JP2580141B2 - 形質転換された酵母及びヒルジンの製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒルジンの製造方法に関するものである。
医用ヒル（Hirudo medicinalis）の唾液腺中に存在す
る抗凝血活性の原因物質は、ヒルジンとして知られる小
型ポリペプチドである（１）。この極めて特異的な、極
めて有効なトロンビン阻害剤は、極めて有用な治療剤を
提供する可能性があるため、最近では、広く研究されて
いる。しかしながら、それの単離及び精製が極めて困難
であり、費用がかさむため、あまり広く用いられるに至
つておらず、更には、臨床の立場から研究する可能性さ
え排除されてきた。

組換えDNA技法を用いて遺伝子をクローニングし、発
現させてヒルジンを製造することの可能なことは、既
に、ヒルジンをコードする天然のヒル遺伝子の微生物E.
coliでのクローニング及び発現（1984年３月27日出願
の本出願人名義のフランス特許出願第84/04,755号）に
より証明されている。E. coli中で生物学的活性をもつ
ペプチドを産生させることは可能となつていても、他の
タイプの微生物中でヒルジンを産生させることは極めて
重要である。実際、ヒルジンを臨床的に使用するには、
製品が極めて高い純度をもつことが要求され、発熱性汚
染物の除去が、大腸菌抽出物からのヒルジンの精製に当
つての問題となりうる。

さらに、E. coliにより合成されたヒルジンは、細胞
内に残り、従って極めて多数のE. coliペプチドから分
離、精製しなければならない。こうした理由で、ヒトに
対し発熱性又は毒性を示す物質を生産せず、かつ培地中
へ蛋白質を分泌できる酵母内で、ヒルジン遺伝子を発現
させることは有用である。

抗凝血剤としてのヒルジンの作用機構は、解明されは
じめたばかりである。ヒルジンが結合する基質は、トロ
ンビンであり、このトロンビンは、酵母前駆体（チモー
ゲン）であるプロトロンビンから活性化（活性化された
第Ｘ因子による）されると、循環血中のフイブリノーゲ
ンを切断して、これを血液凝塊（クロツト）の形成に必
要なフイブリンに変換する蛋白質分解酵母である。1:1
トロンビン−ヒルジン複合体の解離定数（0.8×10^-10）
は、これらの分子間の会合が極めて強いことを示してい
る（２）。実際上、これら２分子間の非共有結合による
複合体は、生体内で解離不可能と考えうる。

ヒルジンは、非常に特異的なトロンビン阻害物質で、
天然の基質であるフイブリノーゲンよりもずつと高い親
和性をもつ。しかも、他の凝固因子又は他の血漿成分が
存在することは必要でない。ヒルジンの抗トロンビン作
用が特異的でかつ極めて強力であるため、これを抗凝血
剤として臨床的に使用できることは明かである。

ヒルジンは、その抗凝血性のため、動物ではかなりの
程度まで研究されている。最も詳細な研究（３）は、ラ
ツトでの静脈血栓症、血管閉塞及び播種性血管内凝固
（DIC）の予防におけるヒルジンの作用を記述してい
る。ヒルジンは、極めて精製された形で静脈内投与され
たときには、ラツト、イヌ、ウサギ及びマウスによく忍
容される。マウスでのLD₅₀は、体重1kg当り50万単位
（即ち60mg/kg）以上である。他の研究（４）は、静脈
内投与、皮下投与とも、マウスは1g/kgまでの用量に耐
え、ウサギは10mg/kgまで忍容することを示している。
マウスでは、２週間の反復注射では感作反応に至らな
い。

また、実験動物では、ヒルジンは、腎を介して、未だ
活性のある形で速やかに排泄される（半減期は１時間の
オーダーである）（３）。

別の２つの研究、一つはイヌを用いたもの（５）、他
はラツトでのDICの予防におけるヒルジンの活性を示し
たもの（６）は、マルクヴアルト（Markwardt）らの正
の結果と一致している。これらの研究者は、ヒトの止血
系に対する天然ヒルジンの作用の初めての生体内解析を
最近発表している（７）。何らの毒性副作用の微候もな
く、期待通りの生物学的効果を被験者は示した。

ヒルジンがブタでの内毒素誘発DICを防止し（８）、
かくしてブタで高い致死率をもたらす内毒素血症が惹起
する極めて重大な問題を解決しうるものとなることを証
明することもできた。

ごく最近の一つの発表（７）は、ヒトへのヒルジンの
静脈内投与及び皮下投与を記述している。６名の志願者
を用いて、ヒルジンの１回投与（1000AT−U/kg）の薬物
動態と止血系への影響が評価された。静脈内投与時、ヒ
ルジンの半減期は50分であり、注射から24時間のうちに
ヒルジンの50％が活性な形で尿中に表われる。血漿中ヒ
ルジン濃度に応じて凝固時間（インヴイトロでトロンビ
ン、トロンボプラスチン及びプロトロンビンについて測
定）の延長が観察され、これは、ヒルジン分子が被験者
の循環血中で生物学的活性を保持していることを示す。
血小板数、フイブリノーゲン濃度あるいはフイブリン分
解系について変化は認められない。静脈内注射の場合と
同様に、ヒルジンの皮下投与もよく忍容され、何らの副
作用も起こさない。アレルギー反応発現の可能性を試験
するため、同じ被験者らに４週間の間隔をおいて２回の
皮内注射が行なわれたが、感作の微候は認められなかつ
た。さらに血清中に抗ヒルジン抗体も検出されなかつ
た。

これらの研究者は、ヒルジンが抗凝血剤として有用な
臨床薬剤となりうることを示唆している。ヒルジンの作
用の特異性が高いため、血液凝固の前段階は影響されな
い。その抗トロンビン活性は、用量依存性であり、ヒル
ジンの作用は、その速かな腎排泄の結果、速かな可逆性
を示す。DICには抗トロンビンIII（ヘパリンの作用に必
要な補足因子）の減少と非常に有効な抗ヘパリン剤であ
る血小板因子４の放出とが伴うという事実からみて予測
できた通り、ヒルジンはDICの処置についてはヘパリン
よりずつと優れていることが証明されている（3,6）。

一つの研究は、ヒトの皮膚によるヒルジン吸収の可能
性を証明している（９）。もつとも、得られた結果には
若干理解しがたいところもある。

細胞を含まない粗製ヒル抽出物の市販製剤が、軟膏と
して入手可能である（フランスのニコラス社のヒルクレ
ーム、西ドイツのプラントルガン ヴエルケ社のエクス
ヒルドーブルートゲル）。しかし、これが有利な投与経
路であるかどうかを確かめるためには、高度に精製され
た材料をより高用量でさらに試験することが必要であ
る。一般的にいつて、好ましい投与経路は、静脈内、筋
肉内及び経皮経路である。他のヒルジン投与経路、特に
経口も報告されている［BSM（フランス医薬特許）3792
M］。

他の成分と組合わせる時、この製品は、西ドイツ特許
出願公開2101393号に記載されているように、乾癬及び
同じタイプの他の皮膚障害の処置にも使用できる。

さらに、ヒルジンは、臨床検査室試験における抗凝固
剤として、また研究のツールとして利用することができ
る。この場合、血液凝固の一つの段階のみに対する高い
特異性のため、作用特異性のずつと低い、最も多用され
ている凝固剤に比してかなり有利となりうる。

また、ヒルジンは、体外循環系及び透析系での抗凝固
剤としても、極めて有用でありうる。これらの系では、
特にそれら人工循環系の表面に活性な形で固定されたな
らば、他の抗凝固剤よりもかなり有用となりうる。

しかも、ヒルジンのトロンビンへの結合活性は、第VI
II因子などの凝固因子をその精製時に間接的に保護する
ことを可能にしうる。

最後に、標識ヒルジンの使用は、トロンビン及びプロ
トロンビンの濃度を測定するための簡単で有効な方法と
なりうる。特に、標識ヒルジンは、クロツト形成過程で
クロツトを可視化する目的で使用できる。何故ならば、
凝固現象は、形成部位での循環血中プロトロンビンのト
ロンビンの転化を包含し、標識ヒルジンは、トロンビン
に結合され、可視化されうるからである。

また、形質転換酵母をヒルジン放出薬として、例えば
ヒルジンを皮膚上に分泌する該酵母を含有するクリーム
を塗付することにより、直接作用することも考えられ
る。

要約すると、本発明のヒルジンには、下記に例示する
可能性ある用途が数多くある。： １）現にある血栓の拡大の阻止及び予防のための、臨床
的血栓症状態での抗凝固剤として； ２）顕微鏡外科手術後の血腫及び腫脹を減じるための抗
凝固剤として（この状況下では、現在生きたヒルがかな
り用いられている）； ３）体外循環系での抗凝固剤として、また合成生体材料
被覆のための抗凝固剤として； ４）検査室実験での血液サンプルの臨床検査に際しての
抗凝固剤として； ５）凝固に関する臨床研究に際しての抗凝固剤として、
また実験ツールとして； ６）痔、静脈瘤及び浮腫の処置における皮膚適用の可能
性ある局所用薬剤として； ７）乾癬症及び関連疾患の処置における一成分として； ８）最後に、ヒルジンは、血液の保存中及び血液由来物
の（血小板、第VIII因子、第IX因子）調製中のトロンビ
ン結合用に利用できる。

目安として、ヒルジンは治療用組成物中で100〜50000
抗トロンビンU/kg/日に相当する濃度で使用することが
できる。

ヒルジンは水溶性であるので、薬理学上許容される担
体及び賦形剤を用いて注射用又はその他の経路で適用可
能な医薬組成物を得るのは容易である。

最後に、インヴイトロ検定或いはインヴイヴオイメー
ジングのために、特にクロツト形成の可視化のために、
既知の手段により放射性標識又は任意のタイプの酵素又
は蛍光性標識で標識化したヒルジンを使用することがで
きる。

全ヒルジン体からのヒルジン製剤が、該当蛋白質のア
ミノ酸配列の決定に使用されている（10、11）。以下の
実験では、絶食ヒルの頭部でメツセンジヤーRNAとして
発現される遺伝子のクローニングがなされた。この遺伝
子は、ヒルの全身中に見出される蛋白質（HV−１として
知られる蛋白質）とはかなり配列の異なる蛋白質（ヒル
ジン変種２、即ちHV−２）に関する情報を担持してい
る。HV−１とHV−２との間にはアミノ酸残基で９ケ所の
相違があり、両者のNH₂末端残基の差（Va1−Va1又はIle
−Thr）により、ヒルジンNH₂末端に関する文献上の一見
しての矛盾を説明できるかもしれない（12）。

第１図は、HV−2mRNAに相当するcDNAのコピーを含有
する組換えプラスミドpTG717のDNA配列を、ｂ）のとこ
ろではそのDNA配列から推論されるアミノ酸配列を、
ｃ）のところではこの配列とHV−１のアミノ酸配列との
差を示している。

このcDNA配列は恐らく不完全であり、成熟型蛋白質の
始端よりも上流にシグナル配列があるのでないかと考え
るのが妥当である。

微生物におけるHV−2cDNAの発現は、相当する蛋白質
が抗トロンビン活性をもつことを示す。

下記の実験は変種HV−２について行なわれたものであ
るが、以下に「ヒルジン」、「ヒルジンをコードする遺
伝子」とは、特に断らない限り、いずれかの変種、即ち
HV−１又はHV−２、また他の可能な変種、及び対応する
配列を表わすものとする。

本発明の主題の一つは、酵母によりヒルジンを調製す
ることである。

酵母は、単細胞真核生物である。サツカロマイセス属
の酵母は、実験室で生化学的、遺伝学的に徹底的に研究
されている株を包含している；それはまた、食品工業
（パン、アルコール性飲料、その他）で用いられてお
り、従つて大量に生産されている株を包含している。

古典的手法により又は遺伝子工学から導かれる手法に
より、さらにはこれら両タイプの手法の組合わせにより
サツカロマイセス・セレヴイシアセ（Saccharomyces ce
revisiae）の細胞を容易に操作できるため、かつこの酵
母種の産業上の歴史が長いため、この種が異種ポリペプ
チド製造のための優れた宿主となる。

それゆえ、本発明は、より詳しくは、酵母における複
製開始点を含むプラスミドに組み込まれるか又は酵母の
染色体に組み込まれた機能性DNAブロックにより形質転
換された酵母であって、前記ブロックが少なくとも −ヒルジン、その変種の一つ又はその前駆体をコードす
るDNA配列（Ｈ遺伝子） −遺伝子産物の分泌を達成するのに必要な要素を含むリ
ーダー配列（Lex） −酵母によるＨ遺伝子の転写のためのシグナルを含むDN
A配列（Str） を含むことを特徴とする酵母を培養培地中で培養し、該
培養培地中に生産されたヒルジンを回収することによる
ヒルジンの製造方法。

プラスミド又は酵母、好ましくはサツカロマイセス属
酵母の染色体に組込まれたとき、この機能性ブロツク
は、該酵母の形質転換後に、ヒルジンを活性型又は活性
化によりヒルジンを再生しうる不活性前駆体型で発現さ
せうる。

サツカロマイセス・セレヴイシアエの価値は、この酵
母が培地中に或る種の蛋白質を分泌できるので、この分
泌をもたらす機構の研究の上で大きな進歩がなされつつ
あることにあり、適切な操作を加えれば、ヒト血清中に
見出だされるものに全ての点で類似の、正確なプロセツ
シングを受けたヒトホルモンをこの酵母に分泌させるこ
とができることが示されている（13、14）。

本発明に関して言えば、この性質を活用して、ヒルジ
ンの分泌を達成しようとするものであり、これには多く
の利点があるからである。

まず第一に、酵母はごく僅かの種類の蛋白質しか分泌
しないが、このため、若しある異種の蛋白質の分泌の誘
導を高度に達成することができれば、総分泌蛋白質で高
い比率を占める或る生成物を培地中に得ること、従つて
求める蛋白質の精製作業を容易にすることが可能となる
という利点がある。

数種の蛋白質またはポリペプチドが酵母により分泌さ
れる。既知の全ての場合に、これらの蛋白質はより長い
前駆体の形で合成され、それらのNH₂末端配列が分泌に
至る代謝過程へ入るのに極めて重要である。

異種蛋白質の配列を伴うこれら前駆体の一つのNH₂末
端配列を含む混成（ハイブリツド）蛋白質の酵母内での
合成が、その異種蛋白質の分泌につながる場合がある。
この異種蛋白質が前駆体の形で、従つて一般には不活性
な形で、合成されるという事実が、求める分子が有する
かもしれない毒性作用から細胞を保護することを可能に
し、活性蛋白質を遊離させるその切断は、該蛋白質を細
胞質から隔離するゴルジ体由来の小胞中で行なわれるだ
けである。

従つて、異種蛋白質を酵母に生産させるために分泌に
至る代謝経路を利用することにはいくつかの利点があ
る： １）培養上澄中で十分に純粋な生成物を回収できる； ２）成熟型蛋白質が有するかもしれない毒性作用から細
胞を保護できる； ３）更に、分泌された蛋白質が修飾（グリコシル化、硫
酸化など）を受けうる場合がある。

このため、本発明の発現ブロツクは、より詳しくは、
次の構造をもつであろう： −−Str−−Lex−−Scl−−Ｈ遺伝子 LexはＨ遺伝子に相当する蛋白質の分泌に必要なリー
ダー配列をコードする;Sclは切断部位をコードするDNA
配列である；また、Scl−Ｈ遺伝子と言う要素は数回繰
返されていてもよい。

分泌系の一例として、アルフアフエロモンのそれを選
んだ。即ち、上記配列において、配列Lexは、酵母のα
性フエロモンをコードする遺伝子に由来するものを選ん
だ。しかし、他の系を利用できる（たとえばキラー蛋白
質の系）（13）。

酵母のα性フエロモンは、性タイプMATαの酵母S. ce
revisiaeによつて培地中へ分泌される13個のアミノ酸か
らなるぺプチドである（第２図において囲んである）。
α因子はG1期に性タイプが反対（MATa）の細胞をとらえ
て、両タイプの細胞の交配に必要な生化学的及び形態学
的変化を誘発する。クリヤン（Kurjan）とヘルスコヴイ
ツ（Herskowitz）（16）は、α因子の構造遺伝子をクロ
ーン化し、この遺伝子の配列から、この13個のアミノ酸
からなるα因子は、165個のアミノ酸からなる前駆体プ
レプロ蛋白質の形で合成されると推論した（第２図）。
この前駆体は、22残基（破線のアンダーライン）からな
る疎水性アミノ末端配列を含み、これに３ケ所のグリコ
シル化部位を包含する61個のアミノ酸からなる配列が続
き、最後にα因子の４コピーが続く。それら４つのコピ
ーは、「スペーサー」配列により隔てられていて、下記
の酵母活性の結果として成熟型蛋白質が前駆体から遊離
される： １）Lys−ArgジペプチドのCOOH側で切断するカテプシン
Ｂ型エンドペプチダーゼ（切断部位を太い矢印で示
す）； ２）切り出されたペプチドのCOOH末端に存在する塩基性
残基を切り取るカルボキシペプチダーゼＢ型エキソペプ
チダーゼ： ３）Glu−Ala及びAsp−Alaの残基を除去するジペプチジ
ルアミノペプチダーゼ（Ａとして知られる）。

この前駆体のヌクオレチド配列は、更に、４ケ所のHi
nd III制限部位（矢印Ｈで示す）を含む。

αフエロモン遺伝子と成熟型ヒルジン配列との融合を
何回か行なつた。MATα型酵母細胞は、これらの融合遺
伝子を発現できる。相当するハイブリツド蛋白質は、つ
ぎに、それらが含有し、αフエロモン前駆体のプレプロ
配列に由来するシグナルの結果としてプロセツシングを
受けることができる。従つて、ヒルジン配列を有するポ
リペプチトが培養上澄み中に回収されるであろうと期待
される。

これらの構成の一つにおいては、Scl配列が、Ｈ遺伝
子に先行する３′末端にATGコドンを含有する；従つ
て、融合蛋白質は、成熟型ヒルジン配列の最初のアミノ
酸のすぐ上流にメチオニンを含有する。臭化シアンで切
断すると、このポリペプチドはヒルジン分子を生じ、こ
れは復元段階で活性とすることができる。

他の構成では、αフエロモン産生のために普通用いら
れる切断シグナルが、培養上澄み中に抗トロンビン活性
をもつポリペプチドを産生するのに役立つ。配列SclがL
ys−Argをコードする２つのコドン、即ち、AAA又はAAG
とAGA又はAGGを３′末端に含む場合がそうである；ポリ
ペプチドは、COOH側のLys−Argジペプチドを切り離すエ
ンドペプチダーゼによつて切断され、ヒルジンを遊離す
る。

本発明はとりわけ、ヒルジン遺伝子に先行する配列が
次のアミノ酸配列のいずれかをコードする構成に関す
る： １）Lys Arg Glu Ala Glu Ala Trp Leu Gln V
al Asp Gly Ser Met ヒルジン………、 ２）Lys Arg Glu Ala Glu Ala ヒルジン………、 ３）Lys Arg Glu Ala Glu Ala Lys Arg ヒルジ
ン………、 ４）Lys Arg Glu Ala Glu Ser Leu Asp Tyr L
ys Arg ヒルジンまたは ５）Lys Arg ヒルジン……… アミノ酸レベルで酵母により選択的に切断される他の
配列を用いることももちろん考えうる。ただし、この切
断部位がヒルジン自体の中にも存在していてはならな
い。

最後に、発現ブロツクはＨ遺伝子の後方に、酵母のタ
ーミネーター配列、例えばPGK遺伝子のそれを有してい
てもよい。

一般に、本発明の発現ブロツクは、独自的に複製する
プラスミド或いは酵母染色体の中へ組込んで酵母、特に
サツカロマイセス内に導入しても良い。

プラスミドが独立存在性である場合、それはその複製
に備えての要素、すなわち２μプラスミドのそれの如き
複製開始点を含むであろう。更に、該プラスミドは、Ur
a3^-又はleu2^-酵母の相補正性を与える選択要素、例えば
URA3又はLEU2遺伝子を含んでいてもよい。これらのプラ
スミドは、プラスミドを「シヤトル」プラスミドとしな
ければならないときに細菌中でのそれらの複製を行なう
要素、例えばpBR322のそれの如き複製開始点、Amp^rの如
きマーカー遺伝子及び／又は当業者に既知の他の要素を
も含みうる。

本発明はまた、本発明の発現ブロツクにより形質転換
された酵母株に関し、該ブロツクはプラスミドに担持さ
れていても或いはその染色体に組込まれていてもよい。
これらの酵母の中でも、サツカロマイセス属の酵母、特
にS.セレヴイシアエに特に言及しなければならない。

プロモーターがαフエロモン遺伝子のそれである場
合、酵母は性タイプがMATαのものであることが好まし
い。例えば、遺伝子型がura3^-又はleu2^-等で、適切な淘
汰圧を加えて酵母中でプラスミドが維持されるようにプ
ラスミドを導入された酵母株を用いる。

適当な培地中で上記形質転換株を培養し、細胞内にヒ
ルジンを蓄積させることにより、ヒルジンを調製するこ
とも可能であるが、上記説明からわかるように、ヒルジ
ンを、成熟型で又はインヴイトロでプロセツシングに付
されるべ前駆体の形で、培地中に分泌させることがより
好ましい。

この成熟化は、幾つかの段階で実施できる。まず、Le
x配列の翻訳で生じた或る種の要素を切断する必要があ
るかもしれない。この切断をSclに相当する配列につい
ても行なう。上に述べたように、成熟型ヒルジンには臭
化シアンにより選択的に切断されるメチオニンが先行し
ていてもよい。ヒルジンをコードする配列は、メチオニ
ンを含んでいないので、この方法を利用できる。

特定のエンドペプチダーゼによりCOOH側で切断される
Lys−ArgジペプチドをＮ末端に配置することも可能であ
る；この酵素は分泌過程においても活性であるので、こ
のようにして成熟型蛋白質を直接培地中に得ることが可
能である。しかしながら、場合によっては、特定の酵素
を添加して分泌後に酵素的切断を行なうことも必要であ
る。

場合によつては、特に臭化シアン処理の後に、ジスル
フイド橋を再形成することによる復元が必要であるかも
知れない。このためには、ペプチドを例えば塩酸グアニ
ジンを用いて変性し、次に還元型及び酸化型グルタチオ
ンの存在下に復元する。

最後に、本発明は、本発明のプロセスによつて得られ
たヒルジンに関する。

本発明のその他の特質及び長所は以下の実施例を読め
ば明かになるであろう。

第１図は、pTG717中にクローンされたヒルジンcDNA断
片のヌクレオチド配列を示す。

第２図は、α性フエロモン前駆体のヌクレオチド配列
を示す。

第３図は、pTG834の構築法を模式的に示す。

第４図は、pTG880の構築法を模式的に示す。

第５図は、pTG882の構築法を模式的に示す。

第６図は、M13TG882の構築法を模式的に示す。

第７図は、pTG874の構築法を模式的に示す。

第８図は、pTG876の構築法を模式的に示す。

第９図は、pTG881の構築法を模式的に示す。

第10図は、pTG886の構築法を模式的に示す。

第11図は、pTG897の構築法を模式的に示す。

第12図は、pTG886及びpTG897によつて形質転換された
酵母を培養した後の培地中に得られたMW＞1000の蛋白質
のアクリルアミドゲル電気泳動図を示す。

第13図は、pTG886及びpTG897によつて形質転換された
酵母を培養した後の培地中に得られたMW＞1000の蛋白質
のアクリルアミドゲル電気泳動図を示す。

第14図は、pTG1805の構築法を模式的に示す。

第15図は、pTG847及びpTG1805によつて形質転換され
た酵母を培養した後の培地中に得られたMW＞1000の蛋白
質のアクリルアミドゲル電気泳動図を示す。

第16図は、種々の構成物質中の最初の切断位置（Lys
−Arg）から下流のアミノ酸配列の比較を示す図であ
る。

本明細書をわずらわしくないよう、本明細書ではアミ
ノ酸配列及びヌクレオチド配列を反復させていないが、
それらも本明細書の明かな一部となるものである。

実施例１−pTG822の構築 ヒルジンHV−２のcDNA断片を、プラスミドpTG717のPs
tＩ消化後のゲルから抽出し、次に、酵素HinfＩ及びAha
IIIで同時に消化した。酵素HinfＩは成熟型ヒルジン配
列の最初のコドンの下流で切断する。酵素AhaIIIはヒル
ジン配列の停止コドンを（３′）の後方約30塩基対のと
ころで切断する。こうして得たHinf.I−AhaIII断片をア
ガロースゲル上で単離し、このゲルから溶出した。

成熟型蛋白質をコードする配列をベクターpTG880に導
入した。ベクターpTG880は、ベクターpTG838の誘導体で
ある（第３図）。プラスミドpTG838は、PGK転写ターミ
ネーター近傍にあるBglII切断部位に関する以外はpTG83
3と同じである。この部位をクレノウポリメラーゼの埋
め込み（filling−in）作用によつて除去したものがpTG
838である。

プラスミドpTG833は、酵母／E. coliシヤトルプラス
ミドである。このプラスミドは、酵母中での異種遺伝子
発現用に設計した。このベクター（第３図）の基本的要
素は次のものである：酵母中での選択マーカーとしての
URA3遺伝子、酵母２μプラスミドの複製開始点、E. col
iプラスミドpBR322のアンピシリン耐性遺伝子と複製開
始点（これらの２要素はこのプラスミドの大腸菌中での
増殖と選択を可能にする）、酵母PGK遺伝子のSalＩ部位
までをコードする配列をもつたこの遺伝子の５′フラン
キング（側面を接する）領域、pBR322のSalＩ−PvuII断
片及びPKG遺伝子ターミネーター（19）。このプラスミ
ドは、既に本出願人の1984年５月９日に提出のフランス
特許出願第84/07125号中に記載されている。

EcoRIBglIIで切断したpTG838に短いポリリンカー領域
（バクテリオフアージM13由来）を挿入することによりp
TG838（第４図）からプラスミドpTG880を構築した。そ
れは、酵母PGK遺伝子に接する５′領域のすぐ後方に一
連のロクーニング部位をBglII、PstＩ、HindIII、BamH
I、SmaＩ及びEcoRIの順序で配置することを可能にす
る。プラスミドpTG880のDNAをBglII及びSmaＩで消化
し、この消化で生じた大きい断片を単離し、ゲルから溶
出した。ヒルジンHV−２をコードする配列の大部分を含
有するpTG717のHinf I−AhaIII断片を、消化pTG880並び
にヒルジン配列のNH₂末端領域の再構成を意図した３種
の合成オリゴヌクレオチド（第５図）と混合した。それ
らヌクレオチドは、ベクターのBglII部位をヒルジン含
有断片のHinf Ｉ部位に再連結するものである。この混
合物をライゲーシヨン処理に付し、ついでE. coli細胞
の形質転換に用いた。形質転換体中にプラスミドpTG822
が回収された。

このプラスミドは、PKGプロモーターの支配下にヒル
ジンを生産する目的で酵母細胞の形質転換にも用いた。
しかしながら、このベクターで形質転換した細胞の粗抽
出物中にはヒルジン活性が検出されなかつた。活性ヒル
ジンの産生が見られなかつた理由は未だ不明である。し
かし、構築したpTG882は、下記酵母分泌ベクター用のヒ
ルジンをコードする配列の供給源として役立つた。

実施例２−pTG886及びpTG897の構築 まず、ヒルジン配列を含むpTG882のBglII−EcoRI断片
（230bp）をバクテリオフアージMl3mp8（第６図）のBam
HI部位とEcoRI部位との間へ移した。これによりフアー
ジM13TG882が得られ、これよりEcoRI−HindIII断片（約
245bp）を単離することができた。この断片はヒルジンH
V−２全体をコードする配列、BamＨ I/BglII融合部位
及び酵母分泌ベクターpTG881（第９図）へのクローニン
グを可能にする付着性末端（HindIII−EcoRI）を含む。

プラスミドpTG881（10kb）は、E. coli中及びサツカ
ロイマイセス・セルヴイシアエのウヴアルム（uvarum）
株及びカルルベルゲンシス（carlbergensis）株中で独
立して複製する。E. coli／酵母シヤトルプラスミドで
ある。

このプラスミドE. coliへの導入によりアンピシリン
（及び他のβ−ラクタム抗生物質）への抵抗性を得るこ
とができる。更に、このプラスミドは、E. coli及びサ
ツカロマイセスの諸株中で発現される酵母遺伝子LEU2及
びURA3を担持している。従つて、E. coli又はサツカロ
マイセス中にこのプラスミドが存在すれば、β−イソプ
ロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ又はOMPデカルボキシ
ラーゼ欠損株の相補性を得ることができる。

プラスミドpTG881は次のようにして構築する： 出発プラスミドはpTG848（ura3遺伝子の向きが逆にな
つている以外はフランス特許第83/15716号に記載されて
いるpTG849と同一である）であり、それは次のDNA断片
からなる（第７図）。

１）プラスミドpJDB207（17）由来の約3.3kbのEcoRI−H
indIII断片。HindIII部位は２μプラスミドＢ型の座標1
05に相当し、EcoRI部位は座標2243に相当する。この断
片には、Ｂ型２μ断片のPstＩ部位でのポリデオキシア
デニレート／ポリデオキシチミジレートによつてLEU２
遺伝子が挿入されている（17）； ２）URA３遺伝子のHindIII断片（18）； ３）pBR322の大きいEcoRI（座標Ｏ）−SalＩ（座標65
0）断片。この断片のPvuII部位には、PGK遺伝子の末端
に相当する510塩基対のEcoRI−HindIII断片（その両端
は４種のヌクレオチドの存在下にクレノウ酵素の作用に
より前もつて平滑にされている）が挿入されている（1
9）。pBR322のPvuII末端にPGK遺伝子の削られたEcoRI末
端を結合すると、EcoRI部位が再生される； ４）PGK遺伝子（19）のHindIII−SalＩ断片（2.15k
b）。

プラスミドpTG848をHindIIIで切断し、それにより遊
離された２断片の両端を４種のデオキシリボヌクレオチ
ドの存在下にクレノウ酵素で処理して平滑化する。２断
片のライゲーシヨンを行ない。形質転換前に、このライ
ゲーシヨン混合物にHindIIIを作用させる。これによりH
indIII部位（１ケ所又は２ケ所）を保持してきたあらゆ
るプラスミド形態を除去できる。E. coliのBJ5183（pyr
Ｆ）株を形質転換し、形質転換体をアンピシリン抵抗
性及びpyr⁺性で選択する。かくしてプラスミドpTG874が
得られる（第７図）。そこでは、２ケ所のHindIII部位
が除去され、URA３遺伝子の配置がホスホグリセリン酸
キナーゼ（PGK）遺伝子のそれとと同じ方向の転写を起
こさせるようになつている。

プラスミドpTG874をSmaＩ及びSalＩで切断し、8.6kb
の断片をアガロースゲルから単離する。pBR322の同じ部
位にクローニングされたMFα１遺伝子のEcoRI−SalＩ断
片（約1.4kb）を含むプラスミドPTG864をEcoRIで切断す
る。この様にして線状としたプラスミドの両端を４種の
ヌクレオチドの存在下にクレノウ酵素の作用により平滑
化する。次に酵素SalＩで消化を行ない、MFα１遺伝子
に相当するEcoRI（平滑端）−SalＩ断片を単離する。後
者の断片をpTG874のSmaＩ−SalＩ片（8.6kb）とライゲ
ートすることにより、プラスミドpTG876を得る（第８
図）。

MFα１プロモーター配列の近位のBglII部位を無くす
べく、プラスミドpTG876のBglII部位による部分消化に
引続いて、４種のデオキシリボヌクレオチドの存在下に
クレノウ酵素を作用させる。得られた新しいプラスミド
pTG881（第９図）は、MFα１遺伝子の最初のHindIII部
位とPGK遺伝子の末端のBglII部位との間に異種コーデイ
ング配列を挿入することができる。

異種コーデイングDNAのHindIII部位での融合により同
じ読取り位相で翻訳が行なわれうるようになると、得ら
れたハイブリツド蛋白質はαフエロモンのプレプロ部分
を含むことになる。

ヒルジン遺伝子を有するHindIII−EcoRI断片をpTG881
にクローニングすると、プラスミドpTG886が得られる
（第10図）。クローニングを行なつた後では、この断片
から下流にBglII部位があり、これによりその断片をHin
f Ｉ−BglII形で再抽出することができる。Hinf Ｉ部
位は上で用いたものと同じである。pTG881にはBglII部
位が１ケ所しかないので、ヒルジンの５′配列を再構成
する３種のオリゴヌクレオチドを用いて、ヒルジンをコ
ードする配列の５′末端を再構成し、α−フエロモンの
プレプロ配列とそれに続く成熟ヒルジン配列とが読取り
枠をそろえて読み取られるようにすることは極めて容易
である。

この新しいプラスミドはpTG897として知られる（第11
図）。

実施例３−酵母によるヒルジンの発現 pTG897のDNAを用いて、既に記載されている手法（2
0）に従つて、TGY1sp4（MATα、ura３−251−373−32
8、his３−11−15）酵母をura⁺に形質転換した。

形質転換コロニーを継代培養し、10mlの最小培地プラ
ス カザミノ酸（0.5％）への播種に用いた。20時間培
養後、細胞を遠心分離し、上澄みを蒸留水に対して透析
し、蒸発（真空下の遠心）により濃縮した。

平行して、pTG886により形質転換したTGY1sp4の培養
及びヒルジンをコードする配列をもたないプラスミドで
形質転換したTGYT1sp4の培養（TGY1sp4/pTG856）を同様
に処理した。乾いたペレツトを50μｌの水にとり、20μ
ｌを2.8％SDSと100mMメルカプトエタノールとの存在下
に煮沸し、次いでアクリルアミド−SDS（15％アクリル
アミド;0.1％SDS）ゲル上にのせた（21）。固定し、ク
ーマシーブルーで染色すると、TGY1sp4/pTG886及びTGY1
sp4/pTG897の培養上澄み中に蓄積したポリペプチドを検
出できるが、対照培養の上澄み中にはそれらが存在しな
い（第12図）。更に、これら一連の付加ペプチドを［³⁵
S］システインで重く標識すると、ヒルジンペプチド
について予測できるように、分子はシステインに極めて
富んでいる（第10図）。

第12図及び第13図に示した電気泳動パターンは次のよ
うにして製出した： 第12図の場合は、抽出物質を次のようにして調製し
た:10mlの最小培地［アミノ酸なしのイーストナイトロ
ジエンベースデイフコ（6.7g/l）及びグリコース（10g/
l）］カザミノ酸を0.5％加え、種々の株をうえ、20時間
培養した（定常期）。細胞を遠心分離し、上澄みを水に
対して透析し（最小滞留分子量1000）、真空下の遠心に
より乾燥した。次に試料を負荷（ローデイング）用緩衝
液50μｌに取り、その20μｌを上述の通り処置し、アク
リルアミド−SDS（15％アクリルアミド、0.1％SDS）（2
1）にのせた。

用いた株は次の通りである： ウエル2:ヒルジン配列を含まないプラスミドで形質転換
したTGY1sp4（対照）； ウエル3:pTG886で形質転換したTGY1sp4 ウエル4:pTG897で形質転換したTGY1sp4 ウエル1:ウエル１には標準マーカーを入れた（フアルマ
シアLMWキツト；上から下へ:94000、67000、43000、300
00、20100、14000）。

バンドはクーマシーブルーＲ−250により染色して可
視化した。

第13図の場合には、抽出物質を次の通りに調製した:1
00mlの最小培地＋40μl/mlのヒルジンに種々の株をう
え、一夜培養した。細胞密度が約５×16⁶（対数増殖
期）に達したとき、35 Sシステイン（9.8mCi/ml;1.015
Ci/mmol）40μｌを各培養に加えた。10分後に細胞を遠
心分離し、完全培地（30℃）10mlにとり、攪拌下に30℃
でインキユベートした。３時間後に上澄み10mlを水に対
して透析し、第12図の場合について記載したようにして
体積0.5mlまで濃縮した。約35000cpm（40μｌ）をアク
リルアミド−SDS（15％アクリルアミド、0.1％SDS）ゲ
ルにのせた。蛋白質バンドはフルオログラフイー後に可
視化した。

用いた株は次の通りである： ウエル2:ヒルジン配列を含まないプラスミドにより形質
転換したTGY1sp4; ウエル3:pTG886により形質転換したTGY1sp4 ウエル4:pTG897により形質転換したTGY1sp4 ウエル1:ウエル１には表示の分子量（×10³）を有する
マーカーを入れた。

しかし、これらのポリペプチドを含有する上澄みを抗
トロンビン活性について試験したところ、活性を検出で
きなかつた。

TGY1sp4/pTG886により分泌されたポリペプチドの場
合、これは、αフエロモン前駆体の正常な段階の切断を
受けると予期され、そのためNH₂末端に８個のアミノ酸
の延長されたヒルジンが得られるであろう。従つて、TG
Y1sp4/pTG886細胞により分泌されたポリペプチドが活性
でないのは驚くには当たらない。

これに対し、TGY1sp4/pTG897により分泌されたポリペ
プチドの場合には、このポリペプチドは天然の蛋白質と
同一で、従つて活性であると予想される。幾つかの仮説
により活性欠如を説明できる： １）蛋白質の成熟が不完全で、EGFについて記載されて
いる（14）のように、Glu−Ala残基がNH₂末端に残つて
いる可能性がある。

２）蛋白質が正しいコンホメーシヨンをもつていないた
め、或いは培養上澄み中に活性を阻害する分子量1000の
蛋白質又は分子が存在するため、蛋白質が不活性であ
る。

３）細胞内及び／又は細胞外で蛋白質分解を受けたため
蛋白質が不完全である。

実施例４−臭化シアンでの切断による活性化 活性欠如の原因がNH₂末端に負荷的なアミノ酸が存在
していることに関係があるのであれば、TGY1sp4/pTG886
が分泌したペプチドを臭化シアンによる切断に付すこと
によつて活性を回復することが可能であろう。この試剤
は、実際、メチオニン残基に対して特異性をもち、pTG8
86がコードする融合蛋白質はメチオニンを１個しか含ま
ない。この反応は次のようにして行なつた：プラスミド
pTG886を含む酵母又はヒルジン挿入部を含まない対照プ
ラスミドを含む酵母を10mlの培地中で24時間培養する。
この時点で培養は７〜10×10⁷細胞/mlの濃度に達する。
上澄みを細胞から分離し、蒸留水に対して強度に透析
し、次いで凍結乾燥する。乾燥粉末を70％蟻酸1mlに溶
かし、１アリコートを用いて総蛋白質含量を測定する
（クーマシーブルー染色法、バイオライド社市販試薬に
よる染色法）；調製液の残部を新鮮な臭化シアンの70％
蟻酸溶液（30ng/ml）1mlで処理する。

窒素気流により酸素を除去した後、チユーブを暗所で
室温にて４時間インキユベートする。臭化シアン存在下
の操作は全て適切な注意を払い、ドラフト内で行なう。
臭化シアンにより切断反応を10倍量の蒸留水の添加によ
つて停止しついで溶液を凍結乾燥する。

切断ペブチドを蒸留水10mlに再溶解し、再凍結乾燥
し、これをもう一度繰返す。最後に、ペプチドを少量の
蒸留水に溶解し、１アリコートを抗トロンビン活性の測
定に用いる。試料の残部を凍結乾燥し、下記の復元工程
に付す。

ヒルジン活性は分子中のジスルフイド結合の存在に依
存している（１）ので、臭化シアンで切断したペプチド
を正確に復元して生物活性を示すようにしなければなら
ないように思われる。従つて、切断したペプチドを5M
GuHCl中で変成した後、当業者に既知の方法に従つて復
元した。

要約して言えば、凍結乾燥したペプチドを5M塩酸グア
ニジン（GuHCl）の250mMトリスHCl溶液（pH9.0）400μ
ｌに溶かす；次いで溶液を還元型グルタチオン中で2m
M、酸化型グルタチオン中で0.2mMとし最終体積2.0mlと
する（最終濃度は1.0mM GuHCl、50mMトリス）。

暗所にて23℃で16時間のインキユベーシヨンの後、試
料を50mMトリス・HCl（pH7.5）、50mM NaClを含む2lに
対して３回23℃で24時間透析し、最終透析物を遠心分離
により澄明化する。

ついで上澄みの抗トロンビン活性を測定する。第１表
に示したこの実験の結果、プラスミドpTG886に感染させ
た細胞の上澄み中に抗トロンビン活性が回復しているこ
とを明瞭に示している。対照プラスミドの場合には活性
ない。

結論として、組換えプラスミドを担持する酵母細胞
は、切断反応と復元反応との後にヒルジンの生物活性を
もつペプチドを、分泌できると言える。これにより、TG
Y1sp4/pTG886培養物中に存在するポリペプチドに活性が
ないのはNH₂末端に余分なアミノ酸が存在することで充
分に説明できることが示される。TGY1sp4/pTG897培養物
の場合（Glu−Alaテイル）も多分そうであろう。

実施例５ ヒルジンHV−２をコードする配列の最初のア
ミノ酸の直前への新しい切断部位の導入−プラスミドpT
G1805 pTG897の構築では、分泌されたペプチドがNH₂末端にG
lu−Alaテイルを保持しているおそれ（それによりこの
物質に抗トロンビン活性が欠けていることを説明できよ
う）がある。この仮説が当たつているならば、Glu−Ala
残基とヒルジンHV−２の最初のアミノ酸（イソロイシ
ン）との間に切断部位を作り出すことにより、上澄み中
で直接活性を回復できるであろう。これを、フエロモン
前駆物質（第２図）の成熟に係わるエンドペプチダーゼ
の認識部位であるLys−Argダブレツトをコードする配列
を付加することにより実行した。構築は、２種の合成オ
リゴヌクレオチド（第14図）の配列に関する以外は、正
確にプラスミドpTG897について記載したと同様にして得
た。得られたプラスミドをpTG1805と呼ぶ。このプラス
ミドを用いてTGY1sp4株をura⁺に形質転換した。上澄み
中へ分泌された物質を上記と同様のゲル電気泳動法によ
り分析し、TGY1sp4/pTG897を用いて得た物質と比較した
（第15図）。

使用した株は次の通りである： ウエル1:第12図のものと同じマーカー； ウエル2:pTG897で形質転換したTGY1sp4; ウエル3:pTG1805で形質転換したTGY1sp4; ウエル4:ヒルジンを産生しない対照。

TGY1sp4/pTG1805株に特異的なポリペプチドは、TGY1sp4
/pTG897株に特異的なそれらよりもゆつくりと移動す
る。この結果は、新しい切断部位が相当するエンドペプ
チダーゼによつて有効に利用されていないことを示唆す
る。しかし、上澄み中のヒルジンをその生物活性に基い
て定量すると、この物質のわずかな部分が、物質が明瞭
に不活性なTGY1sp4/pTG897の培養で得られるところとは
対照的に、活性であることがわかる（第２表）。

第２表 酵母培養上澄み(10ml)中の抗トロンビン活性 プラスミド 比活性U/mg 総活性Ｕ（10ml） pTG856 検出できず − pTG897 検出できず pTG1805 21 2.0 実施例６ 成熟型ヒルジンの遊離を可能にする新しい、
より有効な切断部位を包含する新構築物 上記構築（pTG897）では、上澄み中に少量のヒルジン
活性しか得られなかつたが、これは多分、成熟型ヒルジ
ンの遊離のため設計した第二の切断部位の認識が効率的
でないからであろう。従つて、この付加切断部位の上流
に、天然には最初のLys−Argダブレツトの上流に存在す
る３つのアミノ酸の配列Ser−Leu−Aspを付加すること
により、該切断部位をエンドペプチダーゼに対しより感
受性とするようデザインして、新しい構築を行なつた
（第２図及び第16図）。

用いた手法は、オリゴヌクレオチドの配列が次の通り
であること以外は上に記載したものと同じである。

切断領域のアミノ酸配列は第16図に示されている。相
当するプラスミドをpTG1818と呼ぶが、これは、Ser−Le
u−Aspのコドンに相当するヌクレオチド５′−TTG GAT
AAAが挿入されている点でのみpTG1805と異なる。

既に記載されている標準的条件に従つて、TGY1sp4/pT
G1818の培養上澄み中で測定された活性は、培養液10ml
当り約200単位で、前の実施例で見出された活性の約100
倍に相当する。未濃縮培養液10mlを用いてアツセイを実
施できることは注目すべきことである。

実施例７ Glu−Ala−Glu−Ala配列を欠く前駆体の合成
に導く構成 上記２つの実施例で、成熟ヒルジン配列の冒頭のすぐ
上流に新しいLys−Arg部位を付加することが、上澄み中
への活性物質の遊離を可能ならしめることが示された。
しかし、それらの実施例では、前駆体の切断が最初のLy
s−Arg部位（成熟型配列の冒頭からみて遠位）で起る一
方、NH₂末端で延長されたヒルジン鎖に相当するより重
い不活性不純物が培養液中に得られうる。これは、不活
性不純物が多くを占めるTGY1sp4/pTG1805の場合にとく
に明瞭である。TGY1sp4/pTG1818の培養の場合にも依然
同様で、不活性不純物が多くを占めはしないが、EGFの
場合について他の研究者が記載している（14）ように存
在しうるであろう。不活性物質の合成で表わされるこの
収率上のロスを避けるべく、Lys−Arg切断部位と成熟型
ヒルジン配列の最初のアミノ酸との間にGlu−Ala−Glu
−Ala配列がない点でのみTGY1sp4/pTG897細胞が合成す
るものと相違するだけの前駆体の合成に導く新しい構成
を取り上げることとした。

次の酵母株を、1985年４月30日に、パリ市15区ドクテ
ユールールー通り28番地のパスツール研究所付属国立微
生物培養コレクシヨン（CNCM）に寄託ずみである： ・TGY1sp4/pTG1818:プラスミドpTG1818によりura⁺に形
質転換されたサツカロマイセス・セレヴイシアエTGY1sp
4/（MATαura３−251−373−328−his３−11−15）株；
寄託番号I441。

・TGY1sp4/pTG886:プラスミドpTG886によりura⁺に形質
転換されたサツカロマイセス・セレヴイシアセTGY1sp4
（MATαura３−251−373−328−his３−11−15）株；寄
託番号I442 参考文献 1.デイー．バジー（D.BADGY）、イー．バラバス（E.BAB
RBAS）、エル．グラフ（L.GRAF）、テイー．イー．ペー
ターセン（T.E.PETERSEN）及びエス．マグナソン（S.MA
GNUSSON）（1976）“メソツズ イン エンザイモロジ
ー パートB"（Methods in Enzymology partB）、vol.
45,pp.669〜678 2.エフ．マークワート（F.MARKWARDT）（1970）“メソ
ツズ イン エンザイロモジー”（Methods in Enzymol
ogy vol.19,pp.924〜932 3.エフ．マークワート（F.MARKWARDT）、ジエー．ハウ
プトマン（J.HAUPTMANN）、ジー．ノバク（G.NOWA
K）、、シーエイチ．クレツセン（Ch.KLESSEN）及びピ
ー．ワルスマン（P.WALSMANN）（1982）“トロンボ．ヘ
モスタシス”（Thromb.Hemostasis）シユトツトガルト
（Stuttgart）47,226〜229 4.ピー．ワルスマン（P.WALSMANN）及びエフ．マークワ
ート（F.MARKWARDT）（1981）“デイー フアルマツイ
ー”（Die Pharmazie）10,653〜660 5.テイーエイチ．クロス（Th.KLOSS）及びユー．ミツト
マン（U.MITTMANN）“ロンゲンベツクス アルヒ．チル
ールク”（Longenbecks Arch.Chirurg.）358,548 6.エイ．イシカワ（A.ISHIKAWA）、アール．ハフター
（R.HAFTER）、ユー．ゼーミユラー（U.SEEMULLER）、
ジエイ．エム．ゴーケル（J.M.GOKEL）及びエム．グレ
ーフ（M.GRAEFF）（1980）“トロンボシス リサーチ”
（Thrombosis Research）19,351〜358 7.エフ．マルクワート（F.MARKWARDT）、ジー．ノバク
（G.NOWAK）、ジエー．シユトウルツエベルガー（J.STU
RZEBERGER）、ユー．グライスバデイ（U.GREISBADI）、
ピー．ワルスマン（P.WALSMANN）及びジー．フオーゲル
（G.VOGEL）“トロンボ ヘモスタシス”（Thomb. Hemo
stasis）シユトツトガルト（Stuttgart）52,160〜163 8.シー．ノバク（C.NOWAK）及びエフ．マークワート
（F.MARKWARDT）（1980）“エクスペリメンタル パソ
ロジー”（Expt.path.）18,438〜443 9.エー．エイチ．スーター（A.H.SUTOR）、エス．クノ
ツプ（S.KNOP）及びデイー．アドラー（D.ADLER）“コ
ントローレ アンテイトロンボチカ”（Kontrolle Anti
thrombotica）23回シンポジウム ブルートゲリンヌン
グ（Blutgerinnung）ハンブルグ（Hamburk）、pp.117〜
123 10.テイー．イー．ペーターセン（T.E.PETERSEN）、エ
ル．ソトラツプ−イエンセン（L.SOTTRUP−JENSEN）、
エス．マグナソン（S.MAGNUSSON）及びデイー．バジー
（D.BADGY）（1976）“プロタイズ ビオロ． フルイ
ズ，プロク，コロク."（Protides Biol.Fluides,Proc.C
olloq.）vol.23,pp145〜149 11.ジエイ−ワイ．チヤン（Ｊ−Y.CHANG）（1983）フエ
ブス．レツト．（Febs.Lett.）164,307〜313 12.アイ．ピー．バスコバ（I.P.BASKOVA）、デイー．ユ
ー．チエルケソーバ（D.U.CHERKESOVA）及びヴイ．ヴ
イ．モソーロフ（V.V.MOSOLOV）（1983）“トロンボシ
ス リサーチ”（Thromb.Res.）30,459〜467 13.エイチ．バツセイ（H.BUSSY）、デイー．サビール
（D.SAVILLE）、デイー．グリーン（D.GREENE）他（198
3）“モル．セル．ビオル”（Mol.Cell.Biol）３,1362
〜1370 14.エー．ジエイ．ブレーク（A.J.BRAKE）、デイー．ジ
ー．コイト（D.G.COIT）、ユー．エー．ヘーバーライン
（U.A.HEBERLEIN）、エフ．アール．マリアーツ（F.R.M
ARIARZ）、ジー．テイー．マレンバハ（G.T.MULLENBAC
H）、エム．エス．ウーデア（M.S.URDEA）、ピー．バレ
ンスエラ（P.VALENZUELA）及びピー．ジエイ．バー（P.
J.BARR）（1984）“プロシーデイングス オブ ザ ナ
シヨナル アカデミー オブ サイエンス オブ ザ
ユー．エス．エイ”（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）81,464
2〜4646 15.ジー．エイ．ビター（G.A.BITTER）、ケイ．ケイ．
チエン（K.K.CHEN）、エイ．アール．バンクス（A.R.BA
NKS）及びピー．エイチ．ライ（P.H.LAI）（1984）“プ
ロシーデイングス オブ ザ ナシヨナル アカデミー
オブ サイエンス オブ ザ ユー．エス．エイ”
（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）81,5330〜5334 16.ジエイ．カージヤン（J.KURJAN）及びアイ．ハース
ユウイツツ（I.HERSKOWITZ）（1982）“セル”（Cell）
30,933〜943 17.ジエイ．ベグス（J.BEGGS）（1981）“ジエネテイツ
ク エンジニアリング”（Genetic Engineering）２,17
5〜203 18.エム．エル．バツク（M.L.BACH）、エフ．ラクルー
ト（F.LACROUTE）及びデイー．ボツトスタイン（D.BOTS
TEIN）（1979）“プロシーデイングス オブ ザ ナシ
ヨナル アカデミー オブ サイエンス オブ ザ ユ
ー．エス．エイ”（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）76,386〜
390 19.アール．エイ．ヒツツマン（R.A.HITZEMAN）、イ
ー．エフ．ハギー（E.F.HAGIE）、ジエイ．エス．ハイ
フリツク（J.S.HAYFELICK）その他（1982）“ヌクレイ
ツク アシツズ リサーチ”（Nucleic Acids Res.）1
0,7791〜7807 20.エイチ．イトー（H.ITO）、ワイ．フクダ（Y.FUKUD
A）、ケイ．ムラタ（K.MURATA）及びエイ．キムラ（A.K
IMURA）（1983）“ジヤーナル オブ バクテリオロジ
ー”（J.Bacteriol.）153,163〜168 21.ヴイ．ケイ．シー．レムリ（.K.C.LAEMMI）（1970）
“ネイチヤー”（Natur）227,680〜685 22.ダブリユー．クラマー（W.KRAMER）、ヴイ．ドラツ
ツア（V.DRUTSA）、エイチ．ダブリユー．ヤンセン（H.
W.JANSEN）その他（1984）“ヌクレイツク アシツズ
リサーチ”（Nucleis Acds Res.）12,9441〜9556

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ルモワン イヴ フランス国 67100 ストラスブール リユ デザリジエール ４ (72)発明者 ルコツク ジヤン‐ピエール フランス国 67116 ライヒステート リユ デユ シヤン・デユ・フオ ６ (56)参考文献 特開 昭60−41487（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−132892（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−227899（ＪＰ，Ａ) ＦＥＢＳ ＬＥＴＴ．，Ｖｏｌ．165, Ｎｏ．２，Ｐ．180−184（1984)

Claims (17)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】酵母における複製開始点を含むプラスミド
   に組み込まれるか又は酵母の染色体に組み込まれた機能
   性DNAブロックにより形質転換された酵母であって、前
   記ブロックが少なくとも −ヒルジン、その変種の一つ又はその前駆体をコードす
   るDNA配列（Ｈ遺伝子） −遺伝子産物の分泌を達成するのに必要な要素を含むリ
   ーダー配列（Lex） −酵母によるＨ遺伝子の転写のためのシグナルを含むDN
   A配列（Str） を含むことを特徴とする酵母を培養培地中で培養し、該
   培養培地中に生産されたヒルジンを回収することによる
   ヒルジンの製造方法。
2. 【請求項２】前記機能性ブロックが、５′末端〜３′末
   端に、少なくとも以下の配列を含むことを特徴とする請
   求の範囲第１項に記載の方法： −酵母によるＨ遺伝子の転写のためのシグナルを含む配
   列（Str）， −遺伝子産物の分泌を達成するのに必要な要素を含むリ
   ーダー配列（Lex） −ヒルジン、その変種の一つ又はその前駆体をコードす
   る遺伝子， −切断部位Sclにより先導されるヒルジン又はその変種
   の一つ又はその前駆体をコードする遺伝子。
3. 【請求項３】配列Lexが酵母のα性フェロモンのそれで
   あることを特徴とする請求の範囲第１項又は第２項に記
   載の方法。
4. 【請求項４】リーダ配列が、酵母のα性フェロモンのプ
   レフラグメントを含むことを特徴とする請求の範囲第１
   〜３項のいずれかに記載の方法。
5. 【請求項５】前記ブロックが、Ｈ遺伝子の５′末端に酵
   母のα性フェロモンのプレプロ配列を含むことを特徴と
   する請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載の方法。
6. 【請求項６】Ｈ遺伝子の後に酵母のターミネーター配列
   が続くことを特徴とする請求の範囲第１〜５項のいずれ
   かに記載の方法。
7. 【請求項７】酵母のターミネーター配列がPGK遺伝子の
   それであることを特徴とする請求の範囲第６項に記載の
   方法。
8. 【請求項８】前記切断部位が、ジペプチドLys−Argであ
   ることを特徴とする請求の範囲第１〜７項のいずれかに
   記載の方法。
9. 【請求項９】前記機能性ブロックが、少なくとも１つの
   酵母における複製開始点を含むプラスミドに組み込まれ
   ることを特徴とする請求の範囲第１〜７項のいずれかに
   記載の方法。
10. 【請求項１０】前記複製開始点が、２μプラスミドのそ
    れであることを特徴とする請求の範囲第９項に記載の方
    法。
11. 【請求項１１】前記プラスミドがさらに選択性を有する
    ことを特徴とする請求の範囲第９項又は第10項に記載の
    方法。
12. 【請求項１２】前記選択性が、URA3遺伝子により与えら
    れることを特徴とする請求の範囲第11項に記載の方法。
13. 【請求項１３】サッカロマイセス属の酵母であることを
    特徴とする請求の範囲第１〜12項のいずれかに記載の方
    法。
14. 【請求項１４】性のタイプがMatαであることを特徴と
    する請求の範囲第13項に記載の方法。
15. 【請求項１５】サッカロマイセス・セレヴイシアエの一
    菌株であることを特徴とする請求の範囲第12〜14項のい
    ずれかに記載の方法。
16. 【請求項１６】ａ）プラスミドにより運搬されるか、又
    は酵母の染色体に組み込まれた機能性DNAブロックを含
    む酵母株を培養培地中で培養し、該DNAブロックは少な
    くとも配列： −Str−Lex−Scl−Ｈ遺伝子−ter ・Strは酵母によるＨ遺伝子の転写のためのシグナルを
    含むDNA配列であり， ・Lexは成熟又はインビトロで成熟され得るヒルジン前
    駆体の形態のヒルジンの分泌を達成することのできるリ
    ーダー配列であり、 ・SclはATG及びLys−Argをコードする配列から選ばれる
    切断部位をコードするDNAシグナルである を含むことを特徴とし； ｂ）生産されたヒルジンは、成熟形態又はインビトロで
    成熟され得るヒルジン前駆体の形態で培養培地中に回収
    される ことを特徴とする酵母の培養によるヒルジンの製造方
    法。
17. 【請求項１７】前記配列Scl−Ｈ遺伝子が、配列Lys−Ar
    g−Ile−Thrをコードする配列を含むことを特徴とする
    請求の範囲第16項に記載の方法。