DE69428763T2

DE69428763T2 - Monoklonale Antikörper gegen Ganglioside und deren Verwendung in der spezifischen, aktiven Immuntherapie gegen bösartige Tumoren

Info

Publication number: DE69428763T2
Application number: DE69428763T
Authority: DE
Inventors: Amparo E. Macias Abraham; Angel Mauro Alfonso Fernandez; Maria Eliana Lanio Ruiz; Ana Maria Vazquez Lopez; Rolando Perez Rodriguez; Carlos Manuel Alvarez Valcarcel
Original assignee: Centro de Immunologia Molecular
Current assignee: Centro de Immunologia Molecular
Priority date: 1993-12-09
Filing date: 1994-12-08
Publication date: 2002-08-01
Anticipated expiration: 2014-12-09
Also published as: CA2137638C; JP3003976B2; EP0657471B1; CA2137638A1; ES2166770T3; US5817513A; DE69428763D1; JPH08163984A; EP0657471A1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Immunologie, insbesondere die Erzeugung und Auswahl von monoklonalen Antikörpern (mAbs) gegen Ganglioside (Ab1s), wobei die Antikörper spezifisch sind, wiederkehrende Idiotypen aufweisen und wertvolle Immunoregulatoren der Immunantwort gegen diese Antigene darstellen. Ferner betrifft die Erfindung die Gewinnung von antiidiotypischen mAbs (Ab2s), die durch Immunisierung mit den anti-Gangliosid-mAbs erzeugt worden sind.

Beschreibung des Stands der Technik

Ganglioside sind Glycosphingolipide, die Sialinsäure enthalten und die von einem überwiegenden Teil von Säugetier- Zellmembranen exprimiert werden. Obgleich diese Antigene in normalen Geweben vorhanden sind, lassen sie sich in einer unterschiedlichen Organisation und Konformation in größeren Mengen auf der Oberfläche von malignen Zellen finden und werden dort exprimiert (S. Hakomori, Cancer Res., Bd. 45 (1985), S. 2405-2414; F. Miraldi, Seminars in Nuclear Medicine, XIX (1989), S. 282-294; Hamilton et al., Int. J. Cancer, Bd. 53 (1993), S. 1-8).
Einige mAbs sind dazu befähigt, Ganglioside nur dann zu erkennen, wenn sie in hoher Dichte auf der Zelloberfläche vorliegen, z. B. mAbs gegen GM3 (G.A. Nores et al., J. Immunol., Bd. 139 (1987), S. 3171-3176; I. Dohi et al., Cancer Res., Bd. 48 (1988), S. 5680-5685).
Normale Gewebe von Erwachsenen enthalten nur NeuAc und nicht NeuGc enthaltende Ganglioside.
Von einigen humanen Tumoren, einschließlich Melanomen, Kolorektalkrebs, Retinoblastom und nicht-seminale Keimzelltumoren, wurde berichtet, dass sie N- Glycolylneuraminsäure enthaltende Ganglioside aufweisen, die aber weniger als 0,05% des gesamten Sialinsäuregehalts ausmachen (H. Higachi et al., Jpn. J. Cancer Res. (Gann), Bd. 75 (1984), S. 1025-1029; H. Higachi et al., Cancer Res., Bd. 45 (1985), S. 3796-3802; I. Hirabayashi et al., Jpn. J. Cancer Res. (Gann), Bd. 78 (1987), S. 1614-1620; H. Higachi et al., Jpn. J. Cancer Res. (Gann), Bd. 79 (1988), S. 952- 956; M. Miyake et al., Cancer, Bd. 65 (1990), S. 499-505).
Andere Autoren haben gezeigt, dass humane mAbs gegen diese Antigene keine der untersuchten kolorektalen Tumoren oder Melanome erkannten (K. Furukawa et al., J. Biol. Chem., Bd. 265 (1988), S. 18507-18512).
Untersuchungen über den Gangliosidgehalt in Brusttumoren haben gezeigt, dass NeuGc enthaltende Ganglioside etwa 5-11% des gesamten Gangliosidgehalts ausmachen.
Ganglioside sind keine guten Immunogene. Um eine Immunantwort hervorzurufen, müssen sie an Proteine gekuppelt oder Liposomen oder dem Salmonella minnesota R595-Stamm einverleibt sein. Ein charakteristisches Merkmal der Antikörperantwort dieser Antigene besteht darin, dass es sich bei der erzeugten Immunoglobulinklasse vorwiegend um IgM handelt.
Obgleich IgG-anti-Gangliosid-Antikörper sich in Menschen und Mäusen finden lassen, scheint die T-Zellkooperation nicht spezifisch zu sein und durch das Adjuvans induziert zu werden. Somit ist die erzeugte Antikörperantwort nach jeder Immunisierung nur kurzlebig und von geringer Affinität (P. O. Livingston, Immunology and Allergy Clinics of North America, Bd. 11 (1991), S. 401-425; J. Portoukalian et al., Int. J. Cancer, Bd. 49 (1991), S. 893-899), eine typische Antwort gegen von T-Zellen unabhängige Antigene (P. O. Livingston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 84 (1982), S. 2911-2915; T. Tai et al., Int. J. Cancer, Bd. 35 (1985), S. 607-612; P. O. Livingston et al., Cancer Res., Bd. 49 (1989), S. 7045- 7050).
Es wurden unterschiedliche Mäuse-anti-Gangliosid-mAbs und humane mAbs gegen GD3, GM2 und GD2 erhalten. Die meisten davon gehören zur IgM- und IgG3-Unterklasse (C. S. Pukel et al., J. Exp. Med., Bd. 155 (1982), S. 1133-1147; L. D. Cahan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 79 (1982), S. 7629- 7633; R. F. Irie et al., Bd. 79 (1982), S. 5666-5670; T. Tai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 80 (1983), S. 5392- 5396; Y. Hirabayashi et al., J. Biol. Chem., Bd. 260 (1985), S. 13328-13333; N. K. V. Cheung et al., Cancer Res., Bd. 45 (1985), S. 2642; E. J. Natoli et al., Cancer Res., Bd. 46 (1986), S. 4116-4120; R. Reisfeld und G. Schulz, WO 86/00909 (1986); M. Miyake et al., Cancer Res., Bd. 48 (1988), S. 6154-6160; I. Kawashima et al., Int. J. Cancer, Bd. 41 (1988), S. 267-274; T. Tai et al., Biochimica et Biophysica Acta, Bd. 958 (1988), S. 134-138; T. Tai et al., J. Biochem., Bd. 103 (1988), S. 682-687; S. Yamamoto et al., J. Natl. Cancer Inst., Bd. 82 (1990), S. 1757-1760; M. Yamasaki, US- 4 965 198 (1990); I. Kawashima et al., Molecular Immunology, Bd. 29 (1992), S. 625-632; und M. Kotani et al., Biochimica et Biophysica Acta, Bd. 1117 (1992), S. 97-103).
Bisher wurden Mäuse-anti-Gangliosid-mAbs aufgrund ihrer Spezifität und Unterklasse für die passive Tumorimmunotherapie ausgewählt.
IgG3-Mäuse-mAbs gegen GD3- und GD2-Ganglioside wurden in klinischen Versuchen zur Behandlung von Melanom- bzw. Neuroblastom-Patienten eingesetzt. Obgleich die Ergebnisse erfolgversprechend waren, wurden nur bei einer geringen Anzahl von Patienten totale oder partielle Remissionen erzielt (A. N. Houghton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 82 (1985), S. 1242; W. G. Dippold et al., Eur. J. Cancer Clin. Oncol., Bd. 24 (1988), S. 865; S. Vadhan-Raj et al., J. Clin. Oncol., Bd. 6 (1988), S. 1636; M. N. Saleh et al., Cancer Res., Bd. 52 (1992), S. 4332-4347).
Die immunomodulierenden Eigenschaften von spezifischen anti-Gangliosid-mAbs (Selbstantigen, T-unabhängige Selbstantigene) wurden nicht untersucht. Somit wurde dieser Sachverhalt bei der Auswahl der Antikörper für die Tumorimmunotherapie nicht in Betracht gezogen.
Selbsterkennungsereignisse sind bei den Mechanismen, die die Immunantwort regulieren, beteiligt. Die meisten dieser Ereignisse werden durch die Erkennung von Antikörper- und Lymphozyt-Idiotypen vermittelt.
So wird die Erkennung von Selbstantigenen durch ein dynamisches Gleichgewicht des idiotypischen Netzwerkes reguliert (D. H. Katz, Cell-Cell Recognition, A. S. G. Curtis Hrsg., Cambridge University Press, Cambridge, (1978), S. 4111; M. Zenetti, Immunology Today, Bd. 6 (1985), S. 299; A. C. Martinez et al., Immunological Reviews, Bd. 101 (1988), S. 191-215).
Die Untersuchung von natürlichen Antikörpern und ihrer Wechselwirkungen hat zu der Erkenntnis geführt, dass ein hochgradig verbundenes und weit verteiltes, variable Regionen umfassendes Netzwerk vorliegt. Dieses Netzwerk unterscheidet sich von der antigengesteuerten "idiotypischen Kaskade" (M. D. Kazatchkine und A. Coutinho (1993)), die die Basis des klassischen beta-anti-idiotypischen Vakzinkonzeptes darstellt (internes Bild).
Beta-anti-idiotypische mAbs gegen anti-Gangliosid-mAbs wurden erzeugt (US-Patent 5 208 146; Yamamoto et al., J. of the National Cancer Institute, Bd. 82 (1990), S. 1757-1760; P. B. Chapman und A. N. Houghton, J. Clin. Invest., Bd. 88 (1991), S. 186-192, um zur aktiven Tumorimmunotherapie eingesetzt zu werden.
Dennoch wurde berichtet, dass die Auswahl von antiidiotypischen mAbs auf der Grundlage nur der internen Bildeigenschaften des Antigens für die Immunotherapie nicht angemessen ist. Die Auswahl von Antiidiotypen auf der Grundlage der Korrelation der Konzentrationen eines Idiotyps mit der Progression oder Regression der Krankheit ist für die Konzeption einer angemessenen antiidiotypischen Immunotherapie von Bedeutung (H. Kohler, WO 89/05309 (1989)).
Antiidiotypische Antikörper gegen mit humanem Melanom assoziiertes Proteoglycan-Antigen werden in WO 92/16646 beschrieben.
Bei verschiedenen Antigenmodellen wurde die regulatorische Rolle bestimmter Idiotope, die auf Antikörpern gegen Haptene und Selbstantigene vorhanden sind, nachgewiesen. Diese weisen in Abwesenheit des spezifischen Antigens die Eigenschaft auf, dass sie sowohl das B-Zell- als auch das T-Zellnetzwerk aktivieren, indem sie als Immunosuppressoren oder Stimulatoren der Antigenantwort in Abhängigkeit von der T-Zellpopulation, die sie stimulieren, wirken (D. Teitelbaum et al., J. Immunology, Bd. 132 (1984), S. 1282-1285; M. Zanetti et al., J. Immunology, Bd. 137 (1986), S. 3140-3146; T. J. Powell et al., J. Immunology, Bd. 140 (1988), S. 3266-3272; J. G. Baskin, J. Immunology, Bd. 145 (1990), S. 202-208; A. Furuya et al., Anticancer Res., Bd. 12 (1992), S. 27-32).
Bei den sogenannten wiederkehrenden Idiotypen handelt es sich um Produkte, die zur Aktivierung des gesamten idiotypischen Netzwerkkreises unter Erzeugung einer Antikörperantwort in Abwesenheit des Antigens befähigt sind. Es wurde der Hinweis gegeben, dass diese Idiotypen zur Stimulation der T-Helferzellen befähigt sind (F. Ivars et al., Scand. J. Immunol., Bd. 17 (1983), S. 231-240; L. Forni et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 77 (1980), S. 1125- 1128; D. Holmberg et al., Immunobiol., Bd. 162 (1982), S. 56- 65).
Die vorliegende Erfindung stellt einen neuen Sachverhalt in bezug auf die Erzeugung und Auswahl von spezifischen anti- Gangliosid-Antikörpern bereit, die Idiotypen tragen, die zur Stimulation der Immunantwort gegen diese Antigene befähigt sind (wiederkehrende Idiotypen). Diese können bei der spezifischen aktiven Immunotherapie von Patienten mit Tumoren, die diese Ganglioside exprimieren, und bei der Erzeugung von antiidiotypischen mAbs gegen diese Anti- Gangliosid-mAbs mit den vorerwähnten Eigenschaften verwendet werden.

Zusammenfassende Darstellung

Monoklonale anti-Gangliosid-Antikörper und ihre Verwendung bei der spezifischen aktiven Immunotherapie von malignen Tumoren.

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Immunologie, insbesondere die Erzeugung und Auswahl von monoklonalen Antikörpern (mAbs) gegen Ganglioside (Ab1s), wobei die Antikörper spezifisch sind, wiederkehrende Idiotypen aufweisen und wertvolle Immunoregulatoren der Immunantwort gegen diese Antigene darstellen. Ferner betrifft die Erfindung die Gewinnung von antiidiotypischen mAbs (Ab2s), die durch Immunisierung mit diesen anti-Gangliosid- mAbs erzeugt worden sind.
Demgemäss ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung anti-Gangliosid-mAbs (Ab1s) mit Idiotypen, die zur Induktion einer antigenspezifischen Antwort (Ab1') in Abwesenheit des Antigens befähigt sind, sowie Verfahren zu ihrer Erzeugung bereitzustellen.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, antiidiotypische mAbs (Ab2s), die durch Immunisierung mit anti-GangliosidmAbs, die die vorerwähnten Eigenschaften aufweisen, erzeugt worden sind und ebenfalls zur Bildung einer (Ab1')-Antwort befähigt sind, bereitzustellen.
Ein wichtiges Ziel der Erfindung umfasst die Erzeugung von spezifischen anti-Gangliosid-mAbs (Ab1), das Immunisieren von Mäusen und anderen Spezies mit diesen Antikörpern und die Auswahl von Antikörpern, die zur Erzeugung einer antigenspezifischen Antwort (Ab1') befähigt sind; sowie die Erzeugung von antiidiotypischen mAbs durch Immunisieren von Mäusen oder anderen Tierspezies mit den vorerwähnten anti- Gangliosid-mAbs.
Es ist darauf hinzuweisen, dass der hier verwendete Ausdruck "Antikörper" auch Fragmente, Derivate und dergl., die ähnliche Antigen-Bindungseigenschaften aufweisen, umfasst. Aus dem Stand der Technik sind zahlreiche Möglichkeiten zur Gewinnung von Derivaten und/oder Fragmenten bekannt.
Möglichkeiten zur Erzeugung von Derivaten und/oder Fragmenten umfassen (ohne Beschränkung hierauf) die chemische Spaltung und/oder das (erneute) Zusammensetzen, die rekombinante Bildung von einzelkettigen Antikörpern und/oder molekularen Erkennungseinheiten (MRUs), die CDR-Pfropfung, Klassenumwandlung (class switches) und dergl.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Isolierung von Gangliosiden

Ganglioside wurden aus bekannten natürlichen Quellen nach einer Modifikation der Hakomori-Technik erhalten (S. Hakomori et al., Methods in Enzymology, Bd. 32, Teil B (1974), S. 350).

Herstellung von liposomalen Vesikeln

Liposomale Strukturen mit einem Gehalt an Gangliosiden wurden aus DDPC und Cholesterin hergestellt.
Bekannte Mengen von DDPC und Cholesterin in einer Chloroformlösung wurden in einen Rundkolben gegeben, wobei auf ein Molverhältnis von Phospholipid zu Cholesterin von 1 : 1,5 bis 1 : 2 geachtet wurde.
Gangliosid in Lösung in Chloroform/Methanol/H&sub2;O (60 : 30 : 4,5) wurde zugesetzt. Das Lipidgemisch wurde in Gegenwart von Glaskügelchen am Rotationsverdampfer eingedampft.
Nach Entfernung des Großteils der Lösungsmittel wurde der feine Lipidfilm etwa 30 Minuten unter Vakuum belassen.
Eine Lipid-Hydratisierung wurde in einer PBS-Lösung in einem Volumen, das eine Lipidkonzentration von 2 bis 10 mg/ml ermöglichte, durchgeführt.
Im fertigen Präparat wurde ein Verhältnis von DDPC und Cholesterin zu Gangliosid von 40 : 1 bis 20 : 1 (Mol/Mol) eingehalten.
In den liposomalen Präparaten mit einem Gehalt an toxoidem Tetanus-Toxin wurde das letztgenannte Präparat in Endkonzentrationen von 0,5-1 mg/ml zugesetzt.
Die Suspension wurde für Zeitspannen von 5 bis 10 Minuten in einem Ultraschallbad unter Einhaltung von Pausen von 1 Minute behandelt. Das liposomale Präparat wurde 30 bis 60 Minuten unter fortgesetztem Rühren bei 45ºC inkubiert.
Gegebenenfalls wurde das nicht-verkapselte Protein durch Gelfiltration unter Verwendung einer SepharoseR-Säule CL-4B der Abmessungen 1 · 65 cm bei einer Fließgeschwindigkeit von etwa 20 cm/h entfernt.
Die Elution wurde in PBS durchgeführt. Fraktionen von 1,5 ml wurden gesammelt.

Charakterisierung der liposomalen Präparate

a. Bewertung der Gangliosid-Immobilisierung in den liposomalen Vesikeln

Die Menge der Ganglioside in der liposomalen Membran wird unter Verwendung von 0,5-1 ml einer auf die vorstehend beschriebene Weise hergestellten liposomalen Suspension, die das mit ¹&sup4;C (1-2 uCi) markierte Gangliosid enthält und durch Durchführung der Gelfiltrationschromatographie mit SepharoseR 4B in einer 1,5 · 50 cm-Säule bei einer Fließgeschwindigkeit von 7 cm/h bestimmt. Die Elution wird in PBS durchgeführt. 1 ml-Fraktionen werden gesammelt.
Die Kontrolle der Absorptionsänderung zwischen 350 und 500 nm ermöglicht den Nachweis von Liposomen und Mizellen im chromatographischen Profil. Die Messung der cpm in den einzelnen Fraktionen ermöglicht die Bestimmung des prozentualen Anteils des im liposomalen Präparat gebundenen Gangliosids, der 20-80% beträgt.

b. Bestimmung des prozentualen Anteils von in der liposomalen Struktur verkapselten Proteinen

Unter Verwendung von 0,5-1 ml des nicht-zentrifugierten liposomalen Präparats, das das mit ¹²&sup5;I (1-2 uCi) markierte Protein enthält, wird eine Gelfiltrationschromatographie mit SephadexR G-50 in einer 1,5 · 50 cm-Säule bei einer Fließgeschwindigkeit von etwa 7 cm/h durchgeführt.
Die Elution wird mit PBS durchgeführt. Fraktionen von 1 ml werden gesammelt.
Die Bestimmung der Trübung und die cpm-Werte der einzelnen Fraktionen ermöglichen den Nachweis der Anwesenheit der liposomalen Vesikel und die Bestimmung des prozentualen Anteils an verkapseltem Protein in diesen Strukturen. Die Menge des verkapselten Proteins liegt immer unter 10%.

Immunisierungsverfahren zur Erzeugung einer Antikörperantwort (Ab1) gegen Ganglioside

Mäuse und andere Säugetierspezies werden mit liposomalen Präparaten mit einem Gehalt an 20 bis 50 ug Gangliosiden pro Dosis immunisiert. Bei Präparaten mit einem Gehalt an Proteinen werden ebenfalls 5-10 ug/Dosis zugegeben. Vor und während der Immunisierungsperiode werden den Tieren Blutserumproben entnommen, um die in diesen Tieren gegen die Ganglioside, die als Antigene verwendet werden, erzeugten Antikörpertiter nach einem bekannten Immunoassay-Verfahren unter Nachweis der Antigen-Antikörper-Reaktion zu überwachen.
Drei Tage vor der ersten Immunisierungsdosis erhielten die Tiere niedrige Dosen an Cyclophosphamid (15 mg/kg Körpergewicht des Tiers), um die Aktivität der Suppressorzellen zu verringern (P. O. Livingston et al., J. Immunol., Bd. 131 (1987), S. 2601; D. S. B. Hoo et al. (Cancer Res., Bd. 50 (1990), S. 5358-5354).
Die Tiere lassen sich mit verschiedenen Dosen des liposomalen Präparats in Abständen von 3-4 Tagen und 1 Woche immunisieren.
Liposomale Präparate werden subkutan in einem Volumen von 0,1-0,2 ml verabreicht. Weitere mögliche Immunisierungswege sind die intravenöse und intraperitoneale Verabreichung.
Tiere, die 5 bis 9 akkumulative Dosen der liposomalen Präparate in kurzzeitigen Abständen erhalten, entwickeln eine Antikörperantwort auf das als Antigen verwendeten Gangliosid.

Herstellung von spezifischen monoklonalen anti- Gangliosid-Antikörpern (mAbs)

Mäuse mit Serum-Antikörpertitern gegen Ganglioside erhalten 3 Tage vor Gewinnung der Antikörper erzeugenden Zellen eine neue Immunisierung mit den liposomalen Präparaten. Vorzugsweise sind Milzzellen zu verwenden, obgleich auch andere, Antikörper erzeugende Zellen ausgewählt werden können.
Diese Zellen werden mit den Myelomzellen, die den Hybridzellen oder Hybridomen die Fähigkeit zur in vitro- und in vivo-Reproduktion verleihen, verschmolzen. Die Zellfusion kann nach beliebigen bekannten Verfahren durchgeführt werden.
Die durch die Hybridome erzeugten Antikörper werden durch Immunoassayverfahren getestet, vorzugsweise durch einen enzymatischen Immunoassay, bei dem die Hybridom-Überstände mit den Gangliosiden reagieren und die Antigen-Antikörper- Bindung unter Verwendung eines zweiten, enzymmarkierten Antikörpers, der zur Bindung des Antikörpers unter geeigneten Bedingungen befähigt ist, nachgewiesen wird.
Nachdem das gewünschte Hybridom ausgewählt und mindestens 2-mal geklont worden ist (d. h. Grenzverdünnung) kann der gebildete mAb in vitro in einem geeigneten Medium während einer geeigneten Zeitdauer erzeugt werden, wonach die Gewinnung des gewünschten Antikörpers aus dem Überstand erfolgt.
Das gewählte Medium und die geeignete Züchtungsdauer sind bekannt oder lassen sich leicht ermitteln.
Ein weiteres Herstellungsverfahren umfasst die Injektion des Hybridoms in Tiere (d. h. in syngene Mäuse). Die Hybridome verursachen die Bildung von nicht-festen Tumoren, die eine hohe Konzentration des gewünschten Antikörpers in der Blutbahn und im peritonealen Exsudat (Aszites) des Wirtstieres erzeugen.
Die erhaltenen mAbs weisen verschiedene Spezifitäten auf verschiedene Ganglioside auf.

Immunisierungsverfahren zur Erzielung einer antiidiotypischen (Ab2) und anti-antiidiotypischen (Ab1') Antikörperantwort auf anti-Gangliosid-mAbs

Mäuse und andere Säugetierspezies werden mit Dosen von 25-200 ug gereinigten anti-Gangliosid-mAbs mit oder ohne Adjuvans und gegebenenfalls unter Kupplung an ein Transportprotein immunisiert.
Die Tiere erhalten 3-6 Dosen der anti-Gangliosid-mAbs, wobei Abstände von 15 bis 30 Tagen zwischen den Dosen eingehalten werden. Mögliche Immunisierungswege sind die intraperitoneale, subkutane und/oder endovenöse Verabreichung.
Vor und während der Immunisierungsperiode werden den Tieren Blutserumproben entnommen. Die Ab2- und Ab1'- Antikörperantworten (Konzentrationen) werden nach bekannten Immunoassayverfahren bestimmt. Verdünnungen des tierischen Serums werden mit dem als Immunogen verwendeten anti- Gangliosid-mAb oder anderen anti-Gangliosid-mAbs, die nicht beim Immunisierungsverfahren verwendet worden sind, oder den Gangliosiden inkubiert.
Ferner wurden Versuche durchgeführt, um die Kapazität des Serums der immunisierten Tiere zur Blockierung der Bindung des als Immunogen verwendeten anti-Gangliosid-mAb an dessen Antigen zu bestimmen.
Dabei werden die spezifischen anti-Gangliosid-mAbs, die zur Bindung an das idiotypische Netzwerk, das eine antiidiotypische Antwort erzeugt (Ab2), und zur Bildung einer anti-antiidiotypischen Antikörperantwort (Ab1') in Abwesenheit des Antigens befähigt sind, ausgewählt. Mit anderen Worten, anti-Gangliosid-mAbs, die Idiotypen tragen, die zur Stimulation einer anti-Gangliosid-Immunantwort (wiederkehrende Idiotypen) befähigt sind, wurden ausgewählt.

Bildung von antiidiotypischen mAbs gegen anti- Gangliosid-mAbs, die wiederkehrende Idiotypen tragen

Mäuse mit hohen anti-Gangliosid-Ab2-Antikörpertitern erhalten eine Reimmunisierung mit dem als Immunogen verwendeten mAb drei Tage vor Gewinnung der Antikörper erzeugenden Zellen, die auf die vorstehend beschriebene Weise mit Myelomzellen zu fusionieren sind.
Nach dieser Fusion erhaltene Hybridom-Überstände werden nach beliebigen bekannten Immunoassayverfahren getestet. Die Überstände werden mit dem als Immunogen verwendeten mAb und mit anderen anti-Gangliosid-mAbs, die nicht bei den Immunisierungen verwendet worden sind, inkubiert. Die Fähigkeit des Hybridom-Überstands zum Blockieren der Bindung des als Immunogen verwendeten anti-Gangliosid-mAb an sein Antigen wird durch Inkubation der Überstände mit geeigneten Verdünnungen des anti-Gangliosid-mAb und anschließende Inkubation des Antikörpers mit einem Antigen bestimmt.
Die ausgewählten Hybridome werden mindestens 2-mal geklont. Die sich ergebenden mAbs werden in vitro und in vivo gemäß den vorstehenden Angaben erzeugt.
Die erhaltenen antiidiotypischen mAbs erkennen die anti- Gangliosid-mAbs und können gegebenenfalls (β-Typ) die Fähigkeit zum Blockieren der Bindung des anti-Gangliosid-mAb an sein Antigen besitzen.

Immunisierungsverfahren zur Erzielung einer Antikörperreaktion gegen Ganglioside unter Verwendung von antiidiotypischen mAbs vom α-Typ

Mäuse und andere Säugetiere werden mit α- antiidiotypischen mAbs immunisiert. Diese mAbs lassen sich vor der Verwendung als Immunogen an ein Transportprotein kuppeln.
Die einzelnen Tiere erhalten 3 bis 5 Dosen von 25-200 ug des α-antiidiotypischen mAb unter Einhaltung von Abständen von 15-30 Minuten zwischen den Dosen. Als Immunisierungswege kommt die intraperitoneale, subkutane und/oder endovenöse Verabreichung in Frage.
Blutproben der Tiere werden vor und während des Immunisierungsverfahrens entnommen. Die Serum-Antikörpertiter gegen verschiedene Ganglioside werden unter Verwendung bekannter Immunoassayverfahren überwacht.
Die Verabreichung von α-antiidiotypischen mAbs, die durch Immunisierung mit hochgradig mit dem idiotypischen Netzwerk verknüpften anti-Gangliosid-mAbs erzeugt worden sind, an Tiere kann eine Impfwirkung herbeiführen, die eine Antikörperantwort gegen die Ganglioside (Ab1') erzeugt.

Beispiel 1

Bildung einer Antikörperantwort (Ab1') gegen NeuAcGM2 durch ein atypisches Immunisierungsverfahren: kurzzeitige Abstände und akkumulative hohe Dosen

Weibliche Balb/c-Mäuse im Alter von 6 bis 8 Wochen erhielten eine intraperitoneale Injektion von Cyclophosphamid (15 mg/kg) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (P. O. Livingston et al., J. of Immunol., Bd. 131 (1983), S. 2601; D. S. B. Hoo et al., Cancer Res., Bd. 50 (1990), S. 5358). Drei Tage später wurden die Mäuse subkutan mit einem liposomalen Präparat mit einem Gehalt an 50 ug NeuAcGM2 in 0,2 ml PBS immunisiert.
Die Tiere erhielten 5 Dosen in Abständen von 3-4 Tagen und anschließend 4 zusätzliche wöchentliche Dosen, woraus sich eine akkumulative Gesamtdosis von 450 ug ergab. Serumproben der Tiere wurden vor Beginn der Immunisierung und 1 Woche nach der fünften und neunten Dosis gewonnen.
Der Antikörperspiegel im Mäuseserum wurde durch einen indirekten enzymatischen Immunoassay (ELISA) erfasst. Der Test wurde an mit Polyvinylchlorid aktivierten Platten (ICN- FLOW) mit immobilisiertem NeuAcGM2 gemäß dem folgenden Verfahren durchgeführt.
50 ul NeuAcGM2 in Methanol (4 ug/ml) wurden in jede Vertiefung gegeben. Das Methanol wurde abgedampft, indem man die Platten 1 Stunde bei 37ºC beließ. Anschließend wurden 150 ul/Vertiefung 0,05 M Tris-HCl-Puffer vom pH-Wert 7, 8 mit einem Gehalt an 1% Rinderserumalbumin (BSA) zugegeben. Die Platten wurden 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Sodann wurden 50 ul/Vertiefung in PBS verdünntes Serum zugesetzt. Die Platten wurden 90 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die Vertiefungen wurden 4-mal mit 200 ul PBS gewaschen. 50 ul alkalische Phosphatase-anti-Maus-Immunoglobulin-Konjugat- Antiserum, das in geeigneter Weise verdünnt worden war, wurden zugegeben. Nach Waschen mit PBS wurden die Vertiefungen mit 100 ul Substratpuffer (1 mg/ml p- Nitrophenylphosphat, verdünnt in Diethanolaminpuffer, pH-Wert 9,8) inkubiert. Die Absorption wurde bei 405 nm mit einem ELISA-Lesegerät gemessen.
Die Mäuse zeigten nach den ersten fünf Immunisierungsdosen keine Antikörperantwort auf NeuAcGM2. Es waren neun akkumulative immunogene Dosen erforderlich, um eine nachweisbare Antikörperantwort bei 50% der immunisierten Tiere zu erreichen (Fig. 1).

Beispiel 2

Bildung einer Antikörperantwort (Ab1') an NeuGcGM3

Weibliche Balb/c-Mäuse im Alter von 6 bis 8 Wochen erhielten eine intraperitoneale Injektion von Cyclophosphamid (15 mg/kg 3 Tage vor der ersten Immunisierung mit einem liposomalen Präparat mit einem Gehalt an 50 ug NeuGcGM3 und 5 ug Tetanus-Toxoid pro Dosis in einem Volumen von 0,2 ml.
Die Tiere erhielten 5 Dosen des immunogenen Präparats in Abständen von 3-4 Tagen, wonach sich zwei zusätzliche wöchentliche Dosen anschlossen. Serumproben der Tiere wurden vor und nach Beginn des Immunisierungsverfahrens gewonnen. Der Antikörperspiegel im Mäuseserum wurde gemäß Beispiel 1 erfasst.
Mäuse ohne natürliche Reaktion auf NeuGcGM3 erzeugten Antikörper gegen NeuGcGM3 nach Erhalt von verschiedenen Dosen des Immunogens (Fig. 2) bis zu einer akkumulativen Dosis von 350 ug.

Beispiel 3

Bildung von mAbs gegen NeuAc und NeuGc enthaltende Monosialoganglioside

Monoklonale Antikörper wurden durch Immunisieren von Balb/c-Mäusen gemäß dem in den Beispielen 1 und 2 beschriebenen Verfahren mit liposomalen Präparaten mit einem Gehalt an NeuAcGMl-, NeuAcGM2-, NeuAcGM3- und NeuGcGM3- Gangliosiden erzeugt.
Drei Tage vor der Fusion wurden die Tiere mit den entsprechenden liposomalen Präparaten reimmunisiert. Anschließend wurde die Mäusemilz entnommen und eine zelluläre Suspension hergestellt, indem man das Gewebe durch ein Sieb aus rostfreiem Stahl presste oder die Milz perfundierte.
Die Fusion wurde gemäß dem Verfahren von Kohler und Milstein (Nature (London), Bd. 256 (1975), S. 495-497) unter leichter Modifikation durchgeführt.
Mäuse-Milzzellen wurden mit den Zellen des nichtsezernierenden Mäuse-Myeloms P3/X63 Ag8 6.5.3, das von ACACC unter der Nr. 85011420 erhältlich ist, in einem Verhältnis von 10 : 1 in 0,5 ml Fusionsmedium mit einem Gehalt an 42% Polyethylenglykol in RPMI-1640-Medium fusioniert.
Anschließend wurden die Fusionszellen in einem selektiven HAT-Medium (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) bei 37ºC in einer feuchten, 5% CO&sub2; enthaltenden Atmosphäre gezüchtet.
10 bis 15 Tage nach der Fusion wurde eine Bewertung des Vorliegens von Antikörpern im Hybridom-Überstand unter Verwendung des vorstehend in Beispiel 1 beschriebenen ELISA- Verfahrens durchgeführt.
Ausgewählte Hybridome, die das in Frage stehende Gangliosid erkannten, wurden 2-mal durch das Grenzverdünnungsverfahren in Gegenwart von konditionierenden Zellen geklont.
Die Spezifität der durch die ausgewählten Hybridome gebildeten Antikörper wurde unter Verwendung einer Batterie von Glycolipiden durch einen indirekten ELISA-Test und durch eine Modifikation des von Magnani et al. (Anal. Biochem., Bd. 109 (1980), S. 399-402) beschriebenen Dünnschicht- Immunofärbungs-Chromatographieverfahrens bestimmt.
Glycolipide wurden durch Hochleistungs- Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Chloroform/Methanol/0,25% Kaliumchlorid (50/40/10, Vol./Vol./Vol.) als Chromatographielaufmittel getrennt.
Die Platte wurde an der Luft getrocknet und mit 0,5% Polyisobutylmethacrylat (Aldrich Chemical Co., Ltd., Gillingham, England) in Hexan weichgemacht. Nach dem Trocknen wurde die Platte mit 1% BSA in 0,05 M Tris/HCl-Puffer vom pH-Wert 7,8-8,0 30 Minuten bei Raumtemperatur blockiert. Sodann wurde die Platte mit den anti-Gangliosid-mAbs (Gewebekulturüberstand) über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert.
Anschließend wurde die Platte 4-mal mit PBS gewaschen und 3 Stunden bei Raumtemperatur mit einem mit alkalischer Phosphatase konjugierten anti-Maus-Immunoglobulin-Antiserum (Jackson Immunoresearch Laboratories Inc.), das in Tris-HCl- Pufferlösung mit einem Gehalt an 1% BSA auf 1 : 5000 verdünnt worden war, inkubiert.
Die Platte wurde unter ähnlichen Bedingungen gewaschen und 1 Stunde bei 37ºC mit einer Substratlösung mit einem Gehalt an 0,1% 5'-Brom-4'-chlor-3'-indolylphosphat, gelöst in 0,1 M Glycinpuffer vom pH-Wert 10,4, 1 mM ZnCl&sub2;, 1 mM MgCl&sub2;, inkubiert. Die Reaktion wurde durch Waschen mit Wasser gestoppt.
Ausgewählte Klone wurden sodann intraperitoneal (0,5-1 · 10&sup6; Zellen in 0,2 ml) an Balb/c-Mäuse, die vorher mit 2,6,10,14-Tetramethylpentadecan inokuliert worden waren (wobei aber auch andere aszitogene Mittel verwendet werden können), verabreicht.
Vier IgM-mkbs, die unterschiedliche Monosialoganglioside erkennen, wurden erhalten (Tabelle 1).
A3-mAb erkennt bevorzugt NeuAcGM2 und NeuAcGM1 und reagiert mäßig mit NeuAcGM3, die alle N- Acetylsialinsäurereste aufweisen. (Die Hybridom-Zelllinie, die A3-Antikörper bildet, wurde bei ECACC unter der Nr. 94113023 hinterlegt.)
Glycolipide unter Zusatz (GD1b oder GD1a) oder Verlust (Gg4Cer) eines N-Acetylsialinsäurerestes reagieren nicht mit A3-mAb.
Der Verlust eines terminalen Galactosamins, wie in NeuAcGM3-Gangliosid, verringert die Reaktivität dieses Antikörpers. Diese Ergebnisse zeigen in Verbindung mit der Tatsache, dass der Verlust der terminalen Galactose nicht die Erkennung von NeuAcGM2 beeinflusst, dass es sich bei dem durch A3-mAb erkannten Epitop um die Trisaccharidsequenz GalNAcβ1-4-(NeuAcα2-3)Gal handeln könnte.
E1-mAb zeigte eine hochgradig beschränkte Bindungsspezifität und wies nur NeuAcGM2 nach. (Die Hybridom- Zelllinie, die E1-Antikörper bildet, wurde bei ECACC unter der Nr. 94113025 hinterlegt.)
Glycolipide mit Verlust eines terminalen Galactosamins, d. h. NeuAcGM3, oder unter Addition einer terminalen Galactose (d h. NeuAcGM1, wurden von diesem mAb nicht erkannt.
E1-mAb kann zwischen N-Acetyl- und N-Glycolylgruppen unterscheiden. Somit sind das terminale Galactosamin und die mit der internen Galactose verknüpfte N-Acetylneuraminsäure an der Antikörpererkennung beteiligt.
F6-mAb reagiert vorwiegend mit NeuAcGMl, erkennt mäßig GD1b und weist eine geringe Reaktivität mit dem Gg4Cer- Glycolipid auf.
Die Tatsache, dass es Ganglioside mit fehlender terminaler Galactose (GM2 und GD2) und auch nicht GD1, das eine mit der terminalen Galactose verknüpfte N- Acetylneuraminsäure aufweist, nicht erkennt, lässt darauf schließen, dass dieses externe Monosaccharid für die Bindung mit dem Antikörper wichtig ist.
Außerdem reagieren Glycolipide, denen die mit der internen Galactose verknüpfte N-Acetylneuraminsäure fehlt (Gg4Cer), schwach mit dem F6-mAb, während die Addition eines N-Acetylsialinsäurerestes an diese Position (GD1b im Vergleich mit GM1) mäßig die Antikörperreaktivität verändert.
Alle diese Tatsachen lassen darauf schließen, dass die Tetrasaccharidstruktur Galβ1-3GalNAcβ1-4(NeuAcα2-3)Gal an der antigenen Erkennung beteiligt ist.
P3-mAb bindet spezifisch an die mit der internen Galactose der Ganglioside verknüpfte N-Glycolylneuraminsäure. (Die Hybridom-Zelllinie, die P3-Antikörper bildet, wurde bei ECACC unter der Nr. 94113026 hinterlegt).

Beispiel 4

P3-mAb-Tumorerkennung

Gewebe wurden in einer 10%igen Formalin-Pufferlösung fixiert, dehydratisiert, geklärt und in Paraffin eingebettet. Eine histopathologische Untersuchung wurde an H&E-gefärbten Gewebeschnitten durchgeführt.
Aufeinanderfolgende Schnitte von histopathologisch geprüften Blöcken wurden zur Immunofärbung durch das Biotin- Streptavidin-Peroxidase-Komplex-Verfahren (beschrieben von S. M. Hsu und L. Raine, J. Histochem. Cytochem., Bd. 29 (1981), S. 1349-1353) verwendet.
Entparaffinierte und dehydratisierte Gewebeschnitte wurden mit 3% H&sub2;O&sub2; (Methanollösung) 30 Minuten behandelt, um endogene Peroxidase-Aktivität zu entfernen.
Die Schnitte wurden mit P3-mAb (Gewebekulturüberstand) 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Biotinylierte Schaf- anti-Maus-Immunoglobuline und Biotin-Streptavidin-Peroxidase- Komplex (DAKO A/S) wurden sodann jeweils 30 Minuten bei Raumtemperatur zugegeben.
Zwischen den Inkubationen wurden die Schnitte mit Tris- Kochsalzlösung-Pufferlösung gewaschen.
Die Peroxidase-Reaktion wurde unter Verwendung einer Lösung mit einem Gehalt an 5 ml Tris-Kochsalz-Pufferlösung, 5 ul 30% H&sub2;O&sub2; und 3 mg 3,3-Diaminobenzidin entwickelt.
Objektträger wurden mit Leitungswasser gewaschen, mit Mayer-Hämatoxilin gegengefärbt, mit einem balsamhaltigen Befestigungsmedium versetzt und mit Deckplättchen abgedeckt.
Die Enzymreaktion liefert eine braune Färbung, die folgendermaßen klassifiziert wird: keine Reaktion (-), schwach (+), mäßig (++) und stark (+++).
Eine positive Reaktion bei Gewebeschnitten von duktalem, infiltrierendem Mammakarzinom, Brustkrebs-Metastasen- Lymphknoten und Brustadenose wurde bei Verwendung von P3-mAb erzielt.
Der Antikörper zeigt eine feine, granuläre Zytoplasma- und Membranreaktion. Keine Reaktion wurde mit den übrigen untersuchten bösartigen und gutartigen Tumorgeweben beobachtet (Tabelle 2).

Beispiel 5

Antiidiotypische (Ab2) Antwort auf IgM-anti-Gangliosid- Antikörper in einem syngenen Modell

Zwei verschiedene Immunisierungsverfahren wurden mit Balb/c-Mäusen durchgeführt, denen im Abstand von 15 Tagen 4-6 intraperitoneale mAb-Dosen von jeweils 25 ug verabreicht wurden. A3-, P3- und E1-mAbs wurden allein oder unter Kupplung an KLH als Transportprotein in Gegenwart von komplettem Freund-Adjuvans bei den ersten Dosen und von inkomplettem Freund-Adjuvans bei den folgenden Dosen injiziert.
Mäuse-Serumproben wurden vor den Immunisierungen und 7 Tage später gewonnen.
Das Auftreten einer Ab2-Antwort in Mäuseserum wurde durch ELISA bestimmt. ELISA-Platten (stark bindendes COSTAR) wurden über Nacht bei 4ºC mit 10 ug/ml der verschiedenen, als Immunogene verwendeten anti-Gangliosid-mAbs in Carbonat- Bicarbonat-Puffer vom pH-Wert 9,8 inkubiert.
Platten wurden nach Waschen mit PBS mit einem Gehalt an 0,05% Tween 20 mit dem gleichen Puffer mit einem Gehalt an 1% BSA 1 Stunde bei 37ºC blockiert.
Die Waschstufe wurde wiederholt und 50 ul pro Vertiefung der verschiedenen Serumverdünnungen wurden zugegeben. Nach 2- stündiger Inkubation wurden die Platten erneut gewaschen und alkalische Phosphatase-Ziegen-anti-Mäuse-IgG-Fc-Region- Konjugat-Antiserum wurde zugegeben. Nach Waschen wurde die Substratlösung wie beim vorstehenden ELISA-Test zugegeben.
Bei Immunisierung von Mäusen mit A3- und E1-mAbs allein wurde eine Ab2-Antwort in Mäuseserum nicht erzielt, während die Verbreichung der gleichen Antikörper bei Konjugation mit KLH und in Gegenwart von Adjuvans eine starke antiidiotypische Reaktion vom IgG-Typ (Ab2) in spezifischer Weise für das als Immunogen verwendete mAb erzielt wurde.
Dagegen zeigte P3-mAb (anti-NeuGcGM2/NeuGcGM3) eine Ab2- Antwort vom IgG-Typ bei alleiniger Verwendung (Antikörpertiter 1 : 1000), die sich bei Kupplung an KLH und in Gegenwart von Adjuvans verstärkte (1 : 50 000) (Tabelle 3).
Die antiidiotypische Antwort vom IgG-Typ (Ab2) auf diese mAbs zeigt die Teilnahme der T-Helferzellen bei dieser Antikörperantwort.
Diese Ab1-anti-Gangliosid-mAbs vom IgM-Typ zeigen bei physiologischer Verabreichung eine abweichende Kapazität zur Bildung einer Ab2-Antwort in einem syngenen Modell, was somit unterschiedliche Kapazitäten zur Verbindung mit dem idiotypischen T-Zellnetzwerk bei Balb/c-Mäusen zeigt.
Dennoch sind bei Kupplung an KLH und in Gegenwart von Adjuvans alle mAbs zur Verbindung mit dem idiotypischen T- und B-Zellnetzwerk unter Erzeugung einer starken Ab2-Antwort fähig.

Beispiel 6

Erzeugung einer anti-antiidiotypischen (Ab1') Antwort auf anti-Gangliosid-mAbs vom IgM-Typ in einem syngenen Modell: spezifische, antigenunabhängige Antikörper-Antwort

E1-(anti-NeuAcGM2)- und P3-(anti-NeuGcGM3/NeuGcGM2)-mAbs in Konjugation mit KLH wurden zur Immunisierung von weiblichen Balb/c-Mäusen im Alter von 6-8 Wochen verwendet.
Die Tiere erhielten 25 ug-Dosen von mit KLH konjugiertem mAb in Abständen von 15 Tagen in Gegenwart von komplettem Freund-Adjuvans bei der ersten Dosis und in Gegenwart von inkomplettem Freund-Adjuvans bei den restlichen Dosen.
Serumproben der Tiere wurden vor und während der Immunisierungen entnommen.
Die (Ab1')-Antikörperspiegel wurden durch das in Beispiel 1 beschriebene indirekte ELISA-Verfahren bestimmt.
Eine Immunisierung mit Liposomen erforderte mindestens 9 Dosen, um eine Antikörper-Antwort gegen NeuAcGM2 zu erzielen. Im Gegensatz dazu waren bei Immunisierung unter Verwendung des mit KLH gekuppelten E1-mAb nur drei Dosen erforderlich, um eine anti-Gangliosid-Antikörper-Antwort zu erhalten (Fig. 3).
Gleichermaßen lieferte eine Immunisierung mit P3-mAb bei Kupplung mit KLH eine Antikörper-Antwort gegen NeuGcGM2 (Ab1') bei 6 der 8 immunisierten Tiere (Figg. 4 und 5).
Diese Ergebnisse zeigen, dass diese Antikörper, die in physiologischem Zustand oder bei Konjugation mit KLH zur Erzielung einer Antwort vom Ab2-Typ fähig waren, auch die Fähigkeit zur Erzielung einer (Ab1')-Antwort bei einem syngenen Modell besitzen, was zeigt, dass sie wiederkehrende Idiotope aufweisen, d. h. Idiotope, die zur Erzielung einer spezifischen, antigenunabhängigen Antikörper-Antwort befähigt sind.

Beispiel 7

Erzeugung von Hybridomen, die anti-Gangliosid-mAbs bilden, durch Immunisieren von Balb/c-Mäusen mit dem P3-mAb

Weibliche Balb/c-Mäuse im Alter von 6-8 Wochen wurden mit dem P3-mAb bei Konjugation mit KLH unter Anwendung des in Beispiel 6 beschriebenen Immunisierungsverfahrens immunisiert.
Eine Maus mit Serum-Antikörpertitern vom Ab1'-Typ gegen NeuGcGM3 wurde zur Fusionierung ihrer Milzzellen mit der Myelom-Zelllinie P3/X63 Ag8 6.5.3. unter Einsatz der in Beispiel 3 beschriebenen Fusionstechnik verwendet.
Hybrid-Zellklone, die Antikörper bilden, die bevorzugt Monosialoganglioside erkennen (Fig. 6), wurden bei dieser Fusion erhalten. Im Gegensatz dazu lieferte eine Immunisierung mit Liposomen mit einem Gehalt an NeuGcGM3 und Tetanus-Toxoid vorwiegend Klone, die Antikörper bilden, die sämtliche Ganglioside, mit denen sie getestet wurden, erkennen (Fig. 7). Somit kann die Immunisierung mit P3-mAb die Aktivierung von Klonen verursachen, die Antikörper gegen Ganglioside erzeugen, und zwar in gleicher oder qualitativ hochwertigerer Weise als sie bei Immunisierung mit dem in Liposomen eingeschlossenen Gangliosid erhalten werden.

Beispiel 8

Erzeugung eines anti-Idiotyp-Antikörpers gegen E1-mAb in einem syngenen Modell

Weibliche Balb/c-Mäuse im Alter von 6-8 Wochen wurden mit E1-mAb (anti-NeuAcGM2) bei Kupplung mit KLH unter Anwendung des in Beispiel 4 beschriebenen Immunisierungsverfahrens immunisiert.
Splenozyten einer Maus mit hohen Serumspiegeln an Ab2- Antikörpern gegen E1-mAb wurden mit der P3X63 Ag8 6.5.3.- Myelom-Zelllinie gemäß dem in Beispiel 3 beschriebenen Fusionsverfahren fusioniert.
Ein antiidiotypischer mAb der IgG2a-Unterklasse wurde erhalten. Es wurde gezeigt, dass es sich dabei um einen alpha-antiidiotypischen mAb handelte, da er nicht befähigt war, die Bindung von E1-mAb an dessen Antigen zu hemmen (NeuAcGM2) (Fig. 8).
Dieser B7-anti-idE1-mAb zeigte eine starke Bindung an eine Gruppe der Ab1-anti-Gangliosid-Antikörper, mit denen er getestet wurde. Er reagierte mit dem als Immunogen verwendeten E1-mAb und dem P3-mAb (anti-NeuGcGM3/NeuGcGM2) und dem A3-mAb (anti-NeuAcGM2/NeuAcGM1/NeuAcGM3) (Fig. 9). Die Hybridom-Zelllinie, die B7-anti-id/E1 erzeugt, wurde bei ECACC unter der Nr. 94113024 hinterlegt.
Ein weiterer antiidiotypischer mAb der IgG2a-Unterklasse wurde ebenfalls erhalten. Es handelte sich um einen paratopischen (beta oder gamma) antiidiotypischen mAb, da er befähigt war, die Bindung des E1-mAb an dessen Antigen (NeuAcGM2) zu hemmen (Fig. 10). Dieser anti-idE1 (F2)-mAb war sehr spezifisch gegen den als Immunogen verwendeten E1-mAb. Er reagiert nicht mit anderen anti-Gangliosid-Antikörpern, z. B. den P3- und A3-mAbs (Fig. 11).

Beispiel 9

Antikörper-Antwort gegen NeuAcGM2 nach Immunisierung mit anti-B7-idE1-mAb in einem syngenen Modell

B7-anti-idE1-mAb wurde mit KLH gekuppelt und zur Immunisierung von weiblichen Balb/c-Mäusen im Alter von 6-8 Wochen in Abständen von 21 Tagen mit einer Dosis von 50 ug mAb verwendet. Die Tiere erhielten 3 Dosen von mit KLH konjugiertem B7-anti-idE1-mAb. Die erste Dosis erfolgte in Gegenwart von komplettem Freund-Adjuvans und die restlichen beiden Dosen in Gegenwart von inkomplettem Freund-Adjuvans.
Serumproben wurden vor und nach den Immunisierungen entnommen. Die Antikörper-Antwort gegen NeuAcGM2 wurde durch ein indirektes ELISA-Verfahren gemäß den Angaben in Beispiel 1 bestimmt.
Wie in Fig. 12 gezeigt, war der antiidiotypische alpha- B7-mAb zur Erzeugung einer Antikörper-Antwort gegen NeuAcGM2- Gangliosid im syngenen Modell befähigt.

Kurze Beschreibung der Zeichnung

Fig. 1 zeigt die serologische Antikörper-Antwort gegen NeuAcGM2, gemessen durch ELISA im Serum einer Maus, die mit dem in Liposomen eingekapselten Gangliosid immunisiert worden ist. Die Antikörper-Antwort wurde nach der fünften und neunten Dosis gemessen.
Fig. 2 zeigt die serologische Antikörper-Antwort gegen NeuGcGM3 im Serum einer Maus, die mit dem Gangliosid, das in Liposomen mit einem Gehalt an Tetanus-Toxoid eingekapselt ist, immunisiert worden ist. Die Antikörper-Antwort wurde durch ELISA im Serum der Mäuse in 1/80-Verdünnung gemessen, nachdem das Tier die fünfte und siebte Dosis des Immunogens erhalten hatte.
Fig. 3 zeigt die serologische anti-antiidiotypische (Ab1') Antwort gegen NeuAcGM2, das in Balb/c-Mäusen nach Immunisierung mit E1-mAb unter Kupplung an KLH in Gegenwart von Freund-Adjuvans erzeugt worden ist. Die Ab1'-Antikörper- Antwort wurde durch einen indirekten ELISA-Test vor und nach Verabreichung von drei Dosen des mAb an das Tier gemessen.
Figg. 4 und 5 zeigen die anti-antiidiotypische (Ab1')- Antwort gegen NeuGcGM3, gemessen durch einen indirekten ELISA-Test im Serum von Mäusen, die mit P3-mAb unter Kupplung an KLH und in Gegenwart von Freund-Adjuvans immunisiert worden sind. Die Ab1'-Antwort wurde vor und nach Verabreichung der fünften und sechsten Dosis des mAb gemessen.
Fig. 6 zeigt das Erkennungsmuster von Hybridom- Überständen gegen verschiedene Ganglioside. Die Hybridome wurden durch Fusion von X63 Ag8 6.5.3-Mäuse-Myelomzellen mit den Milzzellen einer mit P3-mkb immunisierten Maus erhalten.
Fig. 7 zeigt das Erkennungsmuster von Hybridom- Überständen gegen verschiedene Ganglioside, die durch Fusion von X63 Ag8 6.5.3-Myelomzellen mit Splenozyten einer Maus, die mit NeuGcGM3, das in Liposomen mit einem Gehalt an Tetanus-Toxoid eingekapselt war, immunisiert worden sind.
Fig. 8 zeigt die Ergebnisse eines Hemmassays, wobei E1- mAb mit dem B7-anti-idE1-mAb oder mit verschiedenen Verdünnungen eines polyklonalen Mäuse-anti-idE1-Antiserum inkubiert wurden. Später wurde die Bindung von E1-mAb an NeuAcGM2 durch ELISA gemessen. Die prozentuale Bindungshemmung wurde berechnet.
Fig. 9 zeigt die Reaktivität des anti-idE1-mAb gegen E1-, A3- und P3-anti-Gangliosid-mAbs.
Fig. 10 zeigt die serologische Antikörper-Antwort gegen NeuAcGM2, das in einer Maus, die mit dem B7-anti-id-mAb immunisiert worden ist, erzeugt worden ist. Die Antikörper- Antwort wurde vor und nach Verabreichung der zweiten und dritten Dosis des an KLH gekuppelten mAb gemessen.
Fig. 11 zeigt die Spezifität von verschiedenen antiidiotypischen mAbs für die anti-Gangliosid-mAbs E1, A3, P3 und C3.
Fig. 12 zeigt die Antikörper-Antwort auf NeuAcGM2 in einer mit anti-idE1-mAb immunisierten Maus.
Tabelle 1 zeigt die Reaktivitäten von A3-, E1-, F6- und P3-mAbs gegen verschiedene Glycolipide, bestimmt durch ELISA und HPTLC-Immunofärbung.
Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse der immunohistochemischen Untersuchung verschiedener bösartiger und gutartiger Humangewebe unter Verwendung von P3-mAb.
Tabelle 3 zeigt die antiidiotypische (Ab2) Antwort, die in einem syngenen Modell erhalten wird, wenn Balb/c-Mäuse mit drei Dosen von jeweils 25 ug der anti-Gangliosid-mAbs (A3, E1 und P3) bei alleiniger Injektion oder unter Kupplung an KLH in Abständen von 15 Tagen immunisiert wurden. Tabelle 1 Reaktivität von mAbs gegen verschiedene Glycolipide
+++ stark ++ mäßig + schwach - negativ

Tabelle 2

Erkennungsmuster von P3-mAb in verschiedenen bösartigen und gutartigen Geweben

Lokalisierung Positive Fälle/Gesamtzahl

Brust

duktales, infiltrierendes Karzinom 12/12
Lymphknotenmetastasen 2/2
Adenose 1/1

Lymphknoten

Hyperplasie 0/2
Adenitis 0/3
nicht-HDG-Lymphom 0/2

Muskel

Leiomyosarkom 0/1

Prostata

Karzinom 0/1

Lunge

Adenokarzinom 0/2
Karzinom 0/1

Schilddrüse

papilläres Karzinom 0/1
follikuläres Karzinom 0/1

Kolon

normal 0/1
hyperplastischer Polyp 0/1
tubuläres Adenom 0/1
tubulo-villöses Adenom 0/2
villöses Adenom 0/2
Adenokarzinom 0/3
epidermoides Karzinom 0/1

Eierstock

papilläres Zytoadenokarzinom 0/1
seröses Zystoadenom 0/1
muzinartiges Zystoadenom 0/1

Haut

normal 0/0
basozelluläres Karzinom 0/2
epidermoides Karzinom 0/1
keratinisiertes, dermoides Karzinom 0/1

Zentralnervensystem

Neurofibrom 0/1
Neurofibrosarkom 0/2
Glyoblastom 0/1

Weichgewebe

fusozelluläres Sarkom 0/1 Tabelle 3 antiidiotypische Antwort auf anti-Gangliosid-Antikörper
anti-Gangliosid-mAbs (IgM)

Claims

1. Monoklonaler anti-Gangliosid-Antikörper vom IgM-Typ, der zur spezifischen Bindung an mit Galactose verknüpfte N- Glycolylneuraminsäure in Gangliosiden befähigt ist.

2. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 1, der allein oder in einem an ein Transportprotein gekuppelten Zustand und bei Verwendung zum Immunisieren eines Tiers eine anti- Gangliosid-Antikörperreaktion Ab1' und eine antiidiotypische Antikörper-Reaktion Ab2' hervorruft.

3. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 1, bei dem es sich um durch das Hybridom ECACC 94113026 gebildeten mAb P3 handelt.

4. Antiidiotypischer monoklonaler Antikörper mit Spezifität für einen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 3, erhältlich als Immunreaktion vom Ab2-Typ durch Immunisieren eines Tiers mit einem monoklonalen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 3.

5. Monoklonaler anti-Gangliosid-Antikörper mit Spezifität für mit Galactose verknüpfter N- Glycolylneuraminsäure in Gangliosiden, erhältlich als Immunreaktion vom Ab1'-Typ durch Immunisieren eines Tiers mit einem monoklonalen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 3.

6. Rekombinanter monoklonaler Antikörper, umfassend die variablen Regionen der schweren und leichten Ketten eines monoklonalen Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 5.

7. CDR-gepfropfter monoklonaler Antikörper, umfassend die komplementären determinierenden Regionen eines monoklonalen Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 5.

8. Hybridom, das einen monoklonalen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 5 bildet.

9. Verfahren zum Nachweis von Tumorzellen, die Ganglioside exprimieren, insbesondere von Brustkrebszellen, umfassend einen Immunoessay unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 7, gegebenenfalls unter Kupplung an einen Marker.

10. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen monoklonalen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und ein Transportmolekül, ein Verdünnungsmittel oder einen Trägerstoff.

11. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 10 zur Behandlung von malignen Neoplasien, insbesondere zur Behandlung von Brustkrebs.