DE69508598T2

DE69508598T2 - Mit polyethylenglycol modifizierte ceramidlipide und liposomen

Info

Publication number: DE69508598T2
Application number: DE69508598T
Authority: DE
Inventors: Lewis S. L. Burnaby British Columbia V5A 3P8 Choi; Thomas D. Vancouver British Columbia V6L 2A1 Madden; Murray S. Vancouver British Columbia V5Y 1X3 Webb
Original assignee: University of British Columbia
Current assignee: University of British Columbia
Priority date: 1994-09-30
Filing date: 1995-10-02
Publication date: 1999-07-15
Anticipated expiration: 2015-10-03
Also published as: AU3559895A; EP0783297A1; DE69508598D1; ES2130651T3; JPH10506622A; US5820873A; JP3920330B2; DK0783297T3; EP0783297B1; WO1996010391A1; CA2201120C; ATE177943T1; CA2201120A1

Description

QUERVERWEIS AUF EINE VERWANDTE ANMELDUNG

Diese Anmeldung ist eine Teilfortführungsanmeldung der gleichzeitig anhängigen U. S. Anmeldung mit der Nummer 08/316 429, angemeldet am 30. September 1994, die durch Nennung Teil der Beschreibung ist.

DER ERFINDUNG ZUGRUNDELIEGENDER STAND DER TECHNIK

1. Erfindungsgebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft neue mit Polyethylenglykol derivatisierte Lipide, deren Herstellungsverfahren und deren Verwendung in Liposomen oder anderen Trägern auf Lipidbasis. Insbesondere umfaßt die vorliegende Erfindung PEG-Ceramidlipide und deren Einschluß in Liposomen zur Verwendung zum Arzneimitteltransport.

2. Relevanter Stand der Technik

Liposomen sind Bläschen aus konzentrisch angeordneten Lipid- Doppelschichten, die eine wäßrige Phase einschließen. Liposomen bilden sich, wenn Lipide, d. h. Moleküle, die typischerweise eine polare Kopfgruppe aufweisen, die an eine oder mehrere langkettige, aliphatische Schwänze gebunden ist, wie Phospho-Lipide, Wasser ausgesetzt werden. Beim Zusammentreffen mit, solchem Medium aggregieren die Lipide unter Bildung einer Struktur, bei der nur die polaren Kopfgruppen dem äußeren Medium ausgesetzt sind unter Bildung einer äußeren Schale, innerhalb der die aliphatischen Schwänze maskiert sind. Siehe zum Beispiel Lehnfinger, Principles Of Biochemistry (Worth, 1982). Die Liposomen können eine Vielzahl von bioaktiven oder pharmazeutischen Agentien einschließen zum Transport dieser Agenden zu Zellen und Gewebe in vivo. Siehe zum Beispiel U. S. Patent Nr. 5 185 154 von Lasic et al.; europäische Patentanmeldung Nr. 526 700 von Tagawa et al.; und U. S. Patent Nr. 5 013 556 von Woodle et al..
Liposomen können die Bioverteilung und Transportgeschwindigkeit eines eingekapselten bioaktiven Agens auf verschiedene Weise ändern. Zum Beispiel sind in Liposomen eingekapselte Arzneimittel geschützt vor Wechselwirkungen mit Serumfaktoren, die das Arzneimittel chemisch abbauen können. Die Größe des Liposoms, verglichen mit der des freien Arzneimittels, wirkt auch auf seinen Zugang zu bestimmten Stellen im Körper; diese Eigenschaft kann vorteilhaft sein, um den Arzneimitteltransport zu bestimmten Stellen zu begrenzen. Die Aufnahme durch das retikuloendotheliale System (RES) kann verhindert werden durch Einfügen von Faktoren auf der Liposomenoberfläche, die die Proteinassoziation mit dem Liposom oder Liposomwechselwirkungen mit RES Zellen verhindern, zum Beispiel durch Verwendung von PEG-Lipiden mit anderen Lipiden, wie Gangliosid GM&sub1;. Siehe Woodle, oben.
Eine Vielzahl von Liposomstrukturen kann durch Verwendung von einem oder mehreren Lipiden gebildet werden. Typische Klassen von Liposomstrukturen umfassen kleine einlamellare Bläschen (SUVs), große einlamellare Bläschen (LUVs) oder mehrlamellare Bläschen (MLVs). Der Aufbau der Liposomen und ihre Anwendung als Transportsysteme sind im Stand der Technik beschrieben. Siehe zum Beispiel LIPOSOMES, Marc J. Ostro, hrsg. (Marcel Dekker 1983).
Liposomen sind hergestellt worden durch Derivatisierung bestehender Lipidsysteme unter Bildung neuer Liposomstrukturen. Zum Beispiel sind mit Polyethylenglykol (PEG) derivatisierte Lipide entwickelt worden. Siehe Woodle, oben.
Typischerweise werden PEG-Lipide hergestellt durch Derivatisierung der polaren Kopfgruppe eines Diacylglycerophospho-Lipids, wie Distearoylphosphatidylethanolamin (DSPE), mit PEG. Diese Phospho-Lipide enthalten gewöhnlich zwei Fettacylketten, die an die 1- und 2-Stellung des Glycerins durch Esterbindungen gebunden sind. Leider neigen diese Acylgruppen unter sauren oder basischen Bedingungen zur Abspaltung. Die entstehenden hydrolytischen Produkte, wie Analoge von Lysophospho-Lipiden und Glycerophosphat, bleiben nicht mit der Doppelschichtstruktur des Liposoms verbunden. Solch eine Dissoziation kann die Vollständigkeit der Liposomstruktur schwächen, was zu einer signifikanten Leckage des bioaktiven Agens oder Arzneimittels aus dem Liposom und zur Instabilität während der Lagerung führt und daher die Lagerbeständigkeit des Liposomprodukts verkürzt. Außerdem würde der Verlust dieser Hydrolyseprodukte, wie PEG-Lysophospho-Lipid, aus dem Liposom die Vorteile unwirksam machen, die sonst aus der Anwesenheit der PEG-Phospho-Lipide resultieren.
Die Lipidbeständigkeit ist wichtig bei der Entwicklung von liposomalen Arzneimittel-Transportsystemen. Dies ist besonders relevant, wenn ein Transmembran pH-Gradient verwendet wird, um das bioaktive Agens in dem Liposom einzuschließen oder einzukapseln, da dsehr saure (pH 2-4) oder basische (pH 10-12) Bedingungen verwendet werden können, um eine effiziente Aufnahme und Retention des Arzneimittels zu erreichen. Daher ist es wünschenswert, PEG-Lipide zu entwickeln, die weniger zur Hydrolyse neigen, wodurch die Zirkulationslebensdauer der Liposomen erhöht wird.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

In einem Aspekt umfaßt die vorliegende Erfindung neue PEG-Lipide, wie die PEG-modifizierten Ceramidlipide der Formel I: Formel I
in der
R¹, R² und R³ unabhängig voneinander Wasserstoff, C&sub1;-C&sub6; Alkyl, Acyl oder Aryl bedeuten;
R&sub4; Wasserstoff, C&sub1;-C&sub3;&sub0; Alkyl, C&sub2;-C&sub3;&sub0; Alkenyl, C&sub2;-C&sub3;&sub0; Alkinyl oder Aryl ist;
R&sup5; Wasserstoff, Alkyl, Acyl, Aryl oder PEG ist;
X¹ -O-, -S- oder -NR&sup6;- bedeutet, worin R&sup6; Wasserstoff, C&sub1;-C&sub6; Alkyl, Acyl oder Aryl bedeutet, oder wenn R&sup5; PEG ist und b 1 ist, X¹ auch -Y¹-Alk-Y²- bedeutet;
Y -NR&sup7; - ist, worin R&sup7; Wasserstoff, C&sub1;-C&sub6; Alkyl, Acyl oder Aryl bedeutet, oder Y -O-, -S- oder -Y¹-Alk-Y²- ist, worin Y¹ und Y² unabhängig voneinander Amino, Amido, Carboxyl, Carbamat, Carbonyl, Carbonat, Harnstoff oder Phoshoro und Alk C&sub1;-C&sub6; Alkylen bedeuten;
PEG ein Polyethylenglykol mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von etwa 550 bis etwa 8500 Dalton ist, gegebenenfalls substituiert mit C&sub1;-C&sub3; Alkyl, Alkoxy, Acyl oder Aryl;
in der a 0 oder 1 ist; und b 1 ist, außer wenn R&sup5; PEG ist, wobei dann b 0 oder 1 ist.
Bevorzugter sind diejenigen Verbindungen, in denen R¹, R², R³ und R&sup5; Wasserstoff bedeuten; R&sup4; Alkyl ist; X¹ 0 ist; Y Succinat ist; und PEG ein durchschnittliches Molekulargewicht von etwa 2000 oder etwa 5000 Dalton hat und mit Methyl an der endständigen Hydroxylstellung substituiert ist.
Bevorzugt sind auch diejenigen Verbindungen, in denen R¹, R², R³ und R&sup5; Wasserstoff bedeuten; R&sup4; Alkyl ist; X¹ 0 ist; Y -NH- ist; und PEG ein durchschnittliches Molekulargewicht von etwa 2000 oder etwa 5000 Dalton hat und mit Methyl an der endständigen Stellung substituiert ist.
Andere bevorzugte Lipidverbindungen sind diejenigen, in denen R¹, R², R³ und R&sup5; Wasserstoff bedeuten; R&sup4; C&sub7;-C&sub2;&sub3; Alkyl ist, X¹ 0 ist; Y Succinat ist; und PEG ein durchschnittliches Molekulargewicht von etwa 2000 Dalton hat und mit Methyl an der endständigen Hydroxylstellung substituiert ist; noch bevorzugter sind diejenigen Lipidverbindungen, in denen R&sup4; C&sub1;&sub3;-C&sub1;&sub9; Alkyl ist.
In einem anderen Aspekt umfaßt die vorliegende Erfindung Liposomen oder andere Träger auf Lipidbasis, die die oben beschriebenen PEG-Ceramidlipide enthalten. Bevorzugte Liposomzusammensetzungen enthalten die oben beschriebenen bevorzugten Lipide. Bei der Herstellung der Liposomen können verschiedene Mischungen der beschriebenen PEG-Ceramidlipide in Kombination und in Verbindung mit anderen Lipidarten verwendet werden, wie DOPE und DODAC ebenso wie DSPC, SM, Chol und ähnlichen, wobei DOPE und DODAC bevorzugt sind. Typischerweise wird das PEG-Ceramid etwa 5 bis etwa 30 mol% des endgültigen Liposomaufbaus ausmachen, aber es kann etwa 0,0 bis etwa 60 mol% oder etwa 0,5 bis etwa 5 mol% ausmachen. Bevorzugtere Lipidzusammensetzungen sind diejenigen, in denen ein Arzneimittel oder ein biologisches Agens innerhalb des Liposoms eingekapselt ist. Die Erfindung umfaßt auch Lipid-Komplexe, wobei das PEG-Ceramidlipid etwa 0,01 bis etwa 90 mol% des Komplexes ausmacht.
In noch anderer Hinsicht umfaßt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Transport therapeutischer Agentien, wie Arzneimittel und Impfstoffe, in einem Patienten, der sie braucht, wobei dem Patienten eine therapeutisch wirksame Menge eines solchen therapeutischen Agens in einem erfindungsgemäßen Liposom oder Träger auf Lipidbasis verabreicht wird. Ebenfalls vorgesehen sind Kits zur Herstellung von markierten Liposomen, die die PEG-Ceramidlipide enthalten, und pharmazeutische Liposomen enthaltende Formulierungen.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1A und Fig. 1B zeigen graphisch die Zirkulationslebensdauer von den erfindungsgemäßen PEG-modifizierten Ceramid-Liposomen. Fig. 1A zeigt Plasmaclearance von 100 nm Liposomen, hergestellt aus Distearylphosphatidylcholin (DSPC)/Cholesterin (Chol) (55 : 45 mol%; offene Kreise), DSPC/Chol/PEG&sub2;&sub0;&sub0;&sub0;-Ceramid (50 : 45 : 5 mol%; gefüllte Kreise) und DSPC/Chol/PEG&sub5;&sub0;&sub0;&sub0;-Ceramid (50 : 45 : 5 mol%; gefüllte Quadrate). Fig. 1B zeigt Plasmaclearance von 100 nm Liposomen, hergestellt aus DSPC/Chol (55 : 45 mol%; offene Kreise), Sphingomyelin (SM)/Chol (55 : 45 mol%; gefüllte Kreise) und Sphingo myelin/Chol/PEG&sub2;&sub0;&sub0;&sub0;-Ceramid (50 : 45 : 5 mol%; offene Quadrate).
Fig. 2 zeigt graphisch, daß die Einarbeitung von PEG-modifiziertem Ceramid in liposomale Vincristin-Formulierungen die Charakteristiken der Arzneimittelretention nicht ungünstig beeinflußt. Die Vincristinretention durch Sphingomyelin/Chol (55 : 45 mol%; gefüllte Kreise) Liposomen innerhalb der Zirkulation wird nicht durch die Einarbeitung von PEG&sub2;&sub0;&sub0;&sub0;-Ceramid (50 : 45 : 5 mol%; offene Quadrate) beeinflußt. Die Vincristinretention wird auch für DSPC/Chol (50 : 45 mol%; offene Kreise) und SM/Chol/PEG-PE (Phosphatidylethanolamin) (50 : 45 : 5 mol%; gefüllte Quadrate) gezeigt.
Fig. 3 zeigt die Lipidzirkulaton-Halbwertszeiten (T1/2) (in Stunden) von verschiedenen SM/Cholesterol Liposomen, einschließlich derjenigen, die PEG&sub2;&sub0;&sub0;&sub0;-Ceramide mit verschiedenen Fettamidkettenlängen enthalten, und derjenigen, die PEG&sub2;&sub0;&sub0;&sub0;-DSPE (Distearylphosphatidylethanolamin) enthalten.
Fig. 4 zeigt die Zirkulation-Halbwertszeiten (T1/2) (in Stunden) der Vincristin/Lipid-Verhältnisse (Vincristinretention) für Liposomen, die Vincristin mit verschiedenen PEG&sub2;&sub0;&sub0;&sub0;-Ceramiden ebenso wie PEG&sub2;&sub0;&sub0;&sub0;-DSPE enthalten.
Fig. 5 stellt die Zirkulation-Halbwertszeiten (T1/2) (in Stunden) von vincristinhaltigen Liposomen dar.
Fig. 6 zeigt graphisch die Wirkung von ansteigenden Konzentrationen von PEG-Ceramid (C20) auf die Bioverteilung der Liposomen in dem Blut und in der Leber. ³H-markierte Liposomen, zusammengesetzt aus DOPE (Dioleoylphosphatidylethanolamin), 15 mol% DODAC (N,N-Dioleoyl-N,N-dimethylammoniumchlorid) und den angegebenen Konzentrationen von PEG-Ceramid (C20), wurden i. v. in Mäuse injiziert. Die Bioverteilung wurde 1 Stunde nach der Injektion geprüft, und die Werte wurden als Prozentsatz der injizierten Dosis in das Blut (oberes Feld) und in der Leber (unteres Feld) mit SD (Standardabweichung) (n = 3) ausgedrückt.
Fig. 7 zeigt graphisch die Wirkung von ansteigenden Konzentrationen von DODAC auf die Bioverteilung der Liposomen in dem Blut. ³H-markierte Liposomen, zusammengesetzt aus DOPE, 10 (offene Quadrate) oder 30 (offene Dreiecke) mol% PEG-Ceramid (C20) und der angegebenen Konzentration von DODAC, wurden i. v. in Mäuse injiziert. Die Bioverteilung wurde 1 Stunde nach der Injektion geprüft, und die Werte wurden als Prozentsatz der injizierten Dosis in das Blut ausgedrückt.
Fig. 8 zeigt graphisch die Liposomniveaus in dem Blut und in der Leber zu verschiedenen Zeiten nach der Injektion. ³H-markierte Liposomen, zusammengesetzt aus DOPE/DODAC (85 : 15 mol/mol) (offene Kreise mit 0% PEG-Ceramid (C20)), DOPE/DODAC/PEG-Ceramid (C20) (75 : 15 : 10 mol/mol/mol) (offene Quadrate mit 10% PEG-Ceramid (C20)), und DOPE/DODAC/PEG-Ceramid (C20) (55 : 15 : 30 mol/mol/mol) (offene Dreiecke mit 30% PEG-Ceramid (C20)) wurden i. v. in Mäuse injiziert. Die Bioverteilung wurde zu den angegebenen Zeiten geprüft, und die Werte wurden als Prozentsatz der injizierten Dosis in das Blut (oberes Feld) und in die Leber (unteres Feld) mit SD (n = 3) ausgedrückt.
Fig. 9 zeigt graphisch die Fusion von PEG&sub2;&sub0;&sub0;&sub0;-DMPE und PEG&sub2;&sub0;&sub0;&sub0;-Ceramid (C14 : 0), die Bläschen mit einem anionischen Target enthielten.

GENAUE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM

Die PEG-modifizierten Ceramidlipide der Formel I steigern die Eigenschaften der Liposomen durch Erhöhung der Zirkulationslebensdauer oder -lebenszeit des Liposoms; durch Verhinderung der Aggregation der Liposomen während der kovalenten Proteinkopplung, wie für zielgerichtetes Binden; durch Verhinderung der Aggregation der Liposomen, die zielgerichtete Teile oder Arzneimittel enthalten, wie Antikörper und DNA; durch Förderung der Arzneimittelretention innerhalb der Liposomen; und/oder durch Erhöhung der Doppelschichten oder anderer Beständigkeit der Liposomen, wenn ein niedriger pH erforderlich ist für die Einkapselung der bioaktiven Mittel. Diese PEG-Ceramidlipide erniedrigen auch die Leckage infolge Hydrolyse von Fettacylketten der Liposom-Doppelschicht und sind beständiger als andere Lipidformen.

Definitionen

Der hier verwendete Begriff "Alkyl" bedeutet verzweigte oder unverzweigte Kohlenwasserstoffketten, wie z. B. Methyl, Ethyl, n-Propyl, iso-Propyl, n-Butyl, sec-Butyl, iso-Butyl, tert-Butyl und 2-Methylpentyl. Diese Gruppen können gegebenenfalls mit einer oder mehreren funktionellen Gruppen substituiert sein, die üblicherweise an solche Gruppen gebunden sind, wie z. B. Hydroxyl, Brom, Fluor, Chlor, Iod, Mercapto oder Thio, Cyano, Alkylthio, Heterocyclus, Aryl, Heteroaryl, Carboxyl, Carbalkoyl, Alkyl, Alkenyl, Nitro, Amino, Alkoxyl, Amido und ähnliche, unter Bildung von Alkylgruppen, wie Trifluormethyl, 3-Hydroxyhexyl, 2-Carboxypropyl, 2-Fluorethyl, Carboxymethyl und Cyanobutyl und ähnliche.
Der Begriff "Alkylen" bezieht sich auf zweiwertiges Alkyl, wie oben definiert, z. B. Methylen (-CH&sub2;), Propylen (-CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;-), Chlorethylen (-CHClCH&sub2;-), 2-Thiobutyliden (-CH&sub2;CH(SH)CH&sub2;CH&sub2;-), 1-Brom-3-hydroxy-4-methylpentyliden (-CHBrCH&sub2;CH(OH)CH(CH&sub3;)CH&sub2;-) und ähnliche.
Der Begriff "Alkenyl" bezeichnet verzweigte oder unverzweigte Kohlenwasserstoffketten, die eine oder mehrere Kohlenstoff-Kohlenstoff Doppelbindungen enthalten.
Der Begriff "Alkinyl" bezeichnet verzweigte oder unverzweigte Kohlenwasserstoffketten, die eine oder mehrere Kohlenstoff-Kohlenstoff Dreifachbindunen enthalten.
Der Begriff "Aryl" bezeichnet eine Kette von Kohlenstoffatomen, die wenigstens einen aromatischen Ring bilden mit vorzugsweise zwischen etwa 6-14 Kohlenstoffatomen, wie z. B. Phenyl, Naphtyl, Indenyl und ähnliche, und die mit einer oder mehreren funktionellen Gruppen substituiert sein kann, die üblicherweise an solche Ketten gebunden sind, wie z. B. Hydroxyl, Brom, Fluor, Chlor, Iod, Mercapto oder Thio, Cyano, Cyanamido, Alkylthio, Heterocyclus, Aryl, Heteroaryl, Carboxyl, Carbalkoyl, Alkyl, Alkenyl, Nitro, Amino, Alkoxyl, Amido und ähnliche, unter Bildung von Arylgruppen, wie Biphenyl, Iodbiphenyl, Methoxybiphenyl, Anthryl, Bromphenyl, Iodphenyl, Chlorphenyl, Hydroxyphenyl, Methoxyphenyl, Formylphenyl, Acetylphenyl, Trifluormethylthiophenyl, Trifluormethoxyphenyl, Alkylthiophenyl, Trialkylammoniumphenyl, Amidophenyl, Thiazolylphenyl, Oxazolylphenyl, Imidazolylphenyl, Imidazolylmethylphenyl und ähnliche.
Der Begriff "Acyl" bedeutet Gruppen -C(O)R, worin R Alkyl oder Aryl, wie oben definiert, bedeutet, wie Formyl, Acetyl, Propionyl oder Butyryl.
Der Begriff "Alkoxy" bedeutet -OR, worin R Alkyl ist.
Der Begriff "Amido" bedeutet eine Amidbindung: -C(O)NH-.
Der Begriff "Amino" bedeutet eine Aminbindung: -NR-, worin R Wasserstoff oder Alkyl ist.
Der Begriff "Carboxyl" bedeutet -C(O)O-, und der Begriff "Carbonyl" bedeutet -C(O)-.
Der Begriff "Carbonat" bedeutet -OC(O)O-.
Der Begriff "Carbamat" bedeutet -NHC(O)O-, und der Begriff "Harnstoff" bedeutet -NHC(O)NH-.
Der Begriff "Phosphoro" bedeutet -OP(O)(OH)O-.

Struktur und Herstellung der Lipidverbindungen

Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden unter Verwendung von Standardtechniken und -reagentien synthetisiert. Es wird bemerkt werden, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen verschiedene Amid-, Amin-, Ether-, Thio-, Ester-, Carbonat-, Carbamat-, Harnstoff- und Phosphorobindungen enthalten werden. Fachleute werden erkennen, daß Verfahren und Reagentien zur Bildung dieser Bindungen wohl bekannt und leicht erhältlich sind. Siehe z. B. March, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY (Wiley 1992), Larock, COMPREHENSIVE ORGANIC TRANSFORMATIONS (VCH 1989); und Furniss, VOGEL'S TEXTBOOK OF PRACTICAL ORGANIC CHEMISTRY 5th ed. (Longman 1989). Er wird auch erkennen, daß irgendwelche anwesenden funktionellen Gruppen, Schutzgruppen und Entfernung der Schutzgruppen an verschiedenen Stellen der Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen erfordern können. Fachleute werden erkennen, daß solche Techniken wohl bekannt sind. Siehe z. B. Green and Wuts, PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS (Wiley 1991).
Eine allgemeine Folge von Reaktionen zur Bildung der erfindungsgemäßen Verbindungen wird unten im Reaktionsschema I gezeigt. Wie darin gezeigt, wird das Ceramidderivat 1 mit dem PEG-Derivat PEG-Y¹-Alk-RG umgesetzt. R¹-R&sup4; und Y¹ haben die oben angegebenen Bedeutungen. RG ist eine Gruppe, die mit X² reagiert unter Bildung der gewünschten Bindung Y² zwischen PEG und dem Ceramidderivat (d. h. -Y¹-Alk-Y²-). Somit wird erkannt werden, daß die Identitäten von RG und X² komplementär zueinander sein und so definiert werden, daß die gewünschte Bindung geschaffen wird. Zum Beispiel wenn RG ein nucleophiles Zentrum ist, wie -SH, -OH oder -NH&sub2;, kann X² derivatisierter Sauerstoff sein, um eine gute austretende Gruppe zu bilden, wie -OTs, worin Ts die Tosylgruppe bedeutet, oder Halogen sein. Umgekehrt kann X² ein nucleophiles Zentrum sein, z. B. -SH, -OH oder -NH&sub2;, und RG eine Gruppe, die für einen nucleophilen Angriff reaktiv ist, z. B. Carboxyl, aktiviert mit Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), oder Acylchlorid (-COCl). Durch geeignete Wahl von RG und X² kann die gewünschte Amido-, Amin-, Ether-, Ester-, Thioether-, Carboxyl-, Carbamat-, Carbonyl-, Carbonat-, Harnstoff- oder Phosphorokupplung zwischen dem Linker und dem Ceramid erhalten werden. Schließlich werden irgendwelche Schutzgruppen, z. B. R&sup8;, die an dem Zwischenprodukt 2 bleiben, umgewandelt werden unter Bildung des gewünschten PEG-Ceramidderivats 3. Reaktionsschema I
Eine beispielhafte Synthese der erfindungsgemäßen PEG-Ceramid- Lipide, in denen Y¹ und Y² Carboxyl sind, wird unten in Reaktionsschema II gezeigt. Um das mögliche Problem von Vernetzungsbildung zu vermeiden, wird PEG an einem Ende durch eine unreaktive Gruppe, wie Methoxy oder Ethoxy abgedeckt. Die zweite Hydroxygruppe an dem anderen Ende des PEG-Moleküls wird entweder mit einem geeigneten Reagens, wie Cyanursäure, 1,1'-Carbonyldiimidazol (CDI) oder Tresylhalogenid aktiviert. Alternativ kann die endständige Hydroxylgruppe zuerst in ein Derivat umgewandelt werden, das leicht mit Ceramid in Gegenwart von geeigneten Kondensationsreagentien, wie dem Succinat oder Amin, reagiert. In anderen alternativen Verfahren können die Hydroxygruppen am Ceramid selektiv aktiviert werden zur Verbindung mit PEG, oder die beiden Verbindungen können in einer gemeinsamen Kupplungsreaktion durch etablierte Kupplungsverfahren verbunden werden.
In dem gezeigten Beispiel wird die primäre Hydroxylgruppe des Ceramids [im Handel erhältlich von Sigma Chemical Company (St. Louis, Missouri) und Avanti Polar Lipids Inc. (Alabaster, Alabama)] mit einer Hydroxyl-Schutzgruppe des Typs umgesetzt, der die Reaktion an primären Alkoholen über sekundäre und tertiäre Alkohole begünstigt. Bevorzugte Schutzgruppen sind diejenigen, die als sterisch gehindert angesehen werden, wie Tritylchlorid (TrCl), das drei Phenylringe an ein zentrales Kohlenstoffatom gebunden enthält. Es sind jedoch andere Schutzgruppen im Stand der Technik bekannt (siehe Green und Wuts oben). Diese Umsetzung wird unter Verwendung von Standardtechniken und -bedingungen durchgeführt.
Im Anschluß an den Schutz der C&sub1;-Hydroxylgruppe wird der sekundäre Alkohol am C&sub3; mit einer zweiten Schutzgruppe geschützt. Die zweite Schutzgruppe sollte eine sein, die gegenüber mehr gehinderten sekundären Alkoholen reaktiv ist, die aber nicht unter den Bedingungen entfernt wird, die zur Entfernung der den C&sub1;-Alkohol blockierenden Schutzgruppe wirksam sind. Eine bevorzugte Schutzgruppe ist Benzyl (Bn). Wiederum werden andere geeignete Schutzgruppenkombinationen für Fachleute ersichtlich sein.
Wenn beide Hydroxylgruppen geschützt sind, wird die C&sub1;-OH Schutzgruppe unter Bedingungen entfernt, die nicht die Schutzgruppe an dem C&sub3;-Alkohol angreifen. Die freie Hydroxylfunktion wird dann mit dem PEG-Derivat Me(PEG)OC(O)CH&sub2;CH&sub2;CO&sub2;H mit Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) und 4-N,N'-Dimethylaminopyridin (DMAP) umgesetzt unter Bildung des gewünschten PEG-Ceramidderivats.
Die Schutzgruppe an C&sub3; kann entfernt werden, falls erwünscht, um andere Reaktionen an dieser Stelle zu ermöglichen, um andere Substituentengruppen zu erhalten. Reaktionsschema II
Bei einem anderen Weg, der in Reaktionsschema III unten gezeigt ist, ist Y¹ eine Carboxylestergruppe -OC(O)- und Y² eine Amidogruppe -C(O)NH-. Wie in dem Schema gezeigt, kann das 1-Amino-Analogon des Ceramids durch Derivatisierung zunächst der C&sub1;-Hydroxylgruppe zu dem entsprechenden C&sub1;-Alkylsulfonat (z. B. Methylsulfonat oder 2,2,2-Trifluorethansulfonat) hergestellt werden. Das letztere wird direkt mit Ammoniak oder, wie gezeigt, durch ein Azid-Zwischenprodukt in das Amino-Analogon umgewandelt. Das 1-Amino-Ceramid wird dann an den N-Hydroxysuccinamid(NHS)ester von MePEG-S gekoppelt unter Bildung eines MePEG-S-Ceramids mit einer Amidbindung. Reaktionsschema III
Alternativ kann die Gruppe Y -NR&sup7;- sein, worin R&sup7; Wasserstoff, Alkyl, Acyl oder Aryl ist; oder Y kann -O- oder -S- sein. Solche Ausführungsformen können unter Verwendung wohl bekannter Verfahren und Reagentien gebildet werden. Zum Beispiel kann die Ausführungsform, in der Y -NH- ist, durch den in Reaktionsschema IV unten gezeigten Syntheseweg hergestellt werden. Darin wird das oben beschriebene 1-Mesyl-Ceramid mit dem Amino-Analogon von (MePEG-NH&sub2;) umgesetzt unter Bildung des gewünschten MePEG-Ceramidkonjugats mit einer Aminobindung. Reaktionsschema IV
Beide C&sub1;- und C&sub3;-Hydroxyfunktionen im Ceramid können mit einem Reagens, wie CDI, aktiviert werden unter Bildung des entsprechenden Bis-imidazolylformats. Das letztere wird dann mit der Aminogruppe des MePEG-NH&sub2; umgesetzt unter Bildung eines Konjugats mit zwei MePEG Molekülen, die an ein Ceramid gebunden sind. Entweder ein oder zwei PEG Moleküle können gewählt werden, um es an jedes Ceramid zu binden, was eine flexiblere Gestaltung erlaubt, um dem liposomalen System spezielle Eigenschaften zu verleihen.
Die Gruppe Y=Y¹-Alk-Y² kann aus leicht erhältlichen Ausgangsmaterialien unter Verwendung bekannter Techniken gebildet werden. Bevorzugte Ausführungsformen umfassen diejenigen, in denen Y¹ und Y² beide Carbonyl (-C(O)-) sind oder eines von Y¹ oder Y² Carbonyl und das andere Amido (-C(O)NH-) ist. Diese Gruppen können aus im Handel erhältlichen Disäuren hergestellt werden, wie Malonsäure (CH&sub2;(CO&sub2;H)&sub2;), Succinsäure (HO&sub2;CCH&sub2;CH&sub2;CO&sub2;H), Glutarsäure (HO&sub2;CCH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;CO&sub2;H) und Adipinsäure (HO&sub2;CCH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;CO&sub2;H) und ähnlichen; ebenso aus substituierten Disäuren, wie Weinsäure (HO&sub2;CCH(OH)CH(OH)CO&sub2;H), 3-Methylglutarsäure (HO&sub2;CCH&sub2;CH(CH&sub3;)CH&sub2;CO&sub2;H) und ähnlichen unter Verwendung von chemisch wohlbekannten Verfahren. Acylderivate, wie Acylchloride, z. B. 3-Carbmethoxypropionylchlorid (ClC(O)C&sub2;H&sub4;CO&sub2;CH&sub3;), und die diesen entsprechenden Amide sind im Handel erhältlich oder können unter Verwendung bekannter Verfahren hergestellt werden.
PEG ist ein lineares, wasserlösliches Polymer von sich wiederholenden Ethylenoxid Einheiten mit zwei endständigen Hydroxylgruppen. PEGs werden durch ihre Molekulargewichte klassifiziert; zum Beispiel hat PEG 2000 ein durchschnittliches Molekulargewicht von etwa 2000 Dalton, und PEG 5000 hat ein durchschnittliches Molekulargewicht von etwa 5000 Dalton. PEGs sind im Handel erhältlich von Sigma Chemical Co. und anderen Firmen und umfassen: Monomethoxypolyethylenglykol (MePEG-OH), Monomethoxypolyethylenglykol-succinat (MePEG-S), Monomethoxypolyethylenglykol-succinimidylsuccinat (MePEG-S-NHS), Monomethoxypolyethylenglykol-amin (MePEG-NH&sub2;), Monomethoxypolyethylenglykol-tresylat (MePEG-TRES) und Monomethoxypolyethylenglykol-imidazolylcarbonyl (MePEG-IM).
Die Bindung von PEG an den Linker Y kann unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren und Materialien durchgeführt werden. Im allgemeinen wird ein Hydroxyl- oder Aminorest der PEG-Gruppe mit einem geeigneten Derivat von Y umgesetzt, um die gewünschte Kupplung zu bilden. Zum Beispiel ergibt die Umsetzung einer freien Hydroxylfunktion von MePEG-OH mit einem Acylchlorid-Derivat, wie 3-Carbmethoxypropionylchlorid (ClC(O)C&sub2;H&sub4;CO&sub2;CH&sub3;), das von Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wisconsin im Handel erhältlich ist, Me(PEG)-OC(O)C&sub2;H&sub4;CO&sub2;CH&sub3;. Der Methylester kann weiter derivatisiert werden, z. B. zu Acylchlorid oder Amid, unter Verwendung von Standardverfahren. Alternativ kann Me(PEG)OC(O)CH&sub2;CH&sub2;CO&sub2;H aus Me(PEG)-OH und Succinanhydrid gebildet werden, wie unten gezeigt:
Noch weitere Verfahren werden den Fachleuten offensichtlich sein.
Um PEG direkt an Ceramid zu kuppeln, kann die Hydroxyfunktion in MePEG direkt mit einem Reagens, wie CDI, aktiviert werden unter Bildung des entsprechenden Imidazolylformats. Das letztere wird dann mit einem Nucleophil umgesetzt, wie einer oder beiden Alkoholfunktionen des Ceramids, unter Bildung eines Konjugats mit einer Carbonatbindung. Alternativ wird die Kupplung von MePEG-imidazolylformat mit 1-Amino-Ceramid zur Bildung eines MePEG-Ceramidaddukts mit einer Carbamatbindung führen.
Handelsübliche Ceramide, die N-Acylfettsäuren von Sphingosinen sind, können erhalten werden durch Phospholipase C-Spaltung des Phosphocholins in den entsprechenden Sphingomyelinvorläufen, die aus Eigelben und Hirngeweben extrahiert werden. Die Sphingomyelinlipide unterscheiden sich in der Zusammensetzung der Fettsäureketten, wie der Kohlenstoffkettenlänge und der Zahl der Doppelbindungen. Die folgenden Ceramide sind im Handel von Sigma Chemical Co. und Avanti Polar Lipids Inc. erhältlich: (1) Typ III: aus Rinderhirn (annähernd 99%); (2) Typ IV: Rinderhirn (annähernd 99%); (3) aus Hirn (annähernd 99%); und (4) aus Ei (annähernd 99%). Die Fettsäureketten unterscheiden sich in der Zusammensetzung in Abhängigkeit von der Quelle des Sphingomyelins, wie in Tabelle I gezeigt. Tabelle I FETTSÄUREGEHALT DES AUS GEWEBE STAMMENDEN SPHINGOMYELINS
Eine große Vielzahl von Ceramidderivaten kann aus üblichen Ausgangsmaterialien synthetisiert werden unter Verwendung bekannter Techniken. Zum Beispiel kann, ausgehend von im Handel erhältlichen Erythritol (Aldrich, Milwaukee, Wisconsin), jedes Ceramidderivat synthetisiert werden, wie unten in dem Reaktionsschema V gezeigt ist. Selektiver Schutz des Erythritols unter Verwendung bekannter Methoden liefert das in Reaktionsschema V gezeigte Ausgangsmaterial, in dem die C&sub1; und C&sub3; Kohlenstoffe als Benzyl(Bn)-Derivate geschützt sind, der C&sub2; Kohlenstoff als Methylmethoxy(MOM)-ether geschützt ist und der C&sub4; Kohlenstoff als 3,4-Dimethoxybenzyl(DMPM)- etherderivat geschützt ist. Selektives Entfernen der DMPM-Gruppe unter Verwendung von Dichlordicyanchinon (DDQ) ergibt den entsprechenden Alkohol, der unter Verwendung von Standardverfahren oxidiert wird unter Bildung des Aldehyds, wie gezeigt ist (siehe z. B. Larock, oben).
Die Umsetzung des Aldehyds mit dem Wittig-Reagens Et&sub3;P&spplus;C&sub1;&sub4;H&sub2;&sub9;Br&supmin; ergibt vorzugsweise das trans-Olefin. Alternativ ergibt die Umsetzung mit dem Triphenylphosphinderivat Ph&sub3;P&spplus;C&sub1;&sub4;H&sub2;&sub9;Br&supmin; überwiegend das cis-Olefin. Wiederum werden andere Verfahren der Olefinbildung den Fachleuten geläufig sein. Die Entfernung der MOM- Schutzgruppe, gefolgt von der Umwandlung des Alkohols unter Verwendung von Natriumazid (NaN&sub3;) und Lithiumaluminiumhydrid (LiAlH&sub4;) ergibt das gewünschte Amin, das mit einem Acylchlorid umgesetzt wird unter Bildung des gezeigten Amids. Die Umsetzung des Amids mit Bortrichlorid (BCl&sub3;) in Methylenchlorid (CH&sub2;Cl&sub2;) unter Verwendung eines Temperaturgradienten von -78ºC bis 0ºC, gefolgt von der Umsetzung mit Methanol (MeOH) bei -78ºC, ergibt das gewünschte Diol. Andere äquivalente Syntheseverfahren werden für Fachleute offensichtlich sein. Zusätzliche Informationen bezüglich der Synthese von Sphingolipiden und optisch aktiven Ceramiden können gefunden werden bei Schmidt et al. ANGEW. CHEM. INT. Ed. Engl. (1987) 26: 793; Kiso et al. J. CARBOHYDR. CHEM. (1986) 5: 335; und Nicolaou et al. J. AMER. CHEM. SOC. (1988) 110: 7910.
Ceramide mit verschiedenen Fettamidkettenlängen können auch hergestellt werden durch Umsetzung des Amins von Schema V mit verschiedenen Acylchloriden [R&sup4;C(O)C&sub1;] oder anderen Acyl- oder Säurederivaten, wobei die Kohlenstoffkettenlänge abhängt von der speziell verwendeten Acylgruppe. Typischerweise und bevorzugt reicht die Kohlenstoffkettenlänge von etwa 8 bis etwa 24 ohne irgendwelche anwesenden Doppelbindungen, z. B. eine Alkylkette. Am meisten bevorzugt sind diejenigen Ceramide, die als 20 : 0 bezeichnet werden, was eine 20-Kohlenstoffkette ohne Doppelbindungen bedeutet, d. h. ein vollständig gesättigtes C&sub2;&sub0; Alkyl als Fettamidkette. Alternativ können Ceramide mit speziellen Acylketten von homogener Zusammensetzung hergestellt werden durch Verbindung einer geeigneten aktivierten Carboxylverbindung, wie N-Hydroxysuccinimid(NHS)-ester einer Fettsäure, mit der Aminofunktion von D-Sphingosin. Zum Beispiel wird ein Acylchlorid der Eicosansäure (auch bekannt als Arachinsäure) eine Kette von 20 Kohlenstoffen (C20) in der Länge für die resultierende Amidseitenkette bilden. Andere Säuren umfassen vorzugsweise: Octansäure (auch als Caprylsäure bekannt) für C8; Myristinsäure für C14; Palmitinsäure (auch bekannt als Hexadecansäure) für C16; und Tetracosansäure (auch bekannt als Lignocerinsäure) für C24. Ceramide mit Fettsäureamiden mit Kettenlängen von 14 bis 20 Kohlenstoffen sind besonders bevorzugt. Am bevorzugtesten sind diejenigen mit 14 bis 20 Kohlenstoffen in der Länge. (Es versteht sich, daß R&sup4; um einen Kohlenstoff kürzer in der Länge ist als das Ausgangsacylchlorid oder die Ausgangssäure.) Reaktionsschema V

Liposomherstellung

Nachdem die Lipide der Formel I hergestellt sind, können sie in Liposomstrukturen verwendet werden, die ein oder mehrere bioaktive Agentien enthalten oder einschließen, wobei eine oder mehrere Lipidverbindungen das Liposom ausmachen. Zum Beispiel kann die Fettamidkette verschiedene Längen auf dem Ceramidteil des Lipids haben, und eine Mischung von verschiedenen resultierenden Lipidverbindungen bildet das gewünschte Liposom. Zusätzlich können nicht-PEG-Ceramidlipide verwendet werden, um das Liposom in Kombination mit den Lipiden der Formel I zu bilden.
Eine Vielzahl von Verfahren sind zur Herstellung von Liposomen verfügbar, wie beschrieben in z. B. Szoka et al. 9 ANN. REV. BIOPHYS. BIOENG. 467 (1980); US Patente Nr. 4 235 871, 4 501 728, 4 837 028; der Text LIPOSOMES Ch. 1 (oben) und Hope et al. 40 CHEM. PHYS. LIP 89 (1986). Ein Verfahren liefert multilamellare Bläschen von heterogenen Größen. Bei diesem Verfahren werden die bläschen bildenden Lipide in einem geeigneten organischen Lösemittel oder Lösemittelsystem gelöst und unter Vakuum getrocknet oder in inertem Gas unter Bildung eines dünnen Lipidfilms. Alternativ können die Lipide in einem organischen Lösemittel, wie tert-Butylalkohol oder Benzol : Methanol (95 : 5 v/v) gelöst und lyophilisiert werden unter Bildung einer homogenen Lipidmischung, die in einer leichter hydratisierbaren pulverartigen Form vorliegt. Die trockene Lipidmischung wird mit einer wäßrigen gepufferten Lösung bedeckt und hydratisieren gelassen, typischerweise während einer 15-60 minütigen Zeitspanne unter Bewegen. Die Größenverteilung der resultierenden multilamellaren Bläschen kann zu kleineren Größen hin verschoben werden durch Hydratisierung der Lipide unter stärkerer Bewegung. Die volle Hydratisierung der Lipide kann durch Frieren in flüssigem Stickstoff und Auftauen auf etwa 50ºC erhöht werden. Dieser Zyklus wird üblicherweise etwa fünfmal wiederholt.
Nach der Liposomherstellung können die Liposomen auf eine bestimmte Größe gebracht werden, um einen gewünschten Größenbereich und eine relativ enge Verteilung der Liposomgrößen zu erreichen. Ein Größenbereich von etwa 0,05-0,20 Mikron erlaubt es, die Liposomsuspension zu sterilisieren durch Filtration durch einen herkömmlichen Filter, üblicherweise unter Verwendung eines 0,22 Mikron Filters. Das Filtersterilisationsverfahren kann mit einem hohen Durchsatz ausgeführt werden, wenn die Liposomen auf eine Größe von etwa 0,05-0,20 Mikron gebracht worden sind.
Verschiedene Techniken sind verfügbar, um die Liposomen auf eine bestimmte Größe zu bringen wie das in dem US-Patent Nr. 4 737 323 beschriebene Verfahren zur Größeneinstellung. Zum Beispiel liefert die Schallbehandlung einer Liposomsuspension entweder durch eine Bad- oder Sondenschallbehandlung eine zunehmende Abnahme der Größe herunter zu kleinen einlamellaren Bläschen von weniger als etwa 0,05 Mikron in der Größe. Homogenisierung ist ein anderes Verfahren, das auf Scherenergie basiert, um große Liposomen in kleinere zu teilen. In einem typischen Homogenisierungsverfahren werden multilamellare Bläschen durch einen Standard-Homogenisierapparat für Emulsionen rezirkuliert, bis die gewählten Liposomgrößen, typischerweise zwischen etwa 0,01 und 0,5 Mikron, beobachtet werden. Bei beiden Verfahren kann die Teilchengrößeverteilung durch herkömmliche Teilchengrößeanalyse mittels Laserstrahl beobachtet werden.
Die Extrusion des Liposoms durch eine kleinporige Polycarbonat membran oder eine asymmetrische Keramikmembran ist auch ein wirksames Verfahren zur Verkleinerung der Liposomen auf eine relativ gut definierte Größenverteilung. Typischerweise wird die Suspension durch die Membran ein oder mehrere Male zykliert, bis die gewünschte Liposomgrößenverteilung erreicht ist. Die Liposomen können durch zunehmend kleiner porige Membranen extrudiert werden, um eine zunehmende Verkleinerung der Liposomgröße zu erreichen. Für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind Liposomen mit einer Größe von etwa 0,05 Mikron bis etwa 0,20 Mikron bevorzugt. Liposomherstellungen werden auch von Deamer et al. in Liposomes (oben) LIPOSOME PREPARATIONS: METHODS AND MECHANISMS beschrieben.
Liposomgrößenverteilungen können auch durch quasi-elastische Lichtstreutechniken bestimmt werden. Siehe Bloomfield, 10 Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 421 (1981).

Verwendung von Liposomen als Transportträger

Die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Lipidverbindungen hergestellten Liposomen können mit Markern markiert werden, was die diagnostische Darstellung von verschiedenen Krankheitszuständen, einschließlich Tumoren, entzündeten Gelenken oder Verletzungen, erleichtert. Typischerweise sind diese Labels radioaktive Marker, obwohl fluoreszierende Labels auch verwendet werden können. Die Verwendung von gamma-emittierenden Radioisotopen ist besonders vorteilhaft, da sie leicht in einem Scintillationszählrohr gezählt werden können, vor dem Zählen keine Gewebehomogenisierung erfordern und mit Gammakameras abgebildet werden können.
Gamma- oder positronemittierende Radioisotope werden typischerweise verwendet, wie &sup9;&sup9;Tc, ²&sup4;Na, &sup5;¹Cr, &sup5;&sup9;Fe, &sup6;&sup7;Ga, &sup8;&sup6;Rb, ¹¹¹In, ¹²&sup5;I und ¹&sup9;&sup5;Pt als gammaemittierend; und solche wie &sup6;&sup8;Ga, &sup8;²Rb, ²²Na, &sup7;&sup5;Br, ¹²²I und ¹&sup8;F als positronemittierend.
Die Liposomen können auch mit einem paramagnetischen Isotop markiert werden für Zwecke der in vivo Diagnose, wie durch die Verwendung von magnetischer Resonanzabbildung (MRI) oder Elektronenspinresonanz (ESR). Siehe zum Beispiel US-Patent Nr. 4 728 575.
Die Liposomen sind ein wertvolles System für den kontrollierten Transport von Arzneimitteln. Wie vorher diskutiert, sind aus PEG- Lipiden hergestellte Liposomen besonders vorteilhaft, da sie beständiger sind und eine erhöhte Halbwertszeit bei der Zirkulation haben gegenüber herkömmlichen Liposomen. Die Verwendung von Liposomen als Arzneimittelträger erlaubt eine größere Steuerung des Ortes und der Geschwindigkeit der Freigabe des Arzneimittels, was es er möglicht, eine größere Genauigkeit bei der Regulierung der Niveaus des Arzneimittels und/oder seiner Metaboliten im Blut und Organ zu erhalten. Daher können die benötigten Arzneimitteldosierungen, um klinische Wirkungen zu erreichen, erniedrigt werden, was wiederum die Toxizität erniedrigt. Toxizitätsprobleme sind besonders bedeutend bei Krebschemotherapie, wo die Dosierungshöhen, die für nützliche Wirkungen erforderlich sind, und die Dosierungen, die eine signifikante Toxizität zur Folge haben, sehr dicht beieinander liegen. Daher kann bei der Krebschemotherapie die Verwendung von Liposomträgern für Antitumorarzneimittel signifikante therapeutische Vorteile ergeben.
In Abhängigkeit von dem Aufnahmevolumen innerhalb des Liposoms und den chemischen und physikalischen Eigenschaften der bioaktiven Agenden können miteinander verträgliche bioaktive Agentien gleichzeitig in einem einzigen Liposom eingekapselt werden. Der gleichzeitige Transport von zwei oder mehreren synergistischen Arzneimitteln auf diese Weise wird den Transport dieser Arzneimittel an dieselbe Stelle im Körper sicherstellen und die Arzneimittel in enger Nähe halten um zusammenzuwirken, was somit die Therapie stark erleichtert.
Eine große Vielzahl von bioaktiven Agenden, pharmazeutischen Substanzen oder Arzneimitteln kann im Inneren der relativ impermeablen Doppelschichtmembranen der Liposomen eingekapselt werden, wo diese Substanzen vor der Umgebung geschützt werden können, während des Weges zu ihren Zielbereichen. Diese Substanzen umfassen Antitumoragentien, Antibiotika, Immunmodulatoren, entzündungshemmende Arzneimittel und Arzneimittel, die auf das zentrale Nervensystem (CNS) wirken. Besonders bevorzugte Antitumoragentien umfassen Actinomycin D, Vincristin, Vinblastin, Cystinarabinosid, Anthracycline, alkylierende Agentien, Platinverbindungen, Antimetaboliten und Nucleosidanaloge, wie Methotrexat und Purin und Pyrimidinanaloge. Berücksichtigt man die bevorzugte Aufnahme von intravenös injizierten Liposomen durch das Knochenmark, die lymphoiden Organe, die Leber, die Milz und die Lungen sowie die Makrophagen, so können Neoplasmen und andere diese Organe befallende Krankheiten wirksam durch Arzneimittel behandelt werden, die in von PEG abgeleiteten Liposomen eingeschlossen sind. (Siehe Daoud et al., "Liposomes In Cancer Therapy", 3 ADV DRUG DELIVERY REVIEWS 405-418, 1989.)
Eine andere klinische Anwendung der Liposomen ist die als Adjuvans zur Immunisierung von sowohl Tieren als auch Menschen. Pro teinantigene, wie Diphtherietoxoid, Choleratoxin, parasitische Antigene, Virusantigene, Immunoglobuline, Enzyme, gewebeverträgliche Antigene können in oder auf den Liposomen gebunden werden für Immunisierungszwecke.
Liposomen sind auch besonders nützlich als Träger für Impfstoffe, die auf die entsprechenden lymphoiden Organe gezielt werden, um die Immunantwort zu stimulieren.
Liposomen sind auch als ein Vektor verwendet worden, um immunsuppressive oder immunstimulierende Agentien selektiv zu Makrophagen zu transportieren. Insbesondere Glukokortikoide, die zur Unterdrückung der Makrophagenaktivität nützlich sind, und Lymphokine, die Makrophagen aktivieren, sind in Liposomen transportiert worden.
Die Liposomen mit auf ein Ziel gerichteten Molekülen können verwendet werden, um eine Zelle zu stimulieren oder zu supprimieren. Zum Beispiel können Liposomen, die ein besonderes Antigen enthalten, verwendet werden, um die B Zellen Population zu stimulieren, die einen Oberflächenantikörper aufweisen, der spezifisch an das Antigen bindet. Ähnlich können PEG-stabilisierte Liposomen, die Wachstumsfaktoren oder Lymphokine auf der Liposomoberfläche aufweisen, gesteuert werden, um die Zellen zu stimulieren, die die geeigneten Rezeptoren für diese Faktoren aufweisen. Solch ein Weg kann zum Beispiel verwendet werden bei der Stimulierung von Knochenmarkzellen, sich schnell zu vermehren, als Teil der Behandlung von Krebspatienten nach Bestrahlung oder Chemotherapie, die Stammzellen und sich aktiv teilende Zellen zerstört.
In Liposomen eingekapselte Antikörper können verwendet werden, um Überdosierungen von Arzneimitteln zu behandeln. Die Neigung der Liposomen mit eingekapselten Antikörpern, zur Leber transportiert zu werden, hat einen therapeutischen Vorteil bei der Ausscheidung von Substanzen, wie toxischen Agentien, aus dem Blutkreislauf. Es ist gezeigt worden, daß eingekapselte Antikörper eine erhöhte Milz- und Leberaufnahme und eine erhöhte Ausscheidungsgeschwindigkeit von Digoxin verursachen, während nicht eingekapselte Antikörper gegen Digoxin intravaskuläre Retention des Arzneimittels verursachen.
Liposomen, die PEG-Lipide enthalten, finden auch Verwendung als Träger zur Einführung von Lipid- oder Proteinantigenen in die Plasmamembran von Zellen, denen die Antigene fehlen. Zum Beispiel können gewebeverträgliche Antigene oder Virusantigene in die Oberfläche von virusinfizierten oder Tumorzellen eingeführt werden, um die Erkennung und das Abtöten dieser Zellen durch das Immunsystem zu beschleunigen.
In bestimmten Ausführungsformen ist es wünschenswert, die erfindungsgemäßen Liposomen auf ein Ziel auszurichten unter Verwendung von auf ein Ziel gerichteten Resten, die für eine Zellart oder ein Gewebe spezifisch sind. Die Zielausrichtung der Liposomen unter Verwendung von einer Vielzahl von auf ein Ziel gerichteten Resten, im folgenden Targetreste genannt, wie Liganden, Rezeptoren der Zelloberfläche, Glykoproteine und monoklonale Antikörper sind früher beschrieben worden. Siehe US-Patent Nr. 4 957 773 und 4 603 044. Die Targetreste können das gesamte Protein oder deren Fragmente enthalten.
Die Mechanismen für die Ausrichtung auf ein Ziel erfordern allgemein, daß die Targetagentien auf der Oberfläche des Liposoms so angeordnet sind, daß der Targetrest für die Wechselwirkung mit dem Ziel zugänglich ist; zum Beispiel einem Rezeptor der Zelloberfläche. Das Liposom ist so ausgelegt, daß es zum Zeitpunkt der Liposombildung einen Verbindungsteil in die Membran einbaut. Der Verbindungsteil muß einen lipophilen Teil haben, der fest eingebettet und verankert in der Membran ist. Er muß auch einen hydrophilen Teil haben, der chemisch auf der wäßrigen Oberfläche des Liposoms zugänglich ist. Der hydrophile Teil ist so ausgewählt, daß er chemisch geeignet für das Targetagens ist, so daß der Teil und das Agens eine beständige chemische Bindung bilden. Daher ragt der Verbindungsteil üblicherweise aus der Liposomoberfläche heraus und ist so gestaltet, um das Targetagens in die richtige Stellung zu bringen. In einigen Fällen ist es möglich, das Targetagens direkt an den Verbindungsteil zu binden, aber in vielen Fällen ist es geeigneter, ein drittes Molekül zu verwenden, das als "molekulare Brücke" wirkt. Die Brücke verbindet den Verbindungsteil und das Targetagens von der Oberfläche des Liposoms entfernt, wodurch das Targetagens für die Wechselwirkung mit dem Zellenziel frei zugänglich ist.
Standardverfahren zur Kupplung der Targetagentien können verwendet werden. Zum Beispiel können Phosphatidylethanolamin, das für die Bindung der Targetagentien aktiviert werden kann, oder derivatisierte lipophile Verbindungen, wie lipidderivatisiertes Bleomycin, verwendet werden. Liposomen, die mit einem Antikörper auf ein Ziel ausgerichtet sind, können hergestellt werden unter Verwendung zum Beispiel von Liposomen, die Protein A enthalten. Siehe Renneisen et al., 265 J. Biol. Chem. 16337-16342 (1990) und Leonetti et al., 87 Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 2448-2451 (1990). Andere Beispiele von Antikörperkonjugation sind in der US-Patentanmeldung Nr. 08/316 394, angemeldet 30. September 1994 offenbart, deren Lehren durch Nennung Teil der Beschreibung sind. Beispiele von Targetresten können auch andere Proteine umfassen, die spezifisch sind für Zellkomponenten, einschließlich Antigenen, die mit Neoplasmen oder Tumoren assoziiert sind. Proteine, die als Targetreste verwendet werden, können an Liposomen über kovalente Bindungen gebunden sein. Siehe Heath, Covalent Attachment of Proteins to Liposomes, 149 Methods in Enzymology 111-119 (Academic Press, Inc. 1987). Andere Verfahren zur Ausrichtung auf ein Ziel umfassen das Biotin- Avidin System.
In einigen Fällen kann die diagnostische Zielausrichtung des Liposoms anschließend verwendet werden, um die Zielzelle oder das Zielgewebe zu behandeln. Wenn zum Beispiel ein Toxin an ein Targetliposom gekuppelt wird, dann kann das Toxin wirksam sein bei der Zerstörung der Zielzelle, wie einer Neoplasmazelle.
Wenn die eingekapselten bioaktiven Agentien oder die Liposomen selbst von der Zelle aufgenommen werden, können auch die bioaktiven Agentien auf eine spezifische intrazellulare Wirkungsstelle ausgerichtet sein, wenn targeterkennende Reste in das Agens eingebaut sind. Zum Beispiel können Proteinagentien, die an den Kern abgegeben werden, eine kernlokalisierende Signalsequenz enthalten, die rekombinant in das Protein eingebaut ist, oder die Signalsequenz kann auf einem separaten Protein oder Peptid kovalent an das primäre Protein gebunden sein. Ebenfalls können Nicht-Protein-Arzneimittel, die für den Kern bestimmt sind, solch einen kovalent gebundenen Signalrest aufweisen. Andere targeterkennende Reste, die rekombinant eingebaut sind oder kovalent an Proteinkomponenten gebunden sind, um durch Liposomen transportiert zu werden, umfassen Liganden, Rezeptoren und Antikörper oder deren Fragmente.
Die vorliegende Erfindung sieht auch ein Kit vor für die Herstellung markierter Liposomen. Das Kit wird typischerweise ein Behältnis aufweisen, das in Abteilungen aufgeteilt ist, um die verschiedenen Elemente des Kits zu enthalten. Eine Abteilung kann die Materialien enthalten zur Herstellung der Markierung direkt vor der Verwendung. Eine zweite Abteilung kann die Liposomen mit oder ohne einen pH-Puffer enthalten, der den pH der Zusammensetzung auf den physiologischen Bereich von etwa 7 bis etwa 8 einstellt. Die Liposomen können auch in gefriergetrockneter Form bereitgestellt sein für die Wiederherstellung zum Zeitpunkt der Verwendung. Innerhalb des Kits werden auch andere Reagentien und Instruktionen für die Verwendung enthalten sein.
Die Liposomen, die die erfindungsgemäßen Lipidverbindungen enthalten, können als pharmazeutische Zusammensetzungen oder Formulierungen nach Standardtechniken formuliert werden unter Verwendung akzeptabler Adjuvantien oder Träger. Bevorzugt werden die physiologischen pharmazeutischen Zusammensetzungen parenteral verabreicht, d. h. intravenös, subkutan oder intramuskulär. Geeignete Formulierungen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung werden in REMINGTONT's PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Publishing Co., 18. Auflage 1990) gefunden.
Bevorzugt werden die Zusammensetzungen intravenös verabreicht. Daher sieht diese Erfindung Zusammensetzungen für intravenöse Verabreichung vor, die eine Lösung der Liposomen enthalten, die in einem physiologisch akzeptablen Adjuvans oder Träger suspensiert sind, vorzugsweise einem wäßrigen Träger, wie Wasser, gepuffertes Wasser, isotonische Salzlösung und ähnliche. Die Zusammensetzungen können durch herkömmliche, wohl bekannte Sterilisationstechniken sterilisiert werden oder können steril filtriert werden. Die resultierenden wäßrigen Lösungen können für die Verwendung so verpackt werden oder lyophilisiert werden; das lyophilisierte Präparat wird mit einer sterilen wäßrigen Lösung vor der Verabreichung kombiniert. Die Zusammensetzungen können pharmazeutisch akzeptable Hilfssubstanzen, falls erforderlich, enthalten, um sich den geeigneten physiologischen Bedingungen anzunähern, wie pH-einstellende und puffernde Agentien, den Tonus einstellende Agentien, Netzmittel und ähnliche. Solche Agentien umfassen Natriumacetat, Natriumlactat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Sorbitanmonolaurat, Triethanolaminoleat und ähnliche.
Die in pharmazeutischen Zusammensetzungen geeignete Konzentration der Liposomen kann von etwa 0,05 Gew.-%, üblicherweise etwa 2-5 Gew.-% oder soviel wie etwa 10-30 Gew.-% der Zusammensetzung reichen, und der Konzentrationsbereich wird in Übereinstimmung mit der Verabreichungsart und dem im Liposom enthaltenen bioaktiven Agens ausgewählt.
Da die vorliegenden aus PEG-Ceramidlipiden hergestellten Liposomen weniger anfällig für Hydrolyse sind, haben sie eine verlängerte Halbwertszeit, was zu einer verlängerten Zirkulation führt. Außerdem kann die pharmazeutische Liposomzusammensetzung lipid schützende Agentien enthalten, die die Liposomen gegen Schaden durch freie Radikale und Lipidperoxidation während der Lagerung schützen. Solche schützenden Agentien umfassen alpha-Tocopherol und wasserlösliche, eisenspezifische Chelatbildner, wie Ferrioxamin.

Verwendung der Lipide oder Träger auf Lipidbasis als Transportträger

Kationische Lipide können zum Transport von therapeutischen Genen oder Oligonukleotiden verwendet werden, die bestimmt sind, die Produktion von einigen Proteinen innerhalb der Zelle zu induzieren oder zu blockieren. Nucleinsäure ist negativ geladen und muß mit einer positiv geladenen Einheit kombiniert werden, um einen für die Formulierung und zellularen Transport geeigneten Lipidkomplex zu bilden.
Kationische Lipide sind verwendet worden in der Transfektion von Zellen in vitro und in vivo (Wang C-Y, Huang L, pH-sensitive immunoliposomes mediate target cell-specific delivery and controlled expression of a foreign gene in mouse. PROC. NATL. ACAD. SCI USA, 1987; 84: 7851-7855 und Hyde SC, Gill Dr. Higgins CF et al. Correction of the ion transport defect in cystic fibrosis transgenic mice by gene therapy. NATURE, 1993; 362: 250-255). Die Wirksamkeit dieser Transfektion ist aus mehreren Gründen oft geringer als erwünscht gewesen. Einer ist die Neigung von an Nucleinsäure komplexierten kationischen Lipiden, nicht zufriedenstellende Träger zu bilden. Diese Träger werden durch die Zugabe von den erfindungsgemäßen PEG-modifizierten Ceramidlipiden verbessert. Die Zugabe der PEG-modifizierten Ceramidlipide verhindert Teilchenaggregation und schafft ein Mittel zur Erhöhung der Zirkulationslebensdauer und zur Erhöhung des Transports der Lipid-Nucleinsäure Teilchen an die Zielzellen. Darüberhinaus ist gefunden worden, daß kationische Lipidträgersysteme schneller mit den Zielzellen verschmelzen und daher die Zugabe von negativ geladenen PEG-PE Lipiden (z. B. PEG&sub2;&sub0;&sub0;&sub0;- DMPE), obwohl sie die Aggregation und Selbstverschmelzung der kationischen Trägerplasmidsysteme verhindert, eine zusätzliche elektrostatische Wechselwirkung zwischen dem anionischen PEG-PE und dem kationischen Lipid einführen kann. Solch eine Wechselwirkung hält wirksam das PEG-PE auf dem Trägersystem fest und hält daher die sterische Stabilisierungswirkung aufrecht und hindert die Verschmelzung des kationischen Trägersystems mit den Zielzellen. Die neutralen PEG-modifizierten Ceramidlipide haben nicht solch eine elektrostatische Wechselwirkung mit den kationischen Trägerkompo nenten und können daher aus dem System herauswechseln entsprechend der Affinitätsstärke zwischen dem spezifischen Ceramidlipid und den anderen hydrophoben Komponenten in dem System. Dies ist ein entscheidender Vorteil, den die PEG-modifizierten Ceramidlipide gegenüber PEG-PE bei der Bildung von programmierbaren fusogenischen kationischen Trägersystemen haben (siehe Beispiel 12 unten).
Geeignete kationische Lipide zur Herstellung von Trägern auf Lipidbasis für den Transport von Gen und Oligonucleotid sind LIPO- FECTIN (US-Patente 4 897 355; 4 946 787 und 5 208 036 von Eppstein et al.) und LIPOFECTACE (US-Patent 5 279 883 von Rose). Beide Agentien ebenso wie andere transfektierende kationische Lipide sind von Life Technologies, Inc. in Gaithersburg, Maryland erhältlich.
Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele besser verstanden werden, die die Aspekte der Erfindung erläutern sollen, ohne sie jedoch darauf einzuschränken.

Beispiel 1: N-Eicosanoyl-D-sphingosin [C20: 0-Ceramid]

N-Hydroxysuccinimid(NHS)-ester von Eicosansäure wurde unter Verwendung des Verfahrens von Lapidot et al. (J. Lipid Res., 1967, 8: 142) synthetisiert. 428 mg des Esters wurden zu einer Lösung von D-Sphingosin (Avanti Polar Lipids, Inc.) (300 mg) in wasserfreiem Methylenchlorid (CH&sub2;Cl&sub2;, 16 ml) und Triethylamin (118 mg) unter Rühren und Stickstoff (N&sub2;) bei 20ºC während 4 Stunden gegeben. Die Analyse durch Dünnschichtchromatographie (DSC) (Silicagel, CHCl&sub3;: CH&sub3;OH : H&sub2;O-65 : 25 : 4 v/v oder CHCl&sub3; : CH&sub3;OH-90 : 10 v/v) zeigte, daß das meiste des D-Sphingosins reagiert hatte. [Falls notwendig, kann ein weiterer kleiner Teil von NHS-Ester der Eicosansäure (20-30 mg) zugegeben werden, um die Acylierung von D-Sphingosin zu vervollständigen]. Die Reaktionsmischung wurde in Eis gekühlt und mit CH&sub2;Cl&sub2; (60 ml), H&sub2;O (30 ml) verdünnt und mit 1 N HCl neutralisiert. Die CH&sub2;Cl&sub2;-Schicht wurde mit H&sub2;O (2 · 30 ml) gewaschen und getrocknet (MgSO&sub4;) vor der Eindampfung zur Trockne im Vakuum. Der Rückstand wurde zweimal aus Aceton umkristallisiert unter Bildung des reinen Produkts, N-Eisosanoyl-D-sphingosin (428 mg), als weißer Feststoff. Die DSC zeigte einen einzigen Fleck und das ¹H-HMR-Spektrum stimmte mit der erwarteten Struktur überein.

Beispiel 2: Monomethoxypolyethylenglycol&sub2;&sub0;&sub0;&sub0;-succinat (MePEG&sub2;&sub0;&sub0;&sub0;-S)

Monomethoxypolyethylenglycol mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 2000 Dalton (MePEG&sub2;&sub0;&sub0;&sub0;) (Sigma Chemical Co.) (4 g), gelöst in CH&sub2;Cl&sub2; (30 ml) wurde mit Succinanhydrid (600 mg), Triethylamin (400 mg) und 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) (250 mg) behandelt und unter N&sub2; bei 20ºC während 16 Stunden gerührt. Die Reaktionslösung wurde mit CH&sub2;Cl&sub2; (60 ml) verdünnt, in Eis gekühlt und mit H&sub2;O (50 ml) versetzt. Die Mischung wurde mit 1N HCl angesäuert und die organische Schicht abgetrennt. Die wäßrige Schicht wurde weiter mit CH&sub2;Cl&sub2; (2 · 30 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden getrocknet (MgSO&sub4;) und dann zur Trockne eingedampft. Das rohe Produkt wurde auf einer Silicagel (G60)-Säule gereinigt, die mit einem Lösemittelsystem, das 2 bis 8% Methanol enthielt, eluiert wurde. Die gesammelten Fraktionen wurden durch DSC (Silicagel, CHCl&sub3; : CH&sub3;OH-88 : 12 v/v) analysiert und diejenigen, die das reine Produkt (MePEG&sub2;&sub0;&sub0;&sub0;-S) mit einem Rf-Wert von 0,4 enthielten, wurden vereinigt und konzentriert. Die Trituration des Produktes mit Diethylether ergab MePEG&sub2;&sub0;&sub0;&sub0;-S als weißen Feststoff (3,2 g).

Beispiel 3: Monomethoxypolyethylenglycol&sub5;&sub0;&sub0;&sub0;-succinat (MePEG&sub5;&sub0;&sub0;&sub0;-S)

Die in der Überschrift angegebene Verbindung wurde aus Monomethoxypolyethylenglycol mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 5000 Dalton (MePEG&sub5;&sub0;&sub0;&sub0;) (Sigma Chemical Co.) in einem ähnlichen Verfahren hergestellt, wie oben für MePEG&sub2;&sub0;&sub0;&sub0;-S beschrieben.

Beispiel 4 : 1-0-(MePEG&sub2;&sub0;&sub0;&sub0;-S)-(C20 : 0-Ceramid)

C20 : 0-Ceramid (60 mg), Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) (28 mg) und DMAP (13 mg) wurden in warmem, wasserfreiem CH&sub2;Cl&sub2; (6 ml) gelöst. MePEG&sub2;&sub0;&sub0;&sub0;-S (230 mg) in wasserfreiem CH&sub2;Cl&sub2; (1 ml) wurde tropfenweise zu der obigen Lösung unter Rühren und N&sub2; bei 25ºC während 6 Stunden zugegeben. Der ausgefällte Dicyclohexylharnstoff (DCU) wurde abfiltriert und das Filtrat im Vakuum konzentriert. Die Trituration des festen Rückstands mit Diethylether entfernte das meiste des DCC, DMAP und nicht umgesetzten C20 : 0-Ceramids. Das resultierende rohe Produkt wurde auf einer kurzen Silicagel-Säule (G60) chromatographiert, die mit CH&sub2;Cl&sub2; : CH&sub3;OH-98 : 2 (v/v) eluiert wurde. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und zur Trockne im Vakuum eingedampft. Der resultierende Feststoff wurde in destilliertem H&sub2;O (2 ml) gelöst und bei 4ºC gegen destilliertes Wasser über Nacht dialysiert. Das reine Produkt wurde als weißes Pulver (160 mg) durch Lyophilisierung erhalten. Die DSC (Silicagel, CHCl&sub3; : CH&sub3;OH-90 : 10 v/v) zeigte einen einzigen Fleck (Rf 0,5). Das ¹H-NMR-Spektrum des Produktes stimmte mit der Struktur von 1-0-(MePEG&sub2;&sub0;&sub0;&sub0;-S)-(C&sub2;&sub0; : 0-Ceramid) überein. LPEG&sub2;&sub0;&sub0;&sub0;-Ceramid]

Beispiel 5 : 1-0-(MePEG&sub2;&sub0;&sub0;&sub0;-S)-(Ei-Ceramid)[PEG&sub2;&sub0;&sub0;&sub0;-Ceramid]

Ei-Ceramid (Avanti Polar Lipids, Inc.) (108 mg), DCC (48 mg) und DMAP (25 mg) wurden in warmem, wasserfreiem CH&sub2;Cl&sub2; (8 ml) gelöst. MePEG&sub2;&sub0;&sub0;&sub0;-S (460 mg) in wasserfreiem CH&sub2;Cl&sub2; (2 ml) wurde tropfenweise zu der obigen Lösung unter Rühren und N&sub2; bei 25ºC während 6 Stunden zugegeben. Das ausgefällte DCU wurde abfiltriert und das Filtrat im Vakuum konzentriert. Die Trituration des festen Rückstands mit Diethylether entfernte das meiste der restlichen Reagentien und eine kleine Menge des nicht umgesetzten Ei-Ceramids. Das rohe Produkt wurde auf einer kurzen Silicagel-Säule (G60) chromatographiert, die mit CH&sub2;Cl&sub2; : CH&sub3;OH-98 : 2 (v/v) eluiert wurde. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und zur Trockne im Vakuum eingedampft. Der resultierende Feststoff wurde in destilliertem Wasser (2 ml) gelöst und bei 4ºC gegen destilliertes Wasser über Nacht dialysiert. Die Lyophilisierung der Lösung ergab das reine Produkt als ein weißes Pulver (338 mg). Die DSC (Silicagel, CHCl&sub3; : CH&sub3;OH-90 : 10 v/v) zeigte einen einzigen Fleck (Rf 0,5). Das ¹H-NMR-Spektrum des Produktes stimmte mit der Struktur von 1-0-(MePEG&sub2;&sub0;&sub0;&sub0;-S)-(Ei-Ceramid) überein.

Beispiel 6 : 1-0-(MePEG&sub5;&sub0;&sub0;&sub0;-S)-(Ei-Ceramid) [PEG&sub5;&sub0;&sub0;&sub0;-Ceramid)

Die in der Überschrift genannte Verbindung wurde aus MePEG&sub5;&sub0;&sub0;&sub0;-S (550 mg) und Ei-Ceramid (54 mg) in einem ähnlichen Verfahren zu dem oben für 1-0-(MePEG&sub2;&sub0;&sub0;&sub0;-S)-(Ei-Ceramid) beschriebenen unter Verwendung von DCC (28 mg) und DMAP (13 mg) als Kondensationsreagentien in wasserfreiem CH&sub2;Cl&sub2; (6 ml) hergestellt. Die ähnliche Reinigung durch Säulenchromatographie (Silicagel) und Dialyse ergab das reine Produkt 1-0-(MePEG&sub5;&sub0;&sub0;&sub0;-S)-(Ei-Ceramid) als ein weißes Pulver (310 mg).

Beispiel 7: Plasmaclearance von spezifischen Liposomen

In diesem Beispiel wird die Plasmaclearance für 100 nm Liposomen bestimmt, die aus Distearylphosphatidylcholin (DSPC)/Cholesterin (Chol) (55 : 45 mol%; offene Kreise); DSPC/Chol/PEG&sub2;&sub0;&sub0;&sub0;-Ceramid (50 : 45 : 5 mol%; gefüllte Kreise) und DSPC/Chol/PEG&sub5;&sub0;&sub0;&sub0;-Ceramid (50 : 45 : 5 mol%; gefüllte Quadrate) hergestellt waren. Die Ergebnisse sind in Fig. 1A gezeigt. Lipidmischungen wurden in Chloroform (CHCl&sub3;) hergestellt und anschließend unter einem Stickstoffgasstrom getrocknet. Der resultierende Lipidfilm wurde hohem Vakuum während wenigstens 2 Stunden ausgesetzt vor der Hydratation mit 150 mM Natriumchlorid und 20 mM Hepes (pH 7,4) (mit Hepes gepufferte Salzlösung). Die Liposomen wurden dann durch Extrusion durch Filter mit 100 nm Porengröße hergestellt unter Verwendung eines vor der Extrusion auf 65ºC vorgeheizten Extruders. Die resultierenden Liposomen wiesen einen mittleren Durchmesser von annähernd 120 nm auf. Diese Liposomen wurden verdünnt, so daß Mäusen (weiblich CD1) eine i. v. Dosis des Lipids gegeben werden konnte, die 50 umol/kg äquivalent war in einem Injektionsvolumen von 200 ul. Zu den in Fig. 1A gezeigten verschiedenen Zeitpunkten wurden Blutproben entnommen durch Einritzen der Schwanzvene und Sammeln von 25 ul Blut in eine EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) beschichtete Kapillare. Die Lipidmenge in der resultierenden Probe wurde bestimmt durch Messung der Menge des anwesenden 3[H]-Cholesterylhexadecylethers. Dieser nicht austauschbare, nicht metabolisierbare Lipidmarker war in die Liposomen vor der Bildung des Lipidfilms eingebracht worden.

Beispiel 8: Plasmaclearance von spezifischen Liposomen

Dieses Beispiel zeigt die Plasmaclearance für 100 nm Liposomen, die aus DSPC/Chol (55 : 45 mol %; offene Kreise), Sphingomyelin/Chol (55 : 45 mol %; gefüllte Kreise) und Sphingomyelin/Chol/PEG&sub2;&sub0;&sub0;&sub0;-Ceramid (50 : 45 : 5 mol%; offene Quadrate) hergestellt waren. Die Ergebnisse sind in Fig. 1B gezeigt. Es wurden Lipidmischungen in Chloroform (CHCl&sub3;) hergestellt und anschließend unter einem Stickstoffgasstrom getrocknet. Der resultierende Lipidfilm wurde einem hohen Vakuum während wenigstens 2 Stunden ausgesetzt vor der Hydratation mit einem 300 mM Citratpuffer (pH 4,0). Die Liposomen wurden dann durch Extrusion durch Filter mit 100 nm Porengröße hergestellt unter Verwendung eines vor der Extrusion auf 65ºC vorgeheizten Extruders. Die resultierenden Bläschen wurden mit 150 mM NaCl, 20 mM Hepes, pH 7,4 verdünnt und der pH auf 7,4 durch Titration mit 500 mM Natriumphosphat eingestellt. Die Probe wurde dann auf 60ºC während 10 Minuten erhitzt. Die resultierenden Liposomen wiesen einen durchschnittlichen Durchmesser von annähernd 120 nm auf. Diese Liposomen wurden so verdünnt, daß Mäusen (weiblich BDF1) eine i. v. Dosis des Lipids gegeben werden konnte, die 20 mg/kg äquivalent war, in einem Injektionsvolumen von 200 ul. Zu den in Fig. 1B gezeigten Zeitpunkten wurden Blutproben durch Herzpunktion entnommen. Die Lipidmenge in der resultierenden Probe wurde bestimmt durch Messungen der Menge des anwesenden 3[H]-Cholesterylhexadecylethers. Dieser nicht austauschbare, nicht metabolisierbare Lipidmarker war in den Liposomen vor der Bildung des Lipidfilms eingebracht worden.

Beispiel 9: Vincristinretention

In diesem Beispiel wurde gezeigt, das die Vincristinretention durch Sphingomyelin/Chol (55 : 45 mol%) Liposomen innerhalb der Zirkulation nicht durch die Einarbeitung von PEG&sub2;&sub0;&sub0;&sub0;-Ceramid beeinträchtigt wird. Im Gegensatz dazu weisen ähnliche mit PEG&sub2;&sub0;&sub0;&sub0;-Phosphatidylethanolamin (PEG-PE) hergestellte Formulierungen eine signifikant reduzierte Arzneimittelretention auf. Die Ergebnisse wurden erhalten durch Messung sowohl des liposomalen Lipids (14[C]- Cholesterylhexadecylether) als auch des Arzneimittels (3[H]-Vincristin) im Plasma, das von BDF1 Mäusen gesammelt wurde, denen eine i. v. Injektion von liposomalem Vincristin (2 mg Arzneimittel/kg) gegeben worden war. Die Proben wurden in einem Volumen von 20 ul injiziert. Die Liposomen wurden hergestellt, wie unten beschrieben.
Das trockene Lipid wurde mit 300 mM Citratpuffer, pH 4,0 hydratisiert. Nach der Extrusion wurden die Bläschen (100 mg/ml) zu einer Vincristinlösung (Oncovin; 1 mg/ml) gegeben, um ein Arzneimittel : Lipid Gewichtsverhältnis von 0,1 : 1 zu erhalten. Der äußere pH der Liposom/Vincristin-Mischung wurde auf pH 7,0-7,2 durch Titration mit 500 mM Natriumphosphat erhöht, und sofort wurde die Probe auf 60ºC erhitzt während 10 Minuten, um die Einkapselung des Vincristins zu erreichen. Zu den in Fig. 2 gezeigten Zeitpunkten nach der i. v. Verabreichung in Mäusen wurden Blutproben durch Herzpunktion entnommen. Die Vincristinmenge und die Lipidmenge wurden durch Verwendung von geeignet markierten Markern gemessen. Das Verhältnis von Arzneimittel zu Lipid wurde dann bestimmt und als Prozentsatz des ursprünglichen Arzneimittel zu Lipid Verhältnisses aufgetragen. Das DSPC/Chol-Liposom ist durch offene Kreise, das SM/Chol-Liposom durch gefüllte Kreise dargestellt; das SM/Chol/PEG&sub2;&sub0;&sub0;&sub0;-Ceramid durch offene Quadrate; und das SM/Chol/PEG-PE durch gefüllte Quadrate.

Beispiel 10: Verschiedene PEG-Ceramid Acylkettenlängen und Wirkungen auf die Retentionzeit

Verfahren: Einhundert (100) mg des gesamten Lipids wurde in ChCl&sub3; gelöst mit 5 uCi von ¹&sup4;C-Cholesterylhexadecylether (Amersham Kundensynthese). Die Lipidpräparationen bestanden aus Ei-Sphingomyelin (SM)/Cholesterin/PE&sub2;&sub0;&sub0;&sub0;-Ceramid (SM/Chol/PEG-Ceramid; 55/40/5, mol/ mol/mol) oder aus Ei-Sphingomyelin/Cholesterin/PEG&sub2;&sub0;&sub0;&sub0;-Distearoylphosphatidylethanolamin (SM/Chol/PEG-DSPE, 55/40/5, mol/mol/mol). Die in dieser Studie verwendeten PEG&sub2;&sub0;&sub0;&sub0;-Ceramide hatten Fettamidkettenlängen von C8, C14, C20 oder C24 oder waren aus Ei-Ceramid (Ei-CER) synthetisiert. Der Großteil des CHCl&sub3; wurde unter einem Stickstoffgasstrom entfernt, dann wurde das restliche Lösemittel entfernt, indem der Lipidfilm hohem Vakuum über Nacht ausgesetzt wurde.
Die Liposomen wurden hergestellt durch Hydratation des Lipidfilms mit 1,0 ml von 0,3 M Citrat (pH 4,0) unter Verwendung von umfassender starker Verwirbelung und kurze Erhitzung auf 65ºC. (Proben dieser Suspension wurden zur Bestimmung der spezifischen Aktivität entfernt.) Die resultierende Lipidsuspension wurde Gefrier/Tau-Zyklen 5 mal zwischen -196ºC und 65ºC unterworfen. Große, einlamellare Liposomen wurden hergestellt durch Extrusionstechnologie; die Lipidsuspension wurde durch zwei übereinander angeordnete 0,1 um Filter bei 65ºC unter Verwendung eines The Extruder (Lipex Biomembranes, Vancouver, B. C.) geleitet.
Als ein getrennter Arbeitsschritt wurden 2,0 mg Vincristin (als 2,0 ml Vincristinsulfat bei 1,0 mg/ml; David Bull Laboratories, Mulgrave, Australien) durch Zugabe von 5 pCi ³H-Vincristin (Amersham) markiert und Proben für die Bestimmung der spezifischen Aktivität von Vincristin entfernt.
Für die liposomale Einkapselung von Vincristin wurden 5-6 mg jedes Lipids in ein Glasteströhrchen entnommen und markiertes Vincristin zugegeben, um ein Vincristin/Lipid Verhältnis von 0,1/1,0 (Gew./Gew.) zu erreichen. Diese Mischung wurde während 5-10 Minuten bei 65ºC äquilibriert, dann wurde die Vincristineinkapselung eingeleitet durch Zugabe von ausreichend 0,5 M Na&sub2;HPO&sub4;, um den pH der Lösung auf 7,0-7,5 zu bringen. Die Vincristinaufnahme ließ man 10 Minuten bei 65ºC fortschreiten, und die Probe wurde dann auf Raumtemperatur gekühlt und mit 150 mM NaCl, 20 mM Hepes (pH 7,5) (HBS) auf die für den in vivo Versuch erforderliche Endkonzentration verdünnt. Die Aufnahme des Vincristins in die Liposomen wurde bestimmt durch Zentrifugieren von 100 ul Liposomen auf einer 1,0 ml Minikolonne von Sephadex G-50, die in HBS voräquilibriert war. Das Eluat wurde auf das Vincristin/Lipid Verhältnis durch Flüssigkeitsszintillationszählung (LSC) untersucht.
Weiblichen BDF1 Mäusen wurde durch i. v. Schwanzveneninjektion liposomales Vincristin in einer Dosis von 20 mg Lipid/kg oder 2 mg Vincristin/kg verabreicht. 1, 4 und 24 Stunden nach der Verabreichung wurde Blut durch Herzpunktion in EDTA enthaltende Micro-Tainer Röhrchen gesammelt. Plasma wurde durch Zentrifugieren bei 2000 g während 15 Minuten erhalten, und die Aliquote wurden auf den Lipid- und Vincristingehalt durch LSC untersucht.
Alle Werte stellen die Mittelwerte (± Standardfehler) von 3 Mäu sen je Zeitpunkt, d. h. 9 Tieren/Gruppe, dar. Die Halbwertszeiten des Lipids, Vincristins und des Vincristin/Lipid Verhältnisses wurden aus der Neigung der halblogarithmischen Aufzeichnung der Konzentration gegen die Zeit erhalten. Alle r² Werte für die lineare Regression dieser Neigungen waren > 0,98. Versuche mit der C20 Kettenlänge des PEG&sub2;&sub0;&sub0;&sub0;-Ceramids wurden zweimal durchgeführt und sind getrennt dargestellt.
Ergebnisse: Die in Fig. 3 (Lipid T1/2) dargestellten Ergebnisse zeigen, daß die Halbwertszeit von SM/Cholesterin Liposomen, die 5 mol% PEG&sub2;&sub0;&sub0;&sub0;-DSPE enthalten, annähernd zweimal größer ist als die von SM/Cholesterin Liposomen, die PEG&sub2;&sub0;&sub0;&sub0;-Ceramide (PEG-Ceramid) enthalten, unabhängig von der Kettenlänge. Bei den PEG-Ceramiden war kein signifikanter Einfluß der Fettacylkettenlänge auf die Kreislauflebensdauer in diesen mit Vincristin beladenen Liposomen.
Die in Fig. 4 (Vincristin/Lipid T1/2) dargestellten Ergebnisse zeigen, daß ein signifikanter Einfluß der Acylkettenlänge auf die Vincristinretention in den Liposomen während des Kreislaufs in dem Plasma besteht. Insbesondere C20 PEG-Ceramid wurde signifikant besser zurückbehalten als beide kürzeren (C8, C14, Ei-CER und C24) Kettenlängen des PEG-Ceramids und auch besser als PEG-DSPE. Die C20 Kettenlängen des PEG-Ceramids hatten Halbwertszeiten für das Vincristin/Lipid Verhältnis von 28-30 Stunden; etwa doppelt so lang wie die für die schlechtesten Vincristin zurückbehaltenden Formulierungen beobachteten Werte von 15 Stunden (C8 PEG-Ceramid und PEG-DSPE).
Das kombinierte Ergebnis der Lebenszeit des Lipids in der Zirkulation und der Arzneimittelretention innerhalb dieser Liposomen ist die Zirkulations-Halbwertszeit des Vincristins (siehe Fig. 5). Unter den PEG-Ceramiden ergab die C20 Kettenlänge die größte Zirkulationslebenszeit für das Vincristin (9,5-10,5 Stunden T1/2 gegenüber 7-9 Stunden für die C8, C14, C24 und Ei-CER Kettenlängen). In den Proben, die PEG-DSPE enthielten, stand der kombinierte Einfluß der längeren Lebenszeit der Liposomen in der Zirkulation ( Fig. 3) im Gegensatz zu der schlechten Vincristinretention (Fig. 4), was zu einer gesamten Arzneimittelhalbwertszeit führte, die sehr ähnlich der des C20 PEG-Ceramids war.

Beispiel 11: Fusogene Liposomen

Die Fähigkeit von amphipathischem Polyethylenglycol(PEG)-Derivaten, fusogene Liposome, die ein kationisches Lipid enthalten, in vivo zu stabilisieren, wurde in dieser Studie untersucht. Eine Ge frier-Bruchfläche Elektronenmikroskopanalyse der Liposomen, die aus Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) und N,N-Dioleoyl-N,N-dimethylammoniumchlorid (DODAC) zusammengesetzt waren, zeigte, daß der Einschluß von amphipathischen PEG-Derivaten, PEG-DSPE und PEG-Ceramid (PEG-Ceramid) wirksam die Liposomaggregation in Gegenwart von Mäuseserum verhindert. Die Bioverteilung von fusogenen Liposomen, zusammengesetzt aus DOPE und DODAC, die zusätzlich ein amphipathisches Polyethylenglycol(PEG)-Derivat enthielten, wurden dann in Mäusen geprüft unter Verwendung von ³H-markiertem Cholesterylhexadecylether als einem Lipidmarker. Amphipathische PEG-Derivate umfaßten PEG-DSPE und verschiedene PEG-Ceramide (PEG-Cer) mit unterschiedlichen Acylkettenlängen im Bereich von C8 bis C24. Es wurde gezeigt, daß DOPE/DODAC-Liposomen (85 : 15, mol/mol) schnell vom Blut ausgeschieden wurden und sich ausschließlich in der Leber ansammelten. Der Einschluß von amphipathischen PEG-Derivaten in einer Menge von 5,0 mol% der Lipidmischung ergab erhöhte Liposomgehalte, die im Blut blieben, und gleichzeitig abnehmende Ansammlungen in der Leber. Unter verschiedenen amphipathischen PEG-Derivaten zeigt PEG-DSPE die höchste Aktivität in der Verlängerung der Zirkulationszeit der DOPE/DODAC-Liposomen. Die Aktivität des PEG-Ceramids ist direkt proportional zur Acylkettenlänge: je länger die Acylkette desto höher die Aktivität. Die Aktivität des PEG-Ceramids (C20), das die optimale Acylkettenlänge aufweist, hängt von seiner Konzentration in der Lipidmischung ab, wobei die maximale Zirkulationszeit bei 30 mol% der Lipidmischung erhalten wurde. Während der Einschluß von amphipathischen PEG-Derivaten in der Lipidzusammensetzung im allgemeinen eine ansteigende Zirkulationszeit von DOPE/ DODAC-Liposomen ergibt, scheint die Anwesenheit eines kationischen Lipids, DODAC, deren schnelle Ausscheidung aus dem Blut zu fördern.
Die Herstellung und Verwendungen von DODAC-Liposomen sind in der US-Patentanmeldung Nr. 08/316 399, angemeldet am 30. September 1994, offenbart, deren Lehren durch Nennung Teil der Beschreibung werden.
Fusogene Liposomen, die Doppelschichten stabilisierende Komponenten enthalten, sind in der US-Patentanmeldung Nr. 08/316 407, angemeldet am 30. September 1994, und der US-Patentanmeldung Nr. - angemeldet am 7. Juni 1995, (Anwaltsaktenzeichen Nr. 016303-001310) offenbart, deren Lehren durch Nennung Teil der Beschreibung werden.

Materialien und Verfahren

Liposomherstellung: Kleine einlamellare Liposomen, zusammengesetzt aus DOPE und DODAC, die zusätzlich amphipathische PEG-Derivate in verschiedenen Verhältnissen enthielten, wurden durch das Extrusionsverfahren hergestellt. Knapp beschrieben, wurde die lösemittelfreie Lipidmischung, die ³H-markiertes CHE als einen nicht austauschbaren und nicht metabolisierbaren Lipidmarker enthielt, mit destilliertem Wasser über Nacht hydratisiert. Die Liposomsuspension (5 mg Lipid pro ml) wurde normal bei Raumtemperatur extrudiert 10 mal durch übereinander angeordnete Nuclepore Membranen (0,1 um Porengröße) unter Verwendung einer Extrusionsvorrichtung, die von Lipex Biomembranes, Inc erhalten wurde, um Liposomen mit homogener Größenverteilung zu erhalten. Die Liposomgröße wurde durch quasielastische Lichtstreuung bestimmt unter Verwendung eines Teilchengrößeanalysators und angegeben als durchschnittlicher Durchmesser mit Standardabweichung (SD).
Studie der Bioverteilung der Liposomen: ³H-markierte Liposomen mit verschiedenen Lipidzusammensetzungen wurden i. v. in weibliche CD-1 Mäuse (8-10 Wochen alt) injiziert mit einer Dosis von 1,0 mg Lipid je Maus in 0,2 ml destilliertem Wasser. Nach spezifischen Zeitintervallen wurden die Mäuse getötet, indem sie zu viel Kohlendioxid ausgesetzt wurden, und Blut wurde durch Herzpunktion in 1,5 ml Mikrozentrifugenrohren gesammelt und zentrifugiert (12000 Upm, 2 min. 4ºC), um die Blutzellen zu pelletieren. Größere Organe einschließlich Milz, Leber, Lunge, Herz und Niere wurden gesammelt, gewogen und in destilliertem Wasser homogenisiert. Fraktionen des Plasmas und der Gewebehomogenate wurden in Glasszintillationsfläschchen gefüllt, mit Solvable (NEN) bei 50ºC gemäß den Herstelleranweisungen solubilisiert, mit Wasserstoffperoxid entfärbt und auf ³H Radioaktivität in Szintillationsfluid in einem Beckman Zähler analysiert. Die Werte wurden als Prozentsätze der gesamten injizierten Dosis von ³H-markierten Liposomen in jedem Organ angegeben. Die Liposomenmengen im Plasma wurden bestimmt durch Annahme, daß das Plasmavolumen einer Maus 5,0% des gesamten Körpergewichts ausmacht.

Ergebnisse und Diskussion

Gefrier-Bruchfläche elektronenmikroskopische Studien: Liposomen, zusammengesetzt aus DOPE/DODAC (85 : 15, mol/mol), DOPE/DODAC/PEG- Ceramid (C20) (80 : 15 : 5, mol/mol) und DOPE/DODAC/PEG-DSPE (80 : 15 : 5, mol/mol) wurden durch das Extrusionsverfahren hergestellt und hatten ähnliche durchschnittliche Durchmesser (100 nm). Elektronenmikroskopbilder der Gefrier-Bruchfläche von den drei liposomalen Formulierungen zeigten einlamellare Liposomen mit relativ engen Größenbereichen. Die Vorinkubation von DOPE/DODAC-Liposomen in 50 Mäuseserum bei 37ºC während 30 Minuten ergab jedoch deren massive Aggregation. Andererseits zeigten sowohl DOPE/DODAC/PEG-Ceramid (C20) als auch DOPE/DODAC/PEG-DSPE-Liposomen keinerlei Aggregation, wenn diese Liposomen mit Mäuseserum vorbehandelt waren. Daher zeigen diese Ergebnisse die Wirksamkeit von amphipathischen PEG-Derivaten bei der Verhinderung von seruminduzierten schnellen Aggregationen von DOPE/DODAC-Liposomen.
Bioverteilung von DOPE/DODAC-Liposomen, die amphipatische PEG-Derivate enthalten: DOPE/DODAC-Liposomen mit oder ohne amphipathische PEG-Derivate wurden hergestellt unter Einschluß von ³H-markiertem Cholesterinhexadecylether als Lipidmarker, und ihre Bioverteilung wurde in Mäusen 1 Stunde nach der Injektion untersucht. In dieser Studie untersuchte Liposomen waren zusammengesetzt aus DOPE/DODAC (85 : 15, mol/mol), DOPE/DODAC/PEG-Ceramid (80 : 15 : 5, mol/mol) und DOPE/DODAC/PEG-DSPE (80 : 15 : 5, mol/mol). Um auch die Wirkung des hydrophoben Ankers auf die Bioverteilung der Liposomen zu untersuchen, wurden verschiedene PEG-Ceramidderivate mit unterschiedlichen Acylkettenlängen verwendet. Diese liposomalen Formulierungen hatten ähnliche durchschnittliche Durchmesser im Bereich von 89 bis 103 nm. Tabelle II unten zeigt die Liposomgehalte in Blut, Milz, Leber, Lunge, Herz und Niere zusammen mit den entsprechenden Blut/Leber Verhältnissen. Bei den DOPE/DODAC-Liposomen zeigte sich, daß sie schnell vom Blut ausgeschieden werden und sich überwiegend in der Leber ansammeln mit dem Blut/Leber Verhältnis von annähernd 0,01. Der Einschluß von 5,0 mol% amphipathischen PEG-Derivaten in der Lipidzusammensetzung ergab deren erhöhte Gehalte im Blut und entsprechende herabgesetzte Ansammlung in der Leber mit unterschiedlichem Ausmaß. DOPE/DODAC/PEG-DSPE-Liposomen zeigten den höchsten Gehalt im Blut (etwa 59%) und die niedrigste Ansammlung in der Leber (etwa 35%) 1 Stunde nach der Injektion mit dem Blut/Leber Verhältnis von annähernd 1,7. Unter verschiedenen PEG-Ceramidderivaten mit unterschiedlichen Acylkettenlängen zeigten PEG-Ceramid (C20) enthaltende Liposomen den höchsten Gehalt im Blut (etwa 30%) mit dem Blut/Leber Verhältnis von annähernd 0,58, während PEG-Ceramid (C8) enthaltende Liposomen einen niedrigeren Gehalt im Blut (etwa 6%) mit dem Blut/Leber Verhältnis von annähernd 0,1 zeigten. Es zeigte sich, daß unter den verschiedenen PEG-Ceramidderivaten die Aktivität zur Erhöhung des Gehalts der Liposomen im Blut direkt propor- Tabelle II: Wirkung von amphipathischen PEG-Derivaten auf die Bioverteilung von DOPE/DODAC Liposomen
³H-markierte Liposomen, zusammengesetzt aus DOPE/DODAG (75:15, mol/mol ein angegebenes PEG-Derivat mit 5,0 mol% der Lipidmischung enthielten, Mäuse injiziert. Die Bioverteilung wurde 1 h nach der Injektion bestim als Prozentsatz der injizierten Dosis der Liposomen mit SD (n=3).
tional zur Acylkettenlänge des Ceramids ist, je länger die Acylkettenlänge, desto größer die Aktivität. Es zeigte sich auch, daß das optimale Derivat zur Erhöhung des Liposomengehalts im Blut PEG-Ceramid (C20) ist.
Optimierungen von DOPE/DOPAC-Liposomen für verlängerte Kreislaufzeiten: Die Wirkung von ansteigenden Konzentrationen des PEG-Ceramids (C20) in der Lipidzusammensetzung auf die Bioverteilung der DOPE/DODAC-Liposomen wurde untersucht. PEG-Ceramid (C20) wurde in DOPE/DODAC-Liposomen eingeschlossen mit ansteigenden Konzentrationen (0-30 mol%) in der Lipidzusammensetzung, während die Konzentration von DODAC auf 15 mol% der Lipidmischung gehalten wurde. Die Liposomen wurden durch das Extrusionsverfahren hergestellt, und sie hatten ähnlich durchschnittliche Durchmesser von 102 nm bis 114 nm. Die Liposomen wurden i. v. in Mäuse injiziert, und die Bioverteilung wurde 1 Stunde nach der Injektion untersucht. Fig. 6 zeigt den Liposomgehalt in dem Blut und in der Leber 1 Stunde nach den Injektionen als eine Funktion der PEG-Ceramid (C20) Konzentration. Die Erhöhung der Konzentration des PEG-Ceramids in der Lipidzusammensetzung führt eindeutig zu einem fortschreitenden Anstieg der Liposomgehalte im Blut, verbunden mit abnehmender Ansammlung in der Leber. Der höchste Gehalt im Blut (etwa 84% 1 Stunde nach der Injektion) wurde für DOPE/DODAC/PEG-Ceramid (C20) (55 : 15 : 30, mol/mol) erhalten mit dem Blut/Leber Verhältnis von etwa 6,5.
Die Wirkung der ansteigenden Konzentrationen des DODAC auf die Bioverteilung der DOPE/DODAC-Liposomen wurde auch untersucht. DOPE/ DODAC-Liposomen, die entweder 10 mol% oder 30 mol% PEG-Ceramid (C20) und verschiedene Konzentrationen (15, 30, 50 mol%) enthielten, wurden durch das Extrusionsverfahren hergestellt und hatten ähnliche durchschnittliche Durchmesser im Bereich von 103 bis 114 nm. Die Bioverteilung wurde 1 Stunde nach den Injektionen untersucht und ausgedrückt als Prozentsätze der Liposomen in dem Blut als eine Funktion der DODAC Konzentration (Fig. 7). Wie in Fig. 7 gezeigt, führten ansteigende DODAC Konzentrationen in der Lipidzusammensetzung zu abnehmenden Gehalten im Blut für beide liposomalen Formulierungen. Daher führt die Anwesenheit eines kationischen Lipids, DODAC, in der Lipidzusammensetzung zu raschen Ausscheidungen aus dem Blut. In Fig. 7 ist auch gezeigt, daß solch einer DODAC Wirkung durch eine Erhöhung der Konzentration des PEG-Ceramids (C20) in der Lipidzusammensetzung entgegengewirkt werden kann.
Fig. 8 zeigt zeitabhängige Ausscheidungen der DOPE/DODAC-Lipo somen mit oder ohne PEG-Ceramid aus dem Blut. Nur ein kleiner Teil der injizierten DOPE/DODAC-Liposomen blieb im Blut, während ein Anstieg der Konzentration des PEG-Ceramids (C20) in der Lipidzusammensetzung zu verlängerten Zirkulationszeiten in dem Blut führte. Geschätzte Halbwertszeiten in der α-Phase für DOPE/DODAC/PEG-Ceramid (C20) (75 : 15 : 10, mol/mol) und DOPE/DODAC/PEG-Ceramid (C20) (55 : 15 : 30, mol/mol) betrugen 1 Stunde bzw. 5 Stunden.
Schlußfolgerungen: Die obigen Studien zeigen, daß es verschiedene Niveaus gibt, bei denen die Bioverteilung von fusogenen Liposomen, die ein kationisches Lipid enthalten, durch Einschluß von amphipathischen PEG-Derivaten gesteuert werden kann. Die Werte in Tabelle II zeigen, daß der hydrophobe Anker der amphipathischen PEG-Derivate eine wichtige Rolle bei der Festlegung der Bioverteilung von DOPE/DODAC-Liposomen hat. Studien unter Verwendung verschiedener PEG-Ceramidderivate mit unterschiedlichen Acylkettenlängen zeigten, je länger die Acylkettenlänge des PEG-Ceramids, desto größer die Aktivität bei der Verlängerung der Zirkulationszeit der DOPE/DODAC- Liposomen. Diese Ergebnisse stimmen mit der Geschwindigkeit überein, mit der amphipathische PEG-Derivate von der Liposommembran dissoziieren, wobei sie direkt proportional zu der Größe des hydrophoben Ankers ist. Entsprechend können PEG-Ceramidderivate mit einer längeren Acylkette stärkere Wechselwirkungen mit anderen Acylketten in der Liposommembran haben und zeigen eine herabgesetzte Dissoziationsgeschwindigkeit von der Liposommembran, was zu einer Stabilisierung der DOPE/DODAC-Liposomen für eine längere Zeitspanne und daher deren verlängerter Zirkulationszeit in dem Blut führt.
Zusätzlich zu dem hydrophoben Anker der amphipatischen PEG-Derivate kann auch die Konzentration der amphipathischen PEG-Derivate in der Lipidmembran verwendet werden, um das in vivo Verhalten der DOPE/DODAC-Liposomen zu steuern. Die Werte in Fig. 6 zeigen, daß die ansteigende Konzentration des PEG-Ceramids (C20) in der Lipidzusammensetzung zu erhöhten Liposomgehalten in dem Blut führt. Für die optimale Konzentration des PEG-Ceramids (C20) in der Lipidzusammensetzung wurde gefunden, daß sie bei 30 mol% der Lipidmischung liegt. Es zeigte sich, daß die Zirkulationslaufzeit der DOPE/DODAC/ PEG-Ceramid(C20)-Liposomen bestimmt wird durch die relativen Konzentrationen der zwei Lipidzusammensetzungen, DODAC und PEG-Ceramid, die entgegengesetzte Wirkungen auf die Liposombioverteilung haben. Während amphipathische PEG-Derivate die Aktivität bei der Verlängerung der Zirkulationszeit der Liposomen im Blut zeigen, zeigt ein kationisches Lipid, DODAC, die Aktivität, die Liposomausscheidung aus dem Blut zu erleichtern. Für die maximale Zirkulationszeit in dem Blut sollte daher eine geeignete Konzentration der amphipathischen PEG-Derivate und eine minimale Konzentration von DODAC verwendet werden. Es sollte jedoch angemerkt werden, daß eine optimale Liposomformulierung für die verlängerte Zirkulationszeit in dem Blut nicht notwendigerweise diejenige ist, die für eine beabsichtigte Anwendung für die Freisetzung von bestimmten therapeutischen Agentien ist. Beides, pharmakokinetische und pharmakodynamische Aspekte von fusogenen Liposomen sollten für verschiedene Anwendungen unter Verwendung unterschiedlicher therapeutischer Agentien untersucht werden.

Beispiel 12: Dieses Beispiel zeigt die Hinderung der Fusion von Transmembranträgersystem (TCS) durch PEG&sub2;&sub0;&sub0;&sub0;-Ceramid (C14 : 0) und PEG&sub2;&sub0;&sub0;&sub0;-DMPE.

TCS, zusammengesetzt aus 1,2-Dioleoyl-3-phosphatidylethanolamin (DOPE), N,N-Dioleoyl-N,N-dimethylammoniumchlorid (DODAC), den Fluorophoren N-(7-Nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)-1,2-dioleoyl-sn- phosphatidylethanolamin (NBD-PE) und N-(Lissamin-Rhodamin B-sulfonyl)-1,2-dioleoyl-snphosphatidylethanolamin (Rh-PE) und entweder PEG&sub2;&sub0;&sub0;&sub0;-Ceramid (C14: 0) oder PEG&sub2;&sub0;&sub0;&sub0;-DMPE wurden durch Extrusion durch Polycarbonatfilter mit 100 nm Durchmesser hergestellt (Hope M. J. et al., Biochim. Biophys. Acta 812, 55-65 (1985)). TCS enthielt 0,5 mol% NBD-PE und 0,5 mol% Rh-PE und entweder DOPE : DODAC : PEG&sub2;&sub0;&sub0;&sub0;-DMPE (80 : 15 : 5 mol%) oder DOPE : DODAC : PEG&sub2;&sub0;&sub0;&sub0;-Ceramid (C14: 0) (80 : 15 : 5 mol%). Die fluoreszierend markierten Liposomen wurden bei 37ºC in 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,4 (HBS) mit einem dreifachen Überschuß der aus DOPE : POPS (85 : 15 mol%) zusammengesetzten Liposomen inkubiert. POPS Liposomen wurden mit 10-facher Konzentration der fluoreszierend markierten Liposomen zugegeben, und das Lipidmischen wurde nach dem Verfahren von Struck D. K. et al. (Biochemistry 20, 4093-4099 (1981)) untersucht. Die verwendete Anregungswellenlänge war 465 nm, und ein Emissionsfilter angeordnet bei 530 nm minimierte die Intensität infolge gestreuten Lichts. Die Raten und Ausmaße der Fusion wurden durch Überwachung des Anstiegs in der NBD Fluoreszenzintensität bei einer Wellenlänge von 535 nm über die Zeit verfolgt. Die prozentuale Maximalfusion wurde bestimmt aus dem Verhältnis Fusion (% max) (t) = (F(t)-Fo)/F∞ - Fo), worin Fo die anfängliche NBD Fluoreszenzintensität zur Zeit null ist, F(t) die Intensität zur Zeit t ist und F∞ die maximal erreichbare Fluoreszenz intensität ist unter den Bedingungen des vollständigen Lipidmischens der fluoreszierend markierten und der DOPC : POPS-Liposomen ist (Bailey A. L. et al., Biochemistry 33, 12573-12580 (1994)). Fig. 9 zeigt ein beträchtliches Mischen von DOPE/DODAC/PEG&sub2;&sub0;&sub0;&sub0;-Ceramid (C14 : 0) mit DOPC : POPS verglichen zu dem von DOPE/DODAC/PEG&sub2;&sub0;&sub0;&sub0;- DMPE mit DOPC : POPS, was nahelegt, daß das PEG&sub2;&sub0;&sub0;&sub0;-DMPE nur minimal von dem TCS entfernt ist. Dieses Ergebnis ist zurückzuführen auf die elektrostatische Wechselwirkung zwischen dem anionischen PEG&sub2;&sub0;&sub0;&sub0;-DMPE und dem kationischen DODAC, die das PEG&sub2;&sub0;&sub0;&sub0;-DMPE wirksam auf dem Trägersystem zurückhält und daher die sterische Stabilisierungswirkung aufrechterhält, wodurch die Fusion mit den Akzeptorbläschen verhindert wird. Die neutralen PEG-modifizierten Ceramidlipide haben solch eine elektrostatische Wechselwirkung mit DODAC nicht, und daher können solche Lipide aus dem System herauswechseln, die wiederum mit dem anionischen Target (DOPE-POPS) eine Fusion eingehen.

Claims

1. Lipidverbindung der Formel

Formel I

in der

R¹, R² und R³ unabhängig voneinander Wasserstoff, C&sub1;-C&sub6; Alkyl, Acyl oder Aryl bedeuten;

R&sup4; Wasserstoff, C&sub1;-C&sub3;&sub0; Alkyl, C&sub2;-C&sub3;&sub0; Alkenyl, C&sub2;-C&sub3;&sub0; Alkinyl oder Aryl ist;

R&sup5; Wasserstoff, Alkyl, Acyl, Aryl oder PEG ist;

X¹ -O-, -S- oder NR&sup6;- bedeutet, worin R&sup6; Wasserstoff, C&sub1;-C&sub6; Alkyl, Acyl oder Aryl bedeutet, oder wenn R&sup5; PEG ist und b 1 ist, X¹ auch -Y¹-Alk-Y² bedeutet;

Y -NR&sup7;- ist, worin R&sup7; Wasserstoff, C&sub1;-C&sub6; Alkyl, Acyl oder Aryl bedeutet, oder Y -O-, -S- oder -Y¹Alk-Y²- ist;

worin Y¹ und Y² unabhängig voneinander Amino, Amido, Carboxyl, Carbamat, Carbonyl, Carbonat, Harnstoff oder Phoshoro und Alk C&sub1;-C&sub6; Alkylen bedeuten;

PEG ein Polyethylenglykol mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von etwa 550 bis etwa 8500 Dalton ist, gegebenenfalls substituiert mit C&sub1;-C&sub3; Alkyl, Alkoxy, Acyl oder Aryl;

worin a 0 oder 1 ist; und b 1 ist, außer wenn R&sup5; PEG ist, wobei dann b 0 oder 1 ist.

2. Lipid nach Anspruch 1, worin R¹, R², R³ und R&sup5; Wasserstoff bedeuten; R&sup4; Alkyl ist; X¹ 0 ist; Y Succinat oder -NH- ist; und PEG ein durchschnittliches Molekulargewicht von etwa 2000 oder etwa 5000 Dalton hat und mit Methyl an der endständigen Hydroxylstellung substituiert ist.

3. Lipid nach Anspruch 1, worin R¹, R², R³ und R&sup5; Wasserstoff bedeuten; R&sup4; C&sub7;-C&sub2;&sub3; Alkyl ist; X¹ 0 ist; Y Succinat ist; und PEG ein durchschnittliches Molekulargewicht von etwa 2000 hat und mit Monomethoxy substituiert ist, wobei R&sup4; vorzugsweise C&sub1;&sub3;-C&sub1;&sub9; Alkyl und R&sup4; insbesondere C&sub1;&sub9; Alkyl oder C&sub1;&sub3; Alkyl ist.

4. Liposom, das das Lipid nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3 enthält.

5. Liposom nach Anspruch 4, das zusätzlich ein oder mehrere bioaktive Agenden enthält.

6. Liposom nach Anspruch 5, bei dem das bioaktive Agens oder die bioaktiven Agentien in dem Liposom eingekapselt ist bzw. sind unter Bildung eines Liposom-biaktiven Komplexes.

7. Liposom nach Anspruch 6, bei dem das bioaktive Agens ausgewählt ist aus der Gruppe der Antitumoragentien, Antibiotika, Immunmodulatoren, entzündungshemmenden Medikamenten und Medikamenten, die auf das zentrale Nervensystem wirken, und/ oder bei dem das bioaktive Agens ein Protein oder ein Peptid ist und/oder bei dem das bioaktive Agens ein Impfstoff ist unter Bildung eines mit dem Liposom beschichteten Impfstoffs und/oder bei dem das bioaktive Agens ein Antigen ist unter Bildung eines mit dem Liposom eingekapselten Antigens.

8. Liposom nach einem der Ansprüche 4 bis 6, das eine pharmazeutische Formulierung bildet, wenn es mit einem physiologisch verträglichen Adjuvans dafür verwendet wird.

9. Liposom nach Anspruch 8, bei dem das bioaktive Agens Vincristin ist.

10. Kit, geeignet für die Herstellung von markierten Liposomen, das ein Behältnis mit wenigstens zwei Abteilungen aufweist, wobei die erste Abteilung Materialien zur Herstellung einer Markierung enthält und die zweite Abteilung das Liposom nach einem der Ansprüche 5 bis 9 enthält.

11. Lipid nach Anspruch 1 in Form eines Lipidkomplexes.

12. Liposom nach Anspruch 5, das ein Genkonstrukt enthält.

13. Liposom nach Anspruch 5, das ein Oligonucleotid enthält.

14. Liposom nach Anspruch 5, das zusätzlich DOPE und DODAC enthält.

15. Liposom nach Anspruch 5. in dem das Molprozentverhältnis des Lipids etwa 0,01 bis etwa 60 ist.