DE69524574T2

DE69524574T2 - Enzymatische spaltung von substituierter 2-methylpropionsäure

Info

Publication number: DE69524574T2
Application number: DE69524574T
Authority: DE
Inventors: W. Chase; T. Goodhue; Robert Seemayer; M. Whited
Original assignee: Genencor International Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 1994-02-18
Filing date: 1995-02-13
Publication date: 2002-08-01
Anticipated expiration: 2015-02-14
Also published as: JP3836873B2; JPH09509317A; WO1995022620A1; DE69524574D1; EP0745137A1; US5476965A; CA2183449C; CA2183449A1; EP0745137B1

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft die enzymatische Hydrolyse von Derivaten substituierter 2- Methylpropionsäure, insbesondere Fibrat-verwandten Verbindungen. Genauer gesagt, betrifft die Erfindung bestimmte enzymatische Aufspaltungen, welche selektiv entweder das S(-)- oder das R(+)-Enantiomer von (±)-Ethylciprofibrat in Abhängigkeit von dem gewählten Enzym und dessen Enantioselektivität ergeben.

Hintergrund der Erfindung

Fibrat-verwandte Verbindungen sind eine Klasse von Verbindungen, denen ein α- Methylpropionsäure-Locus als Teil der gesamten Fibratstruktur gemein ist. Fibratverwandte Verbindungen sind als Lipid- und/oder Cholesterol-reduzierende Verbindungen bekannt und schließen zum Beispiel Gemfibrozil (Lopid, kommerziell verfügbar von Parke-Davis, US-Patente 3 674 836 und 4 126 627), Nafenopin, welche von der Ciba- Geigy für ähnliche Verwendungen untersucht wurde, und Ciprofibrat (Ciprol oder Lipanor, verfügbar von Sterling, Winthrop, Inc., US-Patent 3 948 973) ein. Die Strukturen dieser Verbindungen sind unten angegeben.
Die Verbindung Ciprofibrat (α-2-Methylpropionsäure) wird derzeit als ein Lipidreduzierendes Mittel von der Sterling Winthrop, Inc. entwickelt. Die Verbindung wird als ein (±)-Racemat hergestellt. Es ist bekannt, dass das aktive Enantiomer die R(+)- Säure ist. Da die Verbindung eine racemische Mischung ist, sind die kommerziellen Scale-up-Ausbeuten für das gewünschte R(+)-Enantiomer niedrig, wobei zusätzlich die inaktive S(-)-Verbindung mit unerwünschten Nebeneffekten in Verbindung stehen kann. Deshalb wäre es wünschenswert, ein kostengünstiges Verfahren mit hoher Ausbeute für die selektive Herstellung von einem oder mehreren der Enantiomeren im Vergleich zu der racemischen Mischung, die derzeit erzeugt wird, zu haben. Deshalb besteht ein Bedarf für ein enzymatisches Aufspaltungsverfahren, um selektiv entweder das S(-)- oder das R(+)-Enantiomer der freien Säure zu erzeugen.
Die US-Patente Nr. 5 011 986 und 5 011 985 beschreiben Dextroclprofibrat (d)-(+)-2[4- (2,2-Dichlorcyclopropyl)phenoxy]-2-methylpropansäure und Terociprofibrat (1)-(-)-2[4- (2,2-Dichlorcyclopropyl)phenoxy]-2-methylpropansäure und deren Aufspaltung durch die fraktionelle Kristallisation mit einem optisch aktiven Amin.
Die EPO 0 369 553 A beschreibt die enantioselektive Herstellung von D-(-)-3-Hal-2- methylpropansäure durch die enantioselektive enzymatische Hydrolyse von Estern der Verbindungen.
Die EP 0 214 569 A beschreibt die Aufspaltung von racemischen Mischungen von Estern von α-Phenoxypropansäuren unter Verwendung von Lipasen, Esterasen oder Proteasen.

Zusammenfassung der Erfindung

Es werden Verfahren zur selektiven Aufspaltung von entweder dem S- oder R- Enantiomeren einer racemischen Mischung von einem Derivat substituierter 2-Methylpropionsäure bereitgestellt, wobei das Verfahren die Umsetzung des Propionsäurederivats mit einem geeigneten Enzym unter geeigneten Bedingungen, um im wesentlichen reine Enantiomere der Ausgangsverbindung zu erhalten, und gegebenenfalls das Umwandeln des Enantiomeren zu der aktiven Form umfasst. In einer Ausführungsform der folgenden Erfindung ist das Propionsäurederivat eine Verbindung der Formel I:
Racemische Verbindungen, welche eine Mischung von R- und S-Enantiomeren enthalten und deshalb nicht optisch rein sind, können problematisch von der Herstellungsperspektive sein. Racemische Verbindungen, welche als pharmazeutische Mittel brauchbar sind, können besonders problembehaftet sein, da die Mischung zu einer schlechteren biologischen Aktivität führen kann (und somit eine höhere Dosierung erfordert). Die therapeutische Aktivität einer racemischen Verbindung ist häufig nur mit einem der Enantiomere der Verbindung assoziiert (zum Beispiel ist die therapeutische Aktivität von (±)-Ciprofibrat nur mit dem R(+)-Enantiomer assoziiert). In gleicher Weise wurde geschlussfolgert, dass unerwünschte Nebenwirkungen mit dem zweiten Enantiomer in Verbindung stehen können.
Obgleich die folgende Diskussion vornehmlich sich auf die Aufspaltung vom (±)- Ethylciprofibrat bezieht, versteht sich, dass die vorliegende Erfindung auf alle Fibratverwandten Verbindungen anwendbar ist, insbesondere auf jene, welche 2-Methylpropionsäure-Derivate sind.
Das untenstehende Schema 1 zeigt die enzymatische Hydrolyse einer bevorzugten Verbindung, (±)-Ethylciprofibrat, zu den R(+)- und S(-)-Enantiomeren unter Verwendung einer Esterhydrolase bei einem pH-Wert von 7,0. Schema 1: Enzymatische Hydrolyse
Wie aus dem Schema 1 ersichtlich ist, ist das asymmetrische Zentrum der (+/-)- Verbindung tatsächlich 8 Kohlenstoffatome weg von der zu hydrolysierenden Seitenkette (C&sub2;H&sub5;). Es versteht sich, dass der Ausdruck "Kohlenstoffatome" äquivalente Bindungslängen einschließt und verwendet wird, um die Strecke zwischen dem asymmetrischen Zentrum und der hydrolysierbaren Seitenkette zu definieren. Somit kann das asymmetrische Zentrum und die zu unterziehende Seitenkette 7 Kohlenstoffatome und 1 Sauerstoffatom weg voneinander sein. Dies wird mit 8 äquivalente Bindungslängen bezeichnet, da Sauerstoff-Kohlenstoff und Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen in etwa gleich lang sind.
Esterhydrolasen, (Esterasen, Lipasen) und Proteasen, die von verschiedenen kommerziellen Quellen verfügbar sind, wurden gescreent, um ihre hydrolytische Aktivität für das (±)-Ethylciprofibrat-Substrat zu bestimmen. Die Details dieses Screening-Verfahrens sind unten dargelegt. Gleichwohl wurde allgemein festgestellt, dass bestimmte Esterhydrolasen eine Enantioselektivität zeigten, die zu der freien R(+)-Säure in niedrigen Ausbeuten mit einer optischen Reinheut von > 40% ee führte. Bevorzugte Esterhydrolasen sind Cholesterolesterasen von mikrobiellen Quellen, wie Candida und Pseudomonas, und Lipasen von mikrobiellen Quellen, insbesondere Candida.
Obgleich diese Diskussion vornehmlich sich auf den Wunsch fokussiert, selektiv das R(+)-Enantiomer von Ciprofibrat zu isolieren, welche die pharmazeutisch aktive Verbindung ist, sollte verstanden werden, dass im Vergleich zu herkömmlichen chemischen Verfahren zur Herstellung des aktiven R(+)-Enantiomeren von Ciprofibrat es von Vorteil wäre, zuerst die Enantiomeren durch enzymatische Hydrolyse zu trennen und dann anschließend die freie Säure umzukristallisieren, um die R(+)-Verbindung zu erhalten. Die Verfahren sind unten beispielhaft angegeben und es wird in Betracht gezogen, dass die enantioselektive enzymatische Aufspaltung des racemischen Ethylesters und die anschließende Umkristallisation zu verbesserten Ausbeuten und zu einer verbesserten Kosteneffizienz bei der Scale-up-Herstellung des kommerziellen Produktes führen wird. Es könnte ebenfalls von Vorteil sein, das S(-)-Isomer für pharmazeutische Wirksamkeits- und Toxizitätsuntersuchungen herzustellen.
Obgleich die Esterhydrolasen (Esterasen, Lipasen) selektiv das R-Enantiomer von Ethylciprofibrat hydrolysieren (63%), haben wir herausgefunden, dass Proteasen umgekehrte Enantioselektivitäten aufweisen. Somit sind Proteasen selektiv hinsichtlich der Herstellung von einem R(+)-Ethylester/amid und von der freien S(-)-Säure. Es ist wünschenswert, entweder selektiv direkt die freie R(+)-Säure zu erhalten oder das R(+)- Ethylester/amid zu isolieren und es zu der freien Säure durch Verseifung umzuwandeln. Somit ist gemäß einem Aspekt dieser Erfindung die selektive Aufspaltung von (±)- Ethylciprofibrat, um die freie R(+)-Säure zu erhalten, mit einer Esterase bevorzugt, vorzugsweise unter Verwendung einer Cholesterolesterase. In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die selektive Hydrolyse des S(-)-Ethylesters oder -amids mit einer Protease bevorzugt. Der verbleibende R(+)-Ester oder -Amid kann zu der freien Säure umgewandelt werden. Solche Umwandlungen können leicht durch die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannten Techniken, zum Beispiel durch Verseifung, erreicht werden.
In der vorliegenden Erfindung brauchbare Proteasen können jedweder Quelle (mikrobielle Quelle, Säugetier-Quelle, etc.) sein. Gleichwohl sind bevorzugte Proteasen Bacillus-Proteasen (Subtilisine).
Es wurde ebenfalls festgestellt, dass bei Hydrolysen unter Verwendung von Enzymen mit niedriger Selektivität (E-Wert von weniger als etwa 15) das R(+)-Enantiomer mit der S(- )-Säure verunreinigt ist. In diesem Fall wird in Betracht gezogen, dass die Präzipitation der kontaminierten R(+)/S(-)-Mischung mit einem chiralen Amin die R(+)-Kristallisation begünstigen wird.
Aufgrund der umgekehrten Enantioselektivität von Proteasen im Vergleich zu Lipasen kann man eine hohe optische Reinheit mit einem beliebigen gewünschten Enantiomer (R(+) oder S(-)) erreichen.
Obgleich die unten beispielhaft angeführte Arbeit auf die Arbeit mit dem Ester (±)-Ethylciprofibrat beschränkt ist, wird in Betracht gezogen, dass ähnliche Ergebnisse mit anderen Fibrat-verwandten Verbindungen erreicht werden könnten, einschließlich zum Beispiel Nafenopin.

Versuchsteil

Beispiel 1

Das Screenen für geeignete Lipasen und Esterasen

5 mg (±)-Ethylciprofibrat wurden mit 50 mg Enzym in 1 ml Phosphatpuffer, pH 7,0, bei 30ºC inkubiert. Nach 6 Stunden wurde 1 ml einer Chloroform-Methanol-1-4-Mischung hinzugesetzt, und die Lösung wurde mit 2 ml Ethylacetat extrahiert, um das Produkt zu isolieren. Die organische Phase wurde abgedampft und auf die freie Säure mittels HPLC unter Verwendung einer chiralen Cyclodextrinsäule analysiert. Unter Verwendung dieses Verfahrens wurden 52 Enzympräparationen gescreent. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 1 und 2 zusammengefasst. Die Tabelle 1 zeigt nur jene Esterhydrolasen, welche eine hydrolytische Aktivität zeigten.

HPLC-Bedingungen:

Säule: CYCLOBOND I β-SN (250 · 4,6 mm); kommerziell verfügbar von Astec.
Mobile Phase: CH&sub3;CN-CH&sub3;OH 95-5
Modifiziermittel. Triethylamin 0,4 ml/l
saure Säure 0,5 ml/l
Fluss: 1 ml/min
Detektion: UV 236 nm Tabelle 1 Gescreente Esterhydrolasen
Die Tabelle 1 stellt die 14 Esterhydrolasen dar, welche eine hydrolytische Aktivität für das Substrat zeigten. Sieben der in Tabelle 1 gezeigten Esterhydrolasen (fünf Esterasen und zwei Lipasen) zeigten eine vernünftige Enantioselektivität, die zu der freien Säure mit einer optischen Reinheit > 40% ee führten. In allen Fällen hat die erzeugte Säure die gewünschte (R)-(+)-Konfiguration, wie es durch die Korrelation mit einer authentischen Probe bestätigt wurde.

Tabelle 2

Gescreente Lipasen

Mikrobielle Quelle Vertreiber

Chromobacterium viscosum Toyo Jozo
Mucor javanicus Amano M-AP 10
Mucor miehei Biocatalysts
Geotrichum candidum Amano GC 5
Rhizopus niveus Amano N conc.
Penicillium roquefortii Amano R 10
Pseudomonas Amano PL 105
Penicillium cyclopium Amano G
Rhizopus javanicus Biocatalysts
Pseudomonas sp. Amano SAM II
Aspergillus niger Amano AP 6
Rhizopus javanicus Amano F-AP 15
Humicola lanuginosa Amano CE
Weizenkeime Sigma
Die Tabelle 2 zeigt die 14 Lipase-Enzympräparationen, die durch das Verfahren von Beispiel 1 gescreent wurden. Die in Tabelle 2 aufgelisteten Lipasen zeigten keine hydrolytische Aktivität für das (±)-Ethylciprofibrat.

Beispiel 2

Unter Verwendung der Cholesterolesterase, Güteklasse II (verfügbar von Genzyme), gezeigt in Tabelle 1, wodurch 29% optisch reine freie Säure erhalten wurde, wurde das folgende Scale-up-Experiment durchgeführt. 3,16 g (10 mmol) (±)-Ethylciprofibrat wurden in 20 ml 0,005 M Phosphatpuffer, pH 7,0, in Gegenwart von 200 mg Cholesterolesterase (verfügbar von Genzyme) gerührt. Um die enzymatische Hydrolyse ohne signifikanten Abfall im pH-Wert durchzuführen, wurde die Reaktion unter Bedingungen mit konstantem pH durchgeführt. Eine 1M-Natriumhydroxidlösung wurde durch einen Autotitrator während der Reaktion hinzugesetzt, um die gebildete Carbonsäure zu neutralisieren. Die Reaktion wurde mittels des Verbrauches der Natriumhydroxidlösung überwacht, welcher direkt die Umwandlung widerspiegelt. Die Reaktion stoppte nach 5 Tagen mit einer etwa 27%igen Umwandlungsrate, was die Möglichkeit einer Produktinhibierung angibt. Die wässrige Phase wurde mit 1M Chlorwasserstoffsäure angesäuert und dreimal mit jeweils 50 ml Ethylacetat extrahiert.
Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel wurde abgedampft. Die rohe Mischung wurde mittels Säulenchromatographie auf Silicagel (Hexan-Diethylether 1-1) abgetrennt.
Ausbeute: 710 mg (2,46 mmol) (R)-Ciprofibratsäure, theoretische 25% an farblosem Feststoff
2,00 g (6,30 mmol) (S)-Ethylciprofibrat, theoretische 63% an farbloser Flüssigkeit
Eine schematische Darstellung der Reaktion wird unten als Schema 2 vorgelegt, welche ebenfalls die zusätzlichen Schritte, welche unten in Beispiel 3 beschrieben sind, zeigt. Cholesterolesterase Schema 2: Enzymatische Aufspaltung mit Cholesterolesterase

Beispiel 3

Verseifung des (S)-Ethylciprofibrats

200 mg des S(-)-Ethylesters von Beispiel 2 wurden mit 10 ml destilliertem Wasser und 200 mg Natriumhydroxid 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde angesäuert und dreimal mit Ethylacetat extrahiert. Die organischen Phasen wurden vereinigt, über Natriumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel wurde abgedampft.
Ausbeute: 160 mg (0,55 mmol) (S)-Ciprofibratsäure, theoretische 88% an farbloser Flüssigkeit, kristallisiert beim Stehenlassen bei Raumtemperatur
Die optische Reinheit der zwei erhaltenen Säurefraktionen freien R(+)-Säure von Beispiel 2 und der freien S(-)-Säure von Beispiel 3 wurden mittels chiraler HPLC- Analyse bestimmt. Die Daten wurden verwendet, um die Enantioselektivität der Reaktion unter Verwendung allgemein anerkannter Gleichungen zu berechnen (siehe C. S. Chen, Y. Fujimoto, G. Girdaukas und C. J. Sih, J. Am. Chem. Soc. 1982, 104: 7294- 7299; ein exzellenter Überblick wird von C. J. Sih und S. H. Wu, "Resolution via Biocatalysis" in Topics of Stereochemistry, 1989, Ausgabe 19, 63-125) vorgelegt. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 3 gezeigt.

Tabelle 3

Berechnete kinetische Parameter Optische Reinheiten

E = 15,4 Säure: 83,7% ee
c = 27,8% Ester: 32,2% ee
E: Selektivitätskoeffizient c: Umwandlung

Beispiel 4

Screenen von Proteasen

Selektierte Proteasen wurden bezüglich ihrer hydrolytischen Aktivität in bezug auf die Hydrolyse von (±)-Ethylciprofibrat gescreent. Das folgende Screening-Verfahren wurde angewandt, und die Ergebnisse des Screenings sind in Tabelle 4 zusammengefasst.
317 mg (1,0 mmol) (±)-Ethylciprofibrat wurden mit 10 ml Puffer, pH 8,0, und 100 mg der gewünschten Protease gerührt. Nach 1 Tag wurden 500 ul-Proben genommen, wurden 2 Tropfen 1M Chlorwasserstoffsäure hinzugesetzt und wurde die wässrige Phase mit 500 ul Ethylacetat extrahiert. Die erhaltene organische Phase wurde direkt eingesetzt, um die Hydrolyserate unter Verwendung von HPLC zu bestimmen.

HPLC-Bedingungen:

Säule: RP-18 (250 · 4,6 mm) 5 um
Mobile Phase: Methanol-Wasser 80-20
Modifiziermittel. Essigsäure 0,6 ml/l
Fluss: 1 ml/min
Detektion: UV 254 nm Tabelle 4 Hydrolyse von (±)-Ethylciprofibrat unter Verwendung von verschiedenen Proteasen
Basierend auf den in Tabelle 4 gezeigten Ergebnissen erscheinen einige der Proteasen, insbesondere Protease 899, als guter Kandidat für dieses Verfahren.

Beispiel 5

Verbesserung der optischen Reinheit durch Umkristallisation

110 mg (R)-(+)-Ciprofibrat (74% ee) werden aus 1,6 ml n-Hexan und 0,2 ml Toluol umkristallisiert. Nach dem Kühlen der Mischung auf Raumtemperatur wird die präzipitierte Säure durch Filtration gewonnen.
Ausbeute: 60 mg farblose kristalline Verbindung, 85% ee
¹ Siehe US-Patent 4 814 931 (hierin durch den Bezug darauf einbezogen)
² Siehe US-patent 5 185 258 (hierin durch den Bezug darauf einbezogen)

Claims

1. Verfahren zur enzymatischen Aufspaltung von einem oder mehreren Enantiomeren einer Verbindung der Formel I:

worin:

R und R¹, die einzeln definiert sind, substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl mit C1 -C4 sind (worin die Alkylgruppe mit Halogen, Schwefel oder Nitril substituiert sein kann) oder R und R¹ zusammengenommen mit dem asymmetrischen Zentrum der Verbindung der Formel I eine substituierte oder unsubstituierte cyclische Ringstruktur mit C3-C6 bilden (wobei die Ringstruktur mit C1-C6-Alkyl, Halogen oder Aryl substituiert sein kann); mit der Maßgabe jedoch, dass eines von R und R¹ größer als das andere ist um mindestens ein Kohlenstoffatom oder einer äquivalenten Bindungslänge;

n = 0-6 ist;

R² O oder CH&sub2; ist, mit der Maßgabe, dass R² auf einer beliebigen Seite der (CH&sub2;)n- Kette sein kann; und

R³ H, NHR&sub4; (worin R&sup4; H, Alkyl oder eine Aminosäure ist), Alkyl mit 1-6 Kohlenstoffatomen und substituiertes Alkyl mit 1-6 Kohlenstoffatomen (worin der Substituent aus der Gruppe gewählt ist, die aus Halogen oder CN besteht) ist;

wobei das Verfahren das Umsetzen der Verbindung der Formel I mit einem geeigneten Enzym umfasst, um das im wesentlichen reine R- oder S-Enantiomer unter Bedingungen aufzuspalten, die für eine solche Aufspaltung geeignet sind.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei R und R¹ unabhängig CH&sub2;Cl und C&sub2;H&sub4;Cl sind.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei R und R¹ zusammengenommen mit dem asymmetrischen Zentrum der Verbindung der Formel I eine 3-gliedrige, substituierte, cyclische Ringstruktur bilden.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die 3-gliedrige Ringstruktur mit Halogen substituiert ist.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei R² O ist.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei n = 0 ist.

7. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei R³ Alkyl mit 1-6 Kohlenstoffatomen oder halogeniertes Alkyl mit 1-6 Kohlenstoffatomen ist.

8. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei R und R¹ zusammengenommen einen Di- Chlor-substituierten, 3-gliedrigen, cyclischen Ring bilden; R² = O ist und n = 0 ist.

9. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Propionsäurederivat (±)-Ethylciprofibrat ist.

10. Verfahren gemäß Anspruch 9, umfassend das Kontaktieren von (±)-Ethylciprofibrat mit einer geeigneten Esterhydrolase, um die freie R(+)-Säure von Ciprofibrat mit einer optischen Reinheit von etwa > 40% ee zu erhalten.

11. Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei die Esterhydrolase eine Cholesterolesterase oder eine Lipase ist.

12. Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei die Cholesterolesterase von einer mikrobiellen Quelle herrührt und die Lipase von einem Candida-Organismus ist.

13. Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei die Lipase von Candida cylindracea ist.

14. Verfahren gemäß Anspruch 9, umfassend das Kontaktieren von (±)-Ethylciprofibrat mit einer geeigneten Protease, um die freie R(-)-Säure von Ciprofibrat mit einer optischen Reinheit von etwa 40% ee zu erhalten.