DE69331707T2 - Entsperrung des gemeinsamen syntheseweges von aromatischen aminosäuren - Google Patents

Description

Gebiet der Erfindung
• Diese Erfindung bezieht sich auf die Erhöhung der Effizienz von Biosythesereaktionen. Insbesondere bezieht sich diese Erfindung auf ein Verfahren zur Verbesserung der Biosynthese von aromatischen Verbindungen in dem gemeinsamen Syntheseweg in einer Wirtszelle durch Identifizierung des die Umsetzungsrate beschränkenden Reaktionsschrittes in dem Syntheseweg und genetische Konstruktion der Wirtszelle, um diese die Umsetzungsrate beschränkenden Schritte wirksam zu deblockieren.
Hintergrund und Zusammenfassung der Erfindung
• Der gemeinsame Syntheseweg der Biosynthese von aromatischen Aminosäuren, anders bekannt als der Shikimat-Syntheseweg, erzeugt die aromatischen Aminosäuren Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan in Bakterien und Pflanzen. Der Weg zu den aromatischen Aminosäuren besteht aus einem gemeinsamen Syntheseweg, der in dem Verzweigungspunktmolekül Chorismat endet, welches anschließend in Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan durch drei getrennte abschließende Synthesewege überführt wird. Die aromatischen Aminosäuren sind essentielle Zusätze zu der Nahrung von Menschen und Tieren, welchen das Vermögen der Synthese dieser Verbindungen fehlt. Sie sind ebenfalls Precursor für viele interessante und kommerziell wichtige Moleküle wie beispielsweise Aspa rtam, einen synthetischen Süßstoff, Indigo, einen üblichen Farbstoff, und L-DOPA, ein zur Bekämpfung der Auswirkungen von Parkinsonscher Krankheit verwendetes Arzneimittel, um einige zu benennen.
• Der Erfolg eines jeglichen biokatalytischen Weges zur Überproduktion der aromatischen Aminosäuren oder deren Derivate aus einer leicht verfügbaren Kohlenstoffquelle wie beispielsweise Glukose oder anderen Zuckern hängt ab von dem Vermögen, eine hohe Menge von Kohlenstoff durch den Syntheseweg des Wirtsorganismusses zu leiten. In dem Syntheseweg auftretende Metabolismenblöcke können die nachfolgende Ausbeute und Reinheit von durch die biokatalytische Umwandlung erzeugten Produkten beeinflussen.
• Frühere Ansätze zur Erhöhung der Wirksamkeit der Produktion des gemeinsamen Syntheseweges von aromatischen Biosynthesen wurden in dem US-Patent Nr. 5,186,056, erteilt am 1. Dezember 1992 auf Grundlage der US-Anmeldung Nr. 07/652,993, eingereicht am 8. Februar 1991, deren Offenbarung hiermit durch Bezugnahme auf diese ausdrücklich mit umfasst sei, beschrieben. Das Patent beschreibt eine verwandte Erfindung, die auf die Erhöhung des Kohlenstofflusses in dem Syntheseweg durch Erhöhung der in vivo katalytischen Aktivität von DAHP-Synthase und Transketolase gerichtet ist. Während die oben genannte Patentbeschreibung andeutet, dass andere Enzyme, die Schritte in dem gemeinsamen Syntheseweg katalysieren, in Kombination mit der hauptsächlich darauf abgezielten Transketolase und DAHP-Synthase überexprimiert werden können, wurde es gefunden, dass ein erhöhter in den gemeinsamen Syntheseweg gerichteter Kohlenstoffluss verloren wird, falls ein oder mehrere Synthesewegenzyme vorhanden sind, die nicht in der Lage sind, die Umwandlung von intermediären Substraten zu Produkten mit Raten, die vergleichbar mit den Raten sind, mit welchen jene intermediäre Substrate produziert werden, zu katalysieren. Demzufolge bestehen gewisse die Umsetzungsrate beschränkende Schritte in dem biosynthetischen Syntheseweg, die arbeiten, um den Fortschritt der Reaktionsschritte durch den Syntheseweg zu behindern. Die vorliegende Erfindung beseitigt diese Hindernisse.
• Die Analyse von Kulturüberständen des Escherichia coli Stammes D2704 (pheA-, tyrA-, ΔtrpE-C) unter Verwendung von kernmagnetischer Resonanzspektroskopie (NMR) hat 3-Dehydrochinatsynthase, Shikimatkinase, 5-Enolpyruvoylshikimat-3-phosphatsynthase und Chorismatsynthase als die die Umsetzungsrate beschränkenden Enzyme in dem gemeinsamen Syntheseweg der Biosynthese von aromatischen Aminosäuren identifiziert. Die Einführung eines Plasmids enthaltend die genetischen Fragmente, die für aroL (Shikimatkinase), aroA (EPSP-Synthase) und aroC (Chorismatsynthase) kodieren, zusammen mit dem Plasmid pKD136 (ein Plasmid, von dem gezeigt wurde, dass es eine erhöhte Menge von Kohlenstoff in dem gemeinsamen Syntheseweg der Biosynthese von aromatischen Aminosäuren bindet) in den Escherichia coli-Stamm D2704 resultiert in der Entfernung der Mehrheit der Substrate der die Umsetzungsrate beschränkenden Enzymen aus der Kulturnährbrühe sowie auch einen signifikanten Anstieg der Herstellung der Endprodukte.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
• Fig. 1 illustriert den gemeinsamen Syntheseweg der Biosynthese von aromatischen Aminosäuren.
• Fig. 2 zeigt Plasmidkarten von pKD130A und pKD136.
• Fig. 3a und 3b sind Säulendiagramme, die die Konzentration von Zwischenstoffen gemeinsamer Synthesewege von D2704 Stämmen von E. coli und die durchschnittlichen Phenylalanin- und Phenylmilchsäure-Konzentrationen für diese Stämme darstellen.
• Fig. 4 illustriert den Aufbau von Plasmid pKD28 aus Plasmiden pIA321 und pSU18.
• Fig" 5 ist ähnlich zu Fig. 4 und zeigt den Aufbau des Plasmids pKAD31.
• Fig. 6a, 6b und 6c veranschaulichen die Herstellung von aroEaroL Plasmid pKAD34.
• Fig. 7 bis 13 sind ähnlich zu Fig. 4 bis 7 und zeigen jeweils den Aufbau der Plasmide pKAD38, pKAD43, pKAD39, pKAD50, pKAD44, pKAD51 und pKAD42.
• Fig. 14 ist ein Diagramm, das die Gesamtakkumulation Phenylalanin, Phenylmilchsäure und Prephensäure in einem Kulturmedium von E. coli-Transformanden gemäß dieser Erfindung veranschaulicht.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
• In Übereinstimmung mit der Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung der Biosynthese von aromatischen Verbindungen in einer Wirtszelle über den gemeinsamen Weg Syntheseweg bereitgestellt. In dem Syntheseweg wird eine metabolisierbare Kohlenstoffquelle in intermediäre aromatische Verbindungen in einer mehrstufigen Reaktionsfolge überführt, die durch die auf die intermediären Substrate wirkenden Enzymspezies charakterisiert ist. Eine Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens weist die Entwicklung eines Verfahrens zur Identifizierung der geschwindigkeitsbegrenzenden Schritte in dem Reaktionsweg auf, das Verfahren weist die Schritte der Analyse der Überstände von einer Kultur einer Wirtszelle auf, um akkumulierte Intermediate des gemeinsamen Syntheseweges - die Substrate für die durch Enzyme vermittelten geschwindigkeitsbegrenzenden Schritte in dem Syntheseweg - zu identifizieren. Nachdem die geschwindigkeitsbegrenzenden Schritte identifiziert sind, wird die Wirtszelle mit rekombinanter DNA, die DNA enthält, welche für Enzymspezies kodiert, die auf die identifizierten akkumulierten Intermediat- Substrate in den geschwindigkeitsbegrenzenden Reaktionsschritten des Syntheseweges wirkt, transformiert, um die Expression der Enzymspezies in den Wirtszellen zu erhöhen. Zusätzlich kann die gesteigerte Expression der Enzymspezies, welche in den geschwindigkeitsbegrenzenden Schritten involviert sind, auch durch eine genetische Maßschneiderung der Wirtszellen zur Überexpression endogener Gene für derartige Enzymspezies erzielt werden, entweder durch Modifizierung von endogenen Kontrollsequenzen oder durch Beeinflussung der Derepression von existierenden Expressionskontrollsequenzen unter Verwendung von auf dem Fachgebiet akzeptierter Verfahren.
• Unabhängig von dem genauen Mechanismus, der für die Steigerung der Expression der geschwindigkeitsbegrenzenden Enzymspezies verwendet wird, wird es angenommen, dass ein solcher typischerweise durch den Transfer von rekombinanten genetischen Elementen in die Wirtszellen beeinflusst oder vermittelt wird. Genetische Elemente, wie sie hier definiert sind, umfassen Nukleinsäuren (im allgemeinen DNA oder RNA) mit expremierbaren kodierenden Sequenzen für Produkte wie Beispielsweise Proteine, insbesondere Enzyme, Apoproteine oder Antisense-RNA, welche die Expression von geschwindigkeitsbegrenzenden Enzymen in dem gemeinsamen Syntheseweg expremieren oder regulieren. Die expremierten Proteine können als Enzyme fungieren, die Enzymaktivität reprimieren oder dereprimieren oder die Expression von Enzymen kontrollieren. Die rekombinante DNA, die diese expremierbaren Sequenzen kodiert, kann entweder chromosal (in das Wirtszellenchromosom beispielsweise durch homologe Rekombination integriert) oder extrachromosal (beispielsweise getragen durch Plasmide, Cosmide und andere Vektoren, die in der Lage sind, die beabsichtigte Transformation zu bewirken) sein. Es ist zu verstehen, dass die für die Transformation der Wirtszelle in Übereinstimmung mit dieser Erfindung verwendete rekombinante DNA zusätzlich zu strukturellen Genen Expressionskontrollsequenzen umfassen kann, die Promotoren, Repressoren und Verstärker einschliessen, die bewirken, die Expression oder Derepression von kodierenden Sequenzen für Proteine, Apoproteine oder Antisense-RNA zu kontrollieren. Beispielsweise können derartige Kontrollsequenzen in Wirtszellen von Wildtypen insertiert werden, um eine Überexpression von ausgewählten Enzymen, die bereits in dem Genom der Wirtszellen kodiert sind, zu fördern, oder sie können alternativ verwendet werden, um die Synthese von extrachromosal kodierten Enzymen zu kontrollieren.
• Die rekombinante DNA kann in die Wirtszelle durch Plasmide, Cosmide, Phagen, künstliche Hefechromosomen oder andere Vektoren, die den Transfer von genetischen Elementen in eine Wirtszelle vermitteln, eingefügt werden. Diese Vektoren können einen Ursprung der Replikation zusammen mit cis-wirkenden Kontrollelementen, die die Replikation der Vektoren und der genetischen Elemente, die von dem Vektor getragen werden, einschließen. Auswählbare Marker können auf dem Vektor anwesend sein, um bei der Identifizierung von Wirtszellen, in welche genetische Elemente eingeführt worden sind, zu unterstützen. Beispiele für derartige auswählbare Marker sind Gene, die eine Resistenz auf besondere Antibiotika wie beispielsweise Tetracyclin, Ampicillin, Chloramphenicol, Kanamycin oder Neomycin verleihen.
• Ein bevorzugtes Mittel zur Einführung von genetischen Elementen in eine Wirtszelle benutzt einen extrachromosalen Mehrfachkopie- Plasmidvektor, in welchem genetische Elemente in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung insertiert worden sind. Eine durch Plasmide übertragene Einführung des genetischen Elementes in die Wirtszellen beinhaltet eine anfängliche Spaltung eines Plasmidvektors mit einem Restriktions-Enzym, gefolgt durch eine Verknüpfung des Plasmide und der genetischen Elemente, die für die als Ziel definierte Enzymspezies in Übereinstimmung mit der Erfindung kodieren. Bei der Rezirkularisation des verknüpften rekombinanten Plasmids wird eine Infektion (z. B. Verpackung in Lambda-Phagen) oder andere Mechanismen zum Plasmidtransfer (z. B. Elekt roporation, Mikroinjektion usw.) verwendet, um das Plasmid in die Wirtszelle zu überführen. Für die Insertion von genetischen Elementen in die Wirtszelle geeignete Plasmide umfassen, aber sind nicht beschränkt auf, pBR322 und dessen Derivate wie beispielsweise pAT153, pXf3, pBR325 und pBR327, pUC-Vektoren, pACYC und dessen Derivate, pSC101 und dessen Derivate und ColE1.
• Geeignete Wirtszellen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind Mitglieder von solchen Gattungen, die in der Lage sind, für eine industrielle biosynthetische Herstellung der gewünschten aromatischen Verbindungen verwendet zu werden. Dementsprechend umfassend die Wirtszellen Prokarionten, die zu den Gattungen Escherichia, Corynebacterium, Brevibacterium, Arthrobacter, Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces, Staphylococcus oder Serratia gehören. Eukariontische Wirtszellen können ebenfalls verwendet werden, wobei Hefen der Gattungen Sacchharomyces oder Schizosaccharomyces bevorzugt sind.
• Insbesondere werden prokariontische Wirtszellen aus Spezies erhalten, ohne auf diese beschränkt zu sein, die Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium herculis, Brevibacterium divaricatum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium flavum, Bacillus brevis, Bacillus cereus, Baccillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus lichenformis, Bacillus megaterium, Bacillus mesentericus, Bacillus pumilis, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas angulata, Pseudomonos fluorescens, Pseudomonas tabaci, Streptomyces aureofaciens, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, Streptomyces kasugensis, Streptomyces lavendulae, Streptomyces lipmanii, Streptomyces lividans, Staphylococcus epidermis, Staphylococcus saprophyticus, oder Serratia marcescens umfassen.
• Bevorzugte eukariontische Wirtszellen umfassen Saccharomyces cerevisiae oder Saccharomyces carlsbergensis.
• Zur industriellen Herstellung von primären Metaboliten, die aus Chorismat erhalten wurden (wie beispielsweise aromatische Aminosäuren) sind deregulierte Mutantenstämme der oben genannten Spezies, denen eine Feedback-Inhibition von einem oder mehreren Enzymen in dem biosynthetischen Syntheseweg der Metaboliten fehlen, bevorzugt. Derartige Stämme können durch zufallsverteilte oder ausgerichtete Mutagenese erzeugt werden oder sind kommerziell erhältlich. Beispiele von E. Coli-Stämmen, die eine entfernte Feedback-Inhibition der DAHP-Synthase, Prephenatdehydratase oder Chorismatmutase haben, sind in dem US-Patent 4,681,852 von Tribe und dem US-Patent 4,753,883 von Backman et al., deren Offenbarung hiermit durch Inbezugnahme mitumfasst ist, beschrieben.
• In den bevorzugten Ausführungsbeispielen der vorliegenden Erfindung wird die verstärkte Expression von geschwindigkeitsbegrenzenden Enzymspezies in den Wirtszellen durch Transformation der Wirtszellen mit einem Plasmidvektor erreicht, der für die Enzymspezies 3-Dehydrochinatsynthase, Shikimatkinase und 5-Enolpyruvoylshikimat-3-phosphat-Synthase (EPSP-Synthase) kodierende DNA aufweist. Mehr bevorzugt weist der transformierende Vektor des weiteren DNA auf, die für Chorismatsynthase kodiert. In dem am meisten bevorzugten Ausführungsbeispiel des Verfahrens nach der vorliegenden Erfindung wird ein E. Coli-Stamm mit rekombinanter DANN transformiert, welche DNA enthält, die für die Enzyme Transketolase (tkt), 3-Desoxy-D-arabino-heptulosonat-7-phosphat- Snythase (DAHP-Synthase), 3-Dehydrochinatsynthase (DHQ- Synthase), Shikimatkinase, 5-Enolpyruvoylshikimat-3-phosphat- Synthase und Chorismatsynthase kodiert, um die Expression von diesen Enzymen in den Wirtszellen zu erhöhen.
• Typischerweise wird die rekombinante DNA in die Wirtszellen als ein Teil von einem oder mehreren rekombinanten Plasmidvektoren, die die für die Enzymspezies kodierende DNA enthalten, eingeführt.
• Andere Ausführungsbeispiele nach der vorliegenden Erfindung umfassen Zelltransformanden, die in Übereinstimmung mit dem Verfahren nach dieser Erfindung hergestellt sind, und ein Verfahren, welches derartige Zelltransformanden verwendet, um eine aromatische Verbindung biokatalytisch aus einer Kohlenstoffquelle herzustellen. Das Verfahren enthält den Schritt der Kultivierung eines Zelltransformanden nach dieser Erfindung, der in der Lage ist, eine Kohlenstoffquelle in dessen gemeinsamem Syntheseweg bei der Anwesenheit einer derartigen Kohlenstoffquelle unter Bedingungen, die der Verwendung der Kohlenstoffquelle in dem Syntheseweg förderlich sind, zu verwenden. Andere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen Plasmidkonstrukte, die strukturelle Gene für zwei oder mehr der geschwindigkeitsbegrenzenden Enzyme des gemeinsamen aromatischen biosynthetischen Synthesewegs aufweisen. Zum Beispiel weist eine bevorzugte Konstruktion strukturelle Gene für Shikimatkinase und EPSP-Synthase auf, wobei mehr bevorzugt gleichzeitig auch das strukturelle Gen für Chorismatsynthase mit eingeschlossen ist. Ein mit derartigen Plasmid-Konstrukten transformierter Mikroorganismus ist eine weitere in Betracht gezogene Ausführungsform nach der vorliegenden Erfindung.
• Wie oben bemerkt, gab es frühere Anstrengungen, die biosynthetische Herstellung von Verbindungen, die aus dem gemeinsamen Syntheseweg in einer Wirtszelle abgeleitet wurden, durch Erhöhung der Expression von Proteinen, die Reaktionen in diesem Syntheseweg katalysieren, zu steigern. Die vorliegende Erfindung stellt eine signifikante Verbesserung der Effizienz der Herstellung von aromatischen Verbindungen in Wirtszellen über den gemeinsamen Syntheseweg bereit. Während frühere Berichte gelehrt haben, dass der Kohlenstofffluss in das obere Ende (die anfänglichen Reaktionssequenzen) des Syntheseweges erhöht werden kann, indem die Konzentrationen von Transketolase allein oder in Kombination mit anderen Enzymen des gemeinsamen Syntheseweges, z. B. DAHP- Synthase, DHQ-Synthase und sogar Shikimatkinase gesteigert werden, so bestand durch die früheren Arbeiten keine Anregung, dass die die Umsetzungsrate limitierenden Enzymspezies identifiziert werden könnten und dass diese Identifizierung als ein Anhaltspunkt verwendet werden könnte, um die Wirtszelle für eine Überexpression der die Umsetzungsrate limitierenden Enzymspezies zu transformieren, um eine signifikante Steigerung des Kohlenstoffflusses durch den aromatischen Syntheseweg (wie durch die Konzentration von "im Verfahren befindlichen" aromatischen Metaboliten in dem Kulturmedium von Transformandenwirtszellen bewiesen wird) bereitzustellen. Daher kann die vorliegende Erfindung gleichzeitig auch als eine Verbesserung von früheren Anstrengungen zur Erhöhung der biosynthetischen Herstellung von Verbindungen, die aus dem gemeinsamen Syntheseweg abgeleitet werden, angesehen werden, wobei die Verbesserung die Schritte der (1) Identifizierung des geschwindigkeitsbegrenzenden Reaktionsschrittes in dem besagten Syntheseweg und (2) die Erhöhung der Expression jenen Proteinen, die die identifizierten geschwindigkeitsbegrenzenden Schritte in dem Syntheseweg katalysieren, aufweist. Die erhöhte Expression wird wiederum bevorzugt in Übereinstimmung mit dieser Erfindung durch Transformierung der Wirtszelle erzielt, um konstitutiv exogene Gene, die für die genannten Proteinkatalysatoren (Enzyme) kodieren, zu expremieren, um die Konzentration von diesen Proteinen in der Wirtszelle zu erhöhen. Die Verbesserung wurde insbesondere gezeigt, wenn die Wirtszelle ein Stamm von E-Coli ist, die transformiert ist, um exogene strukturelle Gene zu exprimieren, die die Gene für Transketolase, 3-Desoxy-D-arabino-heptulosonat-7-phosphat-Synthase, 3- Dehydrochinatsynthase, Shikimatkinase, 5-Enolpyruvoylshikimat-3- phosphat-Synthase und Chorismatsynthase enthalten.
• D2704, ein Escherichia Coli-Stamm, der pheA-, tyrA- und ÄtrpE-C ist, sollte theoretisch dazu in der Lage sein, Chorisminsäure zu produzieren, da die endständigen Synthesewege, die zu Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan führen, jeweils blockiert sind ( Fig. 1). Unter Verwendung dieses Stammes war die Deblockierung des gemeinsamen Syntheseweges der Biosynthese von aromatischen Aminosäuren in E-Coli, wenn ein erhöhter Vorrat von Kohlenstoff in dem Syntheseweg festgelegt war, mit der erhöhten Akkumulation von Chorismat als ein Indikator für eine erfolgreiche Blockierung geplant. Das Wachstum von D2704-Zellen in reichem Medium, gefolgt von der Resuspension in Akkumulationsmedien mit minimalen Salzen, ergab eine geringe oder keine Akkumulation von Chorismat aber ergab erhöhte Gehalte von Phenylalanin. Die Herstellung von Phenylalanin kann durch die nicht-enzymatische Claisen- Umlagerung von Chorisminsäure zu Prephensäure, gefolgt von einer Dehydratation, um Phenylbrenztraubensäure herzustellen, erklärt werden. Obwohl das Enzym Chorismatmutase die Konversion von Chorismat in Prephenat um 2 · 10&sup6; bei 37ºC beschleunigt, kann die Reaktion in der Abwesenheit des Enzyms auftreten. Es wurde berichtet, das Prephensäure unter milden sauren Bedingungen wie unter solchen, die während normaler Kultivierung von Zellen erzeugt werden, nicht-enzymatisch Phenylpyruvat ergibt. Mit der Herstellung von Phenylbrenztraubensäure sollte der Mikroorganismus in der Lage sein, Phenylalanin unter Verwendung der intakten Aminotransferase, die durch tyrB kodiert wird, zu synthetisieren. Signifikante Mengen von Phenyllactat wurden jedoch in manchen der Kulturüberstände beobachtet.
• Die aromatische Aminotransferase, die durch tyrB kodiert wird, transaminiert die aromatische Ketosäure unter Verwendung von Glutamat als Stickstoffdonor und Pyridoxalphosphat als ein Koenzym. [Mavrides, C. In Methods in Enzymology; Akademie: San Diego, 1987, 142, Seiten 253-267.] Die Herstellung von Phenylmilchsäure könnte aufgrund von unzureichenden Zufuhren von Glutamat in den Zellen begründet sein, um vollständig die gesamte Phenylbrenztraubensäure zu transaminieren. Die Reduktion von Phenylbrenztraubensäure zu Phenyllaktat könnte auftreten, um eine ZufL.hr von NAD+ innerhalb der Zellen zu regenerieren. Es ist bekannt, dass eine analoge Reduktion von Pyruvat zu Milchsäure, die durch das Enzym Laktatdehydrogenase [Holbrook, J. J.; Liljas, A.; Steindel, S. S.; Rossmann, M. G. In The Enzymes; Boyer, P. D., Ed.; Academic Press: New York, 1975; Vol. 11, Kapitel 4] katalysiert ist, unter anaeroben Bedingungen auftritt, um eine Zufuhr von NAD+ für die fortgesetzte Funktionierung der Glykolyse zu regenieren.
• Die Aktivität der aromatischen Aminotransferase könnte ebenfalls durch die Anwesenheit der pheA-Mutation in D2704 begrenzt sein. Es wurde gezeigt, dass das bifunktionelle Enzym Chorismatmutase - Prephenatdehydratase, das durch pheA kodiert wird, mit der aromatischen Aminotransferase in der Anwesenheit von Phenylpyruvat wechselwirkt, um einen Komplex in E. Coli zu bilden [Powell, J. T.; Morrison, J. F.; Biochem. Biophys. Acta, 1979, 568, 467- 474]. Da D2704 pheK ist, sollte es unmöglich sein, das Chorismatmutase - Prephenatdehydratase - Enzym, welches für die Bildung des Komplexes notwendig ist, herzustellen. Obwohl die Rolle der Enzym - Enzym - Wechselwirkung nicht bestimmt worden ist, existiert die Möglichkeit, dass das Unvermögen, den Komplex zu bilden, die Aktivität der Aminotransferase beeinflussen könnte, was in dem Aufbau von Phenylbrenztraubensäure innerhalb der Zelle resultiert. Obwohl die oben genannten Theorien plausibel sind, muss der Grund für die Phenyllaktat-Akkumulation immer noch experimentell bestimmt werden. Es ist jedoch sicher anzunehmen, dass die Akkumulation von Phenyllaktat deblockierte Glukose -Äquivalente aus dem gemeinsamen Syntheseweg repräsentiert. Daher wurde die erfolgreiche Entfernung von metabolischen Blöcken aus dem gemeinsamen Syntheseweg der Biosynthese von aromatischen Aminosäuren durch die kombinierte Gesamtakkumulation von Phenylalanin und Phenylmilchsäure in der folgenden Studie gemessen. Die Akkumulation von Zwischenstoffen des gemeinsamen Syntheseweges in dem Überstand der Kultur wurde verwendet, um Enzyme zu identifizieren, welche geschwindigkeitsbegrenzende Schritte in dem Fluss von Kohlenstoff abwärts des gemeinsamen Syntheseweges waren, wobei der Befund benutzt wurde, dass der akkumulierte Zwischenstoff das Substrat eines geschwindigkeitsbegrenzenden Enzyms war.
• Fünf Milliliter Starterkulturen von jedem Stamm wurden in LB- Medien enthaltend die geeigneten Mittel für zehn Stunden wachsen gelassen. Die Starterkulturen wurden verwendet, um einen Liter der Kulturen von LB in Vier-Liter Erlenmeyer-Kolben zu impfen, wobei Isopropyl B-D-Thiogalactopyranosid (IPTG) (0,2 mM), Chloramphenicol (20 mg/L) und Ampicillin (50 mg/L) bei Bedarf zugefügt wurden. Der eine Liter der Kulturen wurde für 12 Stunden bei 37ºC unter Rühren (250 Umdrehungen pro Minute) wachsen gelassen. Die Zellen wurden geerntet (3,000 g; 5 Minuten; 4ºC) und dreimal mit M9-Salzen gewaschen [M9-Salze enthält (je Liter): 6 g Na&sub2;HPO&sub9;, 3 g KH&sub2;PO&sub4;, 0,5 g NaCl, 1g NH&sub4;Cl] (300 Milliliter Waschung für jede Probe). Pellets der Zellen wurden in einem Liter von M9 Akkumulationsmedium in einem Vier-Liter Erlenmeyer- Kolben enthaltend Glukose (10 g), MgSO&sub4; (1 mM) und Thiamin (30 mg) resuspendiert, wobei die Zugabe von Chloramphenicol, Ampicillin und IPTG benötigt wurde. Die Zellen wurden für weitere 48 Stunden in dem Akkumulationsmedium bei 37ºC unter Rühren (250 Umdrehungen pro Minute) inkubiert. Aliquote (25 ml) wurden nach 24 und 48 Stunden Intervallen entfernt und zentrifugiert (6,000 g; 5 Minuten; 4ºC). Zehn Milliliter des isolierten Überstandes wurden von jeder Probe gesammelt und das Wasser wurde im Vakuum entfernt. Die Proben wurden zweimal mit D&sub2;O ausgetauscht und durch ¹H NMR analysiert. Das Natriumsalz von 3- (Trimethylsilyl)propion-2,2,3,3-d&sub4;-Säure wurde als ein interner Standard verwendet, um die bei der Akkumulation hergestellten Zwischenstoffe und Endprodukte zu quantifizieren. Alle Kulturen wurden in dreifachen Proben wachsen gelassen, so dass Mittelwerte der akkumulierten Moleküle sowie auch deren Standardabweichungen erhalten werden konnten.
• Um einen Vorrat von Kohlenstoff durch den gemeinsamen Syntheseweg der Biosynthese von aromatischen Aminosäuren zu erzeugen, wurde ein Plasmid enthaltend Transketolase tkt und das Tyrosinempfindliche Isozym von 3-Desoxy-D-arabino-heptulosonat-7- phosphat-Synthase (DAHP-Symthase), aroF, eingesetzt. Es ist gezeigt worden, dass Transketolase die Gehalte von den Zellen verfügbarem Erythrose-4-phosphat zur Verwendung bei der Herstellung von aromatischen Aminosäuren erhöht, während DAHP-Synthase der erste irreversible Schritt des Syntheseweges ist. Das tkt, aroF- Plasmid pKD130A (Fig. 2), ein pBR325-Derivat mit intaktem Ampicillin-Resistenz Gen und ein pMB1-Ursprung der Replikation, akkumulierte die Zwischenstoffe des gemeinsamen Syntheseweges 3- Desoxy-D-arabino-heptulosonat-7-phosphat (DAHP), 3-Dehydroshikimat (DHS), Shikimat und Shikimat-3-phosphat mit einer Gesamtakkumulation von Phenylalanin und Phenyllaktat von 5,6 ± 0,7 mM bei Einführung in D2704 (Fig. 3). Nach einer Inkubation für 48 Stunden wurden ¹H NMR Resonanzen für DAHP bei δ 1,79 (dd, 13, 13 Hz, 1H), δ 2,20 (dd, 13, 5 Hz, 1H), δ 3,46 (dd, 9,9 Hz, 1H) und δ 3,83 (m, 2 H) gefunden. Die Anwesenheit von Shikimat in den Kulturmedien wird durch die Resonanzen bei δ 4,41 (dd, 4, 4 Hz, 1H) und δ 6,47 (m, 1H) gezeigt. Eine Resonanz für Shikimatphosphat liegt bei δ 6,47 (m, 1H). Die Resonanzen für Phenylalanin wurden bei δ 3,14 (dd, 14, 8 Hz, 1H), δ 3,29 (dd, 14, 5 Hz, 1H) und δ 7,30-7,49 (m, 5H) gefunden. Beobachtbare Resonanzen für Phenylmilchsäure wurden bei δ 4,27 (dd, 8, 4 Hz, 1H) und δ 7,30-7,49 (m, 5 H) gefunden. DHS verschwand aus den Akkumulationsmedien zwischen 24 und 48 Stunden.
• Die Akkumulation von DAHP, DHS, Shikimat und Shikimat-3-phosphat in den Überständen der Kulturen führt zu der Bestimmung von jeweils 3-Dehydrochinat-Synthase (DHQ-Synthase), Shikimatdehydrogenase, Shikimatkinase und 5-Enolpyruvoylshikimat-3-phosphat- Synthase (EPSP-Synthase) als geschwindigkeitsbegrenzende Enzyme. Obwohl DHQ-Synthase und Shikimatdehydrogenase zuvor als geschwindigkeitsbegrenzede Schritte in dem gemeinsamen Syntheseweg identifiziert worden sind [Draths, K. M.; Frost, J. W.; J. Am. Chem. Soc. 1990, 112, 9360-9632; Draths, K. M., Ph.D. Dissertation, Stanford University, Juni 1991] ist die Identifizierung von Shikimatkinase und EPSP-Synthase als geschwindigkeitsbegrenzende Schritte in der Literatur nicht berichtet worden.
• Um die Akkumulation von DAHP in dem Kulturüberstand zu entfernen wurde ein tkt, aroF, aroß-Plasmid pKD136 (Fig. 2) in D2704 eingeführt. Unter Verwendung von pKD136 wurde DAHP erfolgreich von dem Überstand der Kultur entfernt, was in einer erhöhten Akkumulation von DHS, Shikimat und Shikimat-3-phosphat resultierte, nicht aber in einem Anstieg in Phenylalanin und Phenyllaktat (Fig. 3). Fig. 3a zeigt Konzentrationen von Zwischenstoffen des gemeinsamen Syntheseweges, die in D2704-Stämmen nach 24 Stunden des Wachstums in minimalen Medien akkumuliert wurden. Fig. 3b illustriert die Gesamtakkumulation von Phenylalanin und Phenyllaktat nach 24 und 48 Stunden des Wachstums in minimalem Medium. Die untersuchten Stämme schließen ein 1) D2704/pKD130A; 2) D2704/pKD136; 3) D2704/pK136/pKD28; 4) D2704/pKD136/pKAD34; 5) D2704/pKD136/pKAD31; 6) D2704/pKD136/pKAD38; 7) D2704/pKD136/ pKAD43; 8) D2704/pKD136/pKAD39; 9) D2704/pKD136/pKAD51; 10) D2704/pKD136/pKAD44; 11) D2704/pKDS136/pKAD50. Obwohl daher sogar ein geschwindigkeitsbestimmender Schritt aus dem Syntheseweg entfernt worden ist, wurde keine erhöhte Akkumulation von Endprodukten beobachtet.
• Das Fehlen von zweckmäßigerweise einmaligen Restriktionsschnittstellen für die Einführung von aroE in pKD136 resultierte in der Verwendung eines 2-Plasmid-Systems für den Rest der Deblockierungsexperimente. Das System bestand aus pKD136 und den aus pSU2718/pSU2719 [Martinez, E.; Bartolome, B.; de la Cruz, F. Gene, 1988, 68, 159-162] erhaltenen Plasmiden pSUIS und pSU19, die eine Chloramphenikol-Resistenz aufweisen, einen lac-Promotor und einen p15A Ursprung der Replikation, in welche die verbleibenden deblockierenden Gene insertiert wurden. Ein auf pSUIB basierendes aroE-Plasmid, pKD28, [Draths, K. M., Ph.D. Dissertation, Stanford University, Juni 1991] wurde durch Isolierung eines 1,6 kb-Fragments enthaltend einen tac-Promotor und das aroE-Gen von pIA321 [Anton, I. A.; Coggins, J. R. Biochem. J., 1988 249, 319- 326] gefolgt von einer Ligation in pSU18, wie in Fig. 4 gezeigt, erzeugt. D2704/pKD136/pKD28 entfernte nicht vollständig den Zwischenstoff aus dem Überstand der Kultur, während sie den Gehalt der DHS-Akkumulation reduzierten. Shikimat und Shikimat- 3-phosphate waren nach wie vor in der Nährlösung der Kultur anwesend. Die gesamte Produktion von Phenylalanin und Phenyllaktat wurde auf 2,1 ± 0,9 mM nach 48 Stunden des Wachstums reduziert (Fig. 3), was impliziert, dass der erhöhte Fluss von Kohlenstoff aus der Deblockierung von aroE nicht in einer zusätzlichen Akkumulation der Endprodukte resultierte.
• Um die geschwindigkeitsbegrenzenden Charakteristika von Shikimatkinase zu entfernen, wurden sowohl aroL und aroEaroL-Plasmide konstruiert. aroL ist in einer transkriptionalen Einheit mit aroM, einem Gen, dessen Funktion unbekannt ist [DeFeyter, R. C.; Pittard, J. J. Bacteriol., 1986, 165, 226-232], angeordnet. Ein 2,7 kb-Fragment enthaltend die transkriptionale Einheit wurde zuvor isoliert und in pBR322 kloniert, um das Plasmid pMU371 [DeFeyter, R. C.; Pittard, J. J. Bacteriol., 1986, 165, 226-232] zu bilden. Ein 1 kb-Fragment enthaltend aroL wurde aus dem Plasmid pMU371 isoliert und in den Vektor pSU19 insertiert, wodurch das 3,3 kb aroL-Plasmid pKAD31 (Fig. 5) erzeugt wurde. Das 4,9 kb aroEaroL-Plasmid pKAD34 wurde durch Manipulation der flankierenden Restriktionsschnittstellen des aroE-Gens aus pKD28, gefolgt von dessen Isolation und Ligation in die einmaligen XbaI und BamHI-Stellen von pKAD31, erhalten (Fig. 6).
• Das aroEaroL-Konstrukt D2704/pKD136/pKAD34 war in der Lage, vollständig DHS und Shikimat aus dem Überstand der Kultur zu entfernen, wobei der einzige akkumulierte Zwischenstoff des gemeinsamen Syntheseweges, der zurückgelassen wurde, Shikimat-3- phosphat war. Die gesamte Produktion von Phenylalanin und Phenyllaktat war 3,4 ± 0,2 mM, ein geringer Anstieg von der Herstellung des Endproduktes von D2704/pKD136/pKD28, aber noch signifikant kleiner als die sowohl mit D2704/pKD130A und D2704/pKD136 beobachteten Konzentrationen von Phenylalanin und Phenyllaktat (Fig. 3).
• Das aroL-Konstrukt D2704/pKD136/pKAD31 war also in der Lage, DHS und Shikimat vollständig aus der Nährlösung der Kultur zu entfernen, wodurch die geschwindigkeitsbegrenzenden Charakteristika von sowohl der Shikimat-Dehydrogenase und der Shikimatkinase mit nur einem überproduziertem Gen abgeschwächt wurden. Der geschwindigkeitsbegrenzende Charakter von Shikimatdehydrogenase erscheint daher ein Artefakt der Shikimat-Akkumulation zu sein. Die Bedeutung der Entfernung von Shikimat aus den Kulturmedien auf die geschwindigkeitsbegrenzende Charakteristika von Shikimatclehydrogenase legt nahe, dass Shikimat gewisse hemmende Effekte auf das Enzym haben kann. Die Akkumulation von Shikimat-3- phosphat wurde noch beobachtet und die gesamte Produktion von Phenylalanin und Phenyllaktat wurde mit 5,6 ± 0,5 mM gefunden, was dem ursprünglich beobachteten Gehalt der Produktion des Endproduktes mit D2704/pKD130A und D2704/pKD136 entspricht (Fig. 3). Bei der Entfernung der metabolischen Blöcke von DHQ- Synthase, Shikimatdehydrogenase und Shikimatkinase erhöhte sich daher die Gesamtakkumulation der Endprodukte des Syntheseweges nicht signifikant, wobei die deblockierten Glukoseäquivalente unberücksichtigt gelassen wurden.
• Es wurde berichtet, dass EPSP [Duncan, K.; Lewendon, A.; Coggins, J. R. FEBS Lett., 1984, 165, 121-127] ein Inhibitor für die Hinreaktion von EPSP-Synthase ist, was eine mögliche Erklärung für die Beobachtung der geschwindigkeitsbegrenzenden Charakteristika des Enzyms ergibt. Um Shikimat-3-phosphat von dem Überstand der Kultur zu entfernen, wurden sowohl aroA und aroAaroL- Plasmide konstruiert. Die aroA-Gene existieren auf einem Operon mit serC, welches 3-Phosphoserin-Aminotransferase, ein Serin- Enzym des biosynthetischen Syntheseweges, kodiert. Das 4,7 kb- Fragment, welches das serCaroA-Operon kodiert, wurde isoliert und sequenziert [Duncan, K.; Coggins, J. R. Biochem. J., 1986, 234, 49-57; Duncan, K.; Lewendon, A.; Coggins, J. R. FEBS Lett., 1984, 170, 59-63]. Um das 4,7 kb aroA-Plasmid pKAD38 zu erzeugen, wurde ein 2,4 kb aroA-Fragment auf dem Plasmid pKD501 isoliert [Duncan, K.; Coggins, J. R. Biochem. J., 1986, 234, 49-57] und in den Vektor pSU18 direkt hinter den externen lac-Promotor ligatiert (Fig. 7). Die Entfernung von aroA aus der transkriptionellen Einheit von serCaroA erfordert dessen Plazierung hinter einem externen Promotor für die Expression. Ein rhounabhängiger Transkriptionsterminator, der zwischen den serC und aroA-Genen angeordnet ist und von dem angenommen wird, dass er die aroA-Expression natürlich abschwächt, verbleibt auf dem 2,4 kb aroA-Fragment intakt, da eine günstige Restriktionsschnittstelle für dessen Entfernung nicht verfügbar war. Die Plazierung von trunktiertem aroA-Gen mit dem Transkriptionsterminator hinter einem externen lac-Promotor sollte noch einen gewissen Grad der Überexpression von EPSP-Synthase bereitstellen. Das 5,7 kb aroAaroL-Plasmid, pKAD43 (Fig. 8) wurde durch Isolation des 2,4 kb aroA-Gens mit flankierendem PstI und Stellen glatter Enden und Ligation in einen pKAD31-Vektor, der manipuliert worden ist, um äquivalente Stellen zu besitzen, erzeugt.
• Die Untersuchung des Stammes D2704/pKD136/pKAD38 ergab einen signifikanten Anstieg in der Gesamtproduktion von Phenylalanin und Phenyllaktat, welche 7,9 ± 1,3 mM nach 48 Stunden der Akkumulation erzeugte (Fig. 3). In dem Überstand akkumulierte Zwischenstoffe des Syntheseweges waren DHS, Shikimat und Shikimat- 3-phosphat. Der Stamm D2704/pKD136/pKAD43 erzeugte 9,7 ± 0,3 mM von Phenylalanin und Phenyllaktat, wobei die Akkumulation von nur einem Zwischenstoff des gemeinsamen Syntheseweges, Shikimat- 3-phosphat, vorlag. Die aroA-Plasmide ergaben den ersten Hinweis für eine erfolgreiche Konversion von deblockierten Glukoseäquivalenten zu den Endprodukten. Das Unvermögen des aroA-Gens, vollständig die Shikimat-3-phosphat-Akkumulation zu entfernen, kann aus der Reversibilität der Reaktion, die durch EPSP- Synthase katalysiert ist, resultieren.
• Es wurde vorgeschlagen, dass Chorismatsynthase sowohl ein irreversibel und möglicherweise geschwindigkeitsbegrenzendes Enzym ist [Pittard, A. J. In Escherichia coli and Salmonella typhimurium; Neidhardt, F. C., Inhgraham, J. L., Low, K. B., Magasanik, B., Schaechter, M., Umbarger, H. E., Eds.; American Society for Microbiology: Washington, DC 1987; Vol. 1, Kapitel 24]. Die geschwindigkeitsbegrenzenden Charakteristika von Chorismatsynthase könnten in der fortgesetzten Anwesenheit von Shikimat-3-phosphat resultieren, wenn die Akkumulationen von EPSP anschließend durch EPSP-Synthase in Shikimat-3-phosphat konvertiert werden. Bei einem Versuch, Shikimat-3-phosphat vollständig aus dem Überstand der Kultur zu entfernen, wurde ein aroAaroCaroL-Plasmid konstruiert. Ein aroC-Plasmid wurde zuerst durch Isolation des aroC-Fragments flankiert von SalI und glattendige Stellen von pGM602 konstruiert [White, P. J.; Millar, G.; Coggins, J. R.; Biochem. J., 1988, 251, 313-322], ein Plasmid enthaltend ein 1,69 kb-Fragment, welches Chorismatsynthase kodiert. Eine Ligation in die einzigen SalI und SmaI-Stellen von pSU19 erzeugte das 4 kb-Plasmid pKAD39 (Fig. 9). Um das 7,4 kb aroAaroCaroL-Plasmid pKAD50 zu erzeugen, wurde das 1,69 kb aroC- Fragment aus pKAD39 als ein Sall/flachendiges Fragment isoliert und in einen pKAD43-Vektor ligatiert, der manipuliert worden ist, um äquivalente Enden zu enthalten (Fig. 10).
• Der Stamm D2704/pKD136/pKAD50 erzeugte 12,3 ± 2,2 mM von Phenylalanin und Phenyllaktat, ein signifikanter Anstieg in der Herstellung des Endproduktes gegenüber D2704/pKD 136/pKAD43 (Fig. 3). Während D2704/pKD136/pKAD50 noch eine gewisse Menge Shikimat-3-phosphat akkumulierte, war die akkumulierte Gesamtmenge weniger als bei D2704/pKD136/pKAD43. Das NMR der 4Bstündigen Akkumulation von D2704/pKD136/pKAD50 zeigte die Anwesenheit von Phenylalanin bei Resonanzen von δ 3,29 (dd, 14, 5 Hz, 1H), δ 4,0 (dd, 8, 5 Hz, 1H) und δ 7,25-7,49 (m, 5H). Resonanzen für Phenylmilchsäure wurden bei δ 2,88 (dd, 14, 8 Hz, 1H), δ 4,27 (dd, 8, 4 Hz 1H) und δ 7,25-7,49 (m, 5H) gefunden. Eine geringe Menge von DHS ist ebenfalls in der Kulturnährlösung anwesend, wie durch die Anwesenheit einer Resonanz bei δ 6,4 (d, 3 Hz, 1H) angezeigt wurde. Die beobachtete erhöhte Produktion des Endproduktes bei der Zugabe von aroC zu dem deblockierenden Plasmid hatte zu der Zuweisung von Chorismatsynthase als ein geschwindigkeitsbegrenzendes Enzym geführt, mit der Annahme, dass die Akkumulation von EPSP in Shikimat-3-phosphat konvertiert worden ist.
• Um weiter die Rolle von Chorismatsynthase zu verstehen, wurden Plasmide enthaltend aroC (pKAD39; Fig. 9), aroAaroC und aroCaroL konstruiert und in dem Stamm D2704/pKD136 untersucht. Das 6,39 kb aroCaroA-Plasmid pKAD44 (Fig. 11) wurde erzeugt durch die Isolation eines aroA-Fragmentes mit flankierendem PstI und flachendigen Stellen, gefolgt durch Ligation in einen pKAD39- Vektor, der manipuliert worden ist, um äquivalente flachendige Stellen zu enthalten. Das 5 kb aroCaroL-Plasmid pKAD51 (Fig. 12) wurde durch die Isolierung von aroC als ein SalI flachendiges Fragment, welches in einen pKAD31-Vektor ligatiert wurde, der manipuliert worden ist, um äquivalente Stelle zu enthalten, konstruiert. Wie in Fig. 3 gesehen werden kann, erreichen pKAD39, pKAD44 und pKAD51 nicht die Gehalte der Akkumulation des Endproduktes, dass das aroAaroCaroL-Plasmid pKAD50 bei Insertion in D2704/pKD136 erreichte. Daher wurde der Stamm D2704/pKD136/pKAD50 bestimmt, der optimale Stamm für die maximale Herstellung des Endproduktes zu sein.
• Um die Rolle von Transketolase in dem optimalen Stamm D2704/pKD136/pKAD50 zu bestimmen, wurde das Gen aus dem Plasmid pKD136 durch Verdauung mit BamHI gefolgt von einer Religation entfernt, wodurch das aroFtkt-Plasmid pKAD42 erzeugt wurde ( Fig. 13). Die Kultivierung des Stammes D2704/pKAD42/pKAD50 resultierte in der Akkumulation von großen Mengen von Acetat und Laktat, die in einem Zelltod resultierten. Um dieses Problem abzumildern, wurde der pH-Wert der Akkumulationsmedien während der Inkubation über 48 Stunden überwacht und mit 5 N NaOH bei Bedarf neutralisiert. Die Aufrechterhaltung eines neutralen pH-Wertes resultierte in hohen Akkumulationen von Prephensäure bei sowohl 24 und 48 Stunden Zeitpunkten von D2704/pKAD42/pKAD50, möglicherweise aufgrund des verringerten Vermögens des Moleküls, bei neutralem pH-Wert in Phenylpyruvat umzulagern. Um daher die Menge des Kohlenstoffflusses zu vergleichen, die erfolgreich zu dem Ende des gemeinsamen Syntheseweges zwischen den Stämmen D2704/pKAD42/pKAD50 und D2704/pKD136/pKAD50 geliefert wurde, wurden die Gesamtmengen von Phenylalanin, Phenylmilchsäure und Prephensäure betrachtet.
• Wie in Fig. 14 gezeigt, war die Menge der durch den Stamm D2704/pKAD136/pKAD50 erzeugten Endprodukte signifikant größer als die durch den Stamm D2704/pKAD42/pKAD50 produzierten. Dieses Resultat zeigt, dass, um erfolgreich einen erhöhten Vorrat von Kohlenstoff zu den aromatischen Aminosäuren und deren Derivaten zu richten, extrachromosale Kopien von Transketolase erforderlich sind, um die Gehalte von Kohlenstoff zu erhöhen, die dem gemeinsamen Syntheseweg verfügbar sind, wie auch die Gene, die für DAHP-Synthase, DHQ-Synthase, Shikimatkinase, EPSP-Synthase und Chorismatsynthase kodieren, um erfolgreich den Vorrat zu den gewünschten Endprodukten zu lenken.
• Die Analyse der Zellüberstände durch NMR-Spektroskopie hatte gezeigt, dass DHQ-Synthase, Shikimatkinase, EPSP-Synthase und Chorismatsynthase metabolische Blöcke in dem gemeinsamen Syntheseweg der Biosynthese von aromatischen Aminosäuren sind. Es wird angenommen, dass die frühere Identifikation von Shikimat- Dehydrogenase als ein metabolischer Block ein Artefakt der Akkumulation von Shikimat in den Kulturmedien ist. Sowohl die Ausbeute als auch die Reinheit der aromatischen Aminosäuren und deren Derivate, die durch biokatalytische Prozesse erzeugt sind, kann durch die Anwendung von einem 2-Plasmid-System in E. Coli erhöht werden. Das Plasmid pKD136 oder ein funktionellen Äquivalent ist essentiell, um einen erhöhten Fluss von Kohlenstoff zu dem gemeinsamen Syntheseweg der Biosynthese von aromatischen Aminosäuren festzulegen, während das Plasmid pKAD50 oder dessen funkaionelles Äquivalent essentiell ist, um erfolgreich den Vorrat von Kohlenstoff auf das Ende des gemeinsamen Syntheseweges zu richten. Die erhöhte Reinheit der Endprodukte, die bei der Einführung der deblockierenden Gene aroB, aroL, aroA und aroC beobachtet wurden, ist schnell in den NMR's von D2704/pkD130A und D2704/pKD136/pKAD50 erkennbar.

Claims (8)

1. Verfahren zur biokatalytischen Verbesserung der Herstellung von einer aromatischen Verbindung in einem E. coli Zelltransformanden über den gemeinsamen Syntheseweg der Biosynthese von aromatischen Aminosäuren, die zu der Zelle endogen ist, wobei das Verfahren den Schritt aufweist:

Kultivierung des Zelltransformanden in Medien enthaltend eine metabolisierbare Kohlenstoffquelle unter Bedingungen, unter denen die Metabolisierung der Kohlenstoffquelle durchführbar ist, wobei der Zelltransformand exogene DNA- Frequenzen aufweist, die Enzymarten des gemeinsamen Syntheseweges kodieren, wobei die Enzymarten im wesentlichen aus den Enzymen Transketolase, 3-Desoxy-D-arabinoheptulosonat-7-phosphatsynthase, 3-Dehydrochinatsynthase, Shikimatkinase, 5-Enolpyruvoylshikimat-3-phosphatsynthase und Chorismatsynthase bestehen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein oder mehrere rekombinante Plasmidvektoren die exogenen DNA-Sequenzen, die die Enzymart kodieren, aufweisen.

3. E. coli-Transformand, gekennzeichnet durch die verstärkte Expression von strukturellen Genen, die die Enzymarten Transketolase, 3-Desoxy-D-arabino-heptulosonat-7-phosphatsynthase, 3-Dehydrochinatsynthase, Shikimatkinase, 5- Enolpyruvoylshikimat-3-phosphatsynthase und Chorismatsynthase kodieren.

4. Verfahren zur biokatalytischen Verbesserung der Herstellung einer aromatischen Verbindung aus einer Kohlenstoffquelle, wobei das Verfahren den Schritt der Kultivierung des Zelltransformanden nach Anspruch 3 in Medien enthaltend eine metabolisierbare Kohlenstoffquelle unter Bedingungen, bei denen die Metabolisierung der Kohlenstoffquelle durchführbar ist, aufweist.

5. Plasmidkonstrukt mit strukturellen Genen für Enzymarten des gemeinsamen Syntheseweges, wobei die Enzymarten im wesentlichen aus 3-Dehydrochinatsynthase, Shikimatkinase, 5- Enolpyruvoyl-Shikimat-3-phosphatsynthase und Chorismatsynthase bestehen.

6. Prokaryontischer Zelltransformand ausgewählt aus der Gruppe von Prokaryonten, die zu den Gattungen Escherichia, Corynebakterium, Brevibakteria, Arthrobacter, Bazillus, Pseudomonas, Streptomyces, Staphlococcus oder Seratia gehören, gekennzeichnet durch die Expression von exogenen strukturellen Genen, die die Enzymarten Transketolase, 3- Desoxy-D-arabino-heptulosonat-7-phosphatsynthase, 3-Dehydrochinatsynthase, Shikimatkinase, 5-Enolpyruvoyl-Shikimat-3-phosphatsynthase und Chorismatsynthase kodieren.

7. Plasmid pKAD50, wie in Fig. 10 gezeigt.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die exogenen DNA-Sequenzen für Shikimatkinase, 5-Enolpyruvoyl-Shikimat-3-phosphatsynthase und Chorismatsynthase ein angrenzendes DNA-Molekül aufweisen.