CN102634516A

CN102634516A - 甘蓝型油菜BnCP51启动子及制备方法和应用

Info

Publication number: CN102634516A
Application number: CN2012100903451A
Authority: CN
Inventors: 刘胜毅; 阳永学; 董彩华; 刘婷婷; 黄军艳; 李振波; 刘越英
Original assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Current assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Priority date: 2012-03-30
Filing date: 2012-03-30
Publication date: 2012-08-15
Anticipated expiration: 2032-03-30
Also published as: CN102634516B

Abstract

本发明公开了一种甘蓝型油菜BnCP51启动子及制备方法和应用。其步骤： A、根据油菜全基因组测序获得的BnCP51基因上游2kb序列设计引物进行PCR，获得油菜BnCP51的5’上游启动子序列；B、根据油菜全基因组测序获得的BnCP51的5’上游2kb序列设计引物，提取油菜叶片基因组DNA，进行PCR扩增，纯化回收后，连接到pMD18-T载体，转化感受态细胞，挑取阳性克隆，PCR检测阳性和酶切验证后测序，得到目的基因上游2kb侧翼序列，为P_BnCP51。P_BnCP51在油菜花药、花粉粒中高效表达，提高外源基因在转基因植物中的表达效率，可用于植物的基因工程研究和籽用油菜安全转基因研究。

Description

甘蓝型油菜BnCP51启动子及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程和生物技术领域，具体涉及一种甘蓝型油菜BnCP51基因启动子(命名为P_BnCP51，以下相同)，同时还涉及一种甘蓝型油菜BnCP51启动子的制备方法。本发明还涉及含有该启动子或其实质同源核苷酸序列的载体和涉及利用该启动子在油菜及其它植物基因工程中的应用。

背景技术

植物基因启动子是位于结构基因5’端上游区、含有顺式作用元件的一段DNA序列，决定着下游基因转录的特异性、方向和效率，是基因转录调控机制和表达模式中最关键的因子。此外，外源基因在植物细胞中表达是植物基因工程研究的关键，而外源基因的表达首先取决于其转录的启动，在某种程度上，启动子决定了基因表达的时空顺序以及表达强度。因此，发掘和研究新型启动子对于基因表达调控机制研究和转基因研究具有非常重要的科学意义。

通过对多种植物基因启动子区的分析发现，绝大多数功能蛋白基因的启动子都具有共同的结构模式，一般由启动子核心元件和上游元件组成。位于转录起始位点上游-20--30bp处的TATA box为启动子核心元件，是富含有AT的保守序列区，与DNA双链的解链有关，并决定转录起始点的选择，是绝大多数植物启动子正确表达所必需的。TATA box上游的保守序列称为启动子上游元件，包括上游-75bp处的CAAT box和-80--110bp附近的GC box等一般上游启动子元件及其他特殊的上游元件，如茉莉酸类物质应答元件(JRE)、乙烯响应元件(ERE)等元件(张春晓等，植物基因启动子研究进展。遗传学报，2004，31(12)：1455-1464；路静等，高等植物启动子及其应用研究进展。自然科学进展，2004，14(8)：856-862)。CAAT box是比较保守的序列，与RNA聚合酶的识别和结合有关，对基因转录有较强的激活作用。然而有些基因无此框，如禾谷类作物的贮藏蛋白基因中无CAAT框而被CATC框代替。GC box的保守序列是5‘GGGCGG3’，可有多个拷贝，并能以任何方向存在而不影响其功能(路静，赵华燕，何奕昆，宋艳茹，高等植物启动子及其应用研究进展。自然科学进展，2004，14(8)：856-862；夏江东，陈在全，吴渝生，季鹏章，高等植物启动子功能和结构研究进展。云南农业大学学报，2006，21(1)：7-14)。只要具有了这些保守的结构框，那么就可以具有相应的启动下游基因表达的功能。

根据植物启动子的转录模式可将其分为组成型启动子、组织特异型启动子和诱导型启动子。组成型启动子驱动的外源基因在转基因植株的所有发育时期和组织中稳定表达。对许多双子叶植物的转化，通常都使用来自花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子或来自细菌的胭脂氨酸合成酶nos启动子的质粒载体，而在单子叶植物转化中最常用的是含有水稻肌动蛋白Act启动子，玉米泛素Ubi启动子及35S启动子的质粒载体(关丽英等，转基因植物中外源基因的有效表达及其安全评价。首都师范大学学报，2002，23(2)：52-56)。但是很多时候外源基因在受体植物中的持续高效表达不仅造成生物体内能源的浪费，而且在所有组织中的表达有可能对植株本身具有毒害作用，甚至引起转基因安全问题(JiaS-R.Environment and food biosafty assessment of transgenic plants.Advanced ofBioengineer.1997，17：37-42；Morris S H，Adley C.C.Irish public perceptions andattitudes to modern biotechnology：an overview with a focus on GM foods.Trends inBiotechnology.2001，19：43-48)。因此，诱导型启动子和组织特异性启动子的研究和应用日益受到育种工作者的重视。在转基因植物中鉴定的诱导型启动子主要包括非生物胁迫诱导型启动子，生物胁迫诱导型启动子和激素诱导型启动子等(聂丽娜等，植物基因启动子的克隆及其功能研究进展。植物遗传资源学报，2008，9(3)：385-391)。但是诱导型启动子的应用也具有一定限制，对受体植物进行的外在条件处理，如热激，激素处理等可能引起生物体内一系列的生理生化反应而不利于植株的正常生长。此外，化学调控系统中用作诱导物的甲基脱氢皮质醇(dex，dexamethasone)、雌二醇(estradiol)和四环素(tetracycline)都对生态环境有害，不宜用于生产实践。使用植物体内本身的组织特异性启动子就可以避免这种问题，显然，外源基因的组织特异性表达必将有效提高转基因作物的生物安全性。(宋扬等，植物组织特异性启动子研究。生物技术通报，2007，(4)：21-24)。近些年来，关于组织特异性启动子研究取得了很大的进步，这些组织特异性启动子主要包括叶片、韧皮部、维管束和根等器官特异表达启动子和花粉、花器官、果实、种子等生殖器官特异表达启动子(宋扬等，植物组织特异性启动子研究。生物技术通报，2007，(4)：21-24)。如Ariizumi等分离了LTP12，XTH3和PGA4的启动子并转化拟南芥，GUS染色表明这3个启动子为花药特异表达启动子，且在不同的时期表达存在差异(Ariizumi et al，Comparative study of promoteractivity of three anther-specific genes encoding lipid transfer protein，xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase and polygalacturonase intransgenic Arabidopsis thaliana.Plant Cell Report.2002，21：90-96)。在芝麻中克隆得到微粒体油酸脱氢酶基因(FAD2)的启动子，预测分析显示此启动子中的E-box和G-box元件与三酰甘油的生物合成有关。通过转化拟南芥后检测GUS基因表达，结果显示该启动子在种子中特异表达(Mi Jung Kim etal.Seed-specificexpression of sesame microsomal oleic acid desaturase is controlled by combinatorialproperties between negative cis-regulatory elements in the SeFAD2 promoter andenhancers in the 5′-UTR intron.Molecular Genetics and Genomics.2006，276：351-368)。耿安奇等从白菜型油菜、甘蓝型油菜、菜苔、甘蓝中分离了4个启动子并转化烟草，GUS染色分析其为花器官特异表达的启动子(Geng etal.Expressionanalysis of four flower-specific promoters of Brassica spp.in the heterogeneous hosttobacco.African Journal of Biotechnology.2009，8(20)：5193-5200)。此外，Mariani等将烟草花药绒毡层特异表达基因启动子TA29与核酸酶基因Barnase、RnaseT1融合后转化植物，核酸酶基因在花药中特异表达，并破坏绒毡层，获得雄性不育烟草和油菜(Mariani C.etal.Induction of male sterility in plants by a chimaericribonuclease gene.Nature，1990，347：737-741)。目前TA29启动子已在烟草、玉米、油菜、拟南芥、水稻等植物上应用并获得成功(宋扬等，植物组织特异性启动子研究。生物技术通报，2007，(4)：21-24)。由此可见，即使不同的植物之间的体内环境不同以及基因间存在互作差异，即使是与拟南芥性质差异较大的植物，只要具有保守的核心启动区域和相应保守的调控元件，就可以在其他不同植物中发挥启动下游基因表达的生物学功能。

近年来，对启动子的功能研究，大量文献报道采用的方法通常是先用生物信息学初步预测和分析启动子序列后，再将启动子片段与报告基因融合构建表达载体，转化模式植物拟南芥、烟草、水稻等的离体培养细胞或植物体，再通过检测报告基因在转基因个体中的表达情况分析启动子的功能并加以利用。大量的文献报道显示其他植物的启动子转化到上述植物中均可正常的行使其生物功能，如：在芝麻中克隆的微粒体油酸脱氢酶基因(FAD2)的启动子，此启动子中的E-box和G-box元件与三酰甘油的生物合成有关。在转基因拟南芥和其他转基因植物中也显示出了种子特异性的表达(Mi Jung Kim，Heeja Kim，Mi Chung Suh.Seed-specific expression of sesame microsomal oleic acid desaturase is controlled bycombinatorial properties between negative cis- regulatory elements in the SeFAD2promoter and enhancers in the 5′-UTR intron.Molecular Genetics and Genomics.2006，276(4)：351-368)。从玉米中克隆的ZmGLU1基因启动子，连接GUS报告基因后转化至烟草中，检测分析结果玉米的ZmGLU1启动子驱动了GUS基因在烟草根部高效表达(Riliang Gu，Li Zhao，Guoying Wang.Isolation of a maizebeta-glucosidase gene promoter and characterization of its activity in transgenictobacco.Plant Cell Reports.2006，25(11)：1157-1165)。从马铃薯中分离的一个与乙醇脱氢酶非常相似的TDF511(tran- script derived fragment)基因Stgan的启动子。构建Stgan启动子-GUS融合表达载体转化烟草，GUS组织化学染色显示该启动子驱动基因在烟草茎结节处特异表达，可能参与块茎形成过程(Trindade L M，et al.Isolation and functional characterization of a stolon specificpromoter from potato(Solanum tuberosum L.).Gene，2003，303：77-84.)。以上这些报道都是利用转基因技术在不同的植物间进行启动子功能分析的例子，这些实例表明利用模式植物拟南芥、烟草等作为载体，通过转基因植株的表达分析证实来自于其他植物的启动子的功能是被广泛认可和接受的。

油菜作为中国主要的油料作物，在长江流域广泛种植，对国计民生具有重要影响。随着转基因技术的成熟，转基因油菜必然会面临转基因安全风险的舆论。用在油菜种子中完全不表达的启动子来启动目的基因的表达是解决这个问题的一个可行方法，既达到既提高油菜各方面品质，又不引起食用油安全风险的目的。

因此，本发明开发了一个甘蓝型油菜内源启动子。荧光定量PCR检测表明该启动子驱动的内源基因在甘蓝型油菜的根、茎、叶、角果中不表达，仅在花蕾中高量表达。通过检测报告基因GUS的表达特征证明启动子驱动的基因在根、茎、叶片、角果中不表达，在花蕾中高量表达。我们的结果预示着该基因的启动子在转基因植物中具有良好的应用前景。

发明内容

本发明的第一个目的是提供了一种甘蓝型油菜P_BnCP51启动子，其优点在于二个方面：首先，来源于油菜内源的组织特异性启动子能够精确定位所调控的基因，驱动目的基因在转基因油菜的特定组织或时期表达，避免造成植物自身能源和物质的浪费。其次，提高外源基因在转基因植物中的表达效率，限制其表达部位。因此，该启动子可应用于植物的基因工程研究和籽用油菜安全转基因研究。

本发明的第二个目的是提供了一种甘蓝型油菜P_BnCP51启动子的制备方法。该方法以对甘蓝型油菜基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获得甘蓝型油菜P_BnCP51序列。其优点在于操作简单，结果稳定可靠。

本发明的第三个目的是提供了一种含有植物高效表达启动子的重组载体，其含有所述的启动子核苷酸序列。该载体大小适合，在植物中易与转化，所带有的标记基因GUS表达强度高，容易检测。通过这个载体转化拟南芥可以获得GUS基因在植物中高效表达的拟南芥转基因植株。

本发明第四个目的是提供了一种甘蓝型油菜P_BnCP51启动子在花药、花粉粒中的应用。在该启动子的驱动下，目的基因主要在植株的花药中精细表达，在其它部位不表达。这一具有组织特异性表达的启动子在植物创建不育系、人工创建种质资源等基因工程和转基因安全(食用、花粉漂流)中具有良好的应用价值。

为了完成上述目的，本发明采用如下技术方案：

为了获得本发明，发明人对油菜发育过程中的相关基因进行了深入和全面的研究，结果发现一种新的启动子。该启动子驱动的内源基因在植物的花药中高效表达。

根据本发明的一个方面，上述目的可以通过提供一种启动子来实现，所述启动子能够特异性驱动下游基因在植物中高效表达，所述启动子含有SEQ ID No.1核苷酸序列或与SEQ ID No.1实质上同源的核苷酸序列。

根据本发明的另一个方面，上述目的可以通过提供含有所述启动子的核苷酸序列的重组载体来实现。

根据本发明的另一个方面，上述目的可以通过提供用所述重组载体转化的微生物来实现。

根据本发明的另一个方面，上述目的可以通过提供用所述微生物转化的转基因植物来实现。

1 一种甘蓝型油菜启动子P_BnCP51的制备方法，其步骤是：

1.1 P_BnCP51驱动的内源基因的表达模式：

本发明所用油菜为甘蓝型油菜(Brassica napus L.)。供试材料播种于大田，正常田间管理。

从大田生长条件下生长的油菜植株上取根、茎、叶、花蕾，角果。每种材料至少取三个重复，每个重复至少一株，取样后用锡箔纸包裹，迅速放置于液氮速冻中，-80℃保存。利用Trirol提取试剂盒(购自TaKaRa公司)的按照试剂盒的要求进行RNA的提取。

荧光定量PCR仪为IQ5(美国伯乐公司)，采用油菜Actin作为内标基因(登录号AF111812)，Actin基因引物为5′CTGGAATTGCTGACCGTATGAG3′和5′ATCTGTTGGAAAGTGCTGAGGG 3′。P_BnCP51驱动的内源基因BnCP51引物为5′AGGACTCAAGGTGCTGTGACTCCTAT3′和5′CTGAGAGAGACACTAAATTCCCTGTTT3′。

荧光定量PCR反应每组实验均完成三个生物学重复，每个生物学重复至少做三次技术重复。分别检测P_BnCP51驱动的内源基因在油菜组织(根、茎、叶、花、角果)中的表达。

用比较Ct法(ΔΔCt)计算基因的相对表达量。通过2^-ΔΔCt估算目的基因的相对表达量和系统误差(Kenneth J Livak.Thomas D Schmittgen.2001，Analysis ofRelative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2-ΔΔCTMethod.METHODS 25，402-408)。在计算相对表达量时，以根的样本为参照，即将其值转换成1(标准值)，其它样品再与其比较，获得相对表达值。

1.2 同源序列法克隆P_BnCP51序列：

1.2.1油菜启动子P_BnCP51的引物序列：

根据油菜全基因组测序获得的BnCP51基因上游2kb序列设计1对引物进行PCR扩增，采用的引物为PBnCP51S：5′-(KpnI)CGGGGTACCGGTAAAATCTCTTGTAGCCCGT-3′和PBnCP51A：5′-(Xba I)GACATCTAGATTTTTTGTTTGTTTTGGGGAA-3′。

1.2.2 油菜启动子PBnCP51的制备：

利用SDS裂解法(J.萨姆布鲁克.D.W.拉塞尔著，黄培堂等译分子克隆试验指南(第三版)科学出版社，以下相同)提取油菜叶片基因组DNA，以此为模板进行PCR扩增，步骤是：提取基因组DNA 25μl，以此为模板进行扩增，反应体系为50μl，分别添加10×Ex Taq buffer 5μl，dNTP 4μl，5’引物1μl，3’引物1μl，ExTaq 0.5μl，DNA模版1μl约100ng，ddH₂O 37.5μl。根据油菜全基因组测序获得的BnCP51基因上游2kb序列设计PCR所用引物为PBnCP51S：5′-(KpnI)CGGGGTACCGGTAAAATCTCTTGTAGCCCGT-3′和PBnCP51A：5′-(Xba I)GACATCTAGATTTTTTGTTTGTTTTGGGGAA-3′。扩增产物大小为1960bp，PCR反应程序为94℃5分钟，94℃1分钟，59℃1分钟，72℃2分钟，33个循环，72℃10分钟，16℃3小时，PCR产物经1.0％(琼脂糖凝胶/TE溶液质量体积比，以下相同)琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶回收试剂盒(购自天根生化科技北京有限公司，以下相同)纯化回收后，连接到pMD18-T载体(购自大连宝生物工程有限公司，以下相同)，热激法(J.萨姆布鲁克.D.W.拉塞尔著，黄培堂等译分子克隆试验指南(第三版)科学出版社，以下相同)转化gold菌株的感受态细胞(购自大连宝生物工程有限公司，以下相同)，涂布于含有氨苄青霉素50μg/mL(质量体积比，以下相同)的LB固体培养基(配方如下：分别称取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化钠，8克琼脂依次溶解于蒸馏水中，定容于1000毫升。分装于500毫升三角瓶中，121℃，6.859×104Pa下高压消毒20分钟。分装到培养皿中，4℃冷藏备用，以下相同)平板上，37℃培养过夜，挑选白斑6个，采用M13引物：5‘TGTAAAACGACGGCCAGT3’和5‘CAGGAAACAGCTATGACC3’，做菌落PCR检测。菌落PCR具体方法(以下相同)是用灭菌的牙签挑取少量菌斑做模版，反应体系为10μL内含：10×Taq buffer(含MgCl₂)1μl，1.5mmol/L dNTP(10mmol/L)1μL，5’引物(10μmol/L)0.5μl，3’引物(10μmol/L)0.5μl，Taq(5U/μl)0.5μl，ddH₂O 6.5μl。反应条件为94℃ 5分钟，94℃ 1分钟，55℃ 1分钟，72℃ 2分钟30秒，33个循环，72℃ 10分钟，扩增大小为1960bp，1.0％(前面已述)琼脂糖凝胶电泳检测大小正确后。将PCR检测大小正确的菌斑接种到含氨苄青霉素50μg/mL的液体LB培养基(配方如下：分别称取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化钠，溶解于蒸馏水中，定容于1000毫升，121℃，6.859×104Pa下高压消毒20分钟，以下相同)，37℃下200r/min振荡培养过夜，小量碱法(J.萨姆布鲁克.D.W.拉塞尔著，黄培堂等译分子克隆试验指南(第三版)科学出版社，以下相同)提取质粒，1.0％(前面已述)琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA大小正确后(为1960bp)，采用Kpn I/Xba I酶(2种酶购自TaKaRa公司，以下相同)切对质粒进行双酶切(以下相同)，酶切体系(以下相同)为10μl，包含质粒DNA5μl，Kpn I 0.5μl，Xba I 0.5μl，ddH₂O 4μl，37℃过夜，1.0％(前面已述)琼脂糖凝胶电泳检测。将检测正确的阳性重组克隆命名为pMD18-P_BnCP51(将目的片段P_BnCP51连入pMD18-T载体构建而成，以下相同)，将pMD18-P_BnCP51送上海英骏公司进行测序，分析结果，得到PBnCP51全长序列，命名P_BnCP51。

1.3 启动子序列生物信息学分析：

将所克隆的BnCP51上游序列用启动子核心元件和上游顺式作用元件用启动子预测软件http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html和PLACE(Higo et al.，Plant cis-acting regulatory DNA elements(PLACE)database(J).Nucleic AcidsResearch.1999，27：297～300.http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE)进行预测。结果表明所克隆的启动子序列含有TATA box核心启动子序列，CAAT等上游启动子元件和花特异表达元件如POLLEN1LELAT52(Bate N，Twell D.Functionalarchitecture of a late pollen promoter：pollen-specific transcription is developmentallyregulated by multiple stage-specific and codependent activator elements.PlantMolecular Biology.1998，37，859-869.)和GTGANTG10(Rogers HJ et al.Functional analysis of cis-regulatory elements within the promoter of the tobacco latepollen gene g10.Plant Molecular Biology.2001，45，577-585.)(图3)。

2一种甘蓝型油菜启动子P_BnCP51在转基因植株的花药中的应用，其步骤是：

2.1 P_BnCP51植物表达载体的构建和根癌农杆菌菌株EHA105(购于上海沪尚生物科技有限公司，以下相同)的转化：

构建的重组载体是将质粒pBI121(购自TaKaRa公司，以下相同)上的35S启动子用技术方案1中克隆得到P_BnCP51片段替换而来。为完成此目的，首先用XbaI/Kpn I(前面已述)双酶切克隆载体pMD18-P_BnCP51的启动子片段，同时用XbaI/Kpn I酶切pBI121(Chen，P.Y.，Wang，C.K.，Soong，S.C.To，K.Y.Complete sequenceof the binary vector pBI121 and its application in cloning T-DNA insertion fromtransgenic plants.Mol.Breed.11，287-293)质粒。酶切体系(前面已述)为10μl酶切反应在37度培养箱中进行，约4-6个小时之后，用1.0％(前面已述)琼脂糖胶电泳检测。将克隆载体pMD18-P_BnCP51酶切下的小片段(大小为1960bp，和pBI121(前面已述)酶切下的大片段(约1400bp)用DNA凝胶回收试剂盒(前面已述)回收。按pMD18-P_BnCP51酶切下的小片段和pBI121(前面已述)酶切下的大片段(150ng小失片段∶50ng大片段)＝3∶1的比例(摩尔浓度比)混合样品，加入T₄ DNA连接酶1μl，10×反应缓冲液1μl，无菌的ddH₂O补充体积至10μL，16℃连接过夜。热激法(前面已述)转化gold菌株的感受态细胞(前面述)后，在含有卡那霉素(50μg/mL)的固体LB培养基(前面述)平板上筛选，挑取白色菌斑做菌落PCR(前面述)，提取质粒(前面已述)，经酶切验证大小正确(酶切小片段为1960bp)的重组质粒命名为pBI-P_BnCP51。为了确保载体中启动子的序列信息，

利用冻融法(J.萨姆布鲁克.D.W.拉塞尔著，黄培堂等译分子克隆试验指南(第三版)科学出版社，以下相同)转化农杆菌EHA105(前面已述)：步骤如下：

1：取0.2ml感受态农杆菌，于冰中缓慢融化。

2：加入约2μg重组质粒DNA，轻轻混匀，冰浴30min后，投入液氮速冻1min，然后37℃水浴5min，融化细胞。

3：加入800μl不含抗生素LB液体培养基(前面已述)，28℃轻摇培养4-5h。

4：12000rpm，30s，去上清，细胞重悬于0.2ml LB液体培养基(前面已述)培养基。

5：将培养物均匀涂布在含Rif(50mg/L)，Str(50mg/L)和Kan(50mg/L)的LB固体培养基(前面已述)琼脂板上，28℃培养2天，待平板上出现转化子后挑菌检测)将pBI-P_BnCP51转入根癌农杆菌EHA105(购自大连宝生物生物制品有限公司，以下相同)，用卡那霉素(50μg/mL)和利福平(50μg/mL)双抗性平板筛选，挑取菌斑，菌落PCR检测验证(前面已述)。

2.2 P_BnCP51的功能分析：

2.2.1 P_BnCP51植物表达载体pBI-P_BnCP51在拟南芥中的遗传转化及转基因植株筛选：

采用花序侵染法(Zhang X.R.et al.Agrobacterium-mediated transformation ofArabidopsis thaliana using the floral dip method.Nature，2006，1：1-6，以下相同)进行拟南芥转化。制备含有重组载体pBI-P_BnCP51的根癌农杆菌EHA105(前面已述)菌液，在转化前一天转入含有卡那霉素50μg/ml、利福平50μg/ml的LB液体培养基((前面已述)中，28℃过夜培养。第二天，用紫外分光光度计(SPEKOL1300)于276nm纳米波长下检测菌液的吸光值，当菌液的吸光值达到在1.6-2.0之间时取出。室温(20-25℃，以下相同)以4000g离心10min，弃上清，沉淀悬浮于等体积的5％蔗糖溶液(蔗糖与蒸馏水的质量体积比，以下相同)中。将浑浊的蔗糖溶液倒入一大培养皿中，转化前加入终浓度为0.02％(体积比)的Silwet 1-77(购自北京五洲元业科贸中心，以下相同)。混匀后把待转化的拟南芥整个花序轻轻的浸没在蔗糖中，默数15秒，取出植株。转化后的植株用一个黑色塑料袋包好，放在生长箱培养。第二天将塑料袋揭开，放在光强的地方培养。隔一周再做一次转化。培养一个月左右收获种子，种子在培养箱或者日光下干燥3-5天。将转化收获的T0代种子用70％(体积比)酒精和0.1％(质量比)的升汞分别表面消毒3分钟和10分钟，然后用蒸馏水洗涤数次(5～7次)，然后均匀地吹打到含有浓度为50mg/L卡那霉素的MS固体筛选培养基(MS大量元素母液100ml；MS微量元素母液10ml；MS有机母液10ml；MS铁盐10ml；肌醇10ml；蔗糖30g；用1M NaOH调PH至5.8，12g琼脂粉，定容至1L，高压121度灭菌后备用。加入8g琼脂粉可配置成固体培养基。各种母液配方见表1)表面。4℃春化4-6天，放入恒温培养箱(光周期16(白天)/8(黑暗)小时，温度：白天22℃，暗周期20℃)培养，筛选得到的转化植株，称T1代转化植株(以下相同)。根据表达载体上特有的卡那霉素抗性筛选阳性植株。叶片长到足够大小时(3-4叶期)，取少许绿苗叶片，提取DNA，进行转化材料的PCR阳性检测(以下相同)。引物为NPT IIF：5‘GATGGATTGCACGCAGGT3’和NPTIIR：5‘TCAGAAGAACTCGTCAAG3’，反应体系为10μl内含：模板DNA模板1μL(约100ng)，10×Taq buffer(含MgCl₂)1μl，1.5mmol/L dNTP(10mmol/L)1μl，5’引物(10μmol/L)0.5μl，3’引物(10μmol/L)0.5μl，Taq(5U/μl)0.5μl，ddH₂O 5.5μl。反应条件为94℃ 5分钟，94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 1分钟，32个循环，72℃ 10分钟，扩增大小为800bp。结果表明获得了转基因阳性植株(含有检测目的片段的植株称阳性植株，以下相同)。

表1 MS培养基母液配方

2.2.2P_BnCP51功能分析：

用P_BnCP51替换pBI121(前面已述)质粒上的35S启动子序列，形成pBI-P_BnCP51重组植物表达载体，其中的GUS基因受P_BnCP51的调控。利用根癌农杆菌EHA105(前面已述)介导的花序侵染法(前面已述)转化拟南芥。收获T0代种子后，经过卡那霉素抗性筛选获得T1代转化植株(前面已述)和PCR检测筛选得到阳性植株(前面已述)。

将PCR验证是阳性的T1代转基因植株种子在含有浓度为50mg/L卡那霉素的MS(前面已述)培养基上播种，4℃春化后在生长箱中萌发，萌发条件：光照时间16h，温度：22±2℃，出苗5天后开始取样染色。染色过程如下：将样品浸泡在GUS染液(X-gluc 0.5mg/mL，磷酸缓冲液50mmol/L，铁氰化钾和亚铁氰化钾各0.5mmol/L，EDTA 10mmol/L，Triton-x-100 0.001％(体积比)，甲醇20％(体积比)中，真空抽气5分钟，37℃过夜。第二天用酒精-乙酸(体积比为1∶1)进行脱色，直至叶片变白，之后用蒸馏水漂洗数次(5～7次)，体式显微镜(OLYMPUS SZX16)拍照。苗期分别取5天，10天，15天的整个植株；生殖生长期，叶片取嫩叶和成熟叶片；花取整个花序含有开过的花朵和未开的花蕾；角果受精后5天，10天，15天和20天的角果。植株被染成蓝色的部位就是GUS基因表达的部位。通过检测不同时空下GUS基因的表达部位和表达强度来探索P_BnCP51的时空表达模式。

结果表明该启动子驱动的GUS基因在拟南芥的花药中高效表达，但是在种子、叶片和根及茎中不表达(图6)。因此，该启动子具有驱动下游基因在植物花药中高效表达，而在种子和其他部位不表达。这一具有组织特异性表达的启动子在植物基因工程和转基因安全(食用)中具有良好的应用价值。如可以通过构建含有该启动子驱动引起花药败育的基因的载体，转化受体植株，人工创造雄性不育材料，应用在杂交育种的生产，或是控制转基因植物通过花粉飘逸造成的转基因的逃逸，或是通过启动子驱动某些提高花粉营养成分的基因，改善花粉营养等。同时由于P_BnCP51驱动的基因在种子中不表达，因此在种子中不会出现外源导入基因的蛋白产物，在转基因食物安全领域具有重要的应用价值。

一种油菜BnCP51启动子全长序列SEQ ID NO：1在模式植物拟南芥不同组织中功能性表达的描述。利用同源序列法克隆得到甘蓝型油菜BnCP51基因的5′上游序列，经启动子核心元件和上游顺式作用元件用启动子预测软件http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html和PLACE(Higo et al.，Plantcis-acting regulatory DNA elements(PLACE)database(J).Nucleic AcidsResearch.1999，27：297～300)http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/进行预测，结果表明所克隆的启动子序列含有TATA box核心启动子序列，CAAT等上游启动子元件和花特异表达元件如POLLEN1LELAT52和GTGANTG10(图3)。此外，荧光定量和GUS染色结果表明PBnCP51驱动的内源基因在花蕾中表达，在其它组织中不表达(图1，图6)。这说明P_BnCP51驱动的内源基因是一个在油菜花蕾中高效表达的基因，证明P_BnCP51是一个油菜花蕾中高效表达的启动子。

一种甘蓝型油菜PBnCP51启动子在模式植物拟南芥的花药和花粉粒中的应用的描述。利用同源序列法克隆得到油菜BnCP51基因的5′上游启动子序列。构建由该启动子调控的报告基因GUS的植物表达载体pBI-PBnCP51(前面已述)。采用农杆菌介导的花期侵染法(前面已述)转化拟南芥，T1代在加有卡那霉素的MS(前面已述)培养基上初步筛选转基因植株，当拟南芥长出两片真叶后，移栽到蛭石上继续种植，当植株出现花序后，进行PCR检测，利用分子手段鉴定阳性株。T2代选择10个转基因株系进行GUS染色。GUS组织化学法染色表明，该启动子驱动的GUS基因在拟南芥的花药和花粉粒中表达。由此可见，该启动子驱动的GUS基因具有一定的时空表达特异性，具有驱动下游基因在花药和花粉粒中表达，种子中完全不表达(图6)的功能。这一具有组织特异性表达的启动子在人工创建种质资源、植物基因工程和转基因安全(食用)中具有应用价值，如利用该启动子驱和花粉粒发育相关的目的基因，首先构建P_BnCP51驱动目的基因的过表达载体，转化受体植株，则目的基因在P_BnCP51启动子的驱动下，可以提高目的基因在上述组织中的表达量，种子中完全不表达，不会引起食品安全问题。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1、所提供的启动子克隆方法克隆到的启动子能够通过对GUS基因的调控和组化分析，获得具有组织特异性表达功能的油菜启动子。

2、克隆到油菜来源的P_BnCP51。从油菜食用油安全性和利用转基因作物品质，人工创建种质资源等方面来考虑，这种启动子具有良好的应用潜力。用P_BnCP51替换pBI121(前面已述)质粒上的35S启动子序列，形成pBI-P_BnCP51重组植物表达载体，其中的GUS基因受P_BnCP51的调控。通过转基因实验证明，该启动子在花药和花粉粒中的高强度驱动GUS基因的表达以及在种子中完全不驱动GUS基因的表达的特性启示申请人可以用此启动子来代替CaMV35S强启动子来驱动和花粉发育相关的基因，使得该基因在花粉中过量表达，人工创造不育系、恢复系，丰富种质资源，或提高转基因植物的生物安全性，抑制外源基因的扩散，防止基因漂流。P_BnCP51在油菜花药、花粉粒中高效表达，在根、茎、叶、果和种子等组织中不表达。因此，该启动子具有驱动外源基因在油菜花药、花粉粒中表达的功能，在油菜转基因食用油安全性和提高作物品质方面，人工创建不育系、恢复系，丰富种质资源等方面，具有良好的应用潜力。

附图说明：

图1为一种P_BnCP51驱动的内源基因的表达模式分析图

图2为一种同源克隆法扩增P_BnCP51片段电泳图。

泳道1别代表基因组DNA为模板PCR扩增结果；泳道M代表DL2000的核酸Marker。

图3为P_BnCP51启动子序列分析

阴影方框和下划线代表基本元件，阴影圆框代表花药特异性表达相关的元件；方框代表其他调控元件，粗体ATG代表翻译起始位点。

图4为一种构建的pBI-P_BnCP51载体示意图。

图5为一种转化载体pBI-P_BnCP51的部分转基因植株PCR鉴定图

泳道M代表DL2000的核酸Marker；泳道1代表pBI-P_BnCP51阳性质粒的PCR扩增结果；泳道2-18 阳性株的PCR扩增结果：泳道19野生型拟南芥的PCR扩增结果。

图6为一种P_BnCP51驱动的GUS基因的组织化学染色结果。

A：15日苗(无色)；B：茎(无色)；C：花序(9-13期花药兰色)；D：未开放花蕾(花药兰色)；E：角果(无色)；F：11期花药组织切片(兰色)

具体实施方式

根据以下实施例，可以更好的理解本发明，但所述的实施例是为了更好的解释本发明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

油菜P_BnCP51驱动的内源基因的表达模式分析：

从大田生长条件相同的可育植株上取根、茎、叶、花蕾、角果，每种材料至少取三个重复，每个重复至少一株，取样后用锡箔纸包裹，迅速放置于液氮中，-80℃保存。提取RNA(方法前面已述)。荧光定量PCR仪为IQ5(伯乐公司)，采用油菜Actin(登录号AF111812)作为内标基因，Actin基因引物为正向引物5′-CTGGAATTGCTGACCGTATGAG-3′和反向引物5′-ATCTGTTGGAAAGTGCTGAGGG-3′。油菜P_BnCP51驱动的内源基因引物为5′AGGACTCAAGGTGCTGTGACTCCTAT3′和5′CTGAGAGAGACACTAAATTCCCTGTTT3′。荧光定量PCR反应体系为20μL：含有SYBR Mix 10μL，正反向引物(10μmol/L)各0.8μL，模板2μL，DEPC处理过的无菌水补足至20μL。扩增条件为：94℃，5min：94℃，15s，60℃，20s，72℃，30s，40个循环；每个循环于72℃复性末端进行荧光检测。反应结束后先加热到95℃，然后降至72℃，再缓慢升温至95℃，记录荧光信号的变化，得出扩增产物的熔解曲线。每组实验均完成三个生物学重复，每个生物学重复至少做三次技术重复。分别检测P_BnCP51驱动的内源基因在油菜组织(根、茎、叶、花、角果)中的表达。

用比较Ct法(ΔΔCt)计算基因的相对表达量。利用仪器所带软件，首先优化内标基因和目的基因扩增条件，分别测定Actin和目的基因的Ct值，选取九次实验测定值中最为接近的三次结果(Ct值的系统误差小于0.3)取平均值，然后通过内标基因对目的基因进行校正得到ΔΔCt，最后通过2^-ΔΔCt估算目的基因的相对表达量和系统误差(Kenneth J Livak.Thomas D Schmittgen Analysis of RelativeGene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2^-ΔΔCT Method.Methods，25，402-408(2001))。在计算相对表达量时，以根的样本为参照，即将其值转换成1，其它样品再与其比较，获得相对表达值。

结果表明：P_BnCP51驱动的内源基因在花蕾中表达(图1)，在其它组织中不表达。这说明P_BnCP51驱动的内源基因是一个在花蕾中高效表达的基因，证明P_BnCP51是一个高效表达启动子。

实施例2：

一种甘蓝型油菜启动子P_BnCP51启动子的制备方法，其步骤是：

1、油菜启动子P_BnCP51的引物序列：

2、油菜启动子PBnCP51的制备：

利用SDS裂解法(前面已述)提取油菜叶片基因组DNA，以此为模板进行PCR扩增，步骤是：提取基因组DNA 25μl，以此为模板进行扩增，反应体系为50μl，分别添加10×Ex Taq buffer 5μl，dNTP 4μl，5’引物1μl，3’引物1μl，ExTaq 0.5μl，DNA模版1μl约100ng，ddH₂O 37.5μl。根据油菜全基因组测序获得的BnCP51基因上游2kb序列设计PCR所用引物为PBnCP51S：5′-(KpnI)CGGGGTACCGGTAAAATCTCTTGTAGCCCGT-3′和PBnCP51A：5′-(Xba I)GACATCTAGATTTTTTGTTTGTTTTGGGGAA-3′。扩增产物大小为1960bp，PCR反应程序为94℃ 5分钟，94℃1分钟，59℃1分钟，72℃2分钟，33个循环，72℃10分钟，16℃3小时，PCR产物经1.0％((前面已述)琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶回收试剂盒((前面已述)纯化回收后，连接到pMD18-T载体((前面已述)，热激法((前面已述)转化gold菌株的感受态细胞(前面已述)，涂布于含有氨苄青霉素50μg/mL((前面已述)的LB固体培养基(前面已述)平板上，37℃培养过夜，挑选白斑6个，采用M13引物：5‘TGTAAAACGACGGCCAGT3’和5‘CAGGAAACAGCTATGACC3’，做菌落PCR检测(前面已述)，1.0％(前面已述)琼脂糖凝胶电泳检测大小正确后。将PCR检测大小正确的菌斑接种到含氨苄青霉素50μg/mL的液体LB培养基(前面已述)，37℃下200r/min振荡培养过夜，小量碱法(前面已述)提取质粒，1.0％(前面已述)琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA大小正确后(为1960bp)，采用Kpn I/Xba I酶(前面已述)切对质粒进行双酶切(前面已述)，酶切体系(前面已述)为10μl，37℃过夜，1.0％(前面已述)琼脂糖凝胶电泳检测。检测正确的阳性重组克隆，命名为pMD18-P_BnCP51(前面已述)，将pMD18-P_BnCP51送上海英骏公司进行测序，将pMD18-P_BnCP51送上海英骏公司序列测定，分析结果，得到PBnCP51全长序列，命名P_BnCP51。一种分离的启动子，其系列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列或与SEQ ID No.1实质上同源的核苷酸序列。

3、油菜P_BnCP51重组表达载体的构建及根癌农杆菌转化：

用Xba I/Kpn I分别双酶切连接有P_BnCP51的pMD18-P_BnCP51(前面已述)和pBI121(前面已述)质粒。凝胶回收酶切下来的P_BnCP51片段和pBI121(前面已述)片段，连接，热激法(前面已述)转化大肠杆菌，构建成植物表达载体pBI-P_BnCP51(前面已述)(图5)。最后用冻融法(前面已述)将该载体导入根癌农杆菌EHA105(前面已述)，在含有卡那霉素(50mg/L)和利福平(50mg/L)双抗性LB平板上(前面已述)挑选阳性克隆，用菌落PCR(前面已述)验证是否含有目标片段。

实施例3：

pBI-P_BnCP51的拟南芥转化及PCR检测：

采用花序侵染法(Zhang X R.et al.Agrobacterium-mediated transformation ofArabidopsis thaliana using the floral dip method.Nature，2006，1：1-6)转化拟南芥，根据转基因植株所特有的卡那霉素抗性，在含有浓度为50mg/L卡那霉素的MS(前面已述)培养基上生长，获得的绿苗初步认为是转化植株。待转化植株长出两片真叶后，将其移栽到蛭石中，待植株出现花序后，取一片真叶用SDS方法提取基因组DNA(前面已述)，做PCR鉴定。引物序列为NPT II F：5′GATGGATTGCACGCAGGT3′和NPT II R：5′-TCAGAAGAACTCGTCAAG-3′；PCR反应体系如下：模板DNA 1μL(约100ng)、10×Taq buffer(含MgCl₂)1μl，1.5mmol/L dNTP(10mmol/L)1μl，5’引物(10μmol/L)0.5μl，3’引物(10μmol/L)0.5μl，Taq(5U/μl)0.5μl，ddH₂O 5.5μl。反应程序为：94℃变性5min，94℃ 45s、55℃ 45s、72℃ 2min 32循环，72℃延伸5min。用1％琼脂糖凝胶(前面已述)电泳检测PCR反应产物，大小为800bp。结果表明P_BnCP51表达载体pBI-P_BnCP51已经成功转入拟南芥(图5)，共获得17株阳性苗。

实施例4：

甘蓝型油菜P_BnCP51启动子的功能分析：

本发明首次克隆得到P_BnCP51的序列，并对其进行了功能分析。从实施例3中，通过模式植物拟南芥转化(前面已述)及PCR检测(前面已述)筛选得到的阳性苗T1代，自交收获种子(即T2代)。在不同时期，取T2代10个株系转化植株的不同组织进行GUS染色。

T2代取染色过程如下：将样品浸泡在GUS染液(X-gluc 0.5mg/mL，磷酸缓冲液50mmol/L，铁氰化钾和亚铁氰化钾各0.5mmol/L，EDTA 10mmol/L，Triton-x-100 0.001％，甲醇20％(体积比)真空抽气5分钟，37℃过夜。第二天用酒精-乙酸(体积比为1∶1)进行脱色，直至叶片变白，之后用蒸馏水漂洗3-5次，体式显微镜(OLYMPUS SZX16)拍照。苗期取不同时间段的整个植株；生殖生长期，叶片取嫩叶和成熟叶片；花取开过的花朵和未开的花蕾的花序；角果取不同时期的角果；种子取开花后10天左右的种子。植株被染成蓝色的部位就是GUS基因表达的部位。

根据花药的细胞学切片的光镜观察结果将拟南芥从雄蕊原基发生到花药开裂脱落详细地分为15个时期(Sanders et al.Anther developmental defects inArabidopsis thaliana male-sterile mutants.Sex Plant Repro，1999，11：297-322)，染色结果发现(表3、图6)，幼花花药(1-8期)和开放的花药(13-14期)未出现蓝色，中期花药(9-12期)和花粉粒被染成蓝色；在角果中，种子未出现蓝色，在其它组织中未出现蓝色。由此可见，该启动子驱动的GUS基因主要在中期花药(9-12期)及其花粉粒中表达，在其它组织中不表达。

实验结果表明，油菜P_BnCP51具有如下生物学功能：该启动子驱动的GUS基因在拟南芥的花药和花粉粒中表达，在其它组织中不表达。P_BnCP51调控下的GUS基因具有一定时空表达特性，这说明P_BnCP51具有驱动下游报告基因GUS在受体植物中表达的功能。在该启动子的调控下，GUS基因能够主要在转基因植株的中期花药(9-12期)及其花粉粒中精细表达，而在其它组织中完全不表达(表3、图6)。

这一具有组织特异性表达的启动子在植物基因工程和转基因安全(食用)中具有应用价值。

一种甘蓝型油菜P_BnCP51启动子在模式植物拟南芥的花药和花粉粒中的应用。利用同源序列法克隆得到油菜BnCP51基因的5′上游启动子序列。经过生物信息学分析该启动子序列具有启动子表达的核心元件和上游元件，构建由该启动子调控的报告基因GUS的植物表达载体pBI-P_BnCP51(前面已述)。采用农杆菌介导的花期侵染法转化拟南芥，T1代在加有卡那霉素的MS(前面已述)培养基上初步筛选转基因植株，当拟南芥长出两片真叶后，移栽到蛭石上继续种植，当植株出现花序后，进行PCR检测，利用分子手段鉴定阳性株。T2代选择10个转基因株系进行GUS染色。GUS组织化学法染色表明，该启动子驱动的GUS基因在拟南芥的中期花药(9-12期)及其花粉粒中表达。由此可见，该启动子驱动的GUS基因具有一定的时空表达特异性，具有驱动下游基因在中期花药(9-12期)及其花粉粒中表达，其它组织中完全不表达(图6)的功能。这一具有组织特异性表达的启动子在植物基因工程和转基因安全(食用)中具有良好的应用价值，如利用该启动子驱动花粉育性或和含油量相关的目的基因，首先构建P_BnCP51驱动目的基因的过表达载体，转化受体植株，则目的基因在P_BnCP51启动子的驱动下，在中期花药(9-12期)及其花粉粒中表达，可以提高目的基因在上述组织中的表达量，种子中完全不表达，不会引起食品安全问题。

表3 P_BnCP51转基因拟南芥T2代株系的GUS染色统计表

Claims

1.一种分离的启动子P_BnCP51，其序列为SEQ ID No.1 所示的核苷酸序列。

2.含有权利要求1所述的启动子的重组载体pBI-P _BnCP51。

3.权利要求1所述的一种甘蓝型油菜启动子P _BnCP51的制备方法，其步骤是：

（1）油菜启动子P _BnCP51的引物序列:

根据油菜全基因组测序获得的BnCP51基因上游2kb序列设计1对引物进行PCR扩增，扩增获得油菜BnCP51的5’上游启动子序列，所用引物为PBnCP51S：5 ′-(Kpn I)CGGGGTACCGGTAAAATCTCTTGTAGCCCGT-3'和PBnCP51A：5′- (Xba I) GACATCTAGATTTTTTGTTTGTTTTGGGGAA-3 ′；

（2）油菜启动子P_BnCP51的制备:

根据油菜全基因组测序获得的BnCP51的5’上游2kb序列设计所用的引物：PBnCP51S：5 ′-(Kpn I)CGGGGTACCGGTAAAATCTCTTGTAGCCCGT-3'和PBnCP51A：5′- (Xba I) GACATCTAGATTTTTTGTTTGTTTTGGGGAA-3，利用SDS裂解法提取油菜叶片基因组DNA，以此为模板进行PCR扩增，步骤是：提取油菜基因组DNA 25μl，以此为模板进行扩增，反应体系为50 μl，分别添加10×Ex Taq buffer 5 μl，dNTP 4 μl，5’引物 1 μl，3’引物 1 μl，ExTaq 0.5 μl，DNA模版1 μl约100ng，ddH₂O 37.5μl，扩增产物大小为1960 bp，PCR反应程序为94℃ 5 分钟，94℃1 分钟，59℃ 1分钟，72℃ 2分钟，33个循环，72℃ 10分钟，16℃ 3小时，PCR产物经1.0%质量体积比琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶回收试剂盒纯化回收后，连接到pMD18-T载体，热激法转化gold菌株的感受态细胞，挑取阳性克隆，PCR检测阳性和酶切验证后测序，得到目的基因上游2kb侧翼序列，经过生物信息学分析此序列为BnCP51的启动子全长序列，命名为P _BnCP51。

4.权利要求1中所述的一种分离的启动子P _BnCP51在拟南芥花药中的应用。

5.权利要求1中所述的一种分离的启动子P _BnCP51在拟南芥花粉粒中的应用。