JPH09173069A - ４−クマル酸：補酵素ａリガーゼ遺伝子、及び該遺伝子を用いた植物中のリグニンの低減方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 植物中のリグニン生合成を抑制することので
きる組み換え遺伝子を構築し、該遺伝子を任意の植物に
導入することで、形質転換植物体中のリグニン含量を制
御する。 【解決手段】 植物から単離された４−クマル酸：補酵
素Ａリガーゼの遺伝子を用いて、植物で発現し得る新規
な遺伝子を作製し、これを植物に導入することで、形質
転換植物中のリグニン含量を減少させる。導入される遺
伝子は、プロモーター、４ＣＬ遺伝子の一部、又は全
部、及びターミネーターを持つ、４ＣＬのアンチセンス
遺伝子、又はセンス遺伝子であることが望ましい。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、植物の４−クマル酸：
補酵素Ａリガーゼ遺伝子（以下４ＣＬ遺伝子という場合
がある）、及び該遺伝子の全部、又はその一部を用いて
作製したアンチセンス遺伝子、又はセンス遺伝子を導入
することにより、形質転換植物中のリグニン含量を低減
せしめる方法及び同方法により作出された植物に関する
ものである。

【０００２】

【従来の技術】紙パルプ産業においては、主に木材チッ
プをアルカリ蒸解行程や各種薬剤を使用する漂白行程で
処理することにより、木材成分中のリグニンを溶出、除
去し、紙の原材料となるパルプを生産している。材料と
なる木材チップの蒸解適性は、チップ中のリグニン含量
やその分子構造に影響を受けるところが大きく、原料中
のリグニンの量や質を人為的に低下、変質することがで
きれば、パルプ生産におけるコストを大幅に減らすこと
が可能となる。

【０００３】また、飼料用の植物に関しては、植物中の
リグニン存在が家畜の胃腸中での飼料の消化性に悪影響
を与えることが知られており（特表平６−５１０４２９
号公報）低リグニン含量の飼料用作物が得られれば、食
肉、乳製品の生産性にも大きく貢献できる。

【０００４】このような観点に立ち、近年遺伝子組み換
え技術を用いて、リグニンの生合成に関与する酵素の遺
伝子の発現を不活化、或は抑制することにより最終生成
物であるリグニンの量を低減させる試みがなされてき
た。

【０００５】特表平６−５０９４６５号公報、及び特開
平６−１８１７７５号公報に見られる例では、植物中で
リグニン前駆体生合成の最終段階に関与すると考えられ
ている、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼをコー
ドする遺伝子の発現を抑制し、リグニン量のコントロー
ルを試みている。しかし、Ｃ. ハルピンらは、この方法
が、リグニンの絶対量を低減させる方法としては効果的
でないことを示している（Plant Journal, 6, 339-350,
1994 ）。

【０００６】また、１９９０年にはＣ. Ｊ. ラムらが、
マメのフェニルアラニンアンモニアリアーゼをコードす
るｃＤＮＡをカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロ
モーターに連結した遺伝子をタバコに導入したところ、
リグニン量の少ない形質転換タバコが得られたと報告し
ている。しかし、この方法により作出された形質転換タ
バコは、形態異常を起こしており、正常に生育しないた
め、この方法を広く植物の育種に利用することは実際上
非常に難しい。

【０００７】更に、Ｕ. Ｎ. ディベディらは、アスペン
から単離したS-アデノシル-L- メチオニン: カフェ酸/5
- ヒドロキシフェルラ酸 3/5-O- メチル- トランスフェ
ラーゼの遺伝子を用いてアンチセンス遺伝子を構築し、
タバコに導入したが、形質転換植物中のリグニンの分子
構造に変化が見られたものの、リグニンの絶対量にはほ
とんど変化がなかった（Plant Molecular Biology 26,
61-71, 1994 ）。

【０００８】遺伝子組み換え操作により、人為的に植物
細胞壁中のリグニン量を低下させた例は、１９９４年
に、Ｗ. ニイらがアルファルファのカフェ酸 3-O- メチ
ル- トランスフェラーゼ（以下ＯＭＴとする）の遺伝子
を用いたアンチセンス遺伝子を導入することにより、低
リグニン含量の形質転換タバコを作出している。しか
し、このＯＭＴは本発明で着目した４ＣＬとは全く別の
触媒機能を持つ酵素である。

【０００９】本発明で着目した４ＣＬの遺伝子は、１９
８８年にパセリにおいて初めてその塩基配列が報告され
た。その後ポテト、マメ、イネ、アラビドプシス等で単
離され、その一次構造が明らかにされてきた（Genetic
engineering of Plant Secondary Metabolism, Plenum
Press, 313-355, 1994）。しかし、タバコ４ＣＬ遺伝子
に関する報告は、現段階では本発明をおいて他にはな
い。

【００１０】上述のように、４ＣＬ遺伝子は複数の植物
種から単離されていたにも関わらず、この遺伝子をリグ
ニンの生合成を制御する為に応用された例はない。単離
された４ＣＬ遺伝子を用いて構築された各種の遺伝子を
植物に導入した例はあるが、形質転換植物中のリグニン
含量を低下させることに成功した報告はなされていな
い。

【００１１】１９９４年に行われた、1994 Annual Meet
ing of the American Society of Plant Physiologists
の要旨集の中で、 Ｄ. リーらはポテトの４ＣＬ遺伝子
を用いて構築したアンチセンス遺伝子、及びセンス遺伝
子をタバコに導入し、形質転換タバコ中に存在する４Ｃ
Ｌタンパク質の量を低下させたということを報告してい
るが、形質転換タバコ中のリグニンに関する記述は全く
ない（Supplement toPlant Physiology, 105, 37, 1994
）。

【００１２】

【本発明が解決しようとする課題】本発明は、リグニン
生合成に関与する新たな酵素の遺伝子に着目し、遺伝子
組み換え技術により該遺伝子の働きを変化させること
で、植物の細胞壁中に存在するリグニンの低減を行うこ
とを目的とするものである。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、これまで
に述べた状況に鑑み、鋭意努力の結果、ポリメラーゼチ
ェインリアクション（ＰＣＲ）を用いることによりタバ
コから４ＣＬをコードするｃＤＮＡを単離し、このｃＤ
ＮＡ断片を用いたアンチセンス、及びセンス遺伝子を植
物に導入することにより、形質転換植物中のリグニンを
低減させることができることを初めて見いだし、本発明
を完成させるに至った。

【００１４】即ち本発明は、植物から４−クマル酸：補
酵素Ａリガーゼ遺伝子を単離し、この遺伝子の少なくと
も１つの一部分、又は全部を含む遺伝子を新たに植物に
導入して形質転換植物を作り出すことにより、該形質転
換植物中のリグニン含量を低減せしめる方法にある。以
下、本発明の詳細を説明する。

【００１５】〈１〉使用され得る植物 本発明で使用できる植物は、細胞、組織、器官からの再
分化法が確立され、且つ遺伝子導入系が構築されている
のもであればいずれの植物種にも適用できる。特に、飼
料用作物、或いはEucalyptus( ユーカリ）属、Populus
（ポプラ）属、Acacia（アカシア）属、Pinus （マツ）
属等に分類される製紙原材料に供される林木を用いると
利用上の効果が著しい。

【００１６】〈２〉４ＣＬをコードする遺伝子 本発明で使用され得る４ＣＬの遺伝子は、植物由来であ
り、酵素番号のＥＣ６. ２. １. １２に分類される酵素
で、少なくとも４−クマル酸と補酵素Ａ（Coenzyme A、
或いは単にCoA といわれる）との間の化学結合の形成反
応を触媒する酵素のアミノ酸配列をコードする構造遺伝
子、その相補ＤＮＡ( ｃＤＮＡ) の一部、或いは全部を
含むものである。この遺伝子を単離するには、幾つかの
遺伝子クローニング方法を使用することができる。例え
ば、酵素を精製し、そのアミノ酸配列を決定し、この配
列をもとに合成ヌクレオチドを作製し、ハイブリダイゼ
ーション法により遺伝子ライブラリーから選択できる。

【００１７】また、酵素の精製を経ず、既知の遺伝子塩
基配列情報を基にポリメラーゼチェインリアクション
（以下ＰＣＲと略す）に用いるプライマーを作製し、Ｐ
ＣＲを行うことにより遺伝子の特定の領域、或いは全領
域を増幅し、単離する方法もある。

【００１８】〈３〉単離した遺伝子断片を用いたアンチ
センス遺伝子、及びセンス遺伝子のの構築 上記のようにして得られた遺伝子を用いて、適切なプロ
モーターとターミネーター配列の制御の元に、植物細胞
中で転写、発現し得る新規な遺伝子を構築することがで
きる。プロモーター領域に隣接して導入される４ＣＬの
遺伝子は、プロモーターに対して本来の向きとは逆方向
に（この場合をアンチセンス遺伝子と定義する）、又は
順方向（この場合をセンス遺伝子と定義する）に導入さ
れ得る。ここで言う逆方向とは、本来のアミノ酸配列を
規定する向きとは反対の向き、順方向とは本来のアミノ
酸を規定する向きのことを指す。導入される４ＣＬ遺伝
子はタンパク質コード領域、非コード領域のいずれも使
用できるが、コード領域を使用することが望ましい。

【００１９】本発明では、アンチセンス遺伝子、センス
遺伝子のいずれを使用した場合でもリグニン低減効果が
発揮されるが、特にセンス遺伝子を用いた場合がより効
果的である。

【００２０】プロモーターとしては、例えばカリフラワ
ーモザイクウィルス３５Ｓプロモーターや４ＣＬ遺伝子
に本来含まれているプロモーター部位を挙げることがで
きるが、植物の茎、特に木部組織で特異的に働くプロモ
ーターを使用すると一層効果が上がると考えられる。タ
ーミネーターとしては、植物細胞で機能するものであれ
ばよく、例えばノパリン合成酵素遺伝子のターミネータ
ーを挙げることができる。

【００２１】アンチセンス遺伝子、及びセンス遺伝子を
構築するために用いられる４ＣＬ遺伝子は、植物由来の
遺伝子であれば十分に機能すると考えられるが、特に形
質転換を行う植物と同じ属、又は同じ種に属する植物か
ら単離したものを利用することが望ましい。

【００２２】〈４〉構築した導入遺伝子の植物ゲノムへ
の組み込み 以上のようにして構築した導入遺伝子は、エレクトロポ
レーション法、パーティクルガンを用いる方法、及びア
グロバクテリウムを用いる方法等、化学的、物理的、生
物的方法を用いて植物のゲノムに導入することが可能で
ある。遺伝子が導入された植物細胞は、抗生物質等の薬
剤耐性の性質を利用することにより選抜され、再分化さ
せることができる。植物に導入された遺伝子は、本来植
物がゲノム中に持つ４ＣＬ遺伝子の働きを抑制し、正常
なリグニンの生合成を阻害する。

【００２３】

【作用】従って、本発明によれば、４ＣＬのアンチセン
ス遺伝子、及びセンス遺伝子、すなわち、４ＣＬ遺伝子
の少なくとも１つの一部分、又は、全部を含む遺伝子を
新たに植物に導入することにより、リグニン含量が低減
された形質転換植物を得ることができる。

【００２４】

【実施例】以下に、本発明の実施例を説明する。

【００２５】〈１〉植物材料 本実施例では、植物材料としてタバコ（Nicotiana taba
cum L.) のサムソン（Samsun）NN株とSR1 株を用いた。
両株ともに、種子を発芽させて得た苗を温室で栽培した
が、場合により無菌苗も作製した。

【００２６】〈２〉タバコ植物体由来のｃＤＮＡの合成 発芽後４ヶ月を経過したSamsun NN 株、及びSR1 株の植
物体の葉と茎を材料に各々独立にＲＮＡを抽出し、更に
カラムクロマトグラフィーによりポリ(A) ＋ＲＮＡを得
た。各々の株のポリ(A) ＋ＲＮＡ画分を材料に、ファル
マシア社製ｃＤＮＡ合成キットを用いて２本鎖ｃＤＮＡ
を合成し、SR1 株については得られたｃＤＮＡを更にス
トラタジーン社製のλＺＡＰIIベクターに連結して、パ
ッケージング処理し、ｃＤＮＡライブラリーを構築し
た。

【００２７】〈３〉４ＣＬのｃＤＮＡ単離の為のＰＣＲ
プライマーのデザイン タバコから４ＣＬをコードするｃＤＮＡを単離するため
に、既に報告されているパセリ、ポテト、マメ、及びイ
ネの４ＣＬ遺伝子のアミノ酸コード領域を比較し、これ
らの植物間で保存されている４ＣＬ中のアミノ酸配列を
探策した。そして、２つのアミノ酸配列の領域（Ala-Gl
n-Gln-Val-Asp-Gly 、及びGly-Glu-Ile-Cys-Ile-Arg ）
が、これらの植物間で保存されていることを突き止め、
これらのアミノ酸配列に対応する１７塩基からなるオリ
ゴヌクレオチド２本を化学合成したこれらの塩基配列
は、表１にある配列番号１、及び表２にある配列番号２
で示した。

【００２８】

【表１】 配列番号：１ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ＧＣＮＣＡＲＣＡＲＧＴＮＧＡＹＧＧ

【００２９】

【表２】 配列番号：２ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ＣＧＤＡＴＲＣＡＤＡＴＹＴＣＮＣＣ

【００３０】〈４〉タバコ４ＣＬのｃＤＮＡ部分断片の
単離 上記のように作製したオリゴヌクレオチドをプライマー
に、サムソン NN 株由来のc ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ
を行った。反応条件は、変性を９４℃、３０秒、プライ
マーと鋳型とのアニールを４６℃、３０秒、伸長反応を
７４℃、９０秒の条件で行った。反応には、宝酒造社製
のＴａｑポリメラーゼを用いた。反応液の一部を１. ８
％アガロースゲルの電気泳動で分離したところ、予想し
たサイズにＤＮＡの増幅物が認められた。増幅断片をア
ガロースより切り出し、末端を平滑処理した後に、宝酒
造社製のプラスミドベクターｐＵＣ１９のＳｍａ I部位
にクローニングした。クローニングしたＤＮＡサンプル
を２０個拾い出し、これらを制限酵素を用いて解析した
ところ、増幅断片中には異なる塩基配列を持つＤＮＡ断
片が少なくとも３種存在することが示唆された。更に、
これらの異なる断片の候補の塩基配列をダイデオキシ法
により決定したところ、増幅断片には表３と表４にある
配列番号３、及び表５と表６にある配列番号４で示した
２種の異なるＤＮＡ断片の存在が確認された。これらの
ＤＮＡ断片は５４２塩基対からなっており、その塩基配
列は既に知られている双子葉植物の４ＣＬ遺伝子の塩基
配列との７５％以上の高い相同性を有していた。このこ
とから、増幅されたＤＮＡはタバコの４ＣＬをコードす
るｃＤＮＡの一部であると結論した。尚、配列番号３、
及び配列番号４で表されるＤＮＡを含むプラスミドを保
持した大腸菌を通産省工業技術院生命工学技術研究所の
特許微生物寄託センターに寄託した。配列番号３のＤＮ
Ａを含むプラスミドを保持する大腸菌（識別の為の表示
ＮＴ４ＣＬ２）についてはＦＥＲＭ Ｐ−１５３３６、
配列番号４のＤＮＡを含むプラスミドを保持する大腸菌
（識別の為の表示ＮＴ４ＣＬ６）についてはＦＥＲＭ
Ｐ−１５３３７の寄託番号で登録されている。

【００３１】

【表３】 配列番号：３ 配列の長さ：５４２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 生物名：Nicotiana tabacum L. 株名：Samsun NN

【００３２】

【表４】 配列 GCGCAACAGG TTGACGGTGA AAATGCGAAT TTGTATATGC ACAGTGAGGA TGTATTGATG 60 TGTGTGTTGC CTTTGTTCCA TATATACTCA CTCAATTCCA TTTTGCTTTG TGGATTGAGA 120 GTCGGTGCAG CGATTTTGAT TATGCAGAAA TTTGACATTG CTCCGTTCCT GGAGTTAATA 180 CAGAAGTATA AGGTGTCAAT TGGGCCATTT GTGCCGCCTA TTGTTCTGGC TATTGCTAAG 240 AGTCCAATTG TTGATAGCTA TGATCTTTCC TCAGTAAGGA CTGTCATGTC TGGGGCTGCA 300 CCATTAGGAA AAGAACTCGA AGACGCTTGT GAGAACCAAA TCCCTAACGC TAAACTTGGC 360 CAGGGTTATG GAATGACGGA AGCTGGGCCG GTGTTGGCAA TGTGTTTGGC ATTTGCAAAA 420 GAACCCTTTG ATATTAAATC AGGGGCATGT GGTACTGTTG TGAGGAACGC CGAGATGAAA 480 ATTGTAGATC CGGATACGGG TTGCTCTCTT CCTCGTAACC AACCCGGTGA GATCTGCATC 540 CG 542

【００３３】

【表５】 配列番号：４ 配列の長さ：５４２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 生物名：Nicotiana tabacum L. 株名：Samsun NN

【００３４】

【表６】 配列 GCGCAACAAG TTGATGGTGA AAACCCTAAT CTTTATTTCA ATAGTGAAGA TGTGATTATG 60 TGTGTTTTGC CATTGTTTCA TATTTATTCA CTCAATTCTG TGTTGCTTTG TGGGCTAAGA 120 GTTGGGGCAA CAATTTTGAT AATGCAAAAG TTTGAGATTA AAGGATTAAT GGAGCTAGTA 180 GAGAAATATA AAGTGACAAT TGCACCATTT GTGCCGCCTA TAGTTTTGGC TATAGCAAAA 240 AGTCCATTGG TCGATAAATA TGATTTGTCA AGTATAAGGA TGATAATGTC TGGGGCTGCA 300 CCAATGGGGA AAGAGCTTGA AGATACTGTT AGAGCTAAAC TGCCAAATGC CATACTAGGA 360 CAGGGATATG GAATGACTGA AGCAGGTCCT GTGTTATCAA TGTGTCTAGC TTTTGCAAAA 420 CAACAGTTTG AAGTCAAGTC TGGATCCTGT GGGACAGTTG TTCGGAACGC TGAGATGAAG 480 ATCGTCGACA CCAACACCGG TGCGTCGCTT CCCCGGAATC ATGCCGGAGA AATCTGCATC 540 CG 542

【００３５】〈５〉４ＣＬｃＤＮＡの全長鎖の単離 他の植物由来の４ＣＬ遺伝子と高い相同性を持つｃＤＮ
Ａ断片が得られたため、このｃＤＮＡ断片の塩基配列を
基に更にＰＣＲプライマーを作製し、得られたｃＤＮＡ
断片に対して５´側、及び３´側に相当する塩基配列の
未知のｃＤＮＡ部分を増幅した。ＰＣＲの鋳型には、SR
1 株由来のｃＤＮＡを用いて作製したｃＤＮＡライブラ
リーからファージＤＮＡを調製し、これを用いた。未知
の５´領域、及び３´領域に相当する部分に対応するＰ
ＣＲプライマーは、ストラタジーン社製のブルースクリ
プトIIファージミドベクター用のマルチプルクローニン
グ領域の塩基配列を持つ１７塩基のオリゴヌクレオチド
を使用した。反応条件は、変性９４℃、３０秒、アニー
ル６０℃、３０秒、伸長反応７４℃、９０秒の条件で行
った。ＰＣＲ反応の結果、ｃＤＮＡの未知な５´領域、
及び３´領域に相当するｃＤＮＡ部分が得られたので、
更にこれらの塩基配列情報を基にＰＣＲプライマーを作
製し、先と同様の条件でＰＣＲを行うことで、最終的に
表７から表１２にある配列番号５に示した１８６０塩基
対からなるｃＤＮＡを得た。得られた全長鎖ｃＤＮＡ
は、その末端を平滑化した後に、プラスミドベクターｐ
ＵＣ１９のＳｍａ Ｉ部位に導入し、このベクターをｐ
ＮＴ４ＣＬ１と命名した。尚、ｐＮＴ４ＣＬ１を保持す
る大腸菌についても、通産省工業技術院生命工学技術研
究所の特許微生物寄託センターに寄託した（識別の為の
表示ＮＴ４ＣＬ１８、寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５３３
８）。

【００３６】

【表７】 配列番号：５ 配列の長さ：１８６０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 生物名：Nicotiana tabacum L. 株名：SR1 配列の特徴 特徴を示す記号：ＣＤＳ 存在位置：1..1629 特徴を決定した方法：Ｓ

【００３７】

【表８】 配列 ATG GAG AAA GAT ACA AAA CAT GGC GAT ATA ATT TTC AGA TCA AAA CTC 48 Met Glu Lys Asp Thr Lys His Gly Asp Ile Ile Phe Arg Ser Lys Leu 5 10 15 CCT GAT ATT TAC ATC CCT AAT CAT CTT CCT TTA CAC TCT TAC TGC TTT 96 Pro Asp Ile Tyr Ile Pro Asn His Leu Pro Leu His Ser Tyr Cys Phe 20 25 30 GAA AAC ATT TCA GAG TTC AGT TCT CGA CCT TGT TTA ATC AAT GGA GCC 144 Glu Asn Ile Ser Glu Phe Ser Ser Arg Pro Cys Leu Ile Asn Gly Ala 35 40 45 AAC AAA CAA ATT TAT ACG TAT GCT GAT GTT GAA CTC AGT TCA AGA AAA 192 Asn Lys Gln Ile Tyr Thr Tyr Ala Asp Val Glu Leu Ser Ser Arg Lys 50 55 60 GTT GCT GCT GGT CTT CAC AAA CAA GGG ATC CAA CAA AAG GAT ACA ATC 240 Val Ala Ala Gly Leu His Lys Gln Gly Ile Gln Gln Lys Asp Thr Ile 65 70 75 80 ATG ATC CTA TTG CCT AAC TCC CCA GAA TTT GTG TTT GCT TTC ATT GGT 288 Met Ile Leu Leu Pro Asn Ser Pro Glu Phe Val Phe Ala Phe Ile Gly 85 90 95 GCA TCG TAC CTT GGA GCT ATT TCT ACA ATG GCC AAT CCT TTG TTT ACG 336 Ala Ser Tyr Leu Gly Ala Ile Ser Thr Met Ala Asn Pro Leu Phe Thr 100 105 110 GCC GCT GAG GTT GTG AAG CAA GTC AAG GCT TCT GGT GCT AAG ATC ATT 384 Ala Ala Glu Val Val Lys Gln Val Lys Ala Ser Gly Ala Lys Ile Ile 115 120 125

【００３８】

【表９】 GTC ACA CAA GCG TGT CAT GTT AAC AAA GTG AAA GAT TAT GCT TTG GAG 432 Val Thr Gln Ala Cys His Val Asn Lys Val Lys Asp Tyr Ala Leu Glu 130 135 140 AAT AAT GTT AAG ATC ATA TGC ATC GAC TCG GCA CCG GAG GGT TGT CTC 480 Asn Asn Val Lys Ile Ile Cys Ile Asp Ser Ala Pro Glu Gly Cys Leu 145 150 155 160 CAC TTC TCC GTG CTA ACT CAG GCC GAT GAG CAC GAT ATT CCT GAG GTA 528 His Phe Ser Val Leu Thr Gln Ala Asp Glu His Asp Ile Pro Glu Val 165 170 175 GAA ATC CAA CCC GAT GAT GTG GTG GCG TTG CCC TAC TCC TCT GGG ACG 576 Glu Ile Gln Pro Asp Asp Val Val Ala Leu Pro Tyr Ser Ser Gly Thr 180 185 190 ACT GGA TTA CCT AAA GGA GTG ATG TTG ACA CAC AAG GGA CTT GTC ACA 624 Thr Gly Leu Pro Lys Gly Val Met Leu Thr His Lys Gly Leu Val Thr 195 200 205 AGC GTG GCA CAA CAA GTC GAT GGT GAA AAT CGG AAT TTG TAT ATC CAT 672 Ser Val Ala Gln Gln Val Asp Gly Glu Asn Arg Asn Leu Tyr Ile His 210 215 220 AGC GAG GAC GTG TTG CTT TGT GTC TTG CCC TTG TTT CAT ATC TAT TCC 720 Ser Glu Asp Val Leu Leu Cys Val Leu Pro Leu Phe His Ile Tyr Ser 225 230 235 240 CTC AAC TCC GTT TTG CTT TGT GGA TTA AGG GTT GGA GCA GCG ATT TTG 768 Leu Asn Ser Val Leu Leu Cys Gly Leu Arg Val Gly Ala Ala Ile Leu 245 250 255

【００３９】

【表１０】 ATT ATG CAG AAA TTT GAT ATT GTT CCA TTC TTG GAG TTG ATA CAA AAT 816 Ile Met Gln Lys Phe Asp Ile Val Pro Phe Leu Glu Leu Ile Gln Asn 260 265 270 TAC AAG GTG ACA ATA GGG CCG TTT GTA CCG CCT ATT GTC TTG GCC ATT 864 Tyr Lys Val Thr Ile Gly Pro Phe Val Pro Pro Ile Val Leu Ala Ile 275 280 285 GCT AAG AGT CCT ATG GTT GAT GAT TAT GAT CTT TCA TCA GTA AGA ACT 912 Ala Lys Ser Pro Met Val Asp Asp Tyr Asp Leu Ser Ser Val Arg Thr 290 295 300 GTC ATG TCT GGG GCT GCA CCA TTA GGA AAG GAG CTT GAA GAC ACT GTT 960 Val Met Ser Gly Ala Ala Pro Leu Gly Lys Glu Leu Glu Asp Thr Val 305 310 315 320 CGA GCC AAA TTT CCT AAT GCT AAA CTT GGT CAG GGT TAT GGT ATG ACA 1008 Arg Ala Lys Phe Pro Asn Ala Lys Leu Gly Gln Gly Tyr Gly Met Thr 325 330 335 GAA GCT GGA CCA GTG TTG GCA ATG TGC TTG GCA TTT GCA AAA GAA CCC 1056 Glu Ala Gly Pro Val Leu Ala Met Cys Leu Ala Phe Ala Lys Glu Pro 340 345 350 TTT GAA ATA AAA TCA GGG GCA TGT GGG ACA GTT GTG AGA AAT GCT GAG 1104 Phe Glu Ile Lys Ser Gly Ala Cys Gly Thr Val Val Arg Asn Ala Glu 355 360 365 ATG AAA ATT GTG GAT CCT GAA ACT GGT AAT TCT CTT CCC AGG AAT CAG 1152 Met Lys Ile Val Asp Pro Glu Thr Gly Asn Ser Leu Pro Arg Asn Gln 370 375 380

【００４０】

【表１１】 TCT GGA GAA ATT TGC ATA AGA GGA GAC CAA ATC ATG AAA GGC TAC CTG 1200 Ser Gly Glu Ile Cys Ile Arg Gly Asp Gln Ile Met Lys Gly Tyr Leu 385 390 395 400 AAT GAT CCA GAG GCC ACA GCA AGA ACA ATA GAC AAA GAA GGA TGG TTA 1248 Asn Asp Pro Glu Ala Thr Ala Arg Thr Ile Asp Lys Glu Gly Trp Leu 405 410 415 TAT ACA GGT GAC ATT GGC TAT ATT GAT GAT GAC GAC GAG CTT TTT ATT 1296 Tyr Thr Gly Asp Ile Gly Tyr Ile Asp Asp Asp Asp Glu Leu Phe Ile 420 425 430 GTG GAT CGA TTG AAG GAG CTG ATT AAA TAC AAA GGA TTT CAA GTT GCA 1344 Val Asp Arg Leu Lys Glu Leu Ile Lys Tyr Lys Gly Phe Gln Val Ala 435 440 445 CCT GCT GAG CTC GAA GCT CTC CTT CTC AAC CAT CCA ACA TTT TCT GAT 1392 Pro Ala Glu Leu Glu Ala Leu Leu Leu Asn His Pro Thr Phe Ser Asp 450 455 460 GCT GCT GTT GTC CCC ATG AAA GAC GAA CAA GCG GAA GAA GTT CCA GTG 1440 Ala Ala Val Val Pro Met Lys Asp Glu Gln Ala Glu Glu Val Pro Val 465 470 475 480 GCT TTT GTT GTT AGA TCC AGT GGA TCC ACC ATT ACT GAA GAT GAA GTC 1488 Ala Phe Val Val Arg Ser Ser Gly Ser Thr Ile Thr Glu Asp Glu Val 485 490 495 AAG GAT TTC ATC TCA AAG CAG GTG ATA TTT TAT AAG AGG ATA AAG CGG 1536 Lys Asp Phe Ile Ser Lys Gln Val Ile Phe Tyr Lys Arg Ile Lys Arg 500 505 510

【００４１】

【表１２】 GTA TTT TTC GTG GAT GCT GTT CCT AAA TCT CCA TCT GGC AAA ATC CTT 1584 Val Phe Phe Val Asp Ala Val Pro Lys Ser Pro Ser Gly Lys Ile Leu 515 520 525 CGA AAA GAT TTG AGA GCT AAA CTG GCT GCT GGG CTT CCA AAT 1626 Arg Lys Asp Leu Arg Ala Lys Leu Ala Ala Gly Leu Pro Asn 530 535 540 TAATACTTTCAGTTTAGCTTTAATAGTGGCAATAACTATAACCAGTTCGCCATTGAAGACAAT 1690 TTATTTTTTATTAAAATGTTACATAATATGTTCTTTTGATTGTACCTTCAACTACGTGCCTCT 1754 TCGGTCAGAATTAATTTACCGAATTGGCAAAAGGAGGAAAATGTATGTAAATTTGACTGTAAG 1818 AACTTCAATTTTTTAAATGTCTTTTTGGTATTATTTTATTC 1860

【００４２】〈６〉４ＣＬｃＤＮＡの同定 上記の方法で得られたｃＤＮＡがタバコの４ＣＬをコー
ドしているか、否かを確かめるために、得られたｃＤＮ
Ａ全長鎖をファルマシア社製の発現ベクターｐＴｒｃ９
９Ａに読み枠を合わせて結合させたベクターｐＴＣＬＦ
１を作製した。このｐＴＣＬＦ１を大腸菌ＪＭ１０９株
に導入して、ｃＤＮＡにコードされる蛋白質を生産させ
た。ｐＴＣＬＦ１で形質転換した大腸菌の菌体破砕液を
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミド
電気泳動にかけ、分離したタンパク質を和光純薬社製の
銀染色キットを用いて染色したところ、分子量約６０キ
ロダルトンの新たなタンパク質が生産されていた。更
に、電気泳動に供した菌体破砕液中には４ＣＬの活性が
検出された。尚、ｃＤＮＡを組み込んでいない発現ベク
ターｐＴｒｃ９９Ａで形質転換した大腸菌の菌体破砕液
からは４ＣＬ活性は検出されず、また、ＳＤＳポリアク
リルアミド電気泳動後の染色でも新たなタンパク質の生
産は認められなかった。以上のことから、配列番号５に
塩基配列を示したｃＤＮＡは、タバコの４ＣＬをコード
していることが明らかとなった。

【００４３】〈７〉単離した４ＣＬｃＤＮＡを用いたア
ンチセンス遺伝子、及びセンス遺伝子の構築 始めに、
クローンテック社製のＴｉプラスミドベクターｐＢＩ１
２１からＧＵＳ遺伝子を制限酵素消化によって除去し、
ＧＵＳ遺伝子の除かれたプラスミドベクターをセルフラ
イゲーションして得たＴｉプラスミドベクターをｐＢＩ
１２１ＤＧと命名した。次にｐＮＴ４ＣＬ１を制限酵素
Ｘｂａ Iで消化し、タバコ４ＣＬｃＤＮＡの全領域を取
り出した。そして、このｃＤＮＡ断片をｐＢＩ１２１Ｄ
Ｇ上のカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモータ
ーに対して逆方向、及び順方向に導入した。ここで、逆
方向とは、本来のアミノ酸配列を規定する向きとは反対
の向き、順方向とは、本来のアミノ酸配列を規定する向
きのことを指す。タバコ４ＣＬｃＤＮＡを逆方向に導入
して得られたプラスミドＤＮＡをｐＡＮＴ４ＣＬ、順方
向に導入して得られたそれをｐＳＮＴ４ＣＬと命名し
た。即ち、ｐＡＮＴ４ＣＬはタバコ４ＣＬのアンチセン
ス遺伝子を、ｐＳＮＴ４ＣＬはタバコ４ＣＬのセンス遺
伝子をも持つＴｉプラスミドベクターである。

【００４４】〈８〉タバコアンチセンス遺伝子、及びセ
ンス遺伝子の植物への組み込み ｐＡＮＴ４ＣＬ、又はｐＳＮＴ４ＣＬを保持するアグロ
バクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４株を用
いて、タバコSR1 株に４ＣＬアンチセンス、及びセンス
ＤＮＡを導入し、形質転換植物体を得た。また、ｐＢＩ
１２１ＤＧを保持するアグロバクテリウム・ツメファシ
エンスＬＢＡ４４０４株を用いて形質転換植物体を得、
これを対照とした。上記のように作製した遺伝子を用い
てタバコを形質転換し、対照個体４個体（表１３中の個
体番号＃１〜＃４で表される）、アンチセンス４ＣＬ遺
伝子を導入した形質転換体５個体（表１３中の個体番号
＃５〜＃９で表される）、及びセンス４ＣＬ遺伝子を導
入した形質転換植物体５個体（表１３中の個体番号＃１
０〜＃１４で表される）を得た。これらに各々の遺伝子
が導入されていることは、各個体由来の全ＤＮＡを用い
たサザン解析、ＰＣＲ解析によって確かめた。

【００４５】〈９〉形質転換植物中のリグニン分析 形質転換植物を節間数が１２になるまで成長させた後、
各植物体の茎から木部組織を取り出し、摩砕処理して木
粉を得た。この木粉をソックスレー抽出器中、エタノー
ル・トルエン混合液（エタノール１容：トルエン２
容）、エタノール、熱水で順次抽出処理し、残さを１週
間真空乾燥した。以上の操作によって得られた脱脂木粉
中のリグニンを、アセチルブロマイド法（Wood Sci. Te
chnol., 22,271-280, 1988 ）により定量した。その結
果を表１３に示した。

【００４６】

【表１３】 注釈： ｐＡＮＴ４ＣＬは、タバコ４ＣＬのアンチセンス遺伝子を 含むプラスミドＤＮＡである。 ｐＳＮＴ４ＣＬは、タバコ４ＣＬのセンス遺伝子を含むプ ラスミドＤＮＡである。

【００４７】アンチセンス遺伝子を導入した形質転換個
体では、個体の木部組織中に存在するリグニンが、対照
個体の平均値に対して最大で約１８％減少していた。ま
た、センス遺伝子を導入した形質転換個体では、対照個
体に対して最大で約３４％のリグニン量の減少が確認さ
れた。

【００４８】

【発明の効果】本発明により、４ＣＬ遺伝子を用いたア
ンチセンス遺伝子、或はセンス遺伝子を植物に導入する
ことにより、形質転換植物中のリグニン含量を低下させ
ることができる。このことは、パルプ製造において、リ
グニン除去に必要なエネルギー、各種薬品の所要量を減
少させ、その結果として生産コストの低減をもたらす。
また、低リグニン含量の飼料用植物の育種が可能になっ
たことで、易消化性の飼料を供給でき、畜産業の生産性
向上に寄与することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｄ２１Ｃ 9/00 Ａ０１Ｈ 1/00 Ａ // Ａ０１Ｈ 1/00 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｓ 3/08 Ｃ１２Ｓ 3/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 植物中に存在する４−クマル酸：補酵素
   Ａリガーゼ遺伝子の少なくとも１つの一部分、又は全部
   を含む遺伝子を新たに植物に導入し、植物中のリグニン
   を低減させる方法。
2. 【請求項２】 新たに植物に導入する遺伝子が、４−ク
   マル酸：補酵素Ａリガーゼ遺伝子の少なくとも１つの一
   部分、或は全部を含むアンチセンス遺伝子である請求項
   １に記載の方法。
3. 【請求項３】 新たに植物に導入する遺伝子が、４−ク
   マル酸：補酵素Ａリガーゼ遺伝子の少なくとも１つの一
   部分、或は全部を含むセンス遺伝子である請求項１に記
   載の方法。
4. 【請求項４】 ４−クマル酸：補酵素Ａリガーゼ遺伝子
   がｃＤＮＡである、請求項１、２、又は３に記載の方
   法。
5. 【請求項５】 新たに導入する遺伝子が、遺伝子を導入
   される植物と同じ属に分類される植物に由来する４−ク
   マル酸：補酵素Ａリガーゼ遺伝子の少なくとも１つの一
   部分、又は全部を含む、請求項１、２、又は３に記載の
   方法。
6. 【請求項６】 新たに導入する遺伝子が、遺伝子を導入
   される植物と同じ種に分類される植物に由来する４−ク
   マル酸：補酵素Ａリガーゼ遺伝子の少なくとも１つの一
   部分、又は全部を含む、請求項１、２、又は３に記載の
   方法。
7. 【請求項７】 配列番号３（塩基番号１〜５４２）に示
   した塩基配列を有する４−クマル酸：補酵素Ａリガーゼ
   遺伝子。
8. 【請求項８】 配列番号４（塩基番号１〜５４２）に示
   した塩基配列を有する４−クマル酸：補酵素Ａリガーゼ
   遺伝子。
9. 【請求項９】 配列番号５（アミノ酸番号１〜５４２）
   で示したアミノ酸配列をコードする４−クマル酸：補酵
   素Ａリガーゼ遺伝子。
10. 【請求項１０】 配列番号５に示されるアミノ酸（アミ
    ノ酸番号１〜５４２）を有するタバコ由来の４−クマル
    酸：補酵素Ａリガーゼ。
11. 【請求項１１】 請求項７、８又は９のいずれかに記載
    の４−クマル酸：補酵素Ａリガーゼ遺伝子の一部、又は
    全部を含有する遺伝子。
12. 【請求項１２】 ４−クマル酸：補酵素Ａリガーゼ遺伝
    子が、請求項７、８、又は９のいずれかに記載の遺伝子
    である請求項１、２、又は３に記載の方法。
13. 【請求項１３】 請求項１２に記載の方法により作出さ
    れた植物。