CN102154313B - 棉花原花色素合成调控基因GhPAPMYB1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了源自棉花的原花色素合成调控基因GhPAPMYB1，该基因编码的多肽以及含有该基因的表达载体。本发明还提供了所述GhPAPMYB1基因在促进植物中原花色素的合成和积累中的应用。通过应用该基因及其植物表达载体可以培育含不同水平原花色素的植物品系(种)，提高植物产品的营养价值和外观品质。

Description

棉花原花色素合成调控基因GhPAPMYB1及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种促进棉花原花色素合成和累积的基因GhPAPMYB1。本发明还涉及该基因编码的多肽，含有该基因的表达载体，以及该基因在促进棉花和其他植物原花色素合成和积累中的应用。

背景技术

原花色素(Proanthocyanidin，PA)，又称缩合鞣质或缩合单宁，是一类重要的植物次生代谢产物。它在自然界植物中广泛存在，是种皮的主要色素物质，对种子发育和萌发有着重要的调节作用。PA是黄烷3-醇的单体或多聚体，属于多羟基酚类物质，具有强烈的蛋白变性作用，有独特的苦涩味。在茎、叶片等器官中累积的PA具有抗菌和阻食的作用，是植物抵抗病害和动物取食的重要手段。饲料植物(如苜蓿)中适当水平的PA可以防止牲畜的胀气病(Pasturebloat)。PA也广泛存在于人类的食物和饮料(如茶、果汁、葡萄酒等)中，具有抗氧化、抗炎、抗癌等作用，广泛应用于食品、化妆品、保健品和医药等行业。因此，利用基因工程技术在植物中激活或修饰PA合成，改变植物产品中的PA含量，有着广阔的应用前景。

高等植物的PA合成属于苯丙烷途径的一个支路，从苯丙氨酸到最终产物PA是一个由多步生化反应组成的复杂生物合成途径。每步反应均由不同结构基因编码的酶催化。对拟南芥种皮PA合成的研究表明植物PA合成主要受R₂R₃-MYB、WD40和bHLH三类转录因子调控。这些转录因子相互作用形成复合体结合到结构基因启动子上，激活PA结构基因的表达，从而促进PA的合成和累积。拟南芥中编码PA相关的R₂R₃-MYB、WD40和bHLH蛋白的基因分别是TT2、TT8和TTG1，其中TT2专一调控PA合成，并能促进TT8的表达；而TT8和TTG1还参与其他生理过程(如花色素合成、表皮毛决定等)的调控。因此，相对于bHLH和WD40蛋白，R₂R₃-MYB蛋白专一性更强，在植物花PA合成中起到关键的中心调控作用。

天然彩色棉亦称有色棉，本身具有天然色彩，不需染色即可直接进行纺织加工，从而大大减少了印染工序导致的环境污染及化学染料对人体健康的危害。目前能应用的天然彩色棉主要是棕色和绿色两种，色彩单一且产量低，品质较差，很难在市场上与白色棉花竞争。前期研究中，我们发现PA是棕色棉花纤维的主要色素物质(Xiao等，2007)。本发明利用同源克隆的方法从棉花棕色纤维中克隆了一个拟南芥TT2同源的能促进棉花PA合成的R₂R₃-MYB蛋白基因(GhPAPMYB1，Gossypium hirsutum proanthocyanidin promoting MYB)。序列分析表明该基因是一个新的TT2同源基因(图1)，且与棕色纤维共分离(图2)。表达分析表明GhPAPMYB1基因在棕色纤维中特异高表达，可能与棕色纤维中的PA合成相关(图3)。转基因研究表明，该基因的上调表达能够促进棉花体内的PA结构基因的表达和PA的合成与累积(图4和图5)。GhPAPMYB1基因的克隆和功能验证为在棉花和其他植物中对PA合成进行转基因调控奠定了基础。利用棉花纤维特异启动子控制GhPAPMYB1基因的表达有可能在棉花纤维中特异合成和累积PA，打破棕色纤维与不良性状的紧密连锁，从而创建优质高产的转基因棕色棉品系(种)。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种促进棉花和其他植物原花色素(PA)合成和累积的基因GhPAPMYB1。

本发明的另一个目的是提供一种上述基因编码的蛋白质。

本发明的再一个目的是提供含有上述基因序列的表达载体。

本发明的进一步目的是提供上述基因在农业、林业、牧业的作物育种中的应用，即促进植物原花色素合成和积累。

本发明也提供上述基因在制备转基因植物中的应用。

根据本发明的一方面，所述促进植物原花色素合成和累积的基因是棉花原花色素合成调控基因GhPAPMYB1，采用基因工程技术从棉花(Gossypiumhirsutum)中分离得到，其超量表达能够促进棉花体内的PA结构基因的表达以及PA的合成和积累。所述基因的核苷酸序列为下述核苷酸序列之一：

1)如SEQ ID NO.1所示的DNA序列；

2)如SEQ ID NO.2所示的DNA序列；

此外，与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的DNA序列具有98％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列也在本发明考虑范围之内。

根据本发明的另一方面，提供由上述基因GhPAPMYB1编码的蛋白质，其为如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；或者将SEQ ID NO.3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID NO.3的氨基酸序列相同生物活性的由SEQ ID NO.3衍生的蛋白质。

SEQ ID NO.1所示的DNA序列是棉花GhPAPMYB1基因的基因组DNA核苷酸序列，由1067个碱基组成；SEQ ID NO.2所示的DNA序列为棉花GhPAPMYB1基因的cDNA核苷酸序列，由906个碱基组成。SEQ ID NO.2为SEQ ID NO.1去除内含子序列后的cDNA序列。两个序列编码序列表中由271个氨基酸残基组成的蛋白质序列SEQ ID NO.3。

根据本发明的另一方面，本发明亦提供包含一种或多种上述基因的重组载体，以及包含上述重组载体的宿主细胞。所述重组载体是至少含有上述一种或多种基因以及组成型或组织特异型启动子的植物表达载体。在一种实施方案中，将SEQ ID NO.1所示的DNA或SEQ ID NO.2所示的cDNA构建在CaMV35S启动子下游，得到重组的植物表达载体(其结构如图5所示)或者用组织特异型启动子替换CaMV35S启动子而得到植物表达载体。进一步地，通过所述植物表达载体转染宿主而获得的转化体也属于本发明的范围。例如，本发明的植物表达载体利用电击法和冻融法等方法转化农杆菌即会得到含有该表达载体的农杆菌菌株。

本发明还提供了所述新基因GhPAPMYB1在促进植物中原花色素(PA)的合成和积累中应用，以及在制备转基因植物中的应用，典型地是在改良植物产品的营养价值和外观品质的新用途。本发明成功构建含有GhPAPMYB1基因的植物表达载体，并以该表达载体转化棉花获得转基因棉花，经分析发现，超量表达GhMYPAP1基因能够促进PA在棉花体内的合成和累积，提高了棉花中PA物质的含量。因此该基因的表达可以在转基因植物的组织器官中激活PA合成，从而获得具有高含量PA的植物材料，培育含不同水平原花色素的植物品系(种)，改良植物产品的营养价值和外观品质。

附图说明

图1：棉花GhPAPMYB1基因与MYB36的序列比较和基因组来源

A，棉花GhPAPMYB1与MYB36两个基因在编码区的序列比较。除20个碱基差异外，GhPAPMYB1基因在ATG上游比MYB36基因少8个AG重复，二者总共有95.8％的碱基相同。

B，用两个特异引物(PAPMYB1-SF与MYB36-SF)区分GhPAPMYB1与MYB36两个基因并检测其染色体组来源。模板DNA来自T586(T)、渝棉1号(Y)、亚洲棉(A)和雷蒙德氏棉(D)。T和Y为陆地棉含A、D两个染色体组；A和D为陆地棉的两个二倍体祖先种，分别提供A染色体组和D染色体组。结果表明GhPAPMYB1与MYB36两个基因来源于A和D两个不同的染色体组。M为DNA分子量标准，各个片段的长度标于图右。

C，棉花GhPAPMYB1基因的基因组DNA序列，其中大写字母表示编码序列。

图2：棉花GhPAPMYB1基因与棕色纤维性状共分离

A，根据编码区下游900bp处的序列差异，设计引物(PAPMYB-DF和PAPMYB-DR)扩增T586(T)和渝棉1号(Y)的DNA，获得了GhPAPMYB1基因的分子标记。B，GhPAPMYB1基因的分子标记在RIL群体中的表现。在检测的120个RIL系中，所有的棕色纤维(Z)系均有棕色纤维亲本T586的带型，而所有的白色(B)和绿色(L)纤维系均表现白色纤维亲本渝棉1号的带型。结果表明GhPAPMYB1基因与棕色纤维性状共分离。该基因与棕色纤维基因(Lc1)紧密连锁，表明该基因定位于棉花棕色纤维基因(Lc1)所在的第7染色体，区别于MYB36所在的第16染色体(Guo W等，BMC Genomics2008，9：314)。M为DNA分子量标准，各个片段的长度标于图左。

图3：棉花GhPAPMYB1基因在不同颜色纤维和不同器官中的表达

A，GhPAPMYB1与MYB36两个基因在6个白色纤维(B1～B10)和6个棕色纤维(Z1～Z10)RIL系中的相对表达水平(REL，relative expression level)。结果表明，MYB36基因在纤维中表达量很低，而GhPAPMYB1只在棕色纤维中有很高的表达，在白色纤维中表达量极低。B，GhPAPMYB1基因在根(Ro)、下胚轴(Hy)、子叶(Cy)、茎(St)、开花后2天胚珠(O2)和开花后10天(F10)中的相对表达水平。

图4：组成型启动子CaMV35S调控下的棉花GhPAPMYB1基因表达载体的构建流程图

NPTII：新霉素磷酸转移酶基因；GUS：β-葡萄糖酸苷酶基因；CaMV 35S：来源于花椰菜花叶病毒的植物组成性启动子；NosTer：Nos终止子。用于构建植物表达载体的骨架载体为pBI121，具有CaMV 35S启动子调控下的NPTII基因，便于在植物遗传转化的过程中对转化子进行卡那霉素(Kan)抗性的筛选。

图5：组成型启动子CaMV35S调控下的棉花GhPAPMYB1基因表达载体的结构图；

图6：超量表达GhPAPMYB1基因促进棉花愈伤中的PA结构基因的表达和PA合成

A和B，不同转化愈伤中PA的定性和定量检测。7、10、13、21、22、23为不同的转化愈伤细胞系。CK为未转化的愈伤细胞系。C，用定量RT-PCR方法比较了GhPAPMYB1超量表达愈伤(21和22)和非转基因愈伤(CK)中的GhPAPMYB1及PA结构基因的相对表达水平。结果表明GhPAPMYB1基因的表达在转化愈伤中显著提高，相应地激活了下游PA结构基因的高水平表达。

具体实施方式

以下结合附图对本发明进行进一步的详细说明，但以下说明并不对本发明进行限定，任何对本发明的变形和改变，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求所定义的范围。

本发明实例中的试剂药品未做具体说明的均为普通市售，材料方法未做具体说明的均参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell，2001)。

材料及其来源：

棉花实验材料为T586(Gossypium hirsutum cv T586)：来自中国农业科学院棉花研究所遗传资源研究室。

渝棉1号(G.hirsutum cv Yumian 1)：来自西南大学棉花研究室。

来源于T586×渝棉1号杂交后代的重组近交系(Recombinant inbred line，RIL)群体：来自西南大学棉花研究室。

冀棉14号(G.hirsutum cv Jimian 14，遗传转化用)：来自河北农业大学棉花遗传育种研究所。

亚洲棉(G.arboreum)和雷蒙德氏棉(G.raimondii)：来自中国农业科学院棉花研究所遗传资源研究室。

实施例一GhPAPMYB1基因序列的克隆

1、CTAB法提取棉花RNA

选取约0.5g新鲜棉花材料，在液氮中迅速磨成精细粉末，装入10mL离心管，加入4mL 65℃预热的RNA提取液【2％CTAB(W/V)，2％PVP(W/V)，100mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，0.5g/L Spermidine，2.0mol/L NaCl，2％巯基乙醇(V/V，使用前加入)】，颠倒混匀。65℃水浴3～10min，期间混匀2～3次。等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提2次(12,000r/min，室温，5min)。取上清，加入1/4体积10mol/L LiCl溶液，4℃放置2h。12,000r/min，4℃离心10min，弃上清，用400μLSSTE【1mol/L NaCl，0.5％SDS(W/V)，10mmol/L Tris-HClpH8.0，1.0mmol/L EDTA】溶解沉淀。以酸饱和酚(pH 4.5)∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)和氯仿∶异戊醇(24∶1)各抽提1次(12,000r/min，室温，5min)。加2倍体积的无水乙醇，在-70℃冰箱沉淀30min以上。12,000r/min，4℃离心10min，弃上清。沉淀用70％的酒精漂洗一次，风干。加50～100μL的DEPC处理水溶解。用非变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量。

2、CTAB法提取棉花DNA

幼叶约1g，在液氮中迅速研磨成粉，加入3mL预热的(65℃)CTAB提取液【0.1mol/L Tris-HCl(pH8.0)，0.02mol/L EDTA(pH8.0)，1.5mol/LNaCl，、2％CTAB(W/V)、4％PVP40(W/V)和2％(V/V)的巯基乙醇(使用前加入)】，快速振荡混匀。65℃水浴30min，然后加入1mL 5mol/L KAc冰浴20min后，用等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提1次，加入2/3倍体积的预冷异丙醇，混匀，静置30min，用玻棒挑出絮状沉淀，用75％的乙醇反复漂洗数次，再用无水乙醇漂洗一次，重悬于500μL TE中。用RNaseA 37℃处理1h。再用酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)和氯仿∶异戊醇(24∶1)各抽提一次，取上清乙醇沉淀，离心弃上清。沉淀用75％的乙醇漂洗，风干，溶于200μL TE中，-20℃冰箱保存备用。

3、GhPAPMYB1基因编码序列的PCR扩增

根据拟南芥、葡萄、杨树、柿子等植物的PA调控相关R₂R₃-MYB蛋白的同源序列设计简并引物PAPMYB-D(SEQ ID NO.4)。用3′-RACE的方法扩增棉花GhPAPMYB1基因的cDNA 3′-末端序列。根据3′-末端序列设计两个反向的巢式引物PAPMYB-R1(5’-TTTCACTGTAGCAGTACTGAT-3’，SEQ ID NO.5)和PAPMYB-R2(5’-CGTATCATGGCCATTCATCA-3’，SEQ ID NO.6)，分别为和)用Y-RACE方法扩增获得GhPAPMYB1基因的cDNA 5′-末端序列。最后根据ATG上游序列设计正向引物PAPMYB-F(5’-GTTGATGCATGGGGTCATC-3’，SEQ ID NO.7)，与下游引物PAPMYB-R2(SEQ ID NO.6)一起分别用cDNA和基因组DNA为模板扩增获得GhPAPMYB1基因的全长编码序列。

具体方法如下：

(1)一链cDNA合成及3′-RACE扩增

从棕色棉T586开花后14d的纤维中提取总RNA。取约2μg纤维总RNA为模板，用简并引物PAPMYB-D(5’-ATTAGGACTAAGGCTATHMGNTG-3’，其中H＝T、A或C；M＝C或A；N＝A、T、C或G，SEQ ID NO.4)和3′-RACE试剂盒(TaKaRa)提供的3′-site引物扩增获得棉花GhPAPMYB1基因的cDNA3′-末端序列。操作步骤按3′-RACE试剂盒(TaKaRa)说明书进行。

(2)Y-RACE扩增

取20μg T586纤维总RNA用cDNA合成试剂盒(TaKaRa)合成双链cDNA，并将cDNA末端平端化。具体操作均按cDNA试剂盒(TaKaRa)说明书进行。

取100μmol/L的接头长链(5’-CGGTAGGATCCCGCAGAACGACGGCCAG-3’，SEQ ID NO.8)和接头短链(5’-pCTGGCCGTCCAAGACGC-3’，SEQ ID NO.9)各2μL，加入2μL 10×退火缓冲液(1mol/L NaCl，100mmol/LTris-HCl，10mmol/L EDTA)和16μL蒸馏水，65℃水浴10min，缓慢冷却至室温，即获得接头。

取接头和双链cDNA建立如下连接体系：

10×T4DNA连接缓冲液      1μL

双链cDNA                 2μL

接头                     2μL

T4DNA连接酶              1μL

用双蒸水补足体积至10μL的连接体系

16℃连接12h，70℃灭活10min。

扩增第一步为线性扩增，25μL体系中含1μL连接产物，1×PCR Buffer，200μmol/L dNTPs，1.5mmol/L MgCl₂，200nmol/L特异引物PAPMYB-R1(SEQID NO.5)，1U Taq DNA聚合酶(在94℃预变性时加入)。温度循环参数为94℃预变性5min；94℃，30s，56℃，30s，72℃，2min30s，40个循环。取1μL线性扩增产物进行第二步指数扩增，除引物为接头引物(SEQ ID NO.9)和特异引物PAPMYB-R2(SEQ ID NO.6)外，反应体系中其他成分同线性扩增。反应扩增25～35个循环后，72℃延伸10min。

(3)全长cDNA编码序列的扩增

25μL体系中含1μL一链cDNA，1×PCR Buffer，200μmol/L dNTPs，1.5mmol/L MgCl₂，各200nmol/L引物PAPMYB-F(SEQ ID NO.7)和PAPMYB-R2(SEQ ID NO.6)，1U Taq DNA聚合酶(在94℃预变性时加入)。温度循环参数为：94℃预变性5min；94℃，30s，56℃，30s，72℃，1min30s，35个循环；最后72℃延伸10min。扩增片段回收、克隆、测序后获得SEQ IDNO.2。

(4)基因组编码序列的扩增

25μL体系中含约100ng棉花基因组DNA，1×PCR Buffer，200μmol/LdNTPs，1.5mmol/L MgCl₂，各200nmol/L引物PAPMYB-F(SEQ ID NO.7)和PAPMYB-R2(SEQ ID NO.6)，1U Taq DNA聚合酶(在94℃预变性时加入)。温度循环参数为：94℃预变性5min；94℃，30s，56℃，30s，72℃，2min，35个循环；最后72℃延伸10min。扩增片段回收、克隆、测序后获得SEQ IDNO.1(图1C)。

4、扩增片段回收和克隆测序

(1)电泳和回收

将扩增产物在1.2％(W/V)琼脂糖凝胶中进行电泳分离。将目的条带从凝胶上切下，用DNA回收试剂盒(Bioflux)回收纯化目的片段，回收步骤按照试剂盒说明书进行。回收片段在琼脂糖凝胶上电泳定量。

(2)克隆和测序

回收的片段经琼脂糖凝胶电泳定量。按试剂盒说明书，通过回收片段与克隆载体的连接、连接产物的大肠杆菌转化、阳性菌落的培养和质粒酶切验证，将回收片段克隆到pMD19-T(TaKaRa)载体上。

回收的片段与pMD19-T(TaKaRa)载体建立如下连接体系：

10×T4DNA连接缓冲液         1μL

载体DNA片段                 1μL

外源连接产物DNA片段         1μL

T4DNA连接酶                 1μL

用双蒸水补足体积至10μL的连接体系

载体DNA与外源片段DNA片段摩尔比为1∶3，16℃连接12h。之后将连接产物转化大肠杆菌DH5a。挑白色菌落培养，提质粒酶切验证。正确克隆由上海英俊公司进行序列测定。

实施例二GhPAPMYB1基因的序列和基因组来源的分析

为查询GhPAPMYB1基因的同源序列，用该基因序列在NCBI网站进行BLAST分析。获得的同源性最高的序列为棉花的MYB36基因。下载相应的DNA和氨基酸序列，用DNAStar软件的MegAlign程序比较GhPAPMYB1基因和MYB36基因的cDNA序列(图1A)。

根据GhPAPMYB1基因和MYB36基因的序列差异设计两个基因特异的上游扩增引物PAPMYB-SF(5’-TACAGTGATGGCGGCTCTG-3’，SEQ ID NO.11)和MYB36-SF(5’-TACAGTGATGGCGGCTCAA-3’，SEQ ID NO.12)，与下游引物PAPMYB-R2配对扩增T586、渝棉1号、亚洲棉和雷蒙德氏棉DNA。25μL体系中含约100ng棉花基因组DNA，1×PCR Buffer，200μmol/L dNTPs，1.5mmol/L MgCl₂，各200nmol/L引物上下游引物，1U Taq DNA聚合酶。温度循环参数为：94℃预变性5min；94℃，30s，56℃，30s，72℃，30s，35个循环；最后72℃延伸5min。

实施例三GhPAPMYB1基因与棕色纤维性状的关联分析

1、棉花重组近交系群体的建立

用棕色纤维品系T586与渝棉1号杂交，F1代自交，随机选取270个F2代植株收取种子，连续自交，每世代取一株的自交种子种成一个株系。自交传代7代以上，获得有270个系组成的重组近交系(RIL，recombinant inbred line)群体。

2、T586与渝棉1号GhPAPMYB1基因差异序列的获得

比较T586与渝棉1号GhPAPMYB1基因编码区序列，未发现序列差异。为获得该基因在两亲本间的序列差异，用PAPMYB-SF(SEQ ID NO.11)和PAPMYB-3F(5’-TTGGCCTTTTTGCTTGACAC-3’，SEQ ID NO.13)作特异引物，用YADE法扩增了T586与渝棉1号中GhPAPMYB1基因编码区的下游序列。结果发现在终止密码子下游900bp处，T586序列比渝棉1号多15bp的插入序列。根据该序列差异设计引物PAPMYB-DF(5’-GCACCACCATTTAAGTTGAG-3’，SEQ ID NO.14)和PAPMYB-DR(5’-CCTACAACATGGACAGTAAC-3’，SEQ ID NO.15)，扩增T586和渝棉1号基因组DNA获得了一个GhPAPMYB1基因的扩增标记。用该标记检测RIL群体中GhPAPMYB1基因的分离情况(图2)。具体方法如下：

(1)YADE扩增①酶切：2μg DNA用10U的平末端内切酶EcoRV、DraI、SmaI和HindII按说明书的条件20μL体系分别酶切过夜，70℃10min灭活。②加接头：接头制备方法同实施例一。取2μL接头和5ng酶切产物，加5U连接酶，16℃连接16h。③扩增：第一步为线性扩增，25μL体系中含1μL连接产物，1×PCR Buffer，200μmol/L dNTPs，1.5mmol/L MgCl2，200μmol/L特异引物PAPMYB-SF，1U Taq DNA聚合酶(在94℃预变性时加入)。温度循环参数为：94℃预变性5min；94℃，30s，56℃，30s，72℃，2min30s，40个循环。取1μL线性扩增产物进行第二步指数扩增，除引物为接头引物和特异引物PAPMYB-3F，反应体系中其他成分同线性扩增。反应扩增35个循环后，72℃延伸10min。

扩增产物的回收、克隆和测序同实施例一。

(2)GhPAPMYB1基因标记的设计和检测

用DNAStar软件的MegAlign程序比较从T586和渝棉1号扩增的GhPAPMYB1下游序列。根据序列差异设计引物PAPMYB-DF(SEQ ID NO.14)和PAPMYB-DR(SEQ ID NO.15)扩增GhPAPMYB1基因下游900bp处的差异片段(T586，229bp；渝棉1号，214bp)。25μL体系中含约100ng棉花基因组DNA，1×PCR Buffer，200μmol/L dNTPs，1.5mmol/L MgCl₂，各200nmol/L引物上下游引物，1U Taq DNA聚合酶。温度循环参数为94℃预变性5min；94℃，30s，56℃，30s，72℃，30s，35个循环；最后72℃延伸5min。

实施例四GhPAPMYB1基因在不同组织和不同颜色纤维中的表达

用定量RT-PCR方法分析基因的相对表达水平。用CTAB方法(同实施例一)提取T586根、下胚轴、子叶、胚珠和纤维的总RNA。进一步提取RIL群体中不同颜色纤维材料开花后14天纤维的总RNA。以这些总RNA反转录的单链cDNA为模板进行定量PCR分析。GhPAPMYB1基因用引物PAPMYB-SF(SEQ ID NO.11)和PAPMYB-R2(SEQ ID NO.6)扩增，MYB36基因用引物MYB36-SF(SEQ ID NO.12)和PAPMYB-R2(SEQ ID NO.6)扩增。用棉花Histone基因做内标，引物为His-up(5’-GAAGCTGCAGAGGCATACC-3’，SEQ ID NO.16)和His-down(5’-CTACCACTACCATCATGGC-3’，SEQ ID NO.17)。反转录和定量PCR分析均采用TaKaRa公司的SYB Green RT-PCR分析试剂盒在iCycle定量PCR仪上完成。按试剂盒和仪器说明书进行各步具体操作。用测得的目的基因与Histone的起始拷贝数的比值表示目的基因的相对表达水平。

实施例五超量表达载体的构建和棉花遗传转化

1、超量表达载体的构建

pMD19-GhPAPMYB1载体在克隆GhPAPMYB1基因时构建，其上的GhPAPMYB1基因的基因组编码序列已测序。为了在转基因棉花中正确表达GhPAPMYB1基因，需要将GhPAPMYB1基因正向插入植物表达载体中，并用适当的启动子启动表达。为此我们根据pMD19-GhPAPMYB1载体上的酶切位点和GhPAPMYB1的插入方向以及植物表达载体(pBI121)上的多克隆位点和CaMV 35S启动子的方向，设计了如图4所示的载体构建路线。根据这个植物表达载体构建路线，构建了超量表达GhPAPMYB1基因的植物表达载体pBI121-GhPAPMYB1，其结构如图5所示。

2、棉花遗传转化

用电激法将构建的植物表达载体质粒导入农杆菌LBA4404用以棉花遗传转化。

参考Bio-RAD MicroPulser用户说明书，将上述载体通过电激转化法导入农杆菌LBA4404。

上述的植物表达载体通过农杆菌下胚轴的方法导入棉花。具体方法如下：

(1)棉花遗传转化用培养基

棉花遗传转化常用配养基及配方如表1。

表1：棉花遗传转化用培养基

MS：Murashige&Skoog，1962；B5：Gamborg，1986

(2)无菌苗的获得

棉花种子去壳，籽仁用0.1％HgCl₂(升汞)灭菌8～12min，无菌自来水冲洗5～6次，无菌自来水浸泡约30min，接种于1/2MSB固体培养基中，28℃暗培养3-5d。下胚轴切段用于农杆菌介导的遗传转化。

(3)农杆菌转化

含植物表达载体的农杆菌菌株接种于液体YEB，28℃200rpm摇床培养过夜，从已摇好的菌液中重新吸取1～2mL于20～25mL液体YEB中再次活化。待菌液摇至OD600约为1时，取出8000rpm，离心2min。用原菌液体积的MSB(含100μmol/LAS)液体重悬菌体。重悬液浸染3～5mm长的下胚轴切段20min(不时轻轻振荡)，吸干菌液。浸染后的下胚轴接种于共培养培养基(可以不铺垫无菌滤纸)，24℃，暗处共培养2d。

(4)愈伤组织诱导和继代

共培养后的下胚轴转接入筛选脱菌培养基上脱菌并进行愈伤组织的诱导。约20d继代一次，下胚轴段与愈伤一起继代。愈伤组织较多后，可以将愈伤组织从下胚轴上刮下，在抗性愈伤继代培养基上培养，每14～20d继代一次。

实施例六转化愈伤的鉴定和检测

超量表达载体(pBI121-GhPAPMYB1)转化棉花获得多个愈伤细胞系，但这些愈伤均不能转化为胚性愈伤或成苗。因此我们用dimethylaminocinnamaldehyde(DMACA)染色法检测这些愈伤中PA合成的情况，并进一步用定量RT-PCR方法检测GhPAPMYB1基因和各个PA结构基因的表达情况。具体方法如下：

1、PA的检测

(1)定性检测取约0.2g愈伤组织放入1.5mL离心管中，加入约200μL0.1％DMACA(溶于6N HCl∶95％乙醇，1∶1)至浸没材料，室温放置染色10min，吸弃染液，用去离子水洗3次，观察材料是否变成PA特异的蓝色。

(2)定量测定取约0.2g愈伤组织，精确称量，在研钵中加液氮把材料研成精细粉末，分两次加入2mL 80％丙酮匀浆，再加1mL 80％丙酮洗研钵，合并3次匀浆液。冰上超声处理20min，12000rpm离心10min，上清液用于PA定量测定。取50μL上清液加入酶标板的孔中，每样品重复3个孔。加好样品和标准液后，用排枪向每个孔中加150μL0.1％DMACA(溶于6N HCl∶95％乙醇，1∶1)，室温反应5分钟，用酶标仪读数各个孔在645nm的光吸收值(A₆₄₅)。用80％丙酮配制不同浓度(1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0mg/mL)的倍儿茶素标准液，制作标准曲线。根据各个样品的A₆₄₅标定样品中的PA含量。

2、基因表达的检测

用CTAB法提取愈伤组织的总RNA同实施例一。反转录、定量PCR方法同实施例四。用棉花Histone3基因做内标，引物为His-up(SEQ ID NO.16)和His-down(SEQ ID NO.17)。GhPAPMYB1基因用引物PAPMYB-SF(SEQ IDNO.11)和PAPMYB-R2(SEQ ID NO.6)扩增。PA合成的结构基因包括：苯丙氨酸氨解酶基因，引物为PAL-up(5’-CAAAGGAGTTGAAGGTACAAG-3’，SEQ ID NO.18)和PAL-down(5’-GCACACTAACAAATTGGAAGTG-3’，SEQID NO.19)；月桂酸4羟化酶基因，引物为C4H-up(5’-TGTTGGAAGGAGGAGCTGT-3’，SEQ ID NO.20)和C4H-down(5’-CCCAACAAAGCTAAATGCAAG-3’，SEQ ID NO.21)；香豆酸辅酶A连接酶基因，引物为4CL-up(5’-AAAATGGC ACCCCAAGCTGA-3’，SEQ ID NO.22)和4CL-down(5’-ACAAGAGCATGATCA CTTGG-3’，SEQ ID NO.23)；查儿酮合成酶基因CHS1，引物为CHS1-up(5’-AATTAGCACTGAAGCCAGAG-3’，SEQ ID NO.24)和CHS1-down(5’-CCAAGTGGAGCACGACCAA-3’，SEQID NO.25)；查儿酮合成酶基因CHS4，引物为CHS4-up(5’-AGTTAGCCCTTAAGCCTGAA-3’，SEQ ID NO.26)和CHS4-down(5’-GACGACGATTACGACGCAG-3’，SEQ ID NO.27)；查儿酮异构酶基因，引物为CHI-up(5’-CACTATTTCAGGCCAAGGTT-3’，SEQ ID NO.28)和CHI-down(5’-CTGGTCTGAAACAGACACTG-3’，SEQ ID NO.29)；类黄酮3-羟化酶基因，引物为F3H-up(5’-AGTGGTGAACTCAAACTGCA-3’，SEQ IDNO.30)和F3H-down(5’-TTTAGGCAAGGATTTCCTCC-3’，SEQ ID NO.31)；二氢黄酮醇还原酶基因，引物为DFR-up(5’-AGAGTGTGGAGTTCTCCTC-3’，SEQ ID NO.32)和DFR-down(5’-AGACATGGGTAGGCACTCAA-3’，SEQ IDNO.33)；花色素合成酶基因，引物为ANS-up(5’-CCATCATCCATGCACATGGA-3’，SEQ ID NO.34)和ANS-down(5’-TCAGTTGGACAGATTATCCT-3’，SEQ ID NO.35)；无色花色素还原酶基因，引物为LAR-up(5’-TCCCAATAG AAGGCCCGAA-3’，SEQ ID NO.36)和LAR-down(5’-ACGTCAAGCACAT GTTGCTG-3’，SEQ ID NO.37)；花色素还原酶基因，引物为ANR-up(5’-AGAATCTGCATCGGGTCGA-3’，SEQ ID NO.38)和ANR-down(5’-CAGAGCG CTTCACTTGAGC-3’，SEQ ID NO.39)；类黄酮3’-羟化酶基因，引物为F3’H-up(5’-GCTGATGTTAGGGGCAATGA-3’，SEQ IDNO.40)和F3’H-down(5’-CTCACCATGAAACGACAACG-3’，SEQ ID NO.41)；类黄酮3’5’-羟化酶基因，引物为F3’5’H-up(5’-TTGCCAAAATCGACCCACG-3’，SEQ ID NO.42)和F3’5’H-down(5’-GGCAAGGGATGTGCTTAGG-3’，SEQ ID NO.43)。

Claims (6)

1.分离的棉花原花色素合成调控基因GhPAPMYB1，其为下述核苷酸序列之一：

1)SEQ ID NO.1所示的DNA序列；或

2)SEQ ID NO.2所示的cDNA序列。

2.由权利要求1所述的基因编码的蛋白质，其为如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

3.含有权利要求1所述的基因的表达载体，其特征在于，所述表达载体至少含有权利要求1所述的基因和组成型启动子。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其具有如图5所示的结构。

5.权利要求1所述的基因在促进植物原花色素合成和累积中的应用，其中所述植物为棉花。

6.权利要求1所述的基因在制备转基因植物中的应用，其中所述植物为棉花。

Images