DE69303943T2

DE69303943T2 - Neuer Vektor, einen von Methanol und/oder Glyzerin induzierbaren Promotor enthaltend

Info

Publication number: DE69303943T2
Application number: DE69303943T
Authority: DE
Inventors: Haruyo Hatanaka; Hiroto Kondo; Yasuyoshi Sakai; Yuji Shibano; Yoshiki Tani
Original assignee: Suntory Ltd
Current assignee: Suntory Holdings Ltd
Priority date: 1992-02-28
Filing date: 1993-02-26
Publication date: 1997-01-30
Anticipated expiration: 2013-02-27
Also published as: JP3113435B2; EP0558024A3; JP3137627B2; DK0558024T3; GR3020824T3; DE69303943D1; EP0558024B1; JP2000279187A; JPH05344895A; ES2093294T3; ATE141330T1; US5750372A; EP0558024A2

Description

Die Erfindung betrifft eine durch Methanol und/oder Glycerin induzierbare Expressionskassette, die folgendes umfaßt: den Alkohol-oxidase- Genpromotor mit der durch Seq. I.D. Nr. 1 wiedergegebenen Nucleotidsequenz, wobei der Promotor durch Methanol und/oder Glycerin induzierbar ist; ein flußabwärts zum Promotor verknüpftes erwünschtes heterologes Gen; und einen Terminator mit der durch Seq. I.D. Nr. 2 wiedergegebenen Nucleotidsequenz, wobei sich der Terminator flußabwärts vom heterologen Gen befindet. Insbesondere betrifft die Erfindung eine rekombinante, methylotrophe Hefe, die diesen Vektor enthält; und ein Verfahren zur Herstellung von wertvollen Enzymen, insbesondere Adenylat-kinasen, Cytochrom C-Enzymen und Peroxidasen durch diese rekombinante Hefe.
Da methylotrophe Hefen auf Methanol als einziger Kohlenstoffquelle wachsen und eine hohe Zellausbeute ergeben, werden sie in der chemischen Industrie zur Herstellung von Ausgangsmaterialien, wie Aldehyden, z. B. Formaldehyd, Methylketon und Ameisensäure, verwendet. Ferner wurden zahlreiche Versuche gemacht, Zellen dieser Hefen selbst als Proteinquellen einzusetzen sowie intrazelluläre Komponenten davon, z. B. Aminosäuren und Vitamine, zu verwerten. Einige dieser Versuche wurden in die Praxis umgesetzt.
In der ersten Stufe des Methanol-Stoffwechselsystems in methylotrophen Hefen wird Methanol in Gegenwart von Sauerstoff durch eine Alkoholoxidase unter Bildung von Formaldehyd und Wasserstoffperoxid oxidiert. Der auf diese Weise gebildete Formaldehyd wird zur Erzeugung von Energie katabolisiert oder zur Bildung von zellulären Komponenten anabolisiert. Die bei dieser Stufe beteiligte Alkohol-oxidase wird durch Methanol induziert, bildet zusammen mit einer Katalase, die Wasserstoffperoxid zersetzt, eine als Peroxysom bezeichnete organelle und nimmt in wirksamer Weise an der Oxidation von Methanol teil. Wenn daher methylotrophe Hefen in Gegenwart von Methanol gezüchtet werden, wird ein signifikant hoher Anteil an Alkohol-oxidase gebildet. Die Ausbeuten betragen bis zu etwa 40% der zellulären loslichen Proteine. Aufgrund der hohen Aktivität oder der bequemen Züchtung stellen methylotrophe Hefen eine wertvolle Quelle zur Bildung von Alkohol-oxidase und Katalase dar. Die Alkohol-oxidase wird als biochemisches Reagenz zur quantitativen Bestimmung von Alkohol oder zur Erhöhung der bakteriziden Wirkung der Ethanoldesinfektion verwendet, während Katalase zur Zersetzung und Beseitigung von Wasserstoffperoxid, das Nahrungsmitteln als Bakterizid zugesetzt wird, dient.
Andererseits stellt Adenylat-kinase ein Enzym dar, das aus Adenosinmonophosphat (AMP) und Adenosintriphosphat (ATP) zwei Adenosindiphosphat (ADP) -Moleküle bildet und somit das geschwindigkeitsbestimmende Enzym bei der Herstellung von ATP in methylotrophen Hefen darstellt (T. Tani, I:Biology of Methylotrophs", Bufferworth Heinemann (1991), S. 253).
Adenylat-kinase wird beispielsweise bei Tests für AMP verwendet, während ATP nicht nur ein wertvolles biochemisches Reagens, sondern auch eine Energiequelle bei der Synthese von biochemischen Verbindungen mit verschiedenen Enzymen darstellt. Wenn daher ATP großtechnisch unter niedrigen Kosten aus einer mikrobiellen Kulturbrühe oder gezüchteten Zellen gebildet werden könnte, könnte das Produkt in wirtschaftlicher Weise für verschiedene enzymatische Reaktionen, die ATP benötigen, bereitgestellt werden.
Cytochrom C552 ist ein Hämoprotein, das eine wichtige Rolle beim Elektronentransportsystem von Hydrogenobactern spielt und durch seine Wärmestabilität charakterisiert ist, die gegenüber Cytochrom C-Enzymen anderen Ursprungs überlegen ist. Kürzlich wurden verschiedene Untersuchungen und Forschungsarbeiten mit dem Ziel durchgeführt, Cytochrom C als Material für elektronische Bauelemente einzusetzen. Obgleich erwartet wird, daß Cytochrom C552 aufgrund seiner Wärmestabilität ein ideales Material für elektronische Bauelemente darstellt, tritt beim herkömmlichen Verfahren zur Herstellung von Cytochrom C552 unter Verwendung von E. coli als Wirt ein Problem insofern auf, als dieses Verfahren nur unzufriedenstellend niedrige Ausbeuten liefert, da das Cytochrom C552-Gen ausschließlich unter anaeroben Bedingungen exprimiert wird.
Peroxidasen oxidieren verschiedene Verbindungen in Gegenwart von Wasserstoffperoxid und wurden in letzter Zeit wie andere Oxidasen als klinisch-diagnostische Wirkstoffe zur quantitativen Bestimmung von Glucose, Cholesterin, Phospholipiden, Harnstoff und dergl. eingesetzt. Ferner werden sie als markierende Enzyme bei enzymgebundenen Immunoassays (ELISA) verwendet. Insbesondere weist die von Arthromyces ramosus (ARP) gebildete und sezernierte Peroxidase eine erheblich höhere katalytische Aktivität bei der Bildung von chemischer Emission in Systemen unter Verwendung von chemischen Emissionsreagenzien auf als andere bekannte Peroxidasen (JP-A- 212398/88). Jedoch besteht ein Nachteil von ARP darin, daß die Wachstumsgeschwindigkeit der ARP bildenden Bakterien so gering ist, daß hohe Kosten zur Bildung von ARP entstehen.
Wie vorstehend erwähnt, eignen sich methylotrophe Hefen insbesondere zur Herstellung von wertvollen Substanzen und Enzymen im gewerblichen Maßstab, da diese Mikroorganismen leicht großtechnisch in einem billigen Medium gezüchtet werden können. Derzeit besteht jedoch hinsichtlich der Substanzen, die durch methylotrophe Hefen erzeugt werden können, eine Beschränkung auf die Substanzen, die im Methanol-Stoffwechselsystem auftreten, wie Aldehyde, und solche Substanzen, aus denen die methylotrophe Hefe besteht, z. B. Aminosäuren und Vitamine. Ferner ist die Erzeugung von Enzymen auf solche Enzyme beschränkt, die im Methanol-Oxidationssystem auftreten, wie Alkohol-oxidasen und Katalasen.
Die Erfinder haben umfangreiche Untersuchungen durchgeführt, um das Expressionssystem des durch Methanol und/oder Glycerin induzierbaren Alkohol-oxidase-Gens in methylotrophen Hefen zu klären und eine wirksame Expression eines heterologen Gens unter Ausnutzung dieses Expressionssystems zu erreichen.
Demgemäß ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen durch Methanol und/oder Glycerin induzierbaren Expressionsvektor bereitzustellen, bei dem der Promotor und der Terminator des von methylotrophen Hefen abgeleiteten Alkohol-oxidase-Gens verwendet werden; sowie eine rekombinante methylotrophe Hefe bereitzustellen, die diesen Expressionsvektor enthält und eine signifikant hohe Menge eines Expressionsprodukts des heterologen Gens bildet.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung eines Expressionsprodukts eines heterologen Gens bereitzustellen, wobei sich das Verfahren des erfindungsgemäßen Expressionsvektors bedient und eine signifikant hohe Menge des Zielprodukts in methybtrophen Hefen bildet. Der hier verwendete Ausdruck "heterologes Gen" bedeutet beliebige Gene, die von dem von methylotrophen Hefen abgeleiteten Alkohol-oxidase-Gen abweichen.
Fig. 1 zeigt Restriktionsenzymkarten der Plasmide, die zusammen das erfindungsgemäße Alkohol-oxidase-Gen enthalten, sowie ein Verfahren zur Herstellung dieser Plasmide.
Fig. 2 zeigt die Nucleotidsequenz eines DNA-Fragments, das das Alkohol-oxidase-Gen enthält, sowie die von dieser Nucleotidsequenz abgeleitete Aminosäuresequenz, wobei die unterstrichenen Bereiche die TATA-Sequenz, das Transkriptionsterminationssignal bzw. das Poly-A-Additionssignal bedeuten. Der unterstrichene Bereich in der Aminosäuresequenz bedeutet den Bereich, der mit der für das gereinigte Enzym bestimmten N-terminalen Sequenz übereinstimmt.
Fig. 3 zeigt ein Verfahren zur Herstellung einer Adenylat-kinase-Expressionskassette, die den Promotor und den Terminator des Alkohol-oxidase-Gens umfaßt.
Fig. 4 zeigt eine Restriktionsenzymkarte des Alkohol-oxidase-Expressionsvektors ptrex, wobei die dicken Linien DNA-Fragmente bedeuten, die das ADK-Gen bzw. das URA3-Gen enthalten.
Fig. 5 zeigt die Adenylat-kinase-Konzentration und das Zeliwachstum bei einem 1-1-Stamm, der Adenylat-kinase exprimiert, und beim parentalen Stamm (Stamm TK62) davon, bei Züchtung in einem Methanol- oder einem Glucosemedium, wobei die leeren Symbole das bei OD&sub6;&sub1;&sub0; bestimmte Zellwachstum bedeuten. Dabei bedeutet die Daten für den TK62-Stamm im Methanolmedium, Δ die Daten für den 1-1-Stamm im Methanolmedium, 0 die Daten für den TK62-Stamm im Glucosemedium und die Daten für den 1-1-Stamm im Glucosemedium. Die entsprechenden ausgefüllten Symbole bedeuten die Adenylat-kinase-Aktivität des entsprechenden Stamms im entsprechenden Medium.
Fig. 6 zeigt ein Verfahren zur Herstellung des Plasmids, das den Promotor und den Terminator des Alkohol-oxidase-Gens und eine dazwischenhegende NotI-Stelle enthält.
Fig. 7 zeigt die Nucleotidsequenz einer autonom replizierenden Sequenz (ARS) aus der chromosomalen DNA von Candida boidinii.
Fig. 8 zeigt Restriktionsenzymkarten für die vier Plasmide pRAC1, pRAC2, pBARCU1 und pBARCU2.
Fig. 9 zeigt den Wirkungsgrad der Transformation durch Deletionsplasmide unter Verwendung von Candida boidinii und Saccharomyces cerevisiae als Wirtszellen.
Um die vorerwähnten Ziele zu erreichen, haben die Erfinder die Nucleotidsequenz des Alkohol-oxidase-Gens eines Stamms von methylotrophen Hefen, Candida boidinii, sowie die Nucleotidsequenz des Promotors und des Terminators dieses Gens geklärt und eine Expressionskassette, die sich dieser Elemente bedient, konstruiert. Ferner haben die Erfinder durch erfolgreiche Bildung einer signifikant hohen Menge einer Adenylat-kinase, eines Cytochroms C und einer Peroxidase bestätigt, daß die Expression eines heterologen Genprodukts in einem wesentlich höheren Wirkungsgrad erreicht werden konnte, wenn sich das Gen in dieser Expressionskassette statt im natürlichen Expressionssystem dieses heterologen Gens befand. Auf der Basis dieser Befunde wurde die Erfindung fertiggestellt.
Der erfindungsgemäße Expressionsvektor enthält in der Expressionskassette die Promotor- und Terminatorregionen des Alkohol-oxidase-Gens (für Alkohol-oxidase wird die Abkürzung AOD verwendet), das sich von einer methylotrophen Hefe ableitet. Jedoch wurde der AOD-Kodierungsbereich durch ein heterologes Gen ersetzt. Der Promotor und der Terminator wurden von den Erfindern aufgefunden. Sie weisen die durch Seg. I.D. Nr. 1 und Seq. I.D. Nr. 2 wiedergegebenen Nucleotidsequenzen auf.
Das Alkohol-oxidase-Gen und die erfindungsgemäß zu verwendenden Elemente von dessen Expressionssystem lassen sich durch Absuchen einer Genbibliothek einer chromosomalen DNA von methylotropher Hefe durch Kobnienhybridisierung oder Plaquehybridisierung erhalten. Als Sonde kann ein geeignetes synthetisches Oligonucleotid verwendet werden, das der N-terminalen Aminosäuresequenz einer aus einer methylotrophen Hefe gereinigten Alkohol-oxidase entspricht. Die Herstellung der Genbibliothek, die Kobnienhybridisierung und die Plaquehybridisierung lassen sich gemäß herkömmlichen Verfahren durchführen. Die Nucleotidsequenz des auf diese Weise erhaltenen Alkohol-oxidase-Gens läßt sich nach einem herkömmlichen Verfahren bestimmen. Anschließend können die nicht-kodierenden Regionen, die sich am 5'-Ende und am 3'-Ende davon befinden, als Promotor bzw. als Terminator verwendet werden. Sodann kann erneut gemäß einem herkömmlichen Verfahren ein gewünschtes heterologes Gen zwischen den Promotor und den Terminator eingesetzt werden, so daß eine Expressionskassette fertiggestellt wird.
Der erfindungsgemäße Expressionsvektor läßt sich durch Inserieren der vorerwähnten Expressionskassette, die ein gewünschtes heterologes Gen enthält, in einen geeigneten Vektor konstruieren. Als Beispiele für einen derartigen Vektor lassen sich bekannte Escherichia coli-Vektoren, wie pUC18, pUC19 und pBR322 erwähnen. Die Insertion des heterologen Gens, des AOD-Promotors und des AOD-Terminators in diese Vektoren läßt sich vom Fachmann auf diesem Gebiet entweder gemäß der Beschreibung in den nachstehenden Beispielen oder nach beliebigen herkömmlichen Techniken erreichen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Zellen, die mit dem vorerwähnten Expressionsvektor transformiert worden sind, sowie ein Verfahren, das die Züchtung der transformierten Zellen und die Isolierung und Reinigung eines Peptids oder Proteins, bei dem es sich um das Expressionsprodukt des gewünschten heterologen Gens handelt, umfaßt.
Bei Züchtung der erfindungsgemäß transformierten Zellen in Gegenwart von Methanol und/oder Glycerin wird eine Expression des heterologen Gens induziert, so daß eine signifikant hohe Menge des gewünschten Peptids oder Proteins innerhalb oder außerhalb der Zellen gebildet wird.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann bei Transformation der Wirtszelle mit dem erfindungsgemäßen Expressionsvektor das heterologe Gen in der Kassette in die chromosomale DNA der Wirtszellen durch sog. homologe Rekombination integriert werden, so daß die Expressionskassette stabil im Wirt enthalten ist. Bei dieser Ausführungsform gibt es hinsichtlich der Wirte keine speziellen Beschränkungen, wobei aber als Wirtszellen zur Durchführung der Transformation Hefen und insbesondere die gleichen methylotrophen Hefen, aus denen das AOD-Genexpressionssystem erhalten worden ist, oder nahe dazu verwandte methylotrophe Hefen und Saccharomyces cerevisiae bevorzugt werden. Es gibt jedoch eine große Anzahl von anderen Wirten, die mit dem erfindungsgemäßen Vektor verträglich und zur Durchführung der Expression des heterologen Gens im Vektor befähigt sind.
Um die Expressionskassette im Vektor in die chromosomale DNA der Wirtszellen zu integrieren, kann ein geeignetes Selektionsmarkergen verwendet werden, wobei das Markergen eine Sequenz aufweist, die zum Gen an der chromosomalen DNA der spezifischen Wirtszelle homolog ist. Selektionsmarker für diesen Zweck können vom Fachmann leicht ausgewählt werden. Ein Beispiel für einen bevorzugten Marker ist ein bestimmtes Gen, das an einem Chromosom vorliegt und mit dem Stoffwechsel der Wirtszellen in Zusammenhang steht. Es ist nämlich bevorzugt, einen Wirt zu verwenden, der so modifiziert worden ist, daß das vorerwähnte Gen am Chromosom durch geeignete Maßnahmen, z. B. Mutation, inaktiviert wird. Der Wirt kann dann einer homologen Rekombination mit einem Expressionsvektor, der das entsprechende intakte Gen enthält, unterworfen werden, wobei nur Transformanten, die das normale Stoffwechselgen enthalten, wachsen können und dann ausgewählt werden. Wird daher ein derartiges Markergen in den Expressionsvektor eingeführt, findet eine homologe Rekombination zwischen dem Markergen im Expressionsvektor und dem entsprechenden Bereich der chromosomalen DNA statt, wobei die Expressionskassette des heterologen Gens gleichzeitig in die chromosomale DNA integriert wird. Transformanten können durch Induktion der Expression des integrierten heterologen Gens in Gegenwart von Methanol oder Glycerin und durch anschließende Bildung des gewünschten Peptids und dergl. abgesucht werden.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der erfindungsgemäße Expressionsvektor zur Replikation als Plasmid in Wirtszellen befähigt, wobei der Expressionsvektor ein DNA-Fragment einer autonom replizierenden Sequenz (ARS) einer methylotrophen Hefe enthält, das in den Vektor an Stelle des Markergens oder zusätzlich zu diesem inseriert worden ist. Als Beispiele für derartige Vektoren lassen sich bekannte Escherichia coli-Vektoren, wie pUC18, pUC19 und pBR322, erwähnen. obgleich es sich bei den bevorzugten Wirtszellen um die gleichen Zellen handelt, wie sie vorstehend beschrieben worden sind, können insbesondere methylotrophe Hefen, aus denen das AOD-Expressionssystem erhalten worden ist, andere methanophile Bakterien oder Saccharomyces cerevisiae verwendet werden.
Die Transformation der Wirtszellen, z. B. der methylotrophen Hefen, und die Gewinnung der transformierten Zellen, bei denen die Expressionskassette in die chromosomale DNA integriert worden ist, können unter Anwendung bekannter Verfahren vorgenommen werden (Y. Sakai et al., J. Bacteriol., Bd. 173 (1991), S. 7458-7463). Als ein Adenylat-kinase-Gen wurde bereits das von Saccharomyces cerevisiae abgeleitete Gen beschrieben (M. Konrad, J. Biol. Chem., Bd. 263 (1988), S. 19468-19474). Ferner sind Beispiele für derartige autonom replizierende Sequenzen und deren Integration in einen Vektor bei M. B. Kurts et al., Mol. Cel. Biol., Bd. 7 (1987), S. 209-217 beschrieben. Außerdem können beliebige bekannte Verfahren zur Isolierung und Reinigung des in der Zellkultur der transformierten methylotrophen Hefe gebildeten Peptids oder Proteins verwendet werden.
Das von Hydrogenobacter thermophilus abgeleitete Cytochrom C552-Gen wird von Sanbongi et al. beschrieben (Y. Sanbongi, J. H. Yang, Y. Igarashi und T. Kodama, Eur. J. Biochem., Bd. 198 (1991), S. 7-12).
Das von Arthromyces ramosus (ARP) abgeleitete Peroxidase-Gen ist in EP-0 486 067 beschrieben.
Der Expressionsvektor mit der erfindungsgemäßen Alkohol-oxidase-Expressionskassette und eine diesen Vektor enthaltende Transformante weisen die nachstehenden erheblichen Vorteile auf:
i) Der starke Promotor, der durch vorhandenes Methanol und/oder Glycerin induzierbar ist, führt zu einem sehr hohen Expressionswirkungsgrad.
ii) Die Zugabe von Chemikalien, wie einem Antibiotikum, zum Medium, die ansonsten zur Stabilisierung des heterologen Gens erforderlich ist, kann unterbleiben, da das heterologe Gen in die chromosomale DNA der Wirtszelle integriert ist, so daß es über eine lange Züchtungsdauer hinweg stabil bleibt.
iii) Da der erfindungsgemäße Expressionsvektor durch bloße Zugabe von Methanol und/oder Glycerin zum Medium induziert werden kann, lassen sich die Bedingungen für die Induktion leicht herstellen und die induzierende Substanz (Methanol und/oder Glycerin) ist billig.
Die nachstehenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung. Es ist jedoch darauf hinzuweisen, daß die Erfindung nicht darauf beschränkt ist.
Obgleich die Erfindung nachstehend in bezug auf die Verwendung des Promotors und des Terminators des Alkohol-oxidase-Gens in der Expressionskassette und unter Verwendung des URA3-Gens als Markergen beschrieben wird, ist es offensichtlich, daß die erfindungsgemäß verwendbaren Elemente nicht hierauf beschränkt sind. Somit können auch andere Markergene eingesetzt werden. Ferner werden zwar als spezielle Beispiele das Adenylat-kinase-Gen, das Cytochrom C-Gen, das Peroxidase-Gen und ein G418-resistentes Gen verwendet, wobei aber das heterologe Gen der Erfindung nicht hierauf beschränkt ist.

Beispiel 1

In diesem Beispiel wurde das Alkohol-oxidase-Gen aus dem Candida boidinii S2 AOU-1-Stamm (Y. Tani et al., Agric. Biol. Chem., Bd. 49 (1985), S. 2699-2706) erhalten, und deren Nucleotidsequenz wurde bestimmt. Dieser Stamm wurde als Candida boidinii SAM 1958 bezeichnet und beim Fermentation Research Institute of the Agency of Industrial Science and Technology unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-3766 am 2S. Februar 1992 hinterlegt.

(1) Herstellung von Bibliotheken

Phagenbibliothek

Chromosomale DNA wurde aus Zellen des Candida boidinii S2 AOU-1- Stamms isoliert. Die Isolierung der DNA konnte beispielsweise gemäß dem Verfahren von Cryer et al. (D. R. Cryer et al., Meth. Cell. Biol., Bd. 12 (1975), S. 39-44) durchgeführt werden. Nach der Isolierung wurde die DNA partiell mit dem Restriktionsenzym SAU3AI verdaut, das Verdauungsprodukt wurde der Elektrophorese an 0,5% Agarosegel unterworfen, und DNA-Fragmente mit 12 bis 22 kb wurden aus dem Gel gewonnen. Diese DNA-Fragmente wurden mit dem EMBL3-Arm (bezogen von Stratagene; Frischauf et al., J. Mol. Biol., Bd. 170 (1983), S. 827-842) verknüpft. Die mit dem Arm versehenen Fragmente wurden in das in vitro-Packungssystem des λ-Phagen Giga Pack Gold (bezogen von der Fa. Stratagene) eingeführt. Als Ergebnis der Bewertung, die sich des Stamms E. coli P2392 als Wirt bediente, wurden 1,1 x 10&sup5; rekombinante Phagen, die eine Phagenbibliothek bildeten, erhalten.

Plasmidbibliothek

Ferner wurde ein weiterer Aliquotanteil der auf die vorstehende Weise gemäß dem Verfahren von Cryer et al. isolierten Candida-DNA vollständig mit dem Restriktionsenzym XbaI verdaut, und das Verdauungsprodukt wurde der Elektrophorese an einem 0,7% Agarosegel unterworfen. DNA-Fragmente von 4 bis 7 kb wurden aus dem Gel gewonnen. Die auf diese Weise gewonnenen DNA-Fragmente wurden in die XbaI-Stelle des Vektors pBluescript II KS&spplus; (bezogen von der Fa. Stratagene) inseriert. Ein E. coli XL1-Blue- Stamm wurde sodann mit dem Vektor unter Bildung einer Plasmidbibliothek transformiert.

(2) Absuchen von Bibliotheken

Die N-terminale Aminosäuresequenz von Candida boidinii-Alkohol-oxidase wurde mit dem Gasphasen-Peptidsequenziergerät (Modell 120-A, Applied Biosystems) als Ala-Ile-Pro-Glu-Glu-Phe-Asp-Val-Ile-Val- bestimmt. Anschließend wurden die folgenden drei synthetischen Nucleotidsonden, die der N-terminalen Aminosäuresequenz entsprechen, synthetisiert: Sonde 1: 5'-TCRAGDGGRATNGCCAT-3', Sonde 2: 5'-ACRATRACRTCRAAYTC-3' und Sonde 3: 5'-ACRTCRAAYTCRAGDGG-3', worin R die Bedeutung A oder G hat, Y die Bedeutung C oder T hat, H die Bedeutung A, C oder T hat, D die Bedeutung A, G oder T hat und N die Bedeutung G, A, T und C hat.
Unter Verwendung dieser synthetischen Nudeotide als Sonden wurden die im vorstehenden Beispiel 1 (1) hergestellten Genbibliotheken durch Plaquehybridisierung oder Kolonienhybridisierung abgesucht. Die Hybridisierung wurde 14 Stunden bei 37ºC gemäß dem bekannten Verfahren (J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. (1989)) durchgeführt. Anschließend wurde der Filter 3 mal in 6 x SSC-0,1% SDS bei 37ºC gewaschen und getrocknet. Sodann wurden positive Klone durch Autoradiographie nachgewiesen. Als Ergebnis wurde ein positiver Klon CL701 aus der Phagenbibliothek ausgewählt, während aus der Plasmidbibliothek als ein positiver Klon ein Klon ausgewählt wurde, der das Plasmid pMOX62O enthielt.

(3) Subklonierung

Restriktionsenzynkarten von CL701 und pMOX620 wurden hergestellt und miteinander verglichen. Es zeigte sich, daß diese Klone ein XbaI-SAU3AI- DNA-Fragment (2,3 kb) gemeinsam hatten, wie in Fig. 1 gezeigt ist. Gemäß dieser Figur wurden das EcoRI-SalI-DNA-Fragment (3,3 kb, die SalI-Stelle liegt im Vektor EMBL3 vor) von CL701, das BglII-PstI-DNA-Fragment (1,05 kb) und das BamHI-XbaI-DNA-Fragment (3,9 kb) von pMOX620 in pBluescript II KS&spplus; oder KS&supmin; inseriert und pMOX330, pMOX105 bzw. Plasmid pMOX390 wurden konstruiert.

(4) Bestimmung der Nucleotidsequenz

Die Nucleotidsequenzen der inserierten DNA-Fragmente in den Plasmiden pMOX330, pMOX105 und pMOX390, die gemäß dem vorstehenden Beispiel 1-(3) konstruiert worden waren, wurden gemäß der durch die Pfeile in Fig. 1 dargestellten Strategie bestimmt. Die inserierten Fragmente aus diesen Plasmiden wurden in den Phagen M13 in beiden Richtungen geklont, und die Fragmente wurden doppelsträngig gemacht. Diese doppelsträngigen DNAs (RF) wurden mit E. coli-Exonuclease III verdaut, um doppelsträngige DNAs mit Deletionen verschiedener Längen von ihrem Ende aus herzustellen. Das Verfahren zur Herstellung von Plasmiden mit derartigen Deletionen durch Exonuclease III ist ausführlich in "Zoku Seikagaku Jikken Koza, Bd. 1, Idenshi Kenhyu-ho II", S. 289-305 beschrieben. Anschließend wurde E. coli JM109 mit diesen doppelsträngigen DNAs mit verschiedenen Deletionen transformiert, um die Phagenklone mit den verschiedenen Deletionen zu vermehren. Die Deletionsgrade in den aus diesen Phagenklonen hergestellten doppelsträngigen DNAs wurden auf der Basis der Spaitmuster in Restriktionsenzymen geprüft. Sodann wurden einzeisträngige Phagen-DNAs aus den entsprechenden Klonen hergestellt. Unter Verwendung dieser einzelsträngigen Phagen-DNAs als Matrizen wurden die Nucleotidsequenzen gemäß dem Didesoxyverfahren bestimmt (F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 74 (1977), S. 5463). Die Nucleotidsequenz des inserierten DNA- Fragments in den einzelnen Plasmiden pMOX330, pMOX105 und pMOX39O wurde durch Verknüpfen der Nucleotidsequenzen der Klone miteinander bestimmt. Die Nucleotidsequenzen dieser Plasmide wurden ferner miteinander verknüpft, wodurch man die gesamte Nucleotidsequenz (4,2 kb) von der EcoRI- Stelle zur HindIII-Stelle in Fig. 1 erhielt. Die erhaltene Sequenz ist in Fig. 2 dargestellt.
In Fig. 2 ist ein offener Leseraster dargestellt, der aus 1989 Basenpaaren von ATG (Base Nr. 1 - Nr. 3) bis TAA (Base Nr. 1990 - Nr. 1992) besteht. Aufgrund der folgenden Feststellung wurde geklärt, daß dieser offene Leseraster das angestrebte Alkohol-oxidase-Gen kodierte.
i) Die von der Nucleotidsequenz abgeleitete Aminosäuresequenz zeigte zu 77% bzw. zu 73% eine Homologie zu den Aminosäuresequenzen der Alkoholoxidasen der methylotrophen Hefen Hansenula polymorpha (A. M. Ledeboer et al., Nucleic Acids Res., Bd. 13 (1985), S. 3063-3082) bzw. Pichia pastoris (P. Koutz et al., Yeast, Bd. 5 (1989), S. 167-177).
ii) Die N-terminale Aminosäuresequenz, die von der Nucleotidsequenz abgeleitet wurde, war identisch mit der N-terminalen Aminosäuresequenz des gereinigten Enzyms (Unterstreichung unter der Aminosäuresequenz in Fig. 2).
iii) Die von der Nucleotidsequenz abgeleitete Aminosäurezusammensetzung war identisch mit der des gereinigten Enzyms.
iv) Das Molekulargewicht (72-75 kDa) des Enzyms stimmte bei Bestimmung durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese mit dem aus der abgeleiteten Aminosäurezusammensetzung berechneten Wert (73 947) überein.
Flußaufwärts vom 5'-Ende der Kodierungsregion wurde eine TATA-Sequenz, die für die Transkription in eukaryontischen Zellen erforderlich ist, beobachtet, während flußabwärts vom 3'-Ende der Kodierungsregion ein Transkriptionsterminationssignal und ein Poly-A-Additionssignal beobachtet wurden (Unterstreichungen in der Nucleotidsequenz in Fig. 2). Die Nucleotidsequenzen flußaufwärts vom 5'-Ende (d. h. die Promotorregion) und flußabwärts vom 3'-Ende (d. h. die Terminatorregion) zeigten keine signifikanten Homologien zu jenen der vorerwähnten H. polymorpha und P. pastoris.

Beispiel 2

Dieses Beispiel zeigt die Konstruktion eines Expressionsvektors, der als heterologes Gen ein Adenylat-kinase-Gen aus einer Hefe (Saccharomyces cerevisiae) und ferner die im vorstehenden Beispiel 1 erhaltenen Promotor- und Terminatorbereiche des Alkohol-oxidase-Gens aus Candida boidinii S2 AOU-1 umfaßt. Das Beispiel zeigt ferner die Transformation eines Stamms von Candida boidinii mit diesem Expressionsvektor.

(1) Herstellung der Expressionskausette

Eine Expressionskassette mit einem Adenylat-kinase-Gen zwischen dem Promotor und dem Terminator der Alkohol-oxidase (AOD) wurde konstruiert (Fig. 3). Das Verfahren zur Herstellung des Adenylat-kinase (ADK) -Gens und zur Bestimmung von dessen Nucleotidsequenz ist von Konrad beschrieben (M. Konrad, J. Biol. Chem., Bd. 263 (1988), S. 19488-19474).
Um die Promotor- und Terminatorregionen des Alkohol-oxidase-Gens sowie das Strukturgen von Adenylat-kinase herzustellen, bediente man sich der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) . Als Primer für die PCRS wurden die folgenden vier oligonucleotide synthetisiert.
Der normale Primer (NP: 17-mer) und der reverse Primer (RV: 17-mer) waren mit den Nucleotidsequenzen flußabwärts vom 3'-Ende bzw. flußaufwärts vom 5'-Ende der Multiklonierungsstelle homolog. Diese Primer wurden von der Fa. Takara Shuzo Co., Ltd. bezogen. Die Primer PADK1 und PADK2, die miteinander komplementär waren, wurden zur Bindung des AOD-Promotors und des ADK-Gens verwendet. Die unterstrichenen Bereiche von PADKL und PADK2 waren mit den Nucleotidsequenzen des 3'-Endes des AOD-Promotors bzw. flußabwärts vom 3'-Ende des Initiationscodons des ADK-Gens komplementär. Der Primer SPETERM enthielt die Nucleotidsequenz (unterstrichener Bereich), die identisch mit dem 5'-Ende des AOD-Terminators war und trug die Spei-Stelle (ACTAGT) an den Positionen 4 bis 9 vom 5'-Ende. Der Pnmer ADKSPE enthielt die Nucleotidsequenz (unterstrichener Bereich), die komplementär mit dem Flußabwärtsbereich vom 3'-Ende des ADK-Gens war und eine Spei-Stelle (ACTAGT) an den Positionen 4 bis 9 vom 5'-Ende trug.

Erste PCR

Das Plasmid pMOX330 (Fig. 1), das den AOD-Promotor enthielt, wurde mit den Primern RV und PADK1 vermischt, und eine PCR wurde durchgeführt. Das Reaktionsprodukt wurde der Elektrophorese an einem Agarosegel unterworfen, und das amplifizierte DNA-Fragment wurde gewonnen. Das gewonnene DNA-Fragment (PAOD-Fragment) enthielt eine Multiklonierungsstelle (mit der das 5'-Ende flankierenden Sequenz davon), die sich am 5'-Ende des AOD-Promotors befand, und ferner eine Primer-PADK1-Sequenz am 3'-Ende des AOD-Promotors.
Andererseits wurde das Plasmid PADK1, das das Strukturgen von ADK enthielt (M. Konrad, J. Biol. Chem., Bd. 263 (1988), S. 19468-19474) mit den Primern PADK2 und ADKSPE vermischt, und eine PCR wurde durchgeführt. Nach der Umsetzung wurde das erhaltene Produkt durch Elektrophorese an einem Agarosegel fraktioniert und das amplifizierte DNA-Fragment (CADK- Fragment) wurde gewonnen. Das gewonnene CADK-Fragment umfaßte eine Se quenz des Primers PADK2 flußaufwärts vom 5'-Ende des ADK-Gens und eine Spei-Stelle am 3'-Ende des ADK-Gens.

Zweite PCR

Die bei den ersten PCRS erhaltenen Fragmente PAOD und CADK wurden vermischt, die Primer RV und ADKSPE wurden zugegeben, und das Gemisch wurde einer zweiten PCR unterworfen, wobei das auf diese Weise amplifizierte DNA-Fragment eine Verknüpfung zwischen dem PAOD-Fragment und dem CADK-Fragment umfaßte (PAOD-CADK-Fragment) . Die erfolgreiche Amplifizierung des PAOD-CADK-Fragments konnte erreicht werden, da die Nucleotidsequenz am 3'-Ende des PAOD-Fragments komplementär mit der am 5'-Ende des CADK-Fragments war (vgl. die Nucleotidsequenzen der Primer PADK1 und PADK2), so daß ein Doppelstrang in diesem Bereich gebildet wurde. Als Ergebnis wurde ein PAOD-CADK-Fragment durch die PCR-Reaktion gebildet. Ein weiterer Grund für den Erfolg bestand darin, daß die Primer RV und ADKSPE während der Umsetzung sich mit den jeweiligen Enden des PAOD-CADK-Fragments anelierten, was die Amplifikation des PAOD-CADK-Fragments in der PCR-Reaktion ermöglichte. Das amplifizierte PAOD-CADK-Fragment wurde mit XbaI/SpeI gespalten, und die Produkte wurden der Elektrophorese an einem Agarosegel unterworfen, wodurch ein in Fig. 3 mit PCx bezeichnetes Fragment gewonnen wurde. Das PC'-Fragment umfaßte den Bereich des AOD-Promotors flußabwärts vom 3'-Ende der XbaI-Stelle zusammen mit der ADK-Region. Andererseits wurde pMOX33 (Fig. 1) mit EcoRI/XbaI gespalten, wodurch man das in Fig. 3 mit Px bezeichnete Fragment erhielt. Das P'-Fragment umfaßte den Bereich des AOD-Promotors flußaufwärts vom 5'-Ende der XbaI- Stelle.

Dritte PCR

Ein DNA-Fragment von 0,6 kb, das durch Spalten des Plasmids pMOX390 mit BamHI/HindIII erhalten wurde, wurde sodann in die BamHI/HindIII- Stelle von pbluescript II KS&spplus; inseriert, um das Plasmid pMOX078 zu konstruieren. Das Plasmid pMOX078 enthielt die Terminatorregion des AOD- Gens. Die Primer SPETERM und NP wurden zu dem Plasmid pMOX078 gegeben, wonach sich eine PCR anschloß. Das Produkt wurde mit SpeI/HindIII gespalten und durch Agarose-Gelelektrophorese fraktioniert, wodurch man das amplifizierte DNA-Fragment (TAOD-Fragment) gewann. Das TAOD-Fragment wies kohäsive SpeI- und HindIII-Enden an den 5'- bzw. 3'-Enden des AOD-Terminators auf.

Konstruktion der Kassette

Die drei auf diese Weise erhaltenen DNA-Fragmente (Px-, PCx- und TAOD-Fragmente) und das durch Spaltung des Vektors pbluescript II KS&spplus; mit EcoRI/HindIII erhaltene DNA-Fragment wurden unter Verwendung von T4-Ligase miteinander verknüpft, um das Plasmid pECA1 zu konstruieren. Das Plasmid pECA1 enthielt die Expressionskassette, die aus dem Bereich des AOD-Promotors flußabwärts vom 3'-Ende der EcoRI-Stelle, dem ADK-Strukturgen und dem Bereich des AOD-Terminators flußaufwärts vom 5'-Ende der HindIII-Stelle bestand.

(2) Konstruktion des Expressionsvektors

Aus dem Plasmid pRCU350, das das URA3-Gen von Candida boidinii enthielt, wurde das URA3-Fragment mit Sall ausgeschnitten, und das Fragment wurde mit T4-DNA-Polymerase stumpfendig gemacht. Sodann wurde das Fragment in die NdeI-Stelle des Plasmids puclg zur Bildung des Plasmids pCU350 inseriert. Die Verfahren zur Gewinnung des URA3-Gens von Candida boidinii und zur Herstellung des Plasmids pRCZ350 sind von Sakai et al. (Y. Sakai et al., J. Bacteriol., Bd. 173 (1991), S. 7458-7463) beschrieben. Die Expressionskassette wurde aus dem Plasmid pECAI mit EcoRI/Sali ausgeschnitten und in die EcoRI-SalI-Stelle des Plasmids pCU350 inseriert, um einen Expressionsvektor herzustellen, der als ptrex bezeichnet wurde. Fig. 4 zeigt die Restriktionsenzymkarte des Vektors ptrex. Der Vektor umfaßte die ADK-Expressionskassette des ADK-Gens und des URA3- Gens, die in die Sall-Stelle bzw. in die Ndei-Stelle des Plasmids pUC19 inseriert waren.

(3) Transformation

Ein Stamm mit Uracilbedarf (Stamm TK62) wurde aus dem Stamm Candida boidinii S2 AOU-1 erhalten. Das Verfahren zur Gewinnung des Stamms mit Uracilbedarf und die Tatsache, daß dieser Stamm mit Uracilbedarf eine Mutation im URA3-Gen aufweist, sind von Sakai et al. beschrieben (Y. Sakai et al., J. Bacteriol., Bd. 173 (1991), S. 7458-7463).
Dieser Stamm mit Uracilbedarf wurde mit pTRex transformiert, um eine Transformante von Candida boidinii zu erhalten, die zur Bildung einer signifikant hohen Menge der Adenylat-kinase befähigt war. Die Transformation wurde mit dem Lithium-Verfahren (vgl. H. Ito et al., J. Bacteriol., Bd. 153 (1983), S. 163-168) oder dem Sphäroplasten-Verfahren (A. Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 75 (1978), S. 1929-1933) durchgeführt. Das Absuchen der Transformanten wird ausführlich von Sakai et al. beschrieben (Y. Sakai et al., J. Bacteriol., Bd. 173 (1991), S. 7458- 7463). Bei dieser Transformante unterlag das URA3-Gen aus dem Plasmid pRTex einer homologen Rekombination mit dem URA-Gen in der chromosomalen DNA von Candida boidinii, so daß die ADK-Expressionskassette in die chromosomale DNA integriert wurde. Wurde dementsprechend diese Rekombinante in einem Methanol enthaltenden Medium gezüchtet, so zeigte sie eine stabile Bildung der Adenylat-kinase, wie in Beispiel 3 erläutert wird.

Beispiel 3

Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung von Adenylat-kinase unter Verwendung eines transformierten Candida boidinii-Stamms mit der Expressionskassette, wobei das Adenylat-kinase-Gen in die chromosomale DNA integriert ist.
Eine Transformante (Stamm 1-1) und deren parentaler Stamm (Stamm TK62) wurden nebeneinander in einem Medium mit einem Gehalt an Methanol oder Glucose als Hauptkohlenstoffquelle gezüchtet, wobei die Zellzahl und die Aktivitäten an intrazellulärer Adenylat-kinase im zeitlichen Verlauf bestimmt wurden (Fig. 5). Das Medium für methylotrophe Hefen wurde von Sakai et al. beschrieben (Y. Sakai et al., Appl. Environ. Microbiol., Bd. 53 (1987), S. 1812-1818). Methanol oder Glucose wurde in einer Konzentration von 2% zugesetzt. Das Verfahren zur Bestimmung der Adenylat-kinase- Aktivitäten wird von Brolin et al. beschrieben (S. E. Brolin et al., Methods of Enzymatic Analysis, Bd. 3, 3. Aufl. (1983), S. 540-544), wobei 1 Einheit des Enzyms als die enzymatische Aktivität definiert ist, die erforderlich ist, um 2 µmol ADP in 1 Minute bei 24ºC zu bilden. Nach 72- stündiger Züchtung im Methanol-Medium ergab der 1-1-Stamm eine Aktivität von 93,5 U Adenylat-kinase pro mg Zeliprotein. Im Vergleich mit der Adenylat-kinase-Aktivität des parentalen Stamms (0,0328 U), war die enzymatische Aktivität der Transformante um den Faktor 2900 höher. Diese Steigerung der enzymatischen Aktivität wurde im Glucose-Medium nie beobachtet, was zeigt, daß die Expression der Adenylat-kinase durch Methanol induziert wurde.
Erfindungsgemäß wurde das Alkohol-oxidase-Gen aus der methylotrophen Hefe Candida boidinii erhalten, und ein Expressionsvektor von methylotropher Hefe wurde unter Verwendung des Promotors und des Terminators dieses Gens hergestellt. Ferner konnte durch Züchten einer methylotrophen Hefe, die mit diesem Expressionsvektor transformiert war, in einem flüssigen Medium Adenylat-kinase in hohen Mengen durch Zugabe von Methanol gebildet werden. Dieses einfache Verfahren zur Herstellung von Adenylat-kinase ermöglicht die Bildung von ATP unter Verwendung des Enzyms in großtechnischem Maßstab.

Beispiel 4

Mit verschiedenen Kohlenstoffquellen induzierte Expression Dieses Beispiel zeigt, daß der Expressionsvektor, der die Promotor- und die Terminatorregionen des Alkohol-oxidase-Gens aus Candida boidinii umfaßt, die Expression einer Adenylat-kinase ermöglicht, und daß die Expression durch Glycerin sowie durch Methanol, jedoch nicht durch Ethanol oder Glucose induziert wird. Ferner zeigt dieses Beispiel, daß der Expressionsvektor auch in Saccharomyces cerevisiae funktioniert, wie durch die Expression des G418-resistenten Gens, das durch die Zugabe von Glycerin stark induziert wurde, bestätigt wurde.
Tabelle 1 zeigt die Adenylat-kinase-Aktivitäten nach 24-stündiger Züchtung des in Beispiel 3 hergestellten transformanten 1-1-Stamms in Gegenwart von Glucose, Ethanol, Methanol, Glycerin oder Gemischen davon. Methanol und Glycerin aktivierten den AOD-Promotor und erhöhten die Expression der Adenylat-kinase. Bei Kombination von Methanol und Glycerin zeigte die Transformante die höchste Expression, entsprechend dem 1,7-fachen der Induktion durch Methanol allein. Die Induktion durch Methanol und Glycerin wurde mit Glucose und Ethanol vollständig unterdrückt. Da Methanol und Glycerin billige Kohlenstoffquellen darstellen, lassen sich heterologe Genprodukte mit der erfindungsgemäßen Transformante zu niedrigen Kosten großtechnisch herstellen. Ferner kann Glycerin im Gegensatz zu Methanol dem Medium in hohen Konzentrationen zugesetzt werden, ohne irgendwelche nachteiligen Einflüsse auf das Wachstum der Transformanten hervorzurufen, wodurch die endgültige Zellkonzentration erhöht werden kann. Daher stellt Glycerin die besonders bevorzugte Kohlenstoffquelle zur Herstellung von Peptiden oder Proteinen durch diese Methanol-Hefen dar. Tabelle 1
Eine Expressionskassette mit dem G418-resistenten Gen zwischen dem Promotor und dem Terminator des Alkohol-oxidase (AOD) -Gens wurde konstruiert. Das G418-resistente Gen aus Transposon Tns wurde aus dem Plasmid PNEO (Pharmacia) erhalten. Die Konstruktion der Expressionskassette wurde durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) auf ähnliche Weise wie in Beispiel 2 durchgeführt. Die auf diese Weise konstruierte Expressionskassette wurde in den YIp-Vektor pRS406 (Stratagene) mit einem Gehalt an dem URA3- Gen aus Saccharomyces cerevisiae inseriert. Transformanten, die diese Expressionskassette in integrierter Form als Ergebnis der homologen Rekombination in den URA3-Genbereich des Hefewirts mit Uracilbedarf (Saccharomyces cerevisiae, YPH500-Stamm; R. Sikorski et al., Genetics, Bd. 122 (1989), S. 19-27) enthielten, wurden auf der Basis ihrer Uracil- Unabhängigkeit abgesucht. Die Resistenz der transformierten Hefen gegen G418 wurde auf der Basis des Wachstums in einem Medium mit einem Gehalt an verschiedenen Konzentrationen (0-100 mg/ml) an G418 geprüft. Die transformierten Hefen waren zum Wachstum selbst in Gegenwart von 100 mg/ml G418 in einem Medium mit einem Gehalt an 3% Glycerin befähigt, während die nicht-transformierte Wirtshefe in einem Medium mit einem Gehalt an mehr als 0,1 mg/ml G418 nicht wachsen konnte. Bei Züchtung mit 2% Glycerin als einziger Kohlenstoffquelle waren diese Transformanten nicht zum Wachstum in einem Medium mit einem Gehalt an mehr als 0,1 mg/ml G418 befähigt, ebenso wie die nicht-transformierte Wirtshefe. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Expressionskassette mit dem Promotor und dem Terminator des aus der methylotrophen Hefe abgeleiteten Alkohol-oxidase (AOD) -Gens in Saccharomyces cerevisiae in zufriedenstellender Weise funktionierte und stark durch die Zugabe von Glycerin zum Medium induziert wurde.

Beispiel 5

Zusätzlich zu dem in Beispiel 2 konstruierten Expressionsvektor wurde ein weiterer Expressionsvektor hergestellt. Dabei wurden die Promotorund Terminatorregionen des Alkohol-oxidase-Gens aus dem Stamm Candida boidinii S2AOU-1, der gemäß Beispiel 1 erhalten worden war, verwendet. Die Nucleotidsequenz der NotI-Stelle wurde zwischen dem Promotor und dem Terminator inseriert (Fig. 6). Von Hydrogenobacter thermophilus abgeleitetes Cytochrom C552-Gen wurde in diesen Expressionsvektor bei einem Versuch zur Bildung von Cytochrom C552 durch Transformation von Candida boidinii mit diesem Vektor inseriert.

(1) Isolierung von AOD-Promotor/Terminator

Eine Mehrzweck-Expressionskassette wurde hergestellt, wobei der Vektor eine Nucleotidsequenz der NotI-Stelle, die zwischen dem Promotor und dem Terminator des Alkohol-oxidase (AOD)-Gens inseriert war, umfaßte.
Um das Alkohol-oxidase-Gen und die Promotor- und die Terminatorregionen des Alkohol-oxidase-Gens auszuschneiden, wurden Polymerase-Kettenreaktionen (PCR) angewandt. Als Primer für die PCRS wurden die folgenden drei oligonucleotide synthetisiert.
Darunter wiesen die Primer PMALL und PMAL2 eine NotI-Stelle am 5'- Ende auf (unterstrichen) . Der Primer PMALL enthielt die 3'-terminale Sequenz des AOD-Promotors und der Primer PMAL2 enthielt die 5'-terminale Sequenz des AOD-Terminators. Der Primer PMAL3 enthielt eine XbaI-Stelle innerhalb des AOD-Terminators (unterstrichen)
Das den AOD-Promotor enthaltende Plasmid pMOX330 wurde mit den Pnmern PMAL1 und PMAL3 vermischt und eine PCR wurde durchgeführt. Das auf diese Weise erhaltene Reaktionsprodukt wurde der Elektrophorese an Agarosegel unterworfen, und das amplifizierte DNA-Fragment wurde gewonnen. Das gewonnene Fragment (PN3-Fragment) umfaßte die AOD-Promotorregion flußabwärts von der XbaI-Stelle sowie eine NotI-Stelle am 3'-Ende.
Inzwischen wurde das plasmid pMOX078 mit dem AOD-Terminator mit den Primern PMAL2 und NP (vgl. Beispiel 1) vermischt, und eine PCR wurde durchgeführt. Das auf diese Weise erhaltene Reaktionsprodukt wurde der Elektrophorese an Agarosegel unterworfen, und das amplifizierte DNA-Fragment wurde gewonnen. Das gewonnene Fragment (TN-Fragment) umfaßte den AOD-Terminator flußaufwärts von der HindIII-Stelle sowie eine NotI-Stelle am 5'-Ende. Das Plasmid pMOX330 mit dem AOD-Promotor wurde mit EcoRI und XbaI verdaut. Das Produkt wurde der Elektrophorese an einem Agarosegel unterworfen, wodurch man ein DNA-Fragment (PN5-Fragment) erhielt, das die AOD-Promotorregion flußaufwärts von der XbaI-Stelle enthielt.

(2) Konstruktion des Expressionsvektors

Das durch Verdauung mit NotI und XbaI erhaltene PN3-Fragment, das durch Verdauung mit NotI und HindIII erhaltene TN-Fragment und der mit XbaI und HindIII verdaute Vektor pUC18 wurden mit T4 DNA-Ligase miteinander verknüpft, um das Plasmid pPN1 zu bilden. Dieses Plasmid wurde sodann mit EcoRI/XbaI behandelt, und das PNS-Fragment wurde inseriert, wodurch man das Plasmid pNOT1 erhielt. Aus dem Plasmid pRCU350 mit einem Gehalt an dem URA3-Gen von Candida boidinii wurde das URA3-Fragment mit Sall ausgeschnitten, und das Fragment wurde mit T4 DNA-Polymerase stumpfendig gemacht. Anschließend wurde das Fragment in die Ndei-Stelle des Plasmids PNOTI inseriert, um das plasmid pNOTe1 zu bilden. Da der Vektor pNOTe1 zwischen der EcoRI-Stelle und der HindIII-Stelle aus dem Plasmid pUC18 eine Expressionskassette, die aus dem AOD-Promotor/Terminator bestand, enthielt, konnte jedes beliebige heterologe Gen in die NotI-Stelle zwischen dem AOD-Promotor und dem AOD-Terminator inseriert werden. Ferner enthielt der Vektor pnotel an der NdeI-Stelle ein URA3-Gen, das für die Transformation von methylotrophen Hefen und die Integration der Kassette in eine chromosomale DNA notwendig war (vgl. Fig. 6).

(3) Konstruktion des Expressionsvektors für Cytochrom C552

Die Verfahren zur Herstellung des Cytochrom C552 (Cyt552) -Gens und die Nucleotidsequenz dieses Gens sind von Sanbongi et al. beschrieben (Y. Sanbongi, J. H. Yang, Y. Igarashi und T. Kodama, Eur. J. Biochem., Bd. 198 (1991), S. 7-12). Aus dem Plasmid pKHC12, das das Strukturgen von Cytss2 an der EcoRI-Stelle des Vektors pUC18 enthielt, wurde mit EcoRI und Sall ein Fragment mit einem Gehalt an dem Gen ausgeschnitten. Das Fragment wurde mit T4 DNA-Polymerase stumpfendig gemacht. Sodann wurde das Fragment in das Plasmid pNOTe1, das mit NotI verdaut und stumpfendig gemacht worden war, inseriert, wodurch das Plasmid pNOTe1C552 zur Expression von CytC552 erhalten wurde.

(4) Transformation und Bildung von Cytochrom C

Die Transformation wurde auf ähnliche Weise wie in Beispiel 2 durchgeführt. Ferner waren auch die Bedingungen zur Züchtung der Transformante und das Medium und dergl. ähnlich wie in Beispiel 2.
Ein Stamm (Stamm 1-a) unter den Transformanten und der parentale Stamm (Stamm TK62) wurden in einem Medium mit einem Gehalt an Methanol und/oder Glycerin als Kohlenstoffquelle gezüchtet. Der Betrag der Cytochrom C-Expression in den Zellen wurde bestimmt. Der Betrag der Cytochrom C-Expression wurde durch Messung der Absorption bei 552 nm berechnet. Nach 100-stündiger Züchtung im Methanol-Medium bildete der Stamm 1-a 0,8 ml Cytochrom C552 pro ml Medium. Diese Expression wurde durch das Glucose-Medium nicht induziert. Im parentalen Stamm wurde die Expression nicht durch Kombination des Methanol-Mediums und des Glucose-Mediums induziert, was zeigt, daß die Expression von Cytochrom C552 durch Methanol induziert wurde.

Beispiel 6

Dieses Beispiel zeigt die Isolierung der autonom replizierenden Sequenz (ARS) der methylotrophen Hefe Candida boidinii, die Bestimmung der Nucleotidsequenz von ARS und die Konstruktion von Plasmiden, die zur Replikation in Wirtszellen mittels ARS befähigt sind.

(1) Isolierung von ARS

Die Isolierung von ARS wurde durch Absuchen einer Genbibliothek von Candida boidinii gemäß dem bekannten Verfahren durchgeführt. Die Genbibliothek von Candida boidinii wurde gemäß dem Verfahren von Sakai et al. (Y. Sakai, T. Kazarimoto und Y. Tani, J. Bacteriol., Bd. 173 (1991), 5. 7458-7463) hergestellt.
Das Absuchen der Plasmide mit ARS wurde auffolgende Weise durchgeführt. Chromosomale DNA aus Candida boidinii wurde umfassend mit EcoRI oder HindIII verdaut, und die Fragmente wurden in die EcoRI- oder die HindIII-Stelle des Plasmids pBCU351 (Y. Sakai, T. Kazarimoto und Y. Tani, J. Ferment. Bioeng., Bd. 73 (1992), S. 253-260), das URA3 von Candida boidinii enthielt, inseriert. Der Stamm E. coli JM109 wurde mit diesen Plasmiden transformiert. Das Absuchen auf Transformanten, die ARS im Plasmid enthielten, wurde unter Heranziehung der fehlenden Abhängigkeit von Uracil als Meßgröße durchgeführt. Von den erhaltenen 350 methylotrophen Hefe-Transformanten wurden Plasmide zur Transformation von Candida boidinii gewonnen. Die Plasmide wurden aus den Transformanten hergestellt und ein weiteres Mal auf der Basis der fehlenden Abhängigkeit von Uracil abgesucht. Das Verfahren zur Transformation des Stamms E. coli JM109 und die Rückführung der ausgesuchten Plasmide in Candida boidinii wurden 3 mal wiederholt. Die erhaltenen 28 Plasmide enthielten DNA-Sequenzen mit starken ARS-Aktivitäten. Die nachstehend wiedergegebenen Analysen wurden an zwei dieser Plasmide, nämlich pBARCU1 und pBARCU2, durchgeführt, die die DNA-Sequenz CARS1 bzw. CARS2 mit starker ARS-Aktivität enthielten (Fig. 8).

(2) Konstruktion von ARS enthaltenden Plasmiden und der dabei erzielte Transformationswirkungsgrad

Die zur Transformation von Saccharomyces cerevisiae verwendeten Plasmide wurden auffolgende Weise konstruiert. Die Plasmide pBARCUI und pBARCU2, die gemäß Abschnitt (1) dieses Beispiels erhalten worden waren, wurden mit HindIII oder EcoRI behandelt, wodurch man die DNA-Fragmente mit einem Gehalt an CARSL bzw. CARS2 erhielt. Die DNA-Fragmente wurden an der HindIII- oder EcoRI-Stelle des YIp-Vektors mit dem URA3-Gen von Saccharomyces cerevisiae inseriert. Das Verfahren zur Isolierung des Marker- Gens URA3 von Candida boidinii und das Verfahren zur Herstellung der Plasmide mit einem Gehalt an CARS1 oder CARS2 sind im Abschnitt (1) dieses Beispiels angegeben. Die beispielhaften Konstruktionen der erhaltenen vier Plasmide pBARCU1, pBARCU2, pRAC1 und pRAC2 sind in Fig. 8 wiedergegeben.
Tabelle 2 zeigt den Transformationswirkungsgrad, der bei Transformation der Wirte Candida boidinii und Saccharomyces cerevisiae mit den vier plasmiden erzielt wurde. Im Fall von Candida boidinii wurde der Wirt mit diesen Plasmiden mit einem höheren Wirkungsgrad transformiert, während das Kontrollplasmid ohne ARS keine Transformanten bildete. In Saccharomyces cerevisiae war der Transformationswirkungsgrad noch höher als bei Candida boidinii. Eine bestimmte Anzahl an Saccharomyces cerevisiae- Transformanten wurde mit dem Kontrollplasmid PBCU351 gebildet, was darauf schließen läßt, daß das Marker-Gen URA3 von Candida boidinii im Plasmid als ein ARS in Saccharomyces cerevisiae diente. Tabelle 2 Transformationswirkungsgrad in C. boidinii- und S. cerevisiae-Stämmen mit Uracilbedarf bei Transformation mit ARS enthaltenden Plasmiden
Die Ergebnisse zeigten, daß die Vektoren mit einem Gehalt an CARS1 oder CARS2 den Transformationswirkungsgrad von C. boidinii erhöhten und somit die Konstruktion von heterologen Gen-Expressionssystemen in diesen Wirtszellen ermöglichten. Ferner konnten diese Vektoren als Shuttle-Vektoren zwischen C. boidinii und S. cerevisiae verwendet werden, da sie zur Transformation der beiden Hefespezies befähigt waren.

(3) Nucleotidsecuenz von ARS

Die vollständige Nucleotidsequenz des vorstehend erhaltenen DNA-Fragments, das CARSL umfaßte, wurde gemäß dem bekannten Verfahren von Sanger et al. (F. Sanger, S. Nicklen und A. R. Coulson, Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 74 (1977) , S. 5463-5467) bestimmt. Die aufgeklärte Nucleotidsequenz von CARSL ist in Fig. 7 dargestellt. Die Box in der Figur zeigt den Bereich, der mit der Konsensus-Sequenz in von S. cerevisiae abgeleiteter ARS (5'-(A/T)TTTATRTTT(A/T)-3'), ähnlich war, während die Unterstreichung den Bereich angibt, der der ARS-Box von S. cerevisiae (5'-TNTRAA-3') ähnlich war.

(4) Analyse der funktionellen Stellen in ARS

Die funktionellen Stellen in CARS1 von C. boidinii und S. cerevisiae wurden untersucht. Dabei wurden Restriktionsenzyme und eine Nudease zur Herstellung verschiedener Deletionsplasmide aus Plasmid pRAC1 mit ARS- Funktion und Plasmid pRAC1R mit einem Gehalt an CARS1 in umgekehrter Orientierung verwendet. Fig. 9 zeigt den Transformationswirkungsgrad in C. boidinii- und S. cerevisiae-Wirten bei Transformation der Wirte mit den Deletionsplasmiden. Die minimale Sequenz zur Erzielung der ARS-Funktion in C. boidinii umfaßte die Basen Nr. 1-495, während sie in S. cerevisiae die Basen Nr. 693-850 umfaßte.

Beispiel 7

Dieses Beispiel erläutert die Bildung einer Peroxidase unter Verwendung von transformierter C. boidinii mit der Expressionskassette für das Peroxidase-Gen, das in den in Beispiel 5 konstruierten Expressionsvektor mit einer NotI-Stelle zwischen dem Promotor und dem Terminator des Alkohol-oxidase (AOD) -Gens integriert war.

(1) Herstellung des Expressionsplasmids aus Arthromyces ramosus-Peroxidase

Das Verfahren zur Gewinnung des Peroxidase-Gens aus Arthromyces ramosus (ARP) und von dessen Nucleotidsequenz sind in der Japanischen Patentveröffentlichung 228078/92 (entsprechend EP-0 486 067) beschrieben. Das DNA-Fragment mit dem ARP-Gen wurde durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung des Expressionsplasmids pYEPOD1 (Japanische Patentveröffentlichung 228078/92) mit einer cDNA des ARP-Gens als Matrize und der synthetischen Oligonucleotide A664 (5'-AAGCGGCCGCATGAAGCTCTCGCTTTTCTCCA- 3') und A663 (5'-GTGCGGCCGCAGGATGTACCATCTTCACCAGA-3') als Primer amplifiziert. Das auf diese Weise erhaltene Reaktionsprodukt wurde der Elektrophorese an einem Agarosegel unterworfen und das amplifizierte DNA-Fragment wurde gewonnen. Das amplifizierte DNA-Fragment umfaßte das ARP-Gen und zwei NotI-Stellen am 5'-Ende (benachbart zum Initiationscodon) und am 3'-Ende (21 bp flußabwärts vom Terminationscodon TGA). Das DNA-Fragment wurde mit NotI verdaut und in die NotI-Stelle des Plasmids pnotel inseriert, um das ARP exprimierende Plasmid pNOTeIARP zu bilden.

(2) Transformation und Bildung von ARP

Die Transformation wurde auf ähnliche Weise wie in Beispiel 2 durchgeführt. Das Verfahren zur Züchtung der Transformante und das Kulturmedium und dergl. waren im wesentlichen mit den Angaben von Beispiel 3 identisch.
Die Transformante (Stamm AP-1) und der parentale Stamm (Stamm TK62) wurden in einem Medium mit einem Gehalt an Methanol als überwiegender Kohlenstoffquelle 100 Stunden gezüchtet. Anschließend wurden die Zellen gewonnen. Die Peroxidase-Aktivität im Kulturüberstand wurde gemessen. Die Messung der Peroxidase-Aktivität wurde gemäß der Japanischen Patentveröffentlichung 228078/92 durchgeführt. Dabei wurde eine Peroxidase-Aktivität für den AP-1-Stamm von 137 u/Liter und für den TK62-Stamm von 0,6 u/Liter ermittelt. Dies zeigt, daß die aktive Form von ARP im Stamm AP-l exprimiert und in das Medium sezerniert wurde. Sequenzlisten (2) Angaben zu Seq. I.D Nr. 1 (i) Sequenzkennzeichen (A) Länge: 1667 Basenpaare (B) Art: Nucleinsäure (C) Strangform: Doppelstrang (D) Topologie: unbekannt (ii) Molekülart: genomische DNA (iii) Sequenzbeschreibung: Seq. I.D. Nr. 1 (2) Angaben zu Seq. I.D Nr. 2 (i) Sequenzkennzeichen (A) Länge: 518 Basenpaare (B) Art: Nucleinsäure (C) Strangform: Doppelstrang (D) Topologie: Unbekannt (ii) Molekülart: genomische DNA (iii) Sequenzbeschreibung: Seq. I.D. Nr. 2 (2) Angaben zu Seq. I.D Nr. 3 (i) Länge: 1992 Basenpaare (A) Art: Nucleinsäure (B) Strangform: Doppelstrang (C) Topologie: unbekannt (D) Molekülart: genomische DNA (ii) Sequenzbeschreibung: Seq. I.D. Nr. 1 (2) Angaben zu Seq. I.D Nr. 4 (i) Sequenzkennzeichen (A) Länge: 850 Basenpaare (B) Art: Nucleinsäure (C) Strangform: Doppelstrang (D) Topologie: unbekannt (ii) Molekülart: genomische DNA (iii) Sequenzbeschreibung: Seq. I.D. Nr. 4

Claims

1. Mit Methanol und/oder Glycerin induzierbare Expressionskassette, die einen Promotor mit der durch Seq. I.D. Nr. 1 wiedergegebenen Nucleotidsequenz, ein heterologes Gen flußabwärts vom Promotor und einen Terminator mit der durch Seq. I.D. Nr. 2 wiedergegebenen Nucleotidsequenz flußabwärts vom heterologen Gen enthält.

2. Expressionsvektor mit der Expressionskassette nach Anspruch 1.

3. Expressionsvektor nach Anspruch 2, wobei der Expressionsvektor einen Sequenzbereich aufweist, der homolog zu einem Bereich der chromosomalen DNA von Wirtszellen ist, um die Kassette in die chromosomale DNA durch eine homologe Rekombination zwischen den homologen Sequenzbereichen des Vektors und des Chromosoms zu integrieren.

4. Expressionsvektor nach Anspruch 2, wobei der Expressionsvektor eine durch Seq. I.D. Nr. 4 wiedergegebene autonom replizierende Sequenz aufweist.

5. Transformierte Zelle, die mit dem Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 2 bis 4 transformiert worden ist.

6. Verfahren zur Herstellung eines Peptids oder eines Proteins, das durch ein heterologes Gen kodiert wird, umfassend die Züchtung der transformierten Zelle nach Anspruch 5 in Gegenwart von Methanol und/oder Glycerin und das Isolieren und Reinigen des gewünschten Peptids oder Proteins, bei dem es sich um ein Expressionsprodukt des heterologen Gens handelt, aus der Kultur.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei es sich beim heterologen Gen um das Gen handelt, das für die von Saccharomyces cerevisiae abgeleitete Adenylat-kinase kodiert.

8. Verfahren nach Anspruch 6, wobei es sich bei dem heterologen Gen um das Gen handelt, das für das von Hydrogenobacter thermophilus abgeleitete Cytochrom C552 kodiert.

9. Verfahren nach Anspruch 6, wobei es sich bei dem heterologen Gen um ein Gen handelt, das für die von Arthromyces ramosus abgeleitete Peroxidase kodiert.