DE69533366T2

DE69533366T2 - Radioaktivmarkierte annexin-galaktose-cluster konjugate

Info

Publication number: DE69533366T2
Application number: DE69533366T
Authority: DE
Inventors: Louis J. Theodore; Sudhakar Kasina; John M. Reno
Original assignee: Poniard Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Poniard Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1994-12-07
Filing date: 1995-12-06
Publication date: 2005-08-04
Anticipated expiration: 2015-12-07
Also published as: DE69533366D1; CA2206274A1; WO1996017618A1; CA2206274C; EP0799050B1; EP0799050A1; EP0799050A4

Description

Beschreibung
Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung ist auf radioaktiv markierte Annexin-Galactose-Cluster-Konjugate gerichtet. Die vorliegende Erfindung zieht ebenfalls Bildgebungsprotokolle in Betracht, welche die Verabreichung von radioaktiv markierten Annexin-Galactose-Cluster-Konjugaten beinhalten. Die Annexinkomponente des Konjugats dient dazu, die radioaktiv markierte Komponente des Konjugats an Gefäßthromben-Zielstellen zu bringen. Die Galactosekomponente des Konjugats erleichtert die rasche Entfernung des radioaktiv markierten Annexin-Galactose-Cluster-Konjugats aus dem Kreislauf eines Empfängers.
Hintergrund der Erfindung
Wenn sich Patienten mit Brustschmerzen, Palpitation oder anderen Symptomen von koronarem Trauma oder Krankheit zeigen, ist das Vorliegen von Gefäßthromben im Herzen ein potenzieller, signifikanter Komplikationsfaktor für die Behandlung. Wenn ein Art nicht-invasiv bestimmten könnte, ob einer oder mehrere Gefäßthromben vorhanden sind, und falls vorhanden, die Stelle dieser Gefäßthromben bestimmen könnte, würde eine bessere Abschätzung der Behandlungsoptionen möglich sein. Wenn ein Arzt weiterhin feststellen könnte, dass keine Gefäßthromben vorhanden sind, wodurch eine potenzielle Komplikation bei der Behandlung wegfallen würde, könnten Herzzustände sicherer und wirksamerer behandelt werden.
Die meisten gegenwärtigen Techniken zur Bestimmung der Anwesenheit von Gefäßthromben sind invasiv und/oder beschwerlich und/oder versagen bei der Feststellung solcher Thromben mit guter Empfindlichkeit und Spezifizität. Daher ist ein bildgebendes Mittel, das für nicht-invasive Bildgebung von Gefäßthromben erwünscht.
Annexine sind eine Klasse von Proteinen, die durch Calcium-vermittelte Bindung an anionische Phospholipide charakterisiert sind. Anionische Phospholipide sind etwa 20-fach höher mit aktivierten Plättchen assoziiert als ruhende Plättchen, und aktivierte Plättchen sind mit Gefäßthromben assoziiert.
Es hat sich gezeigt, dass iodiertes Annexin V sich an Gefäßthromben in vivo lokalisiert, aber suboptimale Bildgebungscharakteristiken hat, möglicherweise aufgrund der ausgeprägten Betaphase der Blutclearance aufgrund einer möglichen Transiodierung und/oder eines metabolischen Abbaus mit Wiedereinbau in Serummakromoleküle oder Nicht-Zielgewebe. Freies radioaktives Iod oder Iod enthaltende Stoffwechselabbauprodukte setzten Nicht-Zielgewebe, insbesondere die Schilddrüse, der Radioaktivität aus. Zusätzlich ist die verwendete Iod-Radiomarkierung schwierig zu erhalten und ist daher für eine breite Verwendung nicht praktisch. Folglich sind verbesserte radioaktiv markierte Annexinverbindungen erwünscht.
Zusätzlich sind die konventionelle Bildgebung und Therapie häufig von dem Problem betroffen, dass das im allgemeinen erzielbare Ziel-(Targeting-)Verhältnis (Verhältnis von verabreichter Dosis, welche im Ziel lokalisiert, zu verabreichter Dosis, welche im Blut zirkuliert oder Verhältnis von verabreichter Dosis, welche im Ziel lokalisiert, zu verabreichter Dosis, welche ins Knochenmark migriert) gering ist. Verbesserungen im Ziel-Verhältnis ist ebenfalls Gegenstand.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Annexin-Konjugat, das zur radioaktiven Markierung mit einem Mittel zur diagnostischen Bildgebung (einem diagnostischen Bildgebungsmittel) geeignet ist, zur Verfügung, welches umfasst:
ein Annexin;
eine N₂S₂- oder N₃S-Verbindung, die ein Radionuklid komplexieren kann, wobei die Verbindung mit einem Annexin assoziiert ist; und
einen Cluster von Hexoseresten oder Resten auf Hexosebasis, die in einer verzweigten Konfiguration verknüpft sind, wobei die Reste des genannten Clusters so konfiguriert sind, dass sie von einem Leberrezeptor erkannt werden.
Bevorzugte Annexin-enthaltende Konjugate der vorliegenden Erfindung sind solche, welche zur radioaktiven Markierung mit einem Mittel zur diagnostischen Bildgebung geeignet sind, welche enthalten:
ein Annexin;
einen Cluster von Galactoseresten; und
ein N₂S₂-Chelat, welches mit dem Annexin assoziiert ist.
Die vorliegende Erfindung stellt auch radioaktiv markierte Annexin-Galactose-Cluster-Konjugate bereit, die zur Bildgebung von Gefäßthromben geeignet sind, wobei die radioaktiv markierten Annexin-Galactose-Cluster-Konjugate umfassen:
ein Annexin,
ein Cluster von Galactoseresten,
ein mit dem Annexin assoziiertes N₂S₂-Chelat und
ein durch das Chelat komplexiertes diagnostisches Radionuklid.
Ein bevorzugtes Annexin für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist Annexin V. Bevorzugte Galactose-Cluster für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung enthalten ein Vielfaches von 4 Galactosen. Weitere bevorzugte Galactose-Cluster für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung enthalten ein Vielfaches von 3 Galactosen.
Die Galactose-Clusterkomponente kann an die Annexinkomponente und die Chelatkomponente über einen trifunktionellen Linker, wie z. B. Lysin, gebunden sein. Ein Extender kann zwischen dem Galactose-Cluster und dem trifunktionellen Linker verwendet werden, um die Bioverfügbarkeit des Galactose-Clusters zu fördern. Diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird bevorzugt, wenn das Chelat dadurch gekennzeichnet ist, dass eine einzige funktionelle Gruppe für die Konjugation zur Verfügung steht und geeignet ist.
Wenn die Chelatkomponente dadurch gekennzeichnet ist, dass sie mehr als eine funktionelle Gruppe hat, die für die Konjugation mit anderen Konjugatkomponenten ver fügbar und geeignet ist, wird eine Struktur wie die folgende bevorzugt verwendet:
Galactose-Cluster – bifunktioneller Linker – Chelat – bifunktioneller Linker – Annexin.
Bevorzugte diagnostische Radionuklide zur Verwendung in der Praxis der vorliegenden Erfindung sind Tc-99m, Re-186 und Re-188, wobei Tc-099m besonders bevorzugt ist. Gefäßthromben, die sich in oder nahe dem Herzen befinden, sind der Bildgebung gemäß der vorliegenden Erfindung besonders zugänglich.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 gibt schematisch ein Verfahren zur radioaktiven Markierung von Annexin V wieder.
2 zeigt die Blutclearance von Tc-99m-Annexin V(o) und von Tc-99m-Annexin V-Galactose (Δ).
3 zeigt schematisch die Synthese von N,N'-bis(2-disulfidyl-4-carbonylphenyl)-1,3-propyldiamin.
4 zeigt schematisch die Synthese von N,N'-bis(disulfidyl-4-methylphenyl)-gamma, gamma'-diamino-isovalerat N-hydroxysuccimid.
5a and 5b zeigen schematisch die Synthese von einem acht Galactoseenthaltenden Galactose-Cluster.
6 zeigt schematisch die Synthese eines erweiterten acht Galactose-enthaltenden Galactose-Clusters.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Bevor die Erfindung beschrieben wird, ist es hilfreich, Definitionen für einige Ausdrücke festzulegen, die in der Beschreibung verwendet werden.
Annexin:
Eine Klasse von Verbindungen, charakterisiert durch die Fähigkeit, mit hoher Affinität an Membranlipide in Gegenwart von millimolaren Konzentrationen von Calcium zu binden. Annexine haben sich als antikoagulatorische Wirkungen aufweisend erwiesen, die durch die Bindung von Annexinen an negativ geladene Oberflächenphospholipide (z.B. an aktivierte Plättchen) vermittelt werden. Es wird angenommen, dass diese Annexin-Phospholipid-Bindung die Aktivierung von Gerinnungsfaktoren durch solche negativ geladene Oberflächenphospholipide blockiert. Vor der Erkennung der Annexinklasse von Molekülen wurden Glieder davon auch in der Literatur als plazentale Antikoagulansproteine (z.B. PAP-1, 2, 3 und 4), Lipocortine, Calpactine, vaskuläres Koagulans (alpha und beta), Calphobindin I, plazentales Protein 4 (PP4), Endonexin II, Anchorin CII, calciumabhängiges Phospholipid bindendes Protein und Ähnliches bezeichnet, vgl. Crumpton et al., Nature 345: 212, 1990. Annexin-V ist ein prototypisches Annexinmolekül, das in der Beschreibung der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
N₂S₂-Chelate:
Bifunktionelle Diamid-Dimercaptid-Chelatoren der N_xS_y-Familie, die befähigt sind, stabil ein Radionuklid durch zwei Stickstoffatome und zwei Schwefelatome, die in geeigneter Weise angeordnet sind, zu komplexieren. N₂S₂-Chelate sind z.B. in der US-Patentschrift Nr. 4,897,225 beschrieben. Bevorzugte Chelate dieses Typs schließen Chelate mit dem folgenden Biphenyl-Rückgrat ein:
N₃S-Chelate:
Bifunktionelle Triamid-Mercaptid-Chelatoren der N_xS_y-Familie, die befähigt sind, stabil ein Radionuklid durch drei Stickstoffatome und ein Schwefelatom, die in geeigneter Weise angeordnet sind, zu komplexieren. Bevorzugte N₃S-Chelate sind z.B. in der US-Patentschrift Nr. 4,965,392 beschrieben.
Radioaktiv markiertes Annexin:
Ein Annexin, konjugiert an ein Chelat mit einem darin komplexierten Radionuklid.
Radioaktiv markierte Annexin-Galactose:
Ein Galactose-derivatisiertes Annexin, konjugiert an ein Chelat mit einem darin komplexierten Radionuklid.
Zucker-Cluster:
Ein Konstrukt, welches eine Vielzahl von Zuckerresten aufweist, die so konfiguriert sind, dass sie von einem Leberrezeptor erkannt werden. Solche Cluster sind bevorzugterweise aus Zuckerresten aufgebaut, die in einer verzweigten Konfiguration verknüpft sind und die an weitere Komponenten eines Zucker-Cluster enthaltenden Konjugates über einen einzigen Verknüpfungspunkt verknüpft sind. Vorzugsweise besteht das Verzweigungsnetzwerk aus zwei- oder dreifachen Verzweigungen, d. h., es besteht aus 2, 4, 8, 16, 32 oder 64 Zuckerresten oder es besteht aus 3, 9, 27 oder 81 Zuckerresten.
Galactose-Cluster:
Ein Konstrukt, welches 3 bis 64 Galactosereste aufweist, die in einer verzweigten Konfiguration verbunden sind. Vorzugsweise besteht das Verzweigungsnetzwerk aus zwei- oder dreifachen Verzweigungen, d. h., es besteht aus 2, 4, 8, 16, 32 oder 64 Galactoseresten oder es besteht aus 3, 9, 27 oder 81 Galactoseresten.
Radioaktiv markiertes Annexin-Galactose-Cluster: Ein Galactose-Clusterderivatisiertes Annexin, welches mit einem Chelat, das ein Radionuklid darin komplexiert hat, konjugiert ist.
Konjugat:
Ein Konjugat umfasst chemische Konjugate (kovalent oder nicht-kovalent gebunden), Fusionsproteine.
Die vorliegende Erfindung ist auf Annexin enthaltende Konjugate, radioaktiv markierte Annexin-Galactose-Konjugate und deren Verwendung für diagnostische Bildgebungszwecke gerichtet. Radioaktiv markierte Annexine sind durch das Folgende charakterisiert: rasche Aufnahme an Zielzellstellen, gekennzeichnet durch anionische Phospholipide; kurze Umlaufhalbwertszeit; in vivo-Stabilität gegen metabolischen Abbau oder Radionuklidtrennung von dem Chelat; und Zugänglichkeit für die Verpackung in einem nicht radioaktiven Kit-Format.
Radioaktiv markierte Annexin-Galactose-Konjugate der vorliegenden Erfindung weisen auch die vorstehend genannten Kennzeichen, wenn auch in verschiedenem Ausmaß, auf. So zeigen z.B. radioaktiv markierte Annexin-Galactose-Konjugate eine kürzere Umlaufhalbwertszeit als ihre radioaktiven Annexin-Gegenstücke. Radioaktiv markierte Annexin-Galactose-Konjugate weisen gewöhnlich auch eine niedrigere Bindungsaffinität für Zielstellen als ihre radioaktiv markierten Annexin-Gegenstücke auf. Erfolgreiche diagnostische Bildgebung beinhaltet sowohl die Signalanhäufung an der Zielstelle als auch die rasche Entfernung von nicht getroffenem Signal. Folglich ergibt die erhöhte Entfernung der radioaktiv markierten Annexin-Galactose-Konjugate der vorliegenden Erfindung aus dem Kreislauf eines Empfängers eine ausgeprägte Möglichkeit, diagnostische Bilder in einem kürzeren Zeitrahmen zu erhalten.
Darüber hinaus nimmt das Zielstellensignal mit der Zeit in Folge des radioaktiven Zerfalls ab. Des Weiteren verringert der Metabolismus des mit dem Ziel assoziierten Materials ebenfalls das Zielsignal. Folglich verstärkt die Bildgebung in einem kürzeren Zeitrahmen das Verhältnis von Ziel : Nicht-Ziel – Verhältnis und das gesamte Zielsignal, wodurch verbesserte diagnostische Informationen gesammelt werden.
Die radioaktiv markierten Annexin-Galactose-Cluster-Konjugate der vorliegenden Erfindung verbinden die wünschenswerten Eigenschaften von radioaktiv markierten Annexinen und radioaktiv markierten Annexin-Galactose-Konjugaten. Zum Beispiel weisen radioaktiv markierte Annexin-Galactose-Cluster-Konjugate eine kürzere Umlaufhalbwertszeit als ihre radioaktiv markierten Annexin-Gegenstücke auf. Außerdem weisen radioaktiv markierte Annexin-Galactose-Cluster-Konjugate im Allgemeinen eine höhere Bindungsaffinität für die Zielstellen als ihre radioaktiv markierten Annexin-Galactose-Konjugat-Gegenstücke auf. Folglich bieten die verstärkte Eliminierung der radioaktiv markierten Annexin-Galactose-Cluster-Konjugate der vorliegenden Erfindung aus dem Kreislauf eines Empfängers und die Aufrechterhaltung der substanziellen Bindungsaffinität der radioaktiv markierten Annexin-Galactose-Cluster-Konjugate der vorliegenden Erfindung die Möglichkeit, klare diagnostische Bilder in einem kürzeren Zeitrahmen zu erhalten.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf Annexin-enthaltene Konjugate, die zur radioaktiven Markierung mit einem Mittel zur diagnostischen Bildgebung geeignet sind, welche umfassen:
ein Annexin;
einen Cluster von Galactoseresten; und
ein N₂S₂- oder N₃S-Chelat, welches mit dem Annexin assoziiert ist.
Radioaktiv markierte Annexin-Galactose-Cluster-Konjugate, die zur Bildgebung von Gefäßthromben irgendwo in dem Empfänger (aber insbesondere in oder nahe dem Herzen) geeignet sind, werden ebenfalls in Betracht gezogen, wobei die radioaktiv markierten Annexin-Galactose-Cluster-Konjugate ein Annexin, einen Cluster von Galactoseresten, ein N₂S₂- oder N₃S-Chelat und weiterhin ein durch das Chelat komplexiertes diagnostisches Radionuklid umfassen.
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beinhaltet Annexin-enthaltene Konjugate, die zur radioaktiven Markierung mit einem Mittel zur diagnostischen Bildgebung geeignet sind, umfassend:
ein Annexin;
einen Cluster von Galctoseresten; und
ein N₂S₂-Chelat, welches mit dem Annexin assoziiert ist.
Radioaktiv markierte Annexin-Galactose-Cluster-Konjugate, die zur Bildgebung von Gefäßthromben geeignet sind, werden ebenfalls in Betracht gezogen, wobei die radioaktiv markierten Annexin-Galactose-Konjugate ein Annexin, einen Cluster von Galactoseresten, ein N₂S₂-Chelat und weiterhin ein diagnostisches Radionuklid, das durch das Chelat komplexiert ist, umfassen.
Zur Sichtbarmachung von Gefäßthromben, verbunden mit einer Anzahl von pathologischen Zuständen, wird ein Konjugat eines Annexins mit einem Chelat, komplexiert mit einem bildgebenden Radionuklid, wie z.B. Tc-99m, an einen Empfänger verabreicht, für welchen eine solche Diagnose erwünscht ist. Der Annexinteil des Konjugats lokalisiert sich rasch an Zielstellen, die durch negativ geladene Oberflächenphospholipi de, wie Gefäßthromben charakterisiert sind. Das Radionuklid wird entsprechend seiner Fähigkeit, über eine der verschiedenen Techniken hierfür, z.B. Gamma-Kamerabildgebung, sichtbar gemacht zu werden, ausgewählt. Wegen der raschen Aufnahme von Annexinen an der Zielstelle und der kurzen Serumhalbwertszeit (gewöhnlich weniger als 30 Minuten) von Annexinen (die durch die radioaktive Markierung nicht signifikant verlängert wird) läuft die Bildgebung an solchen Zielstellen unter geringer Exposition von Nicht-Zielstellen gegen Radioaktivität ab.
Die diagnostische Bildgebung ist abhängig von dem Signal-zu-Rauschen-Verhältnis. Verbesserungen, welche entweder die Zielsignalanhäufung oder die Verminderung des Rauschens beinhalten, verstärken die Wirksamkeit des diagnostischen Bildgebungsprodukts. Für gezielte Bildgebung ist die Verminderung des Rauschens synonym mit der Verminderung der Hintergrundradioaktivität, insbesondere der Blutpoolaktivität. Annexine, einschließlich Annexin V, werden rasch durch die Leber entfernt; mit jedem Durchgang wird jedoch nur ein Teil der Aktivität des umlaufenden Konjugats durch die Leber entfernt.
Um die Hintergrundaktivität aus dem Blut wirksamer zu entfernen, könnte eine Verbesserung bei der Leberextraktion von Annexin enthaltenden Konjugaten verwendet werden. Ein bevorzugtes Verfahren zum Verstärken der Leberextraktion umfasst das Derivatisieren des Annexin enthaltenden Konjugats mit einer Gruppe, wie z.B. Galactose, die durch einen Leberrezeptor erkannt wird. Die Wirksamkeit der Leberrezeptorextraktion der dadurch erkannten Gruppe führt zu erhöhter Entfernung "pro Durchgang" des derivatisierten Annexin enthaltenden Konjugats (z.B. Annexin-Galactose-Konjugat) durch die Leber im Vergleich zu der Menge von so entferntem underivatisiertem Annexin enthaltendem Konjugat.
Eine weitere Verbesserung des Verhältnisses von Signal-zu-Rauschen kann durch Derivatisieren des Annexin-enthaltenden Konjugates mit einem Cluster von Galactosemolekülen, die von einem Leberrezeptor erkannt werden, erreicht werden. Die Effizienz der Leberrezeptorextraktion der dadurch erkannten Gruppe führt zu einer erhöhten Entfernung durch die Leber "pro Durchgang" des derivatisierten Annexin enthaltenden Konjugats (z. B. Annexin-Galactose-Cluster-Konjugat) im Vergleich zu der Menge an underivatisiertem Annexin enthaltenden Konjugat, welches auf diese Art und Wei se entfernt wird. Darüber hinaus sind die mehreren Galactosereste, die in einem Cluster angeordnet sind, mit der Annexin-Konjugatkomponente über einen einzigen Bindungsstelle verbunden. Folglich kann eine geringere oder keine Verringerung in der Annexinzielbindungsaffinität, die aus der Galactosederivatisierung resultiert, im Vergleich zu Annexin-Galactose-Konjugaten erreicht werden.
Annexine sind gewöhnlich (wobei die bemerkenswerteste Ausnahme Annexin II ist) einkettige, nicht-glycosylierte Proteine mit einem Molekulargewicht von etwa 33 – 72 Kilodalton. Annexine besitzen eine Anzahl von biologischen Aktivitäten, die mit durch Calciumionen vermittelte Bindung assoziiert sind.
Untersuchungen haben gezeigt, dass Annexine mit hoher Affinität an anionische Membranlipide in Gegenwart von millimolaren Konzentrationen von Calcium binden. In Gegenwart von Calcium haben diese Proteine eine besonders hohe Affinität für negativ geladene Phospholipide, wie Phosphatidylserin, Phosphatidylgiycerin, Phosphatidinsäure oder Phosphatidylinosit, vgl. z.B. Funakoshi et al., Biochem. 26: 5572 – 78, 1987 und Tait et al., Biochem. 27: 6268 – 76, 1988. Solche negativ geladenen Phospholipide sind mit Gefäßthromben assoziiert (z.B. sind sie auf der Oberfläche von aktivierten menschlichen Plättchen lokalisiert).
Annexine üben antikoagulatorische Wirkungen aus. Die Koagulationshemmung wird durch die Bindung von Annexinen an negativ geladene Oberflächenphospholipide vermittelt (die z.B. auf der Oberfläche von aktivierten Plättchen vorhanden sind). Es wird angenommen, dass diese Bindung die Aktivierung von Gerinnungsfaktoren durch solche negativ geladenen Oberflächenphospholipide blockiert. Annexine sammeln sich rasch an Zielstellen, die anionische Phospholipide tragen, d.h. in einer Zeit von etwa 5 bis 30 Minuten in Abhängigkeit von ihren Umlaufkonzentrationen, bleiben aber im Serum für eine etwas längere Zeit im Umlauf (Umlaufhalbwertszeit < 30 Minuten). Das nachstehende Beispiel III diskutiert Ergebnisse von Bildgebungsversuchen, worin Gefäßthromben in planaren Bildern in einer Durchschnittszeit (nach der Verabreichung von Annexin) von 82 Minuten sichtbar gemacht wurden.
Aufgrund dieser Eigenschaften können Annexine oder an diagnostische oder therapeutische Mittel konjugierte Annexine in Protokollen für die Diagnose oder Behand lung von Gefäßthromben, verbunden mit einer Anzahl von Indikationen, wie DVT (Tiefvenenthrombose), PE (Lungenembolie), Myokardinfarkt, Vorhofflimmern, Probleme mit prosthetischen kardiovaskulären Materialien, Schlaganfall, verwendet werden. Beispielhafte diagnostische Protokolle und Versuche unter Verwendung von radioaktiv markierten Annexinen sind nachstehend beschrieben, um diesen Aspekt der vorliegenden Erfindung weiter zu erhellen.
Ein Beispiel eines bevorzugten Annexins, das in der Praxis der vorliegenden Erfindung verwendbar ist, ist ein Annexin V, welches durch Bohn 1979 aus menschlicher Plazenta, einer reichen Quelle von Annexinen, isoliert und Plazentaprotein 4 (PP4) genannt wurde. Annexin V ist in E. coli exprimiert worden. Es ist auch ein cDNA-Klon von Annexin V mit voller Länge erhalten und in Expressionsvektoren subkloniert worden, wodurch die Produktion von Annexin V enthaltenden Fusionsproteinen erleichtert wird. Annexin V besteht aus vier Domänen (vier unvollständige Tandemrepeats von etwa 75 Aminosäureresten, Funakoshi et al., Biochem. 26: 8087 – 92, 1987), worin jede Domäne aus 5 α-Helices besteht. Von der Seite erscheint das Annexin V-Molekül kronenartig mit wenigstens vier Calcium-Bindungsstellen auf seiner konvexen Oberfläche, durch welche Annexin-Phospholipid-Wechselwirkungen vermittelt werden. Andere Annexinmoleküle sind in der Praxis der vorliegenden Erfindung ebenfalls verwendbar, und die sich auf Annexin V beziehenden Diskussionen hierin gelten allgemein für Annexinmoleküle.
Da Annexin V eine Mehrzahl von Calcium-Bindungsstellen hat, und da die Annexin V-Bindung an negativ geladene Phospholipide durch Calcium vermittelt wird, kann ein konstruiertes Molekül, bestehend aus einer oder mehreren einzelnen Annexin V-Domänen in Bildgebungsprotokollen der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Das Annexinmolekül kann auch auf eine Stelle oder Stellen verteilt sein, die von den Domänengrenzen verschieden sind, um ein konstruiertes Molekül zu ergeben, das zur durch Calcium vermittelten Bindung von anionischen Phospholipiden befähigt ist. Annexin V kann auch in einem oder mehreren Aminosäureresten geändert werden, solange die Affinität von Annexin V für anionische Phospholipide nicht signifikant verschlechtert wird. Der Grad der Bindung von Annexin an Phospholipide kann durch Fluoreszenzquenchen quantifiziert werden, wie von Tait et al., J. Biol. Chem. 264: 7944 – 49, 1989 beschrieben.
Unter den Annexinen hat Annexin V die stärkste Bindungsaffinität (K_d < 10^–10 M) für Phospholipidvesikel, die 80 % Phosphatidylcholin und 20 % Phosphatidylserin unter Bedingungen enthalten, die vergleichbar sind zu Plasma und extrazellulärer Flüssigkeit (1,2 mM ionisiertes Calcium, 0,15 M Ionenstärke). Die Bindung ist reversibel und calciumabhängig.
Um die Hintergrundradioaktivität zu erniedrigen, können Annexine mit Hexose oder mit Gruppen auf Hexosebasis derivatisiert werden. Spezieller können Annexine derivatisiert werden, um eine oder mehrere Hexosen (Sechskohlenstoff-Zuckergruppen) zu enthalten, die von Ashwell-Rezeptoren oder anderen Leberrezeptoren, wie der Mannose/N-Acetylglucosamin-Rezeptor, die mit Endothelzellen und/oder Kupffer-Zellen der Leber assoziiert sind, oder durch den Mannose-6-Phosphat-Rezeptor erkannt werden. Beispiele solcher Hexosen und Gruppen auf Hexosebasis sind Galactose, Mannose, Mannose-6-phosphat, N-Acetylglucosamin, Pentamannosylphosphat. Andere Gruppen, die von Ashwell-Rezeptoren erkannt werden, umfassen Glucose, N-Galactosamin, N-Acetylgalactosamin, Thioglycoside von Galactose und allgemein D-Galactoside und Glucoside können auch in der Praxis der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Galactose ist die prototypische Hexose, die für die Zwecke dieser Beschreibung verwendet wird. Galactosethioglycosid-Konjugation an ein Protein wird vorzugsweise gemäß den Lehren von Lee et al., "2-Imino-2-methoxyethyl 1-Thioglycosides: New Reagents for Attaching Sugars to Proteins," Biochemistry 15(18): 3956, 1976 durchgeführt. Ein anderes verwendbares Galactosethioglycosid-Konjugationsverfahren ist in Drantz et al., "Attachment of Thioglycosides to Proteins: Enhancement of Liver Membrane Binding," Biochemistry 15 18 : 3963, 1976 beschrieben. Die Annexin-Galactose-Konjugation wird auch in den hierin beschriebenen Beispielen diskutiert.
Die Hexose-Konjugation an das Annexin über chemische Verfahren kann entweder vor (nachher gebildete Annäherung) oder nach (vorher gebildete Annäherung) der Konjugation des Chelats an das Annexin erfolgen. Die chemische Hexose-Konjugation wird jedoch bevorzugt vor der Chelatkonjugation durchgeführt.
Die Anzahl von Galactoseresten auf den Produktkonjugaten liegt im Bereich von 1 bis zur maximalen Anzahl von Galactosen, welche die Bindungsaffinität von Annexin für sein Ziel nicht signifikant vermindern. So ist z.B. eine Galactosederivatisierung, welche wenigstens 20 % der nativen Annexin-Bindungsaktivität aufrecht erhält, bevorzugt, wobei die Aufrechterhaltung von wenigstens 50 % nativer Annexin-Bindungsaktivität bevorzugter ist. Die theoretisch mögliche Anzahl von Galactoseresten, die auf dem Annexinmolekül lokalisiert sind, beträgt 22 (d.h. die Anzahl von Lysinresten in der Annexinstruktur). Eine exemplarische Anzahl von Galactoseresten auf radioaktiv markierten Annexin-Galactose-Konjugaten der vorliegenden Erfindung liegt im Bereich zwischen 1 und 5.
Hexose-Cluster werden bevorzugt bei der Anwendung der vorliegenden Erfindung verwendet. Galactose-Cluster sind die prototypischen Hexose-Cluster, welche für den Zweck dieser Beschreibung verwendet werden. Die Konstruktionen von Hexose-Clustern der vorliegenden Erfindung wird mit Blick auf die folgenden Kriterien durchgeführt, wie nachstehend im Zusammenhang mit der Konstruktion eines Galactose-Clusters dargelegt:

1) Anzahl der Galactosen in einem Cluster;
2) Abstand zwischen den Galctosen in dem Cluster; und
3) Abstand zwischen dem Galactose-Cluster und der Annexin-Konjugat-Komponente.

Im Hinblick auf Kriterium Nummer 1 weist die Literatur darauf hin, dass Galactose-Rezeptoren auf der Oberfläche von humanen Hepatozyten als Heterotrimere und, möglicherweise, als Bis-heterotrimere gruppiert sind. Siehe z. B. Hardy et al., Biochemistry, 24: 22–8, 1985. Für die optimale Affinität zu solchen Rezeptoren sollte nach Meinung der Erfinder der vorliegenden Erfindung jedes Galactose-Cluster vorzugsweise wenigstens drei Galactosereste enthalten. Im Allgemeinen gilt: je größer die Anzahl von Zuckern in einem Cluster, desto größer die Neigung des Clusters, von Leberrezeptoren erkannt zu werden.
Eine größere Größe des Zucker-Clusters kann die Annexinbindung an das Ziel beeinträchtigen. Wenn eine signifikante Verschlechterung der Annexinbindung an das Target beobachtet wird (z. B. eine Reduktion auf <20 % der nativen Annexinbindung), kann ein längerer Linker zwischen den beiden Teilen verwendet werden, oder solche großen Cluster sollten in radioaktiv markierten Annexin-Galactose-Cluster-Konjugaten der vorliegenden Erfindung nicht verwendet werden.
Im Hinblick auf Kriterium Nummer 2 sind die Galactoserezeptoren innerhalb jedes Trimers voneinander durch Abstände von 1,5, 2,2 und 2,5 nm (15, 22 und 25 Angström) getrennt. Folglich sollten die Galactosen innerhalb eines Clusters nach Meinung der Erfinder der vorliegenden Erfindung vorzugsweise durch flexiblen Linker getrennt werden, welche einen Abstand von wenigstens 2,5 nm (25 Angström) erlauben. Der Abstand zwischen Zuckerresten ist wahrscheinlich wichtiger, wenn die Anzahl der Zuckerreste klein ist. Bei größeren Konstrukten tritt der geeignete Abstand wahrscheinlich eher in Hinblick auf Zuckerreste, die nicht unmittelbare Nachbarn sind, auf (d. h., Zuckerreste, die weiter voneinander entfernt sind als solche, die unmittelbare Nachbarn sind). Eine durchschnittliche Bindungslänge von 150 pm (1,5 Angström) angenommen, sind die bevorzugten Zucker-Cluster der vorliegenden Erfindung durch einen Abstand der benachbarten Zuckerreste von 10 Bindungslängen oder mehr charakterisiert. Andere bevorzugte Konstrukte beinhalten Galactose-Cluster, welche durch Abstände von benachbarten Zuckerresten von 25 Bindungslängen oder mehr gekennzeichnet sind.
Im Hinblick auf Kriterium Nummer 3 sollte die Distanz zwischen dem Annexin und dem Galactose-Cluster ausreichend sein, um jegliche nachteiligen sterischen Effekte auf die Annexinbindung zu dem Ziel, welche durch die Größe oder Orientierung des Galactose-Clusters verursacht wird, zu vermeiden. Diese Distanz ist vorzugsweise größer als 7 Bindungslängen oder 1 nm (10 Angström). Wenn nötig wird ein Extendermolekül zwischen das Galactose-Cluster und den Linker (welcher den Galactose-Cluster und die Annexinkomponente verbindet) oder zwischen das Annexin und den Linker eingebaut, um für die erforderliche Distanz zu sorgen.
Während die vorangehenden Parameter für Galactose optimal zu sein scheinen, sollte beachtet werden, dass diese Faktoren bei anderen Hexosen oder Mischungen daraus, die an die gleichen Rezeptoren binden können oder nicht, oder anderswie binden können, variieren können. In Anbetracht der Lehre dieser Anmeldung kann ein Fachmann auf dem Gebiet, unter Verwendung der zur Verfügung stehenden Synthese techniken, ein Annexin und ein aktives Agens an weiteren Hexose-Clustern anfügen und solche Konstrukte identifizieren, welche ein optimales Verhalten zur Verfügung stellen.
Jegliche verzweigte Zuckerstrukturen, die die oben beschriebenen Kriterien erfüllen, können in der Anwendung der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Bevorzugte Galactose-Cluster der vorliegenden Erfindung weisen die folgenden Strukturen auf:
worin X vorzugsweise H oder ein Methyl ist, was Galactose-Cluster ergibt, welche 4, 8, 16 bzw. 32 Galactosereste aufweisen. Weitere Wiederholungen in dem Verzweigungsschema erlaubt die Erweiterung der Galactose-Cluster, so dass sie 32, 64, etc., Galactosereste enthalten. Zusätzlich kann die Linkereinheit zwischen dem Zucker selbst und der Verzweigungsstruktur (dargestellt als -S-(CH₂)₄-NX-) in der Länge variieren.
Alternative Verzweigungsstrukturen können ebenfalls bei der Konstruktion von Galactose-Clustern in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Zum Beispiel können andere Konstrukte, in denen die Verzweigung in einer Verdopplung der Anzahl von Galactoseresten resultiert, verwendet werden. Darüber hinaus werden auch Konstrukte von der vorliegende Erfindung in Betracht gezogen, in denen die Verzweigung in einer Verdreifachung oder anderen geeigneten Vervielfachungen der Anzahl an Galactoseresten resultiert.
Eine weitere potenzielle Verzweigungskonstruktion basiert auf dem Molekül Bishomotris: (HO-CH₂)₃-C-NH₂. Das Sulfhydryl enthaltene Derivat dieses Moleküls kann ebenfalls verwendet werden. In dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird jeder Arm des Bis-homotrismoleküls verlängert und endet in einer Carboxylsäure: [HO₂C-(CH₂)_y-Z-(CH₂)]₃-C-NH₂, wobei ZS oder O ist und y in einem Bereich von 1 bis 10 liegt. Für diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein bevorzugtes Galactose-Cluster durch die folgende Strukturen gekennzeichnet:
worin X vorzugsweise N oder Methyl ist; y in einem Bereich von 1 bis 10 liegt; und Z O oder S ist. Die oben angegebenen Strukturen weisen 3, 9 bzw. 27 Galactosereste auf. Eine weitere Wiederholung der Verzweigung erlaubt die Erweiterung auf 81, etc., Galactosereste.
In Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, in denen das Chelat durch eine einzige funktionelle Gruppe, die für die Konjugation zur Verfügung steht und geeignet ist, gekennzeichnet ist, werden die Annexin-, Chelat- und Galactose-Cluster-Komponenten vorzugsweise über einen trifunktionellen Linker verbunden. Funktionelle Gruppen, welche für die Konjugation "zur Verfügung stehen" sind solche, die nicht durch sterische Beschränkungen von der Konjugatbildung abgehalten werden. Funktionelle Gruppen, welche für die Konjugation "geeignet" sind, sind solche, welche in einem chemische Sinne fähig sind, mit den zur Verfügung stehenden funktionellen Gruppen, die mit anderen Konjugatkomponenten assoziiert sind, zu reagieren. Darüber hinaus beeinträchtigt die Konjugation von "geeingeten" funktionellen Gruppen eine notwendige Funktion der Komponente, mit welcher die funktionelle Gruppe assoziiert ist, nicht wesentlich. Zum Beispiel ist eine funktionelle Gruppe, welche sich in der Komplementaritätsdeterminierenden Region einer Antikörperzielkomponente befindet, im Allgemeinen nicht "geeignet" für die Konjugation, da die Targetingfähigkeit des Antikörpers durch eine solche Bindung wahrscheinlich wesentlich eingeschränkt wird.
Nützliche trifunktionelle Linker sind empfänglich für die Bindung mit funktionellen Gruppen, welche auf den drei in der Konjugatkonstruktion verwendeten Konjugatkomponenten oder Extenderkomponenten zur Verfügung stehen. Ein nützlicher trifunktioneller Linker ist Lysin, worin die alphaamino-, epsilonamino- und carboxylfunktionellen Gruppen verwendet werden. Ein Fachmann auf dem Gebiet könnte weitere trifunktionelle Linker identifizieren und dieselben in der vorliegenden Erfindung, wie hierin dargelegt, verwenden.
Extendermoleküle, welche in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, sind bifunktionelle Einheiten, welche fähig sind, entweder an die Annexinkomponente und den Linker oder die Galactose-Cluster-Komponente und den Linker zu binden. Geeignete Extendermoleküle schließen Aminocaproatreste, HS-(CH₂)_nCOOH oder eine aktivierte Esterform davon, worin n in einem Bereich von 2 bis 5 liegt, ein. Ein durchschnittlicher Fachmann auf dem Gebiet ist fähig, weitere geeignete Extendermoleküle, wie hierin beschrieben, zu identifizieren und zu verwenden. Alternativ kann die Extenderfunktion durch einen in geeigneter Weise konstruierten Linker bedient werden.
Ferner können auch Gruppen zur Erleichterung der Bindung in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Solche Gruppen sind bifunktionell und erleichtern die Bindung der Konjugatkomponenten, z. B. Galactose-Cluster, Annexin, Chelat, Linker und Extender. Beispiele für solche bindungserleichternde Gruppen schließen Harnstofffunktionalitäten, Thioharnstofffunktionalitäten, Succinatbrücken und Maleimide ein. Solche bindungserleichternde Komponenten können von Fachleuten auf dem Gebiet leicht identifiziert werden.
Ein Beispiel für ein solches Linker-Extender-Bindungs-Erleichterungssystem ist unten gezeigt:
wobei das Alpha-Amin des Lysinlinkers über eine Harnstoff- oder eine Thioharnstofffunktionalität an einen Aminocaproat-Spacer (der wiederum an ein Galactose-Cluster gebunden ist, welcher nicht gezeigt ist) gebunden ist; das Lysincarboxylat für die Bindung an ein Chelat (nicht gezeigt) zur Verfügung steht; und das Epsilon-Amin des Lysinlinkers für die Bindung an ein Lysinrest der Annexinkomponente (nicht gezeigt) über eine Succinatbrücke zur Verfügung steht. Weitere Aminosäurereste der Annexinkomponente, wie z. B. Cystein, können ebenfalls für Bindungszwecke verwendet werden. Alternativ kann eine Maleimid-S-(CH₂)_nCO- bindungserleichternde Komponente – Extender-Kombination verwendet werden, um den Zuckerrest mit dem Lysin zu verbinden. Ein Beispiel für ein Konjugat, welches durch einen trifunktionellen Linker verbunden ist, wird in Beispiel VII behandelt.
Wenn die Chelatkomponente des Konjugates dadurch gekennzeichnet ist, dass sie mehr als eine für die Konjugation zur Verfügung stehende und geeignete funktionelle Gruppe aufweist, kann das Galactose-Cluster mit der Chelatkomponente verbunden werden, die wiederum mit der Annexinkomponente des Konjugates über zwei oder mehr bifunktionelle Linker verbunden ist. Vorzugsweise ist die Annexinkomponente des Konjugates bei der Bildung eines Galactose-Cluster-Chelat-Annexin-Konjugats als letzte angefügt. Geeignete bifunktionelle Linker und Linkingmethoden können von dem Fachmann auf dem Gebiet identifiziert und angewandt werden. Ein Beispiel für ein solches Chelat und eine Konjugationsmethode ist in Beispiel V dargestellt.
Die Annexinkonjugation an den Hexose-Cluster und das Chelat über chemische Verfahren kann entweder vor der Komplexierung eines Radiometalls mit dem Chelat (Post-Ausbildungsansatz) oder danach (Prä-Ausbildungsansatz) stattfinden. Die chemische Konjugation wird vorzugsweise im Anschluss an die Radiometallkomplexierung durchgeführt, es sei denn, dass in dem Konjugat verwendete Chelat ist fähig, das Radionuklid mit raschen Kinetiken bei Raumtemperatur zu binden.
Annexin V wird zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung mit einem bildgebenden Radionuklid radioaktiv markiert. In der vorliegenden Erfindung verwendbare Radionuklide umfassen Gammastrahler, Positronstrahler, Auger-Elektronenstrahler, Röntgenstrahler, Fluoreszenzstrahler. Radionuklide, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind im Stand der Technik bekannt und umfassen ⁶⁴Cu, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁰⁰Pd, ²¹²Bi, ²¹²Pb, ¹⁰⁹Pd, ⁶⁷Cu, ^99mTc, ⁹⁴Tc, ⁹⁵Ru, ¹⁰⁵Ru, ⁹⁹Rh, ¹⁰⁵Rh, ¹¹¹In, ¹⁵³Sm, ¹⁷⁷Lu, ¹⁷⁰L, ¹⁸⁹Pt, ¹⁹³Pt, ¹⁹⁹Au, ¹⁹⁷Hg.
Tc-99m ist ein bevorzugtes Radionuklid für die Praxis der vorliegenden Erfindung. Tc-99m ist gemäß der vorliegenden Erfindung sowohl bei niedriger als auch hoher spezifischer Aktivität (0,53 μCi/μg – 101,2 μCi/μg) stabil gebunden worden. Es wurden angepasste radiochemische Ausbeuten und gute radiochemische Reinheiten erhalten. Bindungsstudien mit aktivierten Plättchen wurden ebenfalls durchgeführt, und die radioaktiv markierten Annexin V-Konjugate banden gut an aktivierte Plättchen.
N₂S₂- und N₃S-Chelate sind im Stand der Technik bekannt. So sind z.B. bevorzugt N₂S₂-Chelate in der US-Patentschrift Nr. 4,897,225 beschrieben, und bevorzugte N₃S-Chelate sind in der US-Patentschrift Nr. 4,965,392 beschrieben. Die vorliegenden Erfinder haben diese stabile Chelatisierungstechnologie angewandt, um die Thrombus-Zielfähigkeit von Annexinmolekülen auszunutzen, wodurch ein Bildgebungsmittel erhal ten wird, welches fähig ist, rasch Gefäßthromben in vivo sichtbar zu machen. Die radioaktiven Annexine und die radioaktiv markierten Annexin-Galactose-Cluster-Konjugate der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um Thrombusbilder zu erhalten, welche den hohen Wert der Hintergrundradioaktivität verringern oder eliminieren, der aus metabolisch abgebautem, radioaktiv markiertem Konjugat herrührt. Die radioaktiv markierten Annexine und die radioaktiv markierten Annexin-Galactose-Cluster-Konjugate vermeiden auch klinisch unannehmbare Toxizität gegenüber Nicht-Zielzellstellen. In den im Beispiel III hierin beschriebenen Schweine-Studien verhielt sich mit Tc-99m radioaktiv markiertes Annexin V besser als I-123.
Die Radiomarkierung von Annexin X mit einem Radionuklid unter Verwendung eines N₂S₂- oder N₃S-Chelats kann entweder unter Verwendung einer vorher gebildeten oder einer nachher gebildeten Annäherung durchgeführt werden. Das heißt, das Radionuklid wird entweder in dem Chelat vor (vorher gebildet) oder nach (nachher gebildet) der Konjugation des Chelats an Annexin V komplexiert. Die vorher gebildete Annäherung ist bevorzugt, und geeignete Verfahren dafür sind in den Beispielen I, II und IV wiedergegeben.
Für Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, in denen Chelate rasche Komplexierungen des Radionuklids bei Raumtemperatur zeigen, können Chelate mit der folgenden Struktur verwendet werden:
worin eine oder mehrere T-Subsituenten eine funktionelle Gruppe beinhalten, die für die Konjugation mit einer weiteren Konjugatkomponente zur Verfügung steht und geeignet ist. In dem oben erwähnten Beispiel ist eine funktionelle Gruppe, wie z. B. ein Amin, fähig, mit dem Lysincarboxylrest oder einem aktivierten Esterderivat davon zu reagieren. Alternativ kann ein z. B. Chelat, welches einen aktiven Ester enthält, mit einer amino funktionellen Gruppe konjugiert werden. Ein Fachmann auf dem Gebiet ist versiert in der Eigenschaft und der Spezifität von funktionellen Gruppen, und solche Eigenschaft und Spezifität wird auch hierin erörtert.
Annexinmoleküle können durch Zugabe von 2 bis 6 terminalen Aminosäureresten modifiziert werden, um die Konjugationsreaktion zwischen dem Annexinmolekül und dem Chelat oder zwischen dem Annexinmolekül und einem Galactoserest oder zwischen dem Annexinmolekül und entweder einem Linker oder einem Hexose-Cluster zu erleichtern. So können z.B. terminale Aminosäurereste zugesetzt werden, um eine Sulfhydrylgruppe zu ergeben, oder um eine Gruppe zu ergeben, die zur Derivatisierung an eine Maleimidgruppe befähigt ist, wobei solche Sulfhydryl- und Maleimidgruppen für die Konjugationsreaktion erhältlich sind. Diese Modifikation kann durch Verfahren der Proteinchemie oder über die Herstellung eines geeigneten Fusionsproteins oder andere hierfür verwendbare Techniken durchgeführt werden.
Radioaktiv markierte Annexin-Galactose-Cluster-Konjugate der vorliegenden Erfindung bilden einen zusätzlichen Vorteil gegenüber den früher hergestellten, mit I-123-markierten Annexinen dahingehend, dass sie der Verpackung in einem nicht radioaktiven Kit zugänglich sind. Das heißt, die Annexin- oder Annexin-Galactose-Cluster- oder Galactose-Cluster- und Chelat-Komponenten können einzeln abgepackt und getrennt von der Tc-99m-Komponente (und möglicherweise getrennt voneinander abgepackt) bereitgestellt werden. Wenn ein Patient, der ein Thrombusbild braucht, vorhanden ist, kann ein nicht radioaktiver Kit bestellt oder aus dem Lager geholt werden; Tc-99m kann von einer Radiopharmazie oder einer anderen Quelle dafür erhalten werden; das vorher gebildete oder nachher gebildete Chelatisierungs-Komplexierungsverfahren wird durchgeführt; das radioaktiv markierte Annexin oder das radioaktiv markierte Annexin-Galactose-Konjugat wird dem Patienten verabreicht; und der Patient wird anschließend der Bildgebung unterworfen. Für radioaktiv markierte Annexin-Galactose-Cluster-Konjugate wird vorzugsweise ein Chelat-Annexin-Galactose-Cluster-Konjugat hergestellt und in dem Kit abgepackt, obwohl Annexin-Galactose-Cluster/Chelat- Zweikomponenten-Kits oder andere Multikomponenten-Kits ebenfalls verwendet werden können.
Eine Gefriertrocknung und das Abpacken der Konjugatkomponenten in einer sterilen, pyrogenfreien Umgebung kann durch Techniken erfolgen, die dem Fachmann im Stand der Technik betreffend gute Herstellungspraktiken, insbesondere wenn sich solche Praktiken auf biologische Materialien beziehen, bekannt sind.
Radioaktiv markierte Annexin-Galactose-Cluster-Konjugate der vorliegenden Erfindung werden in solchen Mengen verabreicht, dass sie eine diagnostisch wirksame Menge des Radionuklids an Zielstellen ergeben. Geeignete verabreichte Dosen hängen von einer Vielzahl von Faktoren ab, die zum großen Teil patientenspezifisch sind, und Fachleute werden solche Faktoren in der Praxis der vorliegenden Erfindung berücksichtigen. Die Komponenten der radioaktiv markierten Annexin- Galactose-Cluster-Konjugate beeinflussen auch Dosismengen auf eine Art und Weise, die den Fachleuten bekannt oder die routineweise feststellbar sind. Im Allgemeinen wird das radioaktiv markierte Annexin-Galactose-Cluster-Konjugat an große Säuger in einer Dosis im Bereich von 0,3 bis 300 μg/kg Körpergewicht des Empfängers verabreicht, wobei 3 bis 10 μg/kg bevorzugt sind, abhängig von den physiologischen Kennzeichen des Patienten und des vorliegenden oder vermuteten Leidens. Ein Fachmann ist in der Lage, eine geeignete Dosis und einen geeigneten Verabreichungsweg für einen gegebenen Empfänger mit einem gegebenen Leiden festzulegen.
Radioaktiv markierte Annexin- Galactose-Cluster-Konjugate der vorliegenden Erfindung können in jeder hierfür geeigneten Weise verabreicht werden. So kann z.B. eine intravenöse Infusion verwendet werden, um radioaktiv markierte Annexin- Galactose-Cluster-Konjugate zu verabreichen. Andere Verabreichungswege finden ebenfalls Verwendung in der Praxis der vorliegenden Erfindung. Beispielhafte zusätzliche Verabreichungswege sind eine Injektion durch die arteriellen (z.B. Koronararterie) intrakoronaren, intralymphatischen, intrathekalen oder anderen Hohlraumwege.
Nach der Verabreichung des Radionuklids kann der Empfänger in Abhängigkeit von der Natur des Radionuklids und dem Verabreichungszweck verschiedenen Verfahren zum Nachweis von radioaktiven Emissionen aus der Stelle oder den Stellen unterworfen werden, an welchem sich das Radionuklid sammelt. So sind z.B. Konjugate, die Tc-99m enthalten, mittels einer Gamma-Kamera bildgebend zu verarbeiten.
Die Erfindung wird weiter durch die Vorlage der folgenden Beispiele beschrieben. Diese Beispiele werden zur Erläuterung vorgelegt.
Vergleichsbeispiel I
Verfahren zur radioaktiven Markierung eines Annexin-N₂S₂-Chelat-Konjugats
Annexin V kann aus einer Vielzahl von Gewebeextrakten, wie Leber, Lunge und Plazenta, in Übereinstimmung mit Verfahren isoliert werden, die z.B. in Funakoshi et al., Biochem. 26: 8087 – 92, 1987, Tait et al., Biochem. 27: 6268 – 76, 1988 und in der US-Patentschrift Nr. 4,937,324 beschrieben sind. Darüber hinaus kann Annexin V in E. coli exprimiert werden, wie von Tait et al., Archives of Biochemistry and Biophysics 288: 141 – 44, 1991 beschrieben.
Annexin V wurde radioakativ mit Tc-99m unter Verwendung eines Diamid-Dimercaptid-N₂S₂-Chelats entsprechend dem OncoTrac^® Small Cell Lung Cancer Imaging Kit-Markierungsverfahren, beschrieben in J. Nucl. Med. 32: 1445 – 51, 1991, radioaktiv markiert.
Ein bevorzugtes Verfahren zur radioaktiven Markierung von Annexin V mit Tc-99m bildet ein modifiziertes OncoTrac^® Kit-Verfahren unter Verwendung von C-18 Baker gereinigtem Tc-99m-N₂S₂-TFP. In diesem Verfahren wird eine angesäuerte, aktive Esterlösung durch Zugabe von 0,16 ml von 0,2 M Chlorwasserstoffsäure : Eisessig (Verhältnis 14 : 2) zu 0,6 ml 2,3,5,6-Tetrafluorphenyl-4,5-bis-(S-1-ethoxyethylmercaptoacetamido)pentanoat (0,3 mg, 0,0005 mol, frisch aufgelöst in 0,9 ml Isopropylalkohol) hergestellt. Dann wurden 0,5 ml dieser Lösung zu 1,1 ml Tc-99m-Gluconat (hergestellt aus 0,12 mg SnCl₂ · 2 H₂O, 5,0 mg Natriumgluconat bei pH 6,1 – 6,3 und 100 mCi/ml [Tc-99m]-Pertechnetat, d.h. der erste Schritt in dem OncoTrac^® Kit-Markierungsverfahren) zugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde 15 Minuten auf 75°C erwärmt, gefolgt von Kühlen auf Eis. Das erhaltene Tc-99m transchelatierte, aktive Tetrafluorphenylesterderivat von Tc-99m-4,5-Bis(thioacetamido)pentanoat wurde, optional und vorzugsweise, mit 2 ml Wasser verdünnt und durch Laden der Reaktionsmischung auf eine konditionierte C-18-Patrone (J.T. Baker), achtmaliges Waschen mit 2,0 ml Wasser, gefolgt durch Trocknen der Säule für 5 Minuten und Eluieren mit 100 % Acetonitril gereinigt. Das Lösungsmittel wurde unter einem stetigen Strom von N₂ eingedampft. Dann wurden 0,15 ml phosphatgepufferte, physiologische Kochsalzlösung (PBS), 0,15 ml Annexin V bei 2,35 mg/ml und 0,2 ml 0,2 M Bicarbonat (pH 10,0) zur Konjugation an Tc-99m-N₂S₂ zugesetzt. Nach 20 Minuten bei Raumtemperatur wurde das Tc-99m-N₂S₂-Annexin V-Konjugat durch Durchleiten durch eine G-25 SEPHADEX^® (PD-10)-Säule (erhältlich von Pharmacia), äquilibriert mit PBS, gereinigt. Fraktionen (1,0 ml) wurden gesammelt, und diejenigen Fraktionen, die Annexin V enthielten, wurden vereinigt. Die Proteinkonzentration wurde durch UV-Absorption bei 280 nm bestimmt. Die Tc-99m-Annexin V (300 – 350 mg) Konjugatlösung wurde verdünnt und in Rinderserumalbumin (BSA) enthaltender PBS bei einer Endkonzentration von 15 – 20 mg BSA/ml PBS vor der Injektion gelagert.
Vergleichsbeispiel II
Verfahren zur radioaktiven Markierung eines Annexin-N₃S-Chelat-Konjugats
S-Benzoylmercaptoacetylglycylglycylglycin (S-Benzoyl-MAG₃) wird gemäß den in der US-Patentschrift Nr. 4,965,392 beschriebenen Verfahren hergestellt. Dann werden 25 Mikrogramm S-Benzoylmercaptoacetylglycylglycylglycin in 0,10 ml von 1,10 M Carbonatpuffer (pH 12) aufgelöst. Dann werden 75 mCi Tc-99m-Pertechnetat in etwa 1,0 ml zugesetzt, gefolgt von 1,0 mg frisch aufgelöstem Natriumdithionit (10 mg/ml). Diese Mischung wird 3 Minuten auf 100°C plus oder minus 4°C erwärmt, wird dann in einem Eisbad 5 Minuten abgekühlt, wodurch Tc-99m-MAG₃ erhalten wird, bestimmt durch ITLC (Lösungsmittel CH₃CN), Anionenaustauscher-HPLC (Beckman AX, 10 Mikron 0,01 M Na₂SO₄ / 0,01 M Na₃PO₄, pH 7,0) und Umkehrphasen-HPLC (Beckman ODS, 5 Mikron 2 % CH₃CN / 0,01 M Na₃PO₄, pH 7,0).
Der Tc-99m-MAG₃-Komplex in Carboxylatform wird dann verestert; 0,20 ml 1 N HCl, 0,30 ml 0,2 M Phosphatpuffer pH 6,0, 10,0 mg 2,3,5,6-Tetrafluorphenol (TFP) in 0,01 ml 90 % CH₃CN und 12,5 mg EDC(1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid) in 0,10 ml 90 % CH₃CN werden vereinigt, und die Reaktanten werden bei Raumtemperatur (25° plus oder minus 2°C) 1 Stunde vermischt. Bei diesem Punkt ergibt sich Tc-99m-MAG₃-TFP-Ester, bestimmt durch ITLC (Lösungsmittel CH₃CN), Anionenaustauscher-HPLC (Beckman AX, 10 Mikron, 0,01 M Na₂SO₄ / 0,01 M Na₃PO₄, pH 7,0) und Umkehrphasen-HPLC (Beckman ODS, 5 Mikron, 34 % CH₃CN / 0,01 M Na₃PO₄, pH 7,0). Die Präparation wird unter Verwendung einer C-18 Baker-Säule gerei nigt. Die Reaktionsmischung wird, optional und vorzugsweise, mit 2 ml Wasser verdünnt und auf die Säule geladen, zweimal mit Wasser und achtmal mit 10 % C₂H₅OH 10,01 M Na₃PO₄, pH 7,0 gewaschen. Das Produkt wird mit CH₃CN eluiert, und das Lösungsmittel wird vor der Konjugation mit Annexin V entfernt.
Die Konjugation des aktiven Esters an Annexin V wird durchgeführt, indem Annexin V in einem Phosphatpuffer, pH 9,5, zu dem Tc-99m-MAG₃-TFP-Ester zugesetzt wird. Die Reaktion wird wenigstens 30 Minuten durchgeführt, und das erwünschte radioaktiv markierte Annexinprodukt wird durch Durchleiten durch eine PD-10-Gelfiltrationssäule erhalten.
Vergleichsbeispiel III
Thrombus-Bildgebung mit einem radioaktiv markierten Annexin
A. Tierpräparation – LA Gefäßthromben.
Hungernde 25 – 30 kg Yorkshire-Schweine wurden mit intramuskulär verabreichtem Telazol (5 – 10 mg/kg) (im Handel erhältlich von AVECO Co.) und mit im Handel erhältlichem Atropine (1 mg, Elkins-Sinn, Inc., Cherry Hill, NJ) sediert. Eine Surital-Anästhesie (200 mg) (im Handel erhältlich von Abbott Laboratories) wurde intravenös verabreicht. Die Tiere wurden intubiert, und ihnen wurde eine Inhalationsanästhesie von 1,5 – 2 % Halothane (im Handel erhältlich von Abbott Laboratories) und Sauerstoff verabreicht, die ausreichend war, um einen tiefen Anästhesiegrad und physiologische arterielle Blutgase zu erhalten. Es wurde eine kontinuierliche elektrokardiografische Überwachung unter Verwendung von Krokodilklemmelektroden eingerichtet. Es wurde ein Schnitt in dem Nackenbereich durchgeführt, und ein französischer Katheter (USCl Co, Billerica, MA) wurde in die rechte Arteria carotis communis sowohl für die Überwachung des Blutdrucks und des arteriellen Blutgases als auch für Blutprobenentnahme eingebracht.
Die Schweine wurden in eine rechte, seitliche decubitate Stellung verbracht, und ein seitlicher Brustwandschnitt wurde durchgeführt, um das Herz freizulegen. Die Inzision wurde durch einen Brustwandschnitt-Retraktor offengehalten. Das Perikard wurde geöffnet, und der linke Vorhofanhang wurde von dem linken Vorhof durch eine Gefäßkreuzklammer isoliert. Mit einem Gummiansatz versehene Zangen wurden verwendet, um den Anhang sanft zu quetschen. Fünf Minuten später wurden Ricinoleat (1 mg, ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, CA) und Thrombin (50 mg, Johnson and Johnson Co., Arlington, Texas) in den LAA (linker Vorhofanhang) unter Verwendung einer 27 Ga-Nadel injiziert. Die Kreuzklammer wurde 10 Minuten später entfernt.
1 Stunde nach der Quetschverletzung wurde Tc-99m-Annexin V, hergestellt gemäß dem vorstehenden Beispiel I, als intravenöse Bolusdosis in eine Ohrvene verabreicht. Die intravenöse Leitung wurde dann mit physiologischer Kochsalzlösung gespült. 7 Tieren wurde I-125 markiertes Ovalbumin als nicht-spezifische Kontrolle verabreicht, herstellbar z.B. nach dem Verfahren, das von Fraker et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 849 – 57, 1978) beschrieben ist. Kurz gesagt, wurde mit I-125 radioaktiv markiertes Ovalbumin durch das Iodogen-Verfahren hergestellt, wobei 600 μg Ovalbumin (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri) und NaI-125 (2 mCi, 0,92 nmol) verwendet wurden.
Die Bilderzeugung wurde wie nachstehend beschrieben durchgeführt. Am Ende des experimentellen Verfahrens (gewöhnlich etwa 150 Minuten) wurden die Tiere durch eine intravenöse Bolusdosis von 80 mÄquiv. KCl getötet, während die Tiere sich noch unter der allgemeinen Anästhesie befanden. Eine Endblutprobe wurde für die Impulszählung entnommen. Das Herz wurde rasch entnommen, von Blut freigewaschen und zur Impulszählung in Proben zerteilt. Zusätzliche Proben der Arteria carotis, von Lunge, Leber, Milz, Muskeln und Nieren wurden von einigen Tieren erhalten.
B. Kontrollen. Fünf verschiedene Typen von Kontrollen wurden verwendet: das Modell des eröffneten Brustkorbs, das Modell des geschlossenen Brustkorbs, Ovalbumin, Indiumplättchen und nicht-spezifischer Tc-99m markierter Antikörper.

1. Modell des eröffneten Brustkorbs. In drei Tieren wurde das Herz, wie vorstehend, exponiert, aber der linke Vorhof wurde nicht isoliert, gequetscht oder mit Ricinoleat/Thrombin injiziert. Markerbilder mit einem Cobaltmarker wurden durchgeführt, wie nachstehend beschrieben, und das Tc-99m-Annexin V wurde 30 – 60 Minuten nach LAA-Exposition injiziert. Die Bildgebung und die Probengewinnung waren identisch mit der vorstehend in A beschriebenen.
2. Modell des geschlossenen Brustkorbs. In sieben Tieren wurde eine intravenöse Ohrleitung etabliert. Es wurde kein Brustwandschnitt vorgenommen. Die Sedierung und die Anästhesie waren identisch zu der vorstehend in A beschriebenen. Das Tc-99m-Annexin V (+/andere Kontrollradionuklide, wie I-125-Ovalbumin oder In-111-Plättchen) wurde verabreicht, und eine Bildgewinnung wurde durchgeführt.
3. Ovalbumin. I-25-Ovalbumin wurde an 7 Tiere als negatives Kontrollprotein verabreicht. Ovalbumin hat eine Molekulargröße ähnlich der von Annexin und weist eine geringfügig langsamere Blutclearance auf.
4. Indiumplättchen. Eine Markierung mit In-111-Plättchen wurde in 7 Tieren als positive Impulszählungsmarkierung durchgeführt. Mit In-111 radioaktiv markierte Plättchen wurden gemäß dem Verfahren hergestellt, das von Straffon et al., Am. J. Cardiol. 47: 874, 1981 und Stratton et al., Circulation 69: 561, 1984 beschrieben ist. Eine Bildgebung wurde aufgrund der langen Halbwertszeit der In-111-Plättchen im Serum nicht versucht.
5. Nicht-spezifischer Tc-markierter Antikörper. In einem einzigen Versuch wurde ein Thrombus im linken Vorhof durch das vorstehende Verfahren erzeugt, aber Tc-99m-Annexin V wurde nicht verabreicht. Anstelle davon wurde ein Tc-99m-Fab-Fragment eines Antikörpers, bezeichnet als NR-LU-10, verabreicht. NR-LU-10 ist ein IgG2b monoklonaler Antikörper mit einem Molekulargewicht von 150 Kilodalton, der ein von den meisten Carcinoma exprimiertes Glycoproteinantigen von annähernd 40 Kilodalton erkennt. NR-LU-10 ist ein gut charakterisierter Pancarcinom-Antikörper, welcher an mehr als 565 Patienten in klinischen Versuchen an Menschen in sicherer Weise verabreicht wurde. NR-LU-10-Fab wird nach bekannten Techniken hergestellt und wird radioaktiv markiert nach den Verfahren, die in J. Nucl. Med. 32: 1445 – 51, 1991 beschrieben sind, und nach dem C-18 Baker gereinigtes Tc-99m-N₂S₂-TFP-Verfahren, beschrieben in Beispiel I zur Herstellung von radioaktiv markiertem Annexin V. Dieses Tc-99m- Fab-Konjugat wurde als Negativkontrolle sowohl für die Impulszählung als auch für die Bildgebung konstruiert.

C. Bildgebung.
Ein Cobalt-Marker wurde auf die exponierte Oberfläche des LAA aufgebracht und mit chirurgischem Band, das an dem Brustwandschnitt-Retraktor befestigt war, an der Stelle gehalten. Das Band wurde so eingestellt, dass der Marker sich gewöhnlich mit dem LAA mit jedem Herzzyklus bewegte. Markerbilder wurden 10 Sekunden in jeder planaren Ansicht und 10 Sekunden in jedem tomografischen Schnitt gewonnen. Der Cobalt-Marker wurde dann entfernt.
Eine General Electric Starport-Kamera mit einem Allzweckkollimator wurde verwendet, um die Tc-99m-Bilder zu erhalten. Es wurden 5-minütige planare Aufnahmen nacheinander in der linken lateralen Ansicht, der 45 LAO-Ansicht und der anterioren Ansicht durchgeführt. Diese waren gefolgt von einer 10-minütigen tomografischen Aufnahme. Dieser gesamte Satz von 3 planaren Aufnahmen und 1 tomografischen Aufnahme wurde für insgesamt 5 Sätze wiederholt. Es wurde darauf geachtet, das Schwein oder das Bildgebungsgestell während der gesamten Bildgebungsabfolge nicht zu bewegen.
Bilder wurden auf einem Microdelta-Computer aufgezeichnet, der von einem VAX-Großrechnersystem abhängig war. Bilder wurden auf Band oder auf der VAX-Festplatte gespeichert. Die planare Bildanalyse bestand darin, zuerst das Bild mit dem Marker zu betrachten und die Markerposition auf dem Betrachtungsendschirm aufzuzeichnen. Das erste Bild, das nach der Injektion von Tc-99m-Annexin V erhalten wurde, wurde verwendet, um den Herzblutpool zu definieren. Jedes folgende Bild wurde unter Verwendung des Markers und des anfänglichen Blutpools als Bezüge betrachtet und analysiert. Jedes Bild wurde als positiv, zweideutig oder negativ bewertet.
Bei dreizehn Tieren wurden linke Vorhofthromben hervorgerufen, und sie wurden der Bildgebung, wie vorstehend beschrieben, unterworfen. Zwölf Tiere erhielten Tc-99m-Annexin V vor der Bildgebung injiziert, und ein Tier erhielt ein nicht-spezifisches Tc-99m Fab als Kontrolle injiziert. Eine Bildgebung des geschlossenen Brustkorbs wurde bei 7 Tieren ohne atrialen Schaden durchgeführt, und Versuche mit dem Modell des eröffneten Brustkorbs wurden bei 3 Tieren durchgeführt. Bei Tieren mit Vorhofthromben wa ren sämtliche planaren Bilder negativ, die bei weniger als 35 Minuten nach der Verabreichung von Tc-99m-Annexin V aufgenommen wurden. Neun der planaren Bilder mit Vorhofthromben, die nach mehr als 70 Minuten aufgenommen wurden, waren positiv, eines war zweifelhaft und zwei waren negativ. Sämtliche der tomografischen Bilder von Vorhofthromben waren entweder positiv (n = 10) oder zweifelhaft (n = 2) bei Bildgebungszeiten von größer als 2 Stunden nach der Injektion. Die mittlere Zeit, in welcher die planaren Bilder nach der Verabreichung von Tc-99m-Annexin V positiv wurden, betrug 82 Minuten (35 – 135 Minuten).
Keines der Kontrolltiere mit geschlossenem Brustkorb ergab positive Bilder. Eines von drei Modellen mit offenem Brustkorb zeigte ein positives Bild bei 85 Minuten. Es wird angenommen, dass dieses falsche Positiv von der Erzeugung chirurgisch induzierter Thromben herrührt.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die intravenöse Verabreichung von Tc-99m-Annexin V die Aufnahme von diagnostischen Bildern erlaubt, welche Vorhofgefäßthromben innerhalb einer kurzen Zeit nach der Konjugatverabreichung identifizieren.
D. Probenentnahme.
Proben (sowohl Blut als auch Gewebe), wie vorstehend beschrieben, wurden gewogen und in Glasfläschchen zur unmittelbaren Zählung von Tc-99m verbracht. Nachdem das Tc-99m abgeklungen war, typischerweise bei 5 – 7 Tagen) wurden die Proben nochmals untersucht, um die I-125-Zählungen zu erhalten. Jedes Glasfläschchen wurde 1 Minute gezählt. Die Zählungen wurden bezüglich des Zerfalls und dann bezüglich des Gewichts korrigiert und als Impulse pro Minute pro Gramm aufgezeichnet. Die Impulse pro Minute pro Gramm für jede Probe wurden dann durch Dividieren der Impulse pro Minute pro Gramm der Endblutprobe normalisiert. Folglich wurden die Ergebnisse für jede Probe in einem Verhältnis mit der letzten Blutprobe berechnet, was einen aussagekräftigen Vergleich zwischen den Tieren erlaubt. Dieses Verfahren wurde für sämtliche Radionuklide in einem bestimmten Versuch durchgeführt.
Verhältnisse von Impulszählungen für verschiedene Gewebeproben wurden erhalten. Für die verletzten Gewebe und die Thromben wurden gewöhnlich mehrere Proben aus dem gleichen Tier entnommen. In solchen Fällen wird sowohl das Maximalver hältnis für jede Probe als auch der Mittelwert von sämtlichen genommenen Proben angegeben. Das Maximum für jedes Tier wurde über sämtliche Tiere gemittelt und wird als maximales Anx-V-Verhältnis angegeben.
Diese Ergebnisse zeigen, dass sich Tc-99m-Annexin V vorzugsweise an Vorhofthromben und dem verletzten linken Vorhof sammelt, wobei die höchste Nicht-Ziellokalisierung in der Niere erfolgt. Der Nierenwert ist wenigstens teilweise eine Anzeige der Ausscheidung von Tc-99m-Annexin V über die Niere.
Beispiel IV
Radioaktiv markierte Annexin-Galactose-Konjugate
A. Annexin V-Herstellung aus menschlicher Plazenta und durch Expression in E. coli.
Annexin V wurde aus menschlicher Plazenta bis auf eine Endreinheit von 99 gereinigt, wie von Funakoshi et al., Biochemistry 26, 5572 – 78, 1987 und Tait et al., Biochemistry 27, 6268 – 76, 1988 beschrieben.
Alternativ wurde Annexin V durch Expression in E. coli erhalten, aber nicht in den folgenden Versuchen verwendet. Die Expression wurde wie folgt durchgeführt.

1. Herstellung eines Gesamtfermentationsüberstands. Es wurden molekularbiologische Standardtechniken verwendet, um Annexin V in E. coli zu exprimieren. Spezieller wurde der proteinkodierende Bereich von Annexin V-cDNA (vgl. Funakoshi et al., vorstehend angegeben) in die Ndel/BamHI-Stelle des Plasmids pET-12a (Novagen, Madison WI) inseriert. Das ausgewählte Plasmid wurde verwendet, um den Stamm E. coli BL21 (DE3) (Novagen) zu transformieren. Einzelne Kolonien (Klone) wurden auf Luria-Mediumplatten, die 50 μg/ml Ampicillin oder Carbenicillin enthielten, isoliert, wie in Sambrook et al., "Molecular Cloning Laboratory Manual," 2. Aufl., Cold Springs Harbor Laboratory Press, 1989 beschrieben, isoliert. Zur Produktion wurden Kulturen der selektierten Klone, welche das erwünschte Plasmid enthielten, über Nacht bei 37°C in Terrific-Medium (vgl. Tartof et al., Bethesda Res. Lab. Focus, 9: 12, 1987), das 50 μg/ml Carbenicillin (im Handel erhältlich von Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri) enthielt, unter Schütteln wachsen gelassen. Die Kultur wurde 1 : 20 in dem gleichen Medium verdünnt und unter Schütteln 18 – 24 h bei 37°C inkubiert. Die Bakterien wurden durch Zentrifugation geerntet, einmal mit einem gleichen Volumen von 0,05 M Tris-HCl, 0,15 M Natriumchlorid, pH 8, gewaschen und als Pellets bei –20°C gelagert. Die Pellets wurden aufgetaut und mit 10 – 15 %igem (Gew./Vol.) kaltem, 0,05 M Tris-HCl, 0,02 M Na₄EDTA, pH 7,2, wieder suspendiert. Die Suspension wurde 4 min auf Eis mit Ultraschall behandelt, zentrifugiert, und der Überstand wurde bei –70°C gelagert.
2. Reinigung von Annexin V aus dem Gesamtfermentationsüberstand. Nach dem Auftauen wurde der Überstand unter Verwendung einer 0,1 μm Hohlfasereinheit (im Handel erhältlich von A/G Technology, Needham, MA) filtriert, und die Leitfähigkeit wurde mit konzentriertem Natriumchlorid auf einen gleichen Wert von 0,02 M Tris-HCl, 0,5 M Natriumchlorid, pH 8, eingestellt. Polyethylenimin-WP (J.T. Baker, Phillipsberg, NJ) wurde in 0,02 M Tris-HCl, 0,5 M Natriumchlorid, pH 8 suspendiert, und 1 g Harz pro 10 ml Gesamtfermentationsüberstand wurde zu dem filtrierten Überstand zugesetzt. Nach 30-minütigem Rühren wurde der Überstand entfernt, in 0,02 M Tris-HCl, pH 8, ausgetauscht und auf eine Q-SEPHA-ROSE^® HP-Säule (Pharmacia, Piscataway, NJ) äquilibriert in dem gleichen Puffer, aufgebracht. Die Säule wurde mit einem Stufengradienten von 0 – 0,5 M Natriumchlorid entwickelt. Fraktionen wurden auf Annexin V durch Größenausschluss-HPLC untersucht, und Fraktionen, die A₂₈₀-absorbierendes Material von geeigneter Größe enthielten, wurden vereinigt. Das halb gereinigte Annexin V wurde in PBS ausgetauscht und durch Ultrafiltration konzentriert. Die Gelfiltration über SEPHACRYL^® 100 HP (Pharmacia), äquilibriert in PBS, ergab das gereinigte Protein. Die Proteinkonzentration wurde auf 1 mg/ml eingestellt, 0,2 μm steril filtriert und bei 2 – 8°C gelagert.

B. Derivatisierung von Annexin V mit Galactose.
Es wurde nach dem allgemeinen Verfahren von Lee et al., Biochemistry 15: 6268 – 76, 1976 gearbeitet.
a. Herstellung von 2-Amino-2-methoxyethyl-1-thio-D-galactopyranosid.
Eine 1,0 M Lösung von Cyanmethyl-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-1-thio-D-galactopyranosid (im Handel erhältlich von Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) wurde durch Auflösen von 1,83 g (4,5 mmol) in 4,5 ml wasserfreiem Methanol unter Erwärmen auf 50°C hergestellt. Die Lösung wurde bei 50°C gehalten, und 0,1 ml (0,45 mmol) 25 %iges Natriummethoxid in Methanol (im Handel erhältlich von Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI) wurde unter kontinuierlichem Rühren zugesetzt. Nach 6 h bei 50°C wurde das Methanol unter vermindertem Druck entfernt, was das Galactosemethylimidat als farbloses, viskoses Öl ergab.
b. Galactosylierung von Annexin V
Das Galactosemethylimidat wurde Annexin V in Molverhältnissen von 300 1, 150 : 1 und 75 : 1 angeboten. Für das 300 : 1-Angebot wurden 3,35 mg Galactosemethylimidat in Methanol zu einem Öl unter einem Stickstoffstrom gegeben. Zu dem Öl wurden 2,53 mg Annexin V in 0,05 M HEPES-Puffer (im Handel erhältlich von Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri), pH 7,4, und 0,04 ml 0,5 M Natriumboratpuffer, pH 8,5, zugesetzt. Die Lösung wurde 1 h bei Raumtemperatur durch Taumeln des Reaktionsgefäßes vermischt und wurde dann bei Raumtemperatur über Nacht (etwa 18 h) stehen gelassen. Die Reaktionsmischung wurde mit 0,4 ml PBS verdünnt, in einen Dialyseschlauch (Ausschluss 6000 – 8000 MW) überführt und 24 h gegen PBS dialysiert. Nach der Entfernung des Materials aus der Dialysetasche wurde die Lösung durch ein 0,2 μm Spritzenfilter filtriert. Die anderen Angebotskonzentrationen wurden in analoger Weise durchgeführt.
C. Charakterisierung von mit Galactose derivatisiertem Annexin V.
Die Proteinkonzentration wurde unter Verwendung von A₂₈₀ von 0,6 für eine 1 mg/ml-Lösung von Annexin V bestimmt. Die Anzahl von Galactoseresten pro Molekül Annexin V wurde bestimmt, indem die Gesamtzahl von reaktiven Aminen auf Annexin V vor und nach der Reaktion mit Galactosemethylimidat unter Verwendung von Trinitrobenzosulfonsäure, wie von Habeeb, Analytical Biochemistry 14: 328 – 36, 1966 beschrieben, gemessen wurde.
Die Fähigkeit von mit Galactose modifiziertem Annexin V, an aktivierte Plättchen zu binden, wurde untersucht, indem seine Fähigkeit, die Bindung von unmodifiziertem, mit ¹²⁵I radioaktiv markiertem Annexin V an frisch isolierte menschliche Plättchen zu hemmen, nach dem Verfahren von Thiagarajan und Tait, J. Biol. Chem. 265: 17240 – 43, 1990 bestimmt wurde. Die folgende Tabelle zeigt die Ergebnisse des Konkurrenzversuchs, sowohl in absolutem Wert (linke Spalte) als auch in einem auf 100 % für nicht modifiziertes Annexin V normalisierten Wert (rechte Spalte).
D. Herstellung von Tc-99m-Annexin V-Galactose.
Annexin V-Galactose wurde mit Technetium-99m unter Verwendung eines Diamid-Dimercaptid-Chelats (N₂S₂-Chelats), wie von Kasina et al., J. Nucl. Med. 32: 1445 – 51, 1991 beschrieben, radioaktiv markiert. Das vorgeformte, aktive Esterchelat wurde vor der Konjugation an Annexin V-Galactose mit 2,0 ml Wasser verdünnt und gereinigt unter Verwendung einer modifizierten, konditionierten C-18-Säule (im Handel erhältlich von J.T. Baker), wie von Fritzberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4025 – 29, 1988 beschrieben, achtmal mit 2,0 ml Wasser gewaschen, gefolgt von Trocknen der Säule für 5 min und Eluieren mit 100 % Acetonitril. Das Lösungsmittel wurde unter einem stetigen Strom von N₂ entfernt. Dann wurden 0,15 ml PBS, 0,35 ml Annexin V-Galactose (4,7 : 1 Galactose : Annexin V) bei 1,0 mg/ml und 0,2 ml 0,2 M Bicarbonatpuffer (pH 10,0) zur Konjugation an den Tc-99m-N₂S₂-TFP-Ester zugesetzt. Nach 20 min bei Raumtemperatur wurde das Tc-99m-Anne xin V-Galactose-Konjugat durch Passage durch eine G-25 SEPHADEX^® PD-10-Säule (im Handel erhältlich von Pharmacia), äquilibriert mit PBS, gereinigt.
Fraktionen von 1,0 ml wurden gesammelt, und Annexin V enthaltende Fraktionen wurden vereinigt. Die Proteinkonzentration wurde durch UV-Absorption bei 280 nm bestimmt. Die radiochemische Ausbeute des Konjugats betrug 35,3 %. Die radiochemische Reinheit betrug 99,8 %, bestimmt durch sofortige Dünnschichtchromatographie auf mit Silicagel imprägnierten Glasfaserfolien, entwickelt in 12 % (Gew./Vol.) wässriger Trichloressigsäure. Die ITLC-Folien wurden in zwei Hälften geschnitten, und jede Hälfte wurde in einem Gammastrahlenzähler oder einem Dosiskalibrator gemessen. Das radioaktiv markierte Annexin V-Galactose-Konjugat präzipitierte am Ursprung, und jede nicht-proteingebundene Radioaktivität wanderte mit der Lösungsmittelfront in diesem Lösungsmittelsystem. Die Lösung von Annexin V-Galactose-Konjugat (300 – 350 μg) wurde verdünnt und in PBS, enthaltend Rinderserumalbumin (im Handel erhältlich von Sigma Chemical Co.) bei einer Endkonzentration von 15 – 20 mg/ml PBS, vor der intravenösen Verabreichung gelagert.
E. Blutclearance von Tc-99m-Annexin V und von Tc-99m-Annexin V-Galactose.
Ein Tiermodell, wie vorstehend in Beispiel III beschrieben, wurde zur Bewertung der Blutclearance der Moleküle verwendet. Für N = 20 Schweine ist die Blutclearance (2) biphasisch (biexponentiell):
a + b = 0,0689, daher werden 57 % (0,0389 / 0,0689) der injizierten Dosis / Gramm Blut in der schnelleren a-Phase geklärt, und 43 % des ID/g werden in der langsameren b-Phase geklärt.
Die Blutclearance von Tc-99m-Annexin V-Galactose im Schwein (2) ist ebenfalls biphasich (biexponentiell):
a + b = 0,0358, daher werden 87 % (0,0313 / 0,0358) der injizierten Dosis 1 Gramm Blut sehr schnell in der frühen a-Phase geklärt. Diese schnellere Clearance verringert die Hintergrundaktivität in dem Blutkompartiment, d.h. das Rauschen, und verbessert daher das Verhältnis von Signal-zu-Rauschen. Folglich kann die Thrombusbildgebung bei kürzeren Zeitpunkten erreicht werden.
Beispiel V
Chelatherstellung
4,4-Diethoxycarbonylpropyl-1,3-dianilin:
Eine gerührte Lösung aus 2,065 g (1,25 mol) Ethyl-4-aminobenzoat, 14,35 ml (0,125 mol) 1,3-Di-iodpropan und 10,5 g (0,125 mol) Natriumbicarbonat in 500 ml trockenem DMSO wird auf 100°C für 3 Stunden unter Stickstoff erhitzt. Nach dem Abkühlen wird die Mischung in 2 l Eiswasser unter Rühren gegeben, und das resultierende Präzipitat wird durch Filtration gewonnen. Das Präzipitat wird dann mit Eisessig (14 × 75 ml) gewaschen, bis das gesamte Ausgangs-Ethyl-4-aminobenzoat entfernt worden ist. Nach der Vakuumtrocknung wird das so erhaltene Produkt in dem folgenden Schritt ohne weitere Reinigung verwendet.
1,3-Di(2-imino-6-ethoxycarbonylbenzthiazolyl-3-)propan:
Ammoniumthiocyanat (16,5 g, 0,217 mol) wird zu einer magnetisch gerührten Suspension aus 4,4-Diethoxycarbonylpropyl-1,3-dianalin (10,0 g, 0,27 mol) in 1500 ml Eisessig dazugegeben. Eine Lösung aus Bromin (34,6 g, 0,216 mol) in 100 ml Eisessig wird anschließend tropfenweise zu der Suspension gegeben, welche bei Raumtemperatur gerührt wird. Nach dem Rühren der Reaktionsmischung über Nacht bei Raumtemperatur wird das Dihydrobromidsalz des unverarbeiteten Produktes durch Filtration gewonnen und getrocknet. Das Produkt wird durch Auflösen des Rohproduktes in heißem Wasser, der Einstellung auf basischen pH durch die Zugabe von gesättigter Natriumbicarbonatlösung, der Gewinnung des Präzipitates durch Filtration und der Trocknung im Vakuum isoliert.
N,N'-Bis(2-disulfidyl-4-hydroxycarbonylshenyl)-1,3-propyldiamin:
Festes Kaliumhydroxid (20,0 g, 0,357 mol) wird zu einer Suspension aus 1,3-Di(2-imino-6-ethoxycarbonylbenzthiazolyl-3-)propan (1,0 g, 0,002 mol) in 40 ml destilliertem Wasser gegeben, und die resultierende Mischung wird bei 120°C 12 Stunden lang erhitzt. Eine vollständige Auflösung tritt nach 1 Stunde auf. Die Reaktionsmischung wird dann auf einem Eisbad gekühlt, und der pH wird auf 5,0 mit 5,0 N Essigsäure eingestellt. Die wässrige Lösung wird dann mit drei 100 ml Portionen Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten Ethylacetatextrakte werden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, und das Trocknungsmittel wird gefiltert. Die Entfernung des Lösemittels ergibt das Produkt.
Bis zu diesem Punkt wird die Synthese schematisch in 3 gezeigt.
N,N'-Bis(2-disulfidyl-4-hydroxycarbonylphenyl)-1,3-propyldiamin-mono-(methylaminocaproat)addukt.
Zu einer Mischung von N,N'-Bis(2-disulfidyl-4-hydroxycarbonylphenyl)-1,3-propyldiamin und 2–3 Äquivalenten von Methyl 6-aminohexanoathydrochlorid (hergestellt wie unten in Beispiel VI beschrieben) in Dimethylformamid werden 10 Äquivalente von Triethylamin, gefolgt von 0,9–1,0 Äquivalenten von BOP (Benzotriazol-1-yloxy-tris(dimethyl-amino)-phosphoniumhexafluorophosphat) gegeben. Die Mischung wird bei 15–30°C für 2–24 Stunden gerührt und anschließend konzentriert. Der Rückstand wird mit entionisiertem Wasser verdünnt, und der pH wird mit 1 N wässriger Salzsäure auf etwa 2 eingestellt. Die Mischung wird erneut konzentriert. Der Rückstand wird auf Silicagel chromatografiert. Die chromatographischen Fraktionen, welche das Produkt enthalten, werden vereinigt und konzentriert, um das Produkt hervorzubringen.
Dieses Chelat ist geeignet für die Verwendung mit einem geeigneten trifunktionellen Linker oder einem Paar von bifunktionellen Linkern, um ein radioaktiv markiertes Annexin-Galactose-Cluster-Konjugat der vorliegenden Erfindung zu bilden. Seine Verwendung davon mit einem Paar bifunktionellen Linkern wird in dem folgenden Beispiel behandelt.
Beispiel VI
Bifunktioneller Linker-Ansatz für radioaktiv markierte Annexin-Galactose-Cluster-Konjugate
A. Herstellung eines Acht-Galactose-Clusters.
Dieser Vorgang ist schematisch in 5 gezeigt.
Methyl-6-bromohexanoat.
Zu einem 1 l-Kolben mit rundem Boden, gefüllt mit 20 g (102,5 mmol) 6-Bromohexansäure und 500 ml Methanol, wurde Chlorwasserstoffgas für 2–3 Minuten eingeblubbert. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 4 Stunden gerührt und konzentriert, um 21,0 g des Produktes als ein gelbes Öl (99 %) hervorzubringen: ¹H-NMR (200 MHz, d₆-DMSO); 3,57 (s, 3H), 3,51 (t, 2H), 2,30 (t, 2H), 1,78 (pentet, 2H) und 1,62–1,27 (m, 4H) ppm.

Claims

Annexin-Konjugat, das zur radioaktiven Markierung mit einem Mittel zur diagnostischen Bildgebung geeignet ist, welches umfaßt: ein Annexin; eine N₂S₂- oder N₃S-Verbindung, die ein Radionuklid komplexieren kann, wobei die Verbindung mit dem Annexin assoziiert ist; und einen Cluster aus Hexoseresten oder Resten auf Hexosebasis, die in einer verzweigten Konfiguration verknüpft sind, wobei die Reste besagten Clusters so konfiguriert sind, daß sie von einem Leberrezeptor erkannt werden.
Konjugat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Annexin Annexin V ist.
Konjugat nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Cluster von einem Säuger-Leberrezeptor erkannt wird.
Konjugat nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Cluster von einem Ashwell-Rezeptor erkannt wird.
Konjugat nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Cluster an einem einzigen Punkt an das Annexin oder das Konjugat gebunden ist.
Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens ein Rest des Clusters ausgewählt ist aus Galactose, Mannose, Mannose-6-phosphat, N-Acetylglucosamin, Pentamannosylphosphat, Glucose, N-Galactosamin, N-Acetylgalactosamin, Thioglykosiden von Galactose, D-Galactosiden und Glucosiden.
Konjugat nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Cluster wenigstens drei Galactosereste umfaßt.
Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung eine N₂S₂-Verbindung ist, die ein Radionuklid komplexieren kann.
Konjugat nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die N₂S₂-Verbindung ausgewählt ist aus N,N'-Bis(2-disulfidyl-4-ethoxycarbonylphenyl)-1,3-propyldiamin und N,N'-Bis(2-disulfidyl-4-methylphenyl)-γ,γ'-diaminoisovalerat.
Konjugat nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die N₂S₂-Verbindung N,N'-Bis(2-disulfidyl-4-ethoxycarbonylphenyl)-1,3-propyldiamin ist.
Konjugat nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die N₂S₂-Verbindung N,N'-Bis(2-disulfidyl-4-methylphenyl)-γ,γ'-diaminoisovalerat ist.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung eine N₃S-Verbindung ist, die ein Radionuklid komplexieren kann.
Konjugat nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die N₃S-Verbindung S-Benzoylmercaptoacetylglycylglycylglycin ist.
Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Annexin durch die Addition von 2 bis 6 terminalen Aminosäureresten modifiziert ist.
Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung die folgende Struktur aufweist:
in der T eine für die Konjugation nützliche funktionelle Gruppe trägt.
Konjugat nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Konjugat wie folgt konfiguriert ist: Hexose-Cluster – Chelat – Annexin und die Komponenten kovalent durch bifunktionelle Linker verbunden sind.
Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die verzweigte Konfiguration des Clusters eine Linkereinheit umfaßt, die an einen oder mehrere der Hexosereste gebunden ist.
Konjugat nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der einzige Bindungspunkt über eine Linkereinheit vom Hexose-Cluster zum Annexin ist.
Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindung des Clusters an eine Linkereinheit ist, die Teil des Annexins oder der Verbindung ist.
Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Hexose-Cluster ein Galactose-Cluster ist.
Konjugat nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß der Galactose-Cluster die folgende Formel aufweist:
in der X H oder Methyl ist.
Konjugat nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß der Galactose-Cluster die folgende Formel aufweist:
in der X H oder Methyl ist.
Konjugat nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß der Galactose-Cluster die folgende Formel aufweist:
in der X H oder Methyl ist.
Konjugat nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß der Galactose-Cluster die folgende Formel aufweist:
in der X H oder Methyl ist, y von 1 bis 10 ist und Z O oder S ist.
Konjugat nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß der Galactose-Cluster die folgende Formel aufweist:
in der X H oder Methyl ist, y von 1 bis 10 ist und Z O oder S ist.
Konjugat nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß der Galactose-Cluster die folgende Formel aufweist:
in der X H oder Methyl ist, y von 1 bis 10 ist und Z O oder S ist.
Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß ein Radionuklid von der Verbindung komplexiert ist.
Konjugat nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß das Radionuklid ausgewählt ist aus der Gruppe, im wesentlichen bestehend aus Cu-64, Re-186, Re-188, Pd-100, Bi-212, Pb-212, Pd-109, Cu-67, Tc-99m, Tc-94, Ru-95, Ru-105, Rh-99, Rh-105, In-111, Sm-153, Lu-177, Lu-170, Pt-189, Pt-193, Au-199 und Hg-197.
Konjugat nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß das Radionuklid Tc-99m ist.
Konjugat nach Anspruch 8, wenn abhängig von Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die N₂S₂-Verbindung 4,5-Bis(S-1-ethoxyethylmercapto-acetamido)pentanoat ist und daß der Hexose-Cluster ein Galactose-Cluster ist.