DE69530123T2

DE69530123T2 - Plättchenaggregationsinhibitoren

Info

Publication number: DE69530123T2
Application number: DE69530123T
Authority: DE
Inventors: Gerrard Peter RUMINSKI
Original assignee: GD Searle LLC
Current assignee: GD Searle LLC
Priority date: 1995-01-17
Filing date: 1995-12-15
Publication date: 2004-02-05
Anticipated expiration: 2015-12-16
Also published as: PT804418E; WO1996023771A3; WO1996023771A2; ATE235468T1; EP0804418B1; ES2194933T3; AU5710696A; DK0804418T3; US5798370A; DE69530123D1; US5602155A; EP0804418A2; JPH10512581A; CA2210746A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft pharmazeutische Mittel (Verbindungen), die die Plättchenaggregation in Säugern hemmen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Fibrinogen ist ein Glykoprotein, das als normaler Bestandteil im Blutplasma vorhanden ist. Es ist an der Plättchenaggregation und an der Fibrinbildung im Blutgerinnungsmechanismus beteiligt.
Blutplättchen sind im Vollblut zu findende zelluläre Bestandteile, die auch an der Blutgerinnung beteiligt sind. Die Bindung von Fibrinogen an Plättchen ist wichtig für die normale Plättchenfunktion im Blutgerinnungsmechanismus. Wenn ein Blutgefäß eine Verletzung erfährt, wird durch die Bindung der Plättchen an Fibrinogen die Aggregation eingeleitet und ein Thrombus gebildet. Die Interaktion von Fibrinogen mit Plättchen vollzieht sich durch die Bildung eines als GP IIb/IIIa bekannten Membranglycoprotein-Komplexes; dies ist ein wichtiges Merkmal der Plättchenfunktion. Inhibitoren dieser Interaktion sind nützlich zur Modulation der Plättchen-Thrombus-Bildung.
Es ist außerdem bekannt, dass ein weiteres großes Glykoprotein namens Fibronektin, das ein wesentliches extrazelluläres Matrixprotein ist, mit Plättchen interagiert. Für verschiedene, relativ große Polypeptidfragmente innerhalb der Zellbindungsdomäne des Fibronektins wurde gezeigt, dass sie Zellanheftungseigenschaften haben. (vgl. US-Patente 4 517 686 , 4 589 881 und 4 661 111 ). Für bestimmte relativ kurze Peptidfragmente desselben Moleküls wurde gefunden, dass sie die Zellanhaftung an ein Substrat fördern, wenn sie auf dem Substrat immobilisiert sind, oder die Anhaftung inhibieren, wenn sie in gelöster oder suspendierter Form vorliegen (vgl. US-Patente 4 578 079 und 4 614 517 ). Im US-Patent 4 683 291 ist die Inhibierung der Plättchenfunktion durch synthetische Peptide offenbart, die als Antagonisten mit hoher Bindungsaffininität zu Plättchen entwickelt wurden. Das US-Patent 4 857 508 offenbart Tetrapeptide, die als Inhibitoren der Plättchenaggregation nützlich sind.
Andere synthetische Peptide und deren Verwendung als Inhibitoren der Fibrinogenbindung an Plättchen wurden von Koczewiak et al., Biochem. 23, 1767–1774 (1984), Plow et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82, 8057–8061 (985), Ruggeri et al., Ibid. 83, 5708–5712 (1986), Ginsberg et al., J. Biol. Chem. 260 (7), 3931–3936 (1985), Haverstick et al., Blood 66 (4), 946–952 (1985) und Ruoslahti und Pierschbacher, Science 238, 491–497 (1987) offenbart. Noch weitere solcher inhibierenden Peptide sind in den europäischen Patentanmeldungen 275 748 und 298 820 offenbart.
Das US-Patent 4 879 313 offenbart als Plättchenaggregations-Inhibitoren nützliche Peptidnachahmungsverbindungen, die eine Guanidino-Gruppe enthalten, Die europäische Patentanmeldung 512 831 offenbart Piperidinylalkylazacycloalkanone, die die Bindung des Fibrinogens an Blutplättchen inhibieren und deshalb zur Inhibierung der Blutplättchenaggregation nützlich sind.
Die europäische Patentanmeldung 503 548 offenbart cyclische Harnstoffderivate (Imidazolone und Triazolone), die zur Inhibierung der zellulären Interaktion nützlich sind, und die deshalb zur Behandlung oder Verhinderung von Thrombose, Embolien und Metastasen nützlich sind.
Die europäische Patentanmeldung 496 378 offenbart Amidinobiphenyl-Verbindungen, die die Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktion inhibieren und somit nützlich zur Behandlung von Thrombose, cerebrovaskulären Erkrankungen, Lungenembolien, Myocardinfarkt, Arteriosklerose, Osteoporose und Tumormetastasen sind.
Die WO 93/09795 offenbart Nichtpeptid-RGD-Analoga, die terminale Guanidino- und Carboxyl-Funktionen im Abstand von 11 Atomen enthalten, von denen mindestens 5 Kohlenstoffatome sind, und die keine β-Aminosäuresequenzen enthalten, die Verbindungen sind, die die Plättchenaggregation inhibieren und nützlich zur Behandlung verschiedener pathologischer Erkrankungen sind.
Die europäische Patentanmeldung 445 796 offenbart Essigsäurederivate, die eine hemmende Wirkung auf die Bindung an Blutplättchen anhaftender Proteine sowie auf die Blutplättchenaggregation und die Zell-Zell-Adhäsion hat.
Die europäische Patentanmeldung 372 486 offenbart N-Acylbetaaminosäure-Derivate und deren Salze. Die offenbarten Verbindungen sind nützlich zur Inhibierung der Plättchenaggregation bei der Behandlung von Thrombose, Schlaganfall, Myocardinfarkt, Entzündung, Arteriosklerose und zur Inhibierung von Metastasen.
Die europäische Patentanmeldung 381 033 offenbart Amidino oder Guanidinoaryl, substituierte Alkansäurederivate, die zur Behandlung von Thrombose, Apoplex, Herzinfarkt, Entzündung, Arteriosklereose und Tumoren nützlich sind.
Die EP-A 0 512 829 und EP-A 0 478 362 beschreiben Verbindungen der Formel
worin X
und/oder Aryl sein kann. Von solchen Verbindungen wird angenommen, dass sie Fibrinogen-Antagonisten sind.
Die WO-A 93/09795 offenbart nicht-peptidische Surrogate der Sequenz Art-Gly-Asp mit der Formel
worin A Heteroatom enthaltende Gruppen bedeutet, die unter anderem als Plättchenaggregation-Inhibitoren verwendet werden können.
Die WO-A 94/21602 betrifft Harnstoff-Derivate mit derselben pharmakologischen Aktivität wie oben und mit der Formel
mit A = (CH₂)_n-R, Z = H, Alkyl, Halogen etc. R kann eine aromatische Gruppe sein.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Klasse von Verbindungen, die durch die Formel
dargestellt werden oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon, worin
R² aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Hydroxy, Amino, Alkoxy, Alkyl und Cyano ausgewählt ist,
A aus der aus Niederalkylen bestehenden Gruppe ausgewählt ist, wobei diese Gruppe gegebenenfalls mit Niederalkyl oder Phenyl substituiert ist,
V aus der Gruppe bestehend aus -N(R⁶)- und monocyclischen, N-enthaltenden Heterocyclen ausgewählt ist, worin R⁶ aus der Gruppe bestehend aus H und Niederalkyl ausgewählt ist,
Y und Z unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, verzweigtem oder unverzweigtem Niederalkyl und Cycloalkyl ausgewählt sind,
n eine ganze Zahl von 0, 1, 2 oder 3 ist,
R³ unabhängig aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff und Niederalkyl ausgewählt ist,
R¹ Pyridyl ist.
Eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe ist das Bereitstellen pharmazeutischer Zusammensetzungen, die Verbindungen der Formel I enthalten. Solche Verbindungen und Zusammensetzungen sind nützlich als Modulatoren und/oder Inhibitoren der Plättchenaggregation. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung solcher Verbindungen bei der Herstellung eines Arzneimittels zur therapeutischen Inhibierung oder Modulation der Plättchenaggregation in einem Säuger, der einer solchen Behandlung bedarf.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft eine durch die Formel I dargestellte, oben beschriebene Verbindungsklasse.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist eine Verbindung der Formel I oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon, worin V Pyrrolidinyl ist.
Beispielhafte Ausführungen der vorliegenden Erfindung sind die folgenden Verbindungen und deren pharmazeutisch annehmbare Salze:
Methyl-β-[[2-[[5-[(aminoiminomethyl)amino]-1-oxopentyl]amino]-1-oxoethyl]amino]-3-pyridinpropanoat,
β-[[2-[[5-[(Aminoiminomethyl)amino]-1-oxopentyl]amino]-1-oxoethyl]amino]-3-pyridinpropansäure
(±)-Ethyl-β-[[2-[[4-[(aminoiminomethyl)amino]-1-oxobutyl]amino]-1-oxoethyl]amino]-3-pyridinpropanoat,
(±)-β-[[2-[[4-[(Aminoiminomethyl)amino]-1-oxobutyl]amino)-1-oxoethyl]amino]-3-pyridinpropansäure,
(±)-Ethyl-β-[[2-[[6-[(Aminoiminomethyl)amino]-1-oxohexyl]amino]-1-oxoethyl]amino]-3-pyridinpropanoat,
(±)-β-[[2-[[6-[(Aminoiminomethyl)amino]-1-oxohexyl]amino]-1-oxoethyl]amino]-3-pyridinpropansäure,
(±)-β-[[3-[[4-[(Aminoiminomethyl)amino]-1-oxobutyl]amino]-1-oxopropyl]amino]-3-pyridinpropansäure,
(±)-Ethyl-β-[[2-[[4-[(aminoiminomethyl)amino]-1-oxo-3-phenylbutyl]amino]-1-oxoethyl]amino]-3-pyridinpropanoat,
(±)-β-[[2-[[4-[(Aminoiminomethyl)amino]-1-oxo-3-phenylbutyl]amino]-1-oxoethyl]amino]3-pyridinpropansäure,
Ethyl-βS-[[[1-[5-[(aminoiminomethyl)amino]-1-oxopentyl]pyrrolidin-2-yl]carbonyl]amino]-3-pyridinpropanoat, und
βS-[[[1-[5-[(aminoiminomethyl)amino]-1-oxopentyl]pyrrolidin-2-yl]carbonyljamino]-3-pyridinpropansäure.
Wie hier verwendet bedeuten die Begriffe "Alkyl" oder "Niederalkyl" geradkettige oder verzweigtkettige Kohlenwasserstoffreste, die etwa 1 bis 6 Kohlenstoffatome haben. Beispiele solcher Alkylreste sind Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, Isobutyl, sec-Butyl, t-Butyl, Pentyl, Neopentyl, Hexyl, Isohexyl und dergleichen.
Wie hier verwendet, bedeuten die Begriffe "Alkenyl" oder "Niederalkenyl" ungesättigte acyclische Kohlenwasserstoffreste, die mindestens eine Doppelbindung und 2 bis 6 Kohlenstoffatome enthalten, wobei die Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung innerhalb des Alkenylanteils entweder cis- oder trans-Geometrie in Bezug auf die die Doppelbindung substituierenden Gruppen haben. Beispiele solcher Gruppen sind Ethenyl, Propenyl, Butenyl, Isobutenyl, Pentenyl, Hexenyl und dergleichen.
Der Begriff "Cycloalkyl" wie hier verwendet bedeutet einen gesättigten oder ungesättigten cyclischen Kohlenstoffrest, der 3 bis 6 Kohlenstoffatome enthält. Beispiele solcher Cycloalkylreste beinhalten Cyclopropyl, Cyclopropenyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, 2-Cyclohexen-1-yl und dergleichen.
Wie hier verwendet wird der Begriff "Cyano" durch einen Rest der Formel -CN dargestellt.
Die Begriffe "Hydroxy" und "Hydroxyl" sind wie hier verwendet synonym und durch einen Rest der Formel-OH dargestellt.
Wie hier verwendet, umfasst der Begriff "monocyclische oder bicycliscfne Heterocyclo-Reste" monocyclische oder bicyclische Reste, die 1 bis 3 aus der aus Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel bestehenden Gruppe ausgewählte Heteroatome enthalten. Repräsentative Beispiele heterocyclischer Reste sind Furan, Pyridin, Benzofuran, Pyran, Thiophen, Benzodioxol, Benzothiophen und dergleichen.
Wie hier verwendet bedeutet der Begriff "monocyclischer N-enthaltender Heterocyclus" monocyclische Reste, die 3 bis 7 Atome enthalten, von denen mindestens eins ein Stickstoffatom ist. Beispiele solcher "monocyclischer N-enthaltender Heterocyclen" beinhalten Piperidyl, Piperizinyl, Pyrrolidinyl und dergleichen.
Das Zeichen "BOC" bezieht sich auf t-Butoxycarbonyl.
Das Zeichen "Δ" wie hier verwendet bezieht sich auf das Erhitzen der Reaktionsmischung.
Die Abkürzung "DMF" wie hier verwendet bedeutet Dimethylformamid.
Die Abkürzung "DIEA" wie hier verwendet bezieht sich auf Diisopropylethylamin.
Die Abkürzung "LiOH" wie hier verwendet bezieht sich auf Lithiumhydroxid.
Die Abkürzung "TFA" wie hier verwendet bedeutet Trifluoressigsäure.
Der Ausdruck "Niederalkylen" oder "Alkylen" wie hier verwendet bezieht sich auf divalente lineare oder verzweigte gesättigte Kohlenwasserstoff-Reste mit 1 bis etwa 6 Kohlenstoffatomen.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "Alkoxy" auf Sauerstoff enthaltende gerad- oder verzweigtkettige Reste der Formel-OR₁₀, worin R₁₀ eine Alkyl-Gruppe wie oben definiert ist. Beispiele solcher Alkoxy-Gruppen beinhalten Methoxy, Ethoxy, n-Propoxy, n-Butoxy, Isopropoxy, Isobutoxy, sec-Butoxy, t-Butoxy und dergleichen.
Der Begriff "Zusammensetzung" wie hier verwendet bedeutet ein Produkt, das durch Mischen oder Kombinieren von mehr als einem Element oder Inhaltsstoff entsteht.
Der Begriff "pharmazeutisch annehmbarer Träger" wie hier verwendet bedeutet ein pharmazeutisch annehmbares Material, eine Zusammensetzung oder ein Transportmittel, wie einen flüssigen oder festen Füllstoff, ein Verdünnungsmittel, einen Arzneimittelträgerstoff, ein Lösungs- oder Umhüllungsmittel, das oder die als Trägerstoff oder Transportmittel eines chemischen Wirkstoffs beteiligt ist.
Der Begriff "therapeutisch wirksame Menge" soll die Menge eines Arzneimittels oder eines pharmazeutischen Wirkstoffes bedeuten, die eine biologische oder medizinische Reaktion in einem von einem Wissenschaftler oder Mediziner ausgesuchten Gewebe, System oder Tier auslösen kann.
Die in Formel I gezeigten Verbindungen können in verschiedenen isomeren Formen vorliegen und es sollen alle isomeren Formen beinhaltet sein. Tautomere Formen sind ebenso beinhaltet wie pharmazeutische Salze solcher Isomere und Tautomere.
In den hier vorliegenden Strukturen und Formeln kann eine über eine Bindung in einem Ring gezeichnete Bindung zu jedem verfügbaren Atom des Ring führen.
Der Begriff "pharmazeutisch annehmbares Salz" bezieht sich auf ein Salz, das durch in Kontakt bringen einer Verbindung der Formel I mit einer Säure, deren Anion im allgemeinen als für den menschlichen Verzehr geeignet angesehen wird. Beispiele solcher pharmakologisch annehmbaren Salze sind Hydrochlorid, Hydrobromid, Hydroiodid, Sulfat, Phosphat, Acetat, Propionat, Lactat, Maleat, Malat, Succinat und Tartrat. Alle diese pharmakologisch annehmbaren Salze können auf herkömmliche Weise hergestellt werden (vgl. Berge et al., J. Pharm. Sci., 66(1), 1–19 (1977) wegen zusätzlicher Beispiele für pharmazeutisch annehmbare Salze).
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der obigen Verbindungen zur Inhibierung der Plättchenaggregation durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer Verbindung der Formel I zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, um diese Inhibierung zu bewirken.
Zur Inhibierung der Plättchenaggregation können die erfindungsgemäßen Verbindungen oral, parenteral, durch Inhalationsspray, rektal oder topisch als Einheitsdosisformulierungen, die herkömmliche pharmazeutisch annehmbare Träger, Adjuvantien und Transportmittel enthalten, verabreicht werden. Der Begriff parenteral wie hier verwendet beinhaltet zum Beispiel subkutan, intravenös, intramuskulär, intrasternal, durch Infusion oder intraperitoneal.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auf jedem geeigneten Weg verabreicht werden, vorzugsweise in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die für diesen Verabreichungsweg angepasst ist, und in einer Dosis, die für die beabsichtigte Behandlung wirksam ist. Die therapeutisch wirksamen Dosen der erfindungsgemäßen Verbindungen, die erforderlich sind, um einen medizinischen Krankheitszustand zu verhindern oder dessen Fortschreiten aufzuhalten, sind für den Fachmann leicht zu ermitteln.
Erfindungsgemäß wird eine Klasse neuer pharmazeutischer Zusammensetzungen bereitgestellt, die eine oder mehrere erfindungsgemäße Verbindungen zusammen mit einem oder mehreren nicht-toxischen, pharmazeutisch annehmbaren Träger(n) und/oder Verdünnungsmittel(n) und/oder Adjuvans(tien) (hier im Folgenden zusammen fassend als Trägermaterialien bezeichnet) und, falls gewünscht, mit anderen Wirkstoffen umfasst.
Das Dosierungsschema zur Behandlung einer Krankheitszustandes mit den erfindungsgemäßen Verbindungen und/oder Zusammensetzungen beruht auf einer Vielzahl von Faktoren einschließlich Typ, Alter, Gewicht, Geschlecht, dem medizinischen Krankheitszustand des Patienten, der Schwere der Krankheitszustandes, dem Verabreichungsweg und der speziellen verabreichten Verbindung. Somit kann das Dosierungsschema stark variieren. Dosisbereiche in der Größenordnung von 0,1 mg bis etwa 50 mg pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag sind zur Behandlung der oben beschriebenen Krankheitszustände nützlich.
Zur oralen Verabreichung kann die pharmazeutische Zusammensetzung zum Beispiel als Tablette, Kapsel, Suspension oder Liquidum vorliegen. Die pharmazeutische Zusammensetzung wird vorzugsweise in Form einer Einheitsdosis hergestellt, die eine bestimmte Wirkstoffmenge enthält. Diese kann zum Beispiel eine Wirkstoffmenge von etwa 1 bis 500 mg, vorzugsweise von etwa 25 bis 350 mg enthalten. Eine für einen Säuger geeignete Tagesdosis kann in Abhängigkeit vom Krankheitszustand des Patienten und anderen Faktoren stark variieren.
Der Wirkstoff kann auch als Injektion in einer Zusammensetzung, in der zum Beispiel Kochsalz, Dextrose oder Wasser als geeigneter Träger verwendet werden kann, verabreicht werden. Eine geeignete Tagesdosis wäre typischerweise 0,01 bis 10 mg/kg Körpergewicht, die pro Tag in mehreren Dosen in Abhängigkeit vom zu behandelnden Krankheitszustand injiziert wird.
Zur Verabreichung werden die erfindungsgemäßen Verbindungen normalerweise mit einem oder mehreren, für den Verabreichungsweg geeigneten Adjuvarttien kombiniert. Den Verbindungen können mit Lactose, Saccharose, Stärkepulver, Celluloseester von Alkansäuren, Cellulosealkylester, Talkum, Stearinsäure, Magnesiumstearat, Magne siumoxid, Natrium- und Calciumsalze von Phosphor- und Schwefelsäuren, Gelatine, Gummi arabicum, Natriumalginat, Polyvinylpyrrolidon und/oder Polyvinylalkohol vermischt werden, und sie können zur bequemen Verabreichung tablettiert oder in Kapseln gefüllt sein. Alternativ können die Verbindungen in Wasser, Polyethylenglykol, Propylenglycol, Ethanol, Maisöl, Baumwollöl, Erdnussöl, Sesamöl, Benzylalkohol, Kochsalzlösung und/oder verschiedenen Puffern gelöst sein. Andere Adjuvantien und Verabreichungsarten sind aus dem pharmazeutischen Stand der Technik gut und weitreichend bekannt.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können in fester Form wie als Granula, Pulver oder Suppositorien oder in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen hergestellt werden. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können herkömmlichen pharmazeutischen Verfahrenstechniken wie Sterilisieren unterworfen werden und/oder können herkömmliche pharmazeutische Adjuvantien wie Konservierungsstoffe, Stabilisatoren, Befeuchtungsmittel, Emulgatoren, Puffer etc. enthalten.
Die Verbindungen der Formel I können durch synthetische Standardverfahren in Verbindung mit Verfahren, die analog zur Flüssigphasen-Peptidsynthese [vgl. The Peptides: Analysis Sythesis Biology (E. Gross und J. Meienhofer, eds.), Vol. 1–5, Academic Press, New York)] sind, hergestellt werden.
Die generellen synthetischen Sequenzen zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen werden in den Schemata I–VI gezeigt.
Schema I
Schema I beschreibt eine Synthese einer Pyridyl-β-Aminosäure, die zur Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden kann, worin R₁ Pyridyl ist. Das Schema kann unter Verwendung herkömmlicher Verfahrensweisen modifiziert werden, um andere aromatisch-, alkyl- oder heterocyclisch-substituierte β-Aminosäuren durch Substitution des Pyridylcarboxaldehyds mit jedem anderen geeigneten Aldehyd herzustellen. Kurz skizziert wird in Schema I zu Pyridincarboxaldehyd in Propanol Ammoniumacetat gegeben, gefolgt von Malonsäure. Die Reaktionsmischung wird unter Rückfluss gerührt, das resultierende Präzipitat wird filtriert, mit heißem Isopropanol gewaschen und filtriert, wodurch 3-Amino-3-(3-pyridyl)propionsäure bzw. -propansäure erhalten wird.
Zusätzlich sind erfindungsgemäß nützliche β-Aminosäuren durch modifizierte Knoevenagel-Reaktionen (Secor, H.V., Edwards, W.B.J. J. Org. Chem. 1979, 44, 3136–40, Bellasoued, M., Arous-Chtar, R., Gaudemar, M.J., J. Organometal. Chem. 1982, 231, 185–9), durch Reformatski-Reaktion mit Schiffschen Basen (Furukawa, M., Okawara, T., Noguchi, Y., Terawaki, Y. Chem. Pharm. Bull. 1978, 26, 260), Michael-Addition zu einem Acryl-Derivat (Davies, S.G., Ichihara, O. Tetrahedron: Asymmetry 1991, 2, 183–6, Furukawa, M., Okawara, T., Terawki, Y. Chem. Pharm. Bull., 1977, 25, 1319–25) zugänglich. Neuere Verfahren beinhalten die Verwendung von Organometall-Reagentien in Pd oder Zn vermittelten Kopplungsreaktionen (Konopelski, J., Chu, K.S., Negrete, G.R., J. Org. Chem: 1991, 56, 1355, Mokhallalati, M.K., Wu, M-J., Prigden, L.N. Tetrahedron Lett. 1993, 34, 47–50), um die eher traditionellen Reaktionen durch reduktive Aminierung des β-Ketoesters zu ergänzen.
Die racemischen Beta-Alkyl-beta-Aminoester können auch herkömmlich aus dem entsprechenden beta-Lactam durch Behandlung mit wasserfreiem Hydrochloridgas in Ethanol hergestellt werden. Die beta-Lactame werden aus dem entsprechenden Alken und Chlorsulfonylisocyanat hergestellt (Szabo, W.A. Aldrichimica Acta. 1977, 23). Das letztere Verfahren ist nützlich zur Herstellung von α- und β-substituierten β-Aminosäuren (Maunhas, M.S., Wagle, D.R., Chong, J., Bose, A.K. Heterocycles, 1988, 27, 1755). Ein weiterer Weg zu α-sustituierten β-Aminosäuren ist die Raney-Nickel-Reduktion von Cyanoessigsäureestern bei Temperaturen im Bereich von 20 und 80°C und bei einem Druck von 20 bis 100 atm (Tests, E., Fontanella, L., Fava, F., Fermaco Ed. Sci., 1958, 13, 152; Tests, E.; Fontanella, L., Annalen 1959, 625, 95). Es steht auch eine Anzahl von Verfahren zur Herstellung von β-Aminosäuren durch Reduktion der Hydrazone von Ketosäuren (Gootijes, J., Nomte, W.Th., Rec. Trav. Chem. 1953, 72, 721), Oximen (Anziegin, A., Gulewivich, W., Z. Physiol. Chem., 1926, 158, 32) und Nitropropionsäuren zur Verfügung. Die Reinigung der Endprodukte erfolgt gewöhnlich durch Umkehrphasen-HPLC (RP HPLC) [High Performance Liquid Chromatography Protein and Peptide Chemistry, F. Lottspeich, A., Henscher, K.P. Hupe, (eds.) Walter DeGruyter, New York, 1981] oder Kristallisation.
Schema II
Schema II veranschaulicht eine zur Kopplung einer α-Aminosäure an die gemäß Schema I hergestellten β-Aminosäure-Verbindungen nützliche Verfahrensweise. Die auf diese Weise hergestellten Verbindungen sind zur Kopplung an Guanidino-Alkan- und Cycloalkansäure-Verbindungen nützlich, um die gewünschten, erfindungsgemäßen Verbindungen herzustellen. Solche Verfahrensweisen können unter Verwendung herkömmlicher Verfahrensweisen modifiziert werden, um andere Aminoalkylsäuren an die nach Schema I hergestellten β-Aminosäuren zu kuppeln.
Kurz beschrieben wird in Schema II zu einer Lösung von BOC-Glycin in DMF 1-Methylmorpholin gegeben, gefolgt von Isobutylchlorameisensäureester. In einer separaten Reaktionsflasche wird die substituierte β-Aminosäure in DMF mit 1-Methylmorpolin gemischt. Die beiden Mischungen werden zusammengegeben und über Nacht gerührt, wodurch
erhalten wird. Das resultierende Produkt wird unter Verwendung von HCl/Dioxan entschützt.
Schema III
Schema III veranschaulicht eine zur erfindungsgemäßen Herstellung von Guanidinoalkansäure oder des Guanidinocycloalkansäure-Anteils nützliche Verfahrensweise, die zur Kopplung an die β-Aminosäuren verwendet werden kann. Dies kann auch durch andere dem Fachmann bekannte, geeignete Guanidierungs-Reagentien erreicht werden. Die Verfahrensweise von Schema III kann unter Verwendung herkömmlicher Techniken und Verfahren zur Herstellung alternativer, zur Kopplung an die β-Aminosäuren nützlicher Verbindungen modifiziert werden.
Kurz beschrieben wird in Schema III zu 3,5-Dimethylpyrazol-1-carboxamidinnitrat in Dioxan, Wasser und DIEA, 5-Aminovaleriansäure gegeben. Die Reaktionsmischung wird unter Rückfluss gerührt, das Präzipitat filtriert, gewaschen und getrocknet. Das Präzipitat wird dann weiter in Wasser aufgeschlämmt, angesäuert und eingeengt. Das Lösungsmittel wird entfernt, der Rückstand aufgeschlämmt und getrocknet, wodurch 5-Guanidinovaleriansäurehydrochlorid erhalten wird.
Schema IV
Schema IV veranschaulicht eine zur Kopplung von Guanidino-Alkylsäure an den β-Aminosäure-Anteil der gewünschten, erfindungsgemäßen Verbindung nützliche Verfahrensweise. Solche Verfahrensweisen können unter Verwendung herkömmlicher, dem Fachmann bekannter Verfahren modifiziert werden.
Kurz beschrieben wurde in Schema IV Isobutylchlorameisensäureester zu der 5-Guanidinovaleriansäure (hergestellt gemäß Schema III) in DMF und N-Methylmorpholin gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde gerührt und eine Aufschlämmung der β-Aminosäureverbindung (hergestellt gemäß Schema II) in DMF und N-Methylmorpholin portionsweise zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde gerührt, das Präzipitat filtriert und mit DMF gewaschen. Das DMF wurde entfernt. Der resultierende Ester wird in Wasser gelöst, gewaschen, LiOH zu der wässrigen Phase gegeben und gerührt. Die Lösung wird gewaschen und bis pH = 5 mit Trifluoressigsäure behandelt. Das Lösungsmittel wird entfernt und das Produkt über RP-HPLC gereinigt, wodurch die gewünschten Verbindungen erhalten wurden.
Schema V
Schema V (Fortsetzung)
Schema VI
Schema VI (Fortsetzung)
Die Schemata V und VI veranschaulichen Verfahrensweisen, die zur Herstellung verschiedener erfindungsgemäßer Verbindungen nützlich sind. Solche Verfahrensweisen werden in den Schemata I–IV und in den folgenden Beispielen ausführlicher definiert. Solche Verfahrensweisen können vom Fachmann durch Austausch von aus herkömmlichen Verfahrensweisen bekannten Reagentien und Reaktionsbedingungen modifiziert werden, um die gewünschten Verbindungen herzustellen.
Die folgenden, als nicht beschränkend zu verstehenden Beispiele beschreiben und veranschaulichen sowohl die Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen als auch andere Aspekte der vorliegenden Erfindung und die dabei erzielten Ergebnisse in weiteren Einzelheiten. Wo es erforderlich ist, werden sowohl die verschiedenen Aspekte als auch konkrete Herstellungsverfahren bezüglich der vorliegenden Erfindung näher erklärt. Diese Beispiele dienen der Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung.
Der Fachmann wird leicht verstehen, dass bekannte Veränderungen der in diesen Beispielen beschriebenen Reaktionsbedingungen und Vorgehensweisen bei den präparativen Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen und der pharmazeutischen Zusammensetzungen, die diese Verbindungen enthalten, vorgenommen werden können.
Alle in den Beispielen verwendeten Ausgangsmaterialien sind handelsüblich erhältlich (oder können durch bekannte Verfahrensweisen hergestellt werden) sowie auch die gesamte, in den Beispielen verwendete Laborausstattung.
Beispiel 1 Bistrifluoressigsäuresalz von β-[[2-[[(5-((Aminoiminomethyl)amino]-1-oxopentyl]amino]-1-oxoethyl]amino]-3-pyridinpropionsäure
Schritt A
Zu 300 ml 3-Pyridincarboxaldehyd in 3 l 2-Propanol wurden 297 Ammoniumacetat gegeben, gefolgt von 398 g Malonsäure. Die Reaktionsmischung wurde unter Rückfluss während 5 h gerührt. Das Präzipitat wurde noch heiß filtriert und mit 2 l heißem Isopropanol gewaschen. Der resultierende weiße Feststoff wurde dann getrocknet, wodurch 220 g DL-3-Amino-3-(3-pyridyl)propionsäure bzw. -proparusäure erhalten wurden.
NMR und MS waren konsistent mit dem gewünschten Produkt.
Schritt B
220 g DL-3-Amino-3-(3-pyridyl)propionsäure aus Schritt A wurden in 3,6 l absolutem Ethanol aufgeschlämmt. Die Reaktionsmischung wurde unter Rühren während 40 min mit dem Inhalt einer Stahldruckflasche (1/2 lb) Hydrochloridgas (langsam exotherm bis 61°C) durchperlt. Die Aufschlämmung wurde dann unter Rückfluss während 4 h erhitzt (nach 1 bis 1,5 h entstand eine Lösung). Die Reaktionsmischung wurde in einem Eisbad auf 5°C abgekühlt. Nach Rühren bei 5°C während 1,5 h wurde das resultierende weiße Präzipitat abfiltriert und mit Ether gründlich gewaschen. Nach Trocknen im Vakuum bei 50°C wurden 331,3 g DL-Ethyl-3-amino-3-(3-pyridyl)propionatdihydrochlorid bzw. -propanoatdihydrochlorid als weißer Feststoff erhalten.
NMR und MS waren konsistent mit dem gewünschten Produkt.
Schritt C
Zu 220,6 g (0,83 Mol) DL-Ethyl-3-amino-3-(3-pyridyl)propionatdihydrochlorid aus Schritt B in 2 l wasserfreiem THF und 167,2 g (1,65 Mol) Triethylamin wurden 225 g (0,826 Mol) N-t-BOC-Glycin-N-hydroxysuccinimidester (Sigma) in mehreren Portionen bei 5–10°C (nicht exotherm) gegeben. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das resultierende Präzipitat wurde filtriert und mit THF gewaschen. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum aus dem Filtrat entfernt. Der Rückstand wurde in 2,3 l Ethylacetat aufgenommen. Die Ethylacetatphase wurde mit gesättigtem Natriumbicarbonat (2 × 900 ml) und H₂O (3 × 900 ml) gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde über Nacht in 2,5 l 10% Ethylacetat/Hexan aufgeschlämmt. Der Präzipitat wurde filtriert, mit 1 l 10% Ethylacetat/Hexan und dann mit Hexan gewaschen, dann getrocknet, wodurch 233 g Ethyl-β-[[2-[[1,1-dimethylethoxy)carbonyl]amino]-1-oxoethyl]amino]pyridin-3-propionat bzw. -propanoat als weißer Feststoff erhalten wurden.
NMR und MS waren konsistent mit der gewünschten Struktur.
Schritt D
232 g (0,66 Mol) Ethyl-β-([2-[[(1,1-dimethylethoxy)carbonyl]amino]-1-axoethyl]amino]pyridin-3-propionat (aus Schritt C) wurden in 1 l warmen Dioxan gelöst. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurden 1,6 l 4 M HCl in Dioxan (Aldrich) langsam zugegeben. Nach einigen Minuten bildete sich ein weißes Präzipitat, das dann zu einer zähen, dickflüssigen Masse wurde. Nach 2 h wurde das Lösungsmittel dekantiert. Der Rückstand wurde mit Ether aufgeschlämmt und mehrmals dekantiert, bis ein weißer Feststoff entstand. Dieser wurde im Vakuum getrocknet, wodurch 224,2 g des Bistrifluoressigsäuresalzes von Ethyl-β-[[2-amino-1-oxoethyl]amino]pyridin-3-propionat als weißer, hygroskopischer Feststoff erhalten wurden.
NMR und MS waren konsistent mit der gewünschten Struktur.
Schritt E
Zu 325 g (1,63 Mol) 3,5-Dimethylpyrazol-1-carboxamidinnitrat (Aldrich) in 975 ml Dioxan, 390 ml H₂O und 283 ml (1,63 Mol) Diisopropylethylamin wurden 121,6 g (1,04 Mol) 5-Aminovaleriansäure gegeben. Diese Mischung wurde unter Rückfluss während 1 h und dann bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das Präzipitat wurde filtriert, mit 500 ml Dioxan und dann mit 1 l Dioxan:H₂O (1:1) gewaschen. Das Präzipitat wurde luftgetrocknet, dann in 500 ml H₂O aufgeschlämmt und mit konzentrierter HCl bis pH = 1 angesäuert, wodurch eine Lösung entstand. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand mehrmals mit Ether aufgeschlämmt (der Ether wurde jeweils dekantiert) und im Vakuum getrocknet, wodurch 179,8 g des 5-Guanidinovaleriansäurehydrochlorids als weißer Feststoff erhalten wurden.
NMR und MS waren konsistent mit der gewünschten Struktur.
Schritt F
Zu 123,5 g (0,631 Mol) des 5-Guanidinovaleriansäurehydrochlorids (aus Schritt E) in 800 ml wasserfreiem DMF (Aldrich) und 63,8 g (0,631 Mol) N-Methylmorpholin wurden während 10 min tropfenweise 88 g (0,631 Mol) Isobutylchlorameisensäureester bei 0 bis 5°C gegeben (Temperatur wurde während der Zugabe unter Eisbadkühlung unterhalb von 15°C gehalten). Nach Rühren bei Eisbadtemperatur während weiteren 5 min wurde eine Aufschlämmung aus 204,5 g (0,631 Mol) des Bistrifluoressigsäuresalzes von Ethylβ-[(2-amino-1-oxoethyl]amino]pyridin-3-propionat (in HCl) (aus Schritt D) in 800 ml wasserfreiem DMF hergestellt und 127,7 g (1,26 Mol) N-Methylmorphalin in mehreren Portionen zugegeben, wobei die Reaktionstemperatur durch Eisbadkühlung unter 20°C gehalten wurde. Nach dem die Reaktion vollständig erfolgt war, wurde die Reaktionsmischung über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Präzipitat wurde abfiltriert und mit DMF gewaschen. Das DMF wurde unter Vakuum in einem Wasserbad bei 75°C aus dem Filtrat entfernt.
Der Ester-Rückstand wurde in 500 ml warmen Wasser gelöst. Die N₂O-Phase wurde dreimal mit Ethylacetat gewaschen und das Ethylacetat verworfen. Zu der wässrigen Phase wurden 100 g LiOH gegeben und diese Mischung bei Raumtemperatur während 1,5 h gerührt. Die wässrige Lösung wurde zweimal mit Ether gewaschen (Ether wurde verworfen) und die wässrige Phase mit Trifluoressigsäure auf pH = 5 eingestellt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und das Rohprodukt durch präparative RP(C-18)-HPLC entfernt, wodurch 170 g des Bistrifluoressigsäuresalzes von β-[[2-[[5-[[Aminoiminomethyl]amino]-1-oxopentyl]amino]-1-oxoethyl]amino]-3-pyridinpropionsäure als weißer Feststoff erhalten wurden.
NMR und MS waren konsistent mit dem gewünschten Produkt.
Beispiel 2 Bistrifluoressigsäuresalz von βS-[[[1-[5-[(Aminoiminomethyl)aminol-1-oxopentyl]pyrrolidin-2-yl]carbonyl]amino]-3-pyridinpropionsäure
Die obige Verbindung wurde nach dem Verfahren gemäß Beispiel 1 hergestellt, wobei in Schritt C N-t-BOC-Glycin-N-hydroxysuccinimidester durch 257,9 g N-t-130C-L-Prolin-N-hydroxysuccinimidester ersetzt wurde.
NMR und MS waren konsistent mit der gewünschten Struktur.
Beispiel 3 Bistrifluoressigsäuresalz von (±)-R-[[2-[[4-[(Aminoiminomethyl)amino]-1-oxobutyl]amino]1-oxoethyllamino]-3-pyridinpropionsäure
Die obige Verbindung wurde nach dem Herstellungsverfahren gemäß Beispiel 1 hergestellt, wobei in Schritt E die 5-Aminovaleriansäure durch 107,2 g 4-Aminobuttersäure bzw. -butansäure ersetzt wurde.
NMR und MS sind konsistent mit der gewünschten Struktur.
Beispiel 4 Bistrifluoressigsäuresalz von (±)-β-[[2-([6-[(Aminoiminomethyl)amino]-1-oxohexyl]amino]-1-oxoethyllaminol-3-pyridinpropionsäure
Die obige Verbindung wurde nach dem Herstellungsverfahren gemäß Beispiel 1 hergestellt, wobei in Schritt E die 5-Aminovaleriansäure durch 136,4 g 6-Aminocapronsäure bzw. -hexansäure ersetzt wurde.
NMR und MS sind konsistent mit der gewünschten Struktur.
Beispiel 5 Bistrifluoressigsäuresalz von (±)-β-T[3-[[4-[(Aminoiminomethyl)amino]-1-oxobutyllamino]1-oxoproyljaminol-3-pyridinpropionsäure
Die obige Verbindung wurde nach dem Verfahren gemäß Beispiel 3 hergestellt, wobei in Schritt C N-t-BOC-Glycin-N-hydroxysuccinimidester durch 236,5 g N-t-BOC-β-Alanin-N-hydroxysuccinimidester ersetzt wurde.
NMR und MS sind konsistent mit der gewünschten Struktur.
Beispiel 6 Bistrifluoressiasäuresalz von (±)-β-[[2-[[4-[(Aminoiminomethyl)aminol-1-oxo-3-phenylbutyl]amino]-1-oxoethyl]amino]-3-pyridinpropionsäure
Schritt A
4-Guanidino-3-p-chlorphenylbuttersäurehydrochlorid wurde nach dem Verfahren gemäß Beispiel 1, Schritt E, hergestellt, wobei 5-Aminovaleriansäure durch 222,2 g 4-Amino-3-p-chlorphenylbuttersäure (RBI) ersetzt wurde. Dieses Produkt wurde mit 10% Pd/C in 50% EtOH/H₂O unter 50 psi H₂ (7×10⁴ Pa) über Nacht reduziert, wodurch 4-Guanidino-3-phenylbuttersäurehydrochlorid entstanden.
Schritt B:
Die Verbindung gemäß Beispiel 6 wurde gemäß Beispiel 1, Schritt F, hergestellt, wobei 5-Guanidinovaleriansäurehydrochlorid durch 162,6 g des Produktes aus Beispiel 6, Schritt A, oben ersetzt wurde.
NMR und MS sind konsistent mit der gewünschten Struktur.
ASSAY MIT GEREINIGTEM IIb/IIIa REZEPTOR
Materialien:
Menschlicher Fibrinogen-Rezeptor (a_IIbβ₃) wurde aus überalterten Blutplättchen gereinigt (Pytela, R., Pierschbacher, M.D., Argraves, S., Suzuki, S. und Rouslahti, E. "Arginine-Glycine-Aspartic acid adhesion receptors", Methods in Enzymology 144 (1987), 475–489). Menschliches Vitronektin wurde aus frischem, gefrorenen Plasma, wie von Yatohgo, T., Izumi, M., Kashiwagi, N. und Hayashi, M. in "Novel purification of vitronektin from human plasma by heparin affinity chromatography," Cell Structure and Function 13 (1988), 281–292, beschrieben, gereinigt. Biotin-markiertes menschliches Vitronektin wurde durch Kopplung von NHS-Biotin von Pierce Chemical Company (Rockford, IL) an gereinigtes Vitronektin wie zuvor beschrieben (Chara, I.F., Nannizzi, L., Phillips, D.R., Hsu, M.A., Scarborough, R.M., "Inhibition of fibrinogen binding to GP IIb/IIIa by a GP IIIa peptide", J. Biol. Chem. 266 (3) (1991), 1415–1421, hergestellt. Assay-Puffer, OPD Substrattabletten und BSA (Rinderserumalbumin) mit für RIA geeignetem Reinheitsgrad wurden von Sigma (St. Louis, MO) bezogen. Anti-Biotin-Antikörper wurden von Calbiochem (La Jolla, CA) bezogen. GRGDSP-Peptid wurde bei Bachem (Torrance, CA) gekauft. Linbro-Mikrotiterplatten wurden von Flow Labs (McLean, VA) bezogen. ADP-Reagenz wurde von Sigma (St. Louis, MO) bezogen.
Verfahren:
Festphasen-Rezeptor-Assays
Dieser Assay ist im wesentlichen derselbe wie der in Niiya, K., Hodson, E., Bader, R., Byers-Ward, v. Koziol, J.A., Plow, E.F. und Ruggeri, Z.M., "Increased surface expression of the membrane glycoprotein IIb/IIIa complex induced by platelet activation: Relationships to the binding of fibrinogen and platelet aggregation", Blood 70 (1987), 475–483, beschriebene. Der gereinigte menschliche Fibrinogen-Rezeptor (α_IIbβ₃) wurde aus Stammlösungen auf 1,0 μg/ml mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung, pH 7,4 (TBS⁺⁺⁺), die 1,0 mM Ca⁺⁺, Mg⁺⁺ und Mn⁺⁺ enthielt, verdünnt. Der verdünnte Rezeptor wurde unverzüglich in Linbro-Mikrotiter-Platten mit je 100 μl pro Cavität überführt (100 ng Rezeptor/Cavität). Die Platten wurden versiegelt und über Nacht bei 4°C inkubiert, um die Bindung des Rezeptors an die Cavitäten zu ermöglichen. Alle weiteren Schritte wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Assay-Platten wurden geleert und 200 μl 1 % BSA (Reinheitsgrad für RIA-geeignet) in TBS⁺⁺⁺ (TBS⁺⁺⁺/BSA) zugegeben, um unspezifische Bindungsstellen auf der Plastikoberfläche zu blockieren. Nach zweistündiger Inkubation wurden die Assay-Platten unter Verwendung einer 96-Cavitäten-Waschvorrichtung mit TBS+++ gewaschen. Logarithmische Verdünnungsreihen der Testverbindung und der Kontrollen wurden ausgehend von einer Stammlösung von 2 mM biotiniliertem Vitronektin in TBS+++/BSA als Verdünnungslösung hergestellt. Diese Vormischung des markierten Liganden mit dem Test-(oder Kontroll-)Liganden und der nachfolgende Transfer von 50 μl Aliquots auf die Assayplatte wurde mit einer Mehrfachpipette (CETUS Propettte Robot) durchgeführt, wobei die Endkonzentration des markierten Liganden 1 nM und die höchste Konzentration der Testverbindung 1,0 × 10^–4 M waren. Die kompetitive Bindung erfolgte während zwei Stunden, wonach alle Cavitäten wie zuvor mit der Plattenwaschvorrichtung gewaschen wurden. Affinitätsgereinigter, mit Meerrettich-Peroxidase markierter Ziege-Anti-Biotin-Antikörper wurde in TBS+++/BSA 1:3000 verdünnt und 125 μl in jede Cavität gegeben. Nach 30 min wurden die PlAtten gewaschen und mit ODD/N₂O₂-Substrat in 100 mM/l Citratpuffer, pH 5,0, inkubiert. Die Platten wurde bei einer Wellenlänge von 450 nm mit einem Mikrotiterplatten-Lesegerät ausgewertet und die endgültige A₄₅₀ protokolliert, wenn die Kontrolle mit der Maximalbindung eine Absorption von etwa 1,0 erreicht hatte. Die Daten wurden unter Verwendung eines zur Verwendung im Tabellenkalkulationsprogramm Excel^® geschriebenen Macros ausgewertet. Das statistische Mittel, die Standardabweichung und die %CV-Werte wurden für jede Konzentration doppelt bestimmt. Die mittleren A₄₅₀-Werte wurden für einen Mittelwert von vier maximal-bindenden Kontrollen (ohne Zugabe eines Kompetitors = maximale Bindung B-Max) normalisiert. Die normalisierten Werte wurden einem Kurvenangleichungsalgorithmus mit vier Parametern unterworfen (Robard, D., Munson, P.J. und de Lean, A., "Improved Curve Fitting, Parallelism/Testing, Characterization of Sensitivity and Specificity, Validation, and Optimization for Radioligand Assays" in Radioimmunassay and Related Procedures in Medicine, Int. Atomic Energy Agency, Wien, S. 469 (1977)), auf halblogarithmischem Papier aufgetragen und die berechneten IC₅₀-Werte und das entsprechende R² wurden berichtet. GRGDSP, ein Peptid-Fragment des Fibrinogens, wurde bei jeder Platte als Positiv-Kontrolle eingeschlossen.
Assays mit plättchenreichem menschlichen Plasma
Gesunde Blutspender ohne Aspirin-Medikation wurden statistisch aus einer Anzahl Freiwilliger ausgewählt. Die Ernte des plättchenreichen menschlichen Plasmas und die nachfolgende ADP-induzierte Plättchenaggregation wurde wie in Zucker, M.B., "Platelet Aggregation Measured by the Photometric Method", Methods in Enzzymology 169 (1989), 117–133, durchgeführt. Standardverfahren der Venenpunktion unter Verwendung eines Butterflys ermöglichten die Abnahme von 45 ml Vollblut mit einer 60 ml-Spritze, die 5 ml 3,8% Trinatriumcitrat enthielt. Nach gründlichem Durchmischen in der Spritze wurde das gerinnungshemmend behandelte Vollblut in ein konisches 50 ml-Polyethylenröhrchen überführt. Das Blut wurde bei Raumtemperatur während 12 min bei 200 g zur Sedimentation aller Zellen außer den Plättchen zenrifugiert. Das plättchenreiche Plasma wurde in ein Polyethylenröhrchen überführt und bis zur Verwendung bei Raumtemperatur aufbewahrt. Plättchenarmes Plasma wurde aus einer zweiten Zentrifugation des verbliebenen Blutes bei 2000 g während 15 min gewonnen. Die Plättchenzählung ergab typischerweise 300000 bis 500000 pro Mikroliter. Das plättchenreiche Plasma (0,45 ml) wurde in silikonisierten Küvetten allquotiert und vor Zugabe von 50 μl vorverdünnter Testverbindung während 1 min bei 37°C gerührt (1100 rpm). Nach Mischen während 1 min wurde die Aggregation durch Zugabe von 50 μl 200 μM ADP eingeleitet. Die Aggregation wurde während 3 min in einem Payton Zweikanal-Aggregometer aufgezeichnet (Payton Scientific, Buffalo, NY). Die Inhibierung der maximalen Antwort (Kochsalzkontrolle) in Prozent bei einer Verdünnungsreihe der Testverbindungen wurde verwendet, um die Dosis-Antwort-Kurve zu bestimmen. Für alle Verbindungen wurden Doppelbestimmungen durchgeführt und die halbmaximale Inhibierung (IC₅₀) graphisch aus der Dosis-Antwort-Kurve berechnet.
Die Ergebnisse der Assays für die erfindungsgemäßen Verbindungen und deren mittlere inhibierende Konzentrationen (IC₅₀) sind in Tabelle I aufgezeichnet. Die Esterverbindungen dieser Erfindung sind Pro-Arzneimittel der Säureverbindungen und werden somit bei in vivo-Verabreichung in die wirksamen Säureverbindungen umgewandelt, für die in Tabelle I gezeigt ist, dass sie wirksam sind.
TABELLE 1

Claims

Verbindung der Formel
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon, worin R² aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Hydroxy, Amino, C₁-C₆-Alkoxy, C₁-C₆-Alkyl und Cyano ausgewählt ist, A aus der Gruppe bestehend aus C₁-C₆-Alkylen ausgewählt ist, wobei diese Gruppe gegebenenfalls mit C₁-C₆-Alkyl oder Phenyl substituiert ist; V aus der Gruppe bestehend aus -N(R⁶)- und monocyclischen Stickstoff enthaltenden Heterocyclen von 3 bis 7 Atomen und mindestens einem Stickstoffatom ausgewählt ist, worin R⁶ aus der Gruppe bestehend aus N und C₁-C₆-Alkyl ausgewählt ist, Y und Z unabhängig aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, verzweigtem oder unverzweigtkettigem C₁-C₆-Alkyl und C₃-C₆-Cycloalkyl ausgewählt sind, und n eine ganze Zahl ausgewählt aus 0, 1, 2 oder 3 ist, worin R³ unabhängig aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff oder C₁-C₆-Alkyl ausgewählt ist.
Verbindung nach Anspruch 1, worin A C₁-C₆-Alkylen ist.
Verbindung nach Anspruch 2, worin V -N(R⁶) ist.
Verbindung nach Anspruch 3 oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Methyl-β-[[2-[[5-[(aminoiminomethyl]amino]-1-oxopentyl]amino]-1-oxoethyl]amino]-3-pyridinpropanoat; β-[[2-[[5-[(Aminoiminomethyl]amino]-1-oxopentyl]amino]-1-oxoethyl]amino]-3-pyridinpropansäure; (±) Ethyl-β-[[2-[[4-[(aminoiminomethyl]amino]-1-oxobutyl]amino]-1-oxoethyl]amino]-3-pyridinpropanoat; (±) β-[[2-[[4-[(Aminoiminomethyl]amino]-1-oxobutyl]amino]-1-oxoethyl]amino]-3-pyridinpropansäure; (±) Ethyl-β-[[2-[[6-[(aminoiminomethyl]amino]-1-oxohexyl]amino]-1-oxoethyl]amino]-3-pyridinpropanoat; (±) β-[[2-[[6-[(Aminoiminomethyl]amino]-1-oxohexyl]amino]-1-oxoethyl]amino]-3-pyridinpropansäure; (±) β-[[3-[[4-[(Aminoiminomethyl]amino]-1-oxobutyl]amino]-1-oxopropyl]amino]-3-pyridinpropansäure; (±) Ethyl-ß-[[2-[[4-[(aminoiminomethyl]amino]-1-oxo-3-phenylbutyl]amino]-1-oxoethyl]amino]-3-pyridinpropanoat; und (±) β-[[2-[[4-[(Aminoiminomethyl]amino]-1-oxo-3-phenylbutyl]amino]-1-oxoethyl]amino]-3-pyridinpropansäure.
Verbindung nach Anspruch 2, worin V Pyrrolidin ist.
Verbindung nach Anspruch 5 oder ein pharmazeutisch annehmbarres Salz davon, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ethyl-ßS-[[[1-[5-[(aminoiminomethyl)amino]-1-oxopentyl]pyrrolidin-2-yl]carbonyl]amino-3-pyridinpropanoat und βS-[[[1-[5-[(Aminoiminomethyl)amino]-1-oxopentyl]pyrrolidin-2-yl]carbonyl]amino-3-pyridinpropansäure.
Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend eine therapeutisch wirksame Menge einer Verbindung nach Anspruch 1 oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 7, worin die Verbindung aus der Gruppe gemäß Anspruch 4 oder 6 ausgewählt ist.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines Säugetiers, um die Plättchenaggregation zu inhibieren.
Verwendung nach Anspruch 9, worin die Verbindung oder das pharmazeutisch annehmbare Salz davon aus der Gruppe bestehend aus Anspruch 4 oder 6 ausgewählt ist.