymorphismus bestimmt.
38. Verfahren nach Anspruch 34, bei dem man ferner die
synthetisierte doppelsträngige DNA mit der Restriktionsendonuklease
AflIII verdaut, die die untranslatierte Region an der Base
729 spaltet, wenn diese Base Cytosin ist.
39. Verfahren nach Anspruch 38, bei dem man ferner
h) die verdauten synthetisierten doppelsträngigen DNA-
Stränge auftrennt; man
i) die aufgetrennten, verdauten synthetisierten
doppelsträngigen DNA-Stränge auf einer Membran fixiert; man
j) die aufgetrennten, verdauten, synthetisierten
doppelsträngigen DNA-Stränge mit mindestens einer markierten
Nukleinsäuresonde hybridisiert, wobei die markierte
Nukleinsäuresonde komplementär an die fixierten,
aufgetrennten, verdauten, synthetisierten doppelsträngigen
DNA-Stränge binden kann und man nachweisen kann, ob die
Spaltung an der Position 729 eingetreten ist; und man
k) nachweist, ob die markiert Nukleinsäuresonde an die
fixierten, aufgetrennten, verdauten, synthetisierten
doppelsträngigen DNA-Stränge gebunden hat, wobei der
Patient einem Risiko für erblichen Brustkrebs
unterliegt, wenn die markierte Nukleinsäuresonde, die an die
fixierten, aufgetrennten, verdauten, synthetisierten
doppelsträngigen DNA-Stränge gebunden ist, anzeigt,
dass eine Spaltung an der Position 729 nicht
eingetreten ist.
40. Verfahren nach Anspruch 38, bei dem man ferner
h) die verdauten, synthetisierten doppelsträngigen DNA-
Stränge auftrennt; und man
i) das Fragmentmuster der verdauten, synthetisierten
doppelsträngigen DNA durch Ethidiumbromid-Färburig und U1-
traviolett-Photographie visualisiert.
41. Verfahren zur Bestimmung des Risikos für erblichen
Brustkrebs in einem menschlichen Patienten, bei dem man
a) die Sequenz der aus dem Patienten isolierten RNA in
einer Region bestimmt, die eine Transkription eines
Abschnittes der genomischen DNA ist, wobei die
genomische DNA ein Prohibitin-Gen umfasst, das eine
untranslatierte Region umfasst, wobei der Abschnitt der
wie in SEQ ID NO: 10 definierten Position 729, des
Prohibitin-Gens in der untranslatierten Region entspricht;
und man
b) die Basenidentität mit Keimbahn-Polymorphismen
korreliert, die auf ein Risiko für erblichen Brustkrebs
schließen lassen.
42. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Patient dem
niedrigsten Risiko zur Entwicklung von erblichem Brustkrebs
unterliegt, wenn er an Position 729 homozygot C/C ist, er
einem mittleren Risiko unterliegt, wenn er an Position 729
heterozygot C/T ist und er dem größten Risiko unterliegt,
wenn er an Position 729 homozygot T/T ist.
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