DE69534421T2

DE69534421T2 - Cytoplasmatische Inhibition des Genexpression

Info

Publication number: DE69534421T2
Application number: DE69534421T
Authority: DE
Inventors: Jonathan Donson; Guy Della-Cioppa; Monto Kumagai
Original assignee: Large Scale Biology Corp
Current assignee: Large Scale Biology Corp
Priority date: 1994-06-16
Filing date: 1995-05-26
Publication date: 2006-06-29
Anticipated expiration: 2015-05-27
Also published as: MX9606476A; AU710588B2; DE69527654T2; US6720183B2; ES2180641T3; ES2246210T3; JPH10501968A; IL113955A0; WO1995034668A2; DE69527654D1; US20040142477A1; EP1087017B1; ATE221574T1; ZA954451B; CA2193094C; CA2193094A1; EP1087017A3; WO1995034668A3; US6479291B2; US20020155605A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Genregulation durch mittels Antisense-RNA endogen erzeugte inhibitorische RNA-Moleküle, wie beispielsweise Antisense-RNA und Kosuppressor-RNA.
HINTERGRUND
Eines der Hauptziele der Gentechnik ist die Steuerung der Expression von ausgewählten Genen in interessanten eukaryontischen Organismen. Während es relativ unkompliziert ist, neue Gene zur Expression in eukaryontische Zellen einzusetzen, ist das Targeting bzw. die Auswahl von endogenen Genen zur reduzierten Expression schwieriger zu erreichen. Die zielgerichtete Inaktivierung von Genen in höheren Organismen erfordert äußerst komplexe genetische Manipulationen und ist nicht auf eine große Auswahl von Organismen anwendbar. Ein Verfahren zur Reduzierung der Expression spezifischer Gene in eukaryontischen Organismen erfolgt durch die Verwendung von Antisense-RNA und durch Kosuppression.
Antisense-RNA wird verwendet, um die Expression von vorher ausgewählten Genen sowohl in Pflanzen als auch Tieren zu reduzieren. Beschreibungen über die Verwendung von Antisense-RNA zur Reduzierung der Expression von ausgewählten Genen in Pflanzen können unter anderem im US-Patent 5,107,065, Smith u.a., Nature 334: 724–726 (1988), Van der Krol u.a., Nature 333: 866–869 (1988), Rothstein u.a., Proc. Natl. Aca. Sci. USA 84: 8439–8443 (1987), Bird u.a., Bio/Technology 9: 635–639 (1991), Bartley u.a., Biol. Chem. 267: 5036–5039 (1992) und Gray u.a., Plant Mol. Bio. 19: 69–87 (1992) gefunden werden.
Ein anderes Verfahren zur Reduzierung der Expression von bestimmten Genen in eukaryontischen Organismen erfolgt durch die Verwendung von Kosuppressor-RNA. Kosuppressor-RNA hat im Gegensatz zu Antisense-RNA dieselbe Orientierung wie die vom Zielgen transkribierte RNA, d.h. die „Sense"-Orientierung.
Es ist möglich, dass biochemische Wege in Pflanzen, die mit Hybridviren transfiziert sind, durch eine Überproduktion eines Enzyms, das an einem ratenbegrenzenden Schritt beteiligt ist, oder durch eine Hemmung der Synthese eines Enzyms über Antisense-RNA geändert werden könnten. Obwohl die Expression von zahlreichen Genen in transgenen Pflanzen durch Antisense-RNA unterdrückt wird, ist der eigentliche Mechanismus und Ort der Hemmung nicht bekannt. Im Kern kann Antisense-RNA direkt die Transkription stören oder mit dem heterogenen Kern Doppelstränge bilden (hnRNA). Es gibt Hinweise, dass die Hemmung von endogenen Genen in transgenen Pflanzen mit Sense-RNA auftreten kann (A. R. van der Krol u.a., Nature 333: 866–869 (1988) und C. Napoli u.a., Plant Cell 2: 279–289 (1990)). Es wird davon ausgegangen, dass der Mechanismus dieser Runterregulation oder „Kosuppression" durch die Erzeugung von Antisense-RNA durch Durchlese-Transkription von distalen Promotoren, die auf dem gegenüberliegenden Strang der chromosomalen DNA angeordnet sind, bewirkt wird (Greison u.a., Trends in Biotech., 9: 122–123 (1991)). Alternativ kann Antisense-RNA im Zytoplasma ein doppelsträngiges Molekül mit komplementärer mRNA bilden und die Translation von mRNA in ein Protein verhindern.
Vektoren, die von doppelsträngigen, DNA enthaltenden Pflanzenviren stammen und virale Promotoren in funktioneller Kombination mit einer Nukleinsäuresequenz umfassen, die Antisense- oder Kosuppressor-RNA kodiert, werden verwendet, um die Expression von einzelnen Pflanzengenen zu hemmen (Bird u.a., WO-A-91 09128) oder eine koordinierte Hemmung von mehreren Genen vorzusehen (Barron u.a., WO-A-93 23551). Die Verwendung von Vektoren, die von Pflanzenviren stammen, die im Zytoplasma replizieren, die subgenomische Promotoren verwenden, ist nicht offenbart worden.
Tobamoviren, deren Genome aus einem Plus-Sense-RNA-Strang von ungefähr 6,4 kb bestehen, replizieren nur im Zytoplasma und können als episomale RNA- Vektoren verwendet werden, um die pflanzenbiochemischen Wege zu ändern. Hybrid-Tabakmosaik(TMV)/Odontoglossum-Ringspot-Viren (ORSV) sind bisher verwendet worden, um heterologe Enzyme in transfizierten Pflanzen zu exprimieren (Donson u.a., Proc. Natl. Aca. Sci. USA 88: 7204 (1991) und Kumagai u.a., Proc. Natl. Aca. Sci USA 90: 427–430 (1993), Minus-Sense-RNA-Strang, (Miller u.a.). Infektiöse RNA-Transkripte von viralen cDNA-Klonen kodieren für Proteine, die an der RNA-Replikation, Bewegung und Enkapsidation beteiligt sind (10). Subgenomische RNA für die Boten-RNA-Synthese wird durch interne Promotoren gesteuert, die auf dem Minus-Sense-RNA-Strang angeordnet sind (N. benthamiana-Pflanzen wurden mit In-vitro-Transkripten, wie zuvor beschrieben, beimpft (W. O. Dawson u.a., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 1832 (1986)]). Insertionen von fremden Genen in eine bestimmte Stelle unter der Kontrolle eines zusätzlichen subgenomischen RNA-Promotors haben zur systemischen und stabilen Expression von Neomycinphosphotransferase und α-Trichosanthin geführt (Donson u.a., Proc. Natl. Aca. Sci. USA 88: 7204 (1991) und Kumagai u.a., Proc. Natl. Aca. Sci. USA 90: 427–430 (1993)).
Einer der vielen biochemischen Wege, die als Ziel für eine genetische Manipulation dienen könnten, ist die Biosynthese von Karotinoiden. Der erste engagierte Schritt bei der Karotinoid-Biosynthese in höheren Pflanzen ist die Kondensation von zwei Geranylgeranylpyrophosphatmolekülen zu Phytoen, einem farblosen C₄₀-Kohlenwasserstoff, durch Enzymphytoensynthase. In der reifenden Frucht von Lycopersicon esculentum ist Phytoensynthase ein monomeres, im Chloroplast angeordnetes Protein mit einer relativen Molekülmasse von ungefähr 42 kDa. Dieses Enzym wird anfänglich als 47 kDA Präprotein synthetisiert und durch Entfernen eines Transitpeptids während des Imports zum Chloroplast verarbeitet (Bartley u.a., J. Biol. Chem. 267: 5036–5039 (1992)). Transgene Tomatenpflanzen, die antisense zur Phytoensynthase mRNA enthalten, erzeugen gelbe Früchte und blasse Blüten. Obwohl die fruchtspezifischen Karotine um 97% reduziert sind, bleiben die Karotinoidniveaus in den Blätter der transgenen Pflanzen unbeeinflusst (Bird u.a., Bio/Technology 9: 635–639 (1991)). Es ist nahe gelegt worden, dass ein zusätzlicher Satz biosynthetischer Gene in Pflanzen auftritt, die die Expression von blattspezifischen Karotinoiden regulieren.
Der anschließende Schritt im biosynthetischen Weg ist die Modifikation des farblosen Phytoens zu Phytofluen und ζ-Karotin durch Pytoendesaturase. Unter den höheren Pflanzen ist die Isolation eines Gens, das dieses Enzym kodiert, für Tomaten beschrieben worden, Pecker u.a., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 4962 (1992) und Arabidopsis thaliana (Scolnick und Bartley, Plant Physiol. 103: 147 (1993)). Phytoendesaturase wird durch Norflurazon, einem bleichenden Herbizid, in einer reversiblen, nicht kompetitiven Weise gehemmt (Sandman u.a., Target Sites of Herbicide Actions, G. Sandman, P. Boger Es (RC press, Boca Rotan (1989)). Die Anwendung dieser Verbindung bewirkt ein dramatisches Absenken der Blattkarotinoide und Chlorophylle und ein anschließendes Sammeln von Phytoen. Die Verringerung der lichtschützenden Karotinoide, die von Phytoen stammen, kann eine schnelle Zerstörung des Chlorophylls durch Photooxidation bewirken.
Der Bedarf an neuen Verfahren zur Verringerung der Expression von bestimmten Genen in Eukaryonten ist klar belegt. Die hier beschriebene Erfindung stellt neue Verfahren zur Verringerung der Expression von ausgewählten Genen, genetische Konstrukte zur Durchführung der Verfahren und durch diese genetischen Konstrukte transformierte Zellen und höhere, die transformierten Zellen umfassende Organismen zur Verfügung.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Ein Aspekt der Erfindung ist es, neue genetische Konstrukte zur Expression von inhibitorischer RNA im Zytoplasma von Pflanzenzellen zur Verfügung zu stellen. Die genetischen Konstrukte der Erfindung sind in der Lage, im Zytoplasma einer Pflanzenzelle zu replizieren, und umfassen eine Promotorregion in funktioneller Kombination mit einem Polynukleotid, das für eine inhibitorische RNA kodiert, d.h. für eine Antisense-RNA oder eine Kosuppressor-RNA kodiert. Die genetischen Konstrukte der Erfindung können so aufgebaut sein, dass sie im Zytoplasma von Pflanzenzellen replizieren. In einer Pflanzenzelle stammt das genetische Konstrukt vorzugsweise von einem Pflanzen-RNA-Virus, besonders bevorzugt einem positiven einzelsträngigen RNA-Virus. Genetische Konstrukte, die von einem Pflanzen-RNA-Virus stammen, können einen subgenomischen Pflanzenvi rus-Promotor, einschließlich subgenomische Promotoren von Tobamoviren, in funktioneller Kombination mit der für die inhibitorische RNA kodierenden Region umfassen.
Ein anderer Aspekt der Erfindung ist es, Zellen zur Verfügung zu stellen, die die genetischen Konstrukte der Erfindung umfassen, und Pflanzen zur Verfügung zu stellen, die eine Vielzahl solcher Zellen aufweisen.
Ein anderer Aspekt der Erfindung ist es, Verfahren zur Verringerung der Expression eines interessanten Gens in Pflanzenzellen zur Verfügung zu stellen, d.h. Verfahren zur Erzeugung von Pflanzenzellen, die reduzierte Expressionsniveaus eines interessanten Gens zeigen. Die Verfahren der Erfindung umfassen den Schritt des Transformierens einer Zelle mit einem genetischen Konstrukt der Erfindung, wobei die für die inhibitorische RNA kodierende Region für das interessante Gen spezifisch ist. Ein anderer Aspekt der Erfindung ist es, Pflanzenzellen zur Verfügung zu stellen, die erhöhte Niveaus an Karotinoidphytoen erzeugen. Die erhöhten Phytoenniveaus werden durch Hemmen der Expression bei dem Enzym Phytoendesaturase mittels der Vektoren der Erfindung erzielt.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1. Phytoenexpressionsvektor TTO1/PSY+. Dieses Plasmid enthält die TMV-U1 126, 183 und 30 kDa ORFs, das ToMV-Hüllproteingen (ToMVcp), den SP6-Promotor, das Tomatenphytoensynthasegen und einen Teil des pBR322-Plasmids. Das TAA-Stoppkodon im 30 kDa ORF ist unterstrichen. Der subgenomische TMV-U1-Promotor, der sich im Minus-Strang des 30 kDa ORF befindet, steuert die Expression von Phytoensynthase. Der mutmaßliche Transkriptionsstartpunkt (tsp) der subgenomischen RNA ist mit einem Punkt (.) angegeben (SEQ ID NO: 12 und 13).
2. Nukleotidsequenzvergleich von N. benthamiana-Blattphytoendesaturase (PDS1-Nb) und Tomatenphytoendesaturase (PDS-Le). Die Nukleotide sind abgestimmt, um die Sequenzähnlichkeit zu maximieren. (SEQ ID NO: 14 und 15).
BESCHREIBUNG DER SPEZIELLEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Definitionen
Der Begriff „inhibitorische RNA", wie er hier verwendet wird, betrifft ein RNA-Molekül, das die Expression eines Zielgens stört. Eine „inhibitorische RNA" ist für ein oder mehr Zielgene spezifisch. Eine inhibitorische RNA kann eine Antisense-RNA bezüglich eines vom Zielgen transkribierten RNA-Moleküls sein. Alternativ kann die inhibitorische RNA des Zielgens eine Kosuppressor-RNA bezüglich eines vom Zielgen transkribierten RNA-Moleküls sein.
Der Begriff „Antisense-RNA", wie er hier verwendet wird, betrifft ein RNA-Molekül, das in der Lage ist, einen Doppelstrang mit einem zweiten RNA-Molekül zu bilden. Daher soll ein gegebenes RNA-Molekül ein Antisense-RNA-Molekül im Hinblick auf ein zweites, komplementäres oder teilweise komplementäres RNA-Molekül sein, d.h. das Zielmolekül. Ein Antisense-RNA-Molekül kann komplementär zu einer translatierten oder nicht translatierten Region eines RNA-Zielmoleküls sein. Die Antisense-RNA braucht nicht völlig zur Ziel-RNA komplementär zu sein. Die Antisense-RNA kann dieselbe Länge wie das Zielmolekül haben oder auch nicht; das Antisense-RNA-Molekül kann entweder länger oder kürzer als das Zielmolekül sein.
Der Begriff „Kosuppressor-RNA" betrifft ein RNA-Molekül, das die Unterdrückung der Expression eines Zielgens dort bewirkt, wo die RNA teilweise zu einem vom Zielgen transkribierten RNA-Molekül homolog ist. Ein Kosuppressor-RNA-Molekül ist das RNA-Molekül, das die Kosuppression bewirkt, wie im US-Patent 5,231,020, Krol u.a., Biotechniques 6: 958–976 (1988), Mol u.a., FEBS Lett. 268: 427–430 (1990) und Grierson u.a., Trends in Biotech. 9: 122–123 (1991) und ähnlichen Veröffentlichungen beschrieben. Eine „Kosuppressor"-RNA hat eine Sense-Orientierung bezüglich des Zielgens, d.h. die entgegengesetzte Orientierung der Antisense-Orientierung.
Der Begriff „für inhibitorische RNA kodierendes Polynukleotid", wie er hier verwendet wird, betrifft ein Polynukleotid, z.B. DNA, RNA und dergleichen, das transkribiert werden kann, wenn es sich in funktioneller Kombination mit einem Promotor befindet, um so ein inhibitorisches RNA-Molekül zu erzeugen, z.B. eine Antisense-RNA oder eine Kosuppressor-RNA. Für Antisense-RNA kodierende Polynukleotide und für Kosuppressor kodierende Polynukleotide sind beides Ausführungsformen der für inhibitorische RNA kodierenden Polynukleotide. Wenn die inhibitorische RNA eine Antisense-RNA ist, ist die inhibitorische RNA, die von der für inhibitorische RNA kodierenden Polynukleotidregion der genetischen Konstrukte der Erfindung transkribiert wird, vorzugsweise völlig komplementär zur gesamten Länge des RNA-Moleküls oder der RNA-Moleküle, für die die Antisense-RNA spezifisch ist, d.h. das Ziel. Das für Antisense-RNA kodierende Polynukleotid in den vorliegenden Vektoren kann für eine Antisense-RNA kodieren, die einen Doppelstrang mit einer nicht translatierten Region eines RNA-Transkripts, wie beispielsweise einer Intron-Region, oder nicht translatierten 5'-Region, einer nicht translatierten 3'-Region und dergleichen bildet. In ähnlicher Weise kann ein für einen Kosuppressor kodierendes Polynukleotid in den vorliegenden Vektoren für eine RNA kodieren, die zu translatierten oder nicht translatierten Abschnitten einer Ziel-RNA homolog ist. Ein für Antisense-RNA kodierendes Polynukleotid kann in geeigneter Weise mittels des nicht kodierenden Strangs, oder eines Abschnitts davon, einer DNA-Sequenz, die für ein interessantes Protein kodiert, erzeugt werden.
Der Begriff „verringerte Expression", wie er hier verwendet wird, ist ein relativer Begriff, der das Expressionsniveau eines bestimmten Gens in einer Zelle betrifft, die durch die beanspruchten Verfahren verglichen mit einer vergleichbaren nicht modifizierten Zelle, d.h. einer Zelle, der der vorliegende Vektor fehlt, bei einer ähnlichen Reihe von Umweltbedingungen erzeugt oder modifiziert wird. Daher kann eine durch die vorliegenden Verfahren modifizierte Zelle, d.h. eine Zelle mit „verringerter Expression" des interessanten Gens, höhere Niveaus dieses Gens bei einer ersten Reihe von Umweltbedingungen als eine vergleichbare nicht modifizierte Zelle bei einer zweiten Reihe von Umweltbedingungen exprimieren, wenn die zweite Reihe von Bedingungen für eine Genexpression äußerst günstig ist.
Die Erfindung
Die hier beschriebene Erfindung nutzt die Entdeckung aus, dass RNA die Expression eines Zielgens durch inhibitorische RNA-Wechselwirkungen mit Ziel-mRNA verringert, die im Zytoplasma einer eukaryontischen Zelle und nicht im Nukleus stattfinden. Vor der Erfindung war nicht bekannt, ob inhibitorische RNA eine Genexpression mittels einer Wechselwirkung, die im Zytoplasma stattfindet, oder einer Wechselwirkung, die im Nukleus stattfindet, verringert. Daher war es vor der Erfindung notwendig, inhibitorische RNA im Nukleus zu erzeugen, um so sicher zu sein, dass eine Hemmung erreicht würde. Weiterhin war nicht bekannt, ob ausreichende Konzentrationen an inhibitorischer RNA im Zytoplasma zur Verfügung gestellt werden könnten. Die zytoplasmatische Expression von inhibitorischer RNA (die für Zielgene spezifisch ist) hat zahlreiche Vorteile gegenüber einer Kernexpression, wobei diese Vorteile die Fähigkeit umfassen, Vektoren mit hohem Expressionsniveau zu verwenden, die für eine Kernexpression nicht geeignet sind. Die Verwendung von solchen Vektoren ist teilweise bei Pflanzen von Vorteil, weil Vektoren, die in der Lage sind, Pflanzen systemisch zu infizieren, verwendet werden können, um die inhibitorische RNA zu erzeugen. Die hier beschriebene Erfindung hat viele Aspekte. Diese Aspekte umfassen neue genetische Konstrukte zur Expression von inhibitorischer Zielgen-RNA im Zytoplasma von Pflanzenzellen, Zellen, die mit diesen genetischen Konstrukten transfiziert sind, vielzellige Organismen, die die transfizierten Zellen umfassen, und Verfahren zur Reduzierung der Expression von ausgewählten Genen in einer Zelle durch Transformation einer Zelle mit einem genetischen Konstrukt der Erfindung.
Es gibt zahlreiche Arten, um die genetischen Konstrukte der Erfindung zu erzeugen. Verfahren zum Manipulieren von Polynukleotiden, z.B. Restriktionsendonukleaseverdau und Ligation, sind dem Durchschnittsfachmann wohlbekannt. Diese herkömmlichen Polynukleotidmanipulationsverfahren können dazu verwendet werden, das genetische Konstrukt der Erfindung zu erzeugen und zu verwenden. Während eine gewisse Optimierung von Standardverfahren verwendet werden kann, um die vorliegenden genetischen Konstrukte zu erzeugen, ist ein bedeutsames Experimentieren nicht erforderlich, um die genetischen Konstrukte zu erzeugen oder die beanspruchten Verfahren zu praktizieren.
Die genetischen Konstrukte der Erfindung umfassen eine Promotorregion in funktioneller Kombination mit einem für inhibitorische RNA kodierenden Polynukleotid. Die Promotorregion wird so ausgewählt, dass die Transkription einer Polynukleotidsequenz in einer interessanten Wirtszelle betrieben wird. Zum Beispiel wird in einer Pflanzenzelle daher der Promotor so ausgewählt, dass die Transkription in Pflanzenzellen betrieben werden kann. Promotoren, die in einer bestimmten eukaryontischen Zelle funktionieren können, sind dem Durchschnittsfach wohlbekannt. Beispiele für Promotoren, die in der Lage sind, die Transkription in einer interessanten Zelle zu betreiben, können unter anderem bei Goeddel u.a., Gene Expression Technology Methods in Enzymology, Bd. 185, Academic Press, San Diego (1991), Ausubel u.a., Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience (1994) und ähnlichen Veröffentlichungen gefunden werden. Wenn die Zelle für die Transformation eine Pflanzenzelle ist, werden die subgenomischen RNA-Virus-Promotoren vorzugsweise als Promotorregionen verwendet. Subgenomische RNA-Virus-Promotoren werden unter anderem in Dawson und Lehto, Advances in Virus Research, 38: 307–342, veröffentlichte PCT-Anmeldung WO93/03161 beschrieben.
Die genetischen Konstrukte der Erfindung sind replikations- oder erhaltungsfähig, zumindest vorübergehend, und zwar im Zytoplasma von interessanten Pflanzenzellen, d.h. einem Basenvektor. Daher umfassen die genetischen Konstrukte der Erfindung notwendigerweise eine Polynukleotidregion, die von einem Vektor stammt, der in interessanten Pflanzenzellen replikationsfähig oder stabil erhaltungsfähig ist. Es sind viele Vektoren, die replikationsfähig (oder stabil erhaltungsfähig) in unterschiedlichen Arten von eukaryontischen Zellen sind, bekannt.
Vektoren zur Verwendung in Pflanzen umfassen Vektoren, die vom Blumenkohlmosaikvirus, Tabakmosaikvirus, Tomatenmosaikvirus und dergleichen stammen. Informationen, die Pflanzenzellvektoren und ihre Verwendung in Pflanzenzellen beschreiben, können unter anderem in der PCT-Anmeldung WO93/03161 und Donson u.a., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7204–7208 (1991) gefunden werden.
Die vom Promotor betriebene Transkription der die inhibitorische RNA kodierenden Region der vorliegenden genetischen Konstrukte können so ausgewählt werden, dass ein Transkriptionsaktivitätsniveau erhalten wird, das ausreicht, um den gewünschten Expressionsgrad der interessanten inhibitorischen Zielgen-RNA zu erzielen. Der Promotor kann für die genetische Modifikation nativ oder heterolog zur Zelle sein. Der Promotor kann auch nativ oder heterolog zum Basenvektor sein, d.h. dem Abschnitt des Vektors, der nicht der Promotor und die für inhibitorische RNA kodierende Region ist. Der Promotor kann induzierbar oder konstitutiv sein. Vorzugsweise werden starke Promotoren verwendet, um die Transkription des für die inhibitorische RNA kodierenden Polynukleotids zu betreiben, wenn die Ziel-RNA stark exprimiert ist.
Die Erfindung stellt auch Verfahren zur Reduzierung der Expression eines interessanten Gens oder von interessanten Genen in einer eukaryontischen Zelle zur Verfügung. Als Ergebnis des Bereitstellens der vorliegenden Verfahren zur Reduzierung der Genexpression in einer Pflanzenzelle liefert die vorliegende Erfindung auch Verfahren zur Herstellung einer Pflanzenzelle mit reduzierter Expression eines interessanten Gens und Pflanzenzellen, die eine verringerte Expression eines interessanten Gens aufweisen, wie durch die Verfahren der Erfindung erzeugt. Die Verringerung der Genexpression wird durch Einführen von einem oder mehr Vektoren der Erfindung in eine Pflanzenzelle erzielt. Der zum Transformieren der interessanten Zelle verwendete Vektor umfasst ein für inhibitorische RNA kodierendes Polynukleotid, das für eine inhibitorische RNA kodiert, die für das Gen spezifisch ist, für das eine verringerte Expression angestrebt wird. Das Verfahren zur Verringerung der Expression des interessanten Gens umfasst den Schritt des Einführens des vorliegenden genetischen Vektors in eine Wirtszelle, die in der Lage ist, das interessante Gen unter bestimmten Umweltbedingungen zu exprimieren. Der Vektor kann in eine interessante Zelle durch jedes einer Auswahl von bekannten Transformationsverfahren eingeführt werden. Solche Verfahren umfassen: Infektion, Transfektion, Elektroporation, ballistische Projektiltransformation, Konjugation und dergleichen. Der erfinderische Aspekt der vorliegenden Verfahren hängt nicht von den besonderen Mitteln ab, durch die der die inhibitorische RNA kodierende Vektor in die interessante Zelle eingeführt wird. Die besonderen Verfahren zum Einführen des Vektors in eine interessante Zelle hängen teilweise von der bestimmten Zelle zur Modifikation und der genauen Art des ausgewählten Vektors ab.
Für Pflanzenzellen stammen die Vektoren vorzugsweise von RNA-Pflanzenviren. Bevorzugte RNA-Pflanzenvirusvektoren sind einzelsträngige Positivstrang-RNA-Viren. RNA-Pflanzenvirusvektoren können bequem manipuliert und in Zellen in einer DNA-Form eingeführt werden, anstatt dass direkt mit RNA-Vektoren gearbeitet wird. Virusvektoren, die von Tobamoviren stammen, sind besonders bevorzugt. Beschreibungen von geeigneten Pflanzenvirusvektoren, die so modifiziert sein können, dass sie eine inhibitorische RNA kodierende Region in funktioneller Kombination mit einem Promotor enthalten, sowie die Herstellung und Verwendung von solchen Vektoren können unter anderem in der PCT-Veröffentlichung WO 93/03161, Kumagai u.a., Proc. Natl. Aca. Sci. USA 90: 427–430 (1993) gefunden werden.
Die Erfindung stellt auch Polynukleotide zur Verfügung, die Phytoensynthase und Phytoendesaturase kodieren, sowie verschiedene Vektoren zur Expression von inhibitorischer Zielgen-RNA, die für Phytoensynthasegene oder Phytoendesaturasegene spezifisch ist. Der erste engagierte Schritt in der Karotinoidbiosynthese in höheren Pflanzen ist die Kondensation von zwei Geranylgeranlypyrophosphatmolekülen zu Phytoen, einem farblosen C₄₀-Kohlenwasserstoff, durch Enzymphytoensynthase. Der anschließende Schritt im Biosyntheseweg ist die Modifikation des farblosen Phytoens zu Phytofluen und ζ-Karotin durch Phytoendesaturase.
Die Erfindung stellt Polynukleotide zur Verfügung, die das Phytoendesaturaseenzym von Nicotiana-Arten und zahlreichen Derivaten davon kodiert. Insbesondere stellt die Erfindung in gereinigter Form Polynukleotide zur Verfügung, die für die Phytoendesaturase von Nicotiana benthamiana kodiert. Darüber hinaus liefert die Erfindung Polynukleotide, die für Tomaten (Lycopersicon esculentum) Phytoensynthase und Phytoendesaturase kodiert. Die hier beschriebenen, die Phytoensynthase und Phytoendesaturase kodierenden Polynukleotide können dazu verwendet werden, um inhibitorische RNAs, die für Phytoensynthase- und Phytoendesaturasegene spezifisch sind, aus einer Auswahl von Pflanzenarten erzeugen. Die inhibitorische RNAs für Phytoensynthase und Phytoendesaturase werden bevorzugt durch Transkription von Polynukleotiden, die inhibitorische RNA für Phytoensynthase oder Phytoendesaturase kodiert, in funktioneller Kombination mit einer Promotorregion erzeugt.
Die Aminosäuresequenz der verschiedenen Phytoendesaturase- und der Phytoensynthaseenzyme, wie hier beschrieben, und die natürlich auftretenden Polynukleotidsequenzen, die für diese Enzyme kodieren, ermöglichen es einem Durchschnittsfachmann der Molekularbiologie, eine Auswahl von verwandten Molekülen mit nützlichen Eigenschaften auszubilden und aufzubauen, die diesen Enzymen und den direkt aus dem Klonieren der für diese Enzyme kodierenden cDNAs erhaltenden Polynukleotiden ähnlich sind. Im Fall von Polynukleotiden erlaubt die Degeneration des genetischen Codes es dem Durchschnittsfachmann, zahlreiche unterschiedliche Polynukleotide zu erzeugen, die für dasselbe Polypeptid kodieren, d.h. isocodierende Polynukleotide. Die genaue erzeugte Polynukleotidsequenz kann so ausgewählt werden, dass die Expression in einem bestimmten Wirtszelltyp optimiert wird, was Faktoren, die die Expression, wie beispielsweise Kodonhäufigkeit, potentielle sekundäre mRNA-Strukturen, Methylierung und dergleichen beeinflussen, berücksichtigt. Die Erfindung stellt auch eine Auswahl von Polypeptiden mit derselben enzymatischen Aktivität wie Phytoendesaturase und Phytoensynthase zur Verfügung, unterscheidet sich aber in einem oder mehr Aminosäureresten, um so Phytoendesaturase- und Phytoensynthase-Varianten-Polypeptide zu erzeugen. Varianten-Polypeptide können auf vielfältige Art erzeugt und aufgebaut werden. Phytoendesaturase- und Phytoensynthasevarianten können durch Einführen von Mutationen (entweder willkürlich oder durch Anordnung) in eine Polynukleotidsequenz erzeugt und aufgebaut werden, die für das Enzym kodiert, indem das mutierte Enyzm-kodierende Polynukleotid (das funktionsfähig mit einem geeigneten Promotor verbunden ist) in eine Wirtszelle transformiert wird und anschließend die Wirtszelle auf Expression der gewünschten enzymatischen Aktivität untersucht wird. Die Identität von Mutationen in Srf I kodierende Polynukleotide, die willkürlich eingeführt werden, kann durch Sequenzierung des das Enzym kodierenden Polynukleotids bestimmt werden.
Die Erfindung sieht auch die rekombinante DNA-Expression von Phytoendesaturase und Phytoensynthase (sowie Varianten davon) vor. Die rekombinante Ex pression dieser Enzyme kann durch die übliche rekombinante DNA-Expressionstechnologie erzielt werden. Eine geeignete rekombinante DNA-Expressionstechnologie kann unter anderem in Goeddel u.a., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Bd. 185, Academic Press, San Diego (1991) gefunden werden. Das Enzym kann in einer großen Auswahl von Wirtszellen, einschließlich sowohl eukaryontischen und prokaryontischen Wirtszellen, exprimiert werden. Ein Vorteil des Bereitstellens der vorliegenden Enzyme durch rekombinante DNA-Methodik ist das Erzielen von erhöhten Mengen an Enzym aus geringeren Mengen an Zellmaterial.
Ein anderer Vorteil der rekombinanten Herstellung der Enzyme ist die Fähigkeit, das Enzym ohne bestimmte Verunreinigungen zu erzeugen. Phytoensynthase und Phytoendesaturase (und Varianten davon), die durch rekombinante DNA-Verfahren hergestellt werden, können durch Verfahren gereinigt werden, die den hier beschriebenen Verfahren zur Reinigung des nicht rekombinanten Enzyms ähnlich sind. Anleitung bei der Entwicklung und Modifikation von Enzymreinigungsverfahren kann unter anderem in Deutschers ,Guide to Protein Purification Methods in Enzymology', Bd. 182, Academic Press, San Diego (1990), Scopes ,Protein Purification: Principles and Practice', 3. Ausg., Springer-Verlag, NY (1993) und dergleichen gefunden werden.
Die Erfindung lässt sich mit Bezug auf die folgenden Beispiele besser nachvollziehen. Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung der Erfindung angeführt und sind nicht als Einschränkung der Erfindung auszulegen.
BEISPIELE
Beispiel 1
Isolierung der Tomatenmosaikvirus-cDNA
Ein 861 bp langes Fragment (5524–6384) vom Tomatenmosaikvirus (Fruchtnekrosestamm F; ToMV-F), enthaltend den mutmaßlichen subgenomischen Hüll protein-Promotor, das Hüllproteingen und das 3'-Ende, wurde mittels PCR unter Verwendung der ToMV-Primer 5' CTCGCAAAGTTTCGAACCAAATCCTC 3' (SEQ ID NO: 1) (vorwärts) und 5'CGGGGTACCTGGGCCCCAACCGGGGGTTCCGGGGG3' (SEQ ID NO: 2) (rückwärts) isoliert und in die HincII-Stelle von pBluescript KS– subkloniert. Ein Hybridvirus, bestehend aus TMV-U1 und ToMV-F wurde konstruiert, indem ein 874 bp langes XhoI-KpnI-ToMV-Fragment in pBGC152 ausgelagert wurde (Kumagai u.a., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90: 427–430 (1993)), wodurch das Plasmid TTO1 erzeugt wurde. Das insertierte Fragment wurde durch Didesoxynukleotidsequenzierung verifiziert. Eine einzige AvrII-Stelle wurde abwärts von der XhoI-Stelle in TTO1 durch PCR-Mutagene insertiert, wodurch das Plasmid TTO1A entstand, und zwar mittels der folgenden Oligonukleotide:
5' TCCTCGAGCCTAGGCTCGCAAAGTTTCGAACCAAATCCTCA 3' (SEQ ID NO: 3) (aufwärts)
5' CGGGGTACCTGGGCCCCAACCGGGGGTTCCGGGGG 3' (SEQ ID NO: 2) (abwärts).
Beispiel 2
Isolierung einer cDNA, die für Tomatenphytoensynthase kodiert, und einer unvollständigen cDNA, die für Tomatenphytoendesaturase kodiert.
Unvollständige cDNAs wurden von reifender Tomatenfrucht-RNA mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung der folgenden Oligonukleotide isoliert: PSY. 5' TATGTATGGTGCAGAAGAACAGAT 3' (SEQ ID NO: 4) (vorwärts). 5' AGTCGACTCTTCCTCTTCTGGCATC 3' (SEQ ID NO: 5) (rückwärts); PDS, 5' TGCTCGAGTGTGTTCTTCAGTTTTCTGTCA 3' (SEQ ID NO: 6) (vorwärts). 5' AACTCGAGCGCTTTGATTTCTCCGAAGCTT 3' (SEQ ID NO: 7) (rückwärts). Ungefähr 3 × 10⁴ Kolonien von einer Lycopersicon esculentum cDNA-Bibliothek wurden durch Koloniehybridisierung unter Verwendung eines 32 P markierten Tomatenphytoensynthase-PCR-Produkt gescreent. Die Hybridisierung wurde bei 42°C 48 h lang in 50% Formamid, 5× SSC, 0,02 M Phosphatpuffer, 5× Denhart-Lösung und 0,1 mg/ml gescherte Kalbsthymus-DNA durchgeführt. Die Filter wurden bei 65°C in 0,1× SSC, 0,1% SDS vor der Autoradiographie gewaschen. Die PCR-Produkte und die Phytoensynthase-cDNA-Klone wurden mittels Didesoxynukleotidsequenzierung verifiziert.
Beispiel 3
DNA-Sequenzierung und Computeranalyse
Ein 1,2 Kb PstI,BamHI-Fragment, enthaltend die Phytoensynthase-cDNA und eine 0,7 Kb unvollständige Phytoendesaturase-cDNA wurde in pBluescript KS+ (Stratagene, La Jolla, Kalifornien) subkloniert. Die Nukleotidsequenzierung von KS+/PDS #38 und KS+/5'3'PSY wurde mittels Didesoxy-Terminierung unter Verwendung von einzelsträngigen Matrizen durchgeführt. Die Nukleotidsequenzanalyse und Aminosäuresequenzvergleiche wurden mittels der Programme PCGENE und DNA Inspector IIE durchgeführt.
Beispiel 4
Aufbau des Tomatenphytoensynthaseexpressionsvektors.
Ein XhoI-Fragment mit 1253 Basenpaaren, enthaltend die Tomatenphytoensynthase-cDNA wurde in TTO1 subkloniert. Der Vektor TTO1/PSY+ (1) enthält die Phytoensynthase-cDNA (positive Orientierung) unter der Kontrolle des subgenomischen TMV-U1-Hüllprotein-Promotors, während der Vektor TTO1/PSY– die Phytoensynthase-cDNA in der Antisense-Orientierung enthält.
Beispiel 5
Aufbau eines Virusvektors enthaltend eine unvollständige Tomatenphytoen-cDNA
Ein XhoI-Fragment, enthaltend die unvollständige Tomatenphytoendesaturase-cDNA wurde in TTO1 subkloniert. Der Vektor TTO1A/PDS+ enthält die Phytoendesaturase-cDNA (positive Orientierung) unter der Kontrolle des subgenomischen TMV-U1-Hüllprotein-Promators, während der Vektor TTO1/PDS– die Phytoendesaturase-cDNA in der Antisense-Orientierung enthält.
Eine unvollständige cDNA, die für Phytoendesaturase kodiert, wurde von N. benthamiana-Blatt-RNA mittels RT-PCR unter Verwendung der folgenden Oligonukleotide isoliert: PDS, 5' GGCACTCAACTTTATAAACC 3' (SEQ ID NO: 8) (vorwärts), 5'- CTTCAGTTTTCTGTCAAACC 3' (SEQ ID NO: 9) (rückwärts) und durch Didesoxynukleotidsequenzierung verifiziert.
Beispiel 6
Transfektion und Analyse von N. benthamiana [TTO1/PSY+, TTO1/PSY–, TTO1A/PDS700+, TTO1/PDS700–]
Infektiöse RNAs von TTO1/PSY+ (1), TTO1/PSY–, TTO1A/PDS+, TTO1/PDS– wurden mittels In-vitro-Transkription unter Verwendung von SP6-DNA-abhängiger RNA-Polymerase hergestellt und wurden zur mechanischen Beimpfung von N. benthamiana verwendet (Dawson u.a., Adv. Virus Res. 38: 307 (1990)). Die Hybridviren breiteten sich über die ganzen nicht beimpften oberen Blätter aus, wie mittels Transmissionselektronenmikroskopie, Infektiositätsuntersuchung mittels lokaler Läsion und Polymerasekettenreaktion(PCR)-Amplifikation verifiziert. Die viralen Symptome bestanden aus Verformung von systemischen Blättern, Pflanzenverkrüppelung und leichter Chlorose. Die mit TTO1/PSY+ transfizierten Pflanzen zeigten einen mindestens zweifachen Anstieg der Phytoensynthaseaktivität gegenüber Pflanzen, die mit Virusvektorkontrollen transfiziert waren. Blätter von systemisch infizierten TTO1/PSY+-Pflanzen entwickelten einen leuchtend orangefarbenen Phänotyp und sammelten hohen Niveaus an Phytoen an (Tabelle 1). Die Blätter und Kelchblätter von TTO1/PDS^–-Pflanzen entwickelten einen weißen bleichen Phänotyp ähnlich dem mit dem Herbizid Norflurazon festgestellten. Der Aufbau der Chloroplasten von mit TTO1/PSY+ und TTO1/PDS– transfizierten Pflanzen erschien bei Analyse mit Transmissionselektronenmikroskopie normal. Blätter von systemisch infizierten TTO1A/PDS+-Pflanzen entwickelten einen bleichen weißen Phänotyp etwa eine Woche später als Blätter von Antisense-TTO1/PDS^–-Pflanzen und sammelten auch hohe Niveaus an Phytoen an.
Agarosegelelektrophorese von PCR-cDNA, die von Virion-RNA isoliert wurde, und Northern-Blot-Analyse von Virion-RNA zeigten, dass die Vektoren in einem extrachromosomalen Zustand erhalten bleiben und keinen feststellbaren intramolekularen Änderungen unterlagen.
Tabelle I Quantifizierung von Phytoenblättern von N. benthamiana, die mit viralen Transkripten transfiziert waren
Beispiel 7
Reinigung und Analyse von Phytoen aus transfizierten Pflanzen
Phytoen wurde in Methanol extrahiert und durch seine Peak-Rückhaltezeit und Absorptionsspektren auf einer 25 cm Spherisorb ODS-1 5 μm Säule mittels Acetonitril/Methanol/2-Propanol (85:10:5) als Entwicklungslösungsmittel bei einer Strömungsrate von 1 ml/min identifiziert. Das aus dem systemisch infizierten Gewebe isolierte Phytoen hatte eine identische Rückhaltezeit zu Phytoen aus mit Norflurozon behandelten Pflanzen. Die Phytoenspitze von N. benthaminiana, das mit TTO1/PSY+ transfiziert war, hatte charakteristische optische maximale Absorptionsvermögen bei 276, 285 und 298 nm. Eine Woche nach der Beimpfung zeigten Pflanzen, die mit viraler kodierter Phytoensynthase transfiziert waren, eine hundertfache Steigerung des Phytoens im Vergleich zu den Niveaus in nicht infizierten Pflanzen, wie mittels HPLC-Abtrennung von Karotinoiden gemessen. Die Karotinoide wurden in Methanol extrahiert und durch die Peak-Rückhhaltezeit und Absorptionsspektren auf einer 25 cm Spherisorb ODS-1 5 μm Säule mittels Acetonitril/Methanol/2-Propanol (85:10:5) als Entwicklungslösungsmittel identifi ziert. Die Expression der Sense-RNA (TTO1A/PDS+) und Antisense-RNA (TTO1/PDS–) zu einer teilweisen Phytoendesaturase in transfizierten Pflanzen hemmte die Synthese von farbigen Karotinoiden und bewirkte die systemisch infizierten Blätter daran, einen weißen Phänotyp zu entwickeln. Die HPLC-Analyse dieser Pflanzen zeigte, dass auch sie hohe Niveaus an Phytoen ansammelten. Das Bleichen von Blättern wurde in Kontrollpflanzen reproduziert, die mit dem Herbizid Norflurozon, einem nicht kompetitiven Hemmer von Phytoendesaturase, behandelt wurden.
Beispiel 8
Isolierung einer unvollständigen cDNA, die für N. benthamiana-Phytoendesaturase kodiert
Ein unvollständiger cDNA-Klon, der für N. benthamiana-Phytoendesaturase kodiert, wurde aus jungem Blattgewebe isoliert. Der Nukleotidsequenzvergleich von 369 bp in den entsprechenden Regionen zwischen Tomaten- und N. benthamiana-Phytoendesaturase zeigt, dass sie 92% Ähnlichkeit zueinander haben (2). Da die beiden Pflanzengene Bereiche hoher Homologie aufweisen, kann die zytoplasmatische Hemmung des endogenen Pflanzengens mittels von Viren stammender Antisense-RNA durch die Bildung von hybriden, doppelsträngigen RNA-Molekülen auftreten. Die Runterregulation von Phytoendesaturase in mit TTO1A/PDS+ transfizierten Pflanzen kann durch direkte Interferenz während der Translation von mRNA in das Protein oder durch Doppelstränge, die zwischen mRNA und von Viren stammender Negativstrang-RNA gebildet wurden, bewirkt werden, obwohl der genaue Wirkmechanismus nicht bekannt sein muss, um die Erfindung durchzuführen.
Beispiel 9
Aufbau von TTO1- und TTO1A-Expressionsvektoren
Ein 861 bp langes Fragment (5524–6384) vom Tomatenmosaikvirus (Fruchtnekrosestamm F; ToMV-F), enthaltend den mutmaßlichen subgenomischen Hüllprotein-Promotor, das Hüllproteingen und das 3'-Ende, wurde mittels PCR unter Verwendung der ToMV-Primer 5' CTCGCAAAGTTTCGAACCAAATCCTC 3' (SEQ ID NO: 1) (vorwärts) und 5' CGGGGTACCTGGGCCCCAACCGGGGGTTCCGGGGG 3' (SEQ ID NO: 2) (rückwärts) isoliert und in die HincII-Stelle von pBluescript KS– subkloniert. Ein Hybridvirus, der aus TMV-U1 und ToMV-F bestand, wurde mittels Auslagern eines 874 bp langen XhoI-KpnI-ToMV-Fragments in pBGC152 gebildet (I. Pecker u.a., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 4962 (1992)), wodurch das Plasmid TTO1 erzeugt wurde. Das insertierte Fragment wurde mittels Didesoxynukleotidsequenzierung verifiziert. Eine einzelne AvrII-Stelle wurde abwärts der XhoI-Stelle in TTO1 mittels PCR-Mutagenese insertiert, wodurch das Plasmid TTO1A erzeugt wurde, und zwar mittels der folgenden Oligonukleotide: 5' TCCTCGAGCCTAGGCTCGCAAAGTTTCGAACCAAATCCTCA 3' (aufwärts) (SEQ ID NO: 3), 5' CGGGGTACCTGGGCCCCAACCGGGGGTTCCGGGGG 3' (SEQ ID NO: 2) (abwärts).
Beispiel 10
Aufbau von TTO1/PDS–, TTO1A/PDS+
Mittels PCR-Mutagenese wurde ein XhoI-Fragment, das für Tomatenphytoensynthase kodiert, von einem Lycopersicon esculentum-cDNA-Klon, der aus einer cDNA-Bibliothek einer reifenden Frucht isoliert wurde, amplifiziert und unter die Kontrolle des subgenomischen TMV-U1-Hüllprotein-Promotors durch Subklonieren in TTO1 gestellt.
Beispiel 11
Hemmung der Expression eines spezifischen endogenen Pflanzengens (Phytoendesaturase) mittels eines RNA-Virusvektors: Transfektion und Analyse von N. benthamiana I[TTO1/PDS–, TTO1A/PDS+
Infektiöse RNAs von TTO1A/PDS+, TTO1/PDS– wurden mittels In vitro-Transkription unter Verwendung von SP6-DNA-abhäniger RNA-Polymerase hergestellt und dazu verwendet, N. benthamiana mechanisch zu beimpfen. Die Hyb ridviren breiteten sich über alle nicht beimpften oberen Blätter aus, wie mittels Transmissionselektronenmikroskopie, Infektivitätsuntersuchung mittels lokaler Läsion und Polymerasekettenreaktion(PCR)-Amplifikation verifiziert. Die viralen Symptome bestanden aus einer Verformung der systemischen Blätter, Pflanzenverkrüppelung und leichter Chlorose. Die Blätter und Kelchblätter von TTO1/PDS^–-Pflanzen entwickelten einen weißen bleichen Phänotyp ähnlich dem mit dem Herbizid Norflurazon auftretenden. Der Aufbau der Chloroplasten von TTO1/PDS– transfizierten Pflanzen schien bei Analyse mittels Transmissionselektronenmikroskopie normal zu sein. Blätter von systemisch infizierten TTO1A/PDS+-Pflanzen entwickelten einen bleichen weißen Phänotyp ungefähr eine Woche später als die Blätter von Antisense-TTO1/PDS-Pflanzen und sammelten auch hohe Niveaus an Phytoen an.
Beispiel 12
Hemmung der Expression eines spezifischen endogenen Pflanzengens (Phytoensynthase) mittels RNA-Virusvektor: Transfektion und Analyse von N. benthamiana [TTO1/PSY–]
Infektiöse RNAs von TTO1/PSY– wurden durch In vitro-Transkription mittels SP6-DNA-abhängiger RNA-Polymerase hergestellt und dazu verwendet, N. benthamiana mechanisch zu beimpfen. Die Hybridviren breiteten sich über alle nicht beimpften oberen Blätter aus, wie mittels Transmissionselektronenmikroskopie, Infektivitätsuntersuchung mittels lokaler Läsion und Polymerasekettenreaktion(PCR)-Amplifikation verifiziert. Die viralen Symptome bestanden aus einer Verformung der systemischen Blätter, Pflanzenverkrüppelung und leichter Chlorose. Pflanzen, die mit TTO1/PSY+ transfiziert waren, zeigten einen mindestens 2-fachen Anstieg der Phytoensynthaseaktivität gegenüber Pflanzen, die mit Virusvektorkontrollen transfiziert waren (Daten nicht gezeigt). Blätter von systemisch infizierten TTO1/PDS+-Pflanzen entwickelten einen leuchtend organefarbenen Phänotyp und sammelten hohe Niveaus an Phytoen an (Tabelle 1). Die Blätter von TTO1/PDS^–-Pflanzen entwickelten einen bleichen weißen Phänotyp. Der Aufbau der Chloroplasten aus TTO1/PSY– schien bei Analyse mit Transmissi onselektronenmikroskopie normal zu sein. Blätter von systemisch infizierten TTO1A/PSY^–-Pflanzen sammelten kein Phytoen an.
Beispiel 13
Isolierung einer unvollständigen cDNA, die für N. benthamiana-Phytoendesaturase kodiert
Ein unvollständiger cDNA-Klon, der für N. benthamiana-Phytoendesatuase kodiert, wurde aus jungem Blattgewebe isoliert. Ein Nukleotidsequenzvergleich von 380 bp in den entsprechenden Bereichen zwischen Tomaten- und N. benthamiana-Phytoendesatuase zeigt, dass sie 92% Ähnlichkeit zueinander haben (2). Da die beiden Pflanzengene Bereiche hoher Homologie aufweisen, kann die zytoplasmatische Hemmung des endogenen Pflanzengens mittels von Viren stammender Antisense-RNA durch die Bildung von hybriden, doppelsträngigen RNA-Molekülen auftreten. Die Runterregulation von Phytoendesaturase in Pflanzen, die mit TTO1A/PDS+ transfiziert sind, kann durch direkte Interferenz während der Translation von mRNA in Protein oder durch Doppelstränge, die zwischen mRNA und von Viren stammenden Negativstrang-RNA gebildet sind, bewirkt werden.
Beispiel 14 (15)
Analyse von PDS-mRNA in Nicotina-Zellen, die von Tomaten-PDS stammende spezifische Antisense-RNA erzeugen
Es wurden reverse Transkriptase-PCR-Experimente, die das Vorhandensein oder Fehlen von feststellbaren PDS-mRNA-Transkripten in N. benthamiana-Zellen messen, enthaltend TTO1/PDS– (das PDS-Antisense-RNA erzeugt), durchgeführt. RNA wurde aus transfizierten Pflanzen durch das Verfahren von Gailiano u.a. isoliert. Die zur Detektion von TTO1/L. esculeutum verwendeten Primer waren 5'TAATCGATGATGATTCGGAGGCTAC3' (SEQ ID NO: 10) (vorwärts) 5'GGCACTCAACTTTATAAACC3' (SEQ ID NO: 8) (rückwärts). Die zur Erfassung von N. benthamiana-Transkripten verwendeten Primer waren 5'GGCACTCAACTTTATAAACC3' (SEQ ID NO: 8) (vorwärts) und 5'CTCCTTTAATTGTACTGCCA3' (SEQ ID NO: 11) (rückwärts). Mit den PCR-Versuchen war es nicht möglich, endogene PDS-mRNA in den durch Vektor transfizierten Pflanzen festzustellen, während das erwartete 452 bp lange Antisense-Transkript festgestellt werden konnte. Die 219 bp lange PDS-mRNA konnte nur in den nicht infizierten N. benthamiana-Pflanzen der Kontrolle festgestellt werden.

Claims

Viraler genetischer Vektor, der von einem positiven einzelsträngigen Virus stammt und zur Replikation im Zytoplasma einer Pflanzenzelle in der Lage ist, umfassend: a) einen ersten subgenomischen Pflanzenviruspromotor in funktionaler Kombination mit einer ersten Nukleinsäuresequenz, die für eine Antisense-RNA oder eine Kosuppressor-RNA kodiert, die für ein interessierendes Gen in einer Pflanze spezifisch ist, wobei die Transkription der ersten Nukleinsäuresequenz durch den ersten subgenomischen Pflanzenviruspromotor reguliert wird; und b) einen zweiten subgenomischen Pflanzenviruspromotor, der funktionsfähig mit einer zweiten Nukleinsäuresequenz verbunden ist, die für ein Pflanzenvirus-Hüllprotein kodiert, wobei die Transkription der zweiten Nukleinsäuresequenz durch den zweiten subgenomischen Pflanzenviruspromotor reguliert wird.
Vektor nach Anspruch 1, wobei der Vektor von einem positiv-strängigen einzelsträngigen RNA-Pflanzenvirus stammt.
Vektor nach Anspruch 1, wobei der erste und zweite subgenomische Promotor zueinander heterolog sind.
Vektor nach Anspruch 1, wobei das interessierende Gen Phytoendesaturase ist.
Vektor nach Anspruch 1, wobei das interessierende Gen Phytoensynthase ist.
Verfahren zur Erzeugung einer Pflanzenzelle mit reduzierter Expression eines interessierenden Gens, umfassend die Schritte der Transfektion einer Pflanzenzelle mit dem Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Nukleinsäuresequenz, die für eine Antisense-RNA oder eine Kosuppressor-RNA kodiert, für das interessierende Gen spezifisch ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Vektor von einem positiv-strängigen einzelsträngigen RNA-Pflanzenvirus stammt.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei der erste und zweite subgenomische Promotor zur Pflanzenzelle heterolog sind.
Verfahren zur Erzeugung einer Pflanzenzelle mit reduzierter Expression eines interessierenden Gens, umfassend die Schritte der Transfektion einer Zelle mit einem genetischen Vektor nach Anspruch 4 oder 5.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Pflanzenzelle eine Nicotiana-Zelle ist.
Pflanzenzelle umfassend einen Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 5.
Pflanzenzelle nach Anspruch 11, wobei der Vektor von einem einzelsträngigen RNA-Pflanzenvirus stammt.
Pflanzenzelle nach Anspruch 11, umfassend den Vektor von Anspruch 4 oder 5.
Pflanzenzelle nach Anspruch 13, wobei die Pflanzenzelle eine Nicotiana-Zelle ist.
Pflanze, umfassend eine Vielzahl von Zellen nach einem der Ansprüche 11 bis 14.