DE69332030T2

DE69332030T2 - Herstellung von heterologen proteinen in filamentösen fungi

Info

Publication number: DE69332030T2
Application number: DE69332030T
Authority: DE
Inventors: William E. Hintz; Peter A. Lagosky
Original assignee: DSM NV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 1992-12-10
Filing date: 1993-12-10
Publication date: 2002-10-02
Anticipated expiration: 2013-12-11
Also published as: CA2151154C; CA2151154A1; AU666443B2; WO1994013820A1; ATE219143T1; FI952801L; DK0673429T3; EP0673429A1; NZ259339A; EP0673429B1; JPH08504327A; US5710021A; DE69332030D1; FI952801A0; US5674707A; NO952293D0; AU6653494A; NO952293L

Description

Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft das Fachgebiet der rekombinanten DNA-Technologie für die Herstellung gewünschter Proteine in mikrobiellen Wirten, insbesondere der filamentösen Pilze einschließlich Aspergillus-Arten.

Hintergrund der Erfindung

Eine Reihe von Genexpressionssystemen ist für die Verwendung mit filamentösen Pilzwirten entwickelt worden. Darunter befinden sich Systeme, die Kohlenstoff katabolit-reprimierte Promotoren, beispielsweise glucose-reprimierte Promotoren, benutzen, die in erster Linie wegen ihrer Fähigkeit ausgewählt wurden, daß die Genexpression streng kontrolliert werden kann, indem einfach die Fermentationsbedingungen geändert werden. Ein System dieser Art verwendet den Promotor des alcA Gens aus Aspergillus nidulans, welcher in Gegenwart von Glucose reprimiert ist und der durch Ethanol, Threonin oder verwandte Metaboliten unter glucose-armen Bedingungen induziert wird (siehe Gwynne et al., Biochem. Soc. Trans., 17:338). Diese Doppelsteuerung bietet einen attraktiven, aufeinander abgestimmten Ansatz für die Fermentierung, bei welcher der Aspergillus Stamm als Wirt zuerst in Anwesenheit von Glucose kultiviert wird, um die Biomasse auf ein Höchstmaß zu bringen, und anschließend unter glucose-armen Bedingungen in Gegenwart eines Induziermittels kultiviert wird, um die Produktion des gewünschten Proteins auszulösen. Es wurden auch ähnlich regulierte Systeme entwickelt, welche andere glucose-reprimierte Promotoren verwenden, wie den Promoter des aldA Gens aus Aspergillus nidulans (siehe Pickett et al., Gene (1987) 51:217), des amdS Gens aus Aspergillus nidulans (siehe Scazzocchio et al., 1992, unten), des gla Gens aus Aspergillus niger (siehe Fowler et al., Curr. Genet. (1990), 18:537), und der acvA und ipnA Gene aus Aspergillus nidulans und aus Cephalosporium chrysogenum (siehe Brakhage et al., (1992) 174:3789).
Obwohl die Steuerung der Genexpression, die über glucose-reprimierte Promotoren angeboten wird, in vielen Fällen wünschenswert ist, kann deren Verwendung die Produktionsphase der Fermentation erschweren. Damit das Genprodukt gebildet wird, muß der Wirtsstamm nicht nur unter glucose-armen Bedingungen kultiviert werden, sondern auch in einem Medium, welches eine alternative Kohlenstoffquelle zu dem bevorzugteren Substrat Glucose verwendet. Es wäre daher wünschenswert Promotoren zu entwickeln, die von ihrer glucose-reprimierten Funktion befreit sind.
Untersuchungen des glucose-vermittelten Mechanismuses der Kohlenstoffkatabolitrepression in Aspergillus und anderen filamentösen Pilzen haben das Produkt des creA Gens als den eigentlichen Repressor impliziert. Es ist nunmehr weitgehend anerkannt (siehe Scazzocchio, in Aspergillus; Biology and Industrial Applications, Butterworth-Heinemann, 1992, auf den Seiten 43 bis 63), daß wenn Glucose vorhanden ist, das creA Genprodukt die Expression von Genen reprimiert, die bei der Verwertung anderer Kohlenstoffsubstrate, wie Ethanol und Lactose, involviert sind und dadurch die Verwertung von diesen anderen Wegen inhibiert, wenn Glucose verfügbar ist. Die Klonierung und Analyse von creA aus Aspergillus nidulans würde kürzlich von Dowzer und Kelly in Mol. Cell. Biol. (1991) 11:5701 beschrieben.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Domäne in welcher das creA Genprodukt innerhalb der Promotorbereiche von glucosereprimierten Genen aus filamentösen Pilzen bindet, wurde nunmehr identifiziert. Diese Erkenntnis wird erfindungsgemäß dazu benutzt, um die creA-Bindedomäne innerhalb des glucose-reprimierten Promotors zu unterbrechen, und dadurch Promotorvarianten zur Verfügung zu stellen, welche die Expression in Gegenwart von Glucose antreiben können.
Insbesondere, und gemäß eines Aspekts der Erfindung, wird eine rekombinante DNA- Expressionskassette zur Verfügung gestellt, die geeignet ist, die Expression von proteinkodierender DNA in einem filamentösen Pilzwirt zu bewirken, wobei die Kassette die proteinkodierende DNA und, funktionsfähig damit verbunden, eine Promotorvariante enthält, die eine unterbrochene creA-Bindungsstelle aufweist, um die Expression der proteinkodierenden DNA in Gegenwart von Glucose zu gestatten.
Gemäß Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist die Promotorvariante aus dem Promotor eines Aspergillus Gens abgeleitet, welches in den Ethanolstoffwechsel eingebunden ist, ausgewählt beispielsweise aus den alcA, aldA und alcR Genen von Aspergillus nidulans.
Gemäß eines anderen ihrer Aspekte stellt die vorliegende Erfindung einen filamentösen Pilzstamm zur Verfügung, der eine rekombinante DNA-Expressionskasette eingebaut hat, welche heterologe DNA und, funktionsfähig damit verbunden, eine Promotorvariante enthält, die eine unterbrochene creA-Bindungsstelle aufweist.
Gemäß eines anderen Aspekts stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines gewünschten Proteins zur Verfügung, welches den Schritt umfaßt, in Gegenwart von Glucose einen filamentösen Pilzstamm zu kultivieren, der eine rekombinante DNA- Expressionskassette mit DNA eingebaut hat, welche für das gewünschte Protein kodiert und, funktionsfähig damit verbunden, eine Promotorvariante, die eine unterbrochene und räumlich erhaltene creA-Bindungsstelle aufweist.
Die Erfindung und deren bevorzugte Ausführungsformen werden nun im einzelnen unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben.

Kurze Bezugnahme auf die Zeichnungen

Fig. 1 zeigt die Nucleotidsequenz eines Bereichs des alcA-Promotors aus Aspergillus nidulans. Siehe auch SEQ ID NO: 3 des Sequenzprotokolls.
Fig. 2 zeigt schematische den Aufbau einer alcA-Promotorvariante.

Ausführliche Beschreibung und bevorzugte Ausführungsformen

Die vorliegende Erfindung stellt eine Strategie für die Veränderung von solchen Promotoren von Genen filamentöser Pilze zur Verfügung, die üblicherweise glucose-reprimiert sind, um Promotorvarianten zur Verfügung zu stellen, die in Gegenwart von Glucose funktionieren, um die Expression von proteinkodierender DNA anzutreiben, die funktionsfähig mit der Promotorvariante verbunden sind. Dies wird erreicht indem die creA-Bindungsstelle in dem glucose-reprimierten Promotor ausgeschaltet wird, entweder durch Deletion oder, mehr bevorzugt, durch Nucleotidsubstitution. So wie er hier verwendet wird, bezieht sich der Begriff "Promotorvariante" somit auf einen glucose-reprimierten Promotor, in dem die üblicherweise dort vorhandene creA-Bindungsstelle unterbrochen wurde, was der Promotorvariante erlaubt, in Gegenwart einer Glucosekonzentration zu funktionieren, welche ausreicht, um das Wachstum eines gegebenen filamentösen Pilzstamms aufrechtzuerhalten.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung können im Prinzip Promotorvarianten aus dem Promotor jeden glucose-reprimierten Gens eines filamentösen Pilzes, welches in seiner Promotorsequenz die creA-Bindungsdomäne enthält, entwickelt werden. Die creA- Bindungsdomäne ist als ein GC-reicher Abschnitt gekennzeichnet, und ist insbesondere als ein Nucleotidbereich anzusprechen, in dem mindestens sechs G oder C Reste innerhalb einer zusammenhängenden Strecke von zehn Nucleotiden eingebaut sind. Die spezifische Sequenz einer creA-Bindungsdomäne kann innerhalb dieses Parameters weit schwanken, und kann beispielsweise ganz aus zusammenhängenden G/C Resten, z. B. GCGGGGC, oder aus durch einen oder mehrere A und T Reste unterbrochenen G/C Resten bestehen.
Die creA-Bindungsdomäne innerhalb eines Promotors ist üblicherweise stromaufwärts von allen notwendigen regulatorischen Elementen, das heißt den translationalen und transkriptionalen Startpunkten, angeordnet. Für glucose-reprimierte Gene aus filamentösen Pilzen mit veröffentlichten Sequenzen wird die Identifizierung der creA-Bindungsdomäne natürlich eine einfache Aufgabe sein, bei welcher die GC-reiche Sequenz innerhalb dieser Sequenz lokalisiert werden muß. Für Gene, die kloniert wurden, für die aber noch keine Sequenz bekannt ist, kann die creA-Bindungsdomäne nach Sequenzierung des nichttranslatierten 5'-Bereichs des Gens lokalisiert werden, unter Verwendung auf dem Fachgebiet etablierter Methoden. Für andere glucose-regulierte Gene ist die Klonierung und anschließende Sequenzierung des nichttranslatierten 5'-Bereichs desselben notwendig, kann aber auch durch Verfahren erreicht werden, die im Bereich der Molekularbiologie etabliert sind.
Von den glucosereprimierten Promotoren, welche die creA-Bindungsdomäne enthalten, werden Promotorvarianten, die in Gegenwart von Glucose aktiv sind, erhalten indem die creA-Bindungsdomäne unterbrochen wird. Eine Unterbrechung kann erreicht werden, indem die gesamte creA-Bindungsdomäne und deren 5' Region deletiert werden, durch selektive Deletion innerhalb der creA-Bindungsdomäne des Promotors oder eines funktionellen Bereichs davon, oder, besonders bevorzugt, durch Ersetzen eines oder mehrerer der G/C Reste innerhalb der creA-Bindungsdomäne. Ersetzte Reste sind vorzugsweise Adenin und Thymin. Im Vergleich zu einer gesamten oder selektiven Deletion hat ein G/C Ersatz den Vorteil, daß die räumlichen Verhältnisse und die Funktion von anderen regulatorischen Domänen innerhalb der Promotorvariante erhalten bleiben. Natürlich kann dies insbesondere unter solchen Umständen wichtig werden, bei denen expressions-regulierende Bereiche innerhalb des Promotors an einer Stelle stromaufwärts der creA-Bindungsstelle existieren.
In einigen Fällen können Promotoren mehr als eine creA-Bindungsstelle enthalten, und um deren Glucoserepression zu eliminieren ist es erwünscht, jede der creA-Bindungsstellen innerhalb dieses Promotors zu unterbrechen. Dies kann, wie eben erwähnt, entweder durch Deletion dieser Stellen, durch Ersetzen von Resten innerhalb dieser Stellen, oder durch Kombination dieser Unterbrechungstechniken erreicht werden.
Gemäß spezieller Ausführungsformen der Erfindung ist die Promotorvariante eine Variante des unten bezeichneten Promotors aus Aspergillus nidulans, in welchem die unten beschriebene creA-Bindungsstelle durch Nucleotidersatz unterbrochen ist:
¹ = Gwynne et al., Gene (1987) 51:205
² = Picket et al., Gene (1987) 51:217
³ = Felenbok et al., Gene (1988) 73:385
&sup4; = Scazzocchio et al., 1992, oben
&sup5; = Sophianopoulou et al., Mol. Microbiol. (1989) 3:705
Die Erzeugung von Promotorvarianten, die in Gegenwart von Glucose wirksam sind, kann durch Verwendung dieser und anderer Promotoren erreicht werden, indem herkömmliche Methoden der Genmanipulation eingesetzt werden. Beispielsweise kann ein Bereich des ausgewählten Promotors, welcher die creA-Bindungsstelle enthält, unter Verwendung flankierender Restriktionsstellen herausgeschnitten und dann in einen für eine Amplifikation und nachfolgende Genmanipulationsbearbeitung geeigneten Vektor eingebaut werden. Die Technik der auf eine Stelle gerichteten Mutagenese kann dann eingesetzt werden um die creA-Zielbindungsstelle zu unterbrechen. Um die creA-Bindungsstelle und Sequenzen 5' davon zu deletieren, kann beispielsweise ein Oligonucleotid entworfen werden, welches jede gewünsche Restriktionsstelle unmittelbar 3' der creA-Stelle einfügt, um ein Herausschneiden zu ermöglichen. Die selbe Technik kann auch eingesetzt werden, um eine Nucleotidsubstitution innerhalb der creA-Bindungsstelle einzuführen, unter Verwendung eines Oligonucleotids, welches an den gewünschten Orten nicht zusammenpaßt, welches aber ansonsten komplementär ist zu und hybridisiert mit der Zielregion für die Unterbrechung. Die geeignete Technik der Polymerasekettenreaktion (PCR) kann ebenfalls mit dem auf die Stelle gerichteten Ansatz eingesetzt werden, um entweder den gesamten Promotor zu mutieren und dann zu amplifizieren oder einen ausgewählten Bereich davon. Die gewünschte Promotorvariante kann natürlich auch durch Anwendung von Methoden, die nunmehr auf dem Gebiet der Gensynthese Standard sind, neu synthetisiert werden. Kurz gesagt umfaßt dies die aufeinanderfolgende 3' nach 5' Verknüpfung von geeignet geschützten Nucleotidreagenzien in einer automatischen Syntheseeinrichtung, und dann die Gewinnung des von den Schutzgruppen befreiten Polynucleotids durch Gelreinigung. Der Blockligationsansatz kann verwendet werden, wobei "Blöcke" von Oligonucleotidpaaren, bis zu etwa 80 Nucleotide lang, synthetisiert und in korrekter Abfolge durch Überhangkomplementarität ligiert werden, wie beispielsweise von Wosnick et al., in Gene (1989) 76:153 beschrieben. Nach einem alternativen Ansatz kann die gewünschte DNA auch als Ganzes synthetisiert und dann mittels der PCR Technik amplifiziert werden, unter Verwendung der Strategie, wie sie beispielsweise von Barnett et al., in Nucl. Acids Res. (1990) 18:3094 beschrieben wurde.
Einmal erhalten kann die Promotorvariante dazu benutzt werden, um die Expression von DNA anzutreiben, die für jedes gewünschte Protein in einem filamentösen Pilzwirt kodiert, in Übereinstimmung mit Techniken die bereits anderweitig für die filamentösen Pilze etabliert wurden (für eine Übersicht siehe Ballance, Yeast (1986) 2:229). Für diesen Zweck stellt die vorliegende Erfindung rekombinante DNA-Konstrukte zur Verfügung, in welchen die Promotorvariante funktionsfähig mit der protein-kodierenden DNA verbunden ist. Der Ausdruck "funktionsfähig verbunden" bedeutet, daß der Promotor mit der proteinkodierenden DNA derart verbunden ist, daß deren Expression in einem filamentösen Pilzwirt ermöglicht wird. Für die Zwecke dieser Beschreibung bedeutet, daß proteinkodierende DNA ein translationales Startcodon und ein translationales Stopcodon enthält; sowie des weiteren für ein gewünschtes Proteinendprodukt an sich kodiert; ein Fusionsprotein, in welchem das gewünschte Protein ursprünglich in spaltbarer Kombination mit einem Trägerprotein, wie Glucoamylase aus Aspergillus niger, hergestellt wurde; oder eine abscheidbare Vorstufe, in welcher das gewünschte Proteinendprodukt mit einem spaltbaren Signalpeptid verbunden ist, wie einem Signalpeptid, das normalerweise mit einem Protein aus Aspergillus, beispielsweise Glucoamylase, oder einem funktionellen Äquivalent davon, assoziiert ist.
Zusätzlich zu dem Promotor und der protein-kodierenden DNA können die Konstrukte der vorliegenden Erfindung einen transkriptionalen Terminator an einer Stelle 3' von der proteinkodierenden DNA enthalten, obwohl die Erfahrung gezeigt hat, daß solche Terminatoren keine notwendigen Bestandteile des Konstrukts sind. Solche transkriptionalen Terminatoren können als 0,5-1,0 kb Fragmente des 3' nicht-kodierenden Bereichs von Aspergillus Genen, beispielsweise des Glucoamylasegens aus Aspergillus niger, erhalten werden.
Wenn das Konstrukt einmal erhalten ist, kann es unter Verwendung einer Technik, wie der DNA-vermittelten Transformation, Elektroporation, Teilchenbeschuß, Protoplastenfusion oder ähnlichen, entweder in linearer Form oder als Plasmid, beispielsweise in einem Vektor auf pUC-Basis oder einem anderen Vektor, in einen ausgewählten filamentösen Pilzwirt eingeführt werden. Um auf die erhaltenen Transformanden selektieren zu können, umfaßt die Transformation üblicherweise auch einen selektierbaren Genmarker, der mit der Expressionskassette in einen Wirtsstamm, in dem der Genmarker selektierbar ist, eingeführt wird, entweder mit dem selben Vektor oder durch Co-Transformation. Es sind verschiedene Marker/Wirtssysteme verfügbar, einschließlich der pyrG, argB und niaD Gene zur Verwendung mit auxotrophen Stämmen von Aspergillus nidulans; der pyrG und argB Gene für auxotrophe Aspergillus oryzae Stämme; der pyrG, trpC und niaD Gene von auxotrophen Penicillium chrysogenum Stämmen; und dem argB Gen für auxotrophe Trichoderma reesei Stämme. Dominante selektierbare Marker einschließlich amdS, oliC, hyg und phleo sind nun auch verfügbar für die Verwendung mit filamentösen Pilzen wie A. niger, A. oryzae, A. ficcum, P. chrysogenum, Cephalosporium acremonium, Cochliobolus heterostrophus, Glomerella cinuglata, Fulvia fulva und Leptosphaeria maculans (für eine Übersicht siehe Ward in Modern Microbial Genetics, 1991, Wiley-Liss, Inc., auf den Seiten 455-495).
Gemäß eines weiteren Aspekts der Erfindung werden die durch die Transformation erhaltenen filamentösen Pilzstämme in Gegenwart einer das Wachstum aufrecht erhaltenden Konzentration an Glucose kultiviert, um das gewünschte Proteinprodukt zu erhalten. Die Kultivierung des Stammes kann ohne die Notwendigkeit erreicht werden, glucose-arme Wachstumsbedingungen zu etablieren, da die Promotorvariante, welche die Expression des gewünschten Genprodukts antreibt, nicht länger funktionell in Gegenwart von Glucose reprimiert wird. Für die Promotoren, deren Funktion in anderer Weise nicht gesteuert wird, kann die Produktion des gewünschten Proteins während des gesamten Fermentationszeitraums erreicht werden. Auch eine phasenweise Produktion kann noch erzielt werden, indem Promotorvarianten verwendet werden, die durch andere Mechanismen als Glucoserepression gesteuert werden. Wie nachfolgend anhand eines Beispiels erläutert wird, kann der alcA Promotor sogar nach einer Unterbrechung der creA-Bindungsstelle durch die Verwendung eines induzierenden Agens, um die Proteinproduktion in einem bestimmten Fenster innerhalb der Fermentationsperiode zu begrenzen, funktionell gesteuert werden.

Beispiel 1

Herstellung einer alcA Promotorvariante

Der Promotor des alcA Gens aus A. nidulans wird durch eine Kombination aus dem creA- Genprodukt und Glucose reprimiert; er wird auch unter glucose-armen Wachstumsbedingungen durch eine Kombination aus dem alcR Genprodukt und einem induzierenden Agens, wie Ethanol, induziert. Um eine alcA Promotorvariante zu konstruieren, die in Glucose bei Konzentrationen funktioniert, die ausreichen, um das Wachstum von Aspergillus aufrechtzuerhalten, wurde der alcA Promotor auf die Weise erhalten, wie sie bei Gwynne et al. in Bio/Technology (1987) 5:713 angegeben ist, und wie unten beschrieben manipuliert.
Zwei mutmaßliche creA-Bindungsstellen (beide GCGGGGC) wurden zuerst durch Sequenzabtastung identifiziert. Wie in Fig. 1 gezeigt ist, befinden sich diese Stellen stromaufwärts des ATG Startcodons des alcA Gens an den Positionen -302 und -167, und beide liegen günstig innerhalb einer SphI/SplI Region des Promotors. Um einen durch Nucleotidersatz an diesen Stellen unterbrochenen alcA Promotor herzustellen, wurde ein 160 bp Fragment des Promotors unter Verwendung der unten angegebenen Primer mit Enden amplifiziert: (SEQ ID NR: 1) (SEQ ID NR: 2)
Es wurden fünfundzwanzig PCR-Amplifikationszyklen nach der Methode von Scharf, 1990, in: "PCR-Protocols: A Guide to Methods and Applications". M. A. Innis et al. (Herausgeb.), Academic Press, durchgeführt. Das mit einem HindIII/EcoRI-Ende versehene Amplifikationsprodukt wurde in einen pTZ18R Haltevektor unterkloniert und die genaue Sequenz der Variante wurde durch DNA-Sequenzanalyse überprüft. Der Haltevektor und das alcA Gen (pUC8 Hintergrund) in seiner gesamten Länge wurden dann jeweils mit SphI und SplI geschnitten, und dann selektiv ligiert, um das Plasmid palcAvar-2EB zu bilden, in welchem der SphI/SplI Bereich des alcA Promotors vom Wildtyp durch den Bereich der Variante ersetzt ist, der die Mutationen in den beiden mutmaßlichen creA-Bindungsstellen enthält. Durch dieses Vorgehen wurde auch die räumliche Anordnung der Nucleotide innerhalb des alcA Promotors bewahrt.
Da die Expression durch die alcA Promotorvariante die Induktion durch das Produkt des alcR Gens benötigt, welches selbst durch einen creA-vermittelten Mechanismus glucose-reprimiert ist, wurde ein Aspergillus nidulans Stamm, der das alcR Produkt in einer konstitutiven Weise herstellt, für die Expression des alcA Gens durch die Promotorvariante benutzt. Der ausgewählte Wirtsstamm wurde aus dem doppelt auxotrophen Glasgow-Stamm FGSC4 (argB-; ura-) hergestellt, indem er mit einem Plasmid transformiert wurde, das sowohl das argB Gen aus A. nidulans als selektierbaren Marker enthält als auch eine Expressionskassette, in welcher DNA, die für das alcR Produkt kodiert (siehe Felenbok et al., Gene (1989) 73:385), unter Expressionskontrolle des konstitutiven Promotors des Glyceraldehyd-3- phosphatdehydrogenasegens aus A. nidulans (siehe Punt et al., Gene (1988) 69:49) gestellt wurde. Um genügend Platz zu haben, damit mehrere Kopien der Kassetten, welche die alcA Promotorvariante tragen, integriert werden können wurde ein Stamm ausgewählt, der mehrere Kopien des konstitutiven alcR Gens enthielt, und als T2625 (ura, mehrfach alcRc) bezeichnet.
Das Plasmid palcAvar-2EB wurde dann zusammen mit dem Markerplasmid pFB94 in den ausgewählten A. nidulans Wirtsstamm eingeführt, welches das pyr4 Gen von Neurospora crassa trägt (siehe Buxton und Radford, Mol. Gen. Genet. (1983) 190:403). Transformiert wurde unter Verwendung der PEG/CaCl&sub2; vermittelten Technik nach dem von Royer et al., Mol. Gen. Genet. (1991) 225:168, berichteten Protokoll. Mutmaßliche Transformanden, welche das pFB94 Konstrukt enthielten, wurden zuerst ohne Uridin auf Minimalmedium selektiert. Gemischte Sporen, die von etwa 80 ura&spplus; Transformanden (3 mm Kolonien) auf einer einzigen Schale gesammelt wurden, wurde in 50 ml Selektivmedium (0,4% 2- Deoxyglucose (2-DOG), 1,0% Ethanol, 0,67% Hefenährlösung) überimpft. Die Kultur wurde bei 30ºC unter Schütteln (200 Upm) 3 Tage lang inkubiert. Es wurden flockenförmige Kolonien aus den Flüssigkulturen gesammelt, und es wurden für die weitere Analyse aus jeder der 2-DOG resistenten Kolonien Isolate, die von einzelnen Sporen abstammten, gewonnen.
Der Wirtsstamm und die Transformanden wurden als nächstes 48 Stunden lang bei 30ºC in Flüssigmedium kultiviert, das verschiedene Zusatzstoffe enthielt, die ausgewählt waren, um die Auswirkungen der Kohlenstoffquelle auf das Wachstum zu untersuchen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1, unten, dargestellt: Tabelle 1
Sporensuspensionen wurden in 50 ml Flüssigmedium überimpft, welchem 0,67% Hefestickstoff Basis (YNB) und 1 mM Uridin zugesetzt war; sowie gegebenenfalls Ethanol (1.0%), Glucose (0,4%) oder das nicht umgewandelte Analogon, 2-Deoxyglucose (2-DOG) (0,4%).
Wie die Tabelle zeigt, konnte der Wirtstamm in Gegenwart von entweder Glucose oder Ethanol oder einer Kombination davon wachsen. Er konnte weder nur in Gegenwart eines nicht umgewandelten Glucoseanalogons 2-DOG wachsen noch konnte er Ethanol in Anwesenheit von 2-DOG verwenden. Es ist klar, daß 2-DOG wirksam die Expression des alcA Gens des Wildtyps reprimiert, des Produkts, welches für die Verwertung von Ethanol benötigt wird. Andererseits konnten die palcAvar-2EB Transformanden in Anwesenheit von Ethanol wachsen, wenn dieser entweder zusammen mit Glucose oder wenn dieser als einzige Kohlenstoffquelle (sogar wenn Glucose oder ihr 2-DOG Äquivalent vorhanden waren) vorhanden war, wodurch schlüssig nachgewiesen wird, daß die Expression des für die Ethanolverwertung benötigten alcA Genprodukts durch die alcA Promotorvariante vermittelt wird.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE INFORMATION
(i) ANMELDER
(A) NAME: GIST-BROCADES N. V.
(B) STRASSE: Postfach 1
(C) STADT: Delft
(E) LAND: Niederlande
(F) POSTLEITZAHL: NL-2600 MA
(G) TELEFON: 31.15.799111
(H) TELEFAX: 31.15.793957
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: HERSTELLUNG VON HETEROLOGEN PROTEINEN IN FILAMENTÖSEN PILZEN
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 3
(iv) COMPUTERLESBARE FORM:
(A) ART DES MEDIUMS: Diskette
(B) COMPUTER: IBM PC kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIN Release #1.0, Version #1.25 (EPO)
(vi) DATEN DER FRÜHEREN ANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER: US 07/988,778
(B) ANMELDEDATUM: 10-Dez-1992
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR: 1:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 51 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANG: Einzeln
(D) TOPLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLART: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: JA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 1:
GACTGACTAA GCTTGCATGC GGAACCGCAC GAGGGTACTA CGGAAATTGA C 51
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR: 2:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 50 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANG: Einzeln
(D) TOPLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLART: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: JA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 2:
GACTGACTGA ATTCCGTACG GGGTAGTACT CGTTTGTGGC TCTCCGTGCG 50
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR: 3:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 360 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANG: Doppelt
(D) TOPLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLART: DNA (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(vi) HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Aspergillus nidulans (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 3:

Claims

1. Rekombinantes DNA-Konstrukt, in dem eine für Protein kodierende DNA funktionell mit einer filamentösen Pilzpromotorvariante verknüpft ist, die eine creA-Bindungsstelle aufweist, welche funktionell unterbrochen ist, wobei die Promotorvariante mehr als 130 Basispaare stromaufwärts von dem Initiationscodon enthält und wobei die Promotorvariante die Expression der für Protein kodierenden DNA in Gegenwart von Glucose vermittelt.

2. Rekombinantes DNA-Konstrukt nach Anspruch 1, worin die creA-Bindungsstelle durch Ersetzen von Nucleotidresten an dieser Stelle unterbrochen ist.

3. Rekombinantes DNA-Konstrukt nach Anspruch 2, worin der Nucleotidersatz aus A und T ausgewählt ist.

4. Rekombinantes DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Promotorvariante eine Variante eines Aspergillus-Promotors ist.

5. Rekombinantes DNA-Konstrukt nach Anspruch 4, worin die Promotorvariante eine Variante des Aspergillus-Promotors ist, der aus alcA, aldA, alcR, amds und prnB ausgewählt ist.

6. Filamentöser Pilzstamm, der ein rekombinantes DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 5 enthält.

7. Filamentöser Pilzstamm nach Anspruch 6 der Gattung Aspergillus.

8. Filamentöser Pilzstamm nach Anspruch 6 der Species Aspergillus nidulans.

9. Verfahren zum Herstellen eines gewünschten Proteins mit der Stufe des Züchtens eines filamentösen Pilzstamms nach einem der Ansprüche 6 bis 8 in Gegenwart von Glucose.

10. Stamm von Aspergillus nidulans, der das alcR-Genprodukt in Gegenwart von Glucose exprimiert und dadurch gekennzeichnet ist, daß der Stamm ein rekombinantes DNA-Konstrukt enthält, in dem eine für Protein kodierende DNA funktionell mit einer Variante des alcA-Promotors verknüpft ist, in dem alle creA-Bindungsstellen funktionell unterbrochen sind, wobei die Promotorvariante mehr als 130 Basispaare stromaufwärts von dem Initiationscodon enthält, und wobei die für Protein kodierende DNA exprimiert wird, wenn der Stamm in Gegenwart von Glucose und eines Induktors gezüchtet wird.

11. Verfahren zum Herstellen eines gewünschten Proteins mit der Stufe des Züchtens eines Stamms von Aspergillus nidulans gemäß Anspruch 10 in Gegenwart von Glucose und eines Induktors.