DE3222084A1 - Monoklonale antikoerper - Google Patents
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Description
BAYER AKTIENGESELLSCHAFT 5090 Leverkusen, Bayerwerk
Zentralbereich no ι ·
Patente, Marken und Lizenzen Dn/by-c *»*♦ Juni
Monoklonale Antikörper
Die vorliegende Erfindung beschreibt generell neue Hybridom-Zellinien
und im speziellen Hybridom-Ze!linien zur
Produktion von monoklonalen Antikörpern gegen mensch- ■ liehen Plasminogenaktivator vom Gewebetyp (PA II), Antikörper,
die auf diese Weise produziert werden, präparative, therapeutische und diagnostische Anwendungen sowie
pharmazeutische Zubereitungen, die diese Antikörper enthalten.
Die Fusion von Maus-Myelomzellen mit Milzzellen von
immunisierten Mäusen (Köhler und Milstein, Nature 256, 495-497 (1975)) war der erste Hinweis für die Möglichkeit,
kontinuierliche Zellinien zu erhalten, die einheitliche (sog. "monoklonale") Antikörper produzieren.
- Seitdem sind zahlreiche Versuche unternommen worden, verschiedene Hybrid-Zellen (sog. "Hybridome") herzustellen
und die Antikörper, die von ihnen gebildet werden, für unterschiedliche wissenschaftliche Untersuchungen einzusetzen (z.B.: Current Topics in Microbiology and Immunology,
VoI 81 - "Lymphocyte Hybridomas", F. MeIchers, et al, Springer-Verlag (1978), sowie
Le A 21 751
WW * ·
t w · ■ ·
-Z-
Referenzen darin; CJ. Barnstable et al., Cell 14,
9-20 (1978); P. Parham, W.F. Bodmer, Nature 276,
397-399 (1978); Handbook of Experimental Immunology, 3. Aufl., Bd. 2, D.M. Wier, Herausgeber: Backwell,
1978, Kapitel 25, Chem. Eng. News, 15-17 (1979)).
Diese Arbeiten schildern die prinzipielle Technik zur Produktion monoklonaler Antikörper durch Hybridome.
Monoklonale Antikörper gegen Histokompatibilitätsantigene,
gegen Haptene, Protein und Enzyme sind bereits erzeugt worden. Es ist jedoch noch nichts bekannt über
die Antikörperproduktion somatischer Zellhybride gegen menschlichen Plasminogenaktivator vom Gewebetyp.
Der Plasminogenaktivator vom Gewebetyp ist ein Enzym 15 des fibrinolytischen Systems, der Plasminogen zu Plasmin
umwandelt, welches seinerseits Fibrin abbauen kann. Somit wirkt er thrombolytisch. Die drei genannten Proteine
(Plasminogen, Plasmin, Fibrin) kommen im Blut vor. Plasminogenaktivator
kann daher in der Therapie von Hyper-20 koagulationszuständen, speziell bei thromboembolischen
Erkrankungen, von Nutzen sein.
Gegenwärtig werden Urokinase, die aus menschlichem Urin oder aus Nierenzellkulturen gewonnen wird, und Streptokinase,
die aus Kulturfiltraten ß-hämolysierender
Streptokokken isoliert wird als Fibrinolylikum verwendet. Beide sind jedoch in ihrer therapeutischen Verwendung
nicht unproblematisch.
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Plasminogenaktivator vom Geweb'etyp kann von Urokinase
und Streptokinase unterschieden werden. Für den Plasminogenaktivator
vom Gewebetyp wurde ein Molekulargewicht von ca. 72 000 gefunden. Er wird von menschlichen
Melanomzellen produziert und kann aus den entsprechenden
Kulturüberstäriden nach der Methode von Rijken und Collen (JBC 256, 7035-7041 (1981)) isoliert werden.
Monoklonale Antikörper gegen den Plasminogenaktivator
vom Gewebetyp sind in mehrerer Hinsicht von Interesse.
So kann z.B. das bisherige dreistufige Reinigungsverfahren für den Plasminogenaktivator auf ein einstufiges
vereinfacht werden durch Verwendung solcher Antikörper in einer Immunoadsorptionschromatographie.
Die vorliegende Erfindung stellt Hybridomzellinien zur
Verfügung, die hochspezifische monoklonale Antikörper gegen Plasminogenaktivator vom Gewebetyp synthetisieren
und sezerriieren. Diese Hybridome werden nach der eingangs genannten Methode von Köhler und Milstein hergestellt.
Nach der Immunisierung von Mäusen mit Plasminogenaktivator vom Gewebetyp werden die MilζzeIlen dieser
Mäuse mit Zellen einer Maus-Myelomzellinie fusioniert;
.die daraus resultierenden Hybridome wurden systematisch auf Antikörper untersucht, die selektiv mit dem Plasmino
genaktivator vom Gewebetyp der an Mikrotiterplatten fixiert ist, reagieren. Auf diese Weise wurden Hybridome
isoliert, die Antikörper gegen den Plasminogenaktivator produzieren. Einige dieser Antikörper reagieren ausschließlich
mit Plasminogenaktivator vom Gewebetyp,
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während andere eine Kreuzreaktion mit Urokinase aufweisen.
Die so produzierten Antikörper sind ein weiterer Gegenstand der Erfindung. Sie sind monospezifisch für eine
bestimmte antigene Determinante im Plasminogenaktivatormolekül. Die vorliegende Erfindung beschreibt weiterhin
Methoden zur Herstellung dieser Hybridome.
Die erfindungsgemäßen Antikörper können z.B. zur Bestimmung
von Plasminogenaktivator in normalen und malignen Zellen, verwendet werden. Sie sind somit für diagnostische
und prognostische Zwecke, z.B. zur Überprüfung des Tumorwachstums oder des funktioneilen Status normaler Zellen,
einsetzbar.
Die Herstellung der Hybridome umfaßt im allgemeinen die folgenden Schritte:
A. Immunisierung von Mäusen mit dem menschlichen Plasminogenaktivator.
Weibliche Balb/c-Mäuse -erwiesen sich hierzu als brauchbar, jedoch können auch andere
Mäusestämme verwendet werden. Das Immunisierungsschema und die Konzentration an Plasminogenaktivator
20 sollten so gewählt werden, daß hinreichende Mengen an Antigen stimulierten Lymphocyten gebildet werden.
Drei Immunisierungen im Abstand von 14 Tagen mit 100 μg/Protein/Maus/Injektion mit phosphatgepufferter
physiologischer Kochsalzlösung er-
25 wiesen sich als effektiv.
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B. Gewinnung der Milzen der immunisierten Mäuse und
Herstellung einer Milzzellsuspension in einem geeigneten Medium. Ungefähr 1 ml Medium pro Milz
•ist ausreichend. Die experimentellen Techniken
5 dazu sind bekannt.
C. Fusion der suspendierten Milzzellen mit Maus-Myelom-,
zellen einer geeigneten Zellinie (z.B. P 3 χ 68 Ag 8), indem man einen geeigneten Fusionspromotor (z.B.
Polyethylenglykol) verwendet. Bevorzugte Fusionspromoter sind Polyethylenglykole vom mittleren Molekulargewicht
zwischen 1 000 und 4 000 (z-B. kommerziell erhältliches PEG 1 000 etc.). Jedoch können
auch andere bekannte Fusionspromotoren benutzt werden. Bevorzugt wird ein Verhältnis von etwa 10 MiIzzellen
pro Myelomzelle. Ein Gesamtvolumen von etwa
8 0/5 - 1,0 ml Fusionsmedium ist ausreichend für 10
Milzzellen. Es sind viele Myelomzellinien aus Mäusen
bekannt und erhältlich, z.B. von wissenschaftlichen Instituten oder von Zellhinterlegungsinstitutionen
wie z.B. das SaIk Institute Cell Distribution Center, La Jolla, CA. Die verwendete Zellinie soll vor-,
zugsweise vom sog. "drug resistent"-Typ sein, so daß nicht fusionierte Myelomzellen in einem Selektionsmedium
absterben, während Hybride überleben.
Am häufigsten werden gegen 8-Azaguanin-resistente Zellinien, welchen das Enzym Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase
fehlt, und die deshalb in einem HAT-Medium (Hypoxanthin, Aminopterin,
Thymidin) nicht wachstumsfähig sind, benutzt.
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Vorzugsweise soll die verwendete Myelomzellinie
auch vom "non-secreting"-Typ sein, damit sie nicht selbst Antikörper oder H- bzw. L-Ketten von Immunglobulinen
bildet. In gewissen Fällen jedoch können 5 sekretierende Myelomzellen von Vorteil sein.
D. Verdünnung und Kultivierung in Einzelgefässen der
nicht fusionierten Milzzellen, der nicht fusionierten Myelomzellen und der fusionierten Zellen in einem
Selektivmedium, in dem die nicht fusionierten Myelom-
10 zellen sich nicht vermehren, so daß die nicht fusionierten
Zellen absterben (ca. 1-2 Wochen). Die einzelnen fusionierten Zellen werden isoliert, indem das
Volumen des Verdünnungsmittels so eingestellt wird, daß eine bestimmte Zahl von Zellen (etwa 1-4) in das
15 einzelne Gefäß (z.B. jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte) kommt. Das Medium (z.B.. HAT-Medium)
verhindert, daß die resistente (z.B. gegen 8-Azaguanin)
nicht-fusionierte Myelomzellinie auswächst; sie stirbt damit ab. Die nicht fusionierten MiIz-
zellen haben nur eine begrenzte Zahl, von Teilungszyklen; deshalb sterben auch diese Zellen nach
einer gewissen Zeit (etwa 1-2 Wochen). Die fusionierten Zellen hingegen vermehren sich weiterhin,
da sie von den elterlichen Myelomzellen das permanente Wachstum und von der elterlichen Milzzelle
die Fähigkeit, das Enzym Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase
zu synthetisieren, ererbt haben und somit im Selektionsmedium überleben können.
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E. Überprüfung auf Anwesenheit von Antikörpern gegen Plasminogenaktivator in jedem Gefäß.
F. Selektion (z.B. durch limitierte Verdünnung) und Klonierung der Hybridome, die den gewünschten Anti-
5 körper produzieren.
Ist einmal das gewünschte Hybridom selektioniert und
kloniert worden, kann man den Antikörper auf zwei verschiedenen Wegen produzieren. Monoklonale Antikörper
von sehr hoher Reinheit erhält man, wenn man die Hybridome
in einem geeigneten Medium über eine gewisse Zeit kultiviert und den Antikörper aus dem überstand
gewinnt. Ein geeignetes Medium und die optimale Kulturdauer sind einfach zu bestimmen. Diese in-vitro-Technik
liefert monoklonale Antikörper, die nur mit geringen
15 Mengen von Proteinen aus dem heterologen Serum (z.B.
foetalem Kälberserum) verunreinigt sind.
Um eine wesentlich höhere Konzentration an monoklonalen
Antikörpern mit nur wenig geringerer Reinheit herzustellen, kann man das ausgewählte Hybridom einer Maus
20 ~ vorzugsweise einer syngenen oder semisyngenen -
injizieren. Dies führt in der Maus nach einer gewissen Inkubationszeit zur Bildung eines Tumors, der hohe Antikörperkonzentrationen
(5 - 20 mg/ml) im Blut und im
peritonealen Exsudat (Ascites) des Wirtstieres frei-
peritonealen Exsudat (Ascites) des Wirtstieres frei-
25 setzt. Wenn auch diese Mäuse normale Antikörper in Blut und Ascites haben, so kommen diese doch nur in
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-Ji-
einer Konzentration von ca. 5 % der monoklonalen Antikörper
vor. Der so gewonnene monoklonale Antikörper hat
3 einen hohen Titer (er ist aktiv in Verdünnungen von 10
oder darunter), und das Verhältnis zwischen spezifischen und nicht-spezifischem Immunglobulin beträgt etwa 20:1.
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Plasminogenaktivator wurde aus Melanomzellkulturüberständen nach der Methode von Rijken und Colien (JBC 256,
7035 - 7041 (1981)) hergestellt.
Weibliche Balb/c-Mäuse wurden subcutan mit 100 μg Plasminogenaktivator
in komplettem Freund'sehen Adjuvans
immunisiert. Die Tiere wurden subcutan mit 100 μg Plasminogenaktivator
nach 14, 28 und 42 Tagen geboostert. Die Milzen wurden zur Zellfusion am 53. Tag entnommen.
Vier Tage vor Entnahme der Milzen erhielten die Tiere nochmals 30 μg Plasminogenaktivator täglich i.p.
Aus den entnommenen Milzen wurden Einzelzellsuspensionen hergestellt, indem die Organe durch ein Sieb aus rostfreiem
Stahl gepreßt wurden. Die Zellen wurden in Dulbecco's Minimal Essential Medium (DMEM), das mit
4,5 g/l Glucose, 1 000 Einh./ml Penicillin und 100 μg/ml
Streptomycin supplementiert war, überführt. Die Zellen wurden dreimal mit DMEM gewaschen und dann in gewünschter
Konzentration im selben Medium resuspendiert.
8
Im allgemeinen wurden etwa 10 Zellen pro Milz gewonnen.
Im allgemeinen wurden etwa 10 Zellen pro Milz gewonnen.
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- te -
Die hier verwendete Myelomze!linie X 6 3-Ag 8-653 ist ein
Subklon der Mäusemyelomzellinie P 3-X 63-Ag 8. Die Zelllinie exprimiert keine schweren oder leichten Ketten von
5 Immunglobulinen (J. Immunol. 123, 1548 - 1550 (1980 )).
Sie wurde von Dr. Lemke, Institut für Genetik der Universität Köln, zur Verfügung gestellt. Die Zellen sind
gegen 20 μg/ml 8-Azaguanin in einem Medium, das Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin (HAT) enthält, resistent.
Sie wurde von Dr. Lemke, Institut für Genetik der Universität Köln, zur Verfügung gestellt. Die Zellen sind
gegen 20 μg/ml 8-Azaguanin in einem Medium, das Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin (HAT) enthält, resistent.
Sie wurden in DMEM, das mit 4,5 g/l Glukose, 20 mM Glutamin, 1 000 Einh./ml Penicillin, 100 ug/ml Streptomycin
und 10 % foetalem Kälberserum supplementiert war (komplettes Medium) aufgezogen. Die Myelomzellen waren
zum Zeitpunkt der Fusionierung in der logarithmischen Phase der Zellvermehrung.
Die Milzzellsuspensionen wurden zu den Myelomzellen in
DMEM ohne Serum in einem Verhältnis von 10:1 zugegeben und 10 Minuten bei 200 g in Bechern mit rundem Boden
zentrifugiert. Nach Absetzen d/s Sediments wurde das überstehende Medium vorsichtig dekantiert. Die Sedimente
wurden mit 2 ml einer Lösung von PoIyethylenglykol
vom MG 2 000 (verdünnt auf 30 % w/w mit DMEM, pH 7,6) 1 Minuten bei 370C inkubiert. Daraufhin wurden
20 ml DMEM zugegeben, worauf die Zellen über einige Minuten vorsichtig resuspendiert wurden. Sie wurden
dann nochmals 5 Minuten lang bei 200 g zentrifugiert
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-IA-
und nun in komplettem Medium so resuspendiert, daß man eine Konzentration von 10 Zellen/ml erhielt, worauf,
sie in 1 ml-Anteilen auf Costar-Platten verteilt wurden.
Nach der Zellfusion wurden die Zellen in HAT-Medium
(Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin) bei 370C mit 5 %
CO2 in einer feuchten Atmosphäre kultiviert. Nach einigen
Wochen wurden 100 μΐ der überstände aus den Hybridom-Zellkulturen
auf Anti-Plasminogenaktivator-Aktivi-
^q tat geprüft.
Diejenigen Hybridom-Zellinien, die positive Resultate im Anti-Plasminogenaktivator-Test zeigten, wurden zum
Klonieren ausgewählt. Dabei wurden die Hybridome einer Doppel-Verdünnungs-Klonierungstechnik unterworfen, bei
15 der in 96 Mikrptitervertiefungen bei einer errechneten
Verdünnung von 0,5 Zellen/Vertiefung ausgesät wurden, wobei 10 Mäuse-Thymocyten als "Feeder-Zellen" dienten.
Die nach diesem Klonierungsverfahren noch Antikörper produzierenden Zellen wurden vermehrt, eingefroren und
in flüssigem Stickstoff im komplettem Medium, das 25 % foetales Kälberserum sowie 7,5 % Dimethylsulfoxid
enth ie11, aufbewahrt.
100 μΐ Kulturüberstand wurden den Zellkulturen entnommen
25 und auf Mikrotitervertiefungen gegeben, an die Plasmino-
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It» * www
genaktivator (5 μg/ml) 3 Stunden lang bei Raumtemperatur
fixiert worden war/ und die daraufhin mit Wasser er-
1 25 schöpfend gewaschen worden waren. J-(Ziegen)-Anti-
4 Maus-Immunglobulin (8 - 10 χ 10 cpm) wurde darauf
hinzugefügt; danach wurden die Platten 3 Stunden bei Zimmertemperatur inkubiert. Nach erneutem Waschen mit
destilliertem Wasser wurden die Proben in einem LKB-Gammazähler gezählt. Tabelle 1 zeigt einige repräsentative
Beispiele von Hybridomen, die Antikörper gegen menschlichen Plasminogenaktivator vom Gewebetyp sezernieren.
Die gleichen Hybridome wurden Mäusen, die mit 0,5 ml
Pristan vorbehandelt waren, intrape.ritoneal injiziert, um Antikörper enthaltende Ascitesflüssigkeit 10-15 Tage
15 danach zu gewinnen. Die Antikörperaktivität wurde bestimmt
wie oben beschrieben. Wie in Tabelle 1 gezeigt wird, erstrecken sich die Antikörpertiter der Ascitesflüssigkeiten
über einen Bereich von 10 bis 3 χ 10
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1
Tabelle 1
Titer der Aktivitäten von Antikörpern in Hybridomüberständen gegen menschlichen Gewebeplasnujnogen-
125 "^ aktivator, gemessen in ( J)-anti-Maus-IgG-Bindungstest.
Vom Kulturüberstand Nummer gebundenes (12SJ)-Anti^Ig
(cpm) χ 10J
| 7 | C | 6 | 4,03 |
| 22 | D | 12 | 4,22 |
| 31 | C | 10 | 4,76 |
| 33 | B | 12 | 8,38 |
| 34 | C | 4 | 9,24 |
| 46 | D | 10 | 4,39 |
| 50 | F | 8 | 1,98 |
| 57 | F | 11 | 2,07 |
| 71 | C | 12 | 3,97 |
| 73 | E | 10 | 5,42 |
| 77 | G | 7 | 2,16 |
| 86 | E | 6 6 | 1,83 |
| 90 | C | 10 | 3,55 |
| 100 | E | 11 | 2,80 |
| Ascites-Anti- körpertiter (reziprok) |
105 | Nummer | B 11 | Vom Kulturüberstand gebundenes (125J)- Anti^Ig (cpm) χ 10 |
Ascites-Anti körpertiter (reziprok) |
X | 105 |
| 1 χ | 105 | 131 | C 11 | 5,47 | 3 | X | 105 |
| 1 χ | 105 | 135 | G 7 | 3,18 | 1 | X | 104 |
| 3 χ | 106 | 137 | G 6 | 1,72 | 1 | X | 104 |
| 1 χ | 106 | 164 | E 9 | 2,04 | 1 | X | 104 |
| 1 χ | 105 | 167 | C 8 | 2,56 | 1 | X | 103 |
| 1 χ | 103 | 180 | G 5 | 1,47 | 1 | X | 105 |
| 1 x | 103 | 206 | E 8 | 5,21 | 3 | X | 106 |
| 1 χ | 105 | 239 | P 8 | 13,01 | 3 | X | 106 |
| 1 x | 104 | 243 | D 8 | 10,04 | 3 | X | 104 |
| 3 χ | 103 | 245 | G 9 | 2,97 | 3 | X | 106 |
| 1 χ | 103 | 251 | D 12 | 10,53 | 3 | X | TO5 |
| 1 χ | 105 | 260 | E 9 | 3,82 | 1 | X | 105 |
| 3 χ | 104 | 265 | A 7 | 2,95 | 1 | X | 105 |
| 1 X | 280 | 4,69 | 3 |
Tabelle 1 (Portsetzung)
Titer der Aktivitäten von Antikörpern in Eybridomüberständen gegen msnschlichen Gewebeplasminogen-
125 aktivator, gemessen in ( J)-AntirMau3-IgG-Bindungstest.
Vom Kulturüberstand Nuircter gebundenes (125J)-Anti-Ig
(cpm)
Ascites-Antikörpertiter (reziprok)
Nuniner Vom Kulturüberstand
gebundenes. (125J)-Anti-Ig (cpm)
gebundenes. (125J)-Anti-Ig (cpm)
Ascites-Antikörpertiter (reziprok)
108 G, 12
109 F 6
124 D 8
124 D 8
5,32
3,34
9,76
3,34
9,76
1 χ ΙΟΙ χ 10 1 χ 10(
| 282 | B | 8 | 9,68 |
| 286 | G | 8 | 2,46 |
| 299 | G | 12 | 12,65 |
1 χ 10 3 χ 104 3 χ ΙΟ6
125 3
cpm von ( J)-Ziegen-Anti-=-Maus-IgG χ 10 , das von an Mikrotiterplatten fixiertem Plasminogenaktivator
gebunden wird. Die Ausgangsvolumina der Proben betrugen 100 μΐ.
ι t j
* · ■cc««*
Charakterisierung der von den klonierten Hybridomen produzierten Immunglobuline
Die Klassen und Unterklassen der von den Hybridklonen produzierten Antikörper wurden analysiert. Der jeweilige
Antikörper wurde aus den Kulturüberständen durch Fällung mit Ammoniumsulfat (40 %ige Sättigung) angereichert und
partiell gereinigt. Unter Verwendung von klassenspezifischen Anti-Maus-Immunglobulin-Antiseren wurden die
jeweiligen Immunglobulinklassen in Ouchterlony GeI-diffusionstest
bestimmt. Wie in Tabelle 2 gezeigt wird, gehören die meisten Antikörper gegen den Plasminogenaktivator
zur IgM- oder IgG--Klasse; nur einer ist vom
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ro Tabelle 2
> (Charakterisierung von itonoklonalen Antikörpern gegen menschlichen Plasminogenaktivator vom Gewebetyp
^ durch Isotypieanalyse
IgG1 1^b IgM K Zellinie IgG1 I^2b IgM K
+ + 160 P 9 +
+ + 164 G 6 + +
+ + 167 E 9 +
+ 180 G 8 + +
+ 191 B. 12 + +
+198 + ,
+ 206 G 5 + + do
+ + 211 + +
+ 219 C 10 +
+ + 239 E 8 +
+ 243 D 8 + !
+ + 245 D 8 + +
+ · + 251 G 9 + +
+ 260 D 12 + '
+ 265 E 9 + +
+ + 267 +
| Ul -1 Zellinie |
C | 6 |
| 7 | D | 9 |
| 8 | D | 12 |
| 22 | C | 10 |
| 31 | B | 12 |
| 33 | C | 4 |
| 34 | C | 5 |
| 36 | D | 10 |
| 46 | F | 8 |
| 50 | H | 11 |
| 57 | D | 10 |
| 64 | C | 12 |
| 71 | E | 10 |
| •7,3 | G | 7 |
| 77 | E | 6 |
| 86 | C | 10 |
| 90 |
Tabelle 2 (Fortsetzung) Charakterisierung von inönoklonalen Antikörpern gegen menschlichen Plasminogenaktivator vom Gewebetyp
durch Isotypieanalyse
Zellinie
IgM K
IgM K
100 E.11 106 E 9
108 G 12
109 F 6
110 D 7 124 D 8 131 B 11 135 C 11 137 G 7
| 268 | A | 8 | + |
| 275 | + | ||
| 280 | A | 7 | |
| 282 | B | 8 | |
| 285 | A | 10 | + |
| 286 | G | 8 | |
| 297 | C | 6 | |
| 299 | G | 12 | |
Hemmung der Plasminogenaktivator-Aktivität durch Antikörper
gegen Plasminogenaktivator.
Plasminogenaktivator ist eine Protease, die Plasminogen
in Plasmin überführt. Die Aktivität von.Plasminogenaktivatoren
kann mit der Pibrinplattentechnik gemessen werden. Dabei wird Plasminogen, das in Fibrin inkorporiert
ist, durch den Plasminogenaktivator aktiviert. Der Effekt von Anti-Plasminogenaktivator-Antikörpern - entweder
einzeln oder in verschiedenen Kombinationen - wurde im Fibrinplattentest bestimmt. Tabelle 3 zeigt, daß 6 Antikörper
von 34 die fibrinolytische Reaktion in diesem Testsystem hemmen. Die sechs aktiven Antikörper unterscheiden
sich quantitativ in ihren inhibitorischen Eigenschaften. Eine additive Hemmung im Fibrinplattentest
wird beobachtet, wenn zwei Antikörper gemischt werden. Das ist ein Hinweis darauf, daß .die beiden Antikörper
gegen unterschiedliche antigene Determinanten gerichtet sind.
Le A 21 751
t*
Tabelle 3
Φ
jp Heitinung von Plasminogenaktivator vom Gewebetyp im Fibrinplattentest durch Mischungen von Antikörpern
to gegen Plasminogenaktivator
—* ■ .
131 B 11 282 B 8 206 G 5 33 B 12 137 G 7 299 G 12 73 E
13.1 B 11 65 % 100 % 100 % 91 % 86 % 79 % 72 %
282 B 8 100 % 97 % 100 % 80 % 65 % 52 % 45 %
206 G 5 100 % 100 % 65 % 62 % 65 % 65 % 55 %
33 B 12 91 % 80 % 62 % 30 % 45 % 30 % 30 %
137 G 7 86 % 65 % 65 % 45 % 22 % 30 % 20 %
299 G 12 79 % 52 % 65 % 30 % 30 % 14 % 14 %
73 E 10 72 % 45 % 55 % 30 % 20 % 14 % 0 %
Verdünnung der Antikörper: 10"2
Kreuzreaktion der Antikörper gegen den-menschlichen Plasminogenaktivator vom .Gewebetyp mit Urokinase
Urokinase, eine Protease/ die entweder aus menschlichem
(R)
Urin (z.B. Ukidan von Serono) oder aus Gewebekultur-
Urin (z.B. Ukidan von Serono) oder aus Gewebekultur-
(R)
überständen (z.B. Abbokinase von Abbott) gewonnen
wird, vermag Plasminogen in ähnlicher Weise wie Plasminogenaktivator.
vom Gewebetyp zu Plasmin umzuwandeln. Aus diesem Grunde wurden die Antikörper auf ihre Kreuzreaktivität.mit
Urokinase der.beiden obengenannten Typen untersucht. In Tabelle 4 wird gezeigt, daß 5 von 35- Antikörpern
allein gegen Plasminogenaktivator vom Gewebetyp gerichtet sind, während die 30 anderen Antikörper
(Ό)
auch mit· Ukidan v ', und darunter 10 mit Abbokinase
15 reagieren.
Le A 21 751
Kreuzreaktionen der Antikörper gegen Plasminogenaktivator mit Urokinase
Zeillinie
Reaktivität von Antikörpern gegen Plasminogenaktivator mit:
(R)
Plasminogen-
7 C 6 +
22 D 12 +
31 C 10 +
33 B 12 +
34 C 4 + 46 D 10 + 50 F 8 + 57 H 11 + 71 C 12 +
73 E 10 + 77 G 7 + 86 E 6 +
MG = Molgewicht
Ukidan (Urokinase MG 54000
Abbokinase (Urokinase
MG 33000
ZeIl-.linie
0 0
0 0 0
0 0 Reaktivität von Antikörpern gegen Plasminogenaktivator mit:
(R)
Plasminogen Ukidan Abbokinase
Plasminogen Ukidan Abbokinase
(Uro- (Urokinase kinase
MG MG
54000 33000
135 C 137 G 164 G 167 E 180 G 206 G 239 E 243 D 245 D
251 G 260 D 12 + 265 E 9 +
0 0 0 0 0 +
·* tv*
tr1 Tabelle 4 (Fortsetzung)
Kreuzreaktionen der Antikörper gegen Plasminogenaktivator mit Urokinase
ÜkidaniR) Abbokinase(R)
Reaktivität von Antikörpern gegen Plasminogenaktivator mit:
Zeil- Plasmdnogen-
linie (Oro- (Urokinase
kinase
MG MG 54000 33000
| E | 9 | Reaktivität von Antikörpern gegen Plasminogenaktivator mit: |
+ | |
| A | 7 | Plasminogen Ukidan Abbokinase (Uro- (Urokinase kinase MG MG 54000 33000 |
+ | |
| Zell linie |
B | 8 | + | 0 |
| 265 | A | 10 | + + | 0 |
| 280 | G | 8 | + ' 0 | 0 |
| 282 | G | 12 | + + | + |
| 285 | + ' 0 | |||
| 286 | + + | |||
| 299 |
86 E 6
90 C 10
100 E 11
90 C 10
100 E 11
108 G 12
109 F 6
124 D 8
131 B 11
124 D 8
131 B 11
0 0 0 0 0 0 0
MG = Molgewicht
CO K) N) N) O
OO
Diese Kreuzreaktivität der Antikörper könnte auf gemeinsame
Strukturelemente zwischen dem Plasminogenaktivator vom Gewebetyp und Urokinase zurückzuführen sein, aber
auch auf eine Verunreinigung dieses Proteins mit Uro-
kinase. Um zu entscheiden, welche der beiden Interpretationen
die wahrscheinlichere ist, wurde.Plasminogenaktivator
vom Gewebetyp mittels Immunadsorptionschromatographie hergestellt, wobei ein monoklonaler
Antikörper verwendet wurde, der ausschließlich mit
10 diesem Protein reagiert. Der so gereinigte Plasminogenaktivator
wurde dann als Antigen für das Testsystem verwendet. Der Bindungstest zeigte, daß auch dieser Plasminogenaktivator
mit allen.Antikörpern reagierte. Dieses Experiment macht deutlich, daß zwischen Plasminogen-
aktivator vom Gewebetyp und Urokinase Kreuzreaktionen
auftreten; somit haben beide Enzyme gemeinsame antigene Determinanten.
Reinigung und Konzentrierung von Plasminogenaktivator
vom Gewebetyp durch Immunadsorptionschromatographie.
Diejenigen Antikörper, die ausschließlich mit humanem Plasminogenaktivator vom Gewebetyp reagieren - nämlich
131, 206 und 282 - wurden kovalent anSepharose
(R)
4 B* in einer Konzentration von 10 mg Protein pro ml Gel nach dem Verfahren von S.C. March, J. Parikh, P..Cuatrecasas, Anal., Bichem. 60, 149 (1974) gebunden.
4 B* in einer Konzentration von 10 mg Protein pro ml Gel nach dem Verfahren von S.C. March, J. Parikh, P..Cuatrecasas, Anal., Bichem. 60, 149 (1974) gebunden.
Le A 21 751
- 34 -
Die Bindungskapazität der Säule für Plasminogenaktivator wurde mit 0,5 bis 1/5 mg/ml Gel bestimmt. Die enzymatische
Aktivität des so gereinigten Materials war mehr als 1 000-fach gegenüber der Ausgangslösung konzentriert.
Das Elektrophoresemuster des auf diese Art gereinigten Plasminogenaktivators war identisch mit dem
von Material/ das auf konventionelle Weise gereinigt worden war. Die Ausbeute an Plasminogenaktivator bei
der Immunadsorptionschromatographie lag bei bis zu 90 % im Vergleich zu ca. 40 % für die konventionelle Methode.
Le A 21 751
Claims (7)
1. Monoklonale Antikörper gegen Plasminogenaktivator
vom Gewebetyp.
2. Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern
gegen Plasminogenaktivator vom Gewebetyp dadurch gekennzeichnet, daß man Myelomzellen mit
Zellen fusioniert, die aus Säugetieren erhalten wurden, die mit Plasminogenaktivator vom Gewebetyp immunisiert wurden und aus den hieraus resultierenden
Hybridomen diejenigen selektioniert, die die Antikörper produzieren.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Mäusezellen verwendet.
4. Hybridomzellen, die monoklonale Antikörper gegen
Plasminogenaktivator vom Gewebetyp produzieren.
5. Hybridomzellen nach Anspruch 4, dadurch gekennr zeichnet, daß sie durch Fusion von Milzzellen
immunisierter Mäuse mit Mäusemyelomzellen hergestellt
wurden.
6. . Verwendung von monoklonalen Antikörpern gegen
Plasminogenaktivator vom Gewebetyp z.ur. Reinigung
von Plasminogenaktivator mittels Immunadsorptionschromatographie.
Le A 21 751
':V3222Q84
7. Verwendung von monoklonalen Antikörpern gegen Plasminogenaktivator vom Gewebetyp zum Nachweis
von Plasminogenaktivator in normalen oder malignen Zellen und Geweben.
Le A 21 751
Priority Applications (4)
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|---|---|---|---|
| DE19823222084 DE3222084A1 (de) | 1982-06-11 | 1982-06-11 | Monoklonale antikoerper |
| GB8316001A GB2122219A (en) | 1982-06-11 | 1983-06-10 | Monoclonal antibodies |
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| JP10357783A JPS595121A (ja) | 1982-06-11 | 1983-06-11 | モノクロナル抗体 |
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|---|---|---|---|
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|---|---|
| DE3222084A1 true DE3222084A1 (de) | 1983-12-15 |
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ID=6165881
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE19823222084 Withdrawn DE3222084A1 (de) | 1982-06-11 | 1982-06-11 | Monoklonale antikoerper |
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| DE (1) | DE3222084A1 (de) |
| FR (1) | FR2528451A1 (de) |
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-
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- 1982-06-11 DE DE19823222084 patent/DE3222084A1/de not_active Withdrawn
-
1983
- 1983-06-10 FR FR8309632A patent/FR2528451A1/fr not_active Withdrawn
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- 1983-06-11 JP JP10357783A patent/JPS595121A/ja active Pending
Also Published As
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| GB8316001D0 (en) | 1983-07-13 |
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| JPS595121A (ja) | 1984-01-12 |
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|---|---|---|---|
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