DE69327314T2

DE69327314T2 - Zusammensetzungen enthaltend Lipoprotein-Associated-Coagulation-Inhibitor (LACI) zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von akuten oder chronischen Enzündungen

Info

Publication number: DE69327314T2
Application number: DE69327314T
Authority: DE
Inventors: Abla Creasey
Original assignee: Chiron Corp
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1992-06-01
Filing date: 1993-04-23
Publication date: 2000-04-13
Anticipated expiration: 2013-04-24
Also published as: GR3032779T3; ES2139658T3; EP0643585A1; PT643585E; JPH07507300A; JP2007137901A; DE69327314D1; CA2136953A1; WO1993024143A1; ATE187648T1; JP3957740B2; JP2004210801A; CA2136953C; DK0643585T3; EP0643585B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung des Lipoprotein-assoziierten Koagulationsinhibitors (LACI) bei der Herstellung eines Medikamentes zur prophylaktischen und therapeutischen Behandlung einer akuten und chronischen Entzündung, von Sepsis und septischem Schock.

Hintergrund der Erfindung

Die Sepsis und der Folgezustand septischer Schock gehören zu den am meisten gefürchteten Komplikationen nach einer chirurgischen Operation und bei lebensgefährlich erkrankten Patienten. Das Zentrum für Krankheitskontrolle ordnet die Septikämie als 13. häufigste Todesursache in den Vereinigten Staaten von Amerika ein (siehe MMWR, 1987, 39 : 31 und US Dept. of Health and Human Services, 37 : 7, 1989) und als die 10. häufigste Todesursache unter älteren Amerikanern (siehe MMWR, 1987, 39 : 777). Die Inzidenz für diese Krankheiten wächst an, und die Sterblichkeit bleibt hoch. Schätzungen über die Gesamtkosten für die Pflege von Patienten mit Septikämie reichen von 5 Milliarden Dollar bis 10 Milliarden Dollar pro Jahr (siehe MMWR, 1987, 39 : 31). Die Krankheit kann bei 40% bis 60% der Patienten zum Tode führen. Dieser Prozentsatz konnte in den letzten 20 Jahren nicht verbessert werden.
Das Auftreten von aus dem Blut herrührenden grampositiven und gramnegativen Infektionen, die zu einem septischen Schock führen können, kommt ungefähr gleich häufig vor. Der septische Schock wird charakterisiert durch ungenügende Gewebedurchblutung, was zu ungenügender Sauerstoffversorgung der Gewebe führt, zu Hypotonie und Oligurie. Der septische Schock tritt auf, weil bakterielle Produkte, in der Hauptsache LPS, mit Zellmembranen und Komponenten des Koagulations-, Komplement-, fibrinolytischen, Bradykinin- und Immun- Systems reagieren und dadurch die Koagulation aktivieren, Zellen verletzt werden und der Blutfluß besonders in der Mikrozirkulation verändert wird. Mikroorganismen aktivieren häufig den klassischen Aktivierungsweg der Komplement-Kaskade, während Endotoxin meistens den alternativen Aktivierungsweg aktiviert. Die Aktivierung der Komplement-Kaskade, die Bildung von Leukotrien und direkte Effekte von Endotoxin auf Neutrophile führen zur Akkumulation dieser Entzündungszellen in den Lungen, Freisetzung von Enzymen und zur Produktion von toxischen Sauerstoffradikalen, welche das Lungenendothel beschädigen, und das akute Atemnot-Syndrom (ARDS) einleiten. ARDS ist eine der Haupttodesursachen bei Patienten mit septischem Schock und ist charakterisiert durch eine Stauungslunge, Granulozytenaggregation, Blutung und kapilläre Thrombi.
Die Aktivierung des Blutgerinnungssystems resultiert in der Bildung von Thrombin und Plättchen-Thrombin-Bildung in der Mikrozirkulation vieler Gewebe. Die Pathogenese dieses Syndroms beinhaltet die Aktivierung des intrinsischen Blutgerinnungssystems durch den Faktor XII ebenso wie die Aktivierung des extrinsischen Weges durch die Hochregulierung des Gewe befaktors. Aktivierter Faktor XII initiiert die intrinsische Blutgerinnungskaskade, und schließlich wird Fibrinogen zu Fibrin umgesetzt, und Blutgerinnung tritt auf Unkontrollierte Aktivierung der Blutgerinnung, gewöhnlich begleitet von Schock, resultiert in einer Thrombose und dem Verbrauch der Gerinnungsfaktoren II, V und VIII. Einige gewöhnliche Komplikationen von verbreiteter intravaskulärer Gerinnung sind schweres klinisches Bluten, Thrombose, Gewebeischämie und Nekrose, Hämolyse und Organversagen.
Zeitgleich zu der offensichtlichen Auslösung der. Blutgerinnung durch das Endotoxin scheinen ebenso entgegengesetzte Mechanismen durch die Blutgerinnung aktiviert zu werden, besonders die Aktivierung des fibrinolytischen Systems. Der aktivierte Faktor XII wandelt den Plasminogen-pro-Aktivator zu dem Plasminogenaktivator um, der nachfolgend Plasminogen zu Plasmin umwandelt, wodurch die Auflösung der Blutgerinsel vermittelt wird. Die Aktivierung des Plasma-fibrinolytischen Systems kann daher also zu der Blutungsanfälligkeit beitragen.
Endotoxämie wird begleitet von einem Anstieg in den zirkulierenden Spiegeln des Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Inhibitors (PAI). Dieser Inhibitor inaktiviert schnell den Gewebe- Plasminogen-Aktivator (TPA), wodurch dieser daran gehindert wird, die Fibrinolyse durch die Aktivierung von Plasminogen zu Plasmin zu fördern. Die Behinderung der Fibrinolyse kann Fibrinablagerung in Blutgefäßen bewirken und so zu der verbreiteten intravaskulären Koagulation, die mit dem septischen Schock assoziiert ist, beitragen.
Die verbreitete intravaskuläre Koagulation (DIC) ist eine koagulopathische Krankheit, die in Antwort auf einwandernde Mikroorganismen auftritt, charakterisiert durch die weitverbreitete Ablagerung von Fibrin in kleinen Gefäßen. Der initiierende Grund für die DIC scheint die Freisetzung von Thromboplastin (Gewebefaktor) in dem Blutkreislauf zu sein. Während dieses Prozesses erscheint eine Reduktion an Fibrinogen und Plättchen, und ein Anstieg an Fibrin- Spaltprodukten, woraus eine Fibrinablagerung in den Blutgefäßen resultiert. Der Ablauf der Geschehnisse, die während DIC erscheinen, ist in Fig. 1 beschrieben. Die Patienten leiden entweder an Thrombose oder Blutung, abhängig von dem Ausmaß der Abnahme der Koagulations- Protease-Inhibitoren während des Krankheitsverlaufs. Ein Teil der Regulation der Koagulationskaskade hängt von der Geschwindigkeit des Blutflusses ab. Nimmt der Blutfluß ab, wie es bei DIC und Sepsis der Fall ist, vergrößern sich die Probleme. Man nimmt an, daß DIC (sowohl die klinische milde als auch die ernste Form) häufig bei Patienten mit septischem Schock und einigen anderen Syndromen, wie Kopfverletzungen und Verbrennungen, geburtshilflischen Komplikationen, Transfusionsreaktionen und Krebs, auftritt. Eine jüngere Zusammenfassung der Xoma Corporation zeigt, daß DIC bei 24% der Sepsis-Patienten bei Einlieferung auftrat (Martin et al., 1989, Natural History in the 1980s, Abstract Nr. 317, ICAAC Meeting, Dallas). Darüberhinaus beschreibt die Zusammenfassung, daß DIC und das akute Atemnot-Syndrom die Variablen waren, die am Tag 7 am sichersten den Tod vorhersagten (Risikoverhältnisse 4 und 2,3). Die Geschehnisabfolge, die zur Freisetzung von Gewebefaktor in den Kreislauf führt und zur Sepsis ist sehr komplex. Verschiedene Cytokine werden von aktivierten Monozyten, endothelialen Zellen und anderen freigesetzt; diese Cytokine beinhalten den Tumor-Nekrose-Faktor (TNF), Interleukin 1 (IL-1) (von denen bekannt ist daß sie die Expression des Gewebefaktors hochregulieren), Interleukin 6 (IL-6), gamma-Interferon (IFN-γ), Interleukin 8 (IL-8) und andere. Die Komplementkaskade wird ebenso aktiviert, was durch den Anstieg der C3a- und C5a-Spiegel in dem Plasma von Sepsis-Patienten gezeigt wird. In der Konsequenz wird ein Mittel, welches die Koagulation behandelt, ohne die Expression des Gewebefaktors oder seine Aktivität zu beeinflussen, nicht unbedingt bei der Behandlung der Sepsis effektiv sein.
Es gibt zur Zeit keine zufriedenstellenden Ansatzpunkte für die Prävention oder die Behandlung von Sepsis oder DIC. Heparin ist das am häufigsten verwendete Antikoagulans bei DIC. Dies wurde jedoch kontrovers diskutiert, da Heparin Bluten induzieren kann und die Verfassung des Patienten verschlechtern kann. Andere Versuche, Sepsis unter Verwendung eines Antikoagulans zu behandeln, waren ebenfalls von Schwierigkeiten begleitet. Wie in Taylor 4.4, 1991, Blood, 78 : 364-368 gezeigt, werden Warfarin und Heparin als zwei Antikoagulantien, die zur Behandlung von DIC bei Sepsis verwendet werden, erwähnt, aber keines von beiden ist ein ideales Arzneimittel. Zusätzlich zeigen Taylor et al., daß ein neues Arzneimittel, DEGR-Xa, ein Antagonist des Faktors Xa, DIC inhibieren kann, jedoch nicht die lethalen Effekte der Sepsis blockiert. Es ist daher evident, daß ein Mittel, Welches den Koagulations-Aktivierungsweg unterbrechen kann, nicht notwendigerweise als Inhibitor des septischen Schocks effektiv ist. Es gibt daher einen Bedarf für eine Zubereitung, welche die lethalen Effekte der Sepsis inhibiert.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Lipoprotein-assoziierten Koagulationsinhibitor (LACI) oder einem Fragment oder einem Hybrid davon, welcher antientzündliche Aktivität beibehält bei der Herstellung eines Medikamentes zur Verwendung in einem prophylaktischen oder therapeutischen Verfahren zur Behandlung von akuter oder chronischer Entzündung.
Die Erfindung kann daher verwendet werden, ein Verfahren bereitzustellen zur prophylaktischen und therapeutischen Behandlung von Syndromen, die assoziiert sind mit einer akuten oder chronischen Entzündung, wo die Aktivierung von Faktor VII, Xa und die Expression des Gewebefaktors involviert sind, wie Sepsis und septischer Schock, umfassend die Verabreichung einer effektiven Menge des Lipoprotein-assoziierten Koagulationsinhibitors (LACI). LACI kann verwendet werden in Kombination mit einem zusätzlichen Mittel, wie einem Antibiotikum, einem monoclonalen Antikörper, einem Cytokin oder einem Komplementinhibitor in einer kombinierten Zusammensetzung zur Verwendung bei der Behandlung von Sepsis.
Die Verabreichung von LACI kann verwendet werden zur Behandlung einer akuten oder chronischen Entzündung, bei der TNF, IL-1, IL-6 oder andere Cytokine den Gewebefaktor hochregulieren. Vorzugsweise wird LACI intravenös verabreicht in einer Dosierung von 1 ug/kg bis 20 mg/kg, besonders bevorzugt von 20 ug/kg bis 10 mg/kg, am meisten bevorzugt von 1 bis 7 mg/kg. LACI wird vorzugsweise verabreicht zusammen mit einem zusätzlichen Mittel, um Sepsis und den septischen Schock zu behandeln, wie beispielsweise ein Antibiotikum.
Unter anderem wurde überraschenderweise gefunden, daß eine Verbindung die wegen ihrer gerinnungshemmenden Eigenschaft bekannt ist, auch die Immunantwort abschwächen kann und als Behandlung für Sepsis und septischen Schock dienen kann. Dies war überraschend in Hinsicht auf die Ergebnisse von Warr et al., 1990, Blood, 75 : 1481-1489 und Taylor et al., 1991, Blood, 78 : 364-368.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen und Tabellen

Fig. 1 zeigt die komplexen Aktivierungswege, die bei der Sepsis oder dem septischen Schock involviert sind. Der intrinisiche und der extrinsische Aktivierungsweg sind eingeschlossen. Anzeichen für eine mikrovaskuläre Thrombose umfassen: (1) neurologisch: mehrherdig, Delirium, Koma; (2) Haut: fokale Ischämie, oberflächliches Gangrän; (3) die Niere betreffend: Oligurie, Azotämie, kortikale Nekrose; (4) die Lunge betreffend: akutes Atemnot-Syndrom; und (5) gastrointestinal: akute Geschwürbildung. Anzeichen für eine hämorrhagische Diathese umfassen: (1) neurologisch: intrazerebrales Bluten; (2) Haut: Petächien, Ekchymose, das Versickern von Blut während der Venenpunktur; (3) die Niere betreffend: Hämaturie; (4) Schleimhäute: Nasenbluten, Zahnfleischbluten; und (5) gastrointestinal: massive Blutung.
Fig. 2 zeigt die Inhibierung der Aktivität des Gewebefaktors durch 36 Tage konditioniertes Medium (CM) und TNF-induziertes CM.
Fig. 3 zeigt die LACI-Neutralisierung von CM von endothelialen Zellen.
Fig. 4 zeigt die Antikörperneutralisierung des LACI-Proteins.
Fig. 5a und 5b zeigen ein pharmakokinetisches Profil von LACI in Pavianen. Offene Kreise repräsentieren Resultate des Immunotests, und geschlossene Kreise repräsentieren Kreise des Biotests. Beispielsweise wurden 0,5 mg/kg LACI als I.V.-Bolus über 30 Sekunden an zwei gesunde Paviane verabreicht. Blut wurde von diesen Tieren nach 1, 3, 6, 10, 20, 40, 60, 90, 120, 180, 240 und 420 Minuten genommen. LACI-Spiegel im Plasma wurden unter Verwendung von Immunoassay und Bioassay (im Text beschrieben) gemessen. In Fig. 5b zeigt die Linie 0,7 ug/kg + 10 ug/kg/min Inf. 12 h.
Fig. 6a bis 6h zeigen die Koagulations- und hämatologische Antwort auf eine LACI- Verabreichung 30 Minuten nach Beginn einer zweistündigen lethalen bakteriellen intravenösen Infusion. Linien mit gefüllten Kreisen repräsentieren Ergebnisse, die von behandelten Tieren erhalten wurden, und Linien mit "Xs" repräsentieren Resultate, die von Kontrolltieren erhalten wurden. Ein * (Stern) zeigt einen statistisch signifikanten Unterschied (p < 0,05) zwischen den Kontroll- und den experimentellen Gruppen an, und ein offener Kreis zeigt eine statistisch signifikante (p < 0,05) Differenz zwischen Zeiten an. Fig. 6a zeigt Fibrinogenspiegel, Fig. 6b zeigt FDP-Spiegel, Fig. 6c zeigt Plättchenspiegel, Fig. 6d zeigt WBC-Spiegel, Fig. 6e zeigt PT- Spiegel, Fig. 6f zeigt APTT-Spiegel, Fig. 6g zeigt Hämatokritwerte, und Fig. 6h zeigt RBC- Spiegel. Beispielsweise wurden anästhesierte Paviane einer lethalen Dosis E. coli (~5 · 10¹&sup0; Or ganismen/kg), welche über zwei Stunden intravenös infundiert wurde, ausgesetzt. Dreißig Minuten nach dem Beginn der bakteriellen Infusion erhielten fünf Paviane Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS; Trägerkontrolle; *), und die anderen fünf erhielten LACI in PBS (·). Blutproben von den zehn Pavianen wurden vor dem Beginn der bakteriellen Infusion genommen und 2, 4, 6 und 12 Stunden nach dem Beginn der Infusion. Blutproben wurden auf Fibrinogen, Fibrin- Abbauprodukte, die Prothrombinzeit, die aktivierte partielle Thromboplastinzeit und auf Hämatokrit, Plättchen, Anzahl roter und weißer Blutzellen durch Standardmethoden getestet. Der Mittelwert ±-Standardfehler jeder Messung ist gegenüber der Zeit (Std.) aufgetragen.
Tabelle 1 zeigt das Gewicht, das Geschlecht, die E. coli-Dosis und Überlebenszeiten von Kontroll- und LACI-behandelten Pavianen nach 30 Minuten.
Tabelle 2 zeigt zusammengefaßt die klinische Chemie von LACI-behandelten und Kontrollpavianen nach 30 Minuten.
Tabelle 3 zeigt die IL-6-Spiegel (ng/ml) nach LACI-Verabreichung nach 30 Minuten.
Tabelle 4 zeigt das Gewicht, das Geschlecht, die E. coli-Dosierung und Überlebenszeiten von Kontroll- und LACI-behandelten Pavianen nach 240 Minuten.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

LACI

Wie oben gesagt, besteht die vorliegende Erfindung in der Entdeckung, daß LACI die gesundheitsschädlichen Effekte eines septischen Schocks inhibieren kann. Spezifisch hemmt/vermindert LACI die Koagulopathien und den entzündlichen Prozeß, assoziiert mit akutem entzündlichem und septischem Schock. LACI ist ein Serum-Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von 38.000 Kd. Es ist ebenso bekannt als ein Gewebefaktorinhibitor, da es ein natürlicher Inhibitor der durch Thromboplastin (Gewebefaktor) induzierten Blutgerinnung (U. S. Patente Nrn. 5 110 730 und 5 106 833 beschreiben den Gewebefaktor) ist. LACI ist ein Proteaseinhibitor und hat 3 Kunitz-Domänen, wobei zwei davon bekanntermaßen mit den Faktoren VII bzw. Xa interagieren, während die Funktion der dritten Domäne unbekannt ist. Viele der strukturellen Eigenschaften von LACI können aufgrund von dessen Homologie mit anderen sehr gut untersuchten Proteasen abgeleitet werden. LACI ist kein Enzym und inhibiert daher wahrscheinlich die Zielprotease in einer stöchiometrischen Art und Weise, nämlich so, daß eine der LACI- Domänen ein Proteasemolekül inhibiert. LACI wird so definiert, daß es sowohl Fragmente, die Antisepsis-Aktivität beinhalten, als auch Hybridmoleküle, die LACI beinhalten, umfaßt. Siehe U. S. Patent Nr. 5 106 833 für LACI-Fragmente und Muteine.
LACI wurde von Broze et al., 1987, PNAS (USA), 84 : 1886-1890 entdeckt, und es wurde gefunden, daß es Faktor Xa direkt inhibiert, ebenso wie es die Aktivität des Gewebefaktors inhibiert durch Bildung eines inerten Inhibitorkomplexes aus Faktor VIIa/Gewebefaktor (TF)/Faktor Xa/Ca++. Es besitzt die DNA-Sequenz, welche in U. S. Patent Nr. 4 966 852 gezeigt ist. Ein schematisches Diagramm des vorgeschlagenen Mechanismus für die Inhibierung von Faktor Xa und VIIa/TF-Komplex durch LACI ist in Fig. 1 gezeigt.
Die Blutgerinnung wird über zwei Signalwege vermittelt; intrinsisch und extrinsisch. Die intrinsischen und extrinsischen Signalwege der Blutgerinnung bestehen aus verschiedenen Proteasen, die in einer festgelegten Reihenfolge aktiviert werden, welche, wenn nicht inhibiert in der Bildung von Fibrinklumpen resultieren. LACI wirkt auf zwei Schritte in dem Signalweg der Koagulationskaskade sowohl auf dem Xa- und VIIa/TF-Niveau, wie oben beschrieben, ein. Die Aktivierung des Gewebefaktors, den LACI inhibiert, ist ein relativ frühes Geschehen in dem extrinsischen Signalweg. (LACI wurde auch extrinsischer Signalweg-Inhibitor (EPI) und Gewebefaktor-Signalweg-Inhibitor (TFPI) genannt). LACI inaktiviert Faktor Xa, der eine verbreitete Protease des extrinsischen und intrinsischen Signalwegs ist, und der stromab von der Aktivierung des Gewebefaktors liegt.
Die Konzentration von LACI in normalem Plasma beträgt 100 ng/ml. Ein Bericht von Bajaj et al., 1987, J. Clin. Invest., 79 : 1874-1878 schlägt vor, daß LACI in der Leber und in endothelialen Zellen synthetisiert wird und während DIC bei Patienten verbraucht wird. Spezifisch reichten LACI-Werte im Plasma von 15 gesunden Freiwilligen von 72 bis 142 U/ml mit einem Durchschnitt von 101 U/ml. Interessanterweise betrugen LACI-Spiegel von 10 Patienten mit DIC 57 ± 30 U/ml (p < 0,001). Im Gegensatz dazu betrugen LACI-Spiegel von 12 Patienten mit hepatocellulärer Krankheit im Durchschnitt 107 ± 33, d. h. sie waren ähnlich dem Normalzustand. Sandset et al., 1989, J. Internal Med., 225 : 311-316 zeichnete LACI-Plasmaspiegel während einer 7 Tage währenden Beobachtungsperiode bei Patienten mit Lungenentzündung (n = 13) und bei Schlaganfall-Patienten mit Infarkt (n = 9) und Blutung (n = 9) auf. Bei Lungenentzündungs-Patienten zeigte LACI einen schwachen, aber nicht signifikanten Anstieg während der Erholungsperiode (p = 0,068). Bei Patienten mit zerebralen Blutungen änderten sich die LACI- Spiegel nicht konsistent, während bei Patienten mit zerebralem Infarkt ein Anstieg der LACI- Spiegel von Tag 1 bis Tag 2 beobachtet wurde (p < 0,05). Dieser letztere Effekt war höchstwahrscheinlich ausgelöst worden durch die Freisetzung von gewebegebundenem LACI durch Heparin und wurde daher nur beobachtet bei Heparin-behandelten Patienten.
Sandset et al., 1989, Haemostasis, 19 : 189-195 bestimmten ebenso seriell die LACI- Spiegel von 13 Patienten mit einer postoperativen/posttraumatischen Septikämie. Bei den Überlebenden (n = 8) normalisierte sich die initial geringe LACI-Aktivität während der Erholung. In den tödlichen Fällen (n = 5) wurde ein progressiver Anstieg der LACI-Aktivität (maximal 30 ± 15%) bis zum Eintritt des Todes beobachtet. Der Anstieg kann durch ein schwer geschädigtes Endothel erklärt werden, welches gewebegebundenen LACI in die Blutzirkulation freisetzt.

Herstellung von LACI

LACI kann mit Hilfe verschiedener Methoden hergestellt und isoliert werden. Zellen, die LACI sekretieren, schließen beispielsweise alte Endothelzellen oder junge Endothelzellen, die mit TNF für ungefähr 3 bis 4 Tage behandelt wurden, ein, ebenso Hepatocyten und Hepatom- Zellen. LACI kann aus jeder Zellkultur unter Anwendung konventioneller Methoden gereinigt werden. Beispielsweise enthalten diese Methoden chromatographische Methoden, wie sie in Pe dersen et al., 1990, J. of Biological Chemistry, 265 : 16786-16793, Novotny et al., 1989, J. of Biological Chemistry 264 : 18832-18837, Novotny et al., 1991, Blood, 78 : 394-400, Wun et al., 1990, J. of Biological Chemistry, 265 : 16096-16101 und Broze et al., 1987, PNAS (USA), 84 : 1886-1890 gezeigt sind. Darüberhinaus tritt LACI im Blutstrom auf und könnte aus Blut gereinigt werden, siehe Pedersen et al., a.a.O. Diese Methode wird jedoch weder vorgeschlagen noch bevorzugt wegen der großen Mengen an Blut, die erforderlich wären, ausreichende Mengen an LACI zu erhalten.
LACI kann rekombinant produziert werden, wie in U. S. Patent Nr. 4 966 852 gezeigt ist. Beispielsweise kann die cDNA für das Protein in ein Plasmid zur Expression in Prokaryoten oder Eukaryoten eingebaut werden. U. S. Patent Nr. 4 847 201 betrifft Details für die Transformation von Mikroorganismen mit spezifischen DNA-Sequenzen und deren Expression. Es gibt viele andere Referenzen, die einem Fachmann mit durchschnittlichen Kenntnissen bekannt sind, die Details bezüglich der Expression von Proteinen unter Verwendung von Mikroorganismen betreffen. Viele davon werden zitiert in U. S. Patent Nr. 4 847 201, wie Maniatas, T., et al., 1982, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press.
Das folgende ist ein Überblick über die Transformation und die Expression von LACI in Mikroorganismen. LACI-DNA-Sequenzen müssen isoliert und mit geeigneten Kontrollsequenzen verbunden werden. LACI-DNA-Sequenzen sind in U. S. Patent Nr. 4 966 852 gezeigt, und diese können in ein Plasmid, wie pUNC13 oder pBR3822, die kommerziell von Firmen wie Boehringer-Mannheim erhältlich sind, eingebaut werden. Sobald die LACI-DNA in einen Vektor insertiert ist, kann sie in einen geeigneten Wirt cloniert werden. Die DNA kann amplifiziert werden durch Techniken, wie solche, die im U. S. Patent Nr. 4 683 202, Mullis, und U. S. Patent Nr. 4 683 195, Mullis et al., gezeigt sind. (LACI-cDNA kann erhalten werden, indem man Zellen, wie Hepatomazellen (z. B. HepG2 und SKHep), induziert, LACI-mRNA herzustellen und dann die mRNA identifiziert und isoliert und diese dem Prozeß der rerversen Transkription unterzieht, um cDNA für LACI zu erhalten). Nachdem der Expressionsvektor in einen Wirt wie E. coli transformiert wurde, können die Bakterien fermentiert und das Protein exprimiert werden. Bakterien sind bevorzugte prokaryotische Mikroorganismen und E. coli ist besonders bevorzugt. Ein bevorzugter Mikroorganismus, der in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, ist E. coli K-12, Stamm MM294, der bei der ATCC am 14. Februar 1984 unter den Bestimmungen des Budapester Übereinkommens hinterlegt wurde. Er trägt die Zugangsnummer 39607. Alternativ kann LACI in Säugerzellen eingeführt werden. Diese Säugerzellen können CHO, COS, C127, Hep G2, SK Hep, Bakulovirus und infizierte Insektenzellen einschließen (siehe auch U. S. Patent Nr. 4 847 201, siehe oben). Siehe auch Pedersen et al., 1990, J. of Biological Chemistry, 265 : 16786-16793. Einige spezifische Details der Produktion eines rekombinanten Proteins beinhalten typischerweise das folgende:

Geeignete Wirte, Kontrollsyteme und Methoden

Zuerst wird eine DNA, die für das reife Protein (hierin verwendet unter Einschluß aller Muteine), das Präprotein oder eine Fusion des LACI-Proteins an eine zusätzliche Sequenz, die dessen Aktivität nicht zerstört oder an eine zusätzliche Sequenz, welche unter kontrollierten Bedingungen (wie Behandlung mit Peptidase) gespalten wird, um ein aktives Protein zu erhalten, codiert, erhalten. Ist die Sequenz nicht unterbrochen durch Introns, ist sie für die Expression in jedem Wirt geeignet. Sind Introns vorhanden, kann eine Expression erhalten werden in Säuger- oder anderen eukaryotischen Systemen, die fähig sind, diese zu prozessieren. Diese Sequenz sollte in einer ausschneidbaren und wiedergewinnbaren Form vorliegen. Die ausgeschnittene oder wiedergewonnene codierende Sequenz wird in einen replizierenden Expressionsvektor so eingebracht, daß sie arbeitsfähig verbunden ist mit geeigneten Kontrollsequenzen. Der Vektor wird verwendet zum Transformieren eines geeigneten Wirts, und der transformierte Wirt wird unter günstigen Bedingungen kultiviert, um die Produktion des rekombinanten LACI zu bewirken.
Genomische oder cDNA-Fragmente werden erhalten und werden direkt in geeigneten Wirten verwendet. Die Konstruktionen von Expressionsvektoren, die in einer ganzen Reihe von Wirten arbeitsfähig sind, werden unter Verwendung von geeigneten Replikations- und Kontrollsequenzen durchgeführt, wie unten ausgeführt. Geeignete Restriktionsschnittstellen können, falls sie nicht normalerweise verfügbar sind, an die Enden der codierenden Sequenz angefügt werden, um somit ein ausschneidbares Gen für die Insertion in die Vektoren zur Verfügung zu stellen.
Die Kontrollsequenzen, Expressionsvektoren und Transformationsmethoden hängen von dem Typ der Wirtszelle ab, die verwendet wird, um das Gen zu exprimieren. Im allgemeinen sind zur Zeit prokaryotische Zellen, Hefe- oder Säugerzellen als Wirte verwendbar. Wirtssysteme, die fähig sind, ein korrektes post-translationales Prozessieren durchzuführen, werden bevorzugt. Entsprechend werden, obwohl im allgemeinen prokaryotische Wirte die effizientesten und verbreitetsten für die Produktion von rekombinanten Proteinen sind, eukaryotische Zellen, besonders Säugerzellen, wegen ihrer Prozessierungsfähigkeit, beispielsweise der Fähigkeit, die korrekten Glykosilieningsmuster zu bilden, bevorzugt. Zusätzlich gibt es hier eine größere Gewißheit, daß die native Signalsequenz durch die Säugerwirtszelle erkannt wird, wodurch die Sekretion möglich wird und die Reinigung erleichtert wird.

Kontrollsequenzen und entsprechende Wirte

Prokaryoten werden am häufigsten repräsentiert durch verschiedene E. coli-Stämme. Es können jedoch auch andere mikrobielle Stämme verwendet werden, wie Bazillen, beispielsweise Bacillus subtilis verschiedene Arten von Pseudomonas oder andere bakterielle Stämme. In solchen prokaryotischen Systemen werden Plasmidvektoren verwendet, welche Replikationsstellen enthalten, und Kontrollsequenzen, die von Arten stammen, die mit dem Wirt kompatibel sind. Beispielsweise wird E. coli typischerweise transformiert unter Verwendung von Derivaten von pBR322, einem Plasmid, das aus einer E. coli-Art von Bolivar., et al., 1977, Gene, 2 : 95 erhalten wurde. pBR322 enthält Gene für die Ampicillin- und Tetracyclinresistenz und stellt daher zu sätzliche Marker zur Verfügung, die entweder erhalten oder zerstört werden können bei der Konstruktion des gewünschten Vektors. Allgemein verwendete prokaryotische Kontrollsequenzen sind hier so definiert, daß sie Promotoren für die Initiation der Transkription, gegebenenfalls mit einem Operator, zusammen mit Ribosomen-Bindungsstellensequenzen beinhalten, welche solche verbreitet verwendeten Promotoren einschließen, wie die beta-Lactamase (Penicillinase) und Lactose (lac)-Promotorsysteme (Chang, et al., 1977, Nature: 198 : 1056) und das Tryptophan(trp)-Promotorsystem (Goeddel et al., 1980, Nucleic Acids Res., 8 : 4057) und der von λ abstammende PL-Promotor und die N-Gen-Ribosomenbindungsstelle (Shimatake, et al., 1981, Nature, 292 : 128), welche verwendbar gemacht wurden als eine übertragbare Kontrollkassette, wie ausgeführt in U. S. Patent Nr. 4 711 845, erteilt 8. Dezember 1987. Es kann jedoch jedes verfügbare Promotorsystem, welches mit Prokaryoten kompatibel ist, verwendet werden.
Zusätzlich zu Bakterien können auch eukaryotische Mikroorganismen wie Hefe als Wirte verwendet werden. Laborstämme von Saccharomyces cerevisiae, Bäcker-Hefe, werden am häufigsten benutzt, obwohl eine Anzahl anderer Stämme ebenfalls allgemein verfügbar ist. Beispiele für Plasmidvektoren, welche geeignet sind für Expression in Hefe, sind gezeigt in Broach, J. R., 1983, Meth. Enz., 101 : 307, Stinchcomb et al., 1979, Nature, 282 : 39 und Tschempe et al., 1980, Gene, 10 : 157 und Clarke, L., et al., 1983, Meth. Enz., 101 : 300. Die Kontrollsequenzen für Hefevektoren umfassen Promotoren für die Synthese von glykolytischen Enzymen (Hess et al., 1968, J. Adv. Enzyme Reg., 7 : 149, Holland et al., 1978, Biochemistry, 17 : 4900). Zusätzliche Promotoren, die im Fachgebiet bekannt sind, umfassen den Promotor für die 3- Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., 1980, J. Biol. Chem., 255 : 2073) und solche für andere glykolytische Enzyme, wie Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase. Andere Promotoren, die den zusätzlichen Vorteil besitzen, daß die Transkription durch die Wachstumsbedingungen kontrolliert wird, sind Promotorregionen für die Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, saure Phosphatase, abbauende Enzyme, verbunden mit dem Stickstoffmetabolismus, und Enzyme, die verantwortlich sind für für die Verwertung von Maltose und Galactose (Holland, a.a.O.). Es wird ebenso angenommen, daß Terminatorsequenzen am 3'-Ende der codierenden Sequenz wünschenswert sind. Solche Terminatoren werden in der 3'- nichttranslatierten Region, die den codierenden Sequenzen in von Hefe abgeleiteten Genen folgt, gefunden. Viele der gezeigten Vektoren enthalten Kontrollsequenzen, die von dem Plasmid peno46 (Holland, M. J., et al., 1981, J. Biol. Chem., 256 : 1385), welches das Enolasegen enthält, erhalten wurden oder von dem LEU2-Gen, erhalten von Yep13 (Broach, J. et al., 1978, Gene, 8 : 121), es ist jedoch jeder Vektor, der einen hefekompatiblen Promotor, Replikationsursprung und andere Kontrollsequenzen enthält, geeignet.
Es ist natürlich ebenso möglich, Gene, die Polypeptide codieren, in eukaryotischen Wirtszellkulturen, die aus vielzelligen Organismen stammen, zu exprimieren. Siehe z. B. Tissue Culture, 1973, Cruz und Patterson, Hrsg., Academic Press. Verwendbare Wirtszelllinien beinhalten Mäusemyeloma N51, VERO, HeLa-Zellen, Chinesischer Hamster-Ovarien-(CHO)-Zellen, COS, C127, Hep G2, SK Hep, Baculovirus und infizierte Insektenzellen. Die Expressionsvektoren für solche Zellen enthalten normalerweise Promotor- und Kontrollsequenzen, welche mit Säugerzellen kompatibel sind, wie z. B. die häufig verwendeten frühen und späten Promotoren von Simian Virus 40 (SV40) (Fiers, et al., 1978, Nature, 273 : 113) oder andere virale Promotoren, wie solche, die von Polyoma, Adenovirus 2, Rinderpapillomavirus oder Vogel-Sarkomvirus erhalten wurden oder von Immunoglobulinpromotoren oder Hitzeschockpromotoren. Allgemeine Aspekte der Säugerzell-Wirtssystemtransformationen wurden von Axel beschrieben, U. S. Patent Nr. 4 399 216, erteilt am 16. August 1983. Es erscheint heute auch, daß "Verstärker"- Regionen wichtig sind zur Optimierung der Expression; diese sind im allgemeinen Sequenzen, die stromaufwärts von der Promotorregion gefunden werden. Replikationsursprünge können erhalten werden bei Bedarf von viralen Quellen. Die Integration in ein Chromosom ist jedoch ein verbreiteter Mechanismus für die DNA Replikation in Eukaryoten. Pflanzenzellen sind heute ebenfalls als Wirte verfügbar, und Kontrollsequenzen, welche mit Pflanzenzellen kompatibel sind, wie der Nopalin-Synthasepromotor und Polyadenylierungs-Signalsequenzen (Depicker, A., et al., 1982, J. Mol. Appl. Gen., 1 : 561) sind verfügbar. Verfahren und Vektoren für die Transformation von Pflanzenzellen wurden in PCT Publication Nr. WO 85/04899, veröffentlicht am 7. November 1985, offenbart.
Wirtsstämme, die hier zum Clonieren und zur Expression verwendbar sind, sind die folgenden:
Für das Clonieren und das Sequenzieren und für die Expression einer Konstruktion unter Kontrolle der meisten bakteriellen Promotoren: E. coli-Stamm MM294, welcher vom Genetischen Stammsammlungszentrum für E. coli (E. coli Genetic Stock Center) GCSC #6135 erhalten wurde. Für die Expression unter Kontrolle des PLNRBS Promotors kann E. coli-Stamm K12 MC1000 lambda Lysogen, N&sub7;N&sub5;&sub3;cI857 SusP80, ein Stamm, welcher bei der American Type Culture Collection (ATCC 39531) hinterlegt ist, verwendet werden. E. coli DG116, der am 17. April 1987 bei der ATCC hinterlegt wurde (Zugangsnr. 53606), kann ebenso verwendet werden.
Für rekombinante M13-Phagen können E. coli-Stämme, die empfänglich sind für eine Phageninfektion, wie E. coli K12-Stamm DG98, verwendet werden. Der Stamm DG98 wurde bei der ATCC (ATCC 39768) am 13. Juli 1984 hinterlegt.
Säugerexpression kann bewerkstelligt werden in COS-A2-Zellen, COS-7, CV-1, Mäusemyeloma N51, VERO, HeLa-Zellen, Chinesischer Hamster Ovarien-(CHO)-Zellen, COS, C127, Hep G2, SK Hep, Baculovirus und infizierten Insektenzellen. Auf Insektenzellen basierende Expression kann in Spodoptera frugiperda stattfinden.

Transformationen

Abhängig von der verwendeten Wirtszelle wird die Transformation durchgeführt unter Verwendung von Standardtechniken, die für solche Zellen geeignet sind. Die Calciumbehandlung unter Verwendung von Calciumchlorid, wie beschrieben von Cohen, S. N., 1972, PNAS (USA), 69 : 2110, wird bei Prokaryoten oder anderen Zellen, die substantielle Zellwandbarrieren besitzen, verwendet. Die Infektion mit Agrobacterium tumefaciens (Shaw, C. H., et al., 1983, Gene, 23 : 315) wird für bestimmte Pflanzenzellen verwendet. Bei Säugerzellen, die keine solche Zellwände besitzen, wird die Calciumphosphatpräzipitationsmethode von Graham und von der Eb, 1987, Virology, 52 : 546 bevorzugt. Transformationen in Hefe werden entsprechend der Methode von Van Solingen, P. et al., 1977, J. Bact., 130 : 946 und Hsiao, C. L. et al., 1979, PNAS (USA), 76 : 3829 ausgeführt.

Untersuchung von mRNA durch Northern-Blot-Analyse; Untersuchung von cDNA- Banken oder genomischen Banken

RNA wird für die Northern-Blot-Analyse nach Größe durch Flachbett- Agarosegelelektrophorese unter vollständig denaturierenden Bedingungen unter Verwendung von Formaldehyd getrennt, Maniatas, T., et al., 1982, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press, S. 202-203 oder 10 mM Methylquecksilber (CH&sub3;HgOH) (Bailey, J. M., et al., 1976, Anal. Biochem. 70 : 75-85; Shegal, P. B. et al., 1980, Nature, 288 : 95-97) als Denaturierungsmittel. Für Methylquecksilbergele werden 1,5% Gele durch das Schmelzen von Agarose in Laufpuffer (100 mM Borsäure, 6 mM Natriumborat, 10 mM Natriumsulfat, 1 mM EDTA, pH 8,2), Abkühlenlassen auf 60ºC und Hinzufügen von 1/100 Volumen 1 M CH&sub3;HgOH hergestellt. Die RNA wird in 0,5 · Laufpuffer gelöst und durch Inkubation in 10 mM Methylquecksilber für 10 Minuten bei Raumtemperatur denaturiert. Glycerin (20%) und Bromphenolblau (0,05%) werden für das Auftragen der Proben hinzugefügt. Die Proben werden einer Elektrophorese bei 500 bis 600 Volt-h unter Rezirkulation des Puffers unterzogen. Nach der Elektrophorese wird das Gel 40 Minuten in 10 mM 2-Mercaptoethanol gewaschen, um das Methylquecksilber zu entgiften, Northern Blots werden hergestellt, indem die RNA aus dem Gel auf einen Membranfilter übertragen wird.
cDNA-Banken oder genomische Banken werden durchmustert unter Verwendung der Kolonie- oder Plaque-Hybridisierungstechnik. Bakterielle Kolonien oder Phagenplaques werden auf Duplikat Nitrocellulose-Filterpapiere (S&S Typ BA 85) gezogen. Die Plaques bzw. Kolonien werden lysiert und die DNA an den Filter fixiert durch aufeinanderfolgende 5minütige Behandlung mit 500 mM NaOH, 1,5 M NaCl. Die Filter werden zweimal jeweils 5 Minuten mit 5 · Standard-Kochsalzlösung-Citrat (SSC) gewaschen und an der Luft getrocknet und bei 80ºC 2 Stunden gebacken.
Die Gele für den Northern Blot oder die Duplikatfilter für cDNA oder genomisches Durchmustern werden bei 25º bis 42ºC 6 bis 8 Stunden mit 10 ml pro Filter DNA- Hybridisierungspuffer ohne Sonde (0 bis 50% Formamid, 5 bis 6 · SSC, pH 7,0, 5 · Denhardts- Lösung (Polyvinylpyrrolidon, plus Ficoll und Rinderserumalbumin; 1 x = 0,02% jeweils), 20 bis 50 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,0, 0,2% Natriumdodecylsulfat (SDS), 20 ug/ml poly U (bei der Untersuchung von cDNA) und 50 ug/ml denaturierte Lachsspermien-DNA) prähybridisiert.
Die Proben werden dann durch Inkubation bei einer geeigneten Temperatur etwa 24 bis 36 Stunden hybridisiert unter Verwendung des Hybridisierungspuffers, der eine mit Hilfe der Kinase markierte Sonde (bei Oligomeren) enthält. Längere cDNA-Sonden oder genomische Fragmentsonden werden durch Nicktranslation oder Primerextension markiert.
Die Bedingungen sowohl der Prähybridisierung als auch der Hybridisierung hängen von der gewünschten Stringenz ab und variieren beispielsweise mit der Sondenlänge. Typische Bedingungen für relativ lange (z. B. mehr als 30 bis 50 Nukleotide) Sonden beinhalten Temperaturen von 42º bis 55ºC und Hybridisierungspuffer, welche etwa 20% bis 50% Formamid enthalten. Bei niedrigeren Stringenzen, welche für oligomere Sonden von ungefähr 15 Nukleotiden benötigt werden, werden geringere Temperaturen von ungefähr 25º bis 42ºC und geringere Formamidkonzentrationen (0% bis 20%) verwendet. Bei längeren Sonden können die Filter beispielsweise viermal 30 Minuten, jedesmal bei 40º bis 55ºC mit 2 · SSC, 0,2% SDS und 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7, gewaschen werden, dann zweimal mit 0,2 · SSC und 0,2% SDS, luftgetrocknet und autoradiographiert bei -70ºC für 2 bis 3 Tage.
Die Waschbedingungen sind etwas weniger stringent für kürzere Sonden.

Vektorkonstruktion

Die Konstruktion geeigneter Vektoren, die die erforderlichen codierenden und Kontrollsequenzen enthalten, findet unter Verwendung von Standardligations- und Restriktionstechniken statt, die im Fachgebiet sehr gut bekannt sind. Isolierte Plasmide, DNA-Sequenzen oder synthetisierte Oligonukleotide werden geschnitten, mit Anhänger versehen und in der erforderlichen Form religiert.
Sequenzspezifisches Schneiden von DNA wird durch Behandlung mit dem geeigneten Restriktionsenzym (oder den geeigneten Restriktionsenzymen) unter allgemein bekannten Bedingungen durchgeführt unter Beachtung der Besonderheiten, die von den Herstellern dieser kommerziell verfügbaren Restriktionsenzyme spezifiziert werden. Siehe z. B. den Produktkatalog von New England Biolabs. Im allgemeinen wird etwa 1 ug Plasmid oder DNA-Sequenz durch 1 Unit des Enzyms in etwa 20 ul Pufferlösung geschnitten; bei den Beispielen hier wird typischerweise ein Überschuß an Restriktionsenzym verwendet, um die vollständige Umsetzung des DNA-Substrats zu gewährleisten. Inkubationszeiten von etwa 1 bis 2 Stunden bei etwa 37ºC sind angebracht, obwohl Abweichungen davon toleriert werden können. Nach jeder Inkubation wird Protein durch Extraktion mit Phenol/Chloroform entfernt, worauf eine Etherextraktion folgen kann, und die Nukleinsäure wird durch Präzipitation mit Ethanol aus der wäßrigen Fraktion entfernt. Falls gewünscht, kann eine Größentrennung der geschnittenen Fragmente durch Polacrylamidgel oder Agarose-Gelelektrophorese unter Verwendung von Standardverfahren durchgeführt werden. Eine allgemeine Beschreibung der Größentrennung kann in Methods of Enzymology, 1980, 65 : 499-560 gefunden werden.
Die Enden von restringierten Fragmenten können durch eine Behandlung mit dem großen Fragment der E. coli-DNA-Polymerase I (Klenow) in Gegenwart der vier Desoxynukleotidtri phosphate (dNTPs) unter Verwendung von Inkubationszeiten von etwa 15 bis 25 Minuten bei 20º bis 25ºC in 50 mM Dithiothreit (DTT) und 5 bis 10 um dNTPs geglättet werden. Das Klenow-Fragment füllt 5'-klebrige Enden aus, baut aber 3'-vorstehende Einzelstränge ab, auch wenn die vier dNTPs vorhanden sind. Falls nötig, kann eine selektive Reparatur innerhalb der Grenzen, die durch die Natur der klebrigen Enden vorgegeben sind, durchgeführt werden, indem nur eines oder ausgewählte dNTPs vorgelegt werden. Nach der Behandlung mit Klenow- Fragment wird das Gemisch mit Phenol/Chloroform extrahiert, und mit Ethanol präzipitiert. Eine Behandlung mit S1-Nuklease unter geeigneten Bedingungen führt zur Hydrolyse jedes einzelsträngigen Anteils.
Synthetische Oligonukleotide können mit Hilfe der Triester-Methode von Matteucci et al., 1981, J. Am. Chem. Soc., 103 : 3185-3191 oder unter Verwendung von automatisierten Synthesemethoden hergestellt werden. Das Übertragen von Phosphatresten auf Einzelstränge vor dem Reassoziieren oder für das Markieren wird durch die Verwendung eines Überschusses, beispielsweise ungefähr 10 Einheiten Polynukleotidkinase gegenüber 1 nmol Substrat in Gegenwart von 50 mM Tris, pH 7,6, 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT und 1 bis 2 mM ATP erreicht. Wenn das Übertragen von Phosphatresten zur Markierung einer Probe durchgeführt wird, wird das ATP das Phosphorisotop 32 hoher spezifischer Aktivität enthalten.
Ligationen werden in 15 bis 30 ul Volumen unter den folgenden Standardbedingungen und Temperaturen durchgeführt: 20 mM Tris-Cl, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 33 ug/ml Rinderserumalbumin (BSA), 10 mM bis 50 mM NaCl und entweder 40 uM ATP, 0,01 bis 0,02 (Weiss)-Units T4-DNA-Ligase bei 0ºC (für Ligation "klebriger Enden") oder 1 mM ATP, 0,3 bis 0,6 (Weiss)-Units, T4-DNA-Ligase bei 14ºC (für Ligation "glatter Enden"). Ligationen intermolekularer "klebriger Enden" werden normalerweise bei Gesamt-DNA Konzentrationen von 33 bis 100 ug/ml (5 bis 100 nM Gesamtkonzentration an freien Enden) durchgeführt. Intermolekulare Ligationen glatter Enden (normalerweise unter Verwendung eines 10- bis 30fachen molaren Überschusses an Linker) werden bei 1 uM Gesamtkonzentration an freien Enden durchgeführt.
Bei der Vektorkonstruktion unter Verwendung von "Vektorfragmenten" wird das Vektorfragment normalerweise mit bakterieller alkalischer Phosphatase (BAP) behandelt, um 5'- Phosphatreste zu entfernen und die Religation des Vektors zu verhindern. Die Behandlung mit BAP wird bei pH 8 in annäherungsweise 150 mM Tris in Gegenwart von Na²&spplus; und Mg²&spplus; unter Verwendung von etwa 1 Unit BAP pro ug Vektor bei 60ºC für etwa 1 Stunde durchgeführt. Um die Nukleinsäurefragmente wiederzugewinnen, wird das Reaktionsgemisch mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. Alternativ kann die Religation bei Vektoren, die doppelt restringiert wurden, durch zusätzliche Restriktionsenzymeinwirkung auf die unerwünschten Fragmente verhindert werden.

Modifikation von DNA-Sequenzen

Bei Anteilen der Vektoren, die ausgehend von cDNA oder genomischer DNA erhalten wurden, welche Sequenzmodifikationen benötigen, wird die sequenzspezifische primergestützte Mutagenese verwendet. Dies ist heutzutage eine Standardtechnik und wird unter Verwendung eines synthetischen Primeroligonukleotids durchgeführt, welches komplementär zu der zu mutagenisierenden einzelsträngigen Phagen-DNA ist, abgesehen von einer begrenzten Basenfehlpaarung, welche die gewünschte Mutation darstellt. Kurz gesagt, wird das synthetische Oligonukleotid als Primer für die Synthese eines Stranges, der komplementär zur Phagen-DNA ist, verwendet, und die resultierende doppelsträngige DNA wird in ein geeignetes Wirtsbakterium transformiert. Kulturen der transformierten Bakterien werden in Top-Agar ausplattiert, wodurch die Plaquebildung, ausgehend von einzelnen Zellen, die den Phagen tragen, erlaubt wird.
Theoretisch sollten nun 50% der neuen Plaques den Phagen enthalten, der als Einzelstrang die mutierte Form besitzt, und 50% werden die Originalsequenz tragen. Die Plaques werden mit kinasiertem synthetischem Primer bei einer Temperatur, welche Hybridisierung bei einer exakten Übereinstimmung der hybridisierenden Nukleinsäuren erlaubt, bei der aber eine Basenfehlpaarung mit dem Originalstrang ausreichend ist, die Hybridisierung zu verhindern, hybridisiert. Plaques, die mit der Sonde hybridisieren, werden dann gepickt, kultiviert, und die DNA wird isoliert.

Überprüfung der Konstruktion

Bei der Plasmidkonstruktion konnte die Korrektheit der Ligationen überprüft werden, indem zunächst E. coli-Stamm MM294 oder ein anderer geeigneter Wirt mit dem Ligationsansatz transformiert wird. Erfolgreiche Transformanten werden dann selektioniert durch Ampicillin, Tetracyclin oder eine andere antibiotische Resistenz oder unter Verwendung anderer Marker entsprechend der Art der Plasmidkonstruktion, wie es heute standardmäßig in dem Fachgebiet getan wird. Ausgehend von den Transformanten werden dann Plasmide entsprechend der Methode von Clewell, D. B. et al., 1969, PNAS (USA), 62 : 1159 präpariert, unter Umständen gefolgt von Chloramphenikol-Amplifikation (Clewell, D. B., 1972, J. Bacteriol., 110 : 667). Die isolierte DNA wird einer Restriktionsanalyse und/oder einer Sequenzanalyse durch die Didesoxy- Methode von Sanger, F., et al., 1977, PNAS (USA), 74 : 5463 und wie weiter beschrieben von Messing et al., 1981, Nucleic Acids Res., 9 : 309 oder durch die Methode von Maxam et al., 1980, Methods in Enzymology, 65 : 499 unterzogen.

Reinigung von LACI

Zur Reinigung von LACI, welches von Säugerzellen exprimiert wird, können die folgenden Methoden verwendet werden: aufeinanderfolgende Verwendung von Heparin-Sepharose, MonoQ, MonoS und Reverse Phase HPLC-Chromatographie. Siehe Pedersen et al., a.a.O. Novotny et al., 1989, J. of Biological Chemistry, 264 : 18832-18837, Novotny et al., 1991, Blood, 78 : 394400, Wun et al., 1990, J. of Biological Chemistry, 265 : 16096-16101 und Broze et al., 1987, PNAS (USA), 84 : 1886-1890. Diese Referenzen beschreiben verschiedene Methoden zur Reinigung von LACI, welches von Säugerzellen produziert wurde.
Zusätzlich kann LACI in Bakterien, wie E. coli, produziert werden und nachfolgend gereinigt werden. Im allgemeinen können Verfahren, wie sie in den U. S. Patentschriften Nrn. 4 511 502, 4 620 948, 4 929 700, 4 530 787, 4 569 790, 4 572 798 und 4 748 234 gezeigt sind, verwendet werden. Typischerweise wird das heterologe Protein (z. B. LACI) in sogenannten Einschlußkörperchen innerhalb der Bakterien produziert. Zur Isolierung und zur Reinigung des Proteins werden die Zellen lysiert, und die Einschlußkörperchen werden zentrifugiert, um sie von den Zelltrümmern zu trennen (siehe U. S. Patentschrift Nr. 4 748 234 zur Senkung der Ionenstärke des Mediums, um die Reinigung zu erleichtern). Danach werden die Einschlußkörperchen, die LACI enthalten, mindestens einmal (typischerweise in einem reduzierenden Milieu) denaturiert, und das Protein wird in einer geeigneten Pufferlösung für eine geeignete Zeitspanne oxidiert und rückgefaltet. LACI besitzt eine hohe Anzahl von Cysteinresten, und das Verfahren, welches in dem U. S. Patent Nr. 4 929 700 gezeigt ist, sollte auch hier relevant sein, da CSF-1 ebenfalls eine hohe Anzahl von Cysteinresten besitzt. LACI kann aus der Pufferlösung durch verschiedene chromatographische Methoden, wie die oben für das aus Säugerzellen erhaltene LACI erwähnten, gereinigt werden. Zusätzlich können die Verfahren, wie in der U. S. Patentschrift Nr. 4 929 700 gezeigt, verwendet werden.

Zubereitung und Verabreichung

LACI wird in einer Konzentration verabreicht, die therapeutisch wirksam ist, um eine Sepsis, eine akute oder chronische Entzündung und andere Krankheiten, bei denen Cytokine den Gewebefaktor hochregulieren, zu behandeln und zu verhindern. Um dies zu erreichen, wird LACI vorzugsweise intravenös verabreicht. Die Verfahren, eine solche Verabreichung durchzuführen, sind Fachleuten bekannt.
Vor der Verabreichung an Patienten können Formulantien zu LACI hinzugefügt werden. Eine flüssige Formulierung wird bevorzugt. In dem Beispiel unten wurde LACI in 150 mM NaCl und 20 mM NaPO&sub4; bei pH 7,2 formuliert. LACI kann jedoch in unterschiedlichen Konzentrationen oder unter Verwendung unterschiedlicher Formulantien formuliert werden. Beispielsweise können diese Formulantien Öle, Polymere, Vitamine, Kohlenhydrate, Aminosäuren, Salze, Puffer, Albumin, oberflächenaktive Substanzen oder Füllstoffe umfassen. Kohlenhydrate beinhalten vorzugsweise Zucker oder Zuckeralkohole, wie Mono-, Di- oder Polysaccharide, oder wasserlösliche Glucane. Die Saccharide oder Glucane können Fructose, Dextrose, Lactose, Glucose, Mannose, Sorbose, Xylose, Maltose, Saccharose, Dextran, Pullulan, Dextrin, alpha- und beta- Cyclodextrin, lösliche Stärke, Hydroxyethylstärke und Carboxymethylcellulose oder Gemische daraus umfassen. Saccharose wird am meisten bevorzugt. Ein Zuckeralkohol wird als ein C&sub4;-C&sub8;- Kohlenwasserstoff mit einer -OH-Gruppe definiert und beinhaltet Galactitol, Inositol, Mannitol, Xylitol, Sorbitol, Glycerin und Arabitol. Mannitol wird am meisten bevorzugt. Diese oben erwähnten Zucker oder Zuckeralkohole können einzeln oder in Kombination verwendet werden. Es gibt keine feste Begrenzung für die verwendete Menge, solange der Zucker oder der Zuckeralkohol in einer wäßrigen Herstellung löslich ist. Die Zucker- oder Zuckeralkoholkonzentration liegt vorzugsweise zwischen 1,0 Gew./Vol.% und 7,0 Gew./Vol.%, mehr bevorzugt zwischen 2,0 und 6,0 Gew/Vol.%. Aminosäuren umfassen vorzugsweise linksdrehende (L)-Formen von Carnitin, Arginin und Betain; es können jedoch auch andere Aminosäuren zugefügt werden. Polymere umfassen bevorzugt Polyvinylpyrrolidon (PVP) mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht zwischen 2000 und 3000, oder Polyethylenglykol (PEG) mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht zwischen 3000 und 5000. Es wird ebenfalls bevorzugt, einen Puffer in der Zusammensetzung zu verwenden, um pH-Wert-Änderungen in der Lösung vor Lyophilisierung oder nach dem Auflösen möglichst gering zu halten. Praktisch jeder physiologische Puffer kann verwendet werden, aber Citrat-, Phosphat-, Succinat- und Glutamatpuffer oder Mischungen daraus werden bevorzugt. Vorzugsweise liegt die Konzentration von 0,01 bis 0,3 molar. Oberflächenaktive Substanzen, die zu der Formulierung hinzugefügt werden können, sind in den europäischen Patentschriften Nrn. 270 799 und 268 110 gezeigt.
Zusätzlich kann LACI durch eine covalente Bindung an ein Polymer chemisch modifiziert werden, um beispielsweise seine Halbwertszeit im Blutkreislauf zu verlängern. Bevorzugte Polymere und Verfahren, um jene an Peptide zu binden, sind in den U. S. Patentschriften Nrn. 4 766 106, 4 179 337, 4 495 285 und 4 609 546 gezeigt. Bevorzugte Polymere sind polyoxyethylierte Polyole und Polyethylenglykol (PEG). PEG ist in Wasser bei Raumtemperatur löslich und hat die allgemeine Formel: R(O-CH&sub2;-CH&sub2;)nO-R, wobei R ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe, wie eine Alkyl- oder Alkanolgruppe, sein kann. Vorzugsweise besitzt die Schutzgruppe zwischen 1 und 8 Kohlenstoffatome, mehr bevorzugt ist es eine Methylgruppe. Das Symbol n steht für eine positive ganze Zahl, vorzugsweise zwischen 1 und 1000, besonders bevorzugt zwischen 2 und 500. Das PEG besitzt ein bevorzugtes durchschnittliches Molekulargewicht zwischen 1000 und 40.000, besonders bevorzugt zwischen 2000 und 20.000 und am meisten bevorzugt zwischen 3000 und 12.000. PEG besitzt vorzugsweise mindestens eine Hydroxygruppe, besonders bevorzugt besitzt es eine terminale Hydroxygruppe. Diese Hydroxygruppe ist es, welche vorzugsweise aktiviert wird, um mit einer freien Aminogruppe des Inhibitors zu reagieren. Es ist jedoch klar, daß Art und Menge der reaktiven Gruppen variiert werden können, um ein erfindungsgemäßes covalent verbundenes PEG/IL-2 zu erhalten.
Wasserlösliche polyoxyethylierte Polyole sind in der vorliegenden Erfindung ebenso verwendbar. Sie umfassen polyoxyethyliertes Sorbitol, polyoxyethylierte Glucose, polyoxyethyliertes Glycerin (POG) etc. POG ist bevorzugt. Ein Grund dafür ist, daß das Glyceringerüst von polyoxyethyliertem Glycerin dasselbe Gerüst ist, welches natürlicherweise in beispielsweise Tieren und Menschen in Mono-, Di- und Triglyceriden vorkommt. Aus diesem Grund wird diese Verzweigung nicht notwendigerweise im Körper als ein fremdes Mittel angesehen. Das POG besitzt ein bevorzugtes Molekulargewicht in demselben Bereich wie PEG. Die Struktur von POG ist in Knauf et al., 1988, J. Bio. Chem., 263 : 15064-15070 gezeigt, und eine Diskussion von POG/IL-2-Konjugaten kann in der U. S. Patentschrift Nr. 4 766 106 gefunden werden.
Nachdem die flüssige pharmazeutische Zubereitung hergestellt worden ist, wird diese vorzugsweise lyophilisiert, um die Degradation zu verhindern und die Sterilität zu erhalten. Methoden zum Lyophilisieren flüssiger Zubereitungen sind dem Fachmann bekannt. Kurz vor Verwendung kann die Zubereitung in einem sterilen Verdünnungsmittel (z. B. Ringers-Lösung, destilliertes Wasser oder sterile Salzlösung), das zusätzlich Zutaten enthalten kann, wiederaufgelöst werden. Nach Wiederauflösung wird die Zubereitung bevorzugt unter Verwendung dem Fachmann bekannter Methoden Empfängern verabreicht.

Verabreichung an erkrankte Individuen

Wie oben gezeigt, ist LACI verwendbar, um menschliche Patienten mit einer Sepsis oder einem septischen Schock therapeutisch oder prophylaktisch zu behandeln. Im allgemeinen werden Menschen, die eine Sepsis haben, durch hohes Fieber (> 38,5ºC) oder Untertemperatur (< 35,5ºC), niedrigen Blutdruck, hohe Atemfrequenz (> 20 Atemzüge/Minute) und hohen Puls (> 100 Schläge pro Minute), Leukozytose (> 15.000 Zellen/mm³) und Thrombozytopenie (< 100.000 Plättchen/mm³), assoziiert mit einer Bakterieämie, charakterisiert. LACI soll verabreicht werden, sobald der Verdacht einer Sepsis bei einem Patienten auftritt; dies ist der Fall, wenn eine Abnahme an Fibrinogen, welche größer oder gleich 20% ist, oder das Auftreten von Fibrin- Spaltprodukten, ein Anstieg der Temperatur des Patienten und die Diagnose von Leukopenie, Thrombocytopenie und niedrigem Blutdruck, assoziiert mit einer Sepsis, auftritt. Wie ebenso oben bemerkt, ist die bevorzugte Route die intravenöse Verabreichung. Im allgemeinen wird LACI in einer Dosis zwischen 1 ug/kg und 20 mg/kg gegeben, besonders bevorzugt zwischen 20 ug/kg und 10 mg/kg, am meisten bevorzugt zwischen 1 und 7 mg/kg. Vorzugsweise wird es als eine Bolus-Dosis gegeben, um die zirkulierenden Spiegel um das 10- bis 20fache für 4 bis 6 Stunden nach der Bolus-Dosis zu erhöhen. Nach der Bolus-Dosis kann eine kontinuierliche Infusion ebenso verwendet werden. In diesem Falle kann LACI in einer Dosis zwischen 5 und 20 ug/kg/Minute, besonders bevorzugt zwischen 7 und 15 ug/kg/Minute infundiert werden.
LACI kann in Kombination mit anderen Mitteln, die effektiv für die Behandlung der Sepsis sind, gegeben werden. Beispielsweise können folgende Mittel in Kombination mit LACI verabreicht werden: Antibiotika, die die zugrundeliegende bakterielle Infektion behandeln; monoclonale Antikörper, die gegen Bestandteile der bakteriellen Zellwand gerichtet sind; Rezeptoren, die mit Cytokinen, die in den Signalweg der Sepsis involviert sind, komplexieren können; und allgemein jedes Mittel oder Protein, das mit Cytokinen oder Komplementproteinen in dem Signalweg der Sepsis interagieren kann, um deren Effekte zu reduzieren und die Sepsis oder den septischen Schock abzuschwächen.
Antibiotika, die in der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, umfassen solche der allgemeinen Kategorie von: beta-Lactaimringe (Penicillin), Aminozucker mit glykosidischer Bindung (Aminoglykoside), makrozyklische Lactonringe (Makrolide), polyzyklische Derivate von Naphthacencarboxamid (Tetracydine), Nitrobenzolderivate von Dichloressigsäure, Peptide (Bacitracin, Gramicidin und Polymyxin), große Ringe mit konjugiertem Doppelbindungssystem (Polyene), Sulfonamid-Präparate, ausgehend von Sulfanilamid (Sulfonamide), 5-Nitro-2- furanylgruppen (Nitrofurane), Chinoloncarbonsäuren (Nalidixinsäure) und viele andere. Andere Antibiotika und mehr Varianten der oben angegebenen spezifischen Antibiotika können in der Encyclopedia of Chemical Technology, 3. Ausg. Kirk-Othymer (Hrsg.), Bd. 2, Seiten 782-1036 (1978) und Bd. 3, Seiten 1-78, Zinsser, MicroBiology, 17. Ausg. W. Joklik et al., (Hrsg.), Seiten 235-277 (1980) oder Dorlands Illustrated Medical Dictionary, 27. Ausg., W. B. Saunders Company (1988) gefunden werden.
Monoclonale Antikörper, die zusammen mit LACI verabreicht werden können, umfassen die in PCT WO 88/03211, Larrick et al., zu findenden, die "Endotoxine von gramnegativen Bakterien blockierende monoclonale Antikörper" genannt werden. Die Anmeldung offenbart spezifische monoclonale Antikörper, die zur Behandlung einer Sepsis verwendbar sind und die an verschiedene Antigene der bakteriellen Zellwand von E. coli binden. Ein besonders bevorzugter monoclonaler Antikörper ist derjenige, der von der Hybridoma-Zellinie ATCC Nr. HB9431 hergestellt wird.
Andere Mittel, die mit LACI kombiniert werden können, umfassen monoclonale Antikörper, die gegen Cytokine, welche in den Signalweg der Sepsis involviert sind, gerichtet sind, wie monoclonale Antikörper, die gegen IL-6 oder M-CSF gerichtet sind, siehe PCT WO91/08774, und monoclonale Antikörper, die gerichtet sind gegen TNF, siehe Cerami et al., U. S. Patent Nr. 4 603 106, Inhibitoren eines Proteins aus der Zelle, in welcher INF produziert wird, das das reife INF-Prohormon spaltet, siehe PCT WO91/02540, veröffentlicht am 7. März 1991, Kriegler et al., Antagonisten von IL-1, wie in PCT WO91/17249, veröffentlicht am 14. November 1991, Haskill et al., gezeigt, Inhibitoren der IL-6-Cytokinexpression, wie Inhibin, wie in PCT WO91/12334, veröffentlicht am 22. August 1991, Waffen et al., gezeigt, und auf Rezeptoren basierende Inhibitoren verschiedener Cytokine, wie IL-1. Antikörper gegenüber Komplement oder Proteininhibitoren des Komplements, wie CR&sub1;, DAF und MCP, können ebenso verwendet werden.
Im allgemeinen kann LACI für solche Krankheiten nützlich sein, die abhängig von der Hochregulierung des Gewebefaktors, ausgelöst durch INF, IL-1 oder andere Cytokine, auftreten. Beispielsweise wird in den Beispielen unten gezeigt, daß die Verabreichung von LACI die IL-6-Konzentration erniedrigt. Da IL-6 ein Faktor ist der in akute oder chronische Entzündungsvorgänge involviert ist, ist die Verabreichung von LACI bei der Behandlung der Entzündung nützlich. Typische entzündliche Vorgänge, die durch LACI behandelt werden können, beinhalten: Arthritis, septischer Schock, Reperfusionsschädigung, entzündliche Darmerkrankung, akutes Atemnot-Syndrom, Trauma und Brandwunden.
Bei der Behandlung von chronischer oder akuter Entzündung kann LACI auf die gleiche Weise und in einer gleichen Dosierung wie in dem Anti-Sepsis-Verfahren verabreicht werden. Die vorliegende Erfindung wird jetzt illustriert durch die folgenden Beispiele, die besonders vorteilhafte Ausführungsformen darstellen.

Beispiel 1

Produktion von LACI

A. Gealterte Zellen

Humane Nabelschnur-Venen-Endothelzellen (HuVec) wurden in einem Standardgewebekulturmedium ausgesät und aufbewahrt. Sie wurden 32 bis 36 Tage kultiviert, unter zweimaligem Mediumwechsel pro Woche, und das Medium wurde nach 32 Tagen entfernt (sogenanntes konditioniertes Medium oder CM). Das CM enthielt LACI.

B. Induzierte Zellen

Gleichartige HuVec-Zellen wurden in Gewebekulturmedium ausgesät und aufbewahrt für 24 bis 48 Stunden, und dann wurden sie in Kontakt gebracht mit verschiedenen Konzentrationen an Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) für einen Zeitraum von 3 bis 4 Tagen. Das Medium, welches LACI enthielt, wurde entfernt, und TNF-CM genannt.

Beispiel 2

LACI-Inhibition der Sepsis

Der folgende Test wurde erdacht, um die Inhibition der Sepsis durch LACI zu messen. HuVec-Zellen wurden ausgesät und 48 Stunden inkubiert. Bakterielles Lipopolysaccharid (LPS) wurde als Auslöser der Sepsis hinzugefügt. Der Zusatz von LPS war das beste Verfahren, eine Sepsis-ähnliche Antwort, die breiter war als einfache Koagulation, zu stimulieren. Sobald der Auslöser zugefügt wurde, wurde ebenfalls eine Probe hinzugefügt, um deren Effekt auf den LPS-Effekt auf die Endothelzellen zu untersuchen. Die getestete Probe enthielt LACI. Die Zellen wurden 4 bis 5 Stunden inkubiert, und dann wurde Chromozym hinzugefügt. Das Chromozym enthält die Faktoren II, VII, IX und X. Durch dieses erste Verfahren wird die Inhibition der Gewebefaktorinduktion und die Inhibition der Aktivität gemessen. Alternativ zu dem vorliegenden Test, der die Inhibition der Gewebefaktoraktivität mißt, wurde die Probe zusammen mit dem Chromozym hinzugefügt und dann 45 Minuten inkubiert. Die inhibitorische Aktivität von LACI wurde dann gemessen durch Ablesen der optischen Dichte (abhängig von Farbwechseln) in einem Spektralphotometer bei A&sub4;&sub0;&sub5;.
Gealtertes und TNF-induziertes konditioniertes Medium wurde wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Fig. 2 zeigt eine dosisabhängige Inhibition der Gewebefaktoraktivität durch eine Substanz, welche in dem entsprechenden Medium wie in der Figur gezeigt enthalten ist. Die Art der Substanz wurde durch das folgende Experiment identifiziert, welches die Inhibition der auf folgende Weise bestimmten Gewebefaktoraktivität beinhaltete: HuVec-Zellen wurden für den Test präpariert. Eine Zellprobe wurde als Kontrolle nicht behandelt. Eine andere Zellprobe wurde mit LPS induziert, ohne Zusatz irgendeines potentiellen Inhibitors. Nachfolgend wurden sechs unterschiedliche Probeläufe gestartet unter Verwendung von gealtertem und TNFkonditioniertem Medium, welches LACI zusammen mit 0, 10 und 100 mg LACI-Antikörper enthielt. Fig. 3 zeigt das Resultat dieses Experiments. Beispielsweise war Spur 1 (von links) die Kontrolle, und nur sehr wenig Gewebefaktoraktivität wurde nachgewiesen. Die Spur 2 zeigt 100% Gewebefaktoraktivität und Induktion durch den Zusatz von LPS. Die Spuren 3, 4 und 5 zeigen linear anwachsende Mengen an Aktivität (und daher Induktion), abhängig von der Menge des Anti-LACI-Antikörpers. Beispielsweise zeigt die Konzentration 0 (Spur 3), daß sehr wenig Gewebefaktoraktivität nachweisbar war, wodurch der Verdacht nahegelegt wird, daß keine Gewebefaktorinduktion stattfand. Das zeigt, daß LACI die Aktivität des Gewebefaktors, der durch LPS induziert wurde, inhibiert. Die Spuren 4 und 5 zeigen ähnliche Resultate, der Betrag der Gewebefaktoraktivität/Induktion stieg jedoch an, da größere Mengen von LACI durch den Anti- LACI-Antikörper neutralisiert wurden. Die Spuren 6, 7 und 8 (mit TNF-konditioniertem Medium) zeigen ebenso eine nahezu identische Größenordnung der Inhibition der Gewebefaktoraktivität, wie in den Spuren 3, 4 und 5 gezeigt. Um die Identität der Substanz in den konditionierten Medien zu bestätigen, verwendeten wir verschiedene Konzentrationen an hochgradig gereinigtem LACI in Abwesenheit oder in Gegenwart von neutralisierenden Antikörpern. Die Resultate unterstützen die Ergebnisse unter Verwendung von gealterten und TNF-induzierten konditionierten Medien. Siehe Fig. 4.
Diese Daten zeigen, daß LACI Effekte von LPS auf HuVec-Zellen konzentrationsabhängig inhibiert und daß dieser Effekt umgekehrt werden kann durch den Zusatz von unterschiedlichen Konzentrationen an neutralisierenden Antikörpern gegen LACI. Darüberhinaus beweist dieses Modell, daß LACI zur Behandlung von Sepsis verwendet werden kann und daß seine Effekte nicht nur auf seine antikoagulanten Eigenschaften beschränkt sind.

Beispiel 3

Behandlung von humanen Patienten unter Verwendung von LACI

Humane Patienten, die an einer Sepsis erkrankt sind, können unter Verwendung von LACI therapeutisch behandelt werden. Wenn bei den Patienten erhöhte Temperatur, ein Abfall des Blutdrucks, ein Abfall der Zahl der weißen Blutzellen und ein Abfall von 20% an Fibrinogen im Blut auftritt, wird LACI intravenös als Bolus-Dosis von 3 bis 10 mg/kg und als eine Infusion von 10 bis 20 ug/kg/min für 3 bis 4 Stunden verabreicht. Alternativ kann LACI bei einer kontinuierlichen Rate von etwa 10 mg/kg/Minute für 3 Tage oder für 4 Stunden täglich für 3 bis 4 Tage verabreicht werden. Eine antimikrobielle Therapie oder Breitbandantibiotika werden dem Patienten zusammen mit LACI verabreicht.
In der gleichen Weise wird LACI prophylaktisch gegeben.

Beispiel 4

In diesem Experiment wurde hochgradig gereinigtes rekombinantes LACI (6 mg/kg) entweder 30 Minuten oder 4 Stunden nach dem Beginn einer tödlichen intravenösen E. coli- Infusion Pavianen verabreicht. Eine frühe Nachbehandlung mit LACI resultierte in a) einer durchgängigen Überlebensrate von 7 Tagen (5/5 Versuchstiere) mit signifikanter Verbesserung in der Lebensqualität, während die durchschnittliche Überlebenszeit für die Kontrolltiere (5/5) 39,9 Stunden war (keine Überlebenden); b) einer signifikanten Verringerung der Blutgerinnungsantwort und verschiedenen Messungen der Zellschädigung, einhergehend mit einer signifikanten Reduktion pathologischer Prozesse, die in Zielorganen der E. coli-Sepsis, wie Niere, Nebenniere und Lungen, beobachtet wurden. Die Verabreichung von LACI beeinflußte nicht den Abfall im durchschnittlichen systemischen arteriellen Druck, die Anstiege der Atmungs- und Herzgeschwindigkeit oder die Temperaturwechsel, die mit der bakteriellen Infusion einhergehen. E. coli-infizierte Paviane, die mit LACI behandelt wurden, hatten 20fach geringere IL-6-Spiegel als die mit einer phosphatgepufferten Salzlösung behandelten Kontrolltiere. Im Gegensatz zu der frühen 30-Minuten-Behandlung resultierte die Verabreichung von LACI 4 Stunden, d. h. 240 Minuten, nach dem Beginn der bakteriellen Infusion in einer Verlängerung der Überlebenszeit, mit einer 40%igen Verbesserung der Überlebensrate (zwei Überlebende) und einer gewissen Abschwächung der koagulopathischen Antwort, besonders bei Tieren, bei denen die Fibrinogenspiegel oberhalb 10% des Normalwertes zur Zeit der LACI-Verabreichung waren.

Rekombinanter Gewebefaktor-Signalweg-Inhibitor

LACI wurde in der humanen Hepatomazellinie SK Hep exprimiert, wie bei Wun et al., 1992, Thrombosis Haemost., 68 : 54-59 beschrieben. Nachweis bakterieller Endotoxine mit dem Limulus-Amoebozyten-Lysattest, Alna R. Liss, Inc., NY. Das Material wurde unter Verwendung von Standardtechniken gereinigt, um > 95% reine Präparationen bereitzustellen. LACI wurde in 150 mM NaCl und 20 mM NaPO&sub4; (pH 7,2) formuliert, was als Trägerkontrolle diente. Die Endproteinkonzentration in einer LACI-Probe reichte von 2,3 bis 3,7 mg/ml, bestimmt durch die Aminosäurezusammensetzung; und die Endotoxinspiegel reichten von 8 bis 27 Endotoxin- Units pro 15 Milligramm Protein. LACI-Chargen wurden auf biologische Aktivität unter Verwendung eines Gewebefaktor-Inhibitionstests überwacht (Boze et al., Blood (1988) 71 : 335- 343).

Paviane

Männliche und weibliche Papio anubis-Paviane (7,6 ± 2,4 kg) vom Charles River Primatenzentrum (Wilmington, MA) wurden für mindestens 30 Tage in der Tierhaltung des Zentrums für die Gesundheitswissenschaften der Universität von Oklahoma (Oklahoma City, OK) in Quarantäne gehalten. Die Tiere waren frei von Infektionen oder Parasiten und besaßen Hämatokritwerte von ≥ 36%.

Bakterien

Escherichia coli 086:K61H-Organismen (ATCC 33985; Rockville MD) wurden von einer Stuhlprobe am Children's-Memorial-Hospital, Oklahoma City, isoliert. Sie wurden in lyophilisiertem Zustand bei 4ºC nach Wachstum in tryptischem Sojabohnenagar gelagert und wiederaufgelöst und charakterisiert, wie bei Hinshaw et al., J. Trauma (1982), 23 : 361-365 beschrieben.

Tests

Endotoxin-Messung

Endotoxin-Spiegel in LACI-Präparationen und der Trägerpuffer wurden durch den Limulus-Amoebozyten-Lysattest überwacht (Wun et al., Thromb. Haemost. (1992) 68 : 54-59). LPS aus E. coli (B5505; Mallinckrodt, St. Louis, MO) wurden als Standard mitaufgenommen. Die Nachweisgrenze des Tests betrug 10 Endotoxin-Einheiten (E. V.)/ml.

TNF-ELISA

Die TNF-Spiegel im Plasma von Pavianen wurden unter Verwendung eines ELISA, welcher für die Detektion von humanem TNF (Creasey et al., Circ. Shock (1991), 33 : 84-91) entwickelt wurde, gemessen. Ein gereinigter monoclonaler Anti-TNF-Antikörper (24510E11) war an Vertiefungen einer Mikrotiterplatte gebunden (Dynatech Immunolon I, Fisher). Unbesetzte Bindestellen am Plastik wurden dann mit Rinderserumalbumin (BSA) blockiert. Aliquots von Standardkonzentrationen von gereinigtem rekombinantem Human-TNF oder von Pavian- Blutplasmaproben wurden in einem doppelten Ansatz inkubiert. Die ELISA-Platten wurden dann mit einem polyclonalen Affinitäts-gereinigten Kaninchen-Antikörper gegen rekombinanten humanen TNF, an welchen die Meerrettich-Peroxidase (HRP) konjugiert war, und nachfolgend mit O-Phenylendiaminsubstrat als Chromogen inkubiert. Die ELISA-Platten wurden wiederholt mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, pH 7,5) zwischen den aufeinanderfolgenden Inkubationen gewaschen. Die optische Dichte wurde mit einem automatischen Zwei-Wellenlängen-ELISA- Reader bei 490 nm (Bio-Tek Instruments) abgelesen. Die Nachweisgrenze für den Pavian-TNF in diesem Test war 0,5 ng/ml.

IL-6-Bioassay

Die Bioaktivität von IL-6 in Pavianplasma wurde unter Verwendung der 1-6- abhängigen Mäuse-Hybridoma-Zelllinie B9 quantifiziert, unter Verwendung von IL-6, welches kommerziell erhältlich ist bei Amgen, Inc. (Thousand Oaks, CA) als Teststandard (Creasey et al., a.a.O.). Die Nachweisgrenzen für diesen Test waren 10 pg/ml.

LACI-Spiegel

Ein kompetitiver Fluoreszenz-Immunotest wurde für LACI wie von Novotny et al., Blood, 78 : 394-400 beschrieben, verwendet: ein Anti-LACI-IgG aus Kaninchen wurde verwendet um LACI in der zu testenden Probe einzufangen, und FITC-LACI (HepG2) wurde zugefügt, um die Anzahl der verbliebenen Anti-LACI-Bindestellen zu quantifizieren. Standardkurven wurden entwickelt unter Verwendung von Verdünnungen von vereinigtem menschlichem Plasma (George King Biomedical, Overland Park, KS) oder von reinem HepG2-LACI.
Der funktionelle LACI-Test (Gewebefaktor-Inhibitionstest) ist ein dreistufiger Gerinnungstest. Kurz gesagt, wird im ersten Schritt die zu testende Probe mit rohem Hirngewebefaktor, Faktor X, Faktor VII und Calcium inkubiert. Nach 30 Minuten Inkubation wird zusätzlicher Faktor X zugefügt, und 1 Minute später wird Plasma zugefügt, welches Faktor-X-defizient ist, und die Zeit bis zur Blutgerinnung wird in einem Fibrometer gemessen. Die restliche Faktor- VII(a)/Gewebefaktor-Aktivität im zweiten Schritt des Tests ist umgekehrt proportional zu der LACI-Konzentration in der Testprobe. Eine Verlängerung der Gerinnungszeit spiegelt daher einer höhere LACI-Aktivität wider. Standardkurven wurden unter Verwendung von Verdünnungen von reinem HepG2-LACI erstellt.

Pharmakokinetische Analyse

Die Daten für jeden Pavian (ug LACI/ml Plasma bei verschiedenen Probeentnahmezeiten) wurden an ein Zwei-Kompartimenten-Modell angepaßt. Die Modellparameter wurden durch die nichtlinearen Kurvenanpassungsverfahren nach der Methode der kleinsten Fehlerquadrate unter Verwendung des PKDAAS-Datenanalysesystems (entwickelt für VAX-Computer von der Chiron Corporation, hinterlegt bei dem U. S. Copyright Office mit der Registrierungsnr. TXU 416-977) bestimmt. Die korrigierten Konzentrationen zu jedem Zeitpunkt, C(t), wurden als der Kehrwert der Quadratkonzentration gewichtet. Die gewichteten Werte wurden dann an die Kurven der individuellen Untersuchungsobjekte unter Verwendung der folgenden biexponentiellen Gleichung angepaßt:
c(t) = (DOSE/VC)·[(1-B)·2-t/α+B·2-t/β],
wobei t Zeit bedeutet und VC, B, α und β Modellparameter sind. Die Summe der Koeffizienten wurde zu 1,0 normalisiert. Die systemische Ausscheidungsrate (CL) wurde dann errechnet aus:
CL = VC/MRT, wobei
MRT = [(1-B)·α+B·β]1n(2).

Statistische Analyse

Die Daten wurden mit dem t-Test nach Student analysiert, um signifikante Unterschiede (p < 0,05) in Durchschnittswerten zwischen den Gruppen zu gegebenen Zeiten zu bestimmen. Die Varianzanalyse (ANOVA) und der Multivergleichs-Test nach Duncan wurden verwendet, um signifikante Unterschiede zwischen Durchschnittswerten zur Zeit 0 und nachfolgenden Zeiten unter den Gruppen zu bestimmen. Der Richtigkeits-Test nach Fisher wurde verwendet, um signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen hinsichtlich der Überlebensraten zu bestimmen.

Pharmakokinetische Studien

Um die geeignete LACI-Dosierung im Rahmen des E. coli-septischen Schock-Modells zu ermitteln, führten wir eine pharmakokinetische Studie bei drei gesunden Pavianen durch. Fig. 5 zeigt, daß LACI, wenn es als ein Bolus von 0,5 mg/kg gegeben wurde, eine zweiphasige Halbwertszeit zeigte; eine alpha-Phase von etwa zwei Minuten und eine beta-Phase von ungefähr zwei Stunden. Diese Daten wurden dann, wie oben beschrieben, in ein Modell überführt, um die nötige LACI-Dosierung zu bestimmen, um eine LACI-Konzentration im Serum des Blutkreislaufs von 2 ug/ml zu erreichen, welches willkürlich als die gewünschte LACI-Blutkonzentration definiert wurde, da berichtet wurde, daß die endogenen Spiegel von LACI bei Primaten ungefähr 0,1 ug/ml sind (Novotny et al., J. Biol. Chem. (1989), 264 : 18832-18837). Um einen 20fachen Anstieg in den LACI-Serumkonzentrationen bei den Pavianen zu erhalten, gaben wir daher LACI mit einer Ladedosierung von 700 ug/kg und einer Erhaltungsdosierung von 10 ug/kg/min (d. h. eine Gesamtdosis von 6000 ug/kg), wobei die Dosierung gleichzeitig durchgeführt wurde, und zwar 30 Minuten nach dem Beginn der E. coli-Infusion.

Experimentelle Verfahren und Infusionsverfahren

Jeder Pavian wurde mit Ketaminhydrochlorid immobilisiert, wobei am Morgen der Studie 14 mg/kg intramuskulär gegeben wurden, und dann wurde langsam anästhesiert mit Natriumpentobarbital (~ 9 mg/kg) mittels eines perkutanen Katheters, welcher in der Kopfvene plaziert war, wie von Hinshaw et al., J. Surg. Res. (1989) 28 : 151-170 beschrieben. Die Tiere wurden mit isotonischer Kochsalzlösung bei einer Rate von 3,3 ml/kg/h 12 Stunden über die Armvene 30 bzw. 240 Minuten nach Gabe der Bakterien infundiert, um unmerklichen Flüssigkeitsverlust auszugleichen. LACI wurde mit einer Ladedosis von 700 ug/kg 15 Minuten und einer kontinuierlichen Infusion von LACI bei einer Rate von 10 ug/kg/min für weitere 525 Minuten (gezählt vom Beginn der Bakterieninfusion, welche als Zeitpunkt Null definiert war) gegeben. Um jedem Pavian die gleiche Gesamt-LACI-Dosis zu verabreichen, erhielten die Tiere, die bei +240 Minuten behandelt wurden, eine Ladedosis von 2,8 ug/kg 15 Minuten und gleichzeitig eine kontinuierliche Infusion von LAU bei einer Rate von 10 ug/kg/min für 480 min.
E. coli-086:K61H wurde verwendet, um tryptischen Sojabohnen-Wachstumsagar zu inokulieren, und die Lebendkeimzahlbestimmung des Inokulums wurden mittels Standardverdünnungstechniken durchgeführt. Am Zeitpunkt Null erhielten die Paviane eine Infusion von ≥ 4,5 · 10¹&sup0; lebenden Bakterien pro kg Körpergewicht (4 ml/kg), welche durch einen perkutanen Katheter in die rechte Kopfvene 2 Stunden durch kontinuierliche Infusion verabreicht wurden.
In die femorale Arterie und eine femorale Vene wurde aseptisch eine Kanüle eingeführt, um den durchschnittlichen systemischen arteriellen Blutdruck zu messen, Blutproben zu erhalten und zur Gabe von Antibiotika. Am Ende der E. coli-Infusion wurde Gentamycin gegeben (9 mg/kg i.v.), d. h. bei T + 120 für 30 Minuten und dann 4,5 mg/kg bei T + 360 und T + 540 Minuten für 30 min. Gentamycin (4,5 mg/kg IM) wurde dann am Ende des Experimentes und einmal täglich für 3 Tage gegeben.
Die Tiere wurden weiterhin anästhesiert gehalten und kontinuierlich 12 Stunden beobachtet. Blutproben wurden für die Hämatologie, die klinische Chemie und Bestimmungen von Cytokinen (TNF, IL-6) und LACI-Bestimmungen stündlich entnommen. In gleicher Weise wurden die Atmungsrate, der Puls, der durchschnittliche systemische arterielle Druck und die Temperatur stündlich überwacht. Die Tiere wurden die ersten 30 Stunden des Experiments kontinuierlich beobachtet. Tiere, die 7 Tage überlebten, wurden als dauerhaft Überlebende eingeordnet und nachfolgend mit Pentobarbitalnatrium für die Autopsie am 8. Tag eingeschläfert.
Zehn Pavianen (5 LACI-Behandelte und 5 Trägerkontrollen) wurden intravenös 2 Stunden lang lethale Infusionen von E. coli verabreicht. Tabelle 1 zeigt, daß LACI fünf von fünf E. coli-behandelten Pavianen rettete, die dauerhaft Überlebende wurden. Die durchschnittliche E. coli-Dosierung der LACI-behandelten Paviane war 5,7 · 10¹&sup0; CFU/kg, und alle Tiere überlebten länger als 7 Tage. Die durchschnittliche E. coli-Dosierung der Trägerkontrollgruppe war 5,5 · 10¹&sup0; CFU/kg, und die durchschnittliche Überlebenszeit war 39,9 Stunden (Tabelle 1). Das durchschnittliche Gewicht der Trägerkontrollgruppe war 8,4 kg (Bereich 5,9 bis 12,1 kg) und das der LACI-behandelten war 6,8 kg (Bereich 5,2 bis 8,0 kg). Die Trägerkontrollgruppe bestand aus zwei Weibchen und drei Männchen, während die LACI-behandelte Gruppe aus fünf Männchen bestand. Es gab keine Unterschiede in der mittleren E. coli-Dosis, welche jeder Gruppe gegeben wurde (p > 0,05) oder in den Gewichten der Tiere (p > 0,05).
Die LACI-behandelten Paviane bewegten sich energiegeladen in ihrem Käfig, verbrauchten Futter und Wasser in normaler Weise während der 24 Stunden, in denen sie eine lethale E. coli-(LD&sub1;&sub0;&sub0;)-Dosis erhielten. Die Trägerkontrollgruppen-Paviane waren jedoch sehr lethargisch, schienen Schwierigkeiten beim Atmen zu haben und zeigten eine multiple Petechie an ihren Körpern, einem Hinweis auf DIC in dem dermalen Mikrokapillarsystem.

Blutgerinnung und hämatologische Antworten auf die LACI-Gabe bei + 30 Minuten

Um zu untersuchen, mit welchen Mechanismen LACI die bakteriell infizierten Affen schützte, maßen wir ausgewählte physiologische Parameter, die mit der Blutgerinnung, der klinischen Chemie und der Entzündungsantwort assoziiert sind. Fig. 6 zeigt, daß viele der Koagulopathien, die mit der bakteriellen Infektion assoziiert sind, bei LACI-behandelten Pavianen inhibiert und/oder abgeschwächt waren. Die Fibrinogenspiegel bei den Trägerkontrolltieren fielen in 3 Stunden um etwa 80%, während bei den LACI-behandelten Affen nur ein Abfall von 20% (p < 0,0001) auftrat. Gleichermaßen war ein Anstieg an Fibrin-Abbauprodukten bei 240 und 720 Minuten als Anzeichen für einen Fibrinogenverbrauch bei den LACI-behandelten Tieren, verglichen mit den Kontrollen (p < 0,05) nicht evident.
Die aktivierte partielle Thromboplastin-Zeit (APTT) und die Prothrombin-Zeit (PT) war bei Zeitpunkten später als 4 Stunden bei den Trägerkontrollen extrem verlängert (Fig. 6). Zu den Zeitpunkten 4 bzw. 12 Stunden stieg die ATPP von 37 auf 208 und dann auf 226 Sekunden und die PT von 14 auf 58 und dann auf 137 Sekunden an. Im Gegensatz dazu stieg die APTT bei LACI-behandelten Pavianen (p < 0,05) von 32 auf 45 bis 60 Sekunden nach 4 bzw. 12 Stunden an, und die PT stieg von 15 auf 18 Sekunden bis 22 Sekunden nach 4 bzw. 12 Stunden.
Ein gradueller Abfall der Plättchenkonzentration wurde bei den Trägerkontrollen und bei den LACI-behandelten Pavianen für die gesamte 12-Stunden-Beobachtungsperiode beobachtet. (Fig. 6). Die LACI-Behandlung verzögerte jedoch den Abfall, und ist am deutlichsten bei Zeitpunkten ≥ 4 Stunden. Die durchschnittliche Plättchenkonzentration der Kontrollgruppe zum Zeitpunkt 4, 6 und 12 Stunden waren 102,8 ± 26, 69 ± 20 und 43 ± 5,0. Im Gegensatz dazu war die durchschnittliche Plättchenkonzentration der LACI-behandelten Gruppe zu denselben Zeitpunkten 249 ± 44, 236 ± 35 bzw. 153 ± 31.
Obwohl bei den LACI-behandelten Plasmaproben keine sichtbare Hämolyse auftrat, fiel der Hämatokrit mit der Zeit ab und war nach 12 Stunden niedriger in der experimentellen (behandelten) Gruppe, 36 ± 2%, verglichen mit der Kontrollgruppe, 44 ± 2% (p < 0,05). Darüberhinaus war der durchschnittliche 7-Tages-Hämatokrit-Wert der Überlebenden, verglichen mit dem Basiswert ebenso niedrig: 28 ± 1%, versus 42 ± 0%.
In Übereinstimmung mit den Resultaten der Hämatokrit-Untersuchung fiel die Konzentration der roten Blutzellen im Verlauf der ersten 12 Stunden sowohl in der Kontrolle (4,94 ± 0,21 bis 4,4 ± 0,11) und den LACI-behandelten Gruppen (5,20 ± 0,10 bis 4,88 ± 0,17) nur leicht ab, und bei den Überlebenden wurde eine geringe (3,42 ± 0,2 · 10&sup6;) Konzentration an roten Blutkörperchen beobachtet.
Eine Leukopenie trat bei der LACI-behandelten und der Kontrollgruppe in demselben Umfang auf, die niedrigsten Werte (~1,48 · 10³/ul) wurden zum Zeitpunkt 2 Stunden aufgezeichnet; die Konzentration an weißen Blutzellen war jedoch nach 7 Tagen bei den Überlebenden mit einem Durchschnittswert von 19,2 ± 3,5, verglichen mit dem Basiswert von 9,0 ± 1,5 · 10³/ul erhöht.

Klinische Antworten auf die LACI-Verabreichung nach +30 Minuten

Atmungs- und Herzrate stiegen bei beiden Gruppen an. Die Atmungsrate stieg nach dem Beginn der bakteriellen Infusion an und blieb während der 12-Stunden-Periode erhöht. In ähnlicher Weise stieg die Herzrate dramatisch von 120 Schlägen/min auf 200 Schläge/min innerhalb der ersten zwei Stunden der E. coli-Infusion an und verblieb erhöht während der 12 Stunden.
Der durchschnittliche systolische arterielle Druck (MSAP) und die Temperatur fielen bei LACI-behandelten und Kontrollgruppen in gleicher Weise ab. Eine dramatische Abnahme des MSAP wurde am Ende der bakteriellen Infusion beobachtet. MSAP nahm von 107 ± 5 mm Hg auf 69 ± 5 nach zwei Stunden ab und stieg dann allmählich auf 93 ± 11 nach 10 bis 12 Stunden in der Kontrollgruppe wieder an. In ähnlicher Weise fiel MSAP von 115 ± 9 auf 74 ± 3 nach 2 Stunden ab und stieg auf 85 ± 7 nach 6 bis 12 Stunden wieder an. Die zehn Paviane zeigten eine abfallende Temperaturantwort auf die E. coli-Infusion. Der Durchschnittswert der Temperatur der Trägerkontrolle war bei Beginn des Experimentes 37,3 ± 0,1ºC und fiel langsam auf 34,7 ± 2,2ºC nach 12 Stunden ab. Der Durchschnittswert der Temperatur der LACI-behandelten Gruppe war anfänglich 37,0 ± 0,3ºC und änderte sich über die 12 Stunden nur minimal, wonach er 36,9 ± 0,2ºC betrug.

Blutchemie

Tabelle 2 faßt die klinische Chemie der E. coli-infizierten und behandelten Affen zusammen. Nach 12 Stunden wurden Anstiege bei Serumcreatinin, Gesamtbilirubin, Harnsäure, Milchsäure, Triglyceriden, Anionenlücke (anion gap), Chlorid und Natrium gemessen. Die Größenordnungen der Anstiege waren jedoch bei den LACI-behandelten Tieren geringer als bei den Trägerkontrollen (p < 0,05). Bei den folgenden Parametern wurden Konzentrationsänderungen beobachtet: Albumin, alkalische Phosphatase, AST, BUN, Calcium, Cholesterin, CK, Kohlendioxid, Hydrocortison, Kalium, Milchsäuredehydrogenase, Phosphat, SGPT und Gesamtprotein. Die Zu- oder Abnahmen der Konzentration wurden durch die LACI-Behandlung (p > 0,05) nicht beeinflußt. Die durchschnittliche Konzentration an Albumin, Harnstoffstickstoff (BUN) und Lactat kehrten jedoch bei den LACI-behandelten Tieren (d. h. den Überlebenden) nach 7 Tagen nicht zu den Basiswerten zurück. Besonders waren die Albuminkonzentrationen 2,7 ± 0,2 nach 7 Tagen, verglichen mit 3,7 ± 0,1 zu Beginn des Experiments. Albumin wurde daher um etwa 25% reduziert. In gleicher Weise waren die Serumwerte von Harnstoffstickstoff (BUN) nach 7 Tagen 13,8 ± 2,1 gegenüber von 29,6 ± 3,9 zu Beginn des Experimentes. Schließlich stiegen die Lactatwerte um ungefähr das 3fache bei den Überlebenden an. Der durchschnittliche Lactat- Basiswert war bei diesen Tieren 1,7 ± 0,5 mÄq/L zu Beginn der Prozedur und stieg auf 5,7 ± 1,2 mÄq/L nach 7 Tagen.
Ein Anstieg der Glucosekonzentration wurde bei beiden Gruppen (p < 0,05) innerhalb 2 Stunden beobachtet. Die Durchschnittswerte fielen allmählich unter den anfänglichen Anstieg ab, blieben aber durchgängig bei den LACI-behandelten Tieren (p < 0,05) bis zum Zeitpunkt 12 Stunden höher. Anstiege im arteriellen pH-Wert traten bei beiden Gruppen auf.

TNF- und IL-6-Spiegel

Die Plasma-TNF-Konzentrationen waren sowohl bei der Trägergruppe als auch bei den LACI-behandelten Pavianen erhöht. In Übereinstimmung mit unseren früheren Studien (Creasey et al., Circ. Shock (1991) 33 : 84-91) waren die Spitzen-TNF-Spiegel bei 120 Minuten, d. h. am Ende der E. coli-Infusion. Die LACI-Behandlung erschien weder den Anstieg der Serum-TNF- Konzentration noch die Kinetik von dessen Freisetzung zu beeinflussen (Tabelle 3). Die Plasma- IL-6-Konzentrationen stiegen über die Zeit in der Trägerkontrollgruppe ebenso an, wobei die IL-6-Spiegel bei 26 bis 39 Picogramm begannen und auf 100 bis 200 Nanogramm später als vier Stunden anstiegen (Tabelle 4). Interessanterweise waren die Plasma-IL-6-Konzentrationen bei den LACI-behandelten Tieren geringer als bei der Kontrollgruppe, besonders bei und nach vier Stunden. Die IL-6-Konzentrationen waren nach 12 Stunden bei den LACI-Behandelten ungefähr 20fach geringer als bei den Trägerkontrollen (p < 0,05).

Verabreichung von LACI bei +240 Minuten

Um die Zeit zu bestimmen, nach der LACI nicht länger effektiv ist, den E. coli-Schock abzuschwächen, zögerten wir die Gabe von LACI zwei Stunden über das Ende der bakteriellen Infusion hinaus. Der Fibrinogenverbrauch und die Bildung von Fibrin-Abbauprodukten sollte nach vier Stunden offensichtlich sein. Tabelle 5 zeigt, daß die durchschnittliche. E. coli- Dosierung der Trägerkontrollgruppe bei dieser Reihe von Experimenten 5,68 (± 2,6) · 10¹&sup0; CFU/kg und die durchschnittliche Überlebenszeit 28,2 ± 9,6 Stunden betragen. Die durchschnittliche E. coli-Dosierung der LACI-Gruppe war 5,43 (± 0,19) · 10¹&sup0; CFU/kg und die durchschnittliche Überlebenszeit betrug 99 ±29 Stunden. Zwei der fünf LACI-behandelten Tiere überlebten nach 7 Tagen (p < 0,05). Es gab keine Unterschiede in dem durchschnittlichen Gewicht oder in der E. coli-Dosierung, welche den oben genannten Gruppen gegeben wurde (p > 0,05).

Biologische und biochemische Effekte der Gabe von LACI bei +240 Minuten

Die Gabe von LACI zwei Stunden nach dem Ende der zweistündigen bakteriellen Infusion bewirkte eine leichte Abschwächung der koagulopathischen Antwort, gezeigt durch einen Abfall der FDP-Spiegel und der Prothrombin-Zeit nach 12 Stunden. In Übereinstimmung mit dem Zeitpunkt +30 Minuten waren die IL-6-Spiegel bei den LACI-behandelten Pavianen 2fach niedriger als bei ihren Trägerkontrollpartnern nach 12 Stunden. Signifikante Unterschiede in der Fibrinogenkonzentration, APTT und Plättchenkonzentration traten zwischen der Trägerkontrolle und den LACI-behandelten Pavianen nach 12 Stunden nicht auf. Die Fibrinogen-Spiegel am Tag 7 waren bei den zwei Tieren, die überlebten, jedoch leicht erhöht; FDP-, APTT- und PT-Werte waren fast wieder normal, während die Plättchenkonzentration bei einem Tier normal (435) war und niedriger bei dem anderen Tier (97).
Obwohl die Zahl der roten Blutkörperchen und der Hämatokrit über die Zeit bei beiden Gruppen während der ersten 12 Stunden leicht schwankte, besaßen die beiden Überlebenden am Tag 7 einen niedrigeren Hämatokrit (35 und 19%), verglichen mit dem Beginn der Prozedur (43 und 41%). In gleicher Weise war die Konzentration der roten Blutkörperchen 4,0 und 2,7 · 10&sup6;/mm³ am Tag 7, gegenüber von 4,7 und 4,5 · 10&sup6;/mm³ am Tag 0.
Die klinische Chemie für die zehn Paviane der Plus-4-Stunden-Studie wurde in gleicher Weise gemessen wie die Plus-30-Minuten-Studie. Es wurden minimale Unterschiede zwischen der Trägerkontrolle und den LACI-behandelten Pavianen nach 12 Stunden beobachtet. In Übereinstimmung mit der Plus-30-Minuten-Studie waren die Lactat-Spiegel bei den LACI- behandelten jedoch höher als bei den Kontrollen (p < 0,05) nach 12 Stunden und blieben bei den beiden, die 7 Tage überlebten, erhöht (13,2 und 4,0 mg/dl gegenüber 0,5 und 0,6 mg/dl zum Zeitpunkt 0). Im Gegensatz dazu waren die Harnsäurespiegel bei der LACI-behandelten Gruppe leicht niedriger als bei den Kontrollen nach 12 Stunden und kehrten bei den zwei LACI- behandelten Überlebenden auf normale Werte zurück.
Ähnlich wie bei der Plus-30-Minuten-Studie zeigten alle nach 240 Minuten behandelten Tiere Leukopenie und einen graduellen, aber geringen Anstieg in der Anzahl WBC über die 12 Stunden. Außerdem hatten die zwei 7 Tage überlebenden LACI-behandelten Paviane erhöhte WBC-Werte (12,5 und 21,8 · 10³ Zellen/mm³) am Tag 7, verglichen mit 5,1 und 8,0 · 10³ Zellen/mm³ zum Zeitpunkt Null; dieser Trend entspricht dem, der bei den nach 30 Minuten mit LACI-behandelten überlebenden Pavianen auftrat.

Pathologische Ergebnisse

Post-mortem-Untersuchungen wurden an allen Pavianen durchgeführt. Die Tiere wurden in den ersten 36 Stunden kontinuierlich überwacht; daher wurden die Gewebe zur Analyse innerhalb von Minuten nach dem Tod entnommen, wodurch post-mortem-autolytische Veränderungen vermieden werden konnten. Lunge, Leber, Nebennieren, Nieren, Milz und Gallenblase waren Zielorgane der bakteriellen E. coli-Infusion. Besonders Tiere, die Träger + E. coli erhielten, litten an schweren Stauungszuständen, Blutungen, Fibrinablagerung, Ödemen und einer massiven Akkumulation von Leukozyten in der Lunge und Leber, einer schweren Stauung in den medulären Sinusoiden der Milz und einer deutlichen Evidenz für eine tubuläre Nekrose und Thrombose in den Nieren und eine schwere kortikale Stauung in den Nebennieren. Organe, die durch E. coli nicht beeinflußt wurden, waren Magen, Herz, Pankreas und Dünn- und Dickdarm. LACI schützte die Leber, die Nebennieren, die Niere, die Milz und die Gallenblase, in welchen nur schwache oder gar keine pathologische Erscheinungen beobachtet wurden. Der Grad des Schut zes war in den Lungen leicht vermindert, in denen eine moderate vaskuläre Stauung und eine geringe Leukozytenakkumulation beobachtet wurde.
Die Resultate der vorliegenden Studie zeigen, daß LACI einhundert Prozent der Paviane, die eine LD&sub1;&sub0;&sub0;-Dosis E. coli erhielten, rettete, wenn das LACI 30 Minuten nach dem Beginn der bakteriellen Infusion verabreicht wurde, und wenn bereits mehr als 1 · 10¹&sup0; Organismen/kg in das Blut der Paviane eingeschleust worden waren. Zusätzlich rettete LACI vierzig Prozent der Paviane, wenn es 2 Stunden nach dem Ende der bakteriellen Infusion, d. h. wenn mehr als 5 · 10¹&sup0; Organismen/kg infundiert worden waren und viele der Abwehrmechanismen der Paviane 2 Stunden lang ausgelöst worden waren, gegeben wurde.
Die TNF-Spiegel erreichten zum Ende der E. coli-Infusion, d. h. nach 2 Stunden, einen Spitzenwert, während IL-1β- und IL-6-Spiegel zu erscheinen begannen (Creasey et al., Circ. Shock (1991), 33 : 84-91); der Abfall und Verbrauch von Fibrinogen und die Bildung von Fibrin- Abbauprodukten wurde zwischen 3 und 4 Stunden einfacher zu detektieren (De Boer, J. P. et al., Circ. Shock (im Druck 1992)). Diese Studie zeigt, daß LACI den Verbrauch von Fibrinogen verhindern, verlangsamen und sogar umkehren konnte, wenn LAU zu einem so späten Zeitpunkt wie 4 Stunden nach dem Beginn einer lethalen bakteriellen Infusion gegeben wird.
Zusätzlich zum Abschwächen der Koagulation schwächte LACI den Grad der Zellschädigung (Creatinin, Harnsäure, Milchsäure) und der metabolischen Azidose (Anionen-Lücke, Chlorid und Natrium), welche bei den Kontrollen so eindeutig evident waren. In Übereinstimmung mit den verringerten Serum-Spiegeln vieler dieser Marker von Hypoxie, Azidose und Zellschädigung, gewährleistete LACI einen bemerkenswerten morphologischen Schutz der Nieren, Nebennieren, Leber, Milz und der Lungen vor pathologischen Veränderungen. Die Effizienz von LACI bei Pavianen, die einer tödlichem E. coli-Dosierung ausgesetzt wurden, zeigt, daß der gram-negative Schock eine akute entzündliche Erkrankung des vaskulären Endothels ist und daß durch vorübergehendes Schützen des Endothels vor Schädigungen, die mit den gramnegativen Bakterien einhergehen, eine signifikante Verbesserung erreicht wird.
Unsere vorherigen Studien zeigten, daß innerhalb der ersten 30 Minuten der bakteriellen Infusion die PMN Leukozytenkonzentration in der Blutzirkulation scharf abfiel (Taylor et al., Colloquium Mosbach Molecular Aspects of Inflammation (1991) Springer Verlag, Berlin Heidelberg, S. 277-288) und daß Thrombin-Antithrombin(TAT)-Komplexe, Gewebeplasminogenaktivator/Plasminogenaktivatorinhibitor (t-PA/PAI) und Plasmin-Anti-Plasmin(PAP)-Komplexe zu erscheinen begannen (De Boer, J. P. et al., Circ. Shock (1992) (im Druck)) und die Aktivierung der Komplementkaskade war bei einer lethalen E. coli-Dosierung klar evident (De Boer, J. P., im Druck). Die LACI-Behandlung resultierte in einer Verhinderung der tubulären Nekrose und der glomerulären Thrombose in den Nieren; der kortikalen Stauung, Blutung, Nekrose und Leukozyten-Akkumulation in den Nebennieren; der Verhinderung der vaskulären Stauung und Akkumulation von Leukozyten in der Leber; der Verhinderung der medullären Stauung, Blutung und Nekrose in der Milz; und der Fibrin-Thrombin-Ablagerung und Ödembildung in der Lunge.
LACI milderte den Einstrom der Leukozyten und die vaskuläre Stauung in den Lungen in signifikanter Weise. Die zwei Paviane, die LACI nach 4 Stunden erhielten und 7 Tage überlebten, zeigten eine sehr ähnliche Prävention von pathologischen Veränderungen wie die oben beschriebenen. Es traten jedoch milde Formen von Ödemen in den Lungen auf, und es war Fibrin in den Alveolar-Säckchen der Lunge zusammen mit einer moderaten Leukozyten-Akkumulation und vaskulären Stauung vorhanden. Es gab keine Evidenz für ein multiples Organversagen bei irgendeinem der LACI-behandelten Paviane, die 7 Tage überlebten. Der Grad dieses Schutzes ist bemerkenswert und unerwartet, zieht man die verzögerte Gabe von LACI und die massive bakterielle Belastung, der die Paviane ausgesetzt waren, in Betracht.
Die LACI-Behandelten und E. coli-Belasteten, 7 Tage Überlebenden zeigten eine geringere Konzentration roter Blutzellen und einen Anstieg der Leukozyten-Konzentration. Die histologische Untersuchung zeigte keine Blutung in irgendwelchen Geweben. Der niedrige Hämatokrit kann daher entweder der Blutverdünnung oder der langsamen Bildung von Erythrozyten in dem Knochenmark zugeschrieben werden. LACI-Toxikologiestudien mit nichtinfizierten Pavianen können daher zur Aufklärung dieses Sachverhalts nötig sein.
Die verminderten IL-6-Spiegel, die in den E. coli-belasteten und LACI-behandelten Pavianen in der vorliegenden Studie beobachtet wurden, waren unerwartet und legen es nahe, daß LACI entweder direkt oder indirekt auf die Entzüngsantwort wirkt. Zusätzlich zu seiner antikoagulanten Aktivität ist auch eine physiologische Rolle des LACI bei der Modulation der Interaktion des Blutgerinnungsweges mit verschiedenen Bestandteilen des Immunsystems nützlich. Tabelle 1 Gewicht, Geschlecht, E. coli-Dosis und Überlebenszeiten von Kontroll- und LACI*-behandelten Pavianen bei +30 min**
* LACI: Gewebefaktor-Signalweg-Inhibitor
** LACI wurde 30 min nach dem Beginn einer 2stündigen E. coli-Infusion verabreicht Tabelle 2 Zusammenfassung der klinischen Chemie von LACI-behandelten und Kontroll-Pavianen bei +30 min **
* LACI = Gewebefaktor-Signalweg-Inhibitor
** LACI wurde 30 min nach Beginn einer 2stündigen E. coli-Infusion gegeben Tabelle 3 Individuelle Tier-IL-6-Spiegel (ng/ml) LACI-Gabe bei + 30 min
NT = nicht getestet Tabelle 4 Gewicht, Geschlecht, E. coli-Dosis und Überlebenszeiten von Kontroll- und LACI*-behandelten Pavianen bei +240 min**
* LACI = Gewebefaktor-Signalweg-Inhibitor
** 240 min nach dem Beginn einer 2stündigen Infusion von E. coli

Claims

1. Verwendung des Lipoprotein-assoziierten-Koagulations- Inhibitors (LACI) oder eines Fragments oder Hybrids davon mit beibehaltener anti-inflammatorischer Aktivität zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in einem prophylaktischen oder therapeutischen Verfahren zur Behandlung einer akuten oder chronischen Entzündung.

2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die akute oder chronische Entzündung eine Sepsis oder ein septischer Schock ist.

3. Verwendung nach Anspruch 2 von LACI und einem zusätzlichen Mittel zur Herstellung eines kombinierten Medikaments zur Verwendung bei der Behandlung einer Sepsis.

4. Verwendung nach Anspruch 3, wobei das zusätzliche Mittel ein Antibiotikum, ein monoclonaler Antikörper, ein Cytokin oder ein Komplement-Inhibitor ist.

5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei LACI chemisch mit einem Polymer konjugiert ist, das im wesentlichen aus Polyethylenglykol (PEG) oder polyoxyethyliertem Glycerin (POG) zusammengesetzt ist.

6. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei LACI in einer Menge vorhanden ist, mit der eine Dosis zwischen 1 ug/kg und 20 ug/kg bereitgestellt werden kann.

7. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei LACI in einer Form vorliegt, die geeignet ist für eine Verabreichung als eine Bolus-Dosis oder eine kontinuierliche Infusion.