DE69528591T2

DE69528591T2 - Herstellung des inhibitors fuer die komplexbildung des gewebefaktors

Info

Publication number: DE69528591T2
Application number: DE69528591T
Authority: DE
Inventors: A. Creasey; A. Innis
Original assignee: Chiron Corp
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1994-08-05
Filing date: 1995-07-25
Publication date: 2003-02-20
Anticipated expiration: 2015-07-26
Also published as: AU3104495A; AU707762B2; JPH10507071A; ATE226249T1; EP0774001B1; EP0774001A1; US20050064556A1; DE69528591D1; JP3779728B2; CA2196296A1; US6103500A; WO1996004377A1; JP2005348744A; CA2196296C

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Faktor VIIa/TF/Xa-bindenden Proteins, genauer gesagt die Herstellung eines Gewebsfaktorbahn-Inhibitor ("Tissue Factor Pathway Inhibitor" = TFPI) und eines Gewebsfaktorbahn-Inhibitor ("Tissue Factor Pathway Inhibitor 2" = TFPI-2) sowie mutierte Proteine derselben in Hefezellen und die Isolierung derartiger Polypeptide aus der Hefezelle.
Gewebsfaktorbahn-Inhibitor ("Tissue Factor Pathway Inhibitor" = TFPI) hemmt die Gerinnungskaskade auf wenigstens zwei Wegen, nämlich dadurch, dass die Bildung eines Faktor VIIa/Gewebsfaktor-Komplexes verhindert wird und dadurch, dass er sich an das aktive Zentrum des Faktors Xa bindet. Die Primärsequenz von TFPI, wie sie aus der cDNA-Sequenz abgeleitet wurde, zeigt an, dass das Protein drei Enzym-Inhibitor-Domänen vom Kunitz-Typ aufweist. Die erste dieser Domänen wird für die Inhibierung des Faktor VIIa/Gewebsfaktor-Komplexes benötigt. Die zweite Domäne vom Kunitz-Typ wird für die Inhibierung des Faktors Xa gebraucht. Die Funktion der dritten Domäne vom Kunitz-Typ ist unbekannt. TFPI hat keine bekannte enzymatische Aktivität und man nimmt an, dass er seine Protease-Ziele in einer stöchiometrischen Weise inhibiert, nämlich dadurch, dass eine TFPI-Domäne vom Kunitz-Typ an die aktive Stelle beziehungsweise das aktive Zentrum von einem Proteasemolekül bindet. Das Carboxyterminale Ende von TFPI spielt, wie man annimmt, eine Rolle bei der Zelloberflächenlokalisierung über die Heparinbindung und durch die Wechselwirkung mit Phospholipid. TFPI ist auch als so genannter Lipoprotein-assoziierter Koagulationsinhibitor (LACI), als Gewebsfaktor- Inhibitor (TFI) und als Extrinsic-System-Inhibitor (EPI) bekannt.
Reifer TFPI hat eine Länge von 276 Aminosäuren mit einem negativ geladenen Aminoterminalen Ende und einem positiv geladenen Carboxyterminalen Ende. TFPI enthält 18 Cysteinreste und bildet neun Disulfidbrücken, wenn er korrekt gefaltet ist. Die Primärsequenz enthält auch drei über N-verknüpfte Glykosylierungskonsensusstellen der Asn-X- Ser/Thr-Struktur, wobei die Asparagin-Reste an den Positionen 145, 195 sowie 256 lokalisiert sind. Der Kohlenhydratbestandteil von reifem TFPI ist ungefähr 30% der Masse des Proteins. Jedoch implizieren Daten, die der proteolytischen Kartierung entspringen, und Daten der Massen-Spektralanalyse, dass der Kohlenhydratanteil heterogen ist. TFPI wird auch in an dem Serinrest in Position 2 des Proteins phosphorylierter Form gefunden, wobei der Grad der Phosphorylierung variiert. Die Phosphorylierung scheint die TFPI-Funktion nicht zu beeinflussen.
Von TFPI hat man gezeigt, dass er in einem Pavian-Modell für letalen septischen Schock durch Escherichia coli (E. coli) die Mortalität verhindert (Creasey et al., J. Clin. Invest. 91: 2850 bis 2860 (1993)). Verabreichung von TFPI mit einer Dosis von 6 mg/kg Körpergewicht kurz nach der Infusion einer letalen Dosis von E. coli führte zu einem Überleben in allen fünf mit TFPI behandelten Tieren mit signifikanter Verbesserung der Lebensqualität im Vergleich zur mittleren Überlebenszeit für die fünf Kontrolltiere von 39,9 Stunden. Die Verabreichung von TFPI führte auch zu einer signifikanten Abschwächung der Gerinnungsantwort, von verschiedenen Maßnahmen für Zellschädigung und einer signifikanten Reduktion in Bezug auf die Pathologie, die normalerweise in den septischen Zielorganen von E. coli beobachtet wird, welche die Nieren, die Adrenalindrüsen und Lungen einschließen.
Auf Grund seiner die Blutgerinnung verhindernden Eigenschaften kann das TFPI auch dazu verwendet werden, Thrombose während eines mikrovaskulären chirurgischen Eingriffs zu verhindern. Beispielsweise offenbart US-Patentschrift 5,276,015 die Verwendung von TFPI in einer Methode zum Reduzieren der Thrombogenizität in mikrovaskulären Anastomosen, wobei das TFPI an einer Stelle der mikrovaskularen Anastomosen zeitgleich mit einer mikrovaskulären Rekonstruktion verabreicht wird.
Jüngst wurde ein anderes Protein, das einen hohen Grad an struktureller Identität mit TFPI zeigt, identifiziert [Sprecher et al., Proc. Nat. Acad. Sci., USA 91: 3353 bis 3357 (1994)]. Die vorhergesagte Sekundärstruktur dieses Proteins, das TFPI-2 genannt wird, ist anscheinend identisch mit derjenigen von TFPI mit 3 Domänen vom Kunitz-Typ, 9 Cystein-Cystein- Verknüpfungen, einem sauren Amino-terminalen Ende und einem basischen Carboxyterminalen Endstück. Die drei Domänen des Kunitz-Typs von TFPI-2 zeigen eine 43%-, 35%- und 53%-ige Identität der Primärsequenz mit den TFPI-Domänen 1, 2 beziehungsweise 3 vom Kunitz-Typ. Rekombinantes TFPI-2 inhibiert stark die amidolytische Aktivität von Faktors VIIa/Gewebsfaktor. Im Kontrast dazu ist TFPI-2 ein schwacher Inhibitor der amidolytischen Aktivität des Faktors Xa.
TFPI wurde aus humanem Plasma sowie auch den menschlichen Gewebskulturzellen isoliert, HepG2-, Chang-Leber- und SK-Hepatoma-Zellen eingeschlossen. Rekombinantes TFPI wurde in C127-Zellen der Maus, Babyhamster-Nieren-Zellen, Eierstockzellen des chinesischen Hamsters und menschlichen SK-Hepatoma-Zellen exprimiert. Von rekombinantem TFPI aus C127-Zellen der Maus wurde in Tiermodellen gezeigt, dass er die durch Gewebsfaktor induzierte Koagulation inhibiert. Häufig jedoch wird TFPI, der in Säugetierzellen produziert wird, durch proteolytische Spaltung abgebaut. Das Protein wird am häufigsten am Arginin an den Positionen 83 sowie 199 gespalten.
Eine nicht-glykosylierte Form von rekombinantem TFPI wurde aus Escherichia coli (E. coli)-Zellen produziert und isoliert, wie im US-Patent Nr. 5,212,091 offenbart. Von dieser Form des TFPI wurde gezeigt, dass sie bei der Inhibierung des Faktors Xa aus dem Rind und bei der Inhibierung der durch humanen Gewebsfaktor induzierten Koagulierung im Plasma aktiv ist. In einigen Testansätzen mit von E. coli produziertem TFPI wurde gezeigt, dass er aktiver ist als TFPI, der aus SK-Hepatoma-Zellen stammt. Jedoch wird TFPI, der in E. coli-Zellen produziert wird, häufig auf eine Art modifiziert, die ein Ansteigen der Heterogenität des Proteins zur Folge hat. Diese Modifikationen beinhalten den proteolytischen Abbau, die Carbamylierung und N-terminale Modifikationen. Unterschiedliche Formen von TFPI können auch gefunden werden, die aus einer nicht-geeigneten internen Translationsinitiierung durch E. coli-Ribosomen resultieren.
Verfahren für die Reinigung von TFPI aus Zellkultur-Medium von Hefe wurden auch offenbart, wie etwa in Petersen et al., J. Biol. Chem. 18: 13344 bis 13351 (1993). In diesen Fällen wird rekombinanter TFPI aus der Hefezelle sekretiert. TFPI, der in derartigen Protokollen wiedergewonnen wird, ist ebenfalls häufig heterogen, vielleicht auf Grund von proteolytischem Abbau und variabler Glykosylierung. Deshalb gibt es auf dem Fachgebiet einen Bedarf, reifen TFPI herzustellen, der authentisch ist (das heißt mit der korrekten Amino-terminalen Aminosäuresequenz), die komplette Länge aufweist und homogen ist.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen von Faktor VIIa/TF/Xa-bindenden Proteinen, TFPI, TFPI-2 und deren mutierte Proteine eingeschlossen, wobei das Verfahren die Schritte einschließt, dass Hefezellen, die mit einem replizierbaren Klonierungsvehikel transformiert sind, inkubiert werden, wobei das replizierbare Klonierungsvehikel eine erste Nukleotidsequenz umfasst, die für das den Faktor VIIa/TF/Xa-bindende Protein codiert, unter Bedingungen, die günstig für die Produktion des den Faktor VIIa/TF/Xa-bindenden Proteins sind, wobei das den Faktor VIIa/TF/Xa-bindende Protein innerhalb der Hefezelle verbleibt beziehungsweise "retiniert" wird, eine nicht-lösliche Fraktion der transformierten Hefezellen hergestellt wird, die das den Faktor VIIa/TF/Xa-bindende Protein enthält, und das den Faktor VIIa/TF/Xa-bindende Protein, das in der nicht-löslichen Fraktion enthalten ist, isoliert wird. Der DNA, die für das Faktor VIIa/TF/Xa-bindende Protein codiert, kann unmittelbar im Leseraster eine zweite Nukleotidsequenz vorangehen, wobei die erste und die zweite Nukleotidsequenz zusammen für ein Fusionspeptid codieren, wobei das Fusionspeptid in der Lage ist, innerhalb der Hefezellen gespalten zu werden um das authentische Faktor VIIa/TF/Xa-bindende Protein herzustellen. Die zweite Nukleotidsequenz kann für Ubiquitin codieren. Bei den Hefezellen kann es sich um solche des Genus Saccharomyces handeln, insbesondere Saccharomyces cerevisiae, und sie können einen Genotyp aufweisen, der ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus VH6, AB 122 und JSC310.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1A und 1B zeigen die Aktivität von TFPI, das mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens produziert worden ist.
Fig. 2 zeigt ein Schema eines replizierbaren Klonierungsvehikels (bezeichnet als pLA- CI 4.1), das eine DNA-Sequenz einschließt, die für das TFPI-Protein codiert.
Fig. 3 zeigt eine Sequenz, die für ein Ubiquitin-TFPI-Fusionspeptid [SEQ ID NO: 1] codiert, wie sie im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird um TFPI zu produzieren, das die authentische Primärsequenz enthält.
Fig. 4 zeigt ein mit Coomassie gefärbtes PAGE-Gel von TFPI, wie es in der unlöslichen Fraktion innerhalb der Hefezellen nach anfänglicher Reinigung enthalten ist.

GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Der Ausdruck "Faktor VIIa/TF/Xa-bindendes Protein", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf Proteine, die in der Lage sind, an den Faktor VIIa/TF-Komplex zu binden, und dadurch die Funktion des Komplexes zu inhibieren, und die weiter im Stande sein können, den Faktor Xa zu binden, wodurch seine Funktion inhibiert wird. Reifer Gesamtlängen-TFPI, TFPI- 2 und mutierte Proteine davon sind durch diesen Ausdruck mit umfasst. Vorzugsweise handelt es sich bei dem den Faktor VIIa/TF/Xa-bindenden Protein um TFPI.
Es wurde nun gefunden, dass die Herstellung des den Faktor VIIa/TF/Xa-bindenden Proteins, insbesondere des TFPI in Hefe, wobei das TFPI nicht sekretiert, sondern in den Zellen in einer nicht-löslichen Fraktion zurückgehalten beziehungsweise bewahrt wird, zur Gewinnung des authentischen (das heißt mit der korrekten N-terminalen Aminosäuresequenz) homogenen Gesamtlängen-TFPI führt. Dabei bezieht sich der Ausdruck "TFPI" auf das 276 Aminosäuren- Polypeptid, wie es in Girard et al., Nature, 338: 518 bis 520 (1989) beschrieben ist. Hierin bezieht sich der Ausdruck TFPI-2 auf das Polypeptid mit 213 Aminosäuren, wie es in Sprecher et al., Proc. Nat. Acad. Sci., USA 91: 3353 bis 3357 (1994) beschrieben ist.
Hefe-Expressionssysteme können bei der vorliegenden Erfindung für die Produktion des den Faktor VIIa/TF/Xa-bindenden Proteins verwendet werden und sind auch den Fachleuten vertraut. Derartige Expressionssysteme erfordern zumindest einen Promotor aus der Hefe, bei dem es sich um eine DNA-Sequenz handelt, die in der Lage ist, RNA-Polymerase aus der Hefe zu binden, und die stromabwärts führende 5'-3'-Transkription einer codierenden Sequenz (beispielsweise DNA, die für TFPI oder TFPI-2 codiert) zu mRNA zu initiieren. Der Promotor wird dabei einen Bereich für die Initiation der Transkription aufweisen, welches normalerweise nächstliegend zu dem 5'-Ende der codierenden Sequenz gelegen ist. Dieser Bereich der Initiation der Transkription beinhaltet eine Bindungsstelle für die RNA-Polymerase (die sogenannte "TATA-Box") und eine Stelle der Initiation der Transkription. Ein Hefepromotor kann hierbei auch eine zweite Domäne aufweisen, die als stromaufwärts gelegene Aktivator-Sequenz bezeichnet ist (UAS), welche im Falle ihres Vorhandenseins üblicherweise distal von dem Strukturgen gelegen ist (das heißt weiter stromaufwärts), bezogen auf den Bereich der Initiation der Transkription. Die UAS steuert auch die Regulation der Expression. Die Steuerung der Expression kann entweder positiv oder negativ sein, wodurch sie entweder die Transkription verstärkt oder reduziert, wie gewünscht.
Bei Hefe handelt es sich um einen fermentierenden Organismus mit aktiven metabolischen Stoffwechselwegen, weshalb Sequenzen, die für Enzyme, in dem metabolischen Stoffwechselweg codieren, besonders nützliche Promotor-Sequenzen für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bereitstellen. Beispiele beinhalten die Alkoholdehydrogenase (ADH) (EPO Veröffentlichungsnr. 284 044), die Enolase, die Glucokinase, die Glucose-6-phosphat-Isomerase, die Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAP oder GAPDH), die Hexokinase, die Phosphofructokinase, die 3-Phosphoglycerat-Mutase sowie die Pyruvatkinase (PyK) (EPO Veröffentlichungsnr. 329 203). Das PHO5-Gen aus der Hefe, das für saure Phosphatase codiert und von Myanohara et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 1 (1983) beschrieben ist, stellt auch brauchbare Promotorsequenzen für die vorliegende Erfindung bereit.
Zusätzlich fungieren als Hefe-Promotoren hierbei auch synthetische Promotoren, die nicht in der Natur vorkommen. Beispielsweise können die UAS-Sequenzen eines Promotors aus der Hefe mit dem die Transkription aktivierenden Bereich eines anderen Hefe-Promotors verbunden beziehungsweise verknüpft werden, was einen Hybrid-Promotor schafft. Beispiele für derartige Hybrid-Promotoren beinhalten die regulatorischen Sequenzen der ADH, die an den die GAP-Transkription aktivierenden Bereich geknüpft sind, wie in den US Patenten 4,876,197 und 4,880,734 beschrieben, deren Offenbarungen hier durch die Bezugnahme mit inkorporiert werden. Andere Beispiele für Hybrid-Promotoren beinhalten Promotoren, die aus den regulatonschen Sequenzen entweder des ADH2-, GAL4-, GAL10- oder PHO5-Gens bestehen, welche mit dem Bereich für die Aktivierung der Transkription eines glykolytischen Enzyms, wie etwa GAP oder PyK, kombiniert sind, wie in der EPO Veröffentlichungsschrift Nr. 164 556 beschrieben. Des Weiteren kann ein Promotor der Hefe natürlicherweise vorkommende Promotoren beinhalten, die nicht ihren Ursprung in der Hefe haben, die aber die Fähigkeit haben, RNA- Polymerase aus Hefe zu binden und die Transkription zu initiieren. Beispiele derartiger Promotoren beinhalten jene, die in den folgenden Referenzen beschrieben sind: Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 1078 (1980); Henikoff et al., Nature 283: 835 (1981); Hollenberg et al., Curr. Topics Microbiol. Immunol. (1981) 96: 119; Hollenberg et al., "The Expression of Bacterial Antibiotic Resistance Genes in the Yeast Saccharomyces cerevisiae" in Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance (Hrsgg. K. N. Timmis und A. Puhler) (1979); Mercerau-Puigalon et al., (1980) Gene 11: 163; Panthier et al., Curr. Genet. 2: 109 (1980).
Die Produktion von Fusionsproteinen in einem Hefe-Expressionssystem ist für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bevorzugt. Genauer gesagt wird eine DNA-Sequenz, die für den N-terminalen Bereich eines endogenen Hefeproteins oder eines anderen stabilen Proteins codiert, mit dem 5'-Ende der codierenden Sequenzen für das den Faktor VIIa/TF/Xa-bindende Protein fusioniert. Bei der Expression wird dieses Konstrukt eine Fusion von zwei Aminosäuresequenzen bereitstellen. Beispielsweise kann das Gen für die Superoxid-Dismutase (SOD) aus Hefe oder Mensch an das 5'-Ende des TFPI-Gens angehängt werden und das resultierende Fusionsprotein wird in der Hefe exprimiert. Die DNA-Sequenzen bei der Verbindung beziehungsweise dem Übergang der zwei Aminosäuresequenzen können für eine spaltbare Stelle codieren, wie in der EPO Veröffentlichungs-Nr. 196 056 beschrieben, oder aber auch nicht. Vorzugsweise ist diese Stelle jedoch spaltbar. Ein bevorzugtes Fusionsprotein ist das Ubiquitin-TFPI-Fusionsprotein. Ein derartiges Fusionsprotein wird mit der Sequenz für Ubiquitin hergestellt, die vorzugsweise eine Stelle für ein Prozessierungsenzym bewahrt, das die vorzugsweise eine Stelle für ein Prozessierungsenzym bewahrt, das einer Ubiquitinspeziiischen Prozessierungsprotease erlaubt, das Ubiquitin von dem gewünschten Polypeptid abzuspalten. Mittels dieses Verfahrens beziehungsweise dieser Methode kann deshalb reifes, den Faktor VIIa/TF/Xa-bindendes Protein mit einem authentischen Amino-terminalen Ende in der Hefezelle produziert und aus der Hefezelle isoliert werden. Die Verwendung der Fusionstechnik mit dem Ubiquitin-Protein ist als Übersicht in Barr et al., in Recombinant Systems In Protein Expression (Elsevier Science Publishers B. V., 1991), S. 37 bis 46 veröffentlicht.
Üblicherweise sind Sequenzen für die Termination beziehungsweise Beendigung der Transkription, wie sie durch Hefe erkannt werden, regulatorische Bereiche, die 3' stromabwärts des Stoppcodons für die Translation gelegen sind und zusammen mit dem Promotor die codierende Sequenz flankieren. Diese Sequenzen steuern die Transkription zu einer mRNA, welche zu einem Polypeptid, das durch die DNA codiert ist, translatiert wird. Von der Hefe erkannte Terminationssequenzen aus Genen, wie etwa jene, die für den alpha-Faktor und für glykolytische Enzyme codieren, können hier verwendet werden.
Üblicherweise werden die vorstehend beschriebenen Bestandteile, umfassend einen Promotor, wahlweise eine so genannte Leader-Sequenz, die codierende Sequenz für das den Faktor VIIa/TF/Xa-bindende Protein sowie die Sequenz zur Beendigung der Transkription miteinander in einem Expressionskonstrukt zusammengestellt. Die hierin erwähnten Expressionskonstrukte können in einem Replikon, wie etwa einem extrachromosomalen Element (beispielsweise einem Plasmid), aufbewahrt werden, das in der Lage ist, eine stabile Haftung in einem Wirt, wie etwa Hefe oder Bakterien, zu liefern. Das Replikon kann zwei Replikationssysteme aufweisen, welche es zulassen, dass das Replikon beispielsweise in der Hefe für die Expression und in einem prokaryontischen Wirt für das Klonieren und das Amplifizieren gehalten wird. Beispiele derartiger Hefe-Bakterien-Shuttle-Vektoren, die hierbei nützlich sind, beinhalten YEp24, wie in Botstein et al., (1979) Gene 8: 17 bis 24 beschrieben, pCl/l, wie in Brake et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 4642 bis 4646 (1984)] beschrieben und YRp17, wie in Stinchcomb et al. [J. Mol. Biol. 158: 157 (1982)] beschrieben. Zusätzlich kann das Replikon entweder als Plasmid mit einer hohen Kopienzahl oder als Plasmid mit einer niedrigen Kopienzahl vorliegen. Ein Plasmid mit einer hohen Kopienzahl wird im Allgemeinen eine Zahl an Kopien haben, die von etwa 5 bis etwa 200 und üblicherweise von etwa 10 bis etwa 150 reicht. Es kann entweder ein Vektor mit einer hohen Kopienzahl oder ein Vektor mit einer niedrigen Kopienzahl ausgewählt werden, wobei das von dem Effekt des Vektors und des fremden Proteins auf den Wirt abhängt. Vergleiche beispielsweise Brake et al., supra.
Alternativ dazu können die Expressionskonstrukte in das Hefegenom mit einem integrierenden Vektor integriert werden. Integrierende Vektoren enthalten üblicherweise wenigstens eine Sequenz, die homolog zu einem Hefechromosom ist und die es dem Vektor erlaubt zu integrieren, und sie enthalten vorzugsweise zwei homologe Sequenzen, die das Expressionskonstrukt flankieren. Integrationen scheinen das Ergebnis von Rekombinationen zwischen homologen DNA-Sequenzen in dem Vektor und dem Hefechromosom zu sein. Ein integrierender Vektor kann auf eine spezifische Stelle beziehungsweise Locus in Hefe gerichtet sein, indem die geeignete homologe Sequenz für den Einschluss in dem Vektor gewählt wird, wie in Orr-Weaver et al., Methods in Enzymol. 101: 228 bis 245 (1983) beschrieben. Ein oder mehrere Expressionskonstrukte können integrieren, wobei sie möglicherweise Gehalte an rekombinantem Protein, welches produziert wird, beeinträchtigen. Rine et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 6750 (1983). Die chromosomalen Sequenzen, die in dem Vektor beinhaltet sind, können entweder als Einzelsegment in dem Vektor, was zu der Integration des vollständigen Vektors führt, oder als zwei Segmente, die homolog zu den benachbarten Segmenten in dem Chromosom sind und das Expressionskonstrukts in dem Vektor flankieren, was zu einer stabilen Integration von lediglich dem Expressionskonstrukt führen kann, vorkommen.
Üblicherweise können die extrachromosomalen und integrierenden Expressionskonstrukte selektierbare Marker enthalten, die die Selektion von Hefestämmen zulassen, die transformiert worden sind. Selektierbare Marker können biosynthetische Gene beinhalten, die in dem Hefe-Wirt exprimiert werden können, wie etwa ADE2, HIS4, LEU2, TRP1 sowie ALG7 und das G418-Resistenzgen, die Hefezellen Resistenz gegenüber Tunicamycin beziehungsweise G418 verleihen. Zusätzlich kann auch ein geeigneter selektierbarer Marker Hefe mit der Fähigkeit versehen, in der Gegenwart einer toxischen Verbindung wie etwa eines Metalls zu wachsen. Beispielsweise erlaubt es die Präsenz von CUP1 der Hefe, in der Gegenwart von Kupferionen zu wachsen, wie in Butt et al., Microbiol. Rev. 51: 351 (1987) beschrieben.
Alternativ dazu können die vorstehend beschriebenen Bestandteile zu Transformationsvektoren zusammengestellt sein. Transformationsvektoren werden üblicherweise von einem selektierbaren Marker umfasst, der entweder in einem Replikon aufrechterhalten beziehungsweise bewahrt wird oder sich zu einem integrierenden Vektor entwickelt, wie vorstehend beschrieben.
Expressionsvektoren und Transformationsvektoren, entweder in der Form von extrachromosomalen Replikons oder als integrierende Vektoren, sind zur Transformation in viele Hefen entwickelt worden. Beispielsweise wurden Expressionsvektoren unter anderem für folgende Hefen entwickelt: Candida albicans (Kurtz et al., Mol. Cell. Biol. 6: 142 (1986)), Candida maltosa (Kunze et al., J. Basic Microbiol. 25: 141 (1985)), Hansenula polymorpha (Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132: 3459 (1986); Roggenkamp et al., Mol. Gen. Genet. 202: 302 (1986)), Kluyveromyces fragilis (Das et al., J. Bacteriol. 158: 1165 (1984)); Kluyveromyces lactis (De Louvencourt et al., J. Bacteriol. 154: 737 (1983); Van den Berg et al., Bio/Technology 8: 135 (1990)), Pichia guillermondii (Kunze et al., J. Basic Microbiol. 25: 141 (1985); Pichia pastoris (Cregg et al., Mol. Cell. Biol. 5: 3376 (1985); US-Patente Nr. 4,837,148 und 4,929,555), Saccharomyces cerevisiae (Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929 (1978); Ito et al., J. Bacteriol. 153: 163 (1983)); Schizosaccharomyces pombe (Beach und Nurse, Nature 300: 706 (1981)) und Yarrowia dipolytica (Davidow et al., Curr. Genet. 10: 380471 (1985) und Gaillardin et al., Curr. Genet. 10: 49 (1985)).
Vorgehensweisen für die Transformation, die hier verwendet werden um Hefezellen zu transformieren, beinhalten die Elektroporation, wie in "Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology", Bd. 194 METHODS IN ENZYMOLOGY; C. Guthrie und G. R. Fink (Academic Press 1991) beschrieben. Andere Vorgehensweisen beinhalten die Transformation von Sphäroplasten oder die Transformation von intakten Zellen, die mit Alkali-Kationen behandelt worden sind. Solche Vorgehensweisen sind beispielsweise in Kurtz et al., Mol. Cell. Biol. 6: 142 (1986), Kunze et al., J. Basic Microbiol. 25: 141 (1985) für Candida, Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132: 3459 (1986), Roggenkamp et al., Mol. Gen. Genet. 202: 302, für Hansenula (1986), Das et al., J. Bacteriol. 158: 1165 (1984); De Louvencourt et al., J. Bacteriol. 154: 1165 (1983); Van den Berg et al., Bio/Technology 8: 135 (1990) für Kluyveromyces, Cregg et al., Mol. Cell. Biol. 5: 3376 (1985), Kunze et al., J. Basic Microbiol. 25: 141 (1985); US-Patent Nr. 4,837,148 und US-Patent Nr. 4,929,555 für Pichia, Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929 (1978), Ito et al., J. Bacteriol. 153: 163 (1983) für Saccharomyces, Beach and Nurse, Nature 300: 706 (1981) für Schizosaccharomyces, Davidow et al., Curr. Genet. 10: 39 (1985); Gaillardin et al., Curr. Genet. 10: 49 (1985), für Yarrowia beschrieben.
Mutierte TFPI- oder TFPI-2-Proteine können auch entsprechend der Methode der Erfindung bereitgestellt werden. Mutierte Proteine innerhalb des Umfangs dieser Definition beinhalten: (a) Mutierte TFPI- oder TFPI-2-Proteine mit 1 bis 5 konservativen Aminosäuresubstitutionen, die nicht wesentlich die Konformation des Moleküls ändern; (b) Mutierte TFPI- oder TFPI- 2-Proteine mit Aminosäuresubstitutionen, die eine oder mehrere Stellen der Glykosylierung über N-Verknüpfungen eliminieren; (c) Mutierte TFPI-Proteine mit 1 bis 5 Aminosäuresubstitutionen, die einen Rest von TFPI zu einem entsprechenden Rest von TFPI-2 ändern; (d) Mutierte TFPI-2-Proteine, die 1 bis 5 Aminosäuresubstitutionen aufweisen, die einen Rest von TFPI-2 zu einem korrespondierenden Rest von TFPI ändern; (e) Mutierte TFPI-Proteine oder TFPI-2- Proteine mit Aminosäuresubstitutionen in P&sub1;-reaktiven Stellen in einer oder mehreren Domänen vom Kunitz-Typ sowie (f) Mutierte TFPI- oder TFPI-2-Proteine mit Aminosäuresubstitutionen an Positionen innerhalb von 5 Aminosäuren der P&sub1;-reaktiven Stellen in einer oder mehreren Domänen vom Kunitz-Typ. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird der Lysin-Rest in der P&sub1;-reaktiven Stelle der ersten Domäne vom Kunitz-Typ von TFPI durch Arginin ersetzt. Das mutierte Protein hat dann die folgende Sequenz:
In ähnlicher Weise kann das mutierte Protein ein mutiertes TFPI-2-Protein sein, in dem der Glutamat-Rest in der P&sub1;-reaktiven Stelle der zweiten Domäne vom Kunitz-Typ von TFPI-2 durch Arginin ersetzt ist. Herstellung und Isolierung der mutierten TFPI- und TFPI-2-Proteine, bei denen eine oder mehrere Konsensus-Stellen für die N-verknüpfte Glykosylierung geändert worden sind, um eine derartige Erkennung zu verhindern, liegt auch innerhalb des Verfahrens gemäß der Erfindung. TFPI hat drei derartige Konsensus-Sequenzen, die beispielsweise geändert werden können, indem Serin oder Threonin durch Alanin an der Konsensus-Stelle ersetzt wird.
In ähnlicher Weise können ebenfalls mutierte TFPI-2-Proteine, bei dem der Serin-Rest in Position 96 des reifen TFPI-2 und/oder der Threonin-Rest in Position 150 des reifen TFPI-2 durch Alanin substituiert wurden, hergestellt werden. Mutierte Proteine, die konservative Aminosäure-Substitutionen enthalten, bezogen auf die Sequenz von TFPI oder TFPI-2, können erfindungsgemäß hergestellt und isoliert werden. Schließlich sind die Herstellung und die Isolierung von mutierten TFPI-Proteinen, bei denen die entsprechenden Aminosäuren von TFPI-2 an einer gegebenen Stelle für die Aminosäure, die normalerweise in der TFPI-Sequenz gefunden wird, eingesetzt wird und auch von mutierten TFPI-2-Proteinen, bei denen die entsprechende Aminosäure von TFPI an einer gegebenen Stelle für die Aminosäure eingesetzt wird, die normalerweise in der TFPI-Sequenz gefunden wird, ebenfalls im Schutzumfang der Erfindung.
Mutierte Proteine können durch geeignete Mutagenese der Sequenz der rekombinanten Klonierungsvehikel, die für TFPI oder TFPI-2 codieren, hergestellt werden. Techniken für die Mutagenese beinhalten, ohne Beschränkung, ortsspezifische Mutagenese (site specific mutagenesis). Die ortsspezifische Mutagenese kann durchgeführt werden, indem eine Zahl von Arbeitsschritten verwendet wird, die im Stand der Technik bekannt sind. Derartige Techniken sind beispielsweise von Smith, 1985, Annual Review of Genetics, 19: 423 beschrieben und Modifikationen von einigen dieser Techniken sind in Methods in Enzymology, 154, Teil E, (Hrsgg.) Wu und Grossman (1987), Kapitel 17, 18, 19 sowie 20 beschrieben. Die ortsspezifische Mutagenese kann auch durchgeführt werden, indem eine Variante der ortsspezifischen Mutagenese beziehungsweise des entsprechenden Verfahrens verwendet wird, das unter dem Namen "Gapped Duplex site-directed mutagenesis method" bekannt ist. Die generelle Vorgehensweise ist durch Kramer et al., in Kapitel 17 von Methods in Enzymology, supra, beschrieben. Andere Techniken zum Erzeugen von Punktmutationen in PCR-Techniken für die Nukleinsäuresequenz beinhalten ebenfalls die überlappende PCR, wie sie in PCR PROTOCOLS: A GUaE TO ME- THODS AND APPLICATIONS", (Hrsgg.) Innis, Gelfand, Sninsky und White (Academic Press, 1990) beschrieben sind.

Formulierung und Verabreichung

LACI, hergestellt mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens, kann in einer Konzentration verabreicht werden, die therapeutisch effektiv ist, um septischen Schock zu behandeln und zu verhindern. Zur Erreichung dieses Ziels wird der LACI, der hergestellt ist mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens, vorzugsweise intravenös verabreicht. Verfahren um diese Verabreichung zu ermöglichen, sind den Fachleuten bekannt.
Vor der Verabreichung an Patienten können Formulierungs-Hilfsmittel dem mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens gemachten LACI hinzugefügt werden. Eine flüssige Formulierung kann verwendet werden. Beispielsweise können derartige Formulierungshilfen Öle, Polymere, Vitamine, Kohlenhydrate, Aminosäuren, Salze, Puffer, Albumin, oberflächenaktive Mittel oder so genannte Füllmassenmittel beinhalten. Kohlenhydrate, die bei der Formulierung verwendet werden können, beinhalten Zucker oder Zuckeralkohole, wie etwa, Mono-, Di- oder Polysaccharide, oder wasserlösliche Glucane. Die Saccharide oder Glucane können Fructose, Dextrose, Lactose, Glucose, Mannose, Sorbose, Xylose, Maltose, Sucrose, Dextran, Pullulan, Dextrin, alpha- und beta-Cyclodextrin, lösliche Stärke, Hydroxyethylstärke und Carboxymethylcellulose oder Mischungen derselben beinhalten. Sucrose ist am meisten bevorzugt. Zuckeralkohol wird als ein C&sub4;-C&sub8;-Kohlenwasserstoff mit -OH-Gruppen definiert und beinhaltet Galactitol, Inositol, Mannitol, Xylitol, Sorbitol, Glycerol sowie Arabitol. Mannitol ist am meisten bevorzugt. Diese Zucker oder Zuckeralkohole, die vorstehend erwähnt sind, können individuell oder in einer Kombination verwendet werden. Es gibt keine festgelegte Grenze für die zu verwendende Menge, solange der Zucker oder der Zuckeralkohol in der wässrigen Zubereitung löslich ist. Vorzugsweise liegt die Zucker- oder Zuckeralkohol-Konzentration zwischen 1,0% (Gew./Vol.) und 7,0% (Gew./Vol.), stärker bevorzugt zwischen 2,0 und 6,0% (Gew./Vol.). Bevorzugte Aminosäuren beinhalten linksdrehende (L-) Formen von Carnitin, Arginin sowie Betain; jedoch können andere Aminosäuren hinzugefügt werden. Bevorzugte Polymere beinhalten Polyvinylpyrrolidon (PVP) mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht zwischen 2000 und 3000 oder Polyethylenglykol (PEG) mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht zwischen 3000 und 5000. Es ist auch bevorzugt, einen Puffer bei der Zusammensetzung zu verwenden, um Änderungen im pH-Wert in der Lösung vor dem Lyophilisieren oder nach der Rekonstitution zu minimieren. Meist kann ein physiologischer Puffer verwendet werden, jedoch sind Citrat-, Phosphat-, Succinat- sowie Glutamat-Puffer oder Mischungen derselben bevorzugt. Am stärksten bevorzugt ist ein Citrat-Puffer. Des Weiteren sollte die Verwendung von Sulfaten bei der Herstellung der Formulierung vermieden werden. Vorzugsweise liegt die Konzentration bei 0,01 bis 0,3 molar. Oberflächenaktive Mittel können der Formulierung, wie in EP-Veröffentlichungs-Nr. 270,799 und 268,110 gezeigt, hinzugefügt werden.
Zusätzlich kann der LACI, der mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellt wurde, chemisch durch kovalente Konjugation an ein Polymer modifiziert werden, um seine beispielsweise Zirkulationshalbwertslebensdauer zu erhöhen. Bevorzugte Polymere und Verfahren, diese an Peptide anzuhaften zu lassen, sind in den US-Patenten 4,766,106, 4,179,337; 4,495,285 und 4,609,546 gezeigt, welche alle durch diese Bezugnahme in ihrer Gesamtheit in diese Anmeldung inkorporiert sind. Bevorzugte Polymere sind polyoxyethylierte Polyole und Polyethylenglykol (PEG). PEG ist in Wasser bei Raumtemperatur löslich und hat die allgemeine Formel: R(O-CH&sub2;-CH&sub2;)nO-R, wobei es sich bei R um Wasserstoff oder eine Schutzgruppe, wie etwa eine Alkyl- oder Alkanolgruppe handeln kann. Vorzugsweise weist die Schutzgruppe zwischen 1 und 8 Kohlenstoffatomen auf, stärker bevorzugt handelt es sich dabei um Methyl. Das Symbol n ist eine positive ganze Zahl, vorzugsweise zwischen 1 und 1000, stärker bevorzugt zwischen 2 und 500. Das PEG hat ein bevorzugtes mittleres Molekulargewicht zwischen 1000 und 40000, stärker bevorzugt zwischen 2000 und 20000, am stärksten bevorzugt zwischen 3000 und 12 000. Vorzugsweise hat das PEG wenigstens eine Hydroxylgruppe, stärker bevorzugt handelt es sich dabei um eine terminale Hydroxylgruppe. Es ist diese Hydroxyl-Gruppe, die vorzugsweise aktiviert wird, um mit einer freien Aminogruppe am Inhibitor zu reagieren. Jedoch versteht es sich von selbst, dass der Typ und die Menge an reaktiver Gruppe variiert werden kann um ein kovalent konjugiertes PEG/LACI zu erhalten.
Wasserlösliche polyoxyethylierte Polyole sind auch bei der Erfindung nützlich. Diese beinhalten polyoxyethyliertes Sorbitol, polyoxyethylierte Glucose, polyoxyethyliertes Glycerol (POG) und so weiter. POG wird bevorzugt. Ein Grund dafür liegt darin, dass die Hauptkette von Glycerol des polyoxyethylierten Glycerols dasselbe ist wie es natürlich in beispielsweise Tieren und Menschen in Form von Mono-, Di- und Triglyceriden vorkommt. Deshalb wird man diese Verzweigung nicht notwendigerweise als ein fremdes Agens im Körper betrachten können. Das POG hat ein bevorzugtes Molekulargewicht in demselben Bereich wie PEG. Die Struktur von POG ist in Knauf et al., 1988, T. Bio. Chem. 263: 15064 bis 15070 nachgewiesen und eine Diskussion von POG/Proteinkonjugaten wird man im US-Patent 4,766,106 wiederfinden, von denen beide hier durch die Bezugnahme in ihrer Gesamtheit inkorporiert seien.
Nachdem die flüssige pharmazeutische Zusammensetzung hergestellt ist, wird sie vorzugsweise lyophilisiert um einen Abbau zu verhindern und die Sterilität zu bewahren. Verfahren zum Lyophilisieren von flüssigen Zusammensetzungen sind dem Fachmann bekannt. Gerade vor der Verwendung kann die Zusammensetzung mit einem sterilen Verdünnungsmittel (Ringer-Lösung, destilliertes Wasser oder sterile Salzlösung beispielsweise) rekonstitutiert werden, was zusätzliche Bestandteile einschließen kann. Nach der Rekonstitution wird die Zusammensetzung vorzugsweise Subjekten verabreicht, wobei diejenigen Methoden beziehungsweise Verfahren verwendet werden, die dem Fachpublikum bekannt sind.

Verabreichung an betroffene Individuen

Mittels des erfindungsgemäßen Verfahren hergestellter LACI ist nützlich um Säugetiere zu behandeln, die eine Sepsis oder einen septischen Schock haben. Ganz generell sind diese Krankheitsbilder durch hohes Fieber (> 38,5ºC) oder Hypothermie (> 35,5ºC), niedrigen Blutdruck, Kurzatmigkeit (> 20 Atemzüge/Minute), Tachykardie (> 100 Schläge/Minute), Leukocytose (> 15000 Zellen/mm³) und Blutplättchenmangel (< 100000 Blutplättchen/mm³) charakterisiert. Der LACI, der mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellt ist, wird vorzugsweise verabreicht, sobald man von dem Subjekt vermutet, dass es septisch ist, was einem Abfall im Fibrinogen um über 20% entspricht, oder dem Auftreten von Fibrin-Spaltprodukten sowie einem Anstieg in der Temperatur des Individuums und der Diagnose von Leukopenie und zu niedrigem Blutdruck, assoziiert mit dem septischen Schock, gleichkommt. Wie bereits vorstehend erwähnt, wird die intravenöse Verabreichung bevorzugt. Generell wird der LACI, der mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellt ist, in einer Dosis zwischen 1 ug/kg und 20 mg/kg, stärker bevorzugt zwischen 20 ug/kg und 10 mg/kg, am stärksten bevorzugt zwischen 1 und 7 mg/kg gegeben. Vorzugsweise wird die Dosis als ein Bolus gegeben, um den zirkulierenden Spiegel um das 10- bis 20-fache zu erhöhen, und zwar für 4 bis 6 Stunden nach der Bolus- Dosis. Kontinuierliche Infusion kann auch nach der Bolus-Dosis verwendet werden. Falls dem so ist, kann das LACI in einer Dosis zwischen 5 und 20 ug/kg/Minute infundiert werden, stärker bevorzugt zwischen 7 und 15 ug/kg/Minute.
Der LACI, der mittels der erfindungsgemäßen Methode hergestellt ist, kann in Kombination mit anderen Agenzien gegeben werden, die darin effektiv sind, septischen Schock zu behandeln. Beispielsweise können die Folgenden in Kombination mit dem LACI, wie er mittels der erfindungsgemäßen Methode hergestellt ist, verabreicht werden: Antibiotika, die die zugrundeliegende bakterielle Infektion behandeln, monoklonale Antikörper, die gegen Bestandteile der bakteriellen Zellwand gerichtet sind, monoklonale Antikörper und lösliche Rezeptoren, die mit Cytokinen einen Komplex bilden, wobei die Letzteren mit dem Stoffwechselweg für Sepsis involviert sind, was etwa den Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) einschließt, aber nicht darauf begrenzt, Interleukin-1, γ-Interferon und Interleukin-8. Ganz allgemein kann es sich dabei um ein beliebiges Agens oder Protein handeln, das mit Cytokinen oder Komplement-Proteinen in dem Sepsis-Stoffwechselweg wechselwirkt, um deren Wirkungen zu reduzieren und den septischen Schock abzuschwächen.
Antibiotika, die gemäß der Erfindung nützlich sind, beinhalten jene aus den generellen Kategorien: beta-Lactamringen (Penicillin), Aminozucker in glykosidischer Bindung (Aminoglykoside), makrocyclische Lactonringe (Macrolide), polycyclische Derivate von Napthacencarboxamid (Tetracycline), Nitrobenzolderivate von Dichloressigsäure, Peptide (Bacitracin, Gramicidin und Polymyxin), große Ringsysteme mit einem konjugierten Doppelbindungssystem (Polyene), Sulfomedikamente, die von Sulfanilarnid abgeleitet sind (Sulfonamide), 5-Nitro- 2-furanylgruppen (Nitrofurane), Chinolincarbonsäuren (Nalidixinsäure) und viele andere. Andere Antibiotika und mehrere Versionen der vorstehenden spezifischen Antibiotika können in der Encyclopedia of Chemical Technology, 3. Auflage, Kirk-Othmer (Hrsgg.), Bd. 2, Seiten 782 bis 1036 (1978) und Bd. 3, Seiten 1 bis 78, Zinsser, Microbiology, 17. Auflage, Edition W. Joklik et al. (Hrsgg.), Seiten 235 bis 277 (1980) oder Dorland's Illustrated Medical Dictionary, 27. Auflage, W. B. Saunders Company (1988) gefunden werden.
Andere Agenzien, die mit den LACI, wie er mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellt wurde, kombiniert werden können, beinhalten monoklonale Antikörper, die gegen im Stoffwechselweg der Sepsis involvierte Cytokine gerichtet sind, wie etwa diejenigen monoklonalen Antikörper, die gegen IL-6 oder M-CSF gerichtet sind, wie in PCT/US90/07411 gezeigt wird; monoklonale Antikörper gegen TNF, wie in US-Patent Nr. 4,603,106 gezeigt wird; Inhibitoren von Proteinen, die die reife Form des TNF-Prohormons der Zelle, in der es hergestellt wurde, spalten, wie etwa in PCT US90/03266 und PCT/US93/06120 gezeigt wird; Antagonisten von IL-1, wie etwa in PCT/US91/02460 gezeigt wird; Inhibitoren der Cytokin IL-6- Wirkung, wie etwa Activin, wie in PCT US90/00321 gezeigt wird; und Inhibitoren verschiedener Cytokinen wie etwa IL-1, die auf der Grundlage von Rezeptoren basieren. Antikörper gegen oder Kleinmolekül-Inhibitoren von Komplementproteinen können ebenfalls verwendet werden.
Generell kann der mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellte LACI für solche Krankheiten nützlich sein, die während der aufwärts gerichteten Regulation des Gewebsfaktors vorkommen, was bei Verletzung, Trauma, Endotoxin, TNF, Krebs, IL-1 oder anderen Agenzien oder Bedingungen eingreift.
Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die nachfolgenden Beispiele verdeutlicht, welche besonders bevorzugte Ausführungsformen betreffen. Jedoch sollte man festhalten, dass diese Ausführungsformen lediglich illustrierend sind und nicht so ausgelegt werden sollten, dass sie die Erfindung in irgendeiner Weise beschränken.

BEISPIELE

Beispiel 1

Der sogenannte "Shuttle"-Vektor pBS24 ist in Barr et al., EXPRESSION SYSTEMS & PROCESSES FOR rDNA PRODUCTS (American Chemical Society, 1991), S. 51 bis 64 beschrieben. pBS24Ub ist ein Derivat von pBS24.1 und enthält eine Expressionskassette, die von einzelnen Bam HI- und Sal I-Restriktionsschnittstellen flankiert wird, den durch Glucose regulierbaren ADH2/GAP-Promotor und ein synthetisches Ubiquitin-Gen (UB-Gen). Zur Konstruktion von Ub-Fusionen wird eine einzige SstII-Schnittstelle in dem 3'-Ende des Ub-Gens erzeugt. Das Vorliegen der SstII-Schnittstelle erlaubt die rastergemäße Insertion von Nukleotidsequenzen für die Expression von Ubiquitin-Fusionspeptiden. Das Einfügen beziehungsweise die Insertion kann durch Verwendung von synthetischen DNA-Adaptern oder mittels des PCR- Verfahrens vervollständigt werden. In jedem Falle wird die Sequenz an der 5'-Verbindung die folgende sein:
und die 3'-Klonierungsstelle (Sal I) sollte sich so nahe wie möglich an dem 3'-Ende des Terminationscodons befinden.
PCR wurde verwendet um die Ubiquitin/TFPI-Genfusion in dem 15,4 kb-Plasmid pLACI 4.1, in Fig. 3 gezeigt, zu konstruieren. Die Nukleinsäure, die für TFPI codiert, wurde unter Verwendung von Standard-PCR-Arbeitsvorgehensweisen mit den Primern LACI4 und LACI3 amplifiziert. LACI4 hybridisiert mit den 10 Nukleotiden am 5'-Ende der Nukleinsäure, die für reifen TFPI codiert, und enthält auch die Ubiquitin-Sequenz mit der SstII-Restriktionsschnittstelle. LACI3 hybridisiert mit den 15 Nukleotiden am 3'-Ende der Nukleinsäure, die für den reifen TFPI codiert, und auch die Trailersequenz mit der Sal I- Restriktionsstelle. Die Sequenzen dieser Primer sind wie folgt:
Nach der Amplifikation wurde das PCR-Produkt mit Sal I und SstII unter Bedingungen verdaut, die durch die Hersteller dieser Enzyme spezifiziert sind. Das verdaute PCR-Produkt wird dann in pBS24Ub, wie vorstehend beschrieben, kloniert, um pLACI 4.1 herzustellen
pLACI 4.1 wurde dazu verwendet, drei Stämme von Saccharomyces cerevisiae zu transformieren: VH6 (MAT α, cirº, leu-2-112,-3, ura3, FoA, pep4::His3), AB122 (MAT α, cirº, leu2, ura3-52, prb1-1112, pep4-3, prc1-407) und JSC310 (als AB122, + ADR1-Überexpression).
Transformanten von VH6 produzierten TFPI in einem Umfang von ungefähr 5% des Gesamtproteins, Transformanten von AB 122 produzierten TFPI in einem Umfang von ungefähr 10% des Gesamtproteins und Transformanten von JSC310 produzierten TFPI in einem Umfang von ungefähr 15% des Gesamtproteins. Die Stabilität von TFPI ist in einem gewissen Sinne überraschend, wenn man sich die früheren Studien vergegenwärtigt, die zeigten, dass Proteine, welche als Ubiquitin-Fusionen synthetisiert wurden und am N-terminalen Ende Aspartat nach dem Entfernen des Ubiquitins aufweisen, in Hefezellen unstabil sind (beispielsweise Halbwertslebensdauer < 3 min). Vergleiche Finley, "The Yeast Ubiquitin System" in: The Molecular and Cellular Biology of the Yeast Saccharomyces: Gene Expression (1992).

Beispiel 2

Teil A

TFPI wurde aus S. cerevisiae VH6-Zellen gemäß der in US-Patent Nr. 5,212,091 offenbarten Methode, die hier durch Bezugnahme inkorporiert wird, gereinigt, präziser gesagt auf Säulen 9-10. Eine unlösliche Fraktion (hier auch als Membranfraktion bezeichnet) wurde mittels Dyno-Mill-Glasperlen-Extraktion in TEN (50 mM Tris·HCl pH 7,8; 50 mM NaCl; 5 mM EDTA) hergestellt. Ungefähr 3 ug an Gesamtprotein dieser Fraktion wurde auf einem 14%-igen SDS-PAGE-Gel laufen gelassen und auf Nitrocellulosemembranen übertragen. Die Nitrocellulose-Blots wurden mit einer Sonde behandelt, die polyklonales Kaninchen-Antiserum gegen die ersten fünfzehn Aminosäuren der Peptidsequenz von reifem TFPI enthielt. Der erhaltene Blot (Fig. 5) zeigt ein signifikantes Band mit homogenem Gesamtlängen-TFPI. Die Expression von TFPI in der unlöslichen Fraktion wurde auch unter Verwendung eines mit Coomassie-Brillantblau gefärbten 14%-igen-SDS-PAGE-Vergleichsgels (vgl. Fig. 4) bestätigt. Hefezellen wurden mit einer ein Plasmid enthaltenden DNA, die für das TFPI-Protein codiert oder aber mit dem identischen Plasmid, jedoch ohne die DNA, die für das TFPI-Protein codiert, wachsen gelassen. Ungefähr 10 ug an Gesamtzelllysat von Hefe oder der unlöslichen Fraktion aus den beiden Kulturen wurden auf das Gel gepackt. Eine einzige 36 kD-Bande wurde lediglich bei den Bahnen entdeckt, die von Kulturen, die das TFPI-produzierende Plasmid trugen, hergestellt waren.
Sulfonierung und Q-Sepharose®-Fraktionierung wurden, wie in der US-Patentschrift 5,212,091 spezifiziert, durchgeführt. Die Rückfaltung des isolierten TFPI wurde ebenfalls im Wesentlichen so durchgeführt wie beschrieben, außer dass die Dialyse in 5 M Harnstoff, 0,3 M NaCl, 20 mM Tris·HCl pH 7,8, 0,04%-ig NP40, 2 mM L-Cystein, 0,5 mM EDTA über eine Zeitdauer von 4 bis 6 Stunden hinweg bei Raumtemperatur und dann über Nacht bei 4ºC durchgeführt wurde, wonach die Dialysebeutel in 2 M Harnstoff, 1 mM L-Cystein für eine Dauer von 48 Stunden bei 4ºC übertragen wurden. Für die Fraktionierung mittels S-Sepharose® wurde das rückgefaltete TFPI in 2 M Harnstoff, 50 mM NaPO&sub4;, 0,1 M NaCl vor der Beladung auf die Säule äquilibriert. Der Waschpuffer enthielt 2 M Harnstoff, 50 mM NaPO&sub4;, 0,25 M NaCl und der TFPI wurde schrittweise mit einem Puffer, der 2 M Harnstoff, 50 mM NaPO&sub4;, 0,8 M NaCl enthielt, eluiert. Die Fraktionen, die TFPI enthielten, wurden zusammengegeben und bei 4ºC über Nacht gegen PBS/1,5 M Harnstoff dialysiert.
N-terminales Sequenzieren des Produkts, das mittels dieses Verfahrens gewonnen wurde, ergab die folgende korrekte Sequenz:
Asp Ser Glu Glu Asp Glu Glu His Thr Ile Ile Thr Asp Thr Glu Leu Pro Pro [SEQ ID NO: 7]
was dem authentischen reifen TFPI mit einer Reinheit von > 90% entsprach.
Das gewonnene Produkt wurde auch in dem Faktor Xa-amidolytischen Test und mittels Tests auf die Prothrombin-Gerinnungszeit (beide beschrieben in Wun et al., J. Biol. Chem. 265: 16096 (1990)) getestet, um die Aktivität festzustellen. Die Daten dieser Untersuchungen sind in den Fig. 1A beziehungsweise 1B gezeigt. PBS-Puffer wurde als Vergleichskontrolle in dem Faktor Xa-Inhibitionsstest und PBS-Puffer wie auch normales menschliches Serum (NHS) wurden als Kontrolle in dem Prothrombin-Gerinnungsassay verwendet. Der von der Hefe produzierte TFPI inhibierte die Faktor Xa-Aktivität mit einer 50%-Inhibierungs-Konzentration von ungefähr 20 ng/ml und zeigte eine inhibierende Konzentration in dem Prothrombin- Gerinnungstest von 1 ug/ml. Diese Ergebnisse zeigen an, dass das gemäß der erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte TFPI biologisch aktiv ist.

Beispiel 3

Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch dazu verwendet werden, TFPI in großem Maßstab, das heißt in einem Ansatz-Volumen von 10 Litern oder größer, zu produzieren. Der Hefestamm AB122 wurde mit pLACI 4.1 transformiert und in einem Selektionsmedium, das Hefe-Stickstoffbase ohne Aminosäuren (Difco) enthielt, supplementiert mit 87 mg/l L-Adenin, 43,5 mg/l L-Tryptophan, 43,5 mg/l L-Histidin, 43,5 mg/l L-Arginin, 43,5 mg/l L-Methionin, 65,2 mg/l L-Tyrosin, 109 mg/l L-Phenylalanin, 65,2 mg/l L-Lysin und 8% Glucose wachsen gelassen. Aliquots der transformierten Zellen wurden konserviert, indem Glycerol auf 15% hinzugegeben und bei -70ºC gelagert wurde. S. cerevisiae-Stamm AB 122, transformiert mit pLACI4.1 wurde bei der ATCC am 19. Juli 1994 hinterlegt und erhielt die Zugangsnummer 74291.
Inokulum für den 10 Liter-Fermentator wurde durch Zugabe von 1 Vol.-% gefrorener, transformierter Kultur zu frischem Selektionsmedium, wie es in den vorstehenden Absätzen beschrieben ist, hergestellt. Man ließ das Inokulum dann in Schüttelflaschen für eine Zeitdauer von 24 bis 48 Stunden wachsen. Zu dem Inhalt eines 10 Liter-Fermentators wurde das Inokulum dann in eine Menge von 0,5 Vol.-% gegeben. Die Medien in dem Behälter enthielten die folgenden Bestandteile vor der Sterilisierung:
Taston 154 Hefeextrakt: 10 g/l
Casein-Pepton: 20 g/l
Antischaummittel: 0,3 ml/l
Citronensäure: 4 mM
KH&sub2;PO&sub4;: 20 mM
(NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;: 50 mM
MnSO&sub4;: 20 uM
ZnSO&sub4;: 20 uM
H&sub3;BO&sub3;: 100 uM
CoCl&sub2;: 10 uM
Na&sub2;MoO&sub4;: 10 uM
CuSO&sub4;: 2 uM
Glycerol: 30 g/l
Der Inhalt des Fermentationsbehälters wurde dann in situ sterilisiert und es wurden die folgenden sterilen Bestandteile hinzugegeben, um das Medium zu komplettieren:
MgSO&sub4;: 20 mM
FeCl&sub3;: 100 uM
Glucose: 20 g/l
Pyroxidin·HCl: 5 mg/l
Thiamin·HCl: 10 mg/l
D-Biotin: 0,1 mg/l
Ca-Pantothenat: 10 mg/l
Myo-Inositol: 400 mg/l
Während des Wachstums der Zellen in dem Fermentator wurde das Medium bei einer Temperatur von 30ºC gehalten. Der pH betrug 6,0 und wurde durch die Zugabe von NaOH oder Phosphorsäure beibehalten. Man begann das Rühren mit 600 Upm und erhöhte es bei Bedarf um den Wert für D.O > 30% zu halten. Die Belüftung betrug 1 vvm Luft. Beginnend mit 15 h nach der Inokulierung wurde eine Mischung von steriler Glucose (25 Gew.-Vol.-%) und Glycerol (6,8 Gew.-Vol.-%) dem Fermentator in einer Rate von 0,1 ml/min/l hinzugegeben. Nach 39 Stunden wurde die Rate der Zugabe zu der Mischung auf 0,05 ml/min/l abgesenkt. Die Kultur wurde nach 96 Stunden beendigt. Der Spitzenwert der Expression von TFPI (1 mg/ml) stellte sich 72 h nach der Inokulierung ein.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER: Innis, Michael Creasey, Abla
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Herstellung von Gewebsfaktor-Stoffwechselinhibitor
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 7
(iv) KORRESPONDENZ-ADRESSE:
(A) ADRESSAT: Chiron Corporation
(B) STRAßE: 4560 Horton St.
(C) ORT: Emeryville
(D) BUNDESLAND: CA
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL: 94608
(v) COMPUTERLESBARE FASSUNG
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.30B
(vi) DATEN DER JETZIGEN ANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER: US
(B) ANMELDETAG: 5. August 1994
(C) KLASSIFIKATION:
(viii) ANGABEN ZUM ANWALT/VERTRETER:
(A) NAME: Savereide, Paul B.
(B) REGISTRIERUNGSNUMMER: 36,914
(C) REFERENZ/GERICHTS-NUMMER: 0991.001
(ix) TELEKOMMUNIKATIONSANGABEN:
(A) TELEFON: 510-601-2585
(B) TELEFAX: 510-655-3542
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 1065 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: andere Nucleinsäure
(iii) HYPOTHETISCH: Nein
(iv) ANTI-SENSE: Nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1..1056 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 352 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 276 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 9 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: andere Nucleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "Primer"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 23 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: andere Nucleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "Primer" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 24 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: andere Nucleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "Primer" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 18 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines Faktor VIIa/TF/Xa- bindenden Proteins, umfassend:

a) Inkubieren von Hefezellen, die mit einem replizierbaren Klonierungsvehikel transformiert sind, wobei das replizierbare Klonierungsvehikel eine erste Nukleotidsequenz umfasst, die für das Faktor VIIa/TF/Xa-bindende Protein codiert, unter Bedingungen, die zur Herstellung des Faktor VIIa/TF/Xa- bindenden Proteins günstig sind, wobei das Faktor VIIa/TF/Xa- bindende Protein in der Hefezelle retiniert wird;

b) Herstellung einer unlöslichen Fraktion der transformierten Hefezellen, die das Faktor VIIa/TF/Xa-bindende Protein enthalten; und

c) Isolieren des Faktor VIIa/TF/Xa-bindenden Proteins aus der unlöslichen Fraktion.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der DNA, die für das Faktor VIIa/TF/Xa-bindende Protein codiert, im. Raster unmittelbar einer zweiten Nukleotidsequenz vorausgeht, wobei die erste und die zweite Nukleotidsequenz zusammen für ein Fusionspeptid codieren, dieses Fusionspeptid fähig ist, in den Hefezellen unter Produktion des echten Faktor VIIa/TF/Xa- bindenden Proteins gespalten zu werden.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die zweite Nukleotidsequenz für Ubiquitin codiert.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das replizierbare Klonierungsvehikel SEQ ID NO: 1 umfasst.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Hefezellen zu der Gattung Saccharomyces gehören.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Hefezellen zu der Species Saccharomyces cerevisiae gehören und einen Genotyp haben, der aus der Gruppe bestehend aus VH6, AB 122 und JSC310 ausgewählt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Faktor VIIa/TF/Xa- bindende Protein TFPI ist.

8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Faktor VIIa/TF/Xa- bindende Protein TFPI-2 ist.

9. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Faktor VIIa/TF/Xa- bindende Protein ein mutiertes Protein von TFPI ist, das Arginin in der P1-reaktiven Stelle der Domäne 1 des Kunitz-Typs hat.

10. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, das außerdem Herstellen eines Konstrukts durch kovalente Konjugation des isolierten bindenden Proteins an ein Polymer umfasst, um so die Zirkulationshalbwertszeit des bindenden Proteins zu erhöhen.

11. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, das außerdem Formulieren des isolierten bindenden Proteins oder des Konstrukts in einer Weise, die zur Behandlung oder Prävention von septischem Schock geeignet ist, umfasst.

12. Unlösliche Fraktion von transformierten Hefezellen, wie sie in Abschnitt (b) von Anspruch 1 definiert ist, die ein Faktor VIIa/TF/Xa-bindendes Protein enthält.

13. Unlösliche Fraktion nach Anspruch 12, wobei das Faktor VIIa/TF/Xa-bindende Protein TFPI ist.

14. Unlösliche Fraktion nach Anspruch 112, wobei das Faktor VIIa/TF/Xa-bindende Protein TFPI-2 ist.

15. Unlösliche Fraktion nach Anspruch 12, wobei das Faktor VIIa/TF/Xa-bindende Protein ein mutiertes Protein von TFPI ist, das Arginin in der P1-reaktiven Stelle der Domäne 1 des Kunitz-Typs hat.