DE69432417T2

DE69432417T2 - Differentiell exprimierte leishmania gene und proteinen

Info

Publication number: DE69432417T2
Application number: DE69432417T
Authority: DE
Inventors: Gregory Matlashewski; Hugues Charest
Original assignee: McGill University
Current assignee: McGill University
Priority date: 1993-09-03
Filing date: 1994-09-01
Publication date: 2004-02-12
Anticipated expiration: 2014-09-02
Also published as: US5733778A; US5827671A; ES2198420T3; EP0716697B1; AU7529194A; US5780591A; EP0716697A1; PT716697E; JPH09502091A; DE69432417D1; WO1995006729A1; US6133017A; ATE236252T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die molekulare Klonierung von Leishmania-Genen, und insbesondere die Klonierung von Amastigot-differentiell exprimierten Genen aus Leishmania donovani.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Leishmania-Prozotoen sind die Verursacher der menschlichen Leishmaniase, die ein Spektrum von Erkrankungen umfasst, das von selbstheilenden Hautulcera bis zu tödlichen viszeralen Entzündungen reicht. Die menschliche Leishmaniase wird durch wenigstens 13 verschiedene Arten und Unterarten von Parasiten des Stammes Leishmania verursacht. Etwa 80 Länder haben über Leishmaniase berichtet und jedes Jahr treten wahrscheinlich etwa 400000 neue Fälle auf. Vor kurzem gab die Weltgesundheitsorganisation an, dass 12 Millionen Menschen infiziert sind (Literaturstelle 1 – eine Liste aller Literaturstellen erscheint am Ende der Offenbarung).
L. donovani verursacht viszerale Leishmaniase, auch als Eingeweide-Leishmaniase (kala-azar) bekannt. L. brasiliensis verursacht mukokutane Leishmaniase (Haut-Schleimhaut-Leishmaniase) und L. major verursacht kutane Leishmaniase. Die unbehandelte Eingeweide-Leishmaniase ist im allgemeinen tödlich und die mukokutane Leishmaniase führt zu Verstümmelungen durch Zerstörung der Nasen-Ohren-Rachen-Höhle und in manchen Fällen zum Tod.
Des weiteren ist in Gebieten hoher Infektion eine hohe Gesundheitsgefährdung bei der Sammlung von Blut für Transfusionszwecke geschaffen worden. Da Blut ein Träger von Parasiten ist, kann Blut von infizierten Individuen unerkannt in ein gesundes Individuum übertragen werden.
Die Leishmania-Protozoen liegen als extrazelluläre Geißel-Promastigoten in dem Verdauungstrakt der Sandfliege in freilebendem Zustand vor, und werden auf den Säugerwirt durch den Biss des Insektenvektors übertragen. Einmal eingeführt, werden die Promastigoten durch Makrophagen aufgenommen und differenzieren rasch in unbegeißelte Amastigoten und beginnen damit, sich in dem phagolysosomalen Kompartiment zu multiplizieren. Sowie die infizierten Zellen reißen, infizieren die Amastigoten nacheinander weitere Makrophagen, was zur Ausbildung der unterschiedlichen Sym ptome führt, die mit Leishmaniase in Verbindung stehen (Literaturstellen 1 und 2). Auf diese Weise ist es die Amastigoten-Form des Parasiten, die für die Pathologie in Menschen verantwortlich ist.
Während dem Verweilen im Mitteldarm des Insekts erlangen die neu transformierten Promastigoten, die funktionell nicht virulent sind, progressiv die Infektionsfähigkeit und wandern in die Mundbereiche (Literaturstelle 3). Dieser Vorgang, der als Metacyclogenese bezeichnet wird, und der nur bei Promastigoten auftritt, ist zeitgleich mit der differentiellen Expression von wichtigen Oberflächen-Glycokonjugaten, die die Wanderung der Promastigoten in den Verdauungstrakt vermitteln und den Organismus auf die Serumumgebung vorbereiten (Literaturstellen 4 und 5). Im Vergleich ist die Cytodifferenzierung von Promastigot zu Amastigot eine tiefgreifende morphologische und physiologische Transformation. Während der Differenzierung von Promastigot zu Amastigot verliert der Parasit seine Geißel, wird runder, ändert seinen Glycokonjugat-Überzug (Literaturstellen 6, 7 und 8) und exprimiert ein Set von metabolischen Enzymen, die bei niedrigem pH optimal aktiv sind. Das Überleben des Parasiten in dem Makrophagen-Phagolysosom steht in Verbindung mit seiner Fähigkeit, viele Effektorfunktionen und zusätzliche Funktionen der Wirtszelle herunterzuregulieren, einschließlich dem Sauerstoffmetabolit-vermittelten Töten und der Fähigkeit des Makrophagen, als eine effziente Antigen-präsentierende Zelle zu wirken (beschrieben in z. B. Literaturstelle 9).
Die Leishmaniase stellt daher eine schwere Erkrankung dar und es sind verschiedene Arten von Impfungen gegen die Erkrankung entwickelt worden, einschließlich lebende Parasiten, gefrorene Promastigoten aus Kulturen; ultraschallbehandelte Promastigoten; gammabestrahlte lebende Promastigoten, und formalin-getötete Promastigoten, die mit Glucan behandelt worden waren (beschrieben in z. B. Literaturstelle 10). Allerdings hat keiner dieser Ansätze zu befriedigenden Ergebnissen geführt.
Die Promastigot-Amastigot-Differenzierung ist wichtig für die Etablierung der Krankheit. Es wäre wünschenswert, Gene und Genprodukte zu identifizieren, die differentiell exprimiert werden, wenn die Amastigoten in Makrophagen vorliegen.
Joshi, et al. beschreiben L. donovani-Gene, die ungefähr zweimal so hoch in in vitro erzeugten und im Amastigoten-Stadium beibehaltenen "Amastigoten" im Vergleich zu Promastigoten exprimiert werden (Literaturstelle 11).
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Bereitstellung von einem Leishmania-Protein, das in dem Amastigot-Stadium differentiell exprimiert wird, wenn der Leishmania-Organismus innerhalb der Makrophagen vorliegt, und Gene; die für das differentiell exprimierte Protein codieren. Das Amastigot-differentiell exprimierte Gen und Protein sind für die Herstellung von Impfstoffen gegen Erkrankungen, die durch Leishmania verursacht werden, für die Diagnose von Infektionen durch Leishmania und als Mittel für die Entwicklung von immunologischen Reagenzien und die Bildung von abgeschwächten Varianten von Leishmania geeignet.
Die vorliegende Erfindung stellt nun ein isoliertes und gereinigtes DNS-Fragment bereit:

a) mit der Nukleotid-Sequenz:
(SEQ ID NR: 1) oder ihr komplementärer Strang, oder ein DNS-Molekül, das für ein differentiell exprimiertes Gen eines Leishmania-Organismus codiert, der damit unter stringenten Bedingungen hybridisiert: oder
b) mit der Nukleotid-Sequenz:
(SEQ ID NR: 2) oder ihr komplentärer Strang, oder ein DNS-Molekül, das für ein differentiell exprimiertes Gen eines Leishmania-Organismus codiert, der damit unter stringenten Bedingungen hybridisiert; oder
c) codierend die folgende Aminosäuresequenz:

(SEQ ID NR: 3) oder ihr komplementärer Strang, oder ein DNS-Molekül, das für ein differentiell exprimiertes Gen eines Leishmania-Organismus codiert, der damit unter stringenten Bedingungen hybridisiert.

Es konnte festgestellt werden, dass es sich bei dem mit diesem Protein in Beziehung stehendem Gen um ein Virulenz-Gen handelt, das für die Beibehaltung der Infektion durch die Amastigot-Form des Leishmania-Organismus erforderlich ist und das in einer zehnfach erhöhten Konzentration exprimiert wird, wenn die Amastigot-Form des Organismus innerhalb eines Makrophags vorliegt.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird das differentiell exprimierte Virulenz-Gen funktionell unfähig gemacht, z. B. durch Deletion oder Mutagenese, wie z. B. Insertions-Mutagenese, um einen abgeschwächten Leishmania-Organismus herzustellen, der z. B. als lebender Impfstoff verwendet werden kann. Geeigneterweise umfassen Leishmania-Stämme, aus denen differentiell exprimierte Gene isoliert werden können, Leishmania donovani.
Weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung beinhalten das Protein, das durch das differentiell exprimierte Gen codiert wird, und die Verwendung des Proteins in Impfung und Diagnose. Weitere Aspekte der Erfindung umfassen einen abgeschwächten Leishmania-Stamm, in dem das Virulenz-Gen unfähig gemacht worden ist, und einen Impfstoff, der dieses umfasst.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt eine schematische Darstellung der Konstruktion der Amastigot-cDNS-Bibliothek und des differentiellen Screenens mit Amastigot- und Promastigot-spezifischen cDNS-Sonden. Ein Beispiel für einen Amastigot-spezifischen cDNS-Klon wird durch einen Pfeil auf dem Kolonie-Hybridisierungs-Autoradiogramm aufgezeigt.
2 zeigt ein Restriktionsenzym und eine Größenanalyse von Leishmania donovani Amastigot-spezifischen cDNS-Klonen.
3 zeigt eine Southern-Blot-Analyse von Leishmania donovani Amastigot-spezifischen cDNS-Klonen.
4 zeigt eine Northern-Blot-Analyse, um zu beweisen, dass A2-spezifische Transkripte in Amastigot-infizierten Makrophagen vorliegen, aber nicht Promastigoten.
5 zeigt eine Southern-Blot-Analyse, um zu beweisen, dass A2-Transkripte durch eine Multigenfamilie codiert werden.
6 zeigt eine Restriktionsmappe von dem Plasmid pGECO 90, das das L.-donovani A2-Gen enthält.
7 zeigt eine Restriktionsmappe von einem genomischen Klon des A2-Gens und dessen Beziehung zu A2-verwandten cDNS.
8 zeigt die vollständige Nukleotidsequenz (SEQ ID NR: 1) und offenes Leseraster II (open reading frame II) (SEQ ID NR: 2) und die entsprechende abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NR: 3) des Leishmania donovani A2-Gens.
9 zeigt die Homologie zwischen dem Leishmania donovani A2-Protein (SEQ ID NR: 3) und dem Plasmodium falciparum S-Antigen (SEQ ID NR: 4) innerhalb der wiederholten Untereinheiten dieser Proteine.
10 zeigt die Konstruktion von einem Plasmid pET 16b/ORF II* für die Expression des A2-Proteins.
11 zeigt das Vorliegen von Antikörpern gegen A2-Fusionsprotein in Eingeweide- Leishmania-Immunserum durch Immunpräzipitation.
12 zeigt die spezifische Erkennung von dem A2-Fusionsprotein durch Eingeweide-Leishmaniase mittels Western-Blot-Analyse.
13 zeigt die Ergebnisse einer Southern-Blot-Analyse der aufgetrennten Chromosomen von unterschiedlichen Spezies und Subspezies von Leishmania.
ALLGEMEINE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Unter Bezugnahme auf 1 wird ein Verfahren dargestellt, dass für die Isolierung von einem Leishmania-Gen eingesetzt wurde, welches während dem Amastigot-Stadium in dessen Lebenszyklus differentiell exprimiert wurde. Das Verfahren umfasst die Schritte von (a) Konstruieren einer cDNS-Bibliothek aus dem Leishmania-Organismus in dem Amastigot-Stadium in dessen Lebenszyklus; (b) Konstruieren einer ersten Mischung von cDNS-Sonden, die spezifisch für das Amastigot-Stadium in dem Lebenszyklus sind; (c) Konstruieren einer zweiten Mischung von cDNS-Sonden, die spezifisch für das Promastigot-Stadium in dem Lebenszyklus sind; (d) separates Sondieren der cDNS-Bibliothek mit den Amastigot- und den Promastigot-spezifischen cDNS-Sonden, um cDNS-Klone zu identifizieren, die durch die Amastigot-Mischung von cDNS-Sonden, aber nicht durch die Promastigot-Mischung von cDNS-Sonden erkannt werden; und (e) Isolieren der cDNS-Klone, die in Schritt (d) identifiziert wurden.
Die durch das vorstehend beschriebene Verfahren identifizierten Amastigot-spezifischen cDNS-Klone können zusätzlich durch Restriktionsenzym-Analyse und ihre Verwandtschaft, die durch Southern-Nybridisierungs-Studien bestimmt wird, charakterisiert werden. Um zu bestimmen, ob die nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren identifizierten cDNS-Klone Amastigot-spezifische Klone darstellen, die in einer höheren Konzentration exprimiert werden (mehr als zehnmal höher), wenn die Amastigot-Form des Leishmania-Organismus innerhalb der Makrophagen vorliegt, wurden die Makropagen mit Amastigoten infiziert und die differentiell exprimierten Gentranskripte wurden mittels Northern-Blot-Analyse detektiert. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das differentiell exprimierte Leishmania-Gen das L. donovani-Gen, das in einer erhöhten Konzentration exprimiert wird, wenn die Amastigot-Form des Leishmania-Organismus innerhalb eines Makrophagen vorliegt. Die intrazelluläre Umgebung von dem Makrophagen weist einen sauren pH von z. B. etwa 4,5 auf. Die differentiell exprimierten Gene umfassen jene, die Sequenzen wie z. B. die in 8 (SEQ ID NR: 1) dargestellte DNS-Sequenz oder deren komplementärer Strang, und die DNS-Sequenzen, die unter stringenten Bedingungen an diese DNS-Sequenzen hybridisieren, aufweisen. Solche differentiell exprimierten Gensequenzen umfassen das A2-Gen von L. donovani, das die in 8 dargestellte DNS-Sequenz aufweist, und die Erfindung umfasst einen cDNS-Klon, der für das A2-Gen codiert, in 8 dargestellt, wobei der Klon in der Form eines Plasmids vorlie gen kann, insbesondere dasjenige, das als pGECO 90 bezeichnet wird (6), das die ATCC-Zugangsnummer ATCC 75510 hat.
Die differentiell exprimierten Gene können Proteine codieren, wie z. B. das 22 kD A2-Protein (SEQ ID NR: 3), das durch das längste offene Leseraster (ORF II) des A2-Gens codiert wird. Der Großteil des vorhergesagten A2-Proteins ist aus einer repetitiven Sequenz zusammengesetzt, die aus einer Strecke von zehn Aminosäuren besteht, die 19 mal wiederholt wird (8). Da jede Einheit dieser Wiederholung zwei Serine, zwei Valine, zwei Leucine und zwei Proline enthält, die voneinander durch fünf Reste getrennt sind, kann die wiederholte Region auch als eine Strecke von fünf Aminosäuren verstanden werden, die 38 mal wiederholt wird. Die Aminosäuresequenz von dem A2-Protein hat eine Homologie mit einem S-Antigen von Plasmodium falciparum (SEQ ID NR: 4), wie in 9 gezeigt. Wie auch das L. donovani-A2-Protein ist auch der Carboxy-terminale Teil des S-Antigens von P. falciparum vietnamesisches Isolat VI aus einer Strecke von elf Aminosäuren zusammengesetzt, die 19 mal wiederholt sind; die wiederholten Einheiten beider Proteine sind zu 50% identisch und zu 80% homolog.
Lebenszyklus-Stadium-spezifische Gene von Leishmania können gemäß der vorliegenden Erfindung isoliert werden. Manche dieser Gene sind für den Übergang zwischen den Lebenszyklus-Stadien erforderlich und umfassen Virulenz-Gene des Leishmania-Parasiten, wie z. B. Virulenz-Gene, die für die Beibehaltung der Infektion durch die Amastigot-Form des Leishmania-Organismus erforderlich sind. Diese Virulenz-Gene können funktionell unfähig gemacht werden, z. B. durch Deletion oder Mutation, einschließlich Insertions-Mutagenese und des weiteren kann das Wildtyp-Leishmania-Gen durch das funktionell unfähig gemachte Gen ersetzt werden. Die Virulenz-Gene können funktionell unfähig gemacht werden z. B. durch Ersetzen des A2-Gens durch ein selektierbares Antibiotikum-Resistenzgen mittels homologer Rekombination gefolgt von einer Transformation des Leishmania-Organismus mit einem DNS-Fragment, das das Antibiotikum-Resistenzgen enthält, das von 5'- und 3'-nichtcodierenden DNS-Sequenzen flankiert ist. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um abgeschwächte Varianten von Leishmania zu erhalten, und die verbleibende Pathogenizität der abgeschwächten Variante kann in Mäusen, Hamstern und Schweinen bestimmt werden. Es ist wahrscheinlich, dass die Deletion von Genen, die selektiv in der menschlichen Wirtsumgebung exprimiert werden (was auftritt, wenn der Leishmania-Organismus innerhalb der Makrophagenzelle ist) einen abgeschwächten Stamm ergibt, der nicht in Menschen überleben kann, der aber eine schützende Immunreaktion auslöst. Die abgeschwächten Stämme von Leishmania wären als leben de Impfstoffe gegen die durch Leishmania verursachten Erkrankungen geeignet und solche abgeschwächten Stämme bilden einen Aspekt der vorliegenden Erfindung.
Die differentiell exprimierten Gene und Proteine von Leishmania, welche in den in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen angegebenen Ausführungsformen dargestellt sind, sind vorteilhaft als:

– Antigene zur Impfung gegen die durch Leishmania verusachten Erkrankungen,
– Diagnostische Reagenzien einschließlich Hybridisierungssonden, Antigene und Mittel zur Herstellung von spezifischen Antiseren für (z. B.) die Detektion einer Infektion durch Leishmania.
– Zielgene (target genes) für das funktionelle Unfähigmachen für die Generation von abgeschwächten Leishmania-Varianten.

Impfstoffe, die eine wirksame Menge von dem durch differentiell exprimierte Gene codierten Protein oder von einem abgeschwächten Leishmania-Stamm und einem physiologisch verträglichen Träger dafür enthalten, können ein Adjuvanz verwenden, nachdem der Träger und das Protein dem Immunsystem des Wirtes in Kombination mit einem ISCOM oder einem Liposom präsentiert werden können. Der Impfstoff kann so formuliert werden, dass er dem Wirt in einer initiirbaren Form, intranasal oder oral verabreicht werden kann, um den Wirt gegen die Krankheit zu immunisieren.
BIOLOGISCHE HINTERLEGUNGEN
Der in der vorliegenden Beschreibung beschriebene und angegebene Plasmid pGECO 90 wurde bei dem "American Type Culture Collection (ATCC)", das in Rockville, Maryland, USA liegt, nach dem Budapester Vertrag am 28. Juli 1993 hinterlegt und zwar vor der Einreichung dieser Anmeldung, und ihm wurde die ATCC-Zugangsnummer 75510 verliehen. Ein Diagramm dieses Plasmids ist in 6 angegeben. Das Plasmid enthält das A2-Gen von L. donovani, das in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen angegeben ist. Die in der vorliegenden Anmeldung beschriebene und beanspruchte Erfindung soll durch das hinterlegte Material nicht in ihrem Schutzbereich beschränkt werden, da die hinterlegte Ausführungsform nur als eine Darstellung der Erfindung dienen soll.
BEISPIELE
Die vorstehende Offenbarung beschreibt allgemein die vorliegende Erfindung. Ein umfassenderes Verständnis kann durch die folgenden spezifischen Beispiele erhalten werden. Diese Beispiele sind nur zum Zwecke der Darstellung beschrieben und sollen nicht den Schutzbereich der Erfindung beschränken. Änderungen der Form und eine Substitution von Äquivalenten können erwogen werden, wenn dies durch die Umstände angeregt wird oder sinnvoll ist. Obwohl in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen spezielle Ausdrücke verwendet worden sind, sind diese Ausdrücke in einem beschreibenden Sinne zu verstehen und nicht zum Zwecke von Beschränkungen.
Die Verfahren der Molekulargenetik und Proteinbiochemie, die in der vorliegenden Offenbarung und den Beispielen verwendet wurden, aber nicht ausführlich beschrieben wurden, sind weitreichend in der Fachliteratur beschrieben und sind Teil des allgemeinen Fachwissens.
Beispiel 1
Dieses Beispiel beschreibt das Kultivieren und Isolieren von Leishmania-Organismen.
Amastigoten von dem L. donovani äthiopischen LV9-Stamm wurden aus der Milz von infizierten weiblichen syrischen Goldhamstern geerntet und wie zuvor beschrieben gereinigt (Literaturstelle 12). Kurz gesagt wurden die Parasiten aus dem Gewebe mittels einem Homogenisator entfernt, die Mischung wurde dreimal bei 100 xg zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen, und die Amastigoten wurden bei 1500 xg pelletisiert. Das Pellet wurde in 0,17 M Natriumacetat resuspendiert, um die kontaminierenden roten Blutzellen zu lysieren und die Amastigoten wurden durch Zentrifugation bei 1500 xg zurückgewonnen. Die Organismen wurden bei 37°C in vollständigem RPMI-Medium inkubiert (RPMI 1640, mit 10% Endotoxin-freiem Hize-inaktiviertem FBS, 10 ml 1 M HEPES pH 7,3, 100 U Penicillin und 100 U Streptomycin pro ml), für 18 Stunden vor der RNS-Extraktion. Nach dieser Inkubationszeit und mehrmaligem Waschen war die Amastigot-Präparation immer noch physiologisch aktiv und frei von Wirtszellenkontamination. Um Promastigoten zu erhalten, wurde es den LV9-Stamm-Amastigoten erlaubt, in vollständigem RPMI-Medium bei 26°C zu differenzieren, wobei sie für wenigstens 7 Tage in dem gleichen Medium vor einem Einsatz kultiviert wurden (Literaturstelle 12).
Promastigoten des L. donovani sudanesischen Stamms 1S2D wurden kultiviert und in vollständiges RPMI-Medium bei 26°C überführt. Amastigot-ähnliche Organismen des 1S2D-Stamms wurden wie von Doyle et al beschrieben kultiviert (Literaturstelle 13). Die sudanesischen Stämme 1S2D und 1S2D (wt) wurden von Dr. S. Turco erhalten, von der Universität von Kentucky, USA. Die 1S2D (wt)-Promastigoten wurden auf ein Wachstum unter axenischen Bedingungen angepasst und hatten die Fähigkeit verloren, in infektiöse Promastigoten zu transformieren.
Beispiel 2
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung und das Screenen von einer LeishmaniacDNS-Bibliothek.
Ein Verfahren zur Isolierung von einem Leishmania-Gen, das differentiell während dem Amastigot-Stadium in dem Lebenszyklus des Organismus exprimiert wird, ist in 1 angegeben.
Die Gesamt-RNS von Amastigoten und Promastigoten wurde nach der Guanidinium-Isothiocyanat-Methode hergestellt unter Verwendung von "RNAzol" (Trademark of Cinna/biotex Laboratories International Inc., Friendswood, TX); Poly A⁺ RNS wurde durch Oligo-dT-Cellulose-Chromatographie selektiert (Qualität 7:Pharmacia), wie von Sambrook et al beschrieben (Literaturstelle 14). Eine Gesamtmenge von 10 μg Amastigot-mRNS wurde verwendet, um eine EcoRI/XhoI-unidirektionelle cDNS-Bibliothek von 10⁶ Klonen in dem "λ-ZAP II"-Vektor (Markenname von Stratagene) zu konstruieren; hemi-methylierte cDNS wurde mittels der Reagenzien und Protokolle der Hersteller produziert. Etwa 40000 Amastigot- und Promastigot-spezifische Klone der primären Bibliothek wurden differentiell mit Amastigot- und Promastigot-Stadiumspezifischen Genproben gescreent. Die cDNS-Sonden wurden hergestellt, indem Oligo-dT_12-18-Primer (Pharmacia) und M-MLV reverse Transkriptase (BRL) nach den zuvor beschriebenen Protokollen verwenden wurden (Literaturstelle 15). Die Duplikatfilter wurden mit jeder Probe für 18 Stunden bei 42°C hybridisiert, in 50% Formamid, 6 X SSC, 5X Denhardt-Lösung, 5% Dextransulfat. Anschließend wurden die Membranen zweimal bei Raumtemperatur mit 1X SSC für 20 Minuten gewaschen, zweimal bei 55°C in 1X SSC, 0,1% SDS und anschließend auf "X-OMAT"-Filmen (Markenname von Kodak) autoradiographiert mit einem Verstärkungsscreen für 18 bis 72 Stunden. Solche Waschvorgänge entsprechen stringenten Hybridisierungsbedingungen. Die Bereiche auf den Platten, die mögliche interessante Klone enthielten, wurden ausgewählt und die Phagen-Pools wurden einem zweiten Screenen-Zyklus unterworfen. Ein Beispiel für einen Amastigot-spezifischen cDNS-Klon ist durch den Pfeil auf dem Plaque-Hybridisierungsautoradiogramm von 1 angegeben.
Obwohl die cDNS-Klone, die Promastigot-spezifische Transkripte darstellen, häufiger waren als Klone, die Amastigot-spezifische Transkripte darstellen, konnten sieben unabhängige cDNS-Klone, die nur mit Amastigot-spezifischen Sondern hybridisierten, isoliert werden und wurden als 2, 3; 5, 6, 8, 9 und 11 bezeichnet. Für jeden isolierten cDNS-Klon wurde ein Bluescript-Plasmidderivat aus den λZAP II-rekombinanten Phagen in vivo mittels dem Helper-Phage R-408 exzisiert.
Beispiel 3
Dieses Beispiel beschreibt die Charakterisierung von Amastigot-spezifischen cDNS-Klonen.
Die Insertgröße von jedem der Bluescript-Plasmide, die den Amastigot-spezifischen cDNS-Klonen entsprechen, wurde mittels Restriktionsenzym-Verdauung und Agarose-Gel-Elektrophorese bestimmt (2). Die rekombinanten Plasmide (A2, A3, A5, A6, A8, A9 und A11) wurden mit EcoRI und XhoI verdaut, um die cDNS-Inserte zu exzisieben. Die Fragmente wurden auf einem 1% Agarosegel aufgetrennt und mit Ethidiumbromid gefärbt. Die cDNS-Inserte variierten von 0,5 kb (A5) bis 1,8 kb, und A8 enthielt eine interne EcoRI-Stelle. Um festzustellen, ob die Amastigot-spezifischen cDNS-Klone gemeinsame Sequenzen aufwiesen, wurde eine Southern-Blot-Hybridisierungsanalyse der Bluescript-Plasmide durchgeführt, die den Amastigot-spezifischen cDNS-Klonen entsprachen, unter Verwendung von spezifischen Sonden für den Klon A2 und den Klon A6 (3).
Für die Southern-Blot-Analyse wurden 10 μg der Gesamt-DNS mit den Restriktionsenzymen EcoRI und XhoI bis zur Vollendung geschnitten und auf einem 1% Agarosegel aufgetrennt. Die Restriktionsfragmente wurden auf Nylonmembranen überführt, wobei Standardverfahren verwendet wurden (Literaturstelle 16), und die Duplikate hybridisierten mit α-³²P dCTP Nick-translatierten Sonden, die die Inserts von den cDNS-Klonen A2 (0,9 kb) oder A6 (0,6 kb) darstellten. Die A2-Sonde erkannte fünf cDNS (A2, A3, A8, A9 und A11) und die A6-cDNS hybridisierte nur mit sich selbst. Somit zeigte diese Southern-Blot-Analyse, dass die cDNS-Klone A2, A3, A8, A9 und A11 homologe Sequenzen enthielten, aber dass A5 und A6 Klone von nicht verwandten Amastigot-spezifischen Transkripten darstellten.
Zur Bestätigung, dass die A2-Serien von Klonen Leishmania-Gene darstellten, die differentiell exprimiert worden waren, wenn der Leishmania-Organismus in Makropha gen vorliegt im Vergleich zur Expression in den freilebenden Promastigoten, wurde eine Northern-Blot-Analyse durchgeführt. Gesamt-RNS wurde aus vom Knochenmark abstammenden Makrophagen (BMM), L. donovani LV9-infizierten BMM (IBMM) und L. donovani LV9-Promastigoten (PRO) extrahiert. Die murinen vom Knochenmark abstammenden Makrophagen-Kulturen und die in vitro-Infektionen mit L. donovani-Amastigoten wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt (Literaturstelle 12). Die RNS-Spezien (15 μg) wurden auf einem Agarosegel aufgetrennt und vor dem Transfer mit Ethidiumbromid gefärbt (4, rechte Seite). Die RNS wurde mittels Glyoxal-Behandlung denaturiert und auf eine Nylonmembran transferiert. Der Northern-Blot wurde mit markiertem cDNS-A2-Fragment (0,9 kb) hybridisiert, wie zuvor beschrieben (Literaturstelle 12) (4, linke Seite). Diese Sonde erkannte vorwiegend ein 3,5 kb-Transkript, das in Amastigot-infizierten Makrophagen vorlag, aber nicht in Promastigoten oder nicht infizierten Makrophagen. Diese Analyse zeigte, dass das A2-Gen differentiell mit einer erhöhten Konzentration in Amastigoten exprimiert wurde, wenn diese in Makrophagen vorlagen, im Vergleich zu einer freilebenden Existenz, und dass die erhöhte Expression wenigstens eine 10fache Erhöhung darstellte.
Beispiel 4
Dieses Beispiel beschreibt die genomische Anordnung und Sequenzierung von dem Leishmania donovani Amastigoten-spezifischen A2-Gen.
Eines der ungewöhnlichen Merkmale der Genetik von Trypanosomatiden ist die Regulierung der Transkription. Die Kopien von einem Gen oder verwandten Genen sind oft in Tandem-Anordnungen auf dem gleichen Chromosom gehäuft und eine einzige Promotorregion reguliert die Expression von dem Cluster. Die Transkription führt zu der Synthese von einem polynstronischen RNS-Molekül, das vor der Translation durch Trans-Spleißen in monomere Einheiten gespalten wird. Die genomische Anordnung von A2-verwandten Genen) wurde durch Southern-Blot-Analyse untersucht, um zu bestimmen, ob es eine Multigen-Familie darstellt. Gesamt-DNS wurde mit mehreren Restriktionsenzymen bis zur Vollständigkeit verdaut (E: EcoRI, S: SalI, S: XbaI, C: ClaI, P: PvuII). Für Doppelverdauungen wurde die DNS erst vollständig mit ClaI oder PvuII geschnitten, dann wurde die DNS präzipitiert und in dem geeigneten Puffer für die zweite Verdauung resuspendiert. Die Restriktionsfragmente wurden auf einem 0,7% Agarose-Gel aufgetrennt, auf eine Nylonmembran transferiert und mit einem 0,5 kb PstI/XhoI-Fragment des A2-cDNS-Inserts "Nick"-translatiert mit α-³²P dCTP, hybridisiert. Für jede Verdauung zeigte das Hybridisierungsmuster eine Reihe von Banden unterschiedlicher Intensität, was deutlich zeigt, dass viele Kopien des Gens in dem Genom vorlagen (5). Des weiteren ließen gemeinsame Banden bei etwa 6 bis 8 kb der EcoRI-, XbaI- und SalI-Verdauungen auf eine Anordnung in Tandem-Anordnungen schließen. Jedoch lässt das Vorliegen von wenigstens zwei weiteren Banden in jeder Bahn darauf schließen, dass mehr als ein Cluster existierte, wobei jeder Cluster durch Restriktionsfragmente unterschiedlicher Größen flankiert wurde. Alternativ dazu können die Cluster auch Kopie von nichtverwandten Genen oder intergene Regionen unterschiedlicher Größen tragen.
Um die Protein-codierende Region von A2 zu bestimmen, wurden genomische Klone, die die A2-Gensequenz trugen, isoliert. Es wurde eine partielle genomische Bibliothek, die 6 bis 10 kb EcoRI-Fragmente enthielt, in dem λZAP II-Vektor konstruiert (Stratagene). Es wurden mehr als 2000 Klone auf Duplikat-Filtern mit Sonden gescreent, die aus der A2-cDNS mittels Techniken und Hybridisierungsbedingungen, wie sie in Beispiel 2 beschrieben wurden, hergestellt worden waren. Acht Klone wurden isoliert und gereinigt. Die Bluescript-Plasmidderivate wurden aus den rekombinanten λ-Phagen wie bei den cDNS-Klonen herausgeschnitten.
Das 1,9 kb XhoI/EcoRI-Insertfragment von dem A2-Bluescript-Klon wurde in die Bluescript Phagemiden KS⁺ und KS^- zum Sequenzieren subkloniert. "Nested"-Deletionen wurden an beiden Plasmiden durchgeführt, indem ExoIII-Exonuklease und S1-Nuklease eingesetzt wurden. Die Sequenzreaktionen wurden an Einzelstrang-DNS-Templaten durchgeführt, wobei der M13K097-Helfer-Phage nach dem publizierten Verfahren (Literaturstelle 17) mit den Deaza-G/A-Sequenzierungsmischungen (Pharmacia) und d³⁵ATP- oder d³⁵CTP-Radioisotopen verwendet wurde. Die Reaktionen wurden auf 6% denaturierenden Gelen analysiert. Die Inserts der genomischen Klone wurden mit verschiedenen Restriktionsenzymen erfasst und zeigten ähnliche Muster, außer dass manche Inserts länger waren als andere. Einer dieser Klone, pGECO 90 (wie in 6 dargestellt), wurde für eine weitere Charakterisierung ausgewählt. 7 zeigt die Restriktionsmappe des Inserts pGECO 90 und dessen Übereinstimmung mit den A2-verwandten cDNS. Die in 7 gezeigten Restriktionsenzyme sind S: SalI, P: PstI, O: XhoI, X: XbaI, E: EcoRI, M: SmaI. Der Plasmid pGECO 90 enthielt jeweils eine einzelne Stelle für SalI und XbaI, aber keine ClaI-Stelle, und dies war in Übereinstimmung mit der Southern-Blot-Analyse, die in 5 dargestellt ist. Die DNS-Sequenz, die die EcoRI-Stelle in diesem genomischen Klon flankierte, wurde bestimmt und es konnte gezeigt werden, dass sie exakt mit dem verwandten Teil der A8-cDNS übereinstimmte, was bestätigte, dass dieses Fragment eine Einheit der Tandemanordnung darstellt.
Die DNS-Sequenz von dem 1,9 kb XhoI/EcoRI-Fragment des pGECO 90 genomischen Klons, welcher dem 3,5 kb A2-Transkript entsprach, wurde bestimmt (8) und mit den cDNS-Sequenzen verglichen. Das längste offene Leseraster (ORF II), das gefunden wurde, war in dem XhoI/XbaI-1,1 kb-Fragment enthalten und codierte potentiell für ein 22 kD-Proteinprodukt (A2-Protein). In zwei anderen Rastern und aufwärts von dem initiierenden ATG wurden Stop-Codons gefunden. Der Großteil dieses vorhergesagten A2-Proteins war aus einer repetitiven Sequenz zusammengesetzt, die aus einer Strecke von 10 Aminosäuren bestand, die 19 mal wiederholt wurde. Da jede Einheit dieser Wiederholung zwei Serine, zwei Valine, zwei Leucine und zwei Proline enthält, die voneinander durch fünf Reste getrennt sind, kann die Wiederholungsregion auch als eine Strecke von fünf Aminosäuren angesehen werden, die 38 mal wiederholt wird. Die einzige hydrophobe Domäne befand sich an dem Aminoterminalen Teil und könnte einem Signalpeptid entsprechen. Die vorhergesagte Aminosäuresequenz wurde mit Proteinen verglichen, die in der Swiss-Prot-Datenbankversion angegeben sind, wobei ein Fasta-Algorithmus verwendet wurde (Canada Institute for Scientific and Technical Information: Scientific Numeric Database Service). Die bemerkenswerteste Identität wurde mit einem S-Antigen von Plasmodium falciparum vietnamisischen Isolat VI beobachtet. Die Gegenüberstellung der A2-Proteinsequenz (A2) mit dem aminoterminalen Teil des S-Antigens von P. falciparum-Isolat VI ist in 9 dargestellt. Die identischen Reste sind durch Striche und die homologen Aminosäuren durch Punkte dargestellt. Wie bei dem L. donovani-A2-Protein ist der Carboxy-terminale Teil dieses Antigens von P. falciparum vietnamischen Isolats VI aus einer Strecke von 11 Aminosäuren zusammengesetzt, die sich 19 mal wiederholt. Die Wiederholungseinheiten der beiden Proteine sind zu 50% identisch und zu 80% homolog. Das S-Antigen, wie auch die CS-Antigene von Plasmodium, sind Proteine, die Stadium-spezifisch sind, wobei sie in dem Säugerwirt, aber nicht in dem Insektenwirt exprimiert werden. Daher werden die A2- und S-Antigen-Gene aus nicht verwandten humanen infektiösen Protozoen spezifisch in dem Säugerwirt exprimiert und codieren ähnliche Proteine. Folglich könnten das A2-Protein und das S-Antigen-Protein ähnliche Funktionen aufweisen und könnten erforderlich sein, um das Überleben der Protozoen in Menschen zu ermöglichen, und es kann erwartet werden, dass die funktionelle Unfähigkeit der A2-Sequenzen in L. donovani zu einem nicht infektiösen Promastigoten führt, der als lebender, abgeschwächter Impfstoff gegen Leishmaniase geeignet ist.
Beispiel 5
Dieses Beispiel beschreibt das funktionelle Unfähigmachen von differentiell exprimierten Genen in Leishmania.
Ein Ansatz für die Entwicklung von abgeschwächten Stämmen von Leishmania liegt darin, die Amastigot-spezifischen Gene (wie das A2-Gen) von dem Leishmania-Genom funktionell unfähig zu machen (z. B. durch Deletion), wobei homologe Rekombination verwendet wird. Die Deletion von Genen aus Protozoen (wie z. B. Leishmania) ist bereits beschrieben worden (Literaturstelle 18). Dieses Verfahren umfasst das Klonen von DNS-Fragmenten 5'- und 3'- zum A2-Gen und das Konstruieren von einem Plasmidvektor, der diese flankierenden DNS-Sequenzen enthält, die ein Neomycin-Resistenzgen sandwichartig in die Mitte nehmen. Dieses 5'-neo 3'-Fragment der DNS wird dann verwendet, um L. donovani-Promastigoten mit G418-Resistenz zu transformieren. L. donovani ist diploid und die Deletion von einem Allel des A2-Gens in solchen G418-resistenten Stämmen kann durch Southern-Blot-Hybridisierung mitttels A2-spezifischer Sonden bestimmt werden. Das zweite A2-Allel kann anschließend durch Konstruktion von einem zweiten Deletionsvektor deletiert werden, der die 5'und 3'- A2-flankierenden Sequenzen enthält, die ein Hygromycin-Restistenzgen sandwichartig in die Mitte nehmen. Nach der Transformation werden die Kolonien auf einem G418 und Hygromycin enthaltenden Medium selektiert. Die Deletion beider Kopien des A2-Gens kann durch Southern-Blot-Hybridisierung bestätigt werden.
Beispiel 6
Dieses Beispiel beschreibt die Expression von dem L. donovani Amastigoten-spezifschen A2-Gen und die Erkennung des A2-Genproduktes durch Eingeweide-Leishmaniase-Immunserum.
Für die Herstellung von dem A2-Protein in einem heterologen System wurde die codierende Region von dem initiierenden ATG bis zu der XbaI-Restriktionsstelle (siehe 8) in den pET 16B-Restriktionsvektor im Raster mit dem HIS-TAG subkloniert . (10). Das A2-Fusionsprotein von 27. kD wurde in einem in vitro-Transkriptions-Translations-Assay hergestellt (TNT system, Promega), wobei der pET16b/ORF II-Plasmid und ein negativer Kontroll-pBluescript/p53-Plasmid verwendet wurden, der das humane p53-Protein codiert. Das in vitro-translatierte HIS-TAG/A2³⁵S-markierte Protein wurde mit dem Eingeweide-Leishmaniase-Immunserum immunpräzipitiert und durch Natriumdodecylsulfat-Polyacnlamidgel-Elektrophorese analysiert ( 11). Die Eingeweide-Leishmaniase (kala-azar) ist eine Bezeichnung, die für die Beschreibung der durch L. donovani verursachten Krankheit verwendet wird. Das Ein- geweide-Leishmaniase-Immunserum wurde von einem Patienten erhalten, der unter viszeraler Leishmaniase litt und heftig auf L. donovani-Antigene im ELISA reagierte. In der 11 enthielten die Bahnen 1 und 2 jeweils die markierten Proteine A2 und p53, vor der Analyse der Immunpräzipitation. Die Bahnen 3 und 4 enthielten jeweils die Proteine A2 und p53, die mit dem Eingeweide-Leishmaniase-Immunserum (L1) immunpräzipitiert worden waren, und die Bahnen 5 und 6 enthielten jeweils die Proteine A2 und p53, die mit einem Kontrollhumanserum (TXC) immunpräzipitiert worden waren. Das Eingeweise-Leishmaniase-Serum reagierte nicht auf das negative Kontrollprotein menschliches p53; aber es führte zu einer Immunpräzipitation des A2-Genproduktes. Keines der Proteine wurde durch das Kontrollhumanserum immunpräzipitiert. Aus dieser Analyse geht hervor, dass das Produkt des L. donovani-A2-Gens spezifisch durch das Eingeweide-Leishmaniase-Immunserum erkannt wurde.
Zur Bestätigung der Spezifität der Immunreaktion wurden das pET 16b/ORF II-Plasmid, das für das rekombinante A2-Fusionsprotein codiert, und ein negatives Kontrollplasmid pET 16b ohne Insert in E. coli eingeführt. Die Expression wurde mit IPTG induziert, und die vollständigen Lysate der rekombinanten E. coli-Zellen wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt und mittels Western-Blot-Analyse analysiert, wobei das Eingeweide-Leishmaniase-Immunserum, das vorstehend beschrieben worden ist, eingesetzt wurde (siehe 12). In 12 enthält die Bahn 1E. coli pET 16b-Zellen und die Bahn 2 enthält E. coli pET 16b/ORF II-Zellen. Das Eingeweide-Leishmaniase-Serum reagierte spezifisch mit den Proteinprodukten von 27,5 und 25 kD in den Lysaten von Zellen, die das pET 16b/ORF II-Plasmid enthielten (Bahn 2). Das 25 kD-Protein entspricht wahrscheinlich dem A2-Protein ohne dem HIS-TAG, da die A2-Sequenz nicht ihr einiges initiierendes ATG enthielt. Das Serum reagierte nicht spezifisch mit Protein aus E. coli-Lysaten, die das Kontroll-pET 16b-Plasmid enthielten (Bahn 1). Diese Daten bestätigten, dass der ORF II des A2-Gens ein L. donovani-Protein codiert (A2), das in Patienten mit viszeraler Leishmaniase antigenisch wirkt.
Beispiel 7
Dieses Beispiel beschreibt die Southern-Blot-Analyse der isolierten Chromosome aus unterschiedlichen Spezies und Subspezies von Leishmania.
Leishmania-Stämme wurden von der "American type Culture Collection", Rockville, Maryland erhalten, die wie folgt über ihre Zugangsnummern identifiziert sind:
Probenblöcke wurden anfänglich aus den Leishmania-Stämmen nach dem folgenden Protokoll hergestellt:

1) Promastigoten-Zellen wurden einmal in Hepes-NaCl-Puffer gewaschen (21 mM HEPES pH 7,5, 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,7 mM Na₂PO₄ und 6 mM Glucose) und bei einer Dichte von 5 × 10⁸ in dem gleichen Puffer resuspendiert.
2) Die Zellen wurden mit 1 Volumen von 1% Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt verdünnt und man ließ 100 μ1-Proben in Probenhalter auf 4°C abkühlen.
3) Die Blöcke wurden in Lyse-Puffer überführt (0,5 M EDTA pH 9,5, 1% Natriumlaurylsarcosyl und 2 mg/ml Proteinase K) und für 18 Stunden bei 50°C inkubiert.
4) Die Blöcke wurden bei 4°C in 0,5 M EDTA gehalten.

Anschließend wurden die Chromosomen von den Probenblöcken durch 'Transverse Alternating Field Electrophoresis (TAFE)" abgetrennt, wobei ein "Geneline II-System" (Beckman instruments) unter den folgenden Bedingungen verwendet wurde:

– 1% Agarose-Gel wurde in 1X TAFE-Puffer hergestellt (20X TAFE-Puffer besteht aus 0,45 M Tris-borat und 0,01 M EDTA). Die Elektrophorese wurde bei 350 mA für 36 h bei 15°C durchgeführt.
– Die Elektrophoresebedingungen waren: Stadium 1: 12 h, 40 s Pulszeit Stadium 2: 12 h, 100 s Pulszeit Stadium 3: 12 h, 160 s Pulszeit

Aus der chromosomalen DNS wurden Southern-Blots nach dem folgenden Protokoll dargestellt:

1) Die Gele wurden in 0,25 M HCl für 15 Minuten durchtränkt, für eine partielle Depurination von DNS.
2) Die DNS wurde durch eine alkalische Behandlung denaturiert (die Gele wurden mit 0,5 N NaOH, 1,5 M NaCl für 45 Minuten unter leichtem Schütteln durchtränkt).
3) Die Gele wurden neutralisiert, indem sie in 0,5 M Tris-Cl pH 7,0, 3 M NaCl für 45 Minuten durchtränkt wurden.
4) Die DNS wurde auf eine Nylonmembran transferiert, unter Verwendung von Vacugen XL (Pharmacia-LKB) für 2 Stunden bei 60 mbar in 10X SSC (1X SSC besteht aus 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat).

Als nächstes wurde die Hybridisierung wie folgt ausgeführt:

– Nylonmembranen wurden in 1 M NaCl, 1% Natriumdodecylsulfat (SDS), 10% Dextransulfat für 18 Stunden bei 65°C für 2 Stunden prehybridisiert.
– Die denaturierten Proben wurden direkt zu dem Hybridisierungspuffer gegeben und die Blots wurden für 18 Stunden bei 65°C inkubiert.
– Die Membranen wurden zweimal in 2X SSC, 0,1% SDS bei Raumtemperatur für 20 Minuten gewaschen und zweimal in 0,5X SSC, 0,1% SDS für 20 Minuten gewaschen.
– Die Membranen wurden auf Kodak X-OMAT-Filmen mit Verstärkungscreens (itensifying screens) für 18 Stunden exponiert.

Die verwendet DNS-Sonde bestand aus einem pET 16b/ORF II 1,1 kb BamHI-Fragment, Agarosegel-gereinigt und markiert für hohe Spezifität mit ³²P-dCTP (ICN; 3000 ci/mmol) durch "Nick"-Translation. Dieses Fragment enthielt die vollständige A2-Protein-codierende Region des L. donovani-A2-Gens. Die erhaltenen Southern-Blots sind in 13 dargestellt.
Die in 13 dargestellten Daten zeigen, dass das L. donovani-A2-Gen in allen drei untersuchten Spezien von L. donovani und in zwei Subspezien von L. mexicana vorliegt. Jedoch wurde die A2-codierende Sequenz nicht L. tropica, L. major, L: brazilienis oder L. aetiopica gefunden. Aus diesen Ergebnissen geht hervor, dass die L. donovani-A2-Gen-DNS als Sonde zur spezifischen Detektion von L. donovani und L. mexicana unter den Leishmania-Spezies geeignet ist. Die L. donovani- und L. mexicana-Spezies werden üblicherweise an ganz unterschiedlichen geographischen Standorten aufgefunden, so dass die Sonde für Infektionen durch Spezies, die an einem bestimmten geographischen Standort auftreten, spezifisch ist.
ZUSAMMENFASSUNG DER OFFENBARUNG
Zusammenfassend stellt die vorliegende Erfindung differentiell exprimierte Gene und Proteine von Leishmania bereit, einschließlich des A2-Gens, das in deutlich höheren Konzentrationen in dem Amastigot-Stadium des Lebenszyklus exprimiert wird, wenn der Leishmania-Organismus in Makrophagen vorliegt, als in dem Promastigot-Stadium.
LTERATURSTELLEN
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3. Sacks, D.L. 1989. Metacyclogenesis in Leishmania promastigotes. Exp. Parasitology. 69 : 100–103.
4, Sacks, D.L. and da Silva, R.P. 1987. The generation of infective stage L. major promastigotes is associated with the cell-surface expression and release of a developmentally regulated glycolipid. J. Immunol. 139 : 3099–3106.
5. Sacks, D.L., Brodin, T.N., Turco, S.J. 1990. Developmental modification of the lipophosphoglycan from L. Major promastigotes during metacyclogenesis. Mol. Biochemical Parasitol. 42 : 225–234.
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7. Turco, S.J. and Sacks, D.L. 1991. Expression of stage-specific lipophosphoglycan in Leishmania major amastigotes. Mol. Biochemical Parasitol. 45 : 91–100.
8. McConville, M.J. and Blackwell J.M. 1991. Developmental changes in the glycosylated phosphatidylinositols of L. donovani J. Biol. Chem. 260 : 15170– 15179.
9. Bogdan, C., Röllinghoff M. and Solbach, W. 1990. Evasion strategies of Leishmania parasites. Parasitol. Today. 6 : 183–187.
10. Modabber, F. 1989. Experiences with vaccines against cutaneous leishmaniasis: of men and mice. Parasitol. 98 : S49–S60.
11. Joshi, M., Dwyer, D.M. und Nakhasi, H.L. 1993. Cloning and characterization of differentially expressed genes from in vitro-grown "amastigotes" of Leishmania donovani. Mol. Biochemical Parasitol. 58 : 345–354.
12. Descoteaux, A. und Matlashewski, G. 1989. c-fos and tumor necrosis factor gene expression in Leishmania donovani-infected macrophages. Mol. Cell. Biol. 9 : 5223–5227.
13. Doyle, P. S., Engel, J.C., Pimenta, P.F.P., da Silva, P. und Dwyer. 1991. Leishmania donovani: Long-term culture of axenic amastigotes at 37°C. Exp. Parasitol. 73 : 326–334.
14. Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis. 1989. Molecular cloning. A laboratory guide. Cold Spring Harbor Laboratories Press, New York, Seiten 7.26–7.29.
15. Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis. 1989. Molecular cloning. A laboratory guide. Cold Spring Harbor Laboratories Press, New York, Seiten 10.44–10.45.
16. Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis. 1989. Molecular cloning. A laboratory guide. Cold Spring Harbor Laboratories Press, New York, Seiten 9.38–9.40.
17. Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis. 1989. Molecular cloning. A laboratory guide. Cold Spring Harbor Laboratories Press, New York, Seiten 4.48.
18. Cruz, A. und Beverly, S.M. 1990. Genereplacement in parasitic protozoa. Nature 348 : 171–173.
SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE INFORMATIONEN:
(i) ANMELDER:
(A) NAME: McGill University
(B) STRASSE: 845 Sherbrooke Street West
(C) STADT: Montreal
(D) BUNDESSTAAT: Quebec
(E) LAND: Canada
(F) POSTLEITZAHL (ZIP): H3A 2T5
(A) NAME: Gregory Matlashewski
(B) STRASSE: 2571 Chestnut Circle
(C) STADT: St-Lazare
(D) BUNDESSTAAT: Quebec
(E) LAND: Canada
(F) POSTLEITZAHL (ZIP): JOP 1V0
(A) NAME: Huguest Charest
(B) STRASSE: 1930 Sommet-Trinite
(C) STADT: St-Bruno
(D) BUNDESSTAAT: Quebec
(E) LAND: Canada
(F) POSTLEITZAHL (ZIP): H3V 4P6
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: DIFFERENTIELL EXPRIMIERTE LEISHMANIA-GENE UND PROTEINE
(iii) ANZAHL SEQUENZEN: 4
(iv) COMPUTERLESBARE FORM:
(A) MEDIUMART: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version # 1.25 (EPO)
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR: 1:
(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 1091 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGART: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 1:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR: 2:
(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 711 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGART: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 2:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR: 3:
(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 236 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGART: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUEN ZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 3:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR: 4:
(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 269 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGART: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 4:

Claims

Isoliertes und gereinigtes DNS-Fragment: a) mit der Nukleotid-Sequenz:
(SEQ ID NR: 1) oder ihr komplementärer Strang, oder ein DNS-Molekül, das für ein differentiell exprimiertes Gen eines Leishmania-Organismus codiert, der damit unter stringenten Bedingungen hybridisiert: oder b) mit der Nukleotid-Sequenz:
(SEQ ID NR: 2) oder ihr komplentärer Strang, oder ein DNS-Molekül, das für ein differentiell exprimiertes Gen eines Leishmania-Organismus codiert, der damit unter stringenten Bedingungen hybridisiert; oder c) codierend die folgende Aminosäuresequenz:

(SEQ ID NR: 3) oder ihr komplementärer Strang, oder ein DNS-Molekül, das für ein differentiell exprimiertes Gen eines Leishmania-Organismus codiert, der damit unter stringenten Bedingungen hybridisiert.
Rekombinanter Plasmidvektor, der geeignet ist zur Transformation eines mikrobiellen Wirtes, in den ein DNS-Segment, umfassend das isolierte und gereinigte DNS-Molekül nach Anspruch 1, eingefügt ist.
Rekombinanter Plasmid nach Anspruch 2, das das Plasmid pGECO mit der ATCC-Zugangsnummer 75510 ist.
Isoliertes und gereinigtes Protein von Leishmania, das a) durch ein DNS-Molekül mit der folgenden Nukleotid-Sequenz codiert ist:
(SEQ ID NR: 2) oder ein DNS-Molekül, das für ein differentiell exprimiertes Gen eines Leishmania-Organismus codiert, der damit unter stringenten Bedingungen hybridisiert ist; oder b) die folgende Aminosäuresequenz hat:
(SEC ID NR: 3)
Isolierter Leishmania-Antigen-spezifischer Antikörper, der gegen ein gereinigtes Protein gebildet worden ist, das durch ein differentiell exprimiertes Gen eines Leishmania-Organismus gebildet worden ist, wobei das Protein a) die folgende Aminosäuresequenz hat:

(SEQ ID NR: 3); oder b) durch ein DNS-Molekül mit der folgenden Nukleotidsequenz codiert wird:
(SEQ ID NR: 2) oder ein DNS-Molekül, das für ein differentiell exprimiertes Gen eines Leishmania-Organismus codiert, der damit unter stringenten Bedingungen hybridisiert.
Abgeschwächter Stamm von Leishmania, bei dem ein differentiell exprimiertes Virulenz-Gen mit der DNS-Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer DNS-Sequenz mit SEQ ID NR: 1, einer DNS-Sequenz mit SEQ ID NR: 2 und einer DNS-Sequenz, die eine Aminosäuresequenz mit SEQ ID NR: 3 codiert, oder einer DNS-Sequenz, die für ein differentiell exprimiertes Gen eines Leishmania-Organismus codiert, der damit unter stringenten Bedingungen hybridisiert, funktionell unfähig gemacht worden ist, ein Gen-Produkt zu bilden, das durch die DNS-Sequenz in einem solchen abgeschwächten Stamm codiert wird.
Abgeschwächter Stamm nach Anspruch 6, wobei das Virulenz-Gen durch Deletion funktionell unfähig gemacht worden ist.
Abgeschwächter Stamm nach Anspruch 6, wobei das Virulenz-Gen durch Mutagenese davon. funktionell unfähig gemacht worden ist.
Abgeschwächter Stamm nach Anspruch 8, wobei das Virulenz-Gen durch Insertions-Mutagenese davon funktionell unfähig gemacht worden ist.