DE69523931T2

DE69523931T2 - Einwegmodul und verfahren für eine testanordnung für biologische proben

Info

Publication number: DE69523931T2
Application number: DE69523931T
Authority: DE
Inventors: J. Shartle
Original assignee: Biometric Imaging Inc
Current assignee: Biometric Imaging Inc
Priority date: 1994-09-02
Filing date: 1995-08-31
Publication date: 2002-08-29
Anticipated expiration: 2015-09-01
Also published as: EP0778950A1; US5912134A; CA2198854A1; WO1996007919A1; ATE208902T1; AU700750B2; US5627041A; EP0778950A4; EP0778950B1; AU3462795A; JPH10505672A; DE69523931D1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Diese Erfindung betrifft im allgemeinen Verbesserungen bei Vorrichtungen und Verfahren zum gleichzeitigen Analysieren einer Vielzahl von Fluidproben, um die Konzentration von einer oder mehreren festen Komponenten, die in jeder Probe enthalten sind, zu ermitteln. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Testanordnungsmodul und ein Verfahren zum Durchführen eines Immuntests unter Verwendung des Testanordnungsmoduls, um eine Vielzahl von Blutproben gleichzeitig zu verdünnen und die verdünnten Proben zur Analyse durch ein Abbildungsinstrument zu präsentieren.
Die jüngste Ausbreitung von Diagnosetests für eine zunehmende Vielfalt von klinisch bedeutenden Zielkomponenten hat einen Bedarf für eine Routineüberwachung dieser Komponenten in Patientenproben erzeugt. Die Blutkonzentration von T-Lymphozyten, die die CD4- oder CD8-Oberflächenantigene ausdrücken, wird beispielsweise weit und breit als zuverlässiger Indikator für das Krankheitsstadium in Personen angenommen, bei denen das menschliche Immunschwächevirus (HIV) diagnostiziert wurde. Der Bedarf für ein kosteneffizientes, zuverlässiges Verfahren für die Routineanalyse hat zur Entwicklung von Einweg-Testanordnungsmodulen geführt.
In einem solchen Modul wird ein kleines Volumen einer Blutprobe durch eine Bedienungsperson eines Analyseinstruments auf das Modul aufgebracht. Das Modul wird dann in das Instrument eingesetzt, das die restlichen Testschritte automatisch durchführt. Die Menge an verwendeten Reagenzien wird minimiert und das Potential für einen Bedienungspersonfehler oder das Aussetzen biologisch gefährlichen Materialien wird stark verringert, wenn solche Testanordnungsmodule verwendet werden. Solche Module lassen sich leicht für verschiedene Testverfahren auslegen, wie z. B. Transportieren und Dosieren der Probe oder des Reagens, Verdünnen der Probe und Präsentation der Probe zur Analyse.
Zahlreiche Tests wurden zum Identifizieren einer Vielzahl von Zielkomponenten, die in biologischen Proben zu finden sind, entwickelt. In solchen Tests wird eine biologische Probe, z. B. Blut oder Urin, mit einem Reagens zur Reaktion gebracht, das die nachzuweisende Komponente modifiziert. Beispiele von Reagenzien, die üblicherweise verwendet werden, umfassen Bindemittel und Liganden wie z. B. monoklonale Antikörper, Abbaumittel wie z. B. Protease und Marker wie z. B. Fluoreszenzfarbstoffe, UV-aktive und radioaktive Verbindungen. Häufig ist das Reagens ein monoklonaler Antikörper, der an einen Fluoreszenzfarbstoff gebunden ist. Ein Abbildungsinstrument wird zur quantitativen und qualitativen Analyse eines Gemisches der Probe und des Reagens verwendet. Wenn die Probe einmal mit dem Reagens vermischt und inkubiert ist, dann wird ein aliquoter Teil des Gemisches isoliert und auf die Anwesenheit oder Abwesenheit der Zielkomponente analysiert.
Immuntests an Blutproben, bei denen fluoreszenzmarkierte Antikörper verwendet werden, um an spezifische Blutzellen zu binden, sind Beispiele solcher Tests.
Damit ein aliquoter Teil einer Testprobe für eine biologische Probe insgesamt repräsentativ ist, ist es wichtig, daß die Zielkomponente gleichmäßig innerhalb der Probe verteilt ist, wenn sie analysiert wird. Der Testprozeß sollte keine ungleichmäßige Verteilung der Komponente innerhalb der Probe erzeugen. Einige Module und Tests des Standes der Technik unterziehen jedoch die Probe großen Zentrifugalkräften, die die Verteilung der Komponenten innerhalb der Probe stören. Ebenso sind größere Zielkomponenten in Suspension in der Probe wie z. B. Blutzellen für unerwünschtes Absetzen aufgrund der Schwerkraft anfällig. Es ist erwünscht, das Modul und den Testprozeß so auszulegen, daß eine zweckmäßige Zielkomponentenverteilung innerhalb der Probe aufrechterhalten wird.
Die meisten früheren Testanordnungsmodule sind dazu ausgelegt, mehrere Analysen an einer einzigen Probe durchzuführen. Es ist auch erwünscht, einen oder mehrere Tests an mehreren Proben gleichzeitig durchzuführen. Die gleichzeitige Verarbeitung von mehreren Proben erfordert die Beachtung von bestimmten Zeitzwängen, wenn der Test durchgeführt wird. Wenn beispielsweise die Konzentration der Zielkomponente durch Fluoreszenzemissionen ermittelt wird, variiert das vom Abbildungsinstrument erfaßte Signal häufig mit dem Zeitraum, in dem die Probe mit dem Reagens in Kontakt gebracht wird. Daher ist es wichtig, daß alle Proben unter Verwendung derselben oder von ähnlichen Zeitbedingungen getestet werden.
Es ist auch häufig erwünscht und/oder erforderlich, die biologische Probe zu verdünnen, um die Menge an vorliegender Zielkomponente genau zu erfassen. Es kann beispielsweise erforderlich sein, konzentrierte biologische Proben zu verdünnen, so daß ein Fluoreszenzsignal von dem Probe- und Reagensgemisch innerhalb einen leicht erfaßbaren oder linearen Bereich fällt. Der erforderliche Verdünnungsgrad variiert jedoch in Abhängigkeit von der anfänglichen Konzentration der Komponente innerhalb der Probe. Es ist daher wichtig, daß man in der Lage ist, die analysierten Proben genau zu verdünnen.
Um eine Probenverdünnung zu erzielen, haben Module des Standes der Technik häufig komplexe Konstruktionen verwendet, die kostenaufwendig und schwierig herzustellen sind. Die in den Modulen angetroffene Komplexität liegt teilweise an der Dosierung der Probe innerhalb des Moduls. Wenn die Probendosierung unter Verwendung von kleinen, in der Hand gehaltenen Pipetten durchgeführt wird, dann kann die Gestaltung des Moduls vereinfacht werden. Somit ist es erwünscht, die Dosierungsaspekte des Moduls zu beseitigen, um die Modulkonstruktion zu vereinfachen. Dies sieht auch variable Verdünnungsverhältnisse vor.
Wenn das Modul eine unabhängige Verdünnungsvorrichtung enthält, werden verschiedene Anordnungen von Kapillaren, Kanälen, Kammern, Behältern, Aufbringungsvertiefungen und Stoppübergängen verwendet, um die Probe, das Reagens und/oder das Verdünnungsmittel innerhalb des Moduls zu bewegen. Module des Standes der Technik verwenden Kapillar-, Gravitations- und/oder Zentrifugalkräfte, um die Fluide innerhalb des Moduls zu bewegen. Es wurde offenbart, einen Kapillargegendruck zu verwenden, um einen "Stoppübergang" zu erzeugen, der die Strömung der Fluide unter bestimmten Bedingungen stoppt, während er eine Strömung unter anderen Bedingungen gestattet. Solche Stoppübergänge oder Strömungsstoppkapillaren wirken als Ventile ohne bewegliche Teile. Die Stoppübergänge werden durch Ändern des Drucks, der Kraft oder der Beschleunigung, die auf das Fluid in der den Stoppübergang bildenden Kapillare aufgebracht wird, geöffnet oder "durchbrochen".
Module des Standes der Technik, die eine Kapillare verwenden, um einen Stoppübergang auszubilden, dachten nicht daran, geringe Zentrifugalbeschleunigungen zu verwenden, um das Fluid an dem Stoppübergang vorbei zu bewegen. Module des Standes der Technik verwenden eine hohe Drehgeschwindigkeit oder Änderungen des Fluidpegels in einem Behälter, um den Stoppübergang zu überwinden. In bestimmten Modulkonstruktionen können variable Fluidpegel nicht erreichbar oder unerwünscht sein. Ebenso können hohe Drehgeschwindigkeiten, die zum Trennen von Plasma oder ähnlichen Komponenten erwünscht sein können, für bestimmte Komponenten innerhalb einer Probe schädlich sein. Somit ist es erwünscht, ein Testanordnungs- oder Verdünnungsmodul zu gestalten, das die Probe, das Verdünnungsmittel und/oder das Reagens durch geringe Zentrifugalkräfte bewegen würde.
Verschiedene Testanordnungsmodule mit Verdünnungsströmungselementen und verschiedene Testanordnungsmodule, die für Zentrifugalbeschleunigung ausgelegt sind, waren für mehrere Jahre bekannt, und beispielsweise sind verschiedene Formen solcher Vorrichtungen im US-Pat. Nrn. 4 728 500; 4 756 884; 4 946 795; 5 061 381; 5 122 284; 5 173 193; 5 186 844; 5 230 866 und 5 300 779 zu finden. Ein System, das die Optik beinhaltet, die in der Lage ist, ein Testanordnungsmodul zu verwenden, ist in der gleichzeitig anhängigen US-Patentanmeldung, Seriennummer 08/236 342 mit dem Titel "Apparatus and Method for Volumetric Capillary Cytometry", erfunden von Thomas M. Baer, Louis J. Dietz, Robert S. Dubrow, Paul G. Hayter, Michael Hodges, Bala S. Manian und Robert J. Shartle, im Eigentum des gleichen Anmelders wie diese Anmeldung, und durch den Hinweis hierin aufgenommen, offenbart. Ebenso ist ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Sammeln und Analysieren von Daten, die von einem Testanordnungsmodul erhältlich sind, in der gleichzeitig anhängigen US-Patentanmeldung Nummer 08/236 645 mit dem Titel "Method and Apparatus for Cell Counting and Cell Classification", erfunden von Ning L. Sitzo und Louis J. Dietz, ebenfalls im Eigentum des gleichen Anmelders wie diese Anmeldung, und auch durch den Hinweis hierin aufgenommen, beschrieben.
Daher haben diejenigen, die mit der Entwicklung und Verwendung von Testanordnungsmodulen für die Bewegung und Verdünnung von Fluidproben zu tun haben, lange den Bedarf für verbesserte Fluidkreisläufe erkannt. Mit der Einführung von Abbildungsinstrumenten, die eine verdünnte ganze Blutprobe in einem feststehenden Volumen verwenden, wie z. B. jene, die in den vorstehend aufgenommenen Anmeldungen beschrieben sind, wird nun ein Bedarf für Systeme erkannt, die die Probe bewegen, ohne die Probe und das Modul hohen Zentrifugalbeschleunigungen zu unterziehen. Die vorliegende Erfindung befriedigt jedes dieser Bedürfnisse.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt ein neues und verbessertes Modul oder eine Kassette zur Verwendung in einem Abbildungsinstrument zum Analysieren einer Probe von biologischen Fluiden, wie z. B. menschlichem ganzen Blut, nach Anspruch 1 bereit. Das Modul enthält mehrere Kanäle zur parallelen Verarbeitung sowie die erforderlichen Reagenzien wie z. B. Verdünnungsmittel und Fluoreszenzmarker. Mehrere Vertiefungen sind zum Aufnehmen von mehreren Proben des untersuchten biologischen Fluids vorgesehen. Ein System von miteinander verbundenen Kanälen steuert die Bewegung der Probe und des Verdünnungsmittels in eine oder mehrere Mischkammern und dann in eine oder mehrere Abtastkapillaren zur Analyse.
Wenn das zu prüfende Fluid beispielsweise und nicht notwendigerweise als Begrenzung Blut ist, wird ein erstes Reagens mit Antikörpern, die mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind, in eine oder mehrere Aufbringungsvertiefungen gegeben. Nach dem Aufbringen eines präzisen Volumens der Blutprobe in jede Aufbringungsvertiefung wird das erste Reagens mit den Proben vereinigt. Das Modul wird hin- und herbewegt, um die Probe und das Reagens gründlich zu vermischen. Ein Fluidkanal erstreckt sich von jeder Aufbringungsvertiefung zu einer ersten Kapillare mit verringerter Querschnittsgröße, die einen ersten Stoppübergang bildet. Ohne das Aufbringen einer zusätzlichen Kraft bleibt die vermischte Probe in den Aufbringungsvertiefungen und Kanälen und läuft nicht durch den ersten Stoppübergang weiter.
Nachdem sich die Blutprobe oder ein anderes biologisches Fluid mit dem ersten Reagens vereinigt hat, wird das Modul Zentrifugalkräften unterzogen, um die Probe an dem ersten Stoppübergang vorbei und in eine Mischkammer zu bewegen. Die Anordnung der Aufbringungsvertiefungen und der Kanäle ist so ausgewählt, daß, wenn eine Zentrifugalbeschleunigung durch Schleudern des Moduls auf einer Aufnahmeplatte des Abbildungsinstruments aufgebracht wird, ein Druck in dem Fluid am Stoppübergang verursacht, daß die Probe durch die Kanäle in die Mischkammern strömt. Wenn die gemischte Probe einmal die Aufbringungsvertiefung verlassen hat, sind die Kanäle dazu ausgelegt, zu verhindern, daß die Probe das Modul verläßt. Die Probe und das Reagens lässt man in der Mischkammer für einen vorgegebenen Zeitraum inkubieren. Ein Fläschchen, das sich auch in dem Modul befindet, wird dann geöffnet, um ein Verdünnungsmittel in einen Behälter und einen damit verbundenen Kanal strömen zu lassen. Das distale Ende dieses Kanals ist mit einem zweiten Stoppübergang mit einer Größe gekoppelt, die klein genug ist, so daß das Verdünnungsmittel ohne das Aufbringen einer zusätzlichen Kraft nicht durch den zweiten Stoppübergang weiterströmt.
Nach der Inkubation der Blutprobe und des Reagens wird das Modul wieder geschleudert. Die Zentrifugalkraft an den Fluiden in dem Modul durchbricht den zweiten Stoppübergang und verursacht, daß das Verdünnungsmittel von dem Behälter in die Mischkammer strömt. Die Mischkammer weist eine präzise festgelegte Größe auf, so daß nur ein vorbestimmtes Volumen von Fluiden aufgenommen werden kann. Ein Austrittskanal von jeder Mischkammer ist mit einem Austrittsstoppübergang versehen, um die Probe und das Verdünnungsmittel in der Mischkammer zu halten. Außerdem enthält jede Mischkammer eine Mischkugel, um ein gründliches Vermischen der Probe und des Verdünnungsmittels sicherzustellen, und um das Absetzen und die Trennung der Teilchen oder Bestandteile der Probe zu minimieren.
Wenn die inkubierte Probe und das Verdünnungsmittel einmal die Mischkammer gefüllt haben, wird das Modul nahe einem Magneten angeordnet, der geradlinig bewegt wird, um die Mischkugel in einer gewünschten Mischbewegung zu bewegen. Die Probe und das Verdünnungsmittel werden dann in der Kammer für einen vorbestimmten Zeitraum vermischt. Nach dem Ablauf dieser Zeit wird das Modul mit einer höheren U/min geschleudert, um das Modul einer höheren Zentrifugalbeschleunigung zu unterziehen, die bewirkt, daß das gemischte Fluid in der Kammer die Kammer durch den Austrittsstoppübergang verläßt.
In dem Modul ist auch eine präzise Abtastkapillare zur Verwendung vom Abbildungsgerät bei der Analyse des biologischen Fluids ausgebildet. Nach dem Aufbringen der vorstehend erwähnten höheren Zentrifugalbeschleunigung strömt eine präzise Menge von gemischter Probe und Verdünnungsmittel aus der Mischkammer in die Abtastkapillare. Wenn die Abtastkapillare einmal gefüllt ist, steht die verdünnte Probe für das Analysegerät zur Abbildung oder einer anderen Analyse zur Verfügung. Die Konstruktion und Verwendung von Materialien in dem Modul der vorliegenden Erfindung führt zu einer kostengünstigen wegwerfbaren Vorrichtung. Nach der Endanalyse der biologischen Fluide durch das Abbildungsgerät kann das Modul somit weggeworfen werden.
Mehrere Abtastkapillaren können in dem Modul enthalten sein, um eine parallele Verarbeitung von mehreren Proben von biologischen Fluiden zu ermöglichen. Verschiedene Verdünnungsmittel und/oder Reagenzien können in dem Modul enthalten sein, um die Durchführung von verschiedenen Tests an derselben Patientenprobe vorzusehen. Die Größen der inneren Kanäle und Kapillaren sind in Abhängigkeit von den Eigenschaften der zu verarbeitenden Fluide ausgewählt. Wie vorstehend beschrieben, sind die Stoppübergänge in dem Modul derart gestaltet, daß das Fluid nicht ohne die Beaufschlagung mit äußeren Kräften wie z. B. einer Zentrifugalbeschleunigung hindurchströmt. Die Stoppüberganggestaltung stellt eine gesteuerte Umgebung für die Fluidbewegung bereit, die zu erhöhter Genauigkeit führt.
Eines der einzigartigen und neuen Merkmale des Moduls der vorliegenden Erfindung ist die Aufnahme einer Reihe von Kapillaren, Kanälen und Behältern, um Stoppübergänge auszubilden, die die Strömung der Probe und des Verdünnungsmittels durch das Modul steuern. Die vorliegende Erfindung umfaßt die Anordnung eines Stoppübergangs, dessen Kapillargegendruck durch das Aufbringen einer Zentrifugalbeschleunigung überwunden wird, welche durch die relativ langsame Drehung des Moduls innerhalb des Abbildungsinstruments verursacht wird. Die Querschnittsfläche, die radiale Position und der Fluiddruck jeder Kapillare, jedes Behälters und jedes Stoppübergangs sind präzise ausgewählt, um die Strömung durch die Stoppübergänge während der Schritte des Testprozesses auszulösen oder zu verhindern. Überdies wird eine Reihe von ausgewählten Zentrifugalbeschleunigungen auf das Modul aufgebracht, um die Fluide in einer gewünschten Weise zu bewegen.
Das Modul der vorliegenden Erfindung umfaßt auch Befestigungs- und Handhabungsmerkmale. Derzeit sind zwei Führungsschienen auf jeder Seite des Moduls vorhanden und umfassen Verriegelungsaussparungen zum Aufnehmen von äußeren Verriegelungsmechanismen, um das Modul während der Abbildungsverarbeitung in einer ortsfesten Position zu halten. Ein Daumengriff ist am distalen Ende des Moduls zur Verwendung beim Einsetzen in die und Entnehmen der Kassette aus dem Abbildungsinstrument angebracht. Das Modul weist zur Verwendung von mehreren Modulen in einem Instrument mit einem runden Drehtisch oder einer Aufnahmeplatte zum Aufbringen der Zentrifugalbeschleunigungen vorzugsweise eine im wesentlichen dreieckige Form auf. Da ein Kunststoffkörper für das Modul verwendet wird, ist Ultraschallschweißen ein Prozeß, der für die Endmontage des Moduls zur Verfügung steht.
Somit umfaßt das neue und verbesserte Testanordnungsmodul der vorliegenden Erfindung für die Bewegung und Verdünnung von Fluidproben verbesserte Fluidkreisläufe. Solche verbesserten Fluidkreisläufe sind zur Verwendung mit einer verdünnten ganzen Blutprobe in einem feststehenden Volumen besonders vorteilhaft, wie z. B. jene, die in den vorstehend aufgenommenen Anmeldungen beschrieben sind. Die verbesserten Fluidkreisläufe bewegen die Probe, ohne die Probe, das Instrument oder das Modul hohen Zentrifugalbeschleunigungen zu unterziehen. Überdies ebnet die Fähigkeit, Module zu gestalten, die Stoppübergänge aufweisen, die beim Aufbringen von geringen Zentrifugalbeschleunigungen eine Fluidströmung gestatten, die Wege für neue Verwendungen von solchen Testanordnungsmodulen.
Diese und weitere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden, ausführlicheren Beschreibung ersichtlich, wenn sie in Verbindung mit den zugehörigen Zeichnungen betrachtet wird, die beispielhaft die Prinzipien der Erfindung darstellen.

KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 ist eine perspektivische Ansicht eines zusammengesetzten Testanordnungsmoduls, das gemäß der Erfindung konstruiert ist.
Fig. 2 ist eine perspektivische Ansicht des Testanordnungsmoduls von Fig. 1 in auseinandergezogener Anordnung.
Fig. 3 ist eine Draufsicht auf die obere Platte des Testanordnungsmoduls von Fig. 2 von oben.
Fig. 4 ist eine Draufsicht auf die obere Platte von Fig. 3 von unten.
Fig. 5 ist eine Draufsicht auf die mittlere Platte des Testanordnungsmoduls von Fig. 2 von oben.
Fig. 6 ist eine Draufsicht auf die mittlere Platte von Fig. 5 von unten.
Fig. 7 ist eine Draufsicht auf die untere Platte des Testanordnungsmoduls von Fig. 2 von oben.
Fig. 8 ist eine Draufsicht auf die untere Platte von Fig. 7 von unten.
Fig. 9 ist eine perspektivische Ansicht der oberen Platte von Fig. 3 von oben.
Fig. 10 ist eine perspektivische Ansicht der mittleren Platte von Fig. 5 von oben.
Fig. 11 ist eine perspektivische Ansicht der unteren Platte von Fig. 7 von oben.
Fig. 12 ist eine Draufsicht auf zehn Testanordnungsmodule von oben, die auf einer drehbaren Aufnahmeplatte eines Abbildungsinstruments angeordnet sind.
Fig. 13 ist ein Prozeßablaufdiagramm der in dem Verdünnungsprozeß unternommenen Schritte unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Moduls.
Fig. 14 ist eine schematische Darstellung einer Kapillare, die einen Stoppübergang bildet.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSBEISPIELE

Wie in den beispielhaften Zeichnungen dargestellt, ist die vorliegende Erfindung in einem Modul oder einer Kassette verkörpert, die zum Durchführen eines Tests zur qualitativen und quantitativen Analyse von Zielkomponenten in einer biologischen Probe verwendet wird. Während Module des Standes der Technik lediglich eine statische Fluidsteuerung verwenden oder das Modul hohen Drehgeschwindigkeiten unterziehen, vermeidet die vorliegende Erfindung Prozeßschritte, die die Verteilung von Zielkomponenten innerhalb der Probe stören könnten. Ebenso vermeidet die vorliegende Erfindung die Komplexität der Strömungselemente von Modulen des Standes der Technik, die durch den Einschluß eines Dosierungsschritts verursacht wird.
Gemäß der vorliegenden Erfindung und wie in Fig. 1 und 2 gezeigt, wird ein Modul 20 bereitgestellt, um eine biologische Probe zur Analyse durch ein Abbildungsinstrument zu präsentieren. Das Modul der vorliegenden Erfindung verwendet eine Reihe von Kanälen, Kapillaren, Behältern und Stoppübergängen, um eine Probe, ein Reagens und ein Verdünnungsmittel als Funktion der Summe von Kapillar-, Gravitations- und geringen Zentrifugalkräften präzise durch das Modul zu bewegen. Da eine präzise Menge einer Probe auf das Modul aufgebracht wird, besteht kein Bedarf, die Probe innerhalb der Modulströmungselemente zu dosieren. Somit wird ein praktisches und kosteneffizientes Modul und Testverfahren bereitgestellt, die viele der Begrenzungen des Standes der Technik beseitigen. Ein solches Modul ist besonders bei Tests mit feststehendem Volumen nützlich.
Unter speziellerer Bezugnahme auf Fig. 2 umfaßt das Modul 20 drei geformte Platten 22, 26 und 30, die vorzugsweise aus einem Kunststoff oder dergleichen bestehen, wie z. B. Acrylnitrilbutadienstyrol (ABS), Polystyrol oder Polymethylmethacrylat. ABS, das zur Herstellung eines die vorliegende Erfindung beinhaltenden Moduls geeignet ist, kann von BASF Corp. in Wyandotte, MI, unter der Handelsmarke "TERLUX 2802 TR." erworben werden. Die ABS- Platten werden vorzugsweise durch Ultraschallschweißen miteinander verschweißt, wie in Fig. 1 gezeigt.
Wie in Fig. 3-11 genauer dargestellt, weist eine obere Platte 22 eine obere Fläche 23 und eine untere Fläche 24 auf. Eine mittlere Platte 26 weist eine obere Fläche 27 und eine untere Fläche 28 auf. Eine untere Platte 30 weist eine obere Fläche 31 und eine untere Fläche 32 auf. Die Modulplatten sind ferner mit mehreren Vertiefungen, Behältern, Kammern, Kanälen, Kapillaren und Stoppübergängen zum Bewegen einer Fluidströmung durch eine Kombination von Gravitations-, Kapillar- und Zentrifugalkräften gestaltet. Der Prozeß zur Bewegung des Fluids durch das Modul wird hierin weiter beschrieben, wie in Fig. 13 dargestellt.
Um einen Test zu starten, bringt eine Bedienungsperson eines Abbildungsinstruments (nicht dargestellt), das zur Verarbeitung des Moduls 20 verwendet wird, eine bekannte Menge einer Fluidprobe in jede eines Paars von Aufbringungsvertiefungen 35 und 36 auf, wie am besten in Fig. 3-5 zu betrachten ist. Solche Aufbringungsvertiefungen können einen kreisförmigen Querschnitt und eine insgesamt zylindrische Form aufweisen; es können jedoch andere Gestalten verwendet werden. Für einen Test, der mit ganzem Blut beginnt, werden einhundert Mikroliter von ganzem Blut auf jede der Aufbringungsvertiefungen aufgebracht. Tests können mit mehr oder weniger als einhundert Mikrolitern einer Probe, die in die Aufbringungsvertiefung gegeben wird, ausgelegt sein, solange die exakte Menge der Probe vorbestimmt ist. Während der Rest des Verdünnungsprozesses in einem feststehenden Volumen arbeitet, sieht die Fähigkeit, das Probenvolumen zu verändern, einen variablen Verdünnungsfaktor vor, so daß die Bedienungsperson ein variables, aber vorbestimmtes Volumen der ganzen Blutprobe aufbringen kann.
Die Aufbringungsvertiefungen 35 und 36 sind mit unteren Oberflächen 38 und 39 gestaltet, die in der oberen Fläche 27 der mittleren Platte 26 geformt sind. Während der Montage des Moduls 20 wird eine feste Menge eines Reagens auf die Bodenflächen der Aufbringungsvertiefungen ausgegeben. Das Reagens für einen CD4/CD8-Test ist typischerweise eine Saccharoselösung, die einen oder mehrere Antikörper enthält, die mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert sind. Ein sehr kleiner Tropfen, z. B. zehn Mikroliter, der Saccharoselösung wird beim Herstellungsprozeß in jede Aufbringungsvertiefung gegeben und dann durch einen Trockentunnel (nicht dargestellt) geleitet. Das Ergebnis ist ein sehr dünner Zuckerfilm im Boden der zwei Vertiefungen, der eine Matrix bildet, die sich leicht in einer wässerigen Lösung wie z. B. Blut auflöst.
Wenn die Bedienungsperson eines Abbildungsinstruments die Blutproben in die Aufbringungsvertiefungen 35 und 36 gibt, beginnt das Blut sofort, die in dem Reagens enthaltenen Antikörper zu lösen. Für einen CD4/CD8-Test enthält die erste Vertiefung CD3- und CD4-Antikörper, und die zweite Aufbringungsvertiefung enthält CD3- und CD8-Antikörper. Somit liegen zwei verschiedene Antikörpergemische in jeder der Aufbringungsvertiefungen vor. Das Verarbeitungs- oder Abbildungsinstrument ist dazu ausgelegt, festzulegen, welche Vertiefung für welchen Test verwendet wird, beispielsweise durch Festlegen der linken Aufbringungsvertiefung für CD4 und der rechten Aufbringungsvertiefung für CD8. Somit kann der Benutzer Blut von dem gleichen Patienten in jede der zwei Vertiefungen geben und das Abbildungsinstrument legt fest, welche Vertiefung jeden Test enthält.
Wie in Fig. 4, 5 und 9 dargestellt, stehen die Aufbringungsvertiefungen 35 und 36 mit den Mischkammer- Einlaßkapillaren 41 und 42 in Fluidverbindung. Solche Mischkammern können einen Querschnitt aufweisen, der in Form eines Fünfecks gestaltet ist, um die Mischeigenschaften der Kammer zu verbessern; andere Formen der Mischkammern können jedoch verwendet werden. Wenn Blut zu jeder Aufbringungsvertiefung zugegeben wird, füllt sich jede Einlaßkapillare aufgrund der Kombination von Kapillar- und Gravitationskräften. Die Kapillaren füllen sich die gesamte Strecke bis zu einem Paar von Mischkammereinlaß- Stoppübergängen 44 und 45, die in Fig. 3 und 4 gezeigt sind. Die Benetzbarkeit und Kapillarwirkung des Modulmaterials, wie z. B. ABS, kann durch Plasmaätzen oder ähnliche Verfahren verstärkt werden.
Die Mischkammereinlaß-Stoppübergänge 44 und 45 sind kleine kreisförmige Kapillaren, die durch die mittlere Platte 26 hindurchgehen und die die Einlaßkapillaren 41 und 42 mit den Mischkammern 48 und 49 verbinden. Typische Durchmesser für die Einlaßstoppübergänge liegen im Bereich von 0,5 mm bis 1,5 mm und betragen vorzugsweise 1,1 mm. Die Stoppübergänge oder Strömungsstoppkapillaren müssen nicht notwendigerweise mit kreisförmigen Querschnitten gestaltet sein und werden am besten in mindestens zwei Ebenen in dem Modul hergestellt, d. h. auf zwei Oberflächen oder Ebenen der Modulplatten 22, 26 und 30.
Wenn das Probenfluid durch die Mischkammer-Einlaßkapillaren 41 und 42 strömt, füllt das Fluid auch zwei Waschstoppübergänge 51 und 52 aufgrund der Kombination von Kapillar- und Gravitationskräften, die durch die Probe in den Aufbringungsvertiefungen 35 und 36 verursacht werden. Die Waschstoppübergänge füllen sich mit der Probe, aber sie ermöglichen nicht, daß das Fluid über jeden Stoppübergang hinaus strömt. Die Waschstoppübergänge sind so angeordnet, daß in späteren Schritten des Testprozesses das Verdünnungsmittel durch die Stoppübergänge strömt und die Probe, die in den Einlaßkapillaren bleibt, auswäscht. Vorsichtsmaßnahmen müssen in späteren Schritten des Tests auch getroffen werden, um sicherzustellen, daß jegliche Blutzellen, die sich in den Waschstoppübergängen absetzen, gelöst oder durch die Waschstoppübergänge bewegt werden. Jeder Stoppübergang ist stark genug, um dem statischen Druck zu widerstehen, der mit dem Gravitations- oder Kopfdruck verbunden ist, der durch das Blut in jeder Aufbringungsvertiefung 35 oder 36 erzeugt wird. Vorzugsweise ist jede Aufbringungsvertiefung an diesem Punkt im Verdünnungsprozeß etwa ein Drittel der Strecke gefüllt, was einen leichten Gravitationskopfdruck erzeugt. Die Aufbringungsvertiefungen sind derart gestaltet, daß der Kopfdruck nicht genügt, um entweder die Mischkammereinlaß- Stoppübergänge 44 und 45 oder die Waschstoppübergänge 51 und 52 zu durchbrechen. Es ist wichtig, daß die vier Stoppübergänge nicht durchbrechen. Daher sind die Stoppübergänge mit einer genügend kleinen Querschnittsfläche bemessen, so daß sie dem Kopfdruck standhalten, der durch die Probe in den Aufbringungsvertiefungen verursacht wird. Typische Durchmesser für kreisförmige Waschstoppübergänge liegen im Bereich von 0,375 mm bis 0,75 mm und weisen vorzugsweise einen Durchmesser von 0,5 mm auf.
An diesem Punkt in dem Verdünnungsverfahren befinden sich ungefähr fünfundachtzig der ursprünglichen einhundert Mikroliter der Blutprobe noch in den Aufbringungsvertiefungen 35 und 36. Etwa fünfzehn Mikroliter der Probe befinden sich in den Mischkammer- Einlaßkapillaren 41 und 42. Das Antikörper enthaltende, getrocknete Reagens, das in den Aufbringungsvertiefungen abgeschieden ist, hat begonnen, sich in dem Blut aufzulösen. Um für ein verstärktes Mischen und Lösen der Reagenzien auf der Basis von Konvektion und Diffusion zu sorgen, wird das Modul durch das Abbildungsinstrument hin- und herbewegt.
Wie in Fig. 3, 4 und 9 gezeigt, ist die obere Platte 22 des Moduls 20 so konstruiert und ausgelegt, daß die Blutprobe in jeder Aufbringungsvertiefung 35 und 36 bleibt und nicht aus der Vertiefung herausschwappt. Die Aufbringungsvertiefung ist mit einem maximalen Volumen gestaltet, so daß die Vertiefung nach dem Aufbringen der Probe nur etwa ein Drittel der Strecke gefüllt ist. Ferner weist die Vertiefung scharfe Kanten auf, um die Probe und das Reagens innerhalb der Vertiefung zu halten, wenn das Modul hin- und herbewegt wird. Somit sorgt die Aufbringungsvertiefungsgestaltung für ein gutes Vermischen, so daß innerhalb etwa drei Minuten der Hin- und Herbewegung der Antikörper homogen in der Blutprobe gelöst ist.
Der Teil der Blutprobe, der sich in den Einlaßkapillaren 41 und 42 befindet, wurde jedoch wenig oder nicht dem Antikörper enthaltenden Reagens ausgesetzt. Um die Blutzellen in den Kapillaren dem Antikörper auszusetzen, muß die restliche Reagens enthaltende Probe von den Aufbringungsvertiefungen 35 und 36 in die Mischkammern 48 und 49 überführt werden. Eine solche Überführung ist besonders wichtig, wenn mehrere Tests an mehreren Modulen innerhalb desselben Abbildungsinstruments durchgeführt werden und die Inkubation von jeder Probe und jedem Reagens gleichzeitig stattfindet. Wenn der Teil der Probe von jeder Einlaßkapillare nicht zur Mischkammer überführt wird, dann findet eine unvollständige Inkubation der Probe statt, was einen Fehler in die Analyse des Abbildungsinstruments einführen kann.
An diesem Punkt in dem Testprozeß werden siebzig der fünfundachtzig Mikroliter der Probe von den Aufbringungsvertiefungen 35 und 36 und fünfzehn Mikroliter der Probe von den Einlaßkapillaren 41 und 42 durch die Summe der Kapillar-, Gravitations- und Zentrifugalkräfte zu den Mischkammern 48 und 49 überführt. Fünfzehn Mikroliter von vereinigter Probe und Reagens bleiben in jeder Einlaßkapillare. Das Schleudern des Moduls 20 vermeidet die direkte Druckbeaufschlagung der Aufbringungsvertiefung, vermeidet die Verwendung von Pumpen und von irgendeiner anderen Art physischem Kontakt mit dem Modul. Das Schleudern des Moduls sieht eine Zentrifugalbeschleunigung der Fluide in der Einlaßkapillare vor, wodurch die primäre Kraft erzeugt wird, die den Kapillargegendruck an den Einlaßstoppübergängen 44 und 45 überwindet. Durch Schleudern von mehreren Modulen auf einer einzigen Aufnahmeplatte 110 eines Abbildungsinstruments, siehe Fig. 12, kann überdies die Überführung der Probe in die Mischkammern für eine Vielzahl von Modulen gleichzeitig durchgeführt werden.
Die Überführung der Probe in die Mischkammern 48 und 49 wird durch Bemessen der Querschnittsfläche und der radialen Position der Einlaßstoppübergänge 44 und 45 bewirkt, wie hierin weiter erörtert. Der bevorzugte Durchmesser von kreisförmigen Einlaßstoppübergängen beträgt ungefähr 1, 1 mm. Wenn das Modul 20 mit einer Drehgeschwindigkeit geschleudert wird, um eine geringe Zentrifugalbeschleunigung an der Fluidsäule, die zu den Einlaßstoppübergängen führt, zu erzeugen, z. B. achtzig Umdrehungen pro Minute (U/min), wird folglich ein Druck in den Mischkammer-Einlaßkapillaren 41 und 42 vorgesehen, der den Gegendruck an den Einlaßstoppübergängen überwindet. Der Kapillargegendruck kann durch Behandeln des ABS- Modulmaterials mit einem Sauerstoffplasma erhöht werden.
Beim Schleudern des Moduls 20 strömt die Probe mit Reagens von den Aufbringungsvertiefungen 35 und 36 in die Mischkammern 48 und 49. Wenn die ursprüngliche Probe, die auf jede Aufbringungsvertiefung aufgebracht wurde, einhundert Mikroliter ganzes Blut enthielt, ist jede Mischkammer mit ungefähr fünfundachtzig Mikrolitern Antikörper enthaltendem Blut gefüllt, da fünfzehn Mikroliter in den Mischkammer-Einlaßkapillaren 41 und 42 bleiben. Außerdem sind die Einlaßkapillaren derart bemessen, daß die Kapillarkräfte darin stark genug sind, so daß die Einlaßkapillaren bei der maximalen Modulschleudergeschwindigkeit mit Probe gefüllt bleiben. Somit bleibt jede Mischkammer-Einlaßkapillare mit Blut gefüllt, was den Fluidkontakt mit den Mischkammereinlaß- Stoppübergängen 44 und 45 aufrechterhält. Ebenso hält die Probe in den Einlaßkapillaren den Fluidkontakt mit den Waschstoppübergängen 51 und 52 aufrecht, was für die Funktion des Moduls entscheidend ist.
Nach der Bewegung zu den Mischkammern 48 und 49 hat sich der Teil der Blutprobe, der sich in jeder Einlaßkapillare 41 und 42 befand, mit dem Blut vermischt, das sich vorher in jeder Aufbringungsvertiefung 35 und 36 befand, die nun ohne Probe ist. Die Blutprobe hat sich auch mit dem Reagens vermischt, das den Fluoreszenzantikörper enthält, und das Gemisch inkubiert und reagiert in der Mischkammer. Von der Probe von ursprünglich einhundert Mikrolitern befinden sich nun etwa fünfundachtzig Mikroliter in jeder Mischkammer. Etwa fünfzehn Mikroliter der Probe stammen von der Einlaßkapillare und enthielten wahrscheinlich nicht viel Antikörper. Die anderen siebzig Mikroliter stammen von der Aufbringungsvertiefung und weisen genügend Antikörper für die gesamte Probe auf.
Es ist entscheidend, das Volumen der Mischkammer- Einlaßkapillaren 41 und 42 klein zu halten, um die Volumenänderung der Probe, die kein Reagens aufweist, zu minimieren, wenn sie in die Mischkammern 48 und 49 eintritt. Es stellt sich auch heraus, daß das Minimieren des Kapillarvolumens in den nächsten Prozeßschritten wichtig ist, in denen die restliche Probe in jeder Einlaßkapillare in die Mischkammern gespült wird. Beim Optimieren des Tests werden auch überschüssige Mengen an Antikörper verwendet, so daß ein breiter Bereich von Konzentrationen vorliegt, die den korrekten Grad an Probenmarkierung vorsehen.
An diesem Punkt in dem Verdünnungsprozeß wurden die Blutprobe und das Reagens in die Mischkammern 48 und 49 zur Inkubation überführt. Es ist für einen CD4-/CD8-Versuch erwünscht, daß die Antikörper an so viele der Antigenstellen wie möglich binden. Somit sollte man die Probe und das Reagens für einen ausreichenden Zeitraum reagieren oder inkubieren lassen, um die Reaktion zur Vervollständigung zu bringen, z. B. zwanzig Minuten. Das Abbildungsinstrument kann dazu ausgelegt sein, während des Inkubationszeitraums das Schleudern des Moduls 20 zu stoppen oder fortzusetzen. Es ist bevorzugt, das Schleudern des Moduls zu stoppen, um die Zellenwanderung zu minimieren, um das Instrumentgeräusch und den Verschleiß zu verringern und um eine Qualitätskontrolldiagnostik auszuführen. Öffnungen 95 und 96 zur optischen Abtastung, die in Fig. 3 und 9 gezeigt sind, sind beispielsweise vorgesehen, um zu ermöglichen, daß das Abbildungsinstrument die Anwesenheit einer Probe in den Mischkammern 48 und 49 nachweist.
Nachdem die Inkubation vollständig ist, besteht der nächste Schritt darin, die Probe zu verdünnen und dann einen Teil des Probe- und Verdünnungsmittelgemisches zum Abtasten durch das Abbildungsinstrument zu überführen. Ein Grund für das Verdünnen besteht darin, das Fluoreszenzhintergrundrauschen, das durch überschüssigen Antikörper verursacht wird, zu senken. Um den Testinkubationszeitraum zu minimieren und um die Reaktion zur Vervollständigung zu bringen, wird in dem Reagens eine große Menge an überschüssigen Antikörpern verwendet. Nachdem die Blutzellen in der Probe markiert wurden, bleiben die meisten der Antikörper in der flüssigen Phase der Probe, d. h. dem Plasma, suspendiert. Ein weiterer Grund zum Verdünnen ist die Verringerung der Dichte von roten Blutzellen in der Probe. Solche Zellen sind relativ groß und stören die Fähigkeit des Abbildungsinstruments, die Fluoreszenzsignale der Zielzellen zu verarbeiten.
Wenn ein unverdünntes Gemisch von Antikörper enthaltenden Zellen und Plasma abgetastet wird, kann das Plasma einen unerwünschten Fluoreszenzpegel relativ zu den markierten Zellen aufweisen. Obwohl die fluoreszenzmarkierten Zellen von der Hintergrundfluoreszenz unterscheidbar sein können, kann die Menge an Rauschen, die durch den überschüssigen Antikörper verursacht wird, für eine genaue Analyse ungeeignet sein. Um die Präzision und Genauigkeit des Tests zu optimieren, wird das Probengemisch folglich um einen Faktor 2,75 : 1 verdünnt, um das Hintergrundrauschen auf einen annehmbareren Pegel zu bringen.
Wie in Fig. 2 gezeigt, ist eine aus Glas oder einem ähnlichen leicht zerbrechbaren Material bestehende Ampulle 60 in dem Modul 20 angeordnet oder befestigt. Die Glasampulle wird während der Montage des Moduls in eine Haltekammer oder einen Verdünnungsmittelbehälter 62 eingesetzt. Beim bevorzugten Ausführungsbeispiel enthält die zylindrische Glasampulle etwa eintausend Mikroliter Verdünnungsmittel, wie z. B. Dulbecco's Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS), die von Curtin Mathison Scientific in Houston, Tx (CMS), erhältlich ist, vermischt mit Rinderalbumin (BSA), das auch von CMS erhältlich ist, und kristallinem Natriumazid, das von Sigma Corp. in St. Louis, Mo, erhältlich ist. Die Ampullen bestehen aus Glas und sind so ausgelegt und gefertigt, daß sie sehr regelmäßig brechen. Die bevorzugte Ampulle ist elliptisch mit einem Durchmesser von 8,0 mm und einer Länge von etwa 38,6 mm. Diese spezielle Form der Ampulle ist von James Alexander Corp. in Blairstown, NJ, erhältlich.
Um das Probengemisch zu verdünnen, wird das Modul 20 mit einer Welle oder einem ähnlichen Element des Abbildungsinstruments (nicht dargestellt) gestoßen, um die Glasampulle 60 zu zerbrechen und das Verdünnungsmittel in den Verdünnungsmittelbehälter 62 freizugeben. Eine obere Wand 64 des Verdünnungsmittelbehälters wird durch die Welle ausreichend nach unten durchgebogen, so daß die Ampulle zerbrochen wird. Wenn das Abbildungsinstrument einzeln auf die Module schlägt, wenn eine Vielzahl von Probenmodulen verarbeitet werden, können die Probengemische nicht exakt gleichzeitig verdünnt werden, was nicht optimal ist. Für den CD4/CD8-Versuch, wie hierin beschrieben, ist das Zerbrechen der Glasampullen nacheinander angemessen.
Wie in Fig. 6, 7 und 11 gezeigt, ist eine Verdünnungsmittel-Austrittskapillare 66 in der mittleren und der unteren Platte 26 und 30 des Moduls 20 angeordnet, um Verdünnungsmittel aus dem Verdünnungsmittelbehälter 62 zu fördern. Die Verdünnungsmittel-Austrittskapillare weist vorzugsweise einen kreisförmigen Querschnitt auf. Wenn die Glasampulle 60 durch das Abbildungsinstrument zerbrochen wird, füllt das Verdünnungsmittel die Austrittskapillare durch eine Kombination von Gravitations- und Kapillarkräften. Die Verdünnungsmittelkapillare füllt sich bis zu ihrem distalen Ende, an dem ein Verdünnungsmittelaustritts-Stoppübergang 68 in der mittleren Platte 26 angeordnet ist, Fig. 5 und 6. Da ein unzureichender Kopfdruck von dem Pegel des Verdünnungsmittels in dem Behälter erzeugt wird, um die Kapillarstärke des Verdünnungsmittel-Stoppübergangs zu überwinden, verhindert der Stoppübergang, daß das Verdünnungsmittel weiter in das Modul fließt. Folglich kann das Abbildungsinstrument nacheinander die Glasampullen von anderen Modulen zerbrechen, ohne daß sich das Verdünnungsmittel mit den Proben vermischt. Dies sieht eine mehrfache Verarbeitung von Modulen vor, wobei die Verdünnung der Probe in den Mischkammern gleichzeitig geschieht.
Dieselbe Verdünnungsmittel enthaltende Glasampulle 60 wird zum Verdünnen der Proben von beiden Aufbringungsvertiefungen 35 und 36 für jedes Modul 20 verwendet. Alternativ könnte eine separate Glasampulle oder Verdünnungsmittelquelle für jede Aufbringungsvertiefung und Probe bereitgestellt sein. Ebenso könnte das Verdünnungsmittel an die Aufbringungsvertiefung oder eine ähnliche Einlaßöffnung durch das Abbildungsinstrument oder den Benutzer verabreicht werden. Die in Fig. 2 dargestellte Konstruktion des Moduls sieht eine einzige Glasampulle vor, was die Größe und Kosten des Moduls verringert, während eine Verdünnungsmittelquelle aus dem Abbildungsinstrument beseitigt wird.
Der nächste Schritt bei dem Verdünnungsprozeß besteht darin, das Verdünnungsmittel in die Mischkammern 48 und 49 zu bewegen. Wie in Fig. 5 und 6 gezeigt, werden eine Vielzahl von Kapillaren und Stoppübergängen verwendet, um die restliche Probe aus jeder Mischkammer-Einlaßkapillare 41 und 42 in jede Mischkammer zu spülen. Die Kapillare in dem Verdünnungsmittelaustritts-Stoppübergang 68 ist so bemessen, daß das Verdünnungsmittel den Stoppübergang bei einer Schleudergeschwindigkeit durchquert, die geringfügig niedriger als achtzig U/min ist. Das Modulschleuderprofil ist vorzugsweise derart, daß die Schleudergeschwindigkeit in zehn Sekunden linear auf achtzig U/min erhöht wird, für fünfzig Sekunden bei achtzig U/min gehalten wird und in fünf Sekunden linear auf Null U/min gesenkt wird. Ein solches Schleuderprofil könnte auch für die bisher beschriebenen Schritte des Durchbrechens der Mischkammereinlaß-Stoppübergänge 44 und 45 verwendet werden.
Wenn der durch das schleudernde Modul 20 verursachte Fluiddruck den Verdünnungsmittelaustritts-Stoppübergang 68 überwindet, tritt das Verdünnungsmittel in den Verdünnungsmittelquerkanal 70 ein, der in der unteren Fläche 24 der oberen Platte 22 und der oberen Fläche 27 der mittleren Platte 26 angeordnet ist, Fig. 4 und 5. Der Fluiddruck bringt das Verdünnungsmittel durch den Querkanal und in eine Verdünnungsmittelquerkanal-Austrittskapillare 72, die in der mittleren Platte angeordnet ist, Fig. 5 und 6. Das Verdünnungsmittel strömt in einen Verdünnungsmittelverbindungskanal 74 weiter, der in der unteren Fläche 28 der mittleren Platte und der oberen Fläche 31 der unteren Platte 30 angeordnet ist, Fig. 6 und 7. Der Verdünnungsmittelverbindungskanal umfaßt einen ersten Verbindungsarm 75 und einen zweiten Verbindungsarm 76, die jeweils eine Entlüftungsöffnung 77 und 78 zum Ablassen von Luft, wenn das Fluid die Kapillare füllt, aufweisen.
Der Verdünnungsmittelverbindungskanal stellt eine Schnittstelle zu den Mischkammer-Einlaßkapillaren 41 und 42 bereit. Der erste Verbindungsarm 75 befindet sich in der Unterseite der mittleren Platte 26 unterhalb des ersten Waschstoppübergangs 51. Ebenso befindet sich der Verbindungsarm in der Unterseite der mittlere Platte unterhalb des zweiten Waschstoppübergangs 52. Somit wird zwischen dem Verdünnungsmittel und der Blutprobe an den Waschstoppübergängen eine Flüssigkeitsgrenzfläche gebildet. Folglich wird ein durchgehender Fluidkreislauf zwischen dem Verdünnungsmittel in dem Behälter 62 und den Mischkammern 48 und 49 gebildet, was bewirkt, daß das Verdünnungsmittel die restliche Blutprobe in den Mischkammerkapillaren auswäscht.
Da jede Mischkammer 48 und 49 radial auswärts vom Verdünnungsmittelbehälter 62 positioniert ist, wird eine Zentrifugalantriebskraft durch die Zentrifugalbeschleunigung erzeugt, die eine Verdünnungsmittelströmung von dem Verdünnungsmittelbehälter in die Mischkammern bewirkt. Der Verdünnungsmittelbehälter entleert sich durch die Verdünnungsmittelaustrittskapillare 66, den Verdünnungsmittelquerkanal 70 und den Verdünnungsmittelverbindungskanal 74. Das Verdünnungsmittel wird durch jeden Waschstoppübergang 51 und 52 getrieben und wäscht jede Mischkammer-Einlaßkapillare 41 und 42 aus. Das Verdünnungsmittel spült die Reagens enthaltende Blutprobe aus den Einlaßkapillaren in die Mischkammern.
Daher strömt das Verdünnungsmittel von der zerbrochenen Glasampulle 60 in den Verdünnungsmittelbehälter 62, durch die Austrittskapillare 66, den Austrittsstoppübergang 68 hinauf, durch den Querkanal 70 und die Querkanal- Austrittskapillare 72 hinab zum Verdünnungsmittelverbindungskanal 74. An diesem Punkt in dem Testprozeß für mehrere Tests in demselben Modul wird die Strömung des Verdünnungsmittels in mindestens zwei verschiedene Richtungen umgeleitet. Das Verdünnungsmittel strömt in den ersten Verbindungsarm 75 und in den zweiten Verbindungsarm 76. Das Verdünnungsmittel wird jeden Waschstoppübergang 51 und 52 hinauf und in die Mischkammer- Einlaßkapillaren 41 und 42 getrieben, um das restliche Blutprobengemisch durch die Mischkammer-Einlaßkapillaren 44 und 45 hinab in die Mischkammern 48 und 49 zu spülen.
Das Verdünnungsmittel füllt jede Mischkammer 48 und 49 vollständig, bis das Verdünnungsmittel die Mischkammer- Entlüftungsöffnungen 80 und 81 füllt. Während sich die Mischkammern mit Verdünnungsmittel füllen, wird Luft die Entlüftungsöffnungen hinausgeschoben, die als Stoppübergänge wirken. Die zwei Entlüftungsöffnungen sind klein genug bemessen, so daß sie einer Flüssigkeitsströmung aus den Mischkammern standhalten und diese verhindern. Es besteht unzureichender Druck, um die Kapillarstärke der Mischkammer-Entlüftungsöffnungen an diesem Punkt zu überwinden, und das Verdünnungsmittel hört auf zu strömen, wenn das Probe- und Verdünnungsmittelgemisch die Mischkammern einmal vollständig füllt.
Jede Mischkammer 48 und 49 ist mit etwa zweihundertfünfundsiebzig Mikrolitern Fluid gefüllt, einschließlich fünfundachtzig Mikrolitern Blutprobe und Reagens, die vorher zugegeben wurden, fünfzehn Mikrolitern Blutprobe aus den Einlaßkapillaren 41 und 42 und einhundertfünfundsiebzig Mikrolitern Verdünnungsmittel. Somit wird zumindest eine zehnfache Auswaschung der Einlaßkapillaren durchgeführt, um alle Blutzellen aus jeder Einlaßkapillare und in die Mischkammer zu entfernen. Das Auswaschverhältnis von Verdünnungsmittel zu restlicher Blutprobe ist wichtig zum Beseitigen von irgendeinem Absetzen der Blutzellen in den Einlaßkapillaren.
An diesem Punkt wird das Schleudern des Moduls 20 gestoppt. Es ist wichtig, zu erkennen, daß jede Kapillare, jeder Behälter und jeder Stoppübergang gestaltet ist, um zu ermöglichen, daß das Modul wieder einen statischen Zustand annimmt, ohne daß sich die Fluide weiter innerhalb des Moduls bewegen. Vor der Analyse durch das Abbildungsinstrument müssen das Verdünnungsmittel, die Blutprobe und das Reagens in den Mischkammern 48 und 49 gründlich vermischt werden. Vorzugsweise enthält jede Mischkammer ein Mischelement, das durch eine Kraft außerhalb des Moduls bewegt werden kann. Ein Magnet in dem Abbildungsinstrument kann beispielsweise verwendet werden, um eine Kugel oder ein ähnliches Mischelement im Inneren der Mischkammer geradlinig hin- und herzubewegen. Alternativ kann das Modul hin- und herbewegt werden, um zu bewirken, daß eine Kugel die Fluide innerhalb der Mischkammer durchrührt.
Das Modul 20 und die zugehörigen Kapillaren und Stoppübergänge sind gestaltet, um zu gewährleisten, daß, wenn das Modul aufhört, zu schleudern, jede der Fluidgrenzflächen aufrechterhalten wird. Die Stoppübergänge verhindern, daß sich die Fluide von einer Kammer oder Kapillare zu einer anderen bewegen, wobei somit die Fluidpositionen stabilisiert werden, wenn sich das Modul einmal in Ruhe befindet. Die Stärke der Stoppübergänge liegt im Bereich von 10-40 Millimetern Wasser, was mehr als ausreichend ist, um das Verdünnungsmittel und die Probe in Position zu halten. Wenn sich die Probe, das Reagens und das Verdünnungsmittel einmal in den Mischkammern 48 und 49 befinden, muß das Fluidgemisch gründlich vermischt werden. Ein Verfahren zum Mischen würde darin bestehen, alle Module 20 in dem Abbildungsinstrument gleichzeitig zu mischen. Gleichzeitiges Mischen könnte durch gleichzeitiges Hin- und Herbewegen aller Module durchgeführt werden. Ein weiteres Verfahren zum Mischen der Fluide in den Mischkammern besteht darin, jedes Modul zu einer feststehenden Mischstation in dem Instrument weiterzuschalten. Sequentielles Mischen erfordert, daß jedes Modul zu einer anderen Position für jede Mischkammer in dem Modul weitergeschaltet wird.
Gleichzeitiges Mischen der Fluide in den Mischkammern 48 und 49 kann dieselbe Hin- und Herbewegung verwenden, die vorher in dem Testprozeß verwendet wurde, um das Reagens in den Aufbringungsvertiefungen 35 und 36 zu lösen. Um das Mischen zu erleichtern, sind die Mischkammerwände mit einem Winkel geformt, so daß, wenn sich das Modul 20 hin- und herbewegt, eine Mischkugel 97 und 98 sich in einer Dreieckbewegung innerhalb jeder Mischkammer bewegt. Somit sieht jede Mischkammer aller Module gleichzeitig ein Mischen vor.
Gleichzeitiges Mischen hat einige Vorteile gegenüber dem sequentiellen Mischen. Die Hin- und Herbewegung des Moduls 20 beseitigt beispielsweise unerwünschte Magnetkräfte, die bei dem sequentiellen Verfahren verwendet werden können. Ebenso wird der Bedarf für einen magnetischen Mischmechanismus in dem Abbildungsinstrument beseitigt.
Ebenso steht der Hin- und Herbewegungsmechanismus zur Verfügung, da die Module in einem vorherigen Schritt hin- und herbewegt werden. Überdies wird das Mischen aller Module gleichzeitig durchgeführt; daher besteht keine Verzugszeit vom Mischen der ersten Mischkammer 48 und 49 bis zum Mischen der letzten Mischkammer. Ein Nachteil der Hin- und Herbewegung der Module besteht darin, daß nicht die volle Länge der Mischkammer von der Mischkugel 97 und 98 durchlaufen werden kann. Somit kann eine Kombination von gleichzeitigem und sequentiellem Mischen erwünscht sein.
Das Verfahren zum sequentiellen Mischen verwendet einen Permanentmagneten, der in einer geradlinigen Bewegung in dem Abbildungsinstrument bewegt wird, und einen Magnetrührer in den Mischkammern 48 und 49 jedes Moduls 20. Der Rührer kann eine Metall- oder Keramikmischkugel 97 und 98, ein Stab oder ein ähnlicher Mechanismus sein, wie es üblichen Fachleuten gut bekannt ist. Das Abbildungsinstrument bewegt jedes Modul oder schaltet es weiter, so daß sich die Mischkammer nahe dem Magnetfeld befindet, wobei eine Mischkammer auf einmal weitergeschaltet wird. Jede Mischkugel wird dann innerhalb der Kammer im Bereich von zehn bis zwanzig Hertz für ungefähr zwei bis zehn Sekunden hin- und herbewegt. Das Abbildungsinstrument schaltet nacheinander zu jedem Modul weiter, bis alle Mischkammern gründlich gemischt sind.
Einer der Nachteile des sequentiellen Mischens ist die Neigung der Komponenten der Probe, sich abzusetzen. Insbesondere könnten die Zellen in einer Blutprobe einen Fehler in die Analyse der Probe einführen. Von der Zeit, in der die erste Mischkammer 48 gemischt wird, bis zu der Zeit, in der die letzte Mischkammer 49 gemischt wird, wird der Probe in der ersten Mischkammer eine signifikante Menge an Zeit gestattet, sich abzusetzen. Bei der offenbarten Anordnung wird die verdünnte Probe aus jeder Mischkammer aus der Oberseite des Behälters überführt. Wenn ein signifikantes Absetzen stattgefunden hat, liegen andere (weniger) Zellen in dem Teil der entfernten Probe vor, als jenem, der in der Mischkammer verbleibt. Wenn die Probe nahe dem Boden der Mischkammer abgeführt wird, weist ebenso der Teil der entfernten Probe einen unerwünschten hohen Zellenzählwert auf. Wenn irgendeine signifikante Absetzung stattgefunden hat, wird somit ein Fehler in der Abbildungsanalyse von einer nicht-homogenen Probe eingeführt. Um eine gleichmäßige Verteilung der Probe innerhalb der Mischkammern aufrechtzuerhalten, wird jede Mischkammer wieder nahe den Magneten in dem Abbildungsinstrument weitergeschaltet und jede Mischkugel 97 und 98 wird für 0,2 bis 1,0 Sekunden mit zwei bis zehn Hertz hin- und herbewegt. Dieser letzte Mischschritt wird direkt vor dem Füllen der Abtastkapillaren 100 und 101 durchgeführt.
Nachdem die Probe, das Reagens und das Verdünnungsmittel vermischt sind, wird das Modul 20 einem Schleudern mit hoher Geschwindigkeit unterzögen, um einen Teil der verdünnten Probe in ein Paar von Abtastkapillaren 100 und 101 für jeden Test zu bewegen. Die Module werden in zehn Sekunden linear auf einhundertzehn U/min erhöht, bei dieser Geschwindigkeit für zwanzig Sekunden gehalten und dann in fünf Sekunden auf Null U/min abgebremst. Während des Hochgeschwindigkeitsschleuderns strömt ein Teil der gemischten Probe aus den Mischkammern 48 und 49 durch die Mischkammer-Entlüftungsöffnungen 80 und 81, die ansonsten als Stoppübergänge wirken. Das Hochgeschwindigkeitsschleudern erzeugt genügend Druck an den Entlüftungsöffnungen, um den Stoppübergangsgegendruck zu überwinden.
Die verdünnte Probe strömt von den Mischkammer- Entlüftungsöffnungen 80 und 81 durch ein Paar von Abtastkapillaren-Verbindungskanälen 84 und 85 in der oberen Oberfläche 27 der mittleren Platte 26 und der unteren Oberfläche 24 der oberen Platte 22. Die verdünnte Probe strömt weiter durch ein Paar von Abtastniveau- Transportkanälen 86 und 87 in der unteren Oberfläche 28 der mittleren Platte. Der Druck des Fluids bewegt die verdünnte Probe durch die Transportkanäle in ein Paar von Abtastkapillaren-Eintrittskanälen 88 und 89 und bis durch zwei Abtastkapillaren-Eintrittsöffnungen 90 und 91.
Wie in Fig. 2 und 5 gezeigt, ist jede Abtastkapillare 100 und 101 in einem Sockel 102 und 103 für jede durchzuführende Abbildungsanalyse montiert. Die Sockel sind an der mittleren Platte 26 montiert und liegen innerhalb Sockelausschnitten 105 und 106 in der oberen Platte 22. Ein Ende jeder Abtastkapillare ist nahe den Abtastkapillaren- Eintrittsöffnungen 90 und 91 angeordnet. Die Abtastkapillaren sind an einem Ende zum Entlüften offen und am anderen Ende mit den Eintrittsöffnungen verbunden. Die verdünnte Probe strömt in jede Abtastkapillare durch eine Kombination von Zentrifugalkräften, Kapillarkräften und Gravitationskräften. Der Druck an den Abtastkapillaren- Eintrittsöffnungen verursacht, daß sich die Abtastkapillare von einem Ende zum anderen füllt. Der erhöhte Druck, der durch die Zentrifugalbeschleunigung des Fluids, das in die Abtastkapillare eintritt, verursacht wird, verhindert eine Blasenbildung, die üblicherweise zu sehen ist, wenn eine Abtastkapillare durch Kapillar- und Gravitationskräfte allein gefüllt wird. Es wurde beobachtet, daß eine Blasenbildung durch die Form des Meniskus beeinflußt wird, die durch den Gesamtdruck am Eingang in die Abtastkapillare beeinflußt wird.
Jede Abtastkapillare 100 und 101 weist äußere Abmessungen von etwa 54,0 mm Länge mal 0,255 mm Höhe und etwa 0,870 mm Breite auf. Der innere Querschnitt jeder Abtastkapillare bildet ein Rechteck von etwa 0,1 mm mal 0,666 mm, das sehr starke Kapillarkräfte erzeugt. Wenn die verdünnte Probe das Ende der Abtastkapillare erreicht, verhindern die starken Kapillarkräfte, daß die Probe aus dem distalen Ende der Abtastkapillare ausströmt. Die verdünnte Probe strömt bis zu einem Punkt, an dem sich der Verdünnungsmittelbehälter 62 in etwa derselben radialen Position befindet wie die Verdünnungsmittelaustrittskapillare 66, so daß kein oder geringer Zentrifugaldruck an dem Fluid am Austrittsende der Abtastkapillare besteht. Somit besteht eine geringe oder keine Antriebskraft, daß die verdünnte Probe aus der Abtastkapillare herausgeschoben wird, wenn sie einmal vollständig gefüllt ist.
Die Abtastkapillaren 100 und 101 füllen sich mit etwa 2,75 Mikrolitern der verdünnten Probe. Von den 275,0 Mikrolitern der verdünnten Probe, die in der Aufbringungsvertiefung 48 und 49 vermischt wird, werden nur 2,75 Mikroliter durch das Abbildungsinstrument abgetastet, um Zellen zu zählen. Der innere Querschnitt jeder Abtastkapillare ist vorzugsweise rechteckig geformt, um eine abgegrenzte Kante zum Erkennen für das Abbildungsinstrument zu erzeugen. Die Abtastkapillaren bestehen vorzugsweise aus Glas mit hoher Qualität, wie z. B. jenem, das unter der Handelsmarke "PYREX 7740" von Corning Corp., in Corning N.Y., oder unter der Handelsmarke "DURAN 8330" von Schott Glass Technologies, Inc. in Duryea, PA, vertrieben wird. Andere geeignete Materialien für die Abtastkapillaren sind Acryl, wie z. B. "Plexiglas VS-UVT", das von AltoHaas, North American Ltd. in Bristol, PA, erhältlich ist, und Polystyrole, wie z. B. "Styron 663", das von der Dow Chemical Company in Midland, MI, erhältlich ist.
Die vorliegende Erfindung umfaßt ein Testanordnungsmodul, das die Verwendung von geringen Zentrifugalbeschleunigungen beinhaltet, um eine ganze Blutprobe zu verdünnen. Die Verwendung von geringen Zentrifugalbeschleunigungen zum Bewegen der Fluide innerhalb des Moduls weist mehrere Vorteile gegenüber der Verwendung von hohen Schleudergeschwindigkeiten und somit hohen Zentrifugalbeschleunigungen auf. Zuerst ist es wichtig, daß die Blutkomponenten, wie z. B. Ziellymphozyten und rote Blutzellen, nicht signifikant von ihrer natürlichen Verteilung innerhalb der Probe abweichen. Während viele Modulkonstruktionen des Standes der Technik speziell für die Zelltrennung ausgelegt sind, war das Aufrechterhalten einer homogenen Zellen- oder Teilchenverteilung innerhalb der Probe bisher von geringem oder keinem Belang bei der Modulgestaltung. Bei der vorliegenden Erfindung ist jedoch der Fluidkreislauf, d. h. die Anordnung der Aufbringungsvertiefungen, Behälter, Kammern, Kanäle und Kapillaren, hauptsächlich ausgelegt, um die Zellenwanderung zu minimieren und eine homogene Verteilung von Teilchen in der Probe aufrechtzuerhalten. Außerdem werden die auf das Modul aufgebrachten Zentrifugalbeschleunigungen bei niedrigen Werten gehalten, um Abbildungsinstrument- Aufnahmeplatten zu erlauben, die nicht dynamisch im Gleichgewicht sind, um den Verschleiß an dem Instrument zu minimieren. Ebenso ermöglicht die Verwendung von geringen Zentrifugalbeschleunigungen die Verwendung von Schrittmotoren und Modulregistrierungsverfahren, die nicht verfügbar wären, wenn hohe Zentrifugalbeschleunigungen verwendet werden würden.
Eines der zugrundeliegenden Prinzipien der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von Kapillarkräften, um Fluide ohne die Verwendung einer äußeren Kraft zu bewegen. Ein zweites zugrundeliegendes Prinzip ist, daß die Strömung von Fluid durch eine Kapillare durch die Erzeugung eines Stoppübergangs oder einer Strömungsstoppkapillare gestoppt werden kann. Bei der vorliegenden Erfindung ist ein Stoppübergang in dem Modul durch Erzeugen eines scharfen Übergangs von einer Kapillare mit relativ kleinem Durchmesser zu einem Kanal oder einer Kammer mit relativ größerem Durchmesser gestaltet. Die Oberflächenspannung des Fluids in der Kapillare erzeugt einen Gegendruck in der Kapillare, der eine Strömung verhindert. Jede Kapillare, die einen Stoppübergang bildet, ist derart ausgelegt, daß die Summe der Kapillarkräfte und der Gravitationskräfte allein den Kapillargegendruck nicht überwindet. Ein drittes Prinzip, das bei der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist die Verwendung von geringen Zentrifugalbeschleunigungen, um den Gegendruck zu überwinden oder den Stoppübergang zu "durchbrechen". Eine geringe Zentrifugalbeschleunigung wird auf das Modul aufgebracht, welche einen Druck in der Flüssigkeit am Stoppübergang erzeugt, um eine Strömung durch den Stoppübergang auszulösen.
Gemäß der Erfindung ist die Zentrifugalbeschleunigung, die verwendet wird, um den Stoppüberganggegendruck zu überwinden, im Vergleich zu jener, die in Systemen des Standes der Technik zu finden ist, die ein Testanordnungsmodul schleudern, relativ gering. Während Systeme des Standes der Technik ein Modul mit einem Durchmesser von sechs Inch mit 4000 U/min schleudern können, ist ein Ausführungsbeispiel des Moduls der vorliegenden Erfindung dazu ausgelegt, auf einer Aufnahmeplatte mit einem Durchmesser von etwa zwölf Inch angeordnet zu werden, und wird nur mit 70 bis 150 U/min geschleudert. Eine Aufnahmeplatte von zwölf Inch kann zehn Module aufnehmen, wie in Fig. 12 gezeigt. Andere Ausführungsbeispiele von Fluidkreisläufen in einem Modul unter Verwendung einer geringen Zentrifugalbeschleunigung können verwendet werden, um sich auf größere Aufnahmeplatten mit mehr Modulen oder kleinere Aufnahmeplatten mit weniger Modulen einzustellen. Für Erläuterungszwecke übt eine Aufnahmeplatte mit einem Durchmesser von sechs Inch, die mit 4000 U/min schleudert, eine Zentrifugalbeschleunigung von etwa 1300 g (12750 m/s²) auf das Modul aus. Im Gegensatz dazu übt eine Aufnahmeplatte mit einem Durchmesser von zwölf Inch, die mit 150 U/min schleudert, nur etwa 2,5 g (24,5 m/s²) auf das Modul aus.
Einer der Gründe zum Aufrechterhalten einer geringen Zentrifugalbeschleunigung besteht darin, die Zellenwanderung während der Modulschleuderzeiträume zu minimieren. Als grobe Abschätzung erreicht eine rote Blutzelle eine Endgeschwindigkeit in menschlichem Plasma von etwa einem Mikrometer pro Sekunde, wenn sie einer Beschleunigung gleich jener der Schwerkraft auf Meeresspiegel unterzogen wird. Da das Abbildungsinstrument gegen die Teilchen- oder Zellenposition empfindlich ist, ist es vorteilhaft, die Zellenwanderung in der Abtastkapillare zu minimieren, beispielsweise die Teilchenwanderung auf jene von eintausend Teilchendurchmessern zu begrenzen.
Es ist auch wichtig zu verhindern, daß die Zellen in der Probe zu einer Wand der Abtastkapillare wandern, wo sich die Zellen ansammeln, was eine genaue Analyse der Probe verhindert. Wenn die Abtastkapillare der Länge nach entlang des Radius in dem Modul angeordnet ist, wie in Fig. 1 gezeigt, kann eine Zelle entlang eines Weges wandern, der sich auf der vollen Länge der Kapillare erstreckt. Wenn jedoch die Abtastkapillare im wesentlichen senkrecht zur radialen Achse der Aufnahmeplatte angeordnet ist, dann können die Zellen nur entlang eines vergleichsweise kurzen Weges wandern, bevor sie auf eine Kante der Abtastkapillare treffen und sich entlang ihrer Wand ansammeln.
Es gibt mehrere andere Gründe dafür, sich zu wünschen, daß eine Drehgeschwindigkeit der Abbildungsinstrument- Aufnahmeplatte und geringe Zentrifugalbeschleunigungen auf das Testanordnungsmodul aufgebracht werden, abgesehen von dem Problem der Zellenwanderung. Da das Abbildungsinstrument beispielsweise dazu ausgelegt ist, eine variable Anzahl von Modulen auf einer Aufnahmeplatte zu halten, wie in Fig. 12 gezeigt, wird in Erwägung gezogen, daß die Instrumentaufnahmeplatte 110 häufig nur teilweise mit Modulen beladen ist. Eine mit einer ungeraden Anzahl von Modulen beladene Aufnahmeplatte ist nicht dynamisch im Gleichgewicht. Somit können hohe Drehgeschwindigkeiten die Aufnahmeplatte Kräften aussetzen, die die Lagerflächen des Abbildungsinstruments beschädigen können. Bei niedrigen Geschwindigkeiten werden solche Kräfte stark vermindert, wodurch die Lebensdauer und Zuverlässigkeit des Instruments verbessert werden.
Da ein Schrittmotorsystem der Art, die in Erwägung gezogen wird, um die Abbildungsinstrument-Aufnahmeplatte zu schleudern, einen begrenzten dynamischen Bereich aufweist, ist es vorteilhaft, niedrige Drehgeschwindigkeiten der Aufnahmeplatte aufrechtzuerhalten. Für ein gegebenes Schrittmotorsystem mit einer feststehenden Anzahl von Schritten pro Umdrehung und einer maximalen Schrittrate besteht immer ein Kompromiß zwischen der maximalen erreichbaren Drehgeschwindigkeit und der minimalen Schrittweite oder Winkelauflösung des Systems. Wenn man ein System mit kleiner Winkeländerung pro Schritt haben will, dann ist es wichtig, das System so zu gestalten, daß es eine niedrige Winkelgeschwindigkeit bei dem gegebenen begrenzten dynamischen Bereich des Schrittmotors aufweist. Daher ist der Fluidkreislauf des Moduls dazu ausgelegt, daß er bei geringer Winkelgeschwindigkeit arbeitet, um die Verwendung einer Aufnahmeplatte zu ermöglichen, die eine kleine Winkeländerung pro Schrittmotorschritt erfährt.
Wenn die Winkelgeschwindigkeit zunimmt, dann nehmen ebenso auch die Zentripetalkräfte an dem Modul zu. Bei hohen Drehgeschwindigkeiten können die Kräfte groß genug sein, um eine spezielle Befestigung zu erfordern, um eine genaue Modulregistrierung aufrechtzuerhalten. Die Verwendung von geringen Drehgeschwindigkeiten hält die Zentrifugalkräfte auf einem genügend niedrigen Niveau, um einfache Modulregistrierungsmechanismen zu ermöglichen.
Somit ist es wichtig, wenn das Modul der vorliegenden Erfindung konstruiert wird, den minimalen Fluiddruck zu berechnen, der erforderlich ist, um einen Stoppübergang zu durchbrechen. Mehrere Variablen sind für eine solche Konstruktion relevant. Wie im Stand der Technik gelehrt wird, ist zuerst die Querschnittsfläche der Strömungsstoppkapillare, die den Stoppübergang bildet, grundlegend zum Erzeugen des Gegendrucks, der erforderlich ist, um die Fluidströmung für Flüssigkeit, die in der Probe verwendet wird, zu stoppen. Ebenso ist das Unterziehen des Moduls einer hohen Drehgeschwindigkeit oder das Erzeugen eines Gravitationskopfdrucks an einer Fluidsäule auf dem Fachgebiet bekannt. Die Flüssigkeitsoberflächenspannung und -dichte sind auch Faktoren, die zur Stärke des Stoppübergangs beitragen, werden jedoch normalerweise vielmehr als Konstanten anstatt als Konstruktionsvariablen behandelt. Ebenso ist der Kontaktwinkel zwischen der Kapillarwand und der Flüssigkeit von Bedeutung, aber bei Fehlen eines gewissen Herstellungsbehandlungsprozesses wie z. B. Plasmaätzen von ABS kann der Kontaktwinkel auch als Konstante behandelt werden. Es ist ein Teil der vorliegenden Erfindung, daß das, was bisher auf dem Fachgebiet nicht erkannt oder gelehrt wurde, die gezielte Gestaltung und Auswahl der radialen Position des · Stoppübergangs derart ist, daß eine "radiale Höhe" einer Fluidsäule gehandhabt wird, um den Druck am Stoppübergang zu erhöhen, um eine Fluidströmung auszulösen, ohne das Modul unnötig hohen Zentrifugalbeschleunigungen zu unterziehen.
Der Vorteil der Handhabung der radialen Position eines Stoppübergangs relativ zum innersten Punkt des Fluids in einer Kapillare kann durch Inspizieren von bestimmten grundlegenden Konstruktions- und Physikgleichungen, die nachstehend umrissen werden, erkannt werden. Solche Gleichungen können verwendet werden, um eine spezielle relative radiale Position zur innersten Position einer Kapillare herzuleiten, die erforderlich ist, um den · Kapillargegendruck für eine gegebene Stoppübergangs- Querschnittsfläche zu überwinden, die einer gewünschten Zentrifugalbeschleunigung und Drehgeschwindigkeit unterzogen wird, um eine minimale oder tolerierbare Teilchen- oder Zellenwanderung zu bewirken. Es ist die Differenz der radialen Position zwischen dem innersten Punkt einer Fluidsäule und der radialen Position des Stoppübergangs, die den Druck festlegt, der an einem Stoppübergang für irgendeine gegebene Zentrifugalbeschleunigung ausgeübt wird.
Was hierin folgt, ist eine Erörterung und Herleitung der zum Auswählen von radialen Positionen der Komponenten des Modulfluidkreislaufs verwendeten Gleichungen. Einige Beispiele werden gezeigt und in Tabelle 1 zusammengefaßt. Gleichung 1 definiert beispielsweise den Druck, der erzeugt werden muß, um eine Strömung durch einen Stoppübergang auszulösen. Gleichung 1 ist von einer Anpassung für die Kapillarsteighöhe der Young- und Laplace-Gleichung hergeleitet, wie in The Physical Chemistry of Surfaces, Vierte Ausgabe, von Arthur W. Adamson, umrissen. Wie in Fig. 14 gezeigt, ist der Radius "R" der Kapillare der Querschnittsradius der Kapillare. Wenn die Oberflächenspannung "γ" des Fluids und der Kontaktwinkel "θ" zwischen dem Fluid und der Kapillarwand einmal bekannt sind, kann der Kapillargegendruck "Pcap" des Stoppübergangs berechnet werden.
Gleichung 1 Pcap = 2γcos6/R
Pcap = Kapillardruck
γ = Oberflächenspannung von Blut
θ = Kontaktwinkel von Blut am Modul
R = Radius des Stoppübergangs
Gleichungen 2 bis 5 leiten die Gleichung für den Zentrifugaldruck "Pcent" her. Gleichung 2 ist die allgemeine Gleichung, die den Zentrifugaldruck mit der Dichte des Fluids,"ρ", der auf das Fluid aufgebrachten Zentrifugalbeschleunigung, "acent", und der radialen Höhe der Fluidsäule, "r&sub1;-r&sub0;", in Beziehung setzt. Beim Herleiten von Gleichung 2.1 wird die Annahme gemacht, daß die Fluiddichte konstant ist, da das Fluid bei den relevanten Drücken, denen das Fluid unterzogen wird, im wesentlichen nicht komprimierbar ist.
Gleichung 2 Pcent = ρacentdr
Gleichung 2.1 Pcent = ρ acentdr
In Gleichung 3 wird die Zentrifugalbeschleunigung hinsichtlich der Winkelgeschwindigkeit der Abbildungsinstrument-Aufnahmeplatte, "f", und der radialen Position eines Fluidsegments, gemessen vom Zentrum der Aufnahmeplatte, "r", ausgedrückt. Wie in Gleichungen 4 und 4.1 dargestellt, kann die Formel für die Zentrifugalbeschleunigung aus Gleichung 3 in Gleichung 2.1 eingesetzt werden.
Gleichung 3 acent = 4π²f²r
Gleichung 4 Pcent = 4π²ρf² rdr
Gleichung 4.1
Beim Herleiten von Gleichung 5 wurde Gleichung 4 integriert (siehe Gleichung 4.1) und der Zentrifugaldruck wird hinsichtlich der Fluiddichte, der Aufnahmeplatten- Winkelgeschwindigkeit, der Position des Einlasses oder des radial innersten Teils der Kapillare oder des Kanals, "r&sub0;" und der radialen Position des Kapillarauslasses oder des Stoppübergangs, "r&sub1;" ausgedrückt. Gleichung 5.1 ist eine andere Version von Gleichung 5, wobei der relative Beitrag der Summe und Differenz der radialen Terme zu sehen ist. Somit kann der durch die Zentrifugalbeschleunigung erzeugte Druck Pcent zum Überwinden des Kapillargegendrucks direkt durch Ändern der radialen Höhe der Fluidsäule (r&sub1; + r&sub0;) beeinflußt werden. Somit kann der Kapillargegendruck überwunden werden, ohne nur die mittlere radiale Position der Säule, was in Gleichung 5.1 als Beitrag (r&sub1; - r&sub0;)/2 zu finden ist, oder die Zentrifugalbeschleunigung zu ändern, die auf das Modul aufgebracht wird, von denen sich beide nachteilig auf die Teilchenwanderung auswirken. Dies ist ein hauptsächlicher Schlüssel, der bisher nicht im Stand der Technik gelehrt wurde.
Gleichung 5 Pcent = 2π²ρf²(r&sub1;² - r&sub0;²)
Pcent = Zentrifugaldruck
ρ = Dichte des Fluids
f = Winkelgeschwindigkeit
r&sub1; = radiale Position des Auslasses
r&sub0; = radiale Position des Einlasses
Gleichung 5.1 Pcent = 2π²ρf²(r&sub1; + r&sub0;)(r&sub1; - r&sub0;)
Gleichung 6 drückt die Anforderung aus, daß zum Bewirken einer Strömung durch den Stoppübergang der auf das Fluid am Stoppübergang ausgeübte Zentrifugaldruck den Kapillargegendruck übersteigen muß. In Gleichungen 7 und 7.1 werden die Gleichung 5 und Gleichung 1 in Gleichung 6 für den Zentrifugaldruck und den Kapillargegendruck eingesetzt. Gleichung 8 löst Gleichung 7 nach der zum Bewirken einer Strömung durch den Stoppübergang erforderlichen Winkelgeschwindigkeit auf.
Gleichung 6 Pcent > Pcap
Gleichung 7 2π²πf²(r&sub1;² - r&sub0;²) > 2γcosθ/R
f = zum Durchbrechen des Stoppübergangs erforderliche Winkelgeschwindigkeit
γ = Oberflächenspannung von Blut
θ = Kontaktwinkel von Blut am Modul
ρ = Dichte von Blut
R = Radius des Stoppübergangs
r&sub1; = radiale Position des Stoppübergangs
r&sub0; = radiale Position des Proben- oder Verdünnungsmitteleinlasses
Um zu überprüfen, daß die Zentrifugalbeschleunigung eine minimale oder tolerierbare Zellenwanderung vorsieht, kann die radiale Geschwindigkeit eines Teilchens, "ν", berechnet werden. Gleichungen 9 und 10 nähern die radiale Geschwindigkeit eines Teilchens an, wenn es einer Zentrifugalbeschleunigung unterzogen wird. Die Gleichungen sind Anpassungen des Stokesschen Gesetzes, siehe Perry's Chemical Engineers Handbook, Gleichung 19-54. Mit Bezug auf die Konstanten in Tabelle 1 kann die Endgeschwindigkeit (vr) einer roten Blutzelle in Plasma unter Verwendung von Gleichung 10 angenähert werden. Als Teil der Näherung wird eine Kugel mit einem Durchmesser von 6,4 Mikrometern (Dp) als Teilchen verwendet, da eine solche Kugel etwa dasselbe Volumen aufweist wie eine rote Blutzelle, die als Zylinder mit einem Radius von 4,3 Mikrometern und einer Höhe von 2,4 Mikrometern dargestellt wird. Unter Verwendung von solchen Werten in Gleichung 10 beträgt die Endgeschwindigkeit oder Wanderungsgeschwindigkeit einer roten Blutzelle 1,56 Mikrometer pro Sekunde.
vr = radiale Komponente der Geschwindigkeit des Teilchens
acent = Zentrifugalbeschleunigung
ρP = Dichte des Teilchens
ρ = Dichte der flüssigen Phase
DP = Durchmesser des kugelförmigen Teilchens
u = Viskosität der flüssigen Phase
f = Winkelgeschwindigkeit
r = radiale Position des Teilchens
Tabelle 1 ist eine Zusammenfassung von typischen physikalischen Parametern, mechanischen Parametern und Größenberechnungen. Im ersten Kasten der Tabelle sind die feststehenden physikalischen Eigenschaften des Moduls und des Fluids, z. B. die Oberflächenspannung von Blut und der Kontaktwinkel von Blut an plasmageätztem ABS, aufgelistet. Im zweiten Kasten sind konstruktionsspezifische Abmessungen für das Modul der vorliegenden Erfindung aufgelistet, einschließlich der radialen Position und des Durchmessers der Mischkammereinlaß-Stoppübergänge (SJ1), des Verdünnungsmittelaustritts-Stoppübergangs (SJ2) und der Mischkammer-Entlüftungsöffnungen (SJ3). Im dritten Kasten sind die Winkelgeschwindigkeit, die Zentrifugalbeschleunigung und der Zentrifugaldruck an den drei Stoppübergängen aufgelistet. Diese Werte werden unter Verwendung von Gleichung 8, Gleichung 3 bzw. Gleichung 5 berechnet. Wenn die gewünschte Zentrifugalbeschleunigung und der gewünschte Zentrifugaldruck bekannt sind, kann alternativ die radiale Position des Einlasses (r&sub0;) und des Auslasses (r&sub1;) durch Einsetzen der entsprechenden Werte in Gleichungen 1-10, z. B. Gleichung 5.1, ausgewählt werden. Der bevorzugte Bereich des niedrigen Niveaus der Zentrifugalbeschleunigung ist von ein bis einhundert m/s² und vorzugsweise etwa zwanzig m/s². Ebenso ist der bevorzugte Bereich der radialen Höhe (r&sub1; - r&sub0;) von ein bis einhundertfünfzig Millimetern und vorzugsweise etwa fünfundzwanzig Millimeter.
Obwohl mehrere spezielle Formen der Erfindung dargestellt und beschrieben wurden, ist es ersichtlich, daß verschiedene Modifikationen vorgenommen werden können, ohne vom Gedanken und Schutzbereich der Erfindung abzuweichen. Bezugnahmen auf Konstruktionsmaterialien und spezielle Abmessungen sind beispielsweise auch in keiner Weise als Begrenzung vorgesehen und andere Materialien und Abmessungen könnten eingesetzt werden. Folglich ist nicht vorgesehen, daß die Erfindung begrenzt ist, außer wie durch die beigefügten Ansprüche.

TABELLE 1

Feststehende physikalische Eigenschaften

Oberflächenspannung von Blut 0,056 (N/m) γ
Kontaktwinkel von Blut an Modul 35,0 (Grad) θ
Dichte von Blut 1060,0 (kg/m³) ρ
Dichte von Plasma 1026,9 (kg/m³) ρ
Dichte von roter Blutzelle 1096,4 (kg/m³) ρP
Durchmesser von roter Blutzelle 0,0000064 (m) DP
Viskosität von Blut 0,00015 (kg/s/m) u,

Mechanische Parameter von Modul und Aufnahmeplatte

Radiale Position von Probeneinlaß 0,106 (m) r&sub0;
Radiale Position von Verdünnungsmitteleinlaß 0,0927 (m) r&sub0; Berechnete Zentrifugalbeschleunigung, die zum Überwinden des Stoppübergangs erforderlich ist

Claims

1. Fluidkreislauf, der eine Fluidströmung mit geringen Zentrifugalbeschleunigungen ermöglicht, wobei der Fluidkreislauf folgendes umfaßt:

ein radiales Mittel (41, 42) zum Fördern von Fluid, wobei das radiale Mittel (41, 42) einen Einlaß und einen Auslaß mit einer radialen Position auswärts vom Einlaß umfaßt, wobei das radiale Mittel (41, 42) ferner einen Fluiddurchlaß umfaßt, der dazu ausgelegt ist, Fluid durch den Auslaß des radialen Mittels (41, 42) strömen zu lassen;

eine Strömungsstoppkapillare (44, 45) mit einem Einlaß in Fluidverbindung mit dem Auslaß des radialen Mittels (41, 42), wobei die Strömungsstoppkapillare (44, 45) ferner einen Auslaß und einen Fluiddurchlaß umfaßt, der dazu ausgelegt ist, eine Fluidströmung durch den Auslaß der Strömungsstoppkapillare (44, 45) zu verhindern; und

ein Aufnahmemittel (48, 49) zum Vorsehen eines Stoppübergangs in Fluidverbindung mit dem Auslaß der Strömungsstoppkapillare, wobei die radiale Position des Einlasses und des Auslasses des radialen Mittels (41, 42) derart ausgewählt ist, daß Fluid durch die Strömungsstoppkapillare (44, 45) strömt, wenn ein niedriges Niveau einer Zentrifugalbeschleunigung mit einem Bereich von einem bis einhundert Metern pro Quadratsekunde auf das radiale Mittel (41, 42) und die Strömungsstoppkapillare (44, 45) aufgebracht wird.

2. Fluidkreislauf nach Anspruch 1, wobei das niedrige Niveau der Zentrifugalbeschleunigung, die auf das radiale Mittel (41, 42) und die Strömungsstoppkapillare (44, 45) aufgebracht wird, zwanzig Meter pro Quadratsekunde beträgt.

3. Fluidkreislauf nach Anspruch 1, wobei die radiale Position des Auslasses des radialen Mittels (41, 42) mindestens einen Millimeter vom Einlaß des radialen Mittels (41, 42) entfernt ist.

4. Fluidkreislauf nach Anspruch 3, wobei die radiale Position des Auslasses des radialen Mittels (41, 42) weniger als einhundertfünfzig Millimeter vom Einlaß des radialen Mittels (41, 42) entfernt ist.

5. Fluidkreislauf nach Anspruch 1, wobei die radiale Position des Auslasses des radialen Mittels (41, 42) fünfundzwanzig Millimeter vom Einlaß des radialen Mittels (41, 42) entfernt ist.

6. Fluidkreislauf nach Anspruch 1, wobei eine Fluidsäule, die ein suspendiertes Teilchen mit einem Durchmesser enthält, zwischen dem Einlaß und dem Auslaß des radialen Mittels (41, 42) angeordnet ist, und wobei der Fluiddurchlaß der Strömungsstoppkapillare (44, 45) mit einer Querschnittsfläche gestaltet ist, so daß das suspendierte Teilchen nicht um eine Strecke wandert, die größer ist als eintausend mal der Durchmesser des · Teilchens, wenn die Fluidsäule dem niedrigen Niveau von Zentrifugalbeschleunigungen unterzogen wird.

7. Fluidkreislauf nach Anspruch 1, wobei das radiale Mittel (41, 42) eine erste Kapillare (41) mit einem Einlaß und einem Auslaß mit einer radialen Position auswärts vom Einlaß ist, wobei die erste Kapillare (41) einen Fluiddurchlaß mit einem Kapillargegendruck, der Fluid durch den Auslaß der ersten Kapillare (41) strömen läßt, umfaßt; wobei die zweite Strömungsstoppkapillare (45) einen Fluiddurchlaß mit einem Kapillargegendruck aufweist, der eine Fluidströmung durch den Auslaß der Strömungsstoppkapillare (45) verhindert; und wobei das Aufnahmemittel (48, 49) eine Kammer (49) ist, die einen scharfen Übergang mit und in Fluidverbindung mit dem Auslaß der zweiten Kapillare (45) bildet, wobei die radiale Position des Einlasses und des Auslasses der ersten Kapillare (41) derart ausgewählt ist, daß Fluid durch die zweite Kapillare (45) strömt, wenn ein niedriges Niveau einer Zentrifugalbeschleunigung auf die erste Kapillare (41) und die zweite Kapillare (45) aufgebracht wird.

8. Fluidkreislauf nach Anspruch 7, wobei der Kreislauf auf einem Testanordnungsmodul angeordnet ist, wobei das Modul folgendes umfaßt:

einen Körper (22, 26, 30);

einen ersten Behälter (35), der in dem Körper angeordnet ist, um eine Fluidprobe aufzunehmen, wobei der Behälter (35) mit der ersten Kapillare (41) in Fluidverbindung steht;

einen ersten Stoppübergang (45), der in dem Körper (22, 26, 30) angeordnet ist und mit einem zweiten Ende der ersten Kapillare (41) in Fluidverbindung steht, wobei der erste Stoppübergang (45) die Strömungsstoppkapillare (45) mit einem Kapillargegendruck, der eine Fluidströmung aus der ersten Kapillare (41) verhindert, umfaßt; und

einen zweiten Behälter (49), der in dem Körper (22, 26, 30) angeordnet ist und mit dem ersten Stoppübergang (45) in Fluidverbindung steht, wobei die Fluidprobe nach Aufbringen einer ersten geringen Zentrifugalbeschleunigung auf den Körper (22, 26, 30) von dem ersten Behälter (35) durch die erste Kapillare (41) und durch den ersten Stoppübergang (45) und in den zweiten Behälter (49) strömt.

9. Fluidkreislauf nach Anspruch 8, welcher ferner folgendes umfaßt:

einen dritten Behälter (62), der in dem Körper (22, 26, 30) angeordnet ist, um ein Verdünnungsmittel aufzubewahren;

eine dritte Kapillare (66), die in dem Körper (22, 26, 30) angeordnet ist und ein erstes Ende in Fluidverbindung mit dem dritten Behälter (62) aufweist; und

einen zweiten Stoppübergang (68), der in dem Körper (22, 26, 30) angeordnet ist und mit einem zweiten Ende der dritten Kapillare (66) und dem zweiten Behälter (49) in. Fluidverbindung steht, wobei das Verdünnungsmittel nach Aufbringen einer zweiten geringen Zentrifugalbeschleunigung mit einem Bereich von einem bis einhundert Meter pro Quadratsekunde auf den Körper (22, 26, 30) von dem dritten Behälter (62) zu dem zweiten Behälter (49) strömt.

10. Fluidkreislauf nach Anspruch 9, welcher ferner folgendes umfaßt:

eine Abtastkapillare (101), die zumindest teilweise in dem Körper (22, 26, 30) angeordnet ist; und

einen dritten Stoppübergang (77), der in dem Körper (22, 26, 30) angeordnet ist und mit dem zweiten Behälter (49) und mit der Abtastkapillare (101) in Fluidverbindung steht, wobei der dritte Stoppübergang (77) verhindert, daß die Fluidprobe und das Verdünnungsmittel den zweiten Behälter (49) verlassen, wenn die zweite geringe Zentrifugalbeschleunigung auf den Körper (22, 26, 30) aufgebracht wird, und wobei ein Teil der Fluidprobe und des Verdünnungsmittels nach Aufbringen einer dritten geringen Zentrifugalbeschleunigung, die größer ist als die zweite geringe Zentrifugalbeschleunigung und einen Bereich von einem bis einhundert Metern pro Quadratsekunde aufweist, auf den Körper (22, 26, 30) vom zweiten Behälter (49) in die Abtastkapillare (101) strömt.

11. Fluidkreislauf nach Anspruch 10, wobei der Körper (22, 26, 30) eine erste Platte (22), eine zweite Platte (26) und eine dritte Platte (30) umfaßt, wobei der erste Behälter (35) in der ersten Platte (22) und der zweiten Platte (26) angeordnet ist, der zweite Behälter (49) in der zweiten Platte (26) und der dritten Platte (30) angeordnet ist und der dritte Behälter (62) in der ersten Platte (22), der zweiten Platte (26) und der dritten Platte (30) angeordnet ist.

12. Fluidkreislauf nach Anspruch 8, wobei der erste Behälter (35) zumindest einen Antikörper (22, 26, 30), der mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert ist, enthält.

13. Fluidkreislauf nach Anspruch 9, wobei das Verdünnungsmittel in einer Glasampulle (60) enthalten ist, die innerhalb des dritten Behälters (62) angeordnet ist.

14. Fluidkreislauf nach Anspruch 10, wobei die Abtastkapillare (101) einen rechteckigen inneren Querschnitt aufweist.

15. Fluidkreislauf nach Anspruch 10, welcher ferner einen vierten Behälter (36), der in dem Körper (22, 26, 30) angeordnet ist, zum Aufnehmen einer Fluidprobe und eine zweite Abtastkapillare (100) in Fluidverbindung mit dem vierten Behälter umfaßt.

16. Fluidkreislauf nach Anspruch 8, wobei der Körper (22, 26, 30) im wesentlichen in Form eines Dreiecks geformt ist.

17. Fluidkreislauf nach Anspruch 8, wobei der erste Behälter (35) zum Aufnehmen von variablen Mengen einer Probe ausgelegt ist.

18. Verfahren zum Bewegen einer Fluidprobe in einem Testanordnungsmodul, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

Aufbringen einer Fluidprobe auf eine erste Aufbringungsvertiefung (35);

Vorsehen einer ersten Kapillare (41) in Fluidverbindung mit der ersten Aufbringungsvertiefung (35) und eines ersten Stoppübergangs (45) in Fluidverbindung mit einem ersten Behälter (49), so daß sich ein erster Teil der Fluidprobe infolge von Kapillarkräften in die erste Kapillare (41) und den ersten Stoppübergang (45) bewegt, aber sich nicht in den ersten Behälter (49) bewegt; und

Aufbringen einer ersten geringen Zentrifugalbeschleunigung mit einem Bereich von einem bis einhundert Metern pro Quadratsekunde auf die Fluidprobe in der ersten Kapillare (41) und in dem ersten Stoppübergang (45), wodurch bewirkt wird, daß sich ein zweiter Teil der Probe von der Aufbringungsvertiefung (35) in den ersten Behälter (49) bewegt.

19. Verfahren nach Anspruch 18, welches ferner die folgenden Schritte umfaßt:

Vorsehen eines zweiten Behälters (62) in Fluidverbindung mit einer zweiten Kapillare (66) in Fluidverbindung mit einem zweiten Stoppübergang (68) in Fluidverbindung mit dem ersten Behälter (49), wobei der zweite Behälter (62) ein Verdünnungsmittel enthält, von welchem sich ein erster Teil infolge von Kapillarkräften in die zweite Kapillare (66) und den zweiten Stoppübergang (68) bewegt, aber sich nicht in den ersten Behälter (49) bewegt; und

Aufbringen einer zweiten geringen Zentrifugalbeschleunigung mit einem Bereich von einem bis einhundert Metern pro Quadratsekunde auf das Verdünnungsmittel in der zweiten Kapillare (66) und im zweiten Stoppübergang (68), wodurch bewirkt wird, daß sich ein zweiter Teil des Verdünnungsmittels vom zweiten Behälter (62) in den ersten Behälter (49) bewegt.

20. Verfahren nach Anspruch 19, welches ferner die folgenden Schritte umfaßt:

Vorsehen einer Abtastkapillare (101) in Fluidverbindung mit einem dritten Stoppübergang (77) in Fluidverbindung mit dem ersten Behälter (49), wobei der dritte Stoppübergang (77) dazu ausgelegt ist, zu verhindern, daß Fluid aus dem ersten Behälter (49) strömt, wenn die zweite geringe Zentrifugalbeschleunigung aufgebracht wird;

und Aufbringen einer dritten geringen Zentrifugalbeschleunigung mit einem Bereich von einem bis einhundert Metern pro Quadratsekunde mit einem größeren Betrag als die zweite geringe Zentrifugaltrennung, so daß die Probe und das Verdünnungsmittel vom ersten Behälter (49) in die Abtastkapillare (101) strömen.

21. Verfahren nach Anspruch 18, welches ferner den Schritt des Abmessens einer vorbestimmten Menge der Fluidprobe vor und zur Verwendung bei der Durchführung des Schritts des Aufbringens einer Fluidprobe auf eine erste Aufbringungsvertiefung (35) umfaßt.