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DE69430060T2 - Antikörper von rapamycinen mit offenem ring - Google Patents

Antikörper von rapamycinen mit offenem ring

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Publication number
DE69430060T2
DE69430060T2 DE69430060T DE69430060T DE69430060T2 DE 69430060 T2 DE69430060 T2 DE 69430060T2 DE 69430060 T DE69430060 T DE 69430060T DE 69430060 T DE69430060 T DE 69430060T DE 69430060 T2 DE69430060 T2 DE 69430060T2
Authority
DE
Germany
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rapamycin
ring
antibody
derivative
opened
Prior art date
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DE69430060T
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Eduardo Gonzalez
Katherine L. Molnar-Kimber
John C. Russell
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Wyeth LLC
Original Assignee
Abbott Laboratories
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Publication date
Application filed by Abbott Laboratories filed Critical Abbott Laboratories
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Publication of DE69430060T2 publication Critical patent/DE69430060T2/de
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Expired - Lifetime legal-status Critical Current

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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
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Description

    HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Diese Erfindung betrifft einen monoklonalen Antikörper, welcher spezifisch an ein ringgeöffnetes Rapamycin bindet, ein Testkit, welches einen solchen Antikörper verwendet, zur Bestimmung von Niveaus von einem ringgeöffneten Rapamycin oder einem Derivat davon, Verfahren zur Trennung einer Mischung aus einem ringgeöffneten Rapamycin oder eines Derivates davon von Rapamycin oder einem Derivat davon, und eine Hybridomzellinie, die in der Lage ist, Antikörper zu produzieren, die spezifisch an ein ringgeöffnetes Rapamycin binden.
  • Rapamycin ist ein makrozyklisches Trienantibiotikum, welches durch Streptomyces hyproscopicus produziert wird, und welches nachweislich eine antifungale Aktivität besitzt, insbesondere gegen Candida albicans, in vitro wie auch in vivo [C. Vezina et al., J. Antibiot. 28, 721 (1975); S.N. Sehgal et al., J. Antibiot. 28, 727 (1975); H.A. Baker et al., J. Antibiot. 31, 539 (1987); U.S. Patent 3,929,992; und U.S. Patent 3,993,749].
  • Rapamycin alleine (U.S. Patent 4,885,171) oder in Verbindung mit Picibanil (U.S. Patent 4,401,653) hat nachweislich eine Wirkung gegen Tumoren. R. Martel et al. [Can. J. Physiol. Pharmacol. 55, 48 (1977)] legen offen, dass Rapamycin in dem experimentellen allergischen Encephalomyelitismodel wirksam ist, einem Model für die Multiple Sklerose; im adjuvanten Arthritismodel; einem Model für die rheumatoide Arthritis; und das es wirksam die Bildung von IgEartigen Antikörpern hemmte.
  • Die immunosuppressiven Wirkungen von Rapamycin wurden offengelegt in FASEB 3, 3411 (1989). Cyclosporin A und FK-506, andere macrozyklische Moleküle, sind nachweislich wirksam als immunosuppressive Wirkstoffe, und somit nützlich bei der Verhinderung einer Transplantatabstoßung [FASEB 3, 3411 (1989); FASEB 3, 5256 (1989); R.Y. Calne et al., Lancet 1183 (1978); und U.S. Patent 5,100,899].
  • Rapamycin ist ebenfalls nachweislich nützlich bei der Verhinderung oder Behandlung von systemischen Lupus erythematodes [U.S. Patent 5,078,999], Lungenentzündungen [U.S. Patent 5,080,899], Insulinabhängigen Diabetes Mellitus [Fifth Int. Conf. Inflamm. Res. Assoc. 121 (Abstract), (1990)], Adultes T-Zell Leukämie/Lymphom [Europäische Patentanmeldung 525,960 A1], und der Proliferation glatter Muskelzellen und Intimaverdickung nach Gefäßverletzung [Morris, Reaktion. J. Heart Lung Transplant 11 (Seite 2): 197 (1992)].
  • Mono- und diacylierte Derivate von Rapamycin (verestert an den Positionen 28 und 43) sind nachweislich nützlich als antifungale Wirkstoffe (U.S. Patent 4,316,885) und werden verwendet, um wasserlösliche Prodrugs von Rapamycin (U.S. Patent 4,650,803) herzustellen. Kürzlich wurde die Zählkonvention für Rapamycin verändert; demzufolge würden die oben beschriebenen Ester gemäß der Chemical Abstract Nomenclatur an den 31- bzw. 42-Positionen liegen. Das U.S. Patent 5,100,883 beschreibt fluorierte Ester von Rapamycin. Das U.S. Patent 5,118,677 beschreibt Amidester von Rapamycin. Das U.S. Patent 5,118,678 beschreibt Carbamate von Rapamycin. Das U.S. Patent 5,130,307 beschreibt Aminoester von Rapamycin. Das U.S. Patent 5,177,203 beschreibt Sulfonate und Sulfamate von Rapamycin. Das U.S. Patent 5,194,447 beschreibt Sulfonylcarbamate von Rapamycin. Die PCT Veröffentlichung WO 92/05179 beschreibt Carbonsäureester von Rapamycin.
  • Yatscoff hat berichtet, dass die Rapamycinniveaus unter Verwendung eines HPLC Verfahrens mit einer Sensitivität von 1 ng/ml quantifiziert werden können [Ther. Drug Monitoring 14: 138 (1992)]. Dieses Verfahren ist zeitaufwendig und jede Probe muß einzeln untersucht werden.
  • Immunoassays wurden für zahlreiche Proteine, sowohl wie auch zahlreiche Arzneistoffe einschließlich Cyclosporin A entwickelt [Morris, R.G., Ther. Drug Monitoring 14: 226-(1992)], und FK506 [Tamura, Transplant Proc. 19: 23 (1987); Cadoff, Transplant Proc. 22: 50 (1990)]. Verschiedene Arten von Immunoassays welche entwickelt wurden, um Proteine oder Verbindungen zu messen, basieren auf der kompetitiven Inhibition, dualen Antikörpern, Rezeptor- Antikörperinteraktionen, Antigenfangvorgängen, Eintauchstäben, Antikörper oder Rezeptoreinfangverfahren oder auf der Affinitätschromatographie. Affinitätssäulen mit Rapamycin wurden beschrieben, in welchen ein Rapamycinanalogon kovalent an eine Matrix angeheftet war [Fretz J. Am. Chem. Soc. 113: 1409 (1991)]. Diese Säulen wurden verwendet, um Rapamycin bindende Proteine zu isolieren.
    • BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Diese Erfindung stellt einen monoklonalen Antikörper, der spezifisch an ein ringoffenes Rapamycin, vorzugsweise Secorapamycin, bindet, zur Verfügung, welches als RAP-42- OVAF&sub2;#1MoAb bezeichnet ist.
  • Diese Erfindung liefert ebenfalls ein Verfahren zur Trennung einer Mischung eines ringoffenen Rapamycins oder eines Derivates davon, von Rapamycin oder einem Derivat davon, welches die Behandlung der Mischung mit dem obigen monoklonalen Antikörper gebunden an eine feste Matrix umfaßt, und das Ausspülen des ungebundenen Rapamycins von dem gebundenen offenkettigen Rapamycin-Antikörper-feste Matrix Komplex.
  • Diese Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zur Trennung einer Mischung eines ringoffenen Rapamycins oder eines Derivates davon von Rapamycin oder einem Derivat davon zur Verfügung, welches die Behandlung der Mischung mit dem obigen monoklonalen Antikörper, das Einfangen des ringgeöffneten Rapamycin- Antikörperkomplexes mit einem festen Träger und das Ausspülen des ungebundenen Rapamycins von dem ringoffenen Rapamecin- Antikörper-Festmatrixkomplex umfaßt.
  • Ein weiteres Verfahren der Erfindung zur Trennung einer Mischung eines ringoffenen Rapamecins oder eines Derivates davon von Rapamycin oder einem Derivat davon umfaßt die Behandlung der Mischung mit dem obigen monoklonalen Antikörper, gefolgt durch anti-Mausimmunoglobin, und das Entfernen des ausgefallenen ringoffenen Rapamycin-Antikörper-anti-Maus Immunoglobulinkomplexes. Vorzugsweise ist das anti- Mausimmunoglobin ein Hasen, Maus, Ratten, Schaf oder Ziegen anti-Mausimmunoglobulin.
  • Ein weiteres Verfahren der Erfindung zur Trennung einer Mischung eines ringoffenen Rapamycin oder eines Derivates davon von Rapamycin oder einem Derivat davon umfaßt die Behandlung der Mischung mit dem obigen monoklonalen Antikörper, gefolgt durch Protein A oder G, und das Entfernen des ausgefallenen ringoffenen Rapamycin-Antikörper Protein A oder G Komplexes.
  • Die Erfindung stellt ebenfalls eine Hybridomzellinie zur Verfügung, welche in der Lage ist, Antikörper zu produzieren, welche spezifisch an ein ringoffenes Rapamycin zu binden, welche bezeichnet ist als RAP-42-OVAF&sub2;#1hc.
  • Rapamycinderivate oder ringoffene Rapamycinderivate wie hierin definiert sind Verbindungen, welche einen Rapamycinnukleous, einen Metaboliten von Rapamycin, oder ein ringoffenes Rapamycin (wie z. B. Secorapamycin, beschrieben in U.S. Patent 5,252,579),
  • enthalten, in welchem eine oder mehrere der Hydroxylgruppen in einen Carbonester, ein Carbamat einen Sufonatester, ein Amid oder dergleichen verestert wurden, oder eines oder mehrere der Ketone wurde zu einer Hydroxylgruppe reduziert, oder eine oder mehrere der Doppelbindungen wurden reduziert, oder ein Keton wurde in ein Oxim oder ein Hydrazon umgewandelt. Andere derartige Derivate sind für jemanden der im Fachgebiet bewandert ist, basierend auf dieser Offenlegung, offensichtlich.
  • Rapamycinderivate sind nützlich als immunogene Moleküle zur Herstellung von spezifischen Antikörper für Rapamycin oder ringoffenen Rapamycinderivaten. Antikörper können durch Standardtechniken, welche im Fachgebiet bekannt sind, hergestellt werden. Üblicherweise wird ein Wirtstier an einer oder mehreren Stellen mit einem Immunogenkonjugat inokuliert, entweder alleine oder zusammen mit einem Adjuvants. Die üblichen Wirtssäugetiere umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Mäuse, Ziegen, Hasen, Guineaschweine, Schafe oder Pferde. Folgende Injektionen können durchgeführt werden, bis ein ausreichender Titer von Antikörper hergestellt ist.
  • Das immunogene Trägermaterial kann aus einem beliebigen der üblicherweise bekannten gewählt werden. In den meisten Fällen wird der Träger ein Protein oder Polypeptid sein, obwohl andere Materialien wie Kohlenhydrate, Polysaccharide, Lipopolysaccharide, Nukleinsäuren und dergleichen von ausreichender Größe und immunogener Wirksamkeit ähnlich verwendet werden können. Meistens haben immunogene Proteine und Polypeptide Molekulargewichte zwischen 5,000 und 10,000,000, vorzugsweise größer als 15,000 und üblicherweise größer als 40,000. Im allgemeinen sind Proteine, die von einer Tierart genommen werden immunogen, wenn sie in den Blutkreislauf einer anderen Spezies eingebracht werden. Besonders nützliche Proteine sind jene wie z. B. Albumin, Globuline, Enzyme, Hemocyanine, Gluteline oder Proteine, welche wesentliche nicht-proteinartige Bestandteile besitzen, z. B. Glycoproteine und dergleichen. Weiteren Bezug auf den Stand der Technik, was konventionelle immunogene Trägermaterialien und Techniken zur Kopplung von Haptenen an diese betrifft, kann in den folgenden Werken eingesehen werden: Parker, Radioimmunoassay of Biologically Active Compounds, Prentice-Hall (Englewood Cliffs, N.J., USA, 1976), Butler, J. Immunol. Meth. 7: 1-24 (1975) und Pharmacol. Rev. 29(2): 103-163 (1978); Weinryb and Shroff, Drug Metab. Rev. 10: P271-283 (1975); Broughton and Strong, Clin. Chem. 22: 726-732 (1976); und Playfair et al., Br. Med. Bull. 30: 24-31 (1974). Bevorzugte immunogene Trägermaterialien zur Anwendung in der vorliegenden Erfindung sind Ovalbumin und Keyhole-Limpet- Hämocyanin. Insbesondere bevorzugt ist Ovalbumin.
  • Die Antikörper, welche aus einem Immunogenkonjugat erzeugt werden können in zahlreichen Immunoassays verwendet werden, in ELISAs, Radioimmunoassays, bei Chemilumineszenzimmunoassays und bei fluoreszenten Immunoassays. Obwohl viele Abwandlungen des Immunoassays verwendet werden können (Antigenfang, Antikörperfang, kompetitive Inhibition oder Immunoassays mit zwei Antikörpern), kann ein grundliegender kompetitiver Inhibitionsimmunoassay durchgeführt werden wie folgt: Antikörper welcher für den Liganden spezifisch ist, wird wie üblich an eine Matrix gebunden. Eine Lösung wird angewandt, um die unspezifische Bindung des Liganden an die Matrix zu vermindern. Nach dem Abspülen des Überschusses, kann die Antikörper gekoppelte Matrix in einigen Fällen so behandelt werden das sie gelagert werden kann. Bei einem kompetitiven Inhibitionsassay wird die Ligandenstandardkurve erstellt und das Ligandennachweiskonjugat wird zugesetzt, um für die Bindung an den Liganden-spezifischen Antikörper zu kompetieren. Falls notwendig wird der Überschuß entfernt. Das Detektormolekül wird nachgewiesen durch die Standardverfahren, die dem Facharbeiter bekannt sind. Unterschiedliche Formate können verwendet werden, dies umfaßt, ist jedoch nicht beschränkt auf, Tauchstabassays, FPIA, EMIT, ELISA, VISTA, RIA und MEIA. Die Detektorkonjuagte können zur Anwendung in den obigen Assayshergestellt werden. Beispielsweise können die Detektorkonjugate ein Trägermaterial mit markierten fluoreszierenden, chemilumineszenten oder enzymatischen Molekülteilen sein.
  • Das Detektorträgermaterial kann ein Liganden bindender Molekülteil, der an ein Enzym konjugiert ist wie z. B. Meerrettichperoxidase, alkaline Phosphatase, Luciferase, ein fluoreszierender Molekülteil wie z. B. Fluorescein oder Fluoresceinderivate, Texasrot oder Rhodamin, ein chemilumineszenter Molekülteil und dergleichen sein. Das feste Matrixträgermaterial kann aus Harzkugeln, einer ELISA Platte, Glaskugeln wie üblicherweise in Radioimmunoassay verwendete, Plastikkugeln oder einem Festmatrixmaterial wie üblicherweise in einem Tauchstabassay verwendet, bestehen.
  • Die Erfindung stellt ebenfalls die Anwendung der monoklonalen Antikörper, bezeichnet als RAP-42-OVAF&sub2;#1MoAb, spezifisch für ringoffenes Rapamycin oder ein Derivat davon, in einem Testkit zur Verfügung, welches kommerziell vermarktet werden kann. Das Testkit kann zur Messung von Niveaus von ringoffenen Rapamycin oder eines Derivates davon in biologischen Flüssigkeiten oder Laborflüssigkeiten verwendet werden. Testkitbestandteile können zusätzlich zu den obigen Antikörpern, Antiseren oder ringoffene Rapamycinträgerkonjugate umfassen. Die Konjugate oder Antikörper können an eine feste Matrix gebunden sein und ringoffene Rapamycinderivate oder Antikörper können radiomarkiert sein, falls der Assay dieses erfordert. Die Standardkonzentrationen von ringoffenen Rapamycin können eingeschlossen sein, damit eine Standardkonzentrationskurve erzeugt werden kann. Geeignete Behälter, Mikrotiterplatten, feste Träger, Teströhren, Tabletts können ebenfalls in einem solchen Kit eingeschlossen sein. Viele Variationen der Reagenzien können in den Kit eingeschlossen sein, abhängig von der Art des verwendeten Assays.
  • Das folgende ist beispielhaft für die Anwendung eines Rapamycinimmunogenkonjugates, um Antikörper zu erzeugen, welche für Rapamycin oder ein Derivat davon spezifisch sind, und diese unter Verwendung eines ElISA Formatimmunoassays nachweisen. Fünf Mäuse wurden mit 50 ug Rapamycin 31,42-Diester mit Glutarsäurekonjugat mit Keyhole-limpet-hämocyanin (Beispiel 6) (in vollständigen Freund's Adjuvants) intrasplenikal immunisiert und nach etwa einem Monat wurden diese mit 50 ug Rapamycin 31,42- Diester mit Gluratsäurekonjugat mit Keyhole-limpet-hämocyanin unvollständigem Freund's Adjuvants) in die Fußballen geboostet. Mikrotiterplatten (Immunolon I) wurden über Nacht mit 100 ul Ziegen anti-Maus Antikörper (10 ug/ml in 10 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,2) bei 4ºC beschichtet. Die Platten wurden umgekippt und mit 100 ul von 1%igem Rinderserumalbumin in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung bei 4ºC über Nacht blockiert. Nach dem Umkippen und dreimaligen Waschen der Platten mit 10 mM Phophatpuffer pH 7,05, 30 mN NaCl, 0,02% Triton X-100 und 0,004% Thimerosalwaschpuffer, wurden 100 ul jedes Mäuseserums verdünnt mit Phosphatpufferlösung zu einer Kammer hinzugefügt und bei Raumtemperatur über Nacht inkubiert. Nach dem Umkippen und dreimaligen Waschen der Platten mit Waschpuffer, wurde Rapamycin 31,42-Diester mit Glutarsäurekonjugat mit Meerrettichpreroxidase (Verbindung aus Beispiel 7 (100 ul, 0,5 ng/ml) hinzugefügt und für 1 Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Nach dem Umkippen und dreimaligen Waschen der Platten mit Waschpuffer, wurde Tetramethylbenzidin (TMB) Substrat mit H&sub2;O&sub2; hinzugefügt und die Platten wurden für 30 Minuten bedeckt bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Die optische Dichte wurde auf einem Spektrophotometer bei 450 nm abgelesen. Wie in Tabelle I gezeigt, hatten fünf der fünf Mäuse Antikörper, welche auf Rapamycin 31,42-Diester mit Glutarsäurekonjugat mit Meerrettichperoxidase (Verbindung aus Beispiel 7) reaktiv waren. TABELLE 1
  • a Verdünnung von Mäuseserum in PBS
  • Die Ergebnisse in Tabelle 1 zeigen, dass die Maus 6904 die meisten Antikörper gegen die Verbindung aus Beispiel 7 erzeugte. Hybridome wurden erzeugt unter Verwendung eines üblichen Verfahrensweise. Nach einer Splenectomie einer Maus, die immunisiert wurde, und dreimal mit der Verbindung aus Beispiel 3 geboostet wurde, wurden die Milzzellen fusioniert mit SP20 Zellen, um Hybridome zu erzeugen. Die Hybridome wurden beurteilt hinsichtlich ihrer Erzeugung von Rapamycin oder Rapamycinderivat spezifischen Antikörpern unter Verwendung eines ELISA Assays wie kurz unterhalb beschrieben.
  • Mikrotiterplatten (Immunolon I) wurden über Nacht mit 100 ul Ziegen anti-Mausantikörper (10 ug/ml in 10 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,2) bei 4ºC beschichtet. Die Platten wurden umgekippt und mit 100 ul 1%igem Rinderserumalbumin in Phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) über Nacht bei 4ºC blockiert. Nach dem Umkippen und dreimaligen Waschen der Platten mit 0,2xPBS, 0,02% Triton X-100 und 0,004% Thimeroxal enthaltend, wurden 100 ul jedes Hybridomüberstandes zu einer Kammer hinzugesetzt und bei Raumtemperatur über Nacht inkubiert. Nach dem Umkippen und dreimaligen Waschen der Platten mit 0,2xPBS, welches 0,02% Triton X-100 und 0,004% Thimerosal enthielt, wurde die Verbindung aus Beispiel 8 (100 ul, 0,17 uM) hinzugefügt und für 1 Stunde bei 4ºC inkubiert. Nach dem Umkippen und dreimaligen Waschen der Platten mit 0,2xPBS welches 0,2% Triton X-100 und 0,004% Thimerosal enthielt, wurde Strepavidin oder Avidin konjugiert an Meerrettichperoxidase (100 ul, 0,2 ug/ml) hinzugefügt und bei Raumtemperatur für 1 Stunde im Dunkeln inkubiert. Nach dem Umkippen und dreimaligen Waschen der Platten mit 0,2xPBS welches 0,02% Triton X-100 und 0,004% Thimerosal enthielt, wurde TMB Substrat und H&sub2;O&sub2; zugesetzt und die Platten wurden für 30 Minuten bedeckt bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Die optische Dichte wurde auf einem Spektrophotometer bei 450 nm abgelesen. Eine optische Dichte Ablesung von 0,25-3 zeigt eine spezifische Antikörperbindung an. Die Ergebnisse in Tabelle 2 zeigen, dass das Hybridom aus der Kammer P4G1 eine positive Bindung der Verbindung aus Beispiel 8 zeigt, und somit spezifisch ist für Rapamycin oder ein Derivat davon.
    • TABELLE 2 Screening für monoklonale Antikörper, welche spezifisch sind für Rapamycin oder ein Derivat davon Kammer optische Dichte
  • P3H4 0.120
  • P3H5 0.105
  • P4G1 1.940
  • Die Hybridomazellinie in P4G1 wurde geklont durch limitierende Verdünnung und wird bezeichnet als Hybridomzellinie, RAP-42-OVAF&sub2;#1hc-. In einem Fluoreszens- Polarisationsimmunoassay (FPIA) wurde Rapamycin 42-Ester mit Bernsteinsäurekonjugat mit 5-Glycinylfluoresceinamin (Beispiel 9a) als ein Tracer bei einer Konzentration von 10 nM verwendet und zeigte eine Polarisation von 77 mP in 100 mM Natriumphosphat pH 7,5. Nach Zusatz eines Überschusses von FKBP12, maß die Polarisation 195 mP wogegen der Zusatz eines Überschüsses von RAP-42-OVAF2#1MoAb 84 mP ergab. Das ringoffene nicht enzymatisch umgewandelte Produkt des obigen Tracers (Secorapamycin 42-Ester mit Bernsteinsäurekonjugat mit 5-Glycinylfluoresceinamin; Beispiel 10) wurde auf einer TLC Platte isoliert (50 Chloroform : 4 Methanol : 0,5 Essigsäure; migrierte am langsamsten von den drei Verbindungen).
  • Die Rapamycin- und Secorapamycin-Fluoresceinderivate der Beispiele 9 und 10 wurden charakterisiert durch den Nachweis ihrer Bindung an FKBP12 und RAP-42-OVAF2#1 MoAb. Bei Zusatz von 0,01 ug FKBP12 zu 1,00 ml 10 nM Rapamycin-Fluorescein erhöhte sich die Fluoreszenzpolarisation von 57 mP auf 148 mP, wogegen die Fluoreszenzpolarisation des Secorapamycin-Fluoresceinderivates sich von 49 mP nur auf 58 mP erhöhte, was eine viel schwächere Bindung des Secoderivates anzeigt. Bei Zusatz von 5 ug/ml RAP-42- OVAF2#1 MoAb zu dem Rapamycinderivat wurde die Fluoreszenzpolarisation nicht verändert bei 58 mP, wogegen sich die Fluoreszenzpolarisation des Secorapamycinderivates von 44mB auf 136 mP erhöhte. Dies zeigt, dass RAP-42-OVAF2#1 MoAb spezifisch an das Secorapamycin-Fluoresceinderivat bindet, jedoch nicht an seinen Rapamycin-Fluoresceinvorläufer.
  • Die Spezifität der beiden Systeme kann ebenfalls in einem Assayformat bewiesen werden. Zu 50 ul 10 ug/ml RAP-42-OVAF2#1 wurde Rapamycin oder Secorapamycin hinzugefügt, um endgültige Konzentrationen zu ergeben, welche im Bereich von 0 bis 100nM lagen. Der Zusatz von 500 ul 20 nM Secorapamycin-Fluorescein führte zu einer Fluoreszenzpolarisation von 124 mP bei Abwesenheit von Analyten, 120 mP in Anwesenheit von 100 nM Rapamycin und 74 mP in Anwesenheit von 100 nM Secorapamycin. Der Secorapamycinanalyt inhibiert somit die Bindung des Secorapamycinfluoresceinderivates an RAP-42-OVAF2#1, wogegen Rapamycin keine Wirkung hat. In dem umgekehrten Experiment wurden zu 50 ul 0,02 ug/ml FKBP12 Rapamycin oder Secorapamycin hinzugefügt, um endgültige Konzentration im Bereich von 0 bis 100 nM zu ergeben. Der Zusatz von 50 ul 20 nM Rapamycin- Fluorescein führte zu einer Fluoreszenzpolarisation von 128 mP bei Fehlen von Analyten, 61 mP in Anwesenheit von 100 nM Rapamycin und 122 mP in Anwesenheit von 100 nE Secorapamycin. Hier inhibiert Rapamycin die Bindung, wogegen Secorapamycin keine Wirkung hat.
  • Die Hybridomzellinie, RAP-42-OVAF&sub2;#1hc, wurde gemäß den Bestimmung des Budapest Vertrages bei der American Type Culture Colletion (ATCC) von 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852, USA, am 10. März, 1994 hinterlegt, und erhielt die Accessionnumber HB 11568.
    • Beispiel 1 Rapamycin 42-Ester mit Bernsteinsäure
  • 1,1 g (11 mmol) von Bernsteinanhydrid und 400 mg Dimethylaminopyridin (DMAP) wurden zu einer gerührten Lösung von 5 g (5,5 mmol) Rapamycin und 880 ul Pyridin in 15 ml Methylenchlorid hinzugefügt. Die Reaktionmischung wurde 2 Tage bei Raumtemperatur gerührt, mit Methylenchlorid verdünnt und mit drei 50 ml Anteilen 1 N HCl gewaschen. Die organische Schicht wurde dann über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und in vakuo konzentriert, um das rohe Produkt zu ergeben. Das reine Material wurde erzielt duch reverse Phase HPLC mit 55% Acetonitril/Wasser als Laufmittel, um 1 g (18%) der Titelverbindung zu ergeben. Die Spektraldaten folgen:
  • ¹H NMR (CDCl&sub3;, 300 MHz) 4.650 (m, 1H, H&sub2;COC=O), 4.168 (d, 1H, H&sub2;COH), 2.795 (s, 4H, OC=OCH&sub2;CH&sub2;C=O).
    • Beispiel 2 Rapamycin 42-Ester mit (N-Hydroxysuccinimid(hemisuccinat))
  • 21 mg (0,098 mmol) DCC und 12 mg (0,098 mmol) N- Hydroxysuccinimid wurden zu einer gerührten Lösung von 100 mg Rapamycin 42-Ester mit Bernsteinsäure in 3 ml Ethylacetat hinzugefügt. Die Reaktionmischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, gefiltert, und in vakuo konzentriert um das rohe Produkt zu ergeben. Das reine Material wurde erzielt durch reverse Phase HPLC mit 80% Acetonitril/Wasser als Laufmittel und ergab 75 mg (69%) der Titelverbindung. Die Spektraldaten folgen: ¹H NMR (CDCl&sub3;, 300 MHz) 4.650 (m, 1H, H&sub2;COC=O), 4.168 (d, 1H, H&sub2;COH), 2.951 (m, 2H, OC=OCH&sub2;), 2.795 (m, 4H, OC=OCH&sub2;CH&sub2;C=O), 2.705 (m, 2H, OC=OCH&sub2;); MS (neg.ion FAB) 1110 (M&supmin;), 1056, 1012, 913, 148 (100).
    • Beispiel 3 Rapamycin 42-Ester mit Bernsteinkonjugat mit Ovalbumin
  • 197 mg Ovalbumin in 6 ml 0,05 M Phosphatpuffer wurde zu einer gerührten Lösung von 37 mg Rapamycin 42-Ester mit (N- Hydroxysuccinimid-(hemisuccinat)) in 3 ml 1,4 Dioxan hinzugefügt und die Reaktion wurde weiter für 3 Tage bei 4ºC gerührt. Die Reaktionmischung wurde dann 24 Stunden lang bei 4ºC in 1500 ml 0,05 M Phophatpuffer dialysiert, um die Titelverbindung zu ergeben, welche ohne weitere Reinigung verwendet werden konnte.
    • Beispiel 4 Rapamycin 31,42 Diester mit Glutarsäure
  • Die Titelverbindung wurde hergestellt gemäß dem Verfahren, welches in Beispiel 1 verwendet wurde.
    • Beispiel 5 Rapamycin 31,42-Diester mit (N-Hydroxysuccinimid(hemiglutarat))
  • Zu einer Lösung von 15,9 mg Rapamycin 31,42-Diester mit Glutarsäure in 160 ul Dimethylformamid wurden 3,65 mg N,N- Dimethylaminopropylethylcarbodiimid und 1,8 mg N- Hydroxysuccinimid hinzugefügt. Die Reaktionmischung wurde weiter gerührt bis die Reaktion abgeschlossen war, in Wasser gegossen und mit Methylacetat extrahiert. Die organischen Schichten wurden kombiniert, über Natriumsulfat getrocknet, gefiltert und in vakuo konzentriert, um die Titelverbindung zu ergeben, welche bei 4ºC in 0,1 N Natriumphosphatpuffer gelagert wurde, und welche ohne weitere Reinigung verwendet wurde.
    • Beispiel 6 Rapamycin 31,42-Diester mit Glutarsäurekonjugat mit Keyholelimpet-hämocyanin
  • Zu 20 mg Keyhole-limpet-hämocyanin in 2 ml 0,1 M NaHCO&sub3; wurde 55 ul Rapamycin 31,42-Diester mit (N- Hydroxysuccinimid(hemiglutarat)) bei 0ºC in 10u1 Anteilen über einen 30 minütigen Zeitraum hinzugefügt. Die Lösung wurde leicht geschüttelt, bis die Reaktion abgelaufen war, bei 6000 rpm 20 Minuten lang zentrifugiert, und das unkonjugierte Ausgangsmaterial wurde von der Titelverbindung auf einer G-25 Säule mit Phosphatpufferlösung getrennt. Das Konjugat wurde mit 50% Glycerin gemischt und bei -70ºC gelagert. Die Menge von Rapamycin 31,42-Diester mit Gluratsäureanteilen pro Keyholelimpethemocyanin lag im Bereich von 17-45 : 1.
    • Beispiel 7 Rapamycin 31,42-Diester mit Glutarsäurekonjugat mit Meerrettichperoxidase
  • Zu 10 mg Meerrettichperoxidase in 1 ml 0,1 M NaHCO&sub3; wurden 105 ul Rapamycin 31,42-Diester mit (N- Hydroxysuccinimid(hemiglutarat)) in 10 ul Anteilen über einen 30 minütigen Zeitraum hinzugefügt. Die Lösung wurde leicht geschüttelt bis sie vollständig war, bei 6000 rpm für 20 Minuten zentrifugiert, und von einer G-25 Säule mit Phosphatpufferlösung eluiert. Das Konjugat wurde mit 50%Glycerin gemischt und bei -20ºC gelagert.
    • Beispiel 8 Rapamycin 42-Ester mit Glycylbiotin
  • Zu einer Lösung von Biotin (0,83 g, 3,4 mmol) in 60 ml DMF wurde Glycin t-Butylesterhydrochlorid (0,57 g, 3,4 mmol), N- Methylmorpholin (0,92 ml, 8,36 mmol), 1-Hydroxybenzotriazol (0,61 g, 3,99 mmol) und 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid (0,65 g, 3,4 mmol) hinzugefügt. Die Reaktionmischung wurde bei Raumtemperatur für 7 Tage gerührt.
  • Das DMF wurde konzentriert, Ethylacetat wurde hinzugefügt und die organische Schicht wurde mit Wasser, 0,5 N HCl, gesättigtem Natriumbicarbonat und Kochsalzlösung gewaschen. Die Ethylacetatschicht wurde getrocknet (MgSO&sub4;) und konzentriert um tert-Butylglycylbiotin als einen weißen Feststoff zu ergeben, welcher im wesentlichen ein Spot auf der TLC (Dünnschichtchromatographie) (0,611 g, 1,71 mmol, 50%) war. Massenspektrum [M + H]&spplus; bei m/z 358.
  • Zu einer Lösung von tert-Butylglycylbiotin (0,271 g, 0,758 mmol) in CH&sub2;Cl&sub2; (0,5 ml) wurden 0,5 ml Trifluoressigsäure hinzugefügt. Die Reaktionmischung wurde bei Raumtemperatur für 2 Stunden gerührt, konzentriert, und mit wasserfreiem Diethylether titriert. Der überweiße Niederschlag wurde gesammelt, um 0,209 g (0,694 mmol, 92%) Glycylbiotin zu erzielen. Massenspektrum [M + H]&spplus; bei m/z 302.
  • Zu einer Lösung von Glycylbiotin (0,65 g, 2,16 mmol) in 1- Methylpyrrolidinon (5 ml) wurden 6 ml CH&sub2;Cl&sub2; hinzugefügt, was die Bildung eines Niederschlages bewirkte, welcher zurückblieb, selbst nach dem Zusatz von 0,33 ml (2,36 mmol) Triethylamin. Zu dieser heterogenen Lösung wurden 2 g (2,19 mmol) Rapamycin, 0,43 g (2,24 mmol) 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3- ethylcarbodiimidhydrochlorid und 30 mg (2,46 mmol) DMAP hinzugefügt. Nach mehreren Stunden wurde die Reaktionmischung homogen und wurde für weitere vier Tage gerührt. Ein großer Überschuß von Ethylacetat wurde hinzugefügt und die organische Schicht wurde mit Wasser, 0,5 N HCl, gesättigtem Natriumbicarbonat und Kochsalzlösung gewaschen. Die organische Schicht wurde getrocknet (MgSO&sub4;), und konzentriert. Der schwach gelbe Schaum wurde mit heißem wasserfreiem Diethylether titriert, um 1,2 g unreiner Titelverbindung als einen schwach gelben Feststoff zu ergeben. Ein Anteil (0,5 g) dieses Materials wurde in 5% MeOH/CHCl&sub3; blitzchromatographiert und erneut in heißem Ether titriert, um 87 mg der Titelverbindung zu ergeben, welche mit einer kleinen Menge Rapamycin kontaminiert war. Dieses Material wurde erneut chromatographiert (Gradient 0-5% MeOH/CHCl&sub3;) und ein letztes Mal mit Ether titriert, um 34 mg (0,028 mmol) der reinen Titelverbindung als einen weißen Feststoff zu ergeben. Massenspektrum, negativ FAB M&supmin; bei m/z 1196.
    • Beispiel 9 Rpamycin-42-ester mit Bernsteinsäurekonjugat mit 5- Glycinylfluoresceinamin
  • Zu 4,2 mg 5-Glycinylfluoresceinamin aufgelöst in 200 ml Methanol, welches 10 ul Triethylamin enthielt, wurden 4 mg der Verbindung aus Beispiel 2 hinzugefügt. Nach 2 Stunden wurde ein Anteil der Mischung auf eine Silicadünnschichtchromatographieplatte aufgebracht und mit 100 Teilen Chloroform, 10 Teilen Methanol und 1 Teil Essigsäure entwickelt. Nach dem Trocknen wurde das Band, welches das Produkt enthielt, von der Platte abgekratzt, und das Produkt aus dem Silica mit dem Methanol ausgewaschen. Das Produkt wurde charakterisiert über die Veränderung der Fluoreszenzpolarisation einer wässerigen Lösung bei Zuatz von FKBP12.
    • Beispiel 10 Secorapamycin 42-Ester mit Bernsteinsäurekonjugat mit 5- Glycinylfluoresceinamin
  • Ein Anteil des Produktes aus Beispiel 9 wurde aufgebracht auf eine Silicadünnschichtchromatographieplatte und mit einer Mischung von 50 Anteilen Chloroform, 4 Teilen Methanol und 0,5 Teilen Essigsäure eluiert. Drei bewegliche Fluoreszenzbanden wurden beobachtet, wobei das unveränderte Ausgangsmaterial den höchsten rf Wert hatte und die Titelverbindung den niedrigsten rf Wert hatte. Das Silica, welches das gewünschte Produkt enthielt, wurde von der Platte abgekratzt und die Titelverbindung wurde mit Methanol eluiert. Das Produkt wurde charakterisiert durch die Veränderung der Fluoreszenzpolarisation einer wässerigen Lösung bei Zusatz von RAP-42-OVAF2#1 MoAb.

Claims (9)

1. Ein monoklonaler Antikörper, der spezifisch an ein ringgeöffnetes Rapamycin bindet, der bezeichnet ist als RAP-42- OVAF&sub2;#1MoAb.
2. Der monoklonale Antikörper gemäß Anspruch 1, worin das ringgeöffnete Rapamycin Secorapamycin ist.
3. Ein Testkit, das den Antikörper gemäß Anspruch 1 zum Bestimmen von Leveln von einem ringgeöffneten Rapamycin oder einem Derivat davon verwendet.
4. Ein Verfahren zum Trennen einer Mischung aus einem ringgeöffneten Rapamycin oder einem Derivat davon von Rapamycin oder einem Derivat davon, das das Behandeln der Mischung mit dem Antikörper gemäß Anspruch 1 umfaßt, der an eine feste Matrix gebunden ist, und die Elution des ungebundenen Rapamycins von dem gebundenen offenkettigen Rapamycin-Antikörper-feste Matrix- Komplex.
5. Ein Verfahren zum Trennen einer Mischung aus einem ringgeöffneten Rapamycin oder einem Derivat davon von Rapamycin oder einem Derivat davon, das das Behandeln der Mischung mit dem Antikörper gemäß Anspruch 1 umfaßt, wobei der ringgeöffnete Rapamycin-Antikörper-Komplex mit einem festen Träger eingefangen wird, und die Elution des ungebundenen Rapamycins von dem offenkettigen Rapamycin-Antikörper-feste Matrix-Komplex.
6. Ein Verfahren zum Trennen einer Mischung aus einem ringgeöffneten Rapamycin oder einem Derivat davon von Rapamycin oder einem Derivat davon, das das Behandeln der Mischung mit dem Antikörper gemäß Anspruch 1, gefolgt von anti-Maus-Immunglobulin umfaßt, und Entfernen des ausgefallenen ringgeöffneten Rapamycin-Antikörper-anti-Maus-Immunglobulin-Komplexes.
7. Das Verfahren gemäß Anspruch 6, worin das anti-Maus- Immunglobulin Kanichen-, Maus-, Ratten-, Schaf- oder Ziegenanti-Maus-Immunglobulin ist.
8. Ein Verfahren zum Trennen einer Mischung aus einem ringgeöffneten Rapamycin oder einem Derivat davon von Rapamycin oder einem Derivat davon, das das Behandeln der Mischung mit dem Antikörper gemäß Anspruch 1, gefolgt von Protein A oder G umfaßt, und Entfernen des ausgefallenen ringgeöffneten Rapamycin-Antikörper-Protein A oder G Komplexes.
9. Eine Hybridomzellinie, die in der Lage ist, Antikörper zu produzieren, die spezifisch an ein ringgeöffnetes Rapamycin binden, die bezeichnet ist als RAP-42-OVAF&sub2;#1hc.
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