DE69233323T2

DE69233323T2 - Pflanzliche mittelkettige thioesterasen

Info

Publication number: DE69233323T2
Application number: DE69233323T
Authority: DE
Inventors: Alois Toni VOELKER; Maelor Huw DAVIES
Original assignee: Calgene LLC
Current assignee: Monsanto Co
Priority date: 1991-05-21
Filing date: 1992-05-21
Publication date: 2005-02-24
Anticipated expiration: 2012-05-22
Also published as: WO1992020236A1; ATE262042T1; EP0557469A4; EP0557469A1; EP0557469B1; ES2217253T3; JP2002238386A; US5512482A; CA2109580C; DE69233323D1; CA2109580A1

Description

Hintergrund
Vertreter aus mehreren Pflanzenfamilien synthetisieren große Mengen an vorwiegend mittelkettigen (C8-C14) Triacylglycerinen in spezialisierten Speichergeweben, von welchen einige zur Herstellung von wichtigen diätetischen oder industriellen mittelkettigen Fettsäuren gewonnen werden (Gunstone F.D., The Lipid Handbook (Chapman & Hall, New York, 1986), S. 55–112). Laurat (C12:0) zum Beispiel wird gegenwärtig aus Samen tropischer Bäume in einer Rate extrahiert, welche eine Million Tonnen jährlich erreicht (Battey et al., Tibtech 71 (1989), 122–125).
Über den Mechanismus, durch welchen die allgegenwärtige Synthese langkettiger Fettsäuren auf die Produktion von spezialisierten mittelkettigen Fettsäuren umgestellt wird, ist seit vielen Jahren spekuliert worden (Harwood, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biology 39 (1988), 101–138). Vor kurzem identifizierten Pollard et al. (Arch. of Biochem. and Biophys. 284 (1991), 1–7) eine mittelkettige Acyl-ACP-Thioesterase-Aktivität in keimenden Ölsamen des Kalifornischen Lorbeerbaums, Umbellularia californica. Diese Aktivität tritt nur auf, wenn die sich entwickelnden Kotyledonen dazu gebracht werden, nahezu ausschließlich Triglyceride mit Lauroyl- (12:0) und Caproyl-(10:0)-Fettsäuren herzustellen. Diese Arbeit lieferte den ersten Beweis für einen Mechanismus zur Synthese von mittelkettigen Fettsäuren in Pflanzen: während der Elongation bleiben die Fettsäuren mit dem Acyl-Trägerprotein (ACP) verestert. Falls der Thioester vorzeitig hydrolysiert wird, wird die Elongation durch Freisetzung der mittelkettigen Fettsäure beendet. Die Lorbeerbaum-Thioesterase ("Bay-Thioesterase") wurde später durch Davies et al. (Arch. Biochem. Biophys. 290 (1991), 37–45) gereinigt, was die Clonierung einer korrespondierenden cDNA ermöglichte, und deren Verwendung wurde beschrieben, um verwandte Clone zu erhalten und um die Triglyceridzusammensetzung von Pflanzen zu modifizieren (WO 91/16421).
Zusammenfassung der Erfindung
Durch diese Erfindung werden weitere Eigenschaften und Verwendungen von pflanzlichen mittelkettigen Thioesterasen bereitgestellt.
In einer ersten Ausführungsform betrifft diese Erfindung Pflanzensamen, die normalerweise kein Laurat enthalten, aber für welche nun festgestellt wird, daß sie Laurat enthalten. Samen mit nur 1,0 Molprozent Laurat unterscheiden sich wesentlich von Wildtyp-Pflanzenarten, welche natürlicherweise kein Laurat in den Triglyceridölen der Samen speichern. Samen mit mindestens etwa 15 Molprozent Laurat, 33 Prozent Laurat oder 50 Prozent Laurat sind hierin eingeschlossen. Brassica-Samen, abgeleitet aus solchen Samen, enthaltend mehr als 1,0 Molprozent Laurat, werden besonders bevorzugt.
In noch einer anderen Ausführungsform betrifft diese Erfindung eine bestimmte mittelkettige Thioesterase-Sequenz, die mittelkettige Thioesterase-DNA-Sequenz aus dem Lorbeerbaum, sowie DNA-Konstrukte für die Expression dieses Enzyms in einer Wirtszelle. Insbesondere wird ein Startpunkt für die Strukturgen-Sequenz stromaufwärts von dem Startpunkt, welcher früher für diese Sequenz genannt wurde, beschrieben.
Andere Aspekte dieser Erfindung betreffen Verfahren für die Verwendung einer pflanzlichen mittelkettigen Thioesterase. Die Expression einer pflanzlichen mittelkettigen Thioesterase in einer Bakterienzelle zur Herstellung von mittelkettigen Fettsäuren wird vorgesehen. Durch dieses Verfahren können große Mengen solcher Fettsäuren in kristalliner Form aus Bakterien gewonnen werden. In der Anmeldung wird die Verwendung von E. coli und der Lorbeerbaum-Thioesterase veranschaulicht, wobei die fadD-E. coli-Mutante besonders bevorzugt wird. Außerdem werden Temperaturbereiche für eine verbesserte Lauratproduktion beschrieben.
Verfahren zur Herstellung einer ungesättigten mittelkettigen Thioesterase durch die Verwendung einer pflanzlichen mittelkettigen Thioesterase werden hierin auch beschrieben. Es ist nun festgestellt worden, daß, selbst in Pflanzen, welche ausschließlich große Mengen an gesättigten mittelkettigen Acyl-ACP-Fettsäuren produzieren und in Triglyceride einbauen, die Thioesterase eine Aktivität für ungesättigte Fettsäuren der gleichen Länge zeigen kann.
Beschreibung der Figuren
1: Eine Lorbeerbaum-Thioesterase vollständiger Länge (pCGN3822) mit einem ATG-Codon bei den Nucleotiden 145–147. In 1A ist die Nucleinsäuresequenz angegeben. In 1B ist die translatierte Aminosäuresequenz beginnend mit dem ATG-Codon bei den Nucleotiden 145–147 angegeben.
2: Korrelation der Lauroyl-Thioesterase-Aktivität mit der Anreicherung von Acyl-12:0 in Samen von A. thaliana. Die Thioesterase-Aktivität wird in keimenden Samen von verschiedenen unabhängigen transgenen Pflanzen gemessen. Der %12:0-Wert gibt den prozentualen Gehalt an Lauroylacylgruppen in Gesamtfettsäureextrakten wieder, gemessen mittels quantitativer Gaschromatographie.
3: Nucleinsäure- und translatierte Aminosäuresequenz eines Lorbeerbaum-Thioesterase-Clons, Lorbeerbaum D, welcher eine zweite Klasse von Lorbeerbaum-Thioesterase-Genen darstellt.
4: Nucleinsäure- und translatierte Aminosäuresequenzen von zwei Färberdistel-Thioesterase-Clonen, pCGN3264 (4A) und pCGN3265 (4B). Die DNA-Sequenz, einschließlich einer zusätzlichen 3'-nichttranslatierten Sequenz von pCGN3265, ist in 4C dargestellt.
5: Die Nucleinsäuresequenz eines Kampfer-Thioesterase-PCR-Fragments ist in 5A dargestellt. Die Nucleinsäure- und translatierte Aminosäuresequenz einer mittels PCR erzeugten, codierenden Sequenz der Kampfer-Thioesterase ist in 5B dargestellt.
6: Die Nucleinsäuresequenz eines Thioesterase-Clons aus Brassica campestris ist in 6 dargestellt. Die translatierte Aminosäuresequenz ausgehend von dem angenommenen MET-Initiationscodon ist ebenfalls dargestellt.
7: Lauroylanteile und C12:0-ACP-Thioesterase-Aktivität für Samen aus transgenen B. napus-Spezies.
8: Vergleich zwischen der Färberdistel- und der Lorbeerbaum-Thioesterase-Aminosäuresequenz. Die obere Linie gibt die Aminosäuren 61-385 der Färberdistel-Thioesterase-Aminosäuresequenz in 4B wieder. Die untere Linie stellt die Aminosäuren 84–382 der Lorbeer-Thioesterase-Aminosäuresequenz in 1B dar.
9: Die Fettsäurezusammensetzung von 100 Samen aus der transgenen Arabidopsis-Pflanze 3828-13 wird mit der Fettsäurezusammensetzung von Samen aus einer Arabidopsis-Kontrollpflanze verglichen.
10: In 10A wird der Fettsäuregehalt von 26 transgenen Arabidopsis-Pflanzen in der Reihenfolge des ansteigenden Fettsäuregehalts angegeben. Die Transformanten, welche nachweisbare Mengen an Laurat produzieren, sind angegeben. In 10B ist der Gehalt an C18:3-, C18:2- und C16:0-Fettsäuren in diesen Pflanzen dargestellt.
11: Der Lauratgehalt in Molprozent in keimenden Samen von transgenen B. napus-Spezies ist als Anzahl der transgenen Ereignisse angegeben, welche zu den angegebenen Lauratanteilen führen. Die Ergebnisse von pCGN3824-Transformanten sind in 11A dargestellt, und die Ergebnisse von pCGN3828-Transformanten sind in 11B gezeigt.
12: DNA-Sequenz eines PCR-Fragments eines Cuphea-Thioesterase-Gens. Die translatierte Aminosäuresequenz in der Region, welche dem Cuphea-Thioesterase-Gen entspricht, ist auch gezeigt.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Pflanzliche Thioesterasen, einschließlich pflanzliche mittelkettige Thioesterasen, sind in WO 91/16421 (PCT/US91/02960) und USSN 07/824,247 beschrieben.
Eine erfindungsgemäße pflanzliche mittelkettige Thioesterase schließt irgendeine Aminosäure-, Peptid-, Polypeptid- oder Proteinsequenz ein, erhältlich aus einer pflanzlichen Quelle, welche die Fähigkeit besitzt, die Herstellung einer oder mehrerer freier Fettsäuren aus C8-C14-Fettacyl-ACP-Substraten unter pflanzlichen Enzymreaktionsbedingungen zu katalysieren. Mit "Enzymreaktionsbedingungen" ist gemeint, daß irgendwelche notwendigen Bedingungen in einem Milieu zugänglich sind (d.h. solche Faktoren wie Temperatur, pH, das Fehlen von Hemmstoffen), welche ermöglichen, daß das Enzym wirksam ist.
Pflanzliche Thioesterasen sind aus den hierin bereitgestellten, spezifisch veranschaulichten Sequenzen und aus verwandten Quellen erhältlich. Zum Beispiel reichern mehrere Spezies der Gattung Cuphea Triglyceride, enthaltend mittelkettige Fettsäuren, in ihren Samen an; z.B. procumbens, lutea, hookeriana, hyssopifolia, wriightii und inflata. Eine andere natürliche pflanzliche Quelle für mittelkettige Fettsäuren sind Samen der Lauraceae-Familie: z.B. Pisa (Actinodophne hookeri) und Sweet Bay (Laurus nobilis). Andere pflanzliche Quellen schließen Ulmaceae (Ulme), Myristicaceae, Simarubaceae, Vochysiaceae und Salvadoraceae, sowie Regenwald-Spezies von Erisma, Picramnia und Virola, für welche beschrieben worden ist, daß sie C14-Fettsäuren anreichern, ein.
Wie oben angemerkt, sind Pflanzen, welche bedeutende Mengen an mittelkettigen Fettsäuren aufweisen, bevorzugte Kandidaten für den Erhalt von natürlich abgeleiteten pflanzlichen Thioesterasen, welche mittelkettige Fettsäuren bevorzugen. Jedoch sollte auch bekannt sein, daß andere pflanzliche Quellen, welche keine bedeutenden Mengen an mittelkettigen Fettsäuren aufweisen, ohne weiteres als andere Enzymquellen durchmustert werden können. Außerdem kann ein Vergleich zwischen endogenen pflanzlichen Thioesterasen, welche mittelkettige Fettsäuren bevorzugen, und zwischen pflanzlichen Thioesterasen, welche Fettsäuren mit längeren und/oder kürzeren Ketten bevorzugen, Einblicke in die Proteinnachbildung oder in andere Modifikationen ergeben, um synthetische pflanzliche Thioesterasen, die mittelkettige Fettsäuren bevorzugen, wie oben besprochen. zu erzeugen.
Dem Fachmann ist ohne weiteres bekannt, daß Antikörperzubereitungen, Nucleinsäuresonden (DNA und RNA) und dergleichen hergestellt und zum Durchmustern und Gewinnen von "homologen" oder "verwandten" Thioesterasen aus einer Vielzahl von pflanzlichen Quellen verwendet werden können. Für immunologische Screeningverfahren werden Antikörperzubereitungen, entweder monoclonal oder polyclonal, verwendet. Zum Nachweis wird der Antikörper mittels Radioaktivität oder irgendeines einer Vielzahl von zweiten Antikörper/Enzym-Konjugat-Systemen, welche im Handel erhältlich sind, markiert. Beispiele einiger der erhältlichen Antikörper-Nachweissysteme sind durch Oberfilder (Focus 11 (1989), 1–5, BRL Life Technologies, Inc.) beschrieben.
Homologe Sequenzen sind zu finden, wenn es eine Sequenzübereinstimmung gibt, welche beim Vergleich von Sequenzinformation, Nucleinsäure oder Aminosäure, oder durch Hybridisierungsreaktionen zwischen einer bekannten Thioesterase und einer möglichen Quelle festgestellt werden kann. Konservative Austäusche, wie Glu/Asp, Val/Ile, Ser/Thr, Arg/Lys und Gln/Asn, können beim Bestimmen einer Aminosäuresequenz-Homologie auch berücksichtigt werden. Aminosäuresequenzen werden als homolog angesehen, wenn eine Sequenzübereinstimmung von nur 25% zwischen den zwei vollständigen reifen Proteinen vorhanden ist. (Vgl. allgemein Doolittle R.F., OF URFS and ORFS (University Science Books, CA, 1986).) Typischerweise kann eine lange Nucleinsäuresequenz eine Sequenzübereinstimmung von nur 50–60% und mehr bevorzugt eine Sequenzübereinstimmung von mindestens etwa 70% zwischen der Zielsequenz und der bestimmten pflanzlichen Thioesterase von Interesse zeigen, einschließlich irgendwelcher Deletionen, welche vorhanden sein können, und dennoch als verwandt angesehen werden.
Eine genomische oder eine andere geeignete Bank, hergestellt aus der möglichen pflanzlichen Quelle von Interesse, kann mit konservierten Sequenzen aus einer pflanzlichen Thioesterase als Sonde untersucht werden, um homologe verwandte Sequenzen zu identifizieren. Kürzere Sonden sind oft für Polymerasekettenreaktionen (PCRs) besonders nützlich, insbesondere, wenn stark konservierte Sequenzen identifiziert werden können.
Wenn längere Nucleinsäurefragmente (>100 bp) als Sonden benutzt werden, insbesondere, wenn vollständige oder lange cDNA-Sequenzen verwendet werden, würde man bei niedriger Stringenz durchmustern (zum Beispiel 40–50°C unterhalb der Schmelztemperatur der Sonde), um ein Signal von der Zielprobe mit einer Abweichung von 20-50%, d.h. homologe Sequenzen, zu erhalten. (Vgl. Beltz et al., Methods in Enzymology 100 (1983), 266–285.)
Unter Anwendung von Verfahren, welche den Fachleuten bekannt sind, kann eine DNA-Sequenz, codierend eine pflanzliche mittelkettige Thioesterase, in Konstrukte inseriert werden, welche in eine ausgewählte Wirtszelle zur Expression des Enzyms, einschließlich pflanzlicher Zellen zur Herstellung von transgenen Pflanzen, eingeschleust werden können. Folglich schließen mögliche Wirtszellen sowohl prokaryontische als auch eukaryontische Zellen ein. Eine Wirtszelle kann einzellig sein oder in einem mehrzelligen, differenzierten oder undifferenzierten Organismus zu finden sein, abhängig von gewünschten Verwendung. Erfindungsgemäße Zellen können dadurch unterschieden werden, daß sie eine pflanzliche Thioesterase besitzen, welche in der Wildtyp-Zelle nicht vorkommt, zum Beispiel darin bereitgestellt durch ein rekombinantes Nucleinsäurekonstrukt, welches eine pflanzliche Thioesterase darin codiert.
In Abhängigkeit von dem Wirt variieren auch die regulatorischen Regionen, einschließlich Regionen aus viralen, Plasmid- oder chromosomalen Genen, oder dergleichen. Zur Expression in prokaryontischen oder eukaryontischen Mikroorganismen, besonders einzelligen Wirten, kann eine große Vielzahl von konstitutiven oder regulierbaren Promotoren verwendet werden. Unter den Transkriptionsinitiationsregionen, welche beschrieben worden sind, sind Regionen aus Bakterien- und Hefewirten, wie E. coli, B. subtilis oder Sacchromyces cerevisiae, einschließlich Gene wie beta-Galactosidase, T7-Polymerase, Tryptophan-E und dergleichen, zu finden.
Zum überwiegenden Teil, wenn die Expression in einer pflanzlichen Wirtszelle erwünscht ist, schließen die Konstrukte regulatorische Regionen ein (Promotoren und Terminationsregionen), welche in Pflanzen funktionsfähig sind. Das offene Leseraster, welches die pflanzliche Thioesterase oder ein funktionelles Fragment hiervon codiert, ist an seinem 5'-Ende mit einer regulatorischen Transkriptionsinitiationsregion verknüpft, wie der Wildtyp-Sequenz, welche natürlicherweise 5' stromaufwärts des Thioesterase-Struktur gens zu finden ist. Zahlreiche andere Transkriptionsinitiationsregionen sind zugänglich, welche für eine große Vielfältigkeit der konstitutiven oder regulierbaren, z.B. induzierbaren, Transkription der Strukturgen-Funktionen sorgen. Unter den für Pflanzen verwendeten Transkriptionsinitiationsregionen sind solche Regionen, welche mit den Strukturgenen von z.B. CaMV35S sowie Nopalin- und Mannopin-Synthasen oder mit Napin, ACP-Promotoren und dergleichen assoziiert sind. Die Transkiptions/Translationsinitiationsregionen, welche mit solchen Strukturgenen korrespondieren, sind unmittelbar 5' stromaufwärts zu den jeweiligen Startcodons zu finden. Falls ein bestimmter Promotor gewünscht wird, wie ein Promotor, welcher natürlicherweise in dem pflanzlichen Wirt von Interesse vorkommt, oder ein modifizierter Promotor, d.h. mit Transkriptionsinitiationsregionen, abgeleitet aus einer Genquelle, und Translationsinitiationsregionen, abgeleitet aus einer anderen Genquelle, einschließlich der Sequenz, welche die pflanzliche Thioesterase von Interesse codiert, oder verstärkte Promotoren, wie doppelte 35S-CaMV-Promotoren, können die Sequenzen unter Anwendung von Standardtechniken miteinander verknüpft werden. Für die meisten Anwendungen mit dem Ziel, mittelkettige Thioesterasen in Pflanzen zu exprimieren, wird die Verwendung von samenspezifischen Promotoren bevorzugt. Es ist nun beobachtet worden, daß eine solche pflanzliche mittelkettige Thioesterase biologisch aktiv ist, wenn sie in Bakterien und heterologen Pflanzenzellen exprimiert wird.
Insbesondere ist nun beobachtet worden, daß Pflanzensamen, die normalerweise keine mittelkettigen Fettsäuren enthalten würden, entweder als freie Fettsäuren oder eingebaut in Triglyceridmoleküle, gefunden werden können, welche solche mittelkettigen Fettsäuren enthalten. Mit Samen, welcher normalerweise keine mittelkettigen Fettsäuren enthalten würden, sind Samen gemeint, welche weniger als 0,1 Molprozent einer bestimmten mittelkettigen Fettsäure bezogen auf die gesamten Fettsäuren enthalten. Folglich ist irgendein Pflanzensamen, enthaltend mindestens 1,0 Molprozent einer bestimmten mittelkettigen Fettsäure bezogen auf die gesamten Fettsäuren signifikant modifiziert. Der Ausdruck "Molprozent bezogen auf die gesamten Fettsäuren" wird verwendet, um das relative Verhältnis der mittelkettigen Fettsäuren zu dem Gesamtfettsäuregehalt zu beschreiben. Diese Werte können gegebenenfalls in Gewichtsprozente umgerechnet werden.
Mittelkettige Fettsäuregehalte von mindestens 1,0 Molprozent Laurat, bezogen auf die gesamten Fettsäuren, bis mindestens 50,0 Molprozent Laurat, bezogen auf die gesamten Fettsäuren, sind gemessen worden. Die gesamten Fettsäuren eines Pflanzensamens schließen die Embryo-, Endosperm- und Samenschalen-Lipide ein. Weiterhin wird angemerkt, daß in Samen, enthaltend mittelkettige Fettsäuren, der Gehalt an Laurat bezogen auf die gesamten Fettsäuren direkt den Lauratgehalten des Triacylglycerids entspricht. Folglich ist es geeignet, den Gesamtfettsäuregehalt auch als das "gesamte extrahierbare Öl" zu betrachten.
Was die Triacylglyceride anbetrifft, welche die mittelkettigen Fettsäuren einbauen, ist nicht eindeutig, welche Positionen des Glyceringrundgerüsts beteiligt sind.
Basierend auf den hohen Anteilen an mittelkettigen Fettsäuren, welche gemessen wurden, scheint es jedoch, daß mindestens zwei Positionen des Triacylglycerids beteiligt sind.
Hierin werden Samen von Arabidopsis und Brassica, welche mittelkettige Fettsäuren enthalten, veranschaulicht. Insbesondere werden Samen von transgenen Arabidopsis- und Brassica-Pflanzen beschrieben, welche neue Fettsäurezusammensetzungen als ein Ergebnis der Expression eines heterologen mittelkettigen Thioesterase-Strukturgens unter der regulatorischen Kontrolle von samenspezifischen Promotoren enthalten. Durch die Expression der DNA-Sequenz, welche die aus Umbullaria californica (Lorbeerbaum) erhaltene mittelkettige Thioesterase codiert, ist nun Laurat in dem extrahierbaren Öl dieser jeweiligen Samen zu finden. Während die Anwesenheit von Laurat zunimmt, wird eine entsprechende Verminderung der Ölsäure (18:1) beobachtet. Andere Veränderungen hinsichtlich der Fettsäurezusammensetzung in Zusammenhang mit einem erhöhten Lauratgehalt schließen die Zunahme von Myristat (14:0) und in einem geringeren Grad einen Abfall der Mengen an Linolat (18:2), Linolenat (18:3) und Palmitat (16:0) ein.
Bei Arabidopsis führte die Analyse von 100 Samenpools zur Identifizierung von transformierten Pflanzen, deren Samen bis zu 23,5 Molprozent Laurat enthalten, verglichen mit etwa 0% Laurat, gemessen in Kontrollsamen. Da die T2-Samen, daß heißt, die reifen Samen von T1-Pflanzen (ursprüngliche Transformante), eine segregierende Population darstellen, wären in Samen von Pflanzen der zweiten Generation (T2), welche aus den T2-Samen herangezogen werden, noch höhere Lauratanteile zu erwarten.
Die Analyse von transgenen Brassica-Samen, welche ein Lorbeerbaum-Thioesterase-Gen exprimieren (23–30 Samenpools), führte zur Identifizierung von Transformanten, deren Samen bis zu 37 Molprozent Laurat enthalten. TAG-Analysen einzelner Samen und der Hälfte der Samen dieser Pflanzen zeigen, daß die Anteile an Laurat in der segregierenden Samenpopulation mindestens so hoch wie 50 Molprozent sind. Die TAG-Analyse der Hälfte der Samen ermöglicht die Identifizierung von T2-Samen, welche am meisten Laurat produzieren, und die anschließende Keimung des restlichen Samenteils, um Pflanzen der zweiten Generation zu erzeugen, welche Samen mit wünschenswert hohen Lauratanteilen produzieren.
Korrelationen zwischen dem Molprozentwert der mittelkettigen Fettsäuren bezogen auf die gesamten Fettsäuren und der Genkopienzahl sind beobachtet worden. Daher, obwohl der minimale Molprozentwert der mittelkettigen Fettsäuren bezogen auf die gesamten Fettsäuren etwa 50,0 Molprozent beträgt, ist es möglich, die Anteile an den mittelkettigen Fettsäuren durch die Insertion mehrerer Gene weiter zu erhöhen. Solche Techniken können Methoden der Gentechnik oder der Pflanzenzüchtung einschließen.
Einige gentechnische Ansätze zur Erhöhung der mittelkettigen Fettsäuren würden zum Beispiel die Insertion einer zusätzlichen DNA-Sequenz, codierend Strukturgene einer pflanzlichen Thioesterase, in Zellen, die Verwendung von Transkriptionsinitiationsregionen, welche höhere mRNA-Kopienzahlen aufweisen, oder ein besser zeit lich abgestimmtes Spezifitätsprofil, welches der Verfügbarkeit des Substrats besser entspricht, einschließen. Zum Beispiel zeigt die Analyse des zeitlichen Verlaufs der Lauratproduktion unter regulatorischen Kontrolle eines Napin-Promotors in Samen einer Brassica-Pflanze, daß das Auftreten einer mittelkettigen Thioesterase-Aktivität etwa 5–7 Tage hinter dem Einsetzen der Speicherölsynthese zurückbleibt. Berechnungen zeigen, daß etwa 20% der gesamten Fettsäuren bereits synthetisiert sind, bevor die mittelkettige Thioesterase eine wesentliche Wirkung zeigt. Folglich könnten wesentlich höhere Lauratanteile (10–20%) erhalten werden, falls das Thioesterase-Gen in einem früheren Stadium der Embryoentwicklung exprimiert wird.
Weiterhin können Mittel zur Erhöhung der Translationseffizienz die Verwendung der vollständigen strukturellen, codierenden Sequenz des mittelkettigen Thioesterase-Gens einschließen. So kann die Verwendung der vollständigen 5'-Region der Sequenz, welche die Lorbeerbaum-Thioesterase codiert, gezeigt in 1B, die Lauratproduktion verbessern. Alternativ, falls eine mittelkettige Thioesterase eine ungewöhnliche Transportpeptid-Sequenz besitzt, d.h. eine, welche Ähnlichkeiten mit der Plastid-Thylakoid-Hinleitung zeigt, wie sie bei der Lorbeerbaum-Thioesterase zu finden ist, dann kann es durch die Verwendung eines typischeren pflanzlichen Transportpeptids, wie es bei der Färberdistel vorkommt (4), eines Acyl-Trägerproteins oder einer ssu-Region ersetzt werden.
Die vorliegende Erfindung sieht auch die Möglichkeit vor, ungesättigte Fettsäuren in einer Wirtszelle, einschließlich Pflanzenzellen, herzustellen. Pflanzliche mittelkettige Thioesterasen, sogar aus Pflanzen, welche keine ungesättigten mittelkettigen Fettsäuren aufweisen, können eine Aktivität für ein solches Substrat zeigen. Daher kann eine pflanzliche mittelkettige Fettsäure verwendet werden, um ungesättigte mittelkettige Fettsäuren vorzusehen.
Zum Beispiel resultiert die Expression der Lorbeerbaum-Thioesterase in E. coli in der Herstellung von Laurat (C12:0), Myristat (C14:0) und auch ungesättigten Spezies von mittelkettigen Fettsäuren (C12:1 und C14:1). Die Herstellung von ungesättigten Fettsäuren in E. coli wird durch die Wirkung der_= Hydroxydecanoyl-Thioesterasedehydrase katalysiert. Die Sequenz der Dehydrase ist veröffentlicht (Cronan et al., J. Biol. Chem. 263 (1988), 4641–4646), und kann somit in eine Wirtszelle von Interesse, einschließlich einer Pflanzenzelle, zur Verwendung in Verbindung mit einer mittelkettigen Thioesterase inseriert werden.
Wenn eine pflanzliche mittelkettige Thioesterase in einer Bakterienzelle exprimiert wird, besonders in einer Bakterienzelle, welche nicht in der Lage ist, Fettsäuren effizient abzubauen, können große Mengen an mittelkettigen Fettsäuren hergestellt und aus der Zelle gewonnen werden. In einigen Fällen bilden mittelkettige Fettsäuresalze Kristalle, welche ohne weiteres von den Bakterienzellen getrennt werden können. Bakterienmutanten, welche bezüglich der Acyl-CoA-Synthase defizient sind, wie die E. coli fadD- und fadE-Mutanten, können verwendet werden. In Studien mit fadD-Mutanten war das Wachstum von fadD-Lorbeerbaum-Thioesterase-Transformanten im Verhältnis zu der Vektor-transformierten Kontrolle bei 37°C sehr verzögert und bei 25–30°C weniger verzögert. Flüssigkeitskulturen, welche bei den niedrigeren Temperaturen wuchsen, reicherten ein Präzipitat an, und Kolonien, welche sich bei 25°C auf Petrischalen bildeten, lagerten große Mengen an Lauratkristallen ab, insbesondere auf der Oberfläche. Diese Ablagerungen, wie mittels FAB-Massenspektrometrie nachgewiesen, wurden als Laurat identifiziert. Nach Trennung und Quantifizierung mittels Gaschromatographie wird abgeschätzt, daß die Lauratkristalle, welche durch die fadD-Lorbeerbaum-Thioesterase-Transformanten auf den Petrischalen abgelagert wurden, etwa 30–100% des Gesamttrockengewichts der produzierenden Bakterien darstellen.
Wenn die Expression der mittelkettigen Thioesterase in Pflanzenzellen gewünscht wird, schließen, aber sind nicht darauf begrenzt, verschiedene Pflanzen von Interesse Rapssamen (Canola- und hohe Erucasäure-Varietäten), Sonnenblume, Färberdistel, Baumwolle, Cuphea, Sojabohne, Erdnuß, Kokosnuß- und Ölpalme sowie Mais ein. Abhängig von der Methode zur Einschleusung der rekombinanten Konstrukte in die Wirtszelle können andere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Bedeutsam ist, daß diese Erfindung in ähnlicher Weise auf Spezies von Dikotyledonen und Monokotyledonen anwendbar ist und ohne weiteres auf neue und/oder verbesserte Transformations- und Regulationstechniken angewendet werden kann.
In jedem Fall ist die Transformationsmethode für die vorliegende Erfindung nicht entscheidend; verschiedene Methoden der Pflanzentransformation sind gegenwärtig zugänglich. So wie neuere Methoden zur Transformation von Nutzpflanzen verfügbar sind, können sie in Zukunft direkt angewendet werden. Zum Beispiel können viele Pflanzenarten, welche natürlicherweise für eine Agrobacterium-Infektion anfällig sind, mit Hilfe von Methoden einer Agrobacterium-vermittelten Transformation unter Verwendung eines dreiteiligen oder zweiteiligen Vektors erfolgreich transformiert werden. Außerdem sind Techniken der Mikroinjektion, des DNA-Partikelbeschusses und der Elektroporation entwickelt worden, welche die Transformation von verschiedenen monokotyledonen und dikotyledonen Pflanzenarten ermöglichen.
Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung und nicht zur Begrenzung vorgesehen.
Beispiele
Beispiel 1 – Acyl-ACP-Thioesterase-cDNA-Sequenzen
Die Sequenz eines cDNA-Clons vollständiger Länge, pCGN3822 (3A-17), einer mittelkettigen Lorbeerbaum-Thioesterase ist in 1A dargestellt.
Die translatierte Aminosäuresequenz der Lorbeerbaum-Thioesterase beginnend bei dem ATG-Codon an den Positionen 145–147 ist in 1B gezeigt. Dieses ATG ist von einer Sequenz umgeben, welche die Anforderungen für die Initiation der Translation in Pflanzen erfüllt und daher wahrscheinlich das in vivo verwendete Initiationscodon ist. Unter Verwendung des ATG's bei bp 145 zur Initiation kann ein Polypeptid von 382 Aminosäuren aus der Lorbeerbaum-Thioesterase-mRNA translatiert werden. Die DNA-Sequenz einer zweiten Klasse von Lorbeerbaum-Thioesterase-Genen wird in 3 bereitgestellt.
Die N-terminale Sequenz der reifen Lorbeerbaum-Thioesterase, isoliert aus keimenden Samen, beginnt bei Aminosäurerest 84 der abgeleiteten Proteinsequenz. Die N-terminalen 83 Aminosäuren geben daher die Sequenz eines Transportpeptids wieder. Diese Sequenz weist Merkmale auf, die Plastid-Transportpeptide gemeinsam haben, welche üblicherweise zwischen 40 und 100 Aminosäuren lang sind (Keegstra et al., Ann. Rev. Plant Physiol. and Plant Mol. Biol. 40 (1989), 471–501). Ein Hydropathie-Diagramm dieser Transportpeptid-Region zeigt eine hydrophobe Domäne an jedem Ende der Transportsequenz auf. Für andere Transportpeptid-Sequenzen ist gezeigt worden, daß sie ähnliche hydrophobe N-terminale Domänen enthalten. Die Bedeutung dieser N-terminalen Domäne ist nicht bekannt, aber bestimmte Experimente weisen darauf hin, daß die Lipidvermittelte Bindung für den Plastidimport einiger Proteine wichtig sein kann (Friedman und Keegstra, Plant Physiol. 89 (1989), 993–999). Was die C-terminale Domäne anbetrifft, zeigt der Vergleich von Hydropathie-Diagrammen bekannter importierter Chloroplasten-Stromaprotein-Transportpeptide (Keegstra et al., a.a.O.), daß diese Transportpeptide keine hydrophobe Domäne am C-Terminus aufweisen. Jedoch besitzen Prä-Proteine, welche für das Thylakoidlumen des Chloroplasten bestimmt sind, eine Alanin-reiche, hydrophobe Domäne am C-terminalen Ende ihrer Transportpeptide (Smeekens et al., TIBS 15 (1990), 73–76). Das Vorhandensein einer solchen Domäne in der Transportsequenz der Lorbeerbaum-Thioesterase weist darauf hin, daß sie ein Doppeldomänen-Transportpeptid aufweist, welches dieses Enzym zum Lumen des Thylakoid-Gegenstücks oder zum Intermembranraum hinleitet. Dies ist unerwartet, da das Substrat Acyl-ACP im Stroma nachgewiesen worden ist (Ohlrogge et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 76 (1979), 1194–1198). Eine andere Erklärung für das Vorhandensein einer solchen Domäne in dem Prä-Protein der Lorbeerbaum-Thioesterase ist, daß sie ein Membrananker für das reife Protein darstellen kann, welcher bei der Reinigung abgespalten wird, was zur Sequenzbestimmung eines künstlichen N-Terminus führt. Der in vivo-Terminus des reifen Thioesterase-Proteins würde dann an einer Stelle liegen, welche sich weiter stromaufwärts befindet, als mittels einer Aminosäuresequenzanalyse gezeigt wurde.
Genbank-Durchmusterungen mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz zeigen keine wesentlichen Übereinstimmungen mit irgendeinem Eintrag auf, einschließlich der mittelkettigen Acyl-ACP-Thioesterase II aus Vertebraten (Naggert et al., Biochem. J. 243 (1987), 597–601). Auch enthält die Lorbeerbaum-Thioesterase keine Sequenz, welche dem Motiv des katalytischen Zentrums der Fettsäuresynthetase-Thioesterase ähnlich ist (Aitken, 1990, in Identification of Protein Consensus Sequences, Active Site Motifs, Phosphoryla tion and Other Post-Translational Modifications (Ellis Horwood, Chichester, West Sussex, England, S. 40–147).
Zum Vergleich wird die Isolierung und die Sequenz einer langkettigen Acyl-ACP-Thioesterase vorgesehen. Die Sequenzinformation von Cyanbromid-Peptidsequenzen von 34 kD- und 40 kD-Thioesterase-Proteinen aus der Färberdistel wird analysiert, um eine Peptidkarte der Färberdistel-Thioesterase zu erhalten. Homologievergleiche dieser Peptide mit der Aminosäuresequenz der Lorbeerbaum-Thioesterase bestätigen die Peptidkarte für die Färberdistel-Thioesterase.
Degenerierte Oligonucleotidprimer werden aus den Aminosäuresequenzen von Thioesterase-Peptidsequenzen der Färberdistel konstruiert und als Primer in Polymerasekettenreaktionen (PCR) verwendet, um ein Fragment eines Färberdistel-Thioesterase-Gens zu erhalten.
Das Thioesterase-PCR-Genprodukt der Reaktion wird auf einem Gel gereinigt und als eine Sonde zum Durchmustern einer Färberdistel-Embryo-cDNA-Bank verwendet. Sechs Clone werden isoliert; eine Restriktionskartierung zeigt, daß sie zu zwei Genklassen gehören. Die Nucleotid- und translatierten Aminosäuresequenzen eines Vertreters aus jeder Klasse, pCGN3264 (2–1) und pCGN3265 (5–2), sind in 4A und 4B dargestellt. Die DNA-Sequenz von pCGN3265 (5–2) mit einer zusätzlichen 3'-nichttranslatierten Sequenz ist in 4C gezeigt. Basierend auf der N-terminalen Aminosäuresequenzinformation wird das Aminoende der reifen Färberdistel-Thioesterasen dem Alaninrest bei Aminosäure 61 der translatierten Aminosäuresequenzen in 4A und 4B zugewiesen.
Der Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenzen der zwei Acyl-ACP-Thioesterase-cDNA-Clone zeigt, daß die reifen Proteine zu 82% identisch sind, während die entsprechenden DNA-Sequenzen eine Übereinstimmung von 80% gemeinsam haben. Computerabschätzungen des isoelektrischen Punkts der zwei Proteine unterscheiden sich erheblich. Der abgeschätzte pI für das durch 2–1 codierte reife Protein beträgt 5,8, während derjenige des durch 5–2 codierten Proteins 8,1 beträgt.
Die Ergebnisse der Färberdistel-Thioesterase-Reinigung zeigten, daß es unter Umständen mehrere Formen der Färberdistel-Thioesterase gibt. Zwei unterschiedliche Molekülmassenklassen sowie zwei separate Peakfraktionen durch eine chromatographischen Fokussierung wurden beobachtet. Beide Molekülmassenspezies sind in jedem Aktivitätspeak vertreten. Jedoch zeigt die Proteinsequenzanalyse jeder Form, daß diese Isoformen wahrscheinlich Produkte eines einzigen Proteins sind. Die N-terminale Sequenz jeder Spezies ist identisch, und es wurden keine Unterschiede bezüglich der Proteinsequenz irgendeines der internen CNBr-Fragmente beobachtet. Die verschiedenen Molekulargewichtsspezies können das Ergebnis eines C-terminalen Peptids sein, welches entweder durch Prozessierung in vivo oder durch Abbau während der Extraktion und Reinigung, möglicherweise während des Säurefällungsschritts, entfernt wird.
Obwohl der Beweis hinsichtlich der Peptidsequenz zeigt, daß sämtliche der Isoformen, welche bei der Reinigung der Färberdistel-Thioesterase beobachtet werden, aus demselben Protein abgeleitet werden können, wurden zwei im hohen Grade homologe, aber verschiedene Klassen von cDNAs aus einer Färberdistel-Embryo-cDNA-Bank isoliert. Beide Klassen codieren eine Acyl-ACP-Thioesterase mit einer bevorzugten Aktivität für C18:1-Substrate, basierend auf der Expression in E. coli. Jedoch stimmen die Peptidsequenzdaten nur mit der translatierten Aminosäuresequenz für das durch 2–1 codierte Protein überein (unter Berücksichtigung geringfügiger Diskrepanzen infolge der Aminosäuresequenzierung), und es wurden keine Peptide gefunden, welche eindeutig der Thioesterase entsprechen, welche durch das 5-2-Gen codiert wird. Möglicherweise ist das durch 5–2 codierte Protein in geringeren Mengen vorhanden und stellt keine ausreichend deutliche Bande dar, um eine Sequenzierung in Betracht zu ziehen. Alternativ kann das durch 5–2 codierte Protein eine kleinere Komponente der verdauten Probe gewesen sein, mit dem Ergebnis, daß die CNBr-Fragmente nicht in ausreichenden Mengen für einen Nachweis nach einer SDS-PAGE und einem Elektroblotting vorhanden waren. Da die Untersuchung der vorhergesagten pI's der zwei Proteinprodukte zeigt, daß 5–2 ein viel basischeres Protein als 2–1 codiert, kann das 5–2 entsprechende Protein während des Säurefällungsschritts bei der Reinigung eliminiert worden sein.
Beispiel 2 – Expression von Acyl-ACP-Thioesterasen in E. coli
Beispiel 2A
Die Expression von Lorbeerbaum-Thioesterase-Proteinen in E. coli wird beschrieben.
Eine verkürzte (1200 bp) cDNA.des Lorbeerbaums wird als ein 30 kD-Protein in einer E. coli-Wirtszelle exprimiert, und es werden Daten bereitgestellt, welche zeigen; daß das cDNA-Fragment der Transformante eine erhöhte C12-Acyl-ACP-Thioesterase-Aktivität verleiht.
Ein pET3a-Vektor (Rosenberg et al., Gene 56 (1987), 125–135) wird in einem E. coli-Wirt, Stamm BL21 (PE3) (Studier und Moffat, J. Mol. Biol. 189 (1986), 113–130), für diese Studie verwendet. Der pET3a-Vektor enthält einen Promotor und 33 by des 5'-Leserasters von Bakteriophage T7. Die T7-Polymerase befindet sich unter der regulatorischen Kontrolle eines Isopropyl-b-D-Thiogalactopyranosid (IPTG)-induzierbaren lac-UVS-Promotors, welcher in dem E. coli-Stamm BL21 (DE3) vorkommt. Auf diese Weise wird durch die Zugabe von IPTG zu E. coli BL21 (DE3), transformiert mit pET3a, der T7-Promotor aktiviert.
Konstrukte werden hergestellt, enthaltend die verkürzte cDNA von 1, fusioniert im Leseraster durch Deletion des BamHI/EcoRI-Fragments und Austausch der Thioesterase-Sequenz. E. coli-Zellen werden mit pET3a-Konstrukten, enthaltend die Thioesterase (pET3a-THI0), und einem unmodifizierten pET3a als Kontrolle transformiert. Die E. coli-Zellen werden bei 37°C in Flüssigmedium gezüchtet. und die Expression wird durch die Zugabe von 1 mM IPTG induziert. Nach 1-stündiger Induktion werden die Zellen mittels Zentrifugation geerntet, in Testpuffer resuspendiert und mittels Ultraschall lysiert. Zelltrümmer werden durch eine weitere Zentrifugation entfernt, und der Überstand wird in Aktivitätstests nach Pollard et al., Arch. Biochem. & Biophys. 281 (1991), 306-312, verwendet. Tabelle 1
Die Ergebnisse zeigen, daß ein Lysat von Kontroll-E. coli-Zellen eine hydrolytische Aktivität für sämtliche Acyl-ACP-Substrate enthält, welche getestet wurden, wobei langkettige Substrate bevorzugt werden. Beim Vergleich der pET3a-THI0-Ergebnisse mit den Kontrollergebnissen wird offensichtlich, daß sich das Muster der Substratpräferenzen unterscheidet. Das Transformanten-Lysat zeigt eine stark erhöhte Aktivität für 12:0-ACP im Hinblick auf die anderen Substrate, verglichen mit dem Kontrolllysat. Diese erhöhte 12:0-ACP-Aktivität zeigt, daß dieses cDNA-Fragment eine ausreichende Anzahl des 12:0-ACP-Thioesterase-Gens aus dem Lorbeerbaum umfaßt, um ein aktives Enzym in E. coli-Zellen herzustellen.
Außerdem wird das vollständige, reife Lorbeerbaum-Thioesterase-Protein als eine lac-Fusion in E. coli-Zellen exprimiert. Eine Sequenzanalyse der Lorbeerbaum-Thioesterase-cDNA vollständiger Länge, pCGN3822, beschrieben in Beispiel 1, zeigt eine XbaI-Stelle bei Base 394 auf. Eine Spaltung an dieser XbaI-Stelle spaltet die codierende Region unmittelbar 5' des Codons, welches das Leucin bei Aminosäureposition 72 wieder gibt. Dieses Leucin ist als ein Kandidat für den aminoterminalen Rest, wie in Beispiel 1A beschrieben, identifiziert worden.
Ein etwa 1200 bp großes Fragment einer pCGN3822-cDNA wird erzeugt durch Spaltung mit XbaI, welches an dem postulierten Startpunkt des reifen Proteins, wie oben beschrieben, und in den Vektorsequenzen, welche das 3'-Ende der cDNA umgeben, schneidet. Das XbaI-Fragment wird in das XbaI-Spaltprodukt der Minus-Ausführungsform eines Bluescript M13 (+/–) (auch bezeichnet als pBS+/–)-Clonierungsvektors (Stratagene; San Diego, CA) cloniert. Der Thioesterase-Gen-Clon wird derart inseriert, daß das reife Protein im Leseraster mit einem Teil des lacZ-Gens des Bluescript-Vektors und unter Kontrolle des lac-Promotors vorliegt.
Das erhaltene Konstrukt, pCGN3823, und ein Kontroll-Bluescript-Konstrukt mit dem Lorbeerbaum-Thioesterase-Gen, inseriert in der entgegengesetzten Orientierung, werden in E. coli-Zellen inseriert. Die E. coli-Zellen werden bei 37°C in Flüssigmedium gezüchtet, und die Expression durch den lac-Promotor wird durch Zugabe von IPTG bis zu einer Endkonzentration von 0,1 mM IPTG induziert. Nach einer einstündigen Induktion werden die Zellen geerntet, lysiert und auf die verkürzte Lorbeerbaum-Thioesterase getestet, wie oben beschrieben. Tabelle 2
Die Ergebnisse zeigen, daß ein Lysat von E. coli-Zellen, welche das postulierte reife Lorbeerbaum-Thioesteraseenzym exprimieren, eine wesentlich größere Aktivität für ein 12:0-ACP-Substrat als für andere ACP-Substrate mit variierender Kohlenstoffkettenlänge besitzt. Außerdem ist diese Aktivität mehr als zwei Größenordnungen höher als diejenige in einem Lysat von E. coli-Zellen, welche die verkürzte Lorbeerbaum-Thioesterase exprimieren. Untersuchungen werden durchgeführt, um zu bestimmen, ob die Expression des Lorbeerbaum-Thioesterase-Proteins in E. coli-Zellen einen Effekt auf die Fettsäurezusammensetzung dieser Zellen hat. Erste Untersuchungen konnten keine wesentliche Änderung in den Fettsäurezusammensetzungen der E. coli-Zellen nachweisen, welche die Lorbeerbaum-Thioesterase enthalten. Jedoch zeigt die Analyse größerer Proben von entweder pelletierten transformierten Zellen oder der Wachstumsmedien, aus welchen die transformierten Zellen pelletiert worden sind, wie nachstehend beschrieben, eine Änderung in den Fettsäureprofil der transformierten Zellen. C12-Fettsäuren werden in höheren Mengen in den Zellen hergestellt, welche die Lorbeerbaum-Thioesterase enthalten, verglichen mit nichttransformierten Kontrollzellen.
Etwa 100 ml E. coli-Kontrollzellen, transformiert mit dem Plasmidvektor Bluescript (Stratagene; San Diego, CA), und Zellen, transformiert mit dem reifen Thioesterase-Konstrukt, werden bis zu einem OD-Wert von etwa 0,6 in ECLB-Medium (E. coli Luriabrühe) gezüchtet und durch Zentrifugation pelletiert. Die Zellen und das Medium werden unter Anwendung eines Säureverfahrens wie folgt extrahiert. Die pelletierten Zellen werden in 4 ml 5% (Vol./Vol.) H₂SO₄ in Methanol resuspendiert. Das Medium wird nach einer Zentrifugation gewonnen, und 10 ml Essigsäure werden zugegeben. Die Probe wird mit 50 ml Ether kräftig geschüttelt. Die Phasen werden sich trennen gelassen, und die untere Schicht wird verworfen. Die Etherschicht läßt man über Nacht eindampfen, wobei 1–2 ml der Lösung zurückbleiben. 4 ml 5% (Vol./Vol.) H₂SO₄ in Methanol werden zu der übriggebliebenen Mediumlösung zugegeben.
Die folgenden Schritte gelten für die Fettsäureanalyse von sowohl der Mediumlösung als auch den oben beschriebenen pelletierten Zellen. Die Zellen oder die Mediumproben in H₂SO₄/Methanol werden in Röhrchen mit Schraubverschluß überführt, und 2 ml Toluol, enthaltend 0,5 mg/ml eines C17-Standards, werden zugegeben. Die Röhrchen werden fest verschlossen und bei 90°C für 2 Stunden inkubiert, danach werden 4 ml 0,9% (Gew./Vol.) NaCl und 2 ml Hexan zugesetzt. Die Proben werden mit einem Wirbelmischer gründlich gemischt und anschließend für 5 Minuten bei 1500 UpM zentrifugiert. Die obere Schicht (Hexan) jeder Probe wird dann für 5 Minuten bei 1000 UpM in einer Tischzentrifuge zentrifugiert, um irgendwelche extrahierten Fettsäuremethylester abzutrennen, welche innerhalb der Schicht von E. coli-Zellen eingeschlossen sein könnten.
Die Proben werden mittels Gas-Flüssigkeit-Chromatographie (GC) unter Verwendung eines Temperaturprogramms analysiert, um die Auftrennung von Komponenten mit 10 oder weniger Kohlenstoffen zu erhöhen. Das verwendete Temperaturprogramm sorgt für eine Temperatur von 140°C für 3 Minuten, gefolgt durch eine Temperaturerhöhung von 5°C/Minute, bis 230°C erreicht werden, und die 230°C werden für 11 Minuten aufrechterhalten. Die Proben werden mit einem Hewlett-Packard 5890 (Palo Alto, CA)- Gaschromatograph analysiert. Die Fettsäuregehaltberechnungen basieren auf dem internen C17-Standard.
Die GC-Analyse zeigt, daß etwa 70% der Fettsäuren im Medium der transformierten Zellen C12-Fettsäuren sind. Dies ist vergleichbar mit Anteilen von etwa 2% C12-Fettsäuren in dem Medium der Kontrollzellen. Außerdem wird eine etwa 2fache Erhöhung des C12-Gehalts von transformierten Zellen gegenüber demjenigen von nichttransformierten Zellen beobachtet.
Eine Substratanalyse des Lorbeerbaum-Thioesteraseenzym, gereinigt aus keimenden Samen, wie bei Pollard et al., a.a.O., beschrieben, wird auch durchgeführt. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3

Testsubstrat Hydrolyseaktivität (Mittelwert CpM in Etherextrakt)

8:0-ACP 0

10:0-ACP 0

12:0-ACP 126l

14:0-ACP 69

16:0-ACP 12

18:1-ACP 432
Der Vergleich der Ergebnisse der Substratanalyse der Thioesterase in den E. coli-Extrakten und gereinigt aus keimenden Samen des Lorbeerbaums zeigt, daß das Aktivitätsprofil des Enzyms aus den zwei Quellen im Hinblick auf die Aktivität für C8-, C10-, C12-, C14- und C16-ACP-Substrate im wesentlichen identisch ist. Obwohl das aus Embryonen gereinigte Enzym in geringem Maße bei C18:1-Substraten aktiver ist als die in E. coli exprimierte Thioesterase. nimmt man an, daß dieser Unterschied auf die Aktivität einer langkettigen Lorbeerbaum-Thioesterase zurückzuführen ist, welche nicht vollständig aus der Proteinpräparation der mittelkettigen Thioesterase entfernt wurde.
1) Herstellung von Laurat
Für weitere Untersuchungen wurde das Lorbeerbaum-Thioesterase-Expressionsplasmid (pCGN3823) in einem E. coli-Stamm, fadD, etabliert, dem die mittelkettige spezifische Acyl-CoA-Synthetase fehlt (Overath et al., Eur. J. Biochem. 7 (1969), 559-574) und welcher daher unfähig ist, Laurat abzubauen. Das Wachstum von fadD-Lorbeerbaum-Thioesterase-Transformanten im Verhältnis zu der Vektor-transformierten Kontrolle wurde bei 25°C, 30°C und 37°C untersucht. In einer Flüssigkeitskultur vermehren sich Lorbeerbaum-Thioesterase-transformierte fadD-Bakterien bei allen drei Temperaturen in nahezu der gleichen Rate wie die Kontrolle während der exponentiellen Wachstumsphase.
Jedoch können bei 37°C fadD-Zellen, welche das Lorbeerbaum-Thioesterase-Plasmid aufgenommen haben, nahe der stationären Wachstumsphase nicht aus den Kulturen gewonnen werden. Im Gegensatz dazu werden die Plasmide bei den niedrigeren Temperaturen für mehrere Tage stabil beibehalten, und diese stationären Kulturen erzeugen eine erhebliche Menge an einem Präzipitat, welches in Methanol und Ether löslich ist.
Das Wachstum von fadD-Lorbeerbaum-Thioesterase-Kolonien auf Agar ist bei 37°C stark verzögert, aber nur in geringem Maße bei den niedrigeren Temperaturen. Die bei 25°C auf den Petrischalen gebildeten Kolonien lagern große Mengen an Kristallen ab, insbesondere auf der Oberfläche, aber auch in und an der Oberfläche der zellfreien Agarmatrix. Diese Kristallablagerungen wurden mittels (FAB)-Massenspektrometrie als Kaliumlaurat identifiziert. Nach Abtrennung und Quantifizierung mittels Gaschromatographie wurde abgeschätzt, daß die Lauratkristalle bis zu 30% des Gesamttrockengewichts der produzierenden Bakterien ausmachen.
2) Thioesterase-Aktivität für ungesättigte Fettacylgruppen
Außerdem sind mehrere neue Methylester-Peaks bei der fadD-Lorbeerbaum-Thioesterase vorhanden, aber nicht in den Kontroll-E. coli-fadD-Zellen. Analysen zeigen, daß zwei dieser Peaks 12:1- und 14:1-Fettsäuren darstellen. Folglich ist die Lorbeerbaum-Thioesterase in der Lage, Fettacyl-ACPs über sowohl den gesättigten als auch den ungesättigten Fettsäuresynthetaseweg, welche in E. coli zu finden sind, zu hydrolysieren. Der gesättigte Weg wird im wesentlichen bis zu 100% in der späten logarithmischen Phase unterbrochen, und der ungesättigte Weg bis zu 70%. Dies bewirkt eine Reduktion der Sättigungen in den Phospholipiden der Zellen, welche größtenteils durch 16:1 und 18:1 ersetzt werden. Das Verhältnis von angereichertem 12:1 zu 14:1 beträgt etwa 0,9 zu 1, während das Verhältnis der Anreicherung von 12:0 zu 14:0 etwa 9 zu 1 beträgt. Dies kann darauf hinweisen, daß sich die Kettenlängenspezifität der Thioesterase für ungesättigte Fettacyl-ACPs von derjenigen für gesättigte Substrate unterscheidet, oder alternativ, daß der 14:1-ACP-Pool viel größer als der 12:1-ACP-Pool ist. Außerdem scheint die nahezu vollständige Unterbrechung des gesättigten Wegs die kontinuierliche Synthese von gesättigten Fettsäuren während der stationären Wachstumsphase zur Folge zu haben.
Der auffallende Unterschied bezüglich der Lauratanreicherungsanteile zwischen den fadD+– und den fadD-Transformanten stimmt mit Studien der Lorbeerbaum-Thioesterase-Substratspezifität überein (Pollard et al., a.a.O.). Laurat, welches durch die eingeschleuste Lorbeerbaum-Thioesterase in fadD+-E. coli-Zellen erzeugt wird, kann mit CoA, einem weniger wirksamen Substrat für die Lorbeerbaum-Thioesterase, verestert sein und anschließend durch_-Oxidation abgebaut oder für die Fettsäuresynthese wiederverwendet werden. Deshalb kann sich nur ein kleiner Teil anreichern und in das Medium austreten. In dem fadD-Stamm ist das Laurat nicht mit CoA verestert und kann nicht wiederverwendet werden. Die beobachtete geringfügige Wachstumsverzögerung kann darauf hinweisen, daß die Anreicherung von Laurat in solchen hohen Anteilen einen toxischen Effekt auf die E. coli-Wirtszellen zur Folge hat.
Bei 37°C wird die Synthese von Laurat in dem fadD-Stamm nur während des exponentiellen Wachstums toleriert. Die schnelle Abnahme des Zelltiters, enthaltend das Lorbeerbaum-Thioesterase-Plasmid, am Ende der logarithmischen Phase kann eine Temperaturabhängigkeit der Laurat-Toxizität widerspiegeln, oder eine physiologische Verschiebung zum Stoffwechsel in der stationären Phase, welche bewirkt, daß die eingeführte Lorbeerbaum-Thioesterase-Aktivität letal wird. Die Fettsäurezusammensetzung von E. coli-Zellen verändert sich in alternden Kulturen, und ein geringerer Bedarf an gesättigten Fettsäuren bei niedrigeren Temperaturen kann den negativen Einfluß der Lorbeerbaum-Thioesterase-Expression bei diesen Temperaturen verringern. Der Weg für ungesättigte Fettsäuren in E. coli divergiert im C₁₀-Stadium und wird höchstwahrscheinlich nicht durch die Lorbeerbaum-Thioesterase unterbrochen.
Die Anreicherung von Laurat im Medium ist von der Ablagerung kleinerer Mengen an Caprat (10:0) begleitet. Dies steht im Einklang mit dem Thioesterase-Aktivitätsprofil, wobei die 14:0-ACP-Hydrolyse ausgeprägter als die 10:0-ACP-Hydrolyse ist. Die große Menge an Lorbeerbaum-Thioesterase in diesen Zellen kann die in vivo-Poolgrößen von Acyl-ACP's ≥ 12:0 wirksam reduzieren, so daß weniger 14:0-Acyl-ACP-Substrat verfügbar ist. Die Capratproduktion durch die Lorbeerbaum-Thioesterase in E. coli kann darauf hinweisen, daß dieses Enzym für sowohl die 10:0- als auch die 12:0-Fettsäureablagerung in Samen des Lorbeerbaums verantwortlich ist.
Beispiel 2B
Die Expression von Färberdistel-Thioesterase-Proteinen in E. coli wird beschrieben.
Die Färberdistel-Acyl-ACP-Thioesterase-Clone pCGN3264 und pCGN3265 werden durch ortsspezifische Mutagenese verändert, um SalI- und NcoI-Stellen unmittelbar am Startpunkt der das reife Protein codierenden Region dieser Clone zu inserieren. Die reife codierende Region plus 3'-nichttranslatierte Sequenzen in den cDNA-Clonen werden als ein NcoI/SmaI-Fragment entfernt und in pET8c inseriert (Studier et al., 1990), welches mit BamHI gespalten worden war, und mit dem Klenow-Fragment einer DNA-Polymerase behandelt, um ein glattes Ende zu erzeugen, und anschließend mit NcoI geschnitten. Die erhaltenen Expressionskonstrukte, pCGN3270 (2–1) und pCGN3271 (5–2), wurden konstruiert, um die reifen Färberdistel-Acyl-ACP-Thioesterase-cDNA-Sequenzen direkt von dem T7-Promotor zu exprimieren. Zur Expressionsanalyse werden die Konstrukte in den E. coli-Stamm BL21 (DE3) transferiert, welcher das T7-RNA-Polymerase-Gen unter Kontrolle des Isopropyl-_-D-Thiogalactopyranosid (IPTG)-induzierbaren lac-UVS-Promotors enthält (Studier et al., Methods Enzymol. 185 (1990), 60–89).
Für einen Thioesterase-Aktivitätstest werden Zellen, enthaltend pCGN3270, pCGN3271 oder pET8c als Kontrolle, bei 37°C bis zu einem OD₆₀₀-Wert von ~0,5 in 2YT (16 g Trypton, 10 g Hefeextrakt und 5 g NaCl pro Liter, pH 7,0), enthaltend 0,4% Glucose und 300 μg/ml Penicillin, gezüchtet. Die Induktion wird durch die Zugabe von IPTG bis 0,4 mM und weiteres Züchten für 1,5 Stunden erreicht. 10 ml-Aliquots der Kultur werden durch Zentrifugation geerntet, und die pelletierten Zellen werden bei –70°C aufbewahrt. Vor dem Test werden die Pellets in 500 μl Thioesterase-Testpuffer resuspendiert und für drei Bursts von jeweils 20 Sekunden mit Ultraschall behandelt. Die Proteinkonzentrationen werden unter Verwendung des Proteintests von Bio-Rad bestimmt.
Gesamtproteinprofile von E. coli, enthaltend pCGN3270 und pCGN3271, werden durch eine SDS-PAGE analysiert. In jedem Fall wird eine neue Proteinbande in den IPTG-induzierten Kulturen im Verhältnis zu der pET8c-Kontrolle beobachtet. Obwohl das mittels Computer vorhergesagte Molekulargewicht der durch 2–1 und 5–2 codierten Proteine sehr ähnlich ist, ist die Beweglichkeit dieser Proteine, exprimiert durch pCGN3270 und pCGN3271, erheblich verschieden. Das durch pCGN3270 codierte Protein besitzt eine Beweglichkeit von etwa 40 kD, während das durch pCGN3271 codierte Protein bei etwa 36 kD liegt. Die induzierten Proteine wurden einer N-terminalen Sequenzierung unterzogen, um ihre Identität zu bestätigen. In jedem Fall stimmte die Proteinsequenz mit der durch die cDNA vorhergesagten überein. Außerdem wurde die Nucleotidsequenz der 3'-Region der 5-2-cDNA-Insertion in pCGN3271 noch einmal sequenziert, um sicherzustellen, daß keine frühzeitige Stoppcodons während den Clonierungsschritten eingeführt worden waren.
Gesamtextrakte von Zellen, exprimierend entweder pET8c (Kontrolle), pCGN-3270 oder pCGN3271, werden unter Verwendung von 18:1-ACP auf eine Thioesterase-Aktivität getestet. Die 18:1-ACP-Thioesterase-Aktivität in Zellen, enthaltend pCGN3270 und pCGN3271, ist um das ~100- bzw. 50fache höher als die Aktivität in Kontrollzellen. Zur weiteren Charakterisierung der Färberdistel-Acyl-ACP-Thioesterase wird die Kettenlängenspezifität der Thioesterase-Aktivitäten, welche durch die cDNA-Clone exprimiert werden, für eine Vielzahl von Acyl-ACP-Substraten getestet und mit Kontroll-Thioesterase-Aktivitäten von E. coli und einem rohen Färberdistel-Embryoextrakt verglichen. Die pCGN3270- oder pCGN3271-Kulturen enthalten eine Thioesterase-Aktivität, welche für Färberdistel-Embryonen charakteristisch ist, d.h. eine viel größere Präferenz für 18:1-ACP gegenüber 18:0-ACP im Vergleich zu Kontroll-E. coli-Zellen. Unter den zwei Färberdistel-Thioesterase-Clonen zeigt die durch pCGN3271 exprimierte Aktivität eine etwas höhere Spezifität für die gesättigten 18:0-ACP- und 16:0-ACP-Substrate.
Beispiel 3 – Konstrukte & Methoden zur Pflanzentransformation
A. Konstrukte zur Expression der Lorbeerbaum-Thioesterase in Pflanzenzellen, welche Phaseolin-, Napin-, CaMV35S- und Bce4-Promotorregionen verwenden, werden wie folgt hergestellt.
Phaseolin/Thioesterase
Ein 1,45 kb-Fragment von pCGN3822 (3A-17) wird durch Spaltung mit Ball und SalI erhalten. Die BalI-Stelle befindet sich an Position 149 der cDNA-Insertion, und die SalI-Stelle befindet sich in dem Polylinker, welcher 3' zu der cDNA-Insertion vorliegt. Folglich enthält dieses Fragment die gesamte Thioesterase codierende Region und die gesamte cDNA-3'-Region, einschließlich dem Polyadenylierungssignal, AAATAA, das bei sich den Basen 1447–1452 befindet, und es enthält auch die Restriktionsspaltstellen KpnI, SmaI, XbaI und SalI, welche direkt 3' zu der cDNA angeordnet sind.
Ein 850 bp großes BglII-Fragment der _-Phaseolin-5'-nichtcodierenden Region wurde aus p8.8pro (Hoffman et al., EMBO J. 6 (1987), 3213–3221) erhalten und in pUC9 (Vieira und Messing, a.a.O.) in die BamHI-Stelle cloniert, um pTV796 zu erhalten. Das Phaseolin-Fragment in pTV796 ist derart orientiert, daß die SmaI-Stelle von pUC9 3' zu dem Phaseolin-Promotor angeordnet ist. Ein 850 bp-Fragment wird durch Spalten von pTV796 mit HindIII und SmaI erzeugt und auf einem Gel gereinigt.
Der Phaseolin-Promotor (HindIII/SmaI) und die Thioesterase codierende Region (BalI/SalI) werden durch eine 3-Wege-Ligierung in einem Bluescript (Stratagene)-Clonierungsvektor verknüpft, welcher mit HindIII und SmaI gespalten worden ist. Das erhaltene Plasmid enthält das Phaseolin-Promotor/Thioesterase-Konstrukt auf einem HindIII/SalI-Fragment, welches von verschiedenen Restriktionsstellen, einschließlich einer 5'-BamHI-Stelle und einer 3'-KpnI-Stelle, umgeben ist. Es wird keine zusätzliche pflanzliche 3'-nichtcodierende Region vorgesehen, da das Thioesterase-Fragment ein Polyadenylierungssignal enthält. Das Phaseolin-Promotor/Thioesterase-Fragment kann durch Spaltung mit BamHI und KpnI oder alternativ durch partielle Spaltung mit XbaI erhalten und in einen geeigneten binären Vektor, wie pCGN1557 oder pCGN1578 (McBride und Summerfelt, Plant Mol. Biol. 14 (1990), 269–276), zur Pflanzentransformation ligiert werden. Die Ligierung des Phaseolin-Promotor/Thioesterase-Fragments, welches aus der BamHI- und KpnI-Spaltung resultiert, in pCGN1578 ergibt pCGN3821.
35S/Thioesterase/mas
Ein BalI/PstI-Fragment der Thioesterase-cDNA 3A-17, enthaltend etwa 1200 bp und umfassend die gesamte codierende Region, wird durch partielle Spaltung mit den Restriktionsenzymen BalI und PstI und eine Gelreinigung des 1200 bp-Fragments erhalten. Das Fragment wird in einen Plasmidclonierungsvektor, wie einen Bluescript-Vektor (Stratagene Cloning Systems; La Jolla, CA), welcher mit PstI und BamHI gespalten worden ist, cloniert, und die BamHI-Stelle wird unter Verwendung des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase I aufgefüllt. Bei diesem Verfahren wird die BamHI-Stelle durch Ligierung mit der Ball-Stelle der Thioesterase-cDNA wiederhergestellt.
Das erhaltene Plasmid wird mit BamHI und EcoRI partiell gespalten, um das etwa 1200 bp große Thioesterase-Fragment zu erhalten. Dieses Fragment wird dann in ein etwa 4,4 kb großes BamHI/EcoRI-DNA-Fragment cloniert, welches etwa 0,94 kb einer 5'-nichtcodierenden Sequenz aus einem Blumenkohlmosaikvirus (CaMV)-35S-Gen (unmittelbar 5' zu der BamHI-Stelle), etwa 0,77 kb einer 3'-nichtcodierenden Sequenz aus einem Agrobacterium tumefaciens-Manopinsynthase (mas)-Gen (unmittelbar 3' zu der EcoRI-Stelle) und ein pUC19-Grundgerüst (New England BioLabs, Beverly, MA) enthält. Das BamHI/BcoRI-DNA-Fragment wird durch partielle Spaltung eines größeren Plasmidvektors und eine Gelreinigung des gewünschten 4,4 kb-Fragments erhalten. Die 35S-5'-Region besteht aus den Basen 6492 bis 7433 des Stamms CM1841 (Gardner et al., Nucl. Acids Res. 9 (1981), 2871–2887), was etwa –640 bis etwa +2 im Verhältnis zu dem Transkriptionsstartpunkt entspricht. Die mas-3'-nichtcodierende Region umspannt etwa die Basen 19.239 bis 18.474 des Octopin-Ti-Plasmids pTiA6 (die Numerierung entspricht derjenigen des nahe verwandten pTi15955, wie durch Barker et al. (Plant Mol. Biol. 2 (1983), 335–350) beschrieben.
Das erhaltene 35S/Thioesterase/mas-Plasmid wird an den umgebenden BglII-Stellen gespalten und in einen mit BamHI gespaltenen binären Vektor, wie pCGN1557 oder pCGNl578 (McBride und Summerfelt, a.a.O.), cloniert.
Bce4/Thioesterase
Ein 1,45 kb großes Thioesterase-cDNA-BalI/SalI-Fragment wird hergestellt; wie oben beschrieben. Eine Bce4-Expressionskassette, pCGN1870, welche für die bevorzugte Expression in der frühen Samenentwicklung sorgt, ist in der gleichzeitig anhängigen US-Patentanmeldung mit der Anmeldenummer 07/494,722 beschrieben.
Ein etwa 1 kb großes Fragment der Bce4-5'-nichtcodierenden Region, deren 3'-Ende sich unmittelbar 5' zu dem Bce4-Startcodon befindet, wird durch Spaltung von pCGN1870 mit XbaI und XhoI und eine Gelreinigung des erhaltenen 1 kb-Fragments erhalten.
Der Bce4-Promotor (XbaI/XhoI) und die Thioesterase codierende Region (BalI/SalI) werden durch eine 3-Wege-Ligation in einem Bluescript-Clonierungsvektor (Stratagene) verknüpft, welcher mit XbaI und SalI gespalten worden ist. Das erhaltene Plasmid enthält das Bce4-Promotor/Thioesterase-Konstrukt auf einem XbaI/SalI-Fragment, welches von verschiedenen Restriktionsstellen, einschließlich einer 5'-BamHI-Stelle und einer 3'-KpnI-Stelle, umgeben ist. Es wird keine zusätzliche pflanzliche 3'-nichtcodierende Region vorgesehen, da das Thioesterase-Fragment ein Polyadenylierungssignal enthält. Das Bce4-Promotor/Thioesterase-Fragment kann durch Spaltung mit BamHI und eine partielle Spaltung mit KpnI (oder Asp718, welches die gleiche Erkennungssequenz besitzt) oder alternativ durch partielle Spaltung mit XbaI erhalten und in einen geeigneten binären Vektor, wie pCGN1557 oder pCGNl578 (McBride und Summerfelt, a.a.O.), zur Pflanzentransformation ligiert werden. Die Ligierung des Bce4-Promotor/Thioesterase-Fragments, welches aus der BamHI- und KpnI-Spaltung resultiert, in pCGNl578 ergibt pCGN3820.
Napin/Thioesterase/Napin
Die Napin-Expressionskassette, pCGN1808, ist in der gleichzeitig anhängigen US-Patentanmeldung mit der Anmeldenummer 07/550,804 beschrieben. pCGN1808 ist derart modifiziert, daß sie umgebende Restriktionsstellen enthält, um die Verschiebung der Expressionssequenzen allein und nicht des Antibiotikaresistenz-Markers in binäre Vektoren, wie pCGN1557 (McBride und Summerfelt, a.a.O.), zu ermöglichen. Synthetische Oligonucleotide, enthaltend KpnI-, NotI- und HindIII-Restriktionsstellen, werden angelagert und an der einzigen HindIII-Stelle von pCGN1808 ligiert, so daß nur eine HindIII-Stelle wiederhergestellt wird. Das erhaltene Plasmid, pCGN3200, enthält einmalige HindIII-, NotI- und KpnI-Restriktionsstellen am 3'-Ende der 3'-regulatorischen Sequenzen von Napin, wie mittels Sequenzanalyse bestätigt wird.
Der größte Teil der Napin-Expressionskassette wird aus pCGN3200 durch Spaltung mit HindIII und SacI und Ligierung in den mit HindIII und SacI gespaltenen pIC19R (Marsh et al., Gene 32 (1984), 481–485) subcloniert, um pCGN3212 herzustellen. Die äußersten 5'-Sequenzen der Napin-Promotorregion werden mittels PCR unter Verwendung von pCGN3200 als eine Matrize und zwei Primern, welche die SacI-Stelle und die Verbindungsstelle des Napin-5'-Promotors und des pUC-Grundgerüsts von pCGN3200 aus dem pCGN1808-Konstrukt umgeben, rekonstruiert. Der Vorwärtsprimer enthält ClaI-, HindIII-, NotI- und KpnI-Restriktionsstellen sowie die Nucleotide 408–423 der Napin-5'-Sequenz (von der EcoRV-Stelle), und der Rückwärtsprimer enthält den Komplementärstrang zu den Napin-Sequenzen 718–739, welche die einmalige SacI-Stelle in dem 5'-Promotor einschließen. Die PCR wurde unter Verwendung einer Perkin-Elmer/Cetus-Thermocycler-Vorrichtung gemäß den Beschreibungen des Herstellers durchgeführt. Das PCR-Fragment wird als ein Fragment mit glatten Enden in pUC8 (Vieira und Messing, Gene 19 (1982), 259–268, welches mit HincII gespalten wurde, subcloniert, um pCGN3217 zu erhalten. Die Sequenzierung von pCGN3217 entlang der Napin-Insertion bestätigt, daß keine falschen Nucleotide durch die PCR eingeführt wurden. Die Napin-5'-Sequenzen in pCGN3217 werden mit dem Rest der Napin-Expressionskassette durch Spaltung mit ClaI und SacI und Ligierung mit pCGN3212, welches mit ClaI und SacI gespalten wurde, ligiert. Die erhaltene Expressionskassette pCGN3221 wird mit HindIII gespalten, und die Napin-Expressionssequenzen werden durch eine Gelreinigung entfernt und mit pIC20H (Marsh, a.a.O.), welches mit HindIII gespalten wurde, ligiert. Die endgültige Expressionskassette ist pCGN3223, welche in einem Ampicillin-resistenten Hintergrund im wesentlichen identische 1,725 kb-Napin-5'- und 1,265 kb-3'-regulatorische Sequenzen, wie in pCGN1808 zu finden, enthält. Die regulatorischen Regionen sind von HindIII-, NotI- und KpnI-Restriltionsstellen umgeben, und einmalige SalI-, BglII-, PstI- und XhoI-Clonierungsstellen sind zwischen den 5'- und 3'-nichtcodierenden Regionen angeordnet.
Das oben beschriebene 1200 bp große BalI/PstI-Thioesterase-cDNA-Fragment wird in die Napin-Expressionskassette, pCGN3223, welche mit SalI gespalten worden ist, cloniert, und die Sall-Stelle wird unter Verwendung des Klenow-Fragments von DNA-Polymerase I aufgefüllt, gefolgt durch eine Spaltung mit PstI. Die Sall-Stelle wird bei dieser Ligierung wiederhergestellt.
Das durch diese Manipulationen erzeugte Napin/Thioesterase/Napin-Plasmid wird mit BamHI verdaut und mit KpnI partiell gespalten, um ein etwa 3,3 kb großes Fragment zu erzeugen. Dieses Fragment enthält ~1,7 kb der 5'-nichtcodierenden Napin-Sequenz, das 1200 bp große BalI/PstI-Thioesterase-cDNA-Fragment und ~0,33 kb der 3'-nichtcodierenden Napin-Sequenz, wobei der Rest der 3' vorhandenen 1,265 kb des Napins aufgrund der BamHI-Stelle in dieser Region deletiert worden ist. Das ~0,33 kb große Fragment wird mit pCGN1557 oder pCGN1578 (McBride und Summerfelt, a.a.O.), gespalten mit KpnI/BamHI, zur Pflanzentransformation ligiert. Die Insertion des ~0,33 kb großen Fragments in pCGNl578 ergibt pCGN3816.
Napin/Thioesterase
Ein etwa 1,5 kb großes Fragment der Thioesterase-cDNA vollständiger Länge wird durch partielle Spaltung von pCGN3822 mit BamHI und KpnI und eine anschließende Gelreinigung des resultierenden 1,5 kb-Fragments erhalten. Die BamHI-Stelle befindet sich bei Nucleotid 74 der cDNA-Sequenz, und die KpnI-Stelle liegt in dem Vektor-Polylinker, welcher 3' zu der cDNA-Insertion angeordnet ist. Folglich enthält dieses Fragment die gesamte Thioesterase codierende Region, einschließlich des ATG-Codons an den Positionen 145–147, und die gesamte cDNA-3'-Region, welche ein Polyadenylierungssignal enthält, wie oben beschrieben.
Ein etwa 1,7 kb großes Fragment der Napin-5'-nichtcodierenden Region wird durch Spaltung von pCGN3223 (oben beschrieben) mit HindIII und BglII und eine anschließende Gelreinigung des 1,7 kb-Fragments erhalten.
Der Napin-Promotor (HindIII/BglII) und die Thioesterase codierende Region (BamHI/KpnI) werden durch eine 3-Fragment-Ligierung in einen binären Vektor, wie pCGNl557 oder pCGN1578 (McBride und Summerfelt, a.a.O.), welcher mit HindIII und KpnI gespalten wird, verknüpft. Bei dieser Reaktion ermöglichen die komplementären überhängenden Enden der BamHI- und BglII-Stellen die Fusion des 3'-Endes des Napin-Fragments mit dem 5'-Ende des Thioesterase-Fragments. Das aus der Ligierung in pCGNl578 erhaltene Plasmid, pCGN3824, zur Pflanzentransformation enthält die Thioesterase-cDNA, welche zur Expression unter der regulatorischen Kontrolle des Napin-Promotors positioniert ist. Es wird keine zusätzliche pflanzliche 3'-nichtcodierende Region vorgesehen, da das Thioesterase-Fragment ein Polyadenylierungssignal enthält.
Napin/Thioesterase/Napin
Ein Konstrukt zur Expression von Thioesterase unter der transkriptionellen und translationalen Kontrolle eines Napin-Promotors und 3'-transkriptionellen Terminationsregionen wird wie folgt hergestellt. pCGN3822 (oben beschrieben) wird unter Anwendung von PCR-Techniken verändert, um eine BamHI-Stelle unmittelbar 5' zu dem Thyminnucleotid an Position 140 (5 Basen stromaufwärts des ATG-Startcodons) der in 6A (SEQ ID Nr.: 41) gezeigten Lorbeerbaum-Thioesterase-Sequenz zu inserieren, wobei pCGN3826 erhalten wird. Ein etwa 1225 bp großes Fragment, enthaltend die gesamte Thioesterase codierende Region, wird aus pCGN3826 als ein BamHI-PstI-Fragment erhalten und in den mit BglII/PstI gespaltenen pCGN3223, die oben beschriebene Napin-Expressionskassette, ligiert, wobei pCGN3827 erhalten wird. Ein Vektor zur Pflanzentransformation, pCGN3826, wird durch partielle Spaltung von pCGN3827 mit KpnI und BamHI und Clonierung des etwa 3,2 kb großen Fragments, enthaltend das Napin-5'/Thioesterase/Napin-3'-Konstrukt, in den mit KpnI/BamHI gespaltenen pCGN1578 (McBride und Summerfelt, a.a.O.) konstruiert.
Ein Konstrukt, pCGN3837, wird hergestellt, welches pCGN3828 ähnlich ist, aber worin die codierenden Region des Lorbeerbaum-Transportpeptids durch eine Sequenz ersetzt worden ist, welche das Färberdistel-Thioesterase-Transportpeptid und 6 Aminosäuren der reifen Färberdistel-Thioesterase aus Clon 2–1 codiert. Das Färberdistel-Fragment für dieses Konstrukt kann unter Anwendung von PCR-Techniken hergestellt werden, um geeignete Restriktionsspaltstellen vorzusehen. Ein anderes Konstrukt mit 5'- und 3'-regulatorischen Napin-Regionen wird hergestellt, welches die Region, die das Lorbeerbaum-Thioesterase-Transportpeptid und die ersten 11 Aminosäuren des reifen Lorbeerbaum-Thioesterase-Proteins codiert, durch eine Sequenz ersetzt, welche das Färberdistel-Thioesterase-Transportpeptid und die ersten 31 Aminosäuren des reifen Färberdistel-Thioesterase-Proteins codiert.
Ein geeigneter Agrobacterium-Stamm wird mit den binären Konstrukten transformiert und zur Erzeugung von transformierten, Laurat produzierenden Pflanzen verwendet. Die Samen wurden gesammelt und analysiert, wie oben beschrieben, um die Effizienz des Plastidtransports und die Ölzusammensetzung zu bestimmen.
B. Eine Vielzahl von Methoden ist entwickelt worden, um eine DNA-Sequenz von Interesse in das Genom einer Wirtspflanze zum Erhalt der Transkription oder der Transkription und Translation der Sequenz, um phänotypische Veränderungen hervorzurufen, inserieren.
Brassica-Transformation
Samen von Brassica napus cv. Westar werden in 95%-igem Ethanol für 2 min eingeweicht, in einer 1,0%-igen Lösung von Natriumhypochlorit, enthaltend einen Tropfen Tween 20, für 45 min an der Oberfläche sterilisiert und dreimal in sterilem, destilliertem Wasser gespült. Die Samen werden dann in Magenta-Kisten mit einer 1/10 Konzentration eines organischen Murashige-Minimalmedium (Gibco; Grand Island, NY), supplementiert mit Pyriodoxin (50 μg/l), Nicotinsäure (50 μg/l), Glycin (200 μg/l) und 0,6% Phytagar (Gibco), pH 5,6, übertragen. Die Samen werden in einer Percival-Kammer bei 22°C bei einer 16 h-Lichtperiode mit kalter Fluoreszenz und rotem Licht mit einer Intensität von 65 μEinstein pro Quadratmeter pro Sekunde (μEm^–2s^–1) zum Keimen gebracht.
Hypokotyle werden von 5–7 Tage alten Sämlingen abgeschnitten, in Stücke von etwa 4 mm Länge geschnitten und auf Nährplatten übertragen (Horsch et al., Science 227 (1985), 1229–1231). Die Nährplatten werden einen Tag vor der Verwendung durch das Plattieren von 1,0 ml einer Tabak-Suspensionskultur auf einer Petrischale (100 × 25 mm), enthaltend etwa 30 ml MS-Salz-Base (Carolina Biological, Burlington, NC), 100 mg/l Inosit, 1,3 mg/l Thiamin-HCl, 200 mg KH₂PO₄ mit 3% Sucrose, 2,4-D (1,0 mg/l), 0,6% Gew./Vol. Phytagar, und pH vor dem Autoklavieren auf 5,8 eingestellt (MS-0/1/0-Medium), hergestellt. Eine sterile Filterpapierscheibe (Whatman, 3 mm) wird vor der Verwendung oben auf die Nährschicht gelegt. Die Tabak-Suspensionskulturen werden durch Übertragen von 10 ml der Kultur in 100 ml frisches MS-Medium, wie für die Nährplatten beschrieben, mit 2,4-D (0,2 mg/l) und Kinetin (0,1 mg/ml) wöchentlich subkultiviert. In Experimenten, wo keine Nährzellen verwendet werden, werden die Hypokotylexplantate geschnitten und auf einer Filterpapierscheibe oben auf das MS-0/1/0-Medium gelegt. Sämtliche Hypokotylexplantate werden vorher auf Nährplatten für 24 h bei 22°C bei einer kontinuierlichen Lichtintensität von 30 μEm^–2s^–1 bis 65 μEm^–2s^–1 inkubiert.
Einzelne Kolonien des A. tumefaciens-Stamms EHA 101, enthaltend ein binäres Plasmid, werden auf 5 ml MG/L-Brühe übertragen und bei 30°C über Nacht gezüchtet. Hypokotylexplantate werden in 7–12 ml MG/L-Brühe mit Bakterien, verdünnt auf 1 × 10⁸ Bakterien/ml, eingetaucht und nach 10–25 min auf Nährplatten gelegt. Ein Liter MG/L-Brühe enthält 5 g Mannit, 1 g L-Glutaminsäure oder 1,15 g Natriumglutamat, 0,25 g KH₂PO₄, 0,10 g NaCl, 0,10 g MgSO₄ 7H₂O, 1 mg Biotin, 5 g Trypton und 2,5 g Hefeextrakt, und die Brühe wird auf pH 7,0 eingestellt. Nach einer 48-stündigen Co-Inkubation mit Agrobacterium werden die Hypokotylexplantate auf B5-0/1/0-Kallusinduktionsmedium übertragen, welches filtersterilisiertes Carbenicillin (500 mg/l, zugegeben nach dem Autoklavieren) und Kanamycinsulfat (Boehringer Mannheim; Indianapolis, IN) in Konzentrationen von 25 mg/l enthält.
Nach 3-7-tägiger Züchtung bei kontinuierlichem Licht von 65 μEm^–2s^–1 wird Kallusgewebe auf der Schnittfläche sichtbar, und die Hypokotylexplantate werden auf Sproß-Induktionsmedium, B5BZ (B5-Salze und Vitamine, supplementiert mit 3 mg/l Benzylaminopurin, 1 mg/l Zeatin, 1% Sucrose, 0,6% Phytagar und pH eingestellt auf 5,8), übertragen. Dieses Medium enthält auch Carbenicillin (500 mg/l) und Kanamycinsulfat (25 mg/l). Die Hypokotylexplantate werden alle zwei Wochen auf frischem Sproß-Induktionsmedium subkultiviert.
Aus den Hypokotylkallussen regenerieren sich Sprosse nach ein bis drei Monaten. Grüne Sprosse mit einer Länge von mindestens 1 cm werden von den Kallussen abgeschnitten und auf Medium, enthaltend B5-Salze und Vitamine, 1% Sucrose, Carbenicillin (300 mg/l), Kanamycinsulfat (50 mg/l) und 0,6% Gew./Vol Phytagar, gelegt. Nach 2–4 Wochen werden Sprosse, welche grün bleiben, an der Basis abgeschnitten und in Magenta-Kisten, enthaltend Wurzel-Induktionsmedium (B5-Salze und Vitamine, 1% Sucrose, 2 mg/l Indolbuttersäure, 50 mg/l Kanamycinsulfat und 0,6% Phytagar), übertragen. Grüne, bewurzelte Sprosse werden auf eine Thioesterase-Aktivität getestet.
Arabidopsis-Transformation
Transgene Arabidopsis thaliana-Pflanzen können durch Agrobacterium-vermittelte Transformation, wie durch Valverkens et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. 85 (1988), 5536–5540) beschrieben, erhalten werden. Konstrukte werden in Agrobacterium-Zellen, wie den Stamm EHA101 (Hood et al., J. Bacteriol. 168 (1986), 1291–1301), durch die Methode nach Holsters et al. (Mol. Gen. Genet. 163 (1978), 181–187) eingeschleust.
Erdnuß-Transformation
DNA-Sequenzen von Interesse können als Expressionskassetten, umfassend mindestens eine Promotorregion, ein Gen von Interesse und eine Terminationsregion, in ein Pflanzengenom mittels Partikelbeschuß, wie in der Europäischen Patentanmeldung 332 855 und in der gleichzeitig anhängigen Anmeldung USSN 07/22,332, eingereicht am 27. Juli 1988, eingeschleust werden.
Kurz zusammengefaßt werden Wolfram- oder Goldpartikel mit einer Größe im Bereich von 0,5 μM bis 3 μM mit DNA einer Expressionskassette beschichtet. Diese DNA kann in Form einer wäßrigen Mischung oder eines trockenen DNA/Partikel-Präzipitats vorliegen.
Das als Ziel für den Beschuß verwendete Gewebe kann aus Kotyledonenexplantaten, Sproßmeristemen, unreifen Blättchen und anderen stammen.
Der Beschuß des Gewebes mit den DNA-beschichteten Partikeln wird unter Verwendung einer Biolistics^TM-Partikelkanone (Dupont; Wilmington, DE) ausgeführt. Die Partikel werden bei variablen Abständen im Bereich von 1 cm bis 14 cm von der Laufmündung in den Lauf eingebracht. Das zu beschießende Gewebe wird unter die Abbremsplatte gestellt; der Test wird mit dem Gewebe bei Abständen von bis zu 20 cm durchgeführt. Im Moment des Abfeuerns wird das Gewebe durch ein Nylonnetz oder eine Kombination von Nylonnetzen mit Maschenweiten im Beeich von 10 μM bis 300 μM geschützt.
Nach dem Beschuß können nach der Methode von Atreya et al. (Plant Science Letters 34 (1984), 379–383) Pflanzen regeneriert werden. Kurz zusammengefaßt werden Embryoachsengewebe oder Kotyledonensegmente auf MS-Medium (Murashige und Skoog, Physio. Plant. 15 (1962), 473) (MS plus 2,0 mg/l 6-Benzyladenin (BA) für die Kotyledonensegmente) gelegt und im Dunkeln für 1 Woche bei 25 ± 2°C inkubiert und anschließend unter kontinuierliches, kaltes, weißes Fluoreszenzlicht (6,8 W/m²) gebracht. Am 10. Tag der Kultur werden die Pflänzchen in Töpfe mit steriler Erde umgepflanzt, für 3–5 Tage im Schatten gehalten und schließlich in ein Gewächshaus gebracht.
Die vermutlich transgenen Sprosse werden bewurzelt. Die Integration einer exogenen DNA in das Pflanzengenom kann durch verschiedene Methoden bestätigt werden, welche den Fachleuten bekannt sind.
C. Transgene Pflanzen, transformiert mit Thioesterase-Konstrukten, werden auf eine Thioesterase-Aktivität und die Fettsäure- und Triglyceridzusammensetzungen untersucht.
Arabidopsis-Samen von selbstbefruchteten, transgenen A. thaliana-Pflanzen, transformiert mit pCGN3816 und pCGN3821, werden auf 12:0- und 14:0-Acyl-ACP-Thioesterase-Aktivitäten untersucht. Keimende Samen werden mit Thioesterase-Testpuffer (Beispiel 1) extrahiert, und die lösliche Fraktion wird untersucht. Transgene Samen zeigen eine signifikante Erhöhung der 12:0-Thioesterase-Aktivität im Vergleich zu den Kontrollen. Die 14:0-ACP-Hydrolyse erhöht sich ebenfalls, aber in einem kleineren Maßstab, was mit den Enzymspezifitätsdaten von transformierten E. coli-Zellen übereinstimmt.
Eine Gesamtfettsäureanalyse von reifen A. thaliana-Samen ergab bis zu 5% Laurat in Pflanzen, welche mit den oben beschriebenen Konstrukten transformiert wurden, verglichen mit 0% Laurat, gemessen in Samen von Kontrollpflanzen. 7 zeigt, daß der Prozentsatz an Laurat direkt mit der Lauroyl-Thioesterase-Aktivität in transgenen Samen korreliert. Der Myristatgehalt in transgenen Samen erhöht sich ebenfalls von 0,1 (Kontrolle) auf bis zu 0,7% in den Pflanzen mit der höchsten Expression und korreliert auch mit der Myristoyl-Thioesterase-Aktivität. Eine Triglyceridanalyse mittels Dünnschichtchromatographie zeigt, daß das durch die Gesamtfettsäureanalyse nachgewiesene Laurat in der neutralen Lipidfraktion vorliegt, was darauf hinweist, daß das Laurat in Triglyceride eingebaut (verestert) wird.
Reife Samen von A. thaliana-Pflanzen, transformiert mit pCGN3828, wurden auf die Gesamtfettsäuren untersucht, im wesentlichen wie beschrieben durch Browse et al. (Anal. Biochem. 152 (1986), 141–145), wie in Beispiel 16 ausführlich dargelegt ist. Diese Untersuchungen zeigen mindestens eine Pflanze auf, 3828-13, deren Samen bis zu etwa 17 Gew.-% (23,5 Molprozent) Laurat enthalten. Reife Samen dieser transformierten Pflanze werden einem Verdauungsprotokoll mit Lipase aus der Bauchspeicheldrüse unterzogen (Brockerhoff, Meth. Enzymol. 35 (1975), 315–325), um Acylzusammensetzungen der sn-2- und sn-1+3 (kombiniert)-Positionen zu unterscheiden. Vorläufige Ergebnisse dieser Analysen sind wie folgt:
Diese vorläufigen Ergebnisse deuten darauf hin, daß mittelkettige Fettsäuren wirksam in die sn-1- und/oder sn-3-Positionen des Triglyceridmoleküls eingebaut werden.
Insgesamt wurden 26 pCGN3828-transformierte Arabidopsis-Pflanzen auf eine 12:0-ACP-Thioesterase-Aktivität getestet, wobei sieben als positiv getestet wurden. Das Vorhandensein von "Transformanten", welche bezüglich einer Laurat-Expression negativ sind, ist nicht überraschend, da die Arabidopsis-Transformationsmethode keine Selektion im Bewurzelungsstadium einschließt. Folglich wäre zu erwarten, daß Laurat-negative Pflanzen nichttransformierte "Kulturflüchtlinge" sowie transformierte Pflanzen, welche das Lorbeerbaum-Thioesterase-Gen nicht exprimieren, einschließen. Die Analyse reifer Samen (Pools von 100 Samen) von diesen sieben positiven Pflanzen zeigt, daß die positiven Pflanzen erhebliche Mengen an 12:0 enthalten, welches in Kontrollen fehlt. Die Mengen an 12:0 reichten von 2,1 bis 23,5 Molprozent und korrelieren annähernd mit der Thioesterase-Aktivität. Die Gesamtfettsäuregehalte der Samen liegen innerhalb des Bereiches, welcher typischerweise bei Arabidopsis beobachtet wird, was nahelegt, daß die 12:0-Ablagerung die Ölausbeute nicht ungünstig beeinflußt. Es werden keine offensichtlichen Effekte auf die Samenentwicklung oder -morphologie beobachtet. Eine Lipidklassenanalyse (TLC) zeigt, daß die Triglyceridfraktion den gleichen Anteil an Laurat wie die extrahierbaren Fettsäuren insgesamt enthält, d.h. in diesen Anteilen wird das 12:0 ohne weiteres in das Triglycerid eingebaut.
Eine geringe Menge an 14:0 reichert sich auch in transgenen Arabidopsis-Samen an. Das Verhältnis von 12:0- zu 14:0-Fettsäuren in den Samen (6–8) entspricht dem Verhältnis der in vitro-Thioesterase-Aktivitäten für 12:0-ACP und 14:0-ACP. Das nahezu konstante Verhältnis zwischen den 12:0- und 14:0-Produkten spiegelt vermutlich die Spezifität der Lorbeerbaum-Thioesterase für 12:0-ACP und 14:0-ACP wieder und deutet auf eine Enzymfunktion in vivo in den transgenen Samen durch direkte Einwirkung auf Pools ähnlicher Größe von 12:0-ACP und 14:0-ACP hin. Die Lorbeerbaum-Thioesterase scheint keine signifikante Wirkung auf 10:0-ACP in vitro zu haben, und es werden nur geringe Spuren an 10:0 in den transgenen Samen nachgewiesen.
Weitere Studien wurden durchgeführt, um zu bestimmen, ob die mittelkettigen Fettsäuren auf Kosten von sämtlichen oder nur einigen der "nativen" Arabidopsis-Fettsäuren synthetisiert wurden. Die durchschnittliche Fettsäurezusammensetzung von 100 reifen Samen einer Kontroll-Arabidopsis-Pflanze wurde mit derjenigen aus der transgenen Pflanze 3828-13 verglichen. Die Ergebnisse dieser Studien sind in 9 gezeigt. Die Unterschiede bezüglich der 12:0- und 14:0-Gehalte der zwei Pflanzen sind eindeutig, aber Unterschiede hinsichtlich der Gehalte an anderen Fettsäuren als Ergebnis einer mittel kettigen Produktion sind schwieriger zu identifizieren. Die Gesamtfettsäuregehalte variierten zwischen Arabidopsis-Pflanzen erheblich, was den Vergleich von absoluten Fettsäureanteilen sehr schwierig macht. Das Ausdrücken der Daten als Prozentsätze (Gesamtfettsäuren = 100), um diese Unterschiede zu eliminieren, rief weitere Unterschiede bei der Interpretation hervor.
Folglich wurde ein Weg für die Unterscheidung einzigartiger Fettsäurezusammensetzungen von einer typischen Variation zwischen Pflanzen wie folgt erdacht. Die Gesamtfettsäuregehalte reifer (T2) Samen von den 26 T1-Arabidopsis-Pflanzen wurden in zunehmender Reihenfolge geordnet und ergaben eine gleichmäßige Verteilung der Werte, wie in 10A gezeigt. Die sechs größten Laurat-Erzeuger sind zusammen mit den entsprechenden Gew.-%-12:0-Daten durch Pfeile angegeben. Es scheint keine Beziehung zwischen den Anteilen an der 12:0-Produktion und dem Gesamtfettsäuregehalt zu geben. In 10B sind die Daten in der gleichen Weise geordnet dargestellt, aber für drei einzelne Fettsäuren. Die Daten für 18:2 und 16:0 bilden auch eine gleichmäßige Linie, ausgenommen für die positiven Ereignisse, bei denen sich Laurat anreicherte. In solchen Fällen blieb der Gehalt an 18:2 und 16:0 merklich hinter dem Gesamttrend zurück, was zeigt, daß 12:0 in solchen Samen auf Kosten von 18:2 und 16:0 produziert wurde. Dies traf auch für 18:1, 20:1 und 20:2 zu. Der einzige wichtige Fettsäurebestandteil, welcher durch die 12:0-Produktion relativ unbeeinflußt zu sein scheint, war 18:3, wie in 15B gezeigt, obwohl Kontrollen mit geringem 18:3 gefunden werden können, zum Beispiel in Pflanze 10.
Samen von Brassica napus-Pflanzen, transformiert mit pCGN3816, werden auch auf die Gesamtfettsäuren untersucht, wie oben beschrieben. Die Analyse einzelner segregierender Samen von transformierten T2-Pflanzen ergab Anteile an C12:0 im Bereich von Null bis 14,5%, verglichen mit Null Prozent in Samen von nichttransformierten Kontrollpflanzen. Die C12:0-Anteile korrelieren mit den C12:0-ACP-Thioesterase-Aktivitäten in korrespondierenden unreifen Samen, wie in 7 gezeigt. Außerdem wird C14:0 auch in diesen Samen in Anteilen nachgewiesen, welche mit denen von C12:0 korrelieren, obwohl die C14:0-Anteile geringer sind.
Transformierte Brassica napus-Pflanzen, enthaltend die pCGN3824 (Napin/Thioesterase)- und pCGN3828 (Napin/Thioesterase/Napin)-Konstrukte, wurden untersucht, um die Fettsäurezusammensetzung der Samen zu bestimmen. Vereinigte Samen von 34 Pflanzen, transformiert mit pCGN3824, und 31 Pflanzen, transformiert mit pCGN3828, wurden analysiert (25–50 Samen pro Test), um die Bereiche der Lauratanteile in den Samen zu bestimmen. Die Ergebnisse dieser Analysen, dargestellt als die Anzahl der transgenen Ereignisse, welche einen bestimmten Prozentsatz an Laurat ergeben, sind in 11A und 11B dargestellt. Die pCGN3824-Transformanten wiesen Lauratgehalte im Bereich von 0 bis 11 Molprozent auf, mit Ausnahme einer einzigen Pflanze, deren Samen 17 Molprozent Laurat enthielten. Die Pflanzen mit dem pCGN3828-Konstrukt wiesen Lauratgehalte im Bereich von 1 bis 17 Molprozent auf, wobei zwei Vertreter mit 37 Molprozent Laurat (Pflanze 3828–23) und mit 27 Molprozent Laurat (Pflanze 3828–35) außerhalb dieses Bereiches lagen. Außerdem weisen die Samenöle dieser Pflanzen auch geringe Mengen an C14:0-Fettsäuren auf, welche etwa 16% der Lauratanteile entsprechen. Geringfügige Mengen an C 10:0 werden auch beobachtet, typischerweise bei 1 % des Lauratanteils. Weitere pCGN3828-Transformanten werden auch analysiert, um Pflanzen mit noch höheren Lauratgehalten zu identifizieren.
Eine Analyse der Hälfte der Samen wird auch verwendet, um die Lauratanteile in reifen Samen von transformierten Pflanzen zu bestimmen. Für die Analyse der Hälfte der Samen werden die Samen auf eine befeuchtete (2–3 ml Wasser) Filterpapierscheibe in einer Petrischale gelegt, welche luftdicht verschlossen und im Dunkeln für 20 bis 48 Stunden bei Raumtemperatur oder 30°C stehen gelassen wird. Zum Keimen gebrachte Samen besitzen 2–5 mm große Keimwurzeln, welche aus den Samenschalen hervortreten. Feine Pinzetten werden verwendet, um jeden Sämling aus seiner Schale zu entnehmen und die äußeren Kotyledonen abzuzupfen. Die präparierten Kotyledonen werden in 4 ml-Fläschchen eingebracht und vor der Fettsäureanalyse für 2–12 Stunden in einem 110°C-Ofen getrocknet. Die präparierten Sämlinge werden direkt in Eintopferde in 12er-Pack-Behältern eingepflanzt, besprüht, mit transparenten Kunststoffdeckeln abgedeckt; in eine Wachstumskammer bei 22°C mit einer Lichtintensität von 150–200 Mikroeinstein, m^–2S^–1, bei einer 16h/8h-Lichtperiode gebracht und wachsen gelassen, um T2-Pflanzen (Transformanten der zweiten Generation) zu erzeugen. Alternativ kann die Analyse der Hälfte der Samen unter Verwendung eines abgelösten Teils eines reifen Samens durchgeführt werden. Die Samen werden unter ein Präpariermikroskop gehalten, und ein Stückchen von etwa 30% des Samens wird entfernt, wobei die Embryonenachse vermieden wird. Das Samenstückchen wird zur Fettsäureanalyse mittels GC verwendet, und der restliche Samenteil wird in Wasser für 5–7 Tage in einer Mikrotiterschale zum Keimen gebracht. in Erde eingepflanzt und zur Erzeugung von T2-Samen gezüchtet.
Der Lauratgehalt von 144 getesteten, halben pCGN3828-35-Samen reichte von 4 bis 42 Molprozent. Der Lauratgehalt von 214 getesteten, halben pCGN3828-23-Samen reichte von 12 bis 50 Molprozent. Keiner der Samen, welche von entweder den pCGN-3828-23- oder den pCGN3828-35-Pflanzen analysiert wurden, wies Null Prozent Laurat auf, was zeigt, daß diese Transformanten drei oder mehr Thioesterase-Insertionen in ihr Genom inseriert haben. Außerdem zeigen Analysen unter Verwendung von etwa 60 halben Samen der pCGN3828-Transformanten mit 10–20 Mol% Laurat in ihren Samen, daß diese Pflanzen 1–2 Insertionen des Lorbeerbaum-Thioesterase-Gens besitzen.
Um das Schicksal des Laurats in transgenen Brassica napus-Samen zu untersuchen, wurden die Fettsäurezusammensetzungen verschiedener Lipidklassen, extrahiert aus reifen transgenen Samen von zwei transgenen Pflanzen, pCGN3828-23 und pCGN-3828-7, untersucht. Die TLC-Analyse der Phospholipide zeigt, daß nahezu 100% des Laurats in der TAG-Fraktion vorliegen. Analysen der Acylzusammensetzungen der sn-2- und sn-1+-Positionen der TAG wurden durch das Protokoll unter Verwendung einer Lipase aus der Bauchspeicheldrüse (Brockerhoff (1975, a.a.O.) durchgeführt. Idealerweise spaltet die Lipase bei diesem Protokoll die Fettsäuren an den sn-1- und sn-3-Positionen und nicht an der sn-2-Position. Folglich sind die Fettsäuren in dem erhaltenen Monoglycerid vermutlich diejenigen in der sn-2-Position. Erste Untersuchungen der TAG-Fraktion in den Laurat-Transformanten nach dieser Methode zeigen, daß C12:0-Fettsäuren nicht in der sn-2-Position eingebaut werden. Jedoch ist anzumerken, daß Forscher, welche früher versuchten, TAG-Fraktionen von Fettsäuren kürzerer Kettenlänge nach dieser Methode zu untersuchen (Entressangles et al., Biochem. Biophys. Acta 84 (1964), 140-148), berichteten, daß Fettsäuren kürzerer Kettenlänge, welche sich an der sn-2-Position befinden, während einer solchen Spaltung schnell hydrolysiert wurden, wobei die Autoren berichteten, daß dies das Ergebnis einer spontanen Wanderung von internen Fettsäuren kürzerer Kettenlänge zu den äußeren Positionen in Diglyceriden und Monoglyceriden ist.
Weitere Analysen von transformierten Pflanzen, enthaltend das pCGN3828-Konstrukt, werden durchgeführt, um die Expression der Lorbeerbaum-Thioesterase in diesen Pflanzen weiter zu charakterisieren. Die extrahierbare C12:0-Thioesterase-Aktivität in keimenden Samen von pCGN3828-23-Transformanten wird gemessen, und es wird ein Wert bestimmt. welcher erheblich höher als die endogene 18:1-Thioesterase-Aktivität ist. Im Hinblick auf die hohe Lorbeerbaum-Thioesterase-Aktivität in transgenen Pflanzen werden weitere Faktoren zur Optimierung der Lauratproduktion untersucht.
Das Vorhandensein der prozessierten (34 kD) Lorbeerbaum-Thioesterase in transformierten 3828-23-Pflanzen wird mittels Western-Analyse des zeitlichen Verlaufs der Entwicklung von Samen aus dieser Pflanze untersucht. Die Experimente werden unter Verwendung eines polyclonalen Antikörpers gegen Lorbeerbaum-Thioesterase und eines Biotin-markierten Sekundärantikörpers durchgeführt. Diese Studien zeigen, daß ein wichtiges Samenspeicherprotein in Brassica mit der gleichen Beweglichkeit wie die Lorbeerbaum-Thioesterase wandert, was eine unspezifische Hintergrundfärbung hervorruft. Jedoch wird eine Bande mit einem scheinbaren Molekulargewicht von etwa 42 kD, welche mit dem Lorbeerbaum-Ab reagiert, in transformierten, Laurat produzierenden Pflanzen nachgewiesen. Dieses scheinbare Molekulargewicht stimmt mit demjenigen der nichtprozessierten Lorbeerbaum-Thioesterase überein.
Andere Western-Nachweismethoden werden untersucht, um die unspezifische Hintergrundfärbung zu reduzieren. Zum Beispiel ergibt eine zweite Antikörper-Methode, wobei der Sekundärantikörper an alkalische Phosphatase gekoppelt ist, eine reduzierte Hintergrundfärbung. Die Anreicherung der Lorbeerbaum-Thioesterase ist bei geringen Anteilen am Tag 24 nach der Bestäubung nachweisbar, wobei starke Signale in Samen an den Tagen 30–40 nach der Bestäubung beobachtet wurden. Erste Ergebnisse deuten darauf hin, daß der größte Teil des Signals auf das nichtprozessierte 42 kD-Prä-Protein zurück zuführen ist, wobei nur 10–20% des Thioesterase-Antigens bei 34 kD wandern. Diese Studien legen nahe, daß das ungewöhnliche Transportpeptid der Lorbeerbaum-Thioesterase eine Plastid-Hinleitung in Brassica zur Folge haben kann, welche nicht optimal ist.
Die RNA-Analyse des obigen zeitlichen Verlaufs der Entwicklung der Samenproben zeigt, daß die Napin-gesteuerte Lorbeerbaum-Thioesterase-mRNA sich mit der gleichen Kinetik wie die gesamte endogene Napin-Information bei einer maximalen Transkription im Bereich von 27–50 Tagen anreichert. Folglich bleibt die Lorbeerbaum-Thioesterase-Aktivität um etwa 5–7 Tage hinter dem Einsetzen der Speicherölsynthese zurück, und die frühere Expression der Lorbeerbaum-Thioesterase kann einen wesentlichen Einfluß auf die Gesamtlauratanteile in reifen Samen haben. Eine Northern-Analyse von ACP- und Stearoyl-ACP-Desaturase-Transkripten in den obigen Samenproben zeigt, daß die nativen Transkripte dieser Gene sich 3–5 Tage früher als das Lorbeerbaum-Thioesterase-Transkript, welches durch den Napin-Promotor hergestellt wird, anreichern. Diese Daten legen nahe, daß die ACP- und Stearoyl-ACP-Desaturase-Gen-Promotoren für die frühere Expression des Lorbeerbaum-Thioesterase-Gens nützlich sein können. Die Clonierung einer cDNA für eine Stearoyl-ACP-Desaturase aus Brassica rapa und einer Promotorregion für ACP aus B. rapa sind beschrieben worden (Knutzon et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 89 (1992), 2624–2628; Scherer et al., Plant Mol. Biol. 18 (1992), 591–594).
Transformierte Arabidopsis-Pflanzen, enthaltend ein Konstrukt (pCGN3836) mit dem 1,2 kb-Fragment des Lorbeerbaum-Thioesterase-Gens, welches zur Expression durch eine etwa 1,5 kb große Region des ACP-Promotors aus B. rapa positioniert ist, und etwa 0,3 kb einer 3'-regulatorischen Napin-Region, sind erhalten worden. Eine erste Analyse der Samen von den pCGN3836-transformierten Pflanzen auf den Lauratgehalt zeigt, daß sich das Laurat nicht in nachweisbaren Mengen in diesen Samen anreichert. Jedoch ist es möglich, daß, wenn der Expressionszeitpunkt und die Hinleitung der Lorbeerbaum-Thioesterase in transgenen Brassica-Samen optimiert werden, durch eine geringe Menge an Thioesterase eine sehr große Menge an Laurat herstellt wird, wie es anscheinend im Lorbeerbaum der Fall ist, und eine geringere Expressionsrate der Lorbeerbaum-Thioesterase ausreichend sein kann.
Beispiel 4 – Transgene Pflanzen
Pflanzen, transformiert mit Thioesterase-Konstrukten, werden auf eine Thioesterase-Aktivität und die Fettsäure- und Triglyceridzusammensetzungen untersucht.
A. Arabidopsis
Arabidopsis-Samen aus selbstbefruchteten, transgenen A. thaliana-Pflanzen, transformiert mit pCGN3816 und pCGN3821, werden auf 12:0- und 14:0-Acyl-ACP-Thioesterase-Aktivitäten untersucht. Keimende Samen werden mit Thioesterase-Testpuffer extrahiert (Pollard et al., a.a.O.), und die lösliche Fraktion wird getestet. Transgene Samen zeigen eine signifikante Erhöhung der 12:0-Thioesterase-Aktivität im Vergleich zu den Kontrollen. Die 14:0-ACP-Hydrolyse erhöht sich ebenfalls, aber in einem kleineren Maßstab, was mit den Enzymspezifitätsdaten von transformierten E. coli-Zellen übereinstimmt.
Eine Gesamtfettsäureanalyse von reifen A. thaliana-Samen ergab bis zu 5% Laurat in Pflanzen, welche mit den oben beschriebenen Konstrukten transformiert wurden, verglichen mit 0% Laurat, gemessen in Samen von Kontrollpflanzen. 2 zeigt, daß der Prozentsatz an Laurat direkt mit der Lauroyl-Thioesterase-Aktivität in transgenen Samen korreliert. Der Myristatgehalt in transgenen Samen erhöht sich ebenfalls von 0,1 % (Kontrolle) auf bis zu 0,7% in den Pflanzen mit der höchsten Expression und korreliert auch mit der Myristoyl-Thioesterase-Aktivität. Eine Triglyceridanalyse mittels Dünnschichtchromatographie (TLC) zeigt, daß das durch die Gesamtfettsäureanalyse nachgewiesene Laurat in der neutralen Lipidfraktion vorliegt, was darauf hinweist, daß das Laurat in Triglyceride eingebaut (verestert) wird.
Reife Samen von A. thaliana-Pflanzen, transformiert mit pCGN3828, wurden mittels GC auf die Gesamtfettsäuren untersucht, im wesentlichen wie beschrieben durch Browse et al. (Anal. Biochem. 152 (1986), 141–145), wie in Beispiel 2 ausführlich dargelegt ist. Diese Untersuchungen zeigen mindestens eine Pflanze auf, 3828-13, deren Samen bis zu etwa 17 Gew.-% (23,5 Molprozent) Laurat enthalten. Reife Samen dieser transformierten Pflanze werden einem Verdauungsprotokoll mit Lipase aus der Bauchspeicheldrüse unterzogen (Brockerhoff, Meth. Enzymol. 35 (1975), 315–325), um Acylzusammensetzungen der sn-2- und sn-1+3 (kombiniert)-Positionen zu unterscheiden. Vorläufige Ergebnisse dieser Analysen sind wie folgt:
Diese vorläufigen Ergebnisse legen nahe, daß mittelkettige Fettsäuren wirksam in die sn-1- und/oder sn-3-Positionen des Triglyceridmoleküls eingebaut werden. (Eine weitere Besprechung dieser Technik wird nachstehend vorgesehen.)
In einem anderen Experiment wurden von 26 pCGN3828-transformierten Arabidopsis-Pflanzen, welche auf eine 12:0-ACP-Thioesterase-Aktivität getestet worden waren, sieben als positiv getestet. Das Vorhandensein von "Transformanten", welche bezüglich einer Laurat-Expression negativ sind, ist nicht überraschend, da die Arabidopsis-Transformationsmethode keine Selektion im Bewurzelungsstadium einschließt. Folglich wäre zu erwarten, daß Laurat-negative Pflanzen nichttransformierte "Kulturflüchtlinge" sowie transformierte Pflanzen, welche das Lorbeerbaum-Thioesterase-Gen nicht exprimieren, einschließen. Die Analyse reifer Samen (Pools von 100 Samen) von diesen sieben positiven Pflanzen zeigt; daß die positiven Pflanzen erhebliche Mengen an 12:0 enthalten, welches in Kontrollen fehlt. Die Mengen an 12:0 reichten von 2,1 bis 23,5 Molprozent und korrelieren annähernd mit der Thioesterase-Aktivität. Die Gesamtfettsäuregehalte der Samen liegen innerhalb des Bereiches, welcher typischerweise bei Arabidopsis beobachtet wird, was nahelegt, daß die 12:0-Ablagerung die Ölausbeute nicht ungünstig beeinflußt. Es werden keine offensichtlichen Effekte auf die Samenentwicklung oder -morphologie beobachtet. Eine Lipidklassenanalyse (TLC) zeigt, daß die Triglyceridfraktion den gleichen Anteil an Laurat wie die extrahierbaren Fettsäuren insgesamt enthält, d.h. in diesen Anteilen wird das 12:0 ohne weiteres in das Triglycerid eingebaut.
Eine geringe Menge an 14:0 reichert sich auch in transgenen Arabidopsis-Samen an. Das Verhältnis von 12:0- zu 14:0-Fettsäuren in den Samen entspricht dem Verhältnis der in vitro-Thioesterase-Alttivitäten für 12:0-ACP und 14:0-ACP. Das nahezu konstante Verhältnis zwischen den 12:0- und 14:0-Produkten spiegelt vermutlich die Spezifität der Lorbeerbaum-Thioesterase für 12:0-ACP und 14:0-ACP wieder und deutet auf eine Enzymfunktion in vivo in den transgenen Samen durch direkte Einwirkung auf Pools ähnlicher Größe von 12:0-ACP und 14:0-ACP hin. Die Lorbeerbaum-Thioesterase scheint keine signifikante Wirkung auf 10:0-ACP in vitro zu haben, und es werden nur geringe Spuren an 10:0 in den transgenen Samen nachgewiesen.
Weitere Studien wurden durchgeführt, um zu bestimmen, ob die mittelkettigen Fettsäuren auf Kosten von sämtlichen oder nur einigen der "nativen" Arabidopsis-Fettsäuren synthetisiert wurden. Die durchschnittliche Fettsäurezusammensetzung von 100 reifen Samen einer Kontroll-Arabidopsis-Pflanze wurde mit derjenigen der transgenen Pflanze 3828-13 verglichen. Die Ergebnisse dieser Studien sind in 9 gezeigt. Die Unterschiede bezüglich der 12:0- und 14:0-Gehalte der zwei Pflanzen sind eindeutig, aber Unterschiede hinsichtlich des Gehalts an anderen Fettsäuren als Ergebnis einer mittelkettigen Produktion sind schwieriger zu identifizieren. Die Gesamtfettsäuregehalte variierten zwischen Arabidopsis-Pflanzen erheblich, was den Vergleich von absoluten Fettsäureanteilen sehr schwierig macht. Das Ausdrücken der Daten als Prozentsätze (Gesamtfettsäuren = 100), um diese Unterschiede zu eliminieren, rief weitere Unterschiede bei der Interpretation hervor.
Folglich wurde ein Weg für die Unterscheidung einzigartiger Fettsäurezusammensetzungen von einer typischen Variation zwischen Pflanzen wie folgt erdacht. Die Gesamtfettsäuregehalte reifer (T2) Samen von den 26 T1-Arabidopsis-Pflanzen wurden in zunehmender Reihenfolge geordnet und ergaben eine gleichmäßige Verteilung der Werte, wie in 10A gezeigt. Die sechs größten Laurat-Erzeuger sind zusammen mit den entsprechenden Gew.-%-12:0-Daten durch Pfeile angegeben. Es scheint keine Beziehung zwischen den Anteilen an der 12:0-Produktion und dem Gesamtfettsäuregehalt zu geben. In 10B sind die Daten in der gleichen Weise geordnet dargestellt, aber für drei einzelne Fettsäuren. Die Daten für 18:2 und 16:0 bilden auch eine gleichmäßige Linie, ausgenommen für die positiven Ereignisse, bei denen sich Laurat anreicherte. In solchen Fällen blieb der Gehalt an 18:2 und 16:0 merklich hinter dem Gesamttrend zurück, was zeigt, daß 12:0 in solchen Samen auf Kosten von 18:2 und 16:0 produziert wurde. Dies traf auch für 18:1, 20:1 und 20:2 zu. Der einzige wichtige Fettsäurebestandteil, welcher durch die 12:0-Produktion relativ unbeeinflußt zu sein scheint, war 18:3, wie in 10B gezeigt, obwohl Kontrollen mit geringem 18:3 gefunden werden können, zum Beispiel in Pflanze 10.
B. Brassica
Samen von Brassica napus-Pflanzen, transformiert mit pCGN3816, werden auch auf die Gesamtfettsäuren mittels GC untersucht, wie oben beschrieben. Die Analyse einzelner segregierender Samen von transformierten Pflanzen (T1-Pflanzen) ergab Anteile an C12:0 im Bereich von Null bis 14,5%, verglichen mit Null Prozent in Samen von nichttransformierten Kontrollpflanzen. Die C12:0-Anteile korrelieren mit den C12:0-ACP-Thioesterase-Aktivitäten in korrespondierenden unreifen Samen, wie in 7 gezeigt. Außerdem wird C14:0 auch in diesen Samen in Anteilen nachgewiesen, welche mit denen von C12:0 korrelieren, obwohl die C14:0-Anteile geringer sind.
Geringfügige Modifikationen können bei dem GC-Temperaturprogramm, das zur Analyse der Laurat enthaltenden TAG-Fraktion verwendet wird, durchgeführt werden. Ein weiterer nützlicher Temperaturwechsel ist wie folgt: 160°C für 3 Minuten, gefolgt von einer Temperaturerhöhung von 5 Grad pro Minute auf eine Endtemperatur von 240°C. welche für 6 Minuten aufrechterhalten wird, dies ergibt eine Gesamtlaufzeit von 26 Minuten.
Transformierte Brassica napus-Pflanzen_; enthaltend die pCGN3824 (Napin/Thioesterase)- und pCGN3828 (Napin/Thioesterase/Napin)-Konstrukte, wurden untersucht, um die Fettsäurezusammensetzung der Samen zu bestimmen. Vereinigte Samen von 34 Pflanzen, transformiert mit pCGN3824, und 31 Pflanzen, transformiert mit pCGN3828, wurden analysiert (25–50 Samen pro Test), um die Bereiche der Lauratanteile in den Samen zu bestimmen. Die Ergebnisse dieser Analysen, dargestellt als die Anzahl der transgenen Ereignisse, welche einen bestimmten Prozentsatz an Laurat ergeben, sind in 11 dargestellt. Die pCGN3824-Transformanten wiesen Lauratgehalte im Bereich von 0 bis 11 Molprozent auf, mit Ausnahme einer einzigen Pflanze, deren Samen 17 Molprozent Laurat enthielten. Die Pflanzen mit dem pCGN3828-Konstrukt wiesen Lauratgehalte im Bereich von 1 bis 17 Molprozent auf, wobei zwei Vertreter mit 37 Molprozent Laurat (Pflanze 3828-23) und mit 27 Molprozent Laurat (Pflanze 3828-35) außerhalb dieses Bereiches lagen. Es wird angemerkt, daß die Samenöle dieser Pflanzen zusätzlich zu dem Laurat auch geringe Mengen an C14:0-Fettsäuren aufweisen, welche etwa 16% der Lauratanteile entsprechen.
Eine Analyse der Hälfte der Samen wird auch verwendet, um die Lauratanteile in reifen Samen von transformierten Pflanzen zu bestimmen. Für die Analyse der Hälfte der Samen werden die Samen auf eine befeuchtete (2–3 ml Wasser) Filterpapierscheibe in einer Petrischale gelegt, welche luftdicht verschlossen und im Dunkeln für 20 bis 48 Stunden bei Raumtemperatur oder 30°C stehen gelassen wird. Zum Keimen gebrachte Samen besitzen 2–5 mm große Keimwurzeln, welche aus den Samenschalen hervortreten. Feine Pinzetten werden verwendet, um jeden Sämling aus seiner Schale zu entnehmen und die äußeren Kotyledone abzuzupfen. Die präparierten Kotyledonen werden in 4 ml-Fläschchen eingebracht und vor der Fettsäureanalyse für 2–12 Stunden in einem 110°C-Ofen getrocknet. Die präparierten Sämlinge werden direkt in Eintopferde in 12er-Pack-Behältern eingepflanzt, besprüht, mit transparenten Kunststoffdeckeln abgedeckt, in eine Wachstumskammer bei 22°C mit einer Lichtintensität von 150–200 Mikroeinstein, m^–2s^–1, bei einer 16h/8h-Lichtperiode gebracht und wachsen gelassen, um T2-Pflanzen (Transformanten der zweiten Generation) zu erzeugen. Alternativ kann die Analyse der Hälfte der Samen unter Verwendung eines abgelösten Teils eines reifen Samens durchgeführt werden. Die Samen werden unter ein Präpariermikroskop gehalten, und ein Stückchen von etwa 30% des Samens wird entfernt, wobei die Embryonenachse vermieden wird. Das Samenstückchen wird zur Fettsäureanalyse mittels Gaschromatographie verwendet, und der restliche Samenteil wird in Wasser für 5–7 Tage in einer Mikrotiterschale zum Keimen gebracht, in Erde eingepflanzt und zur Erzeugung von T2-Samen gezüchtet. Ein Diagramm, welches die Fettsäurezusammensetzung als Molprozent der Gesamtfettsäuren von 15 repräsentativen halben pCGN3828-23-Samen angibt, ist in Tabelle 4A gezeigt. Ähnliche Daten einzelner Samen, gesammelt von nichttransformierten, regenerierten Kontrollpflanzen, sind in Tabelle 4B gezeigt. Die Daten stammen von einer GC-Analyse der Hälfte der Samen, wie oben beschrieben.
Der Lauratgehalt von 144 getesteten, halben pCGN3828-35-Samen (T2-Samen, erhalten von einer T1-Pflanze) reichte von 4 bis 42 Molprozent. Der Lauratgehalt von 214 getesteten, halben pCGN3828-23-Samen reichte von 12 bis 50 Molprozent. Keiner der Samen, welche von entweder den pCGN3828-23- oder den pCGN3828-35-Pflanzen analysiert wurden, wies Null Prozent Laurat auf, was statistisch zeigt, daß diese Transformanten drei oder mehr Thioesterase-Insertionen in ihr Genom inseriert haben. Die Analyse von Samen, welche durch die T2-Generation erzeugt werden, wird dieses Ergebnis weiter bestätigen. Außerdem zeigen Analysen unter Verwendung von etwa 60 halben Samen der pCGN3828-Transformanten mit 10–20 Molprozent Laurat in ihren Samen, daß diese Pflanzen 1–2 Insertionen des Lorbeerbaum-Thioesterase-Gens besitzen.
Um das Schicksal des Laurats in transgenen Brassica napus-Samen zu untersuchen, wurden die Fettsäurezusammensetzungen verschiedener Lipidklassen, extrahiert aus reifen transgenen Samen von zwei transgenen Pflanzen, pCGN3828-23 und pCGN-3828-7, untersucht. Die TLC-Analyse der Phospholipide zeigt, daß nahezu 100% des Laurats in der Triacylglycerid (TAG)-Fraktion vorliegen. Analysen der Acylzusammensetzungen der sn-2- und sn-1+3-Positionen der TAG wurden durch das Protokoll unter Verwendung einer Lipase aus der Bauchspeicheldrüse (Brockerhoff (1975), a.a.O.) durchgeführt. Idealerweise spaltet die Lipase bei diesem Protokoll die Fettsäuren an den sn-1- und sn-3-Positionen und nicht an der sn-2-Position. Folglich sind die Fettsäuren in dem erhaltenen Monoglycerid vermutlich diejenigen in der sn-2-Position. Erste Untersuchungen der TAG-Fraktion in den Laurat-Transformanten nach dieser Methode zeigen, daß C12:0-Fettsäuren nicht in der sn-2-Position eingebaut werden. Jedoch ist anzumerken, daß Forscher, welche früher versuchten, TAG-Fraktionen von Fettsäuren kürzerer Kettenlänge nach dieser Methode zu untersuchen (Entressangles et al., Biochim. Biophys. Acta 84 (1964), 140-148), berichteten, daß Fettsäuren kürzerer Kettenlänge, welche sich an der sn-2-Position befinden, während einer solchen Spaltung schnell hydrolysiert wurden, wobei die Autoren berichteten, daß dies das Ergebnis einer spontanen Wanderung von internen Fettsäuren kürzerer Kettenlänge zu den äußeren Positionen in Diglyceriden und Monoglyceriden ist.
Weitere Analysen von transformierten Pflanzen, enthaltend das pCGN3828-Konstrukt, werden durchgeführt, um die Expression der Lorbeerbaum-Thioesterase in diesen Pflanzen weiter zu charakterisieren. Die extrahierbare C12:0-Thioesterase-Aktivität in keimenden Samen von pCGN3828-23-Transformanten wird gemessen, und es wird ein Wert bestimmt, welcher erheblich höher als die endogene 18:1-Thioesterase-Aktivität ist. Im Hinblick auf die hohe Lorbeerbaum-Thioesterase-Aktivität in transgenen Pflanzen werden weitere Faktoren zur Optimierung der Lauratproduktion untersucht.
Das Vorhandensein der prozessierten (34 kD) Lorbeerbaum-Thioesterase in transformierten 3828-23-Pflanzen wird mittels Western-Analyse des zeitlichen Verlaufs der Entwicklung von Samen aus dieser Pflanze untersucht. Die Experimente werden unter Verwendung eines polyclonalen Antikörpers gegen Lorbeerbaum-Thioesterase und eines Biotin-markierten Sekundärantikörpers durchgeführt. Diese Studien zeigen, daß ein wichtiges Samenspeicherprotein in Brassica mit der gleichen Beweglichkeit wie die Lorbeerbaum-Thioesterase wandert, was eine unspezifische Hintergrundfärbung hervorruft. Jedoch wird eine Bande mit einem scheinbaren Molekulargewicht von etwa 42 kD, welche mit dem Lorbeerbaum-Antikörper reagiert, in transformierten, Laurat produzierenden Pflanzen nachgewiesen. Dieses scheinbare Molekulargewicht stimmt mit demjenigen der nichtprozessierten Lorbeerbaum-Thioesterase überein.
Andere Western-Nachweismethoden werden untersucht, um die unspezifische Hintergrundfärbung zu reduzieren. Zum Beispiel ergibt eine zweite Antikörper-Methode, wobei der Sekundärantikörper an alkalische Phosphatase gekoppelt ist, eine reduzierte Hintergrundfärbung. Die Anreicherung der Lorbeerbaum-Thioesterase ist bei geringen Anteilen am Tag 24 nach der Bestäubung nachweisbar, wobei starke Signale in Samen an den Tagen 30–40 nach der Bestäubung beobachtet wurden. Erste Ergebnisse deuten darauf hin, daß der größte Teil des Signals auf das nichtprozessierte 42 kD-Prä-Protein zurückzuführen ist, wobei nur 10–20% des Thioesterase-Antigens bei 34 kD wandern. Diese Studien legen nahe, daß das ungewöhnliche Transportpeptid der Lorbeerbaum-Thioesterase eine Plastid-Hinleitung in Brassica zur Folge haben kann, welche nicht optimal ist.
Die RNA-Analyse des obigen zeitlichen Verlaufs der Entwicklung der Samenproben zeigt, daß die Napin-gesteuerte Lorbeerbaum-Thioesterase-mRNA sich mit der gleichen Kinetik wie die gesamte endogene Napin-Information bei einer maximalen Transkription im Bereich von 27–50 Tagen anreichert. Folglich bleibt die Lorbeerbaum-Thioesterase-Aktivität um etwa 5–7 Tage hinter dem Einsetzen der Speicherölsynthese zurück, und die frühere Expression der Lorbeerbaum-Thioesterase kann einen wesentlichen Einfluß auf die Gesamtlauratanteile in reifen Samen haben. Eine Northern-Analyse von ACP- und Stearoyl-ACP-Desaturase-Transkripten in den obigen Samenproben zeigt, daß die nativen Transkripte dieser Gene sich 3–5 Tage früher als das Lorbeerbaum-Thioesterase-Transkript, welches durch den Napin-Promotor hergestellt wird, anreichern. Diese Daten legen nahe, daß die ACP- und Stearoyl-ACP-Desaturase-Gen-Promotoren für die frühere Expression des Lorbeerbaum-Thioesterase-Gens nützlich sein können. Die Clonierung einer cDNA für eine Stearoyl-ACP-Desaturase aus Brassica rapa und einer Promotorregion für ACP aus B. rapa sind beschrieben worden (Knutzon et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 89 (1992), 2624–2628; Scherer et al., Plant Mol. Biol. 18 (1992), 591–594).
Transformierte Arabidopsis-Pflanzen, enthaltend ein Konstrukt (pCGN3836) mit dem 1,2 kb-Fragment des Lorbeerbaum-Thioesterase-Gens, welches zur Expression durch eine etwa 1,5 kb große Region des ACP-Promotors aus B. rapa positioniert ist, und etwa 0,3 kb einer 3'-regulatorischen Napin-Region, sind erhalten worden. Eine erste Analyse der Samen von den pCGN3836-transformierten Pflanzen auf den Lauratgehalt zeigt, daß sich das Laurat nicht in nachweisbaren Mengen in diesen Samen anreichert. Jedoch ist es möglich, daß, wenn der Expressionszeitpunkt und die Hinleitung der Lorbeerbaum-Thioesterase in transgenen Brassica-Samen optimiert werden, durch eine geringe Menge an Thioesterase eine sehr große Menge an Laurat herstellt wird, wie es anscheinend im Lorbeerbaum der Fall ist, und eine geringere Expressionsrate der Lorbeerbaum-Thioesterase ausreichend sein kann.
Beispiel 5 – Erhalt anderer pflanzlicher Thioesterasen
A. Weitere Quellen für pflanzliche Thioesterasen
Zusätzlich zu den in den vorherigen Beispielen identifizierten Lorbeerbaum- und Färberdistel-Thioesterasen sind andere Pflanzen Quellen für wünschenswerte Thioesterasen, welche unterschiedliche Spezifitäten im Hinblick auf die Fettacylkettenlänge und/oder den Sättigungsgrad besitzen. Solche zusätzlichen pflanzlichen Thioesterasen können durch Analyse der Triacylglyceridzusammensetzung von verschiedenen Pflanzenölen und das Vorhandensein einer spezifischen Thioesterase, bestätigt durch Tests unter Verwendung des geeigneten Acyl-ACP-Substrats, identifiziert werden.
Andere Pflanzen, welche wünschenswerte Thioesteraseenzyme besitzen können, schließen Ulme (Ulmaceae) und Kampfer (Cinnamomum camphora) ein. Ein signifikanter Prozentsatz an 10:0-Fettsäuren wird in Samen der Ulme nachgewiesen, und sowohl 10:0- als auch 12:0-Fettsäuren überwiegen in Samen von Kampfer. Die Ergebnisse biochemischer Assays zum Testen auf eine Thioesterase-Aktivität in sich entwickelnden Embryonen von Kampfer und Ulme sind nachstehend in Tabelle 5 dargestellt. Tabelle 5
Bei der Ulme wird zusätzlich zu der signifikanten Aktivität bei längerkettigen Substraten ein Peak einer Thioesterase-Aktivität für das C10:0-ACP-Substrat beobachtet. Dieser Hinweis legt nahe, daß eine Thioesterase mit einer spezifischen Aktivität für das C10:0-ACP-Substrat in Embryonen der Ulme vorhanden ist. Eine signifikante Aktivität für das C12:0-ACP-Substrat wird in Kampferextrakten nachgewiesen. Außerdem zeigen Kampferextrakte eine größere Aktivität für C10:0-ACP-Substrate als ähnliche Extrakte aus Embryonen des Lorbeerbaums. Dieser Hinweis legt nahe, daß eine mittelkettige Acyl-ACP-Thioesterase mit einer Spezifität für C10:0-ACP- und C12:0-ACP-Substrate in Embryonen von Kampfer vorhanden ist.
In ähnlicher Weise kann auch eine längerkettige Fettacyl-Thioesterase (C16 oder C18) erhalten werden. Zum Beispiel ist ein signifikanter Prozentsatz (45%) an 16:0-Fettsäuren in der Talgschicht der Samen des Chinesischen Kerzenbaums (Sapium sebiferum) und in dem Samenöl von Baumwolle (Gossypium hirsutum) zu finden (Gunstone, Harwood und Padley, Hrsg., The Lipid Handbook (1986), Chapman und Hall, Ltd., The University Press, Cambridge).
Jeweils etwa 250 mg eines sich entwickelnden Gewebes des Chinesischen Kerzenbaums, von Embryonen der Baumwolle (Var. Stoneville 506; Tag 21 nach der Blüte) oder von Embryonen von Brassica napus (Cv. Delta; Tag 28 nach der Blüte) werden in einem Mörser mit einem Stößel unter Flüssigstickstoff zu einem feinen Pulver zermahlen und durch Homogenisieren in 1 ml 50 mM Natriumphosphat, pH 7,5, 2 mM Dithiothreit, 2 mM Natriumascorbat, 20% Vol./Vol. Glycerin, 1% Gew./Vol PVP-10 und 5 mM Diethyldithiocarbamat in einem Glas-Homogenisator mit einem motorisch betriebenen Stößel extrahiert. Das Homogenat wird in einem Mikrozentrifugenröhrchen für 15 min zentrifugiert, und Aliquots der Überstandsfraktion werden wie folgt auf eine Thioesterase-Aktivität getestet.
25 μl einer 1/20-Verdünnung des Überstands in Testpuffer (7 mM Kaliumphosphat, pH 8,0, 20% Vol./Vol. Glycerin, 0,02% Gew./Vol. Triton X-100, 1 mM Dithiothreit) werden zu 70 μl Testpuffer in einem Glasfläschchen mit Schraubverschluß zugegeben. 50 pmol [¹⁴C]-radiomarkiertes Acyl-Substrat werden zugegeben, um die Reaktion einzuleiten. Die Substrate sind Myristoyl-ACP (14:0-ACP), Palmitoyl-ACP (16:0-ACP), Stearoyl-ACP (18:0-ACP) oder Oleoyl-ACP (18:1-ACP), synthetisiert, wie für Lauroyl-ACP bei Pollard et al., a.a.O., beschrieben. Die Fläschchen werden für 30 min bei 30°C inkubiert. Die Umsetzungen werden mit Essigsäure gestoppt, und freie Fettsäuren werden mit Ether durch Zugabe von 0,5 ml 10%iger (Vol./Vol.), kalter (4°) Essigsäure und Stellen des Reaktionsgemisches auf Eis für wenige Minuten extrahiert. Das Fettsäureprodukt der Wirkung des hydrolytischen Enzyms wird aus dem nicht-hydrolysierten Substrat durch Zugabe von 2 ml Diethylether und kräftiges Mischen extrahiert. Der Ether wird in 5 ml Szintillationsflüssigkeit für eine Szintillationszählung überführt. Weitere Etherextraktionen können gegebenenfalls durchgeführt werden, um restliche Produktspuren für eine genauere Quantifizierung der Aktivität zu gewinnen.
Die Substratspezifität-Analysenergebnisse für Baumwolle, den Chinesischen Kerzenbaum und Brassica sind in Tabelle 6 gezeigt. Tabelle 6
Ein Aktivitätspeak wird bei dem 16:0-ACP-Substrat sowie bei dem 18:1-ACP-Substrat bei sowohl Baumwolle als auch dem Chinesischen Kerzenbaum beobachtet, während das Brassica-Samenprofil nur eine signifikante Aktivität bei dem 18:1-ACP zeigt. Es scheint, daß eine Acyl-ACP-Thioesterase mit einer Spezifität für 16:0-Fettacyl-ACP zur Triacylglyceridzusammensetzung des Chinesischen Kerzenbaums und der Baumwolle beiträgt.
Zwei Peaks einer Thioesterase-Aktivität werden bei Extrakten von Embryonen der Baumwolle beobachtet, welche auf Heparin-Agarose einer Chromatographie unterzogen wurden. Es ist gezeigt worden, daß diese Chromatographie zwei verschiedene Thioesterasen trennt: eine 12:0-ACP-Thioesterase und eine 18:1-Thioesterase aus Extrakten des Lorbeerbaums (Pollard et al., Arch. Biochem. Biophys. 284 (1991), 306–312). Von den zwei Aktivitätspeaks, welche bei der Chromatographie von Baumwollextrakten beobachtet werden, besitzt der erste eine 18:1-Aktivität, welche höhere als die 16:0-Aktivität ist, und der zweite Peak besitzt eine 16:0-Aktivität, welche höhere als die 18:1-Aktivität ist. Die Daten weisen auf das Vorhandensein von zwei Enzymen mit unterschiedlichen Spezifitäten in der Baumwolle hin.
Zusätzlich enthält das Kernöl der Mango (Mangifera indica) 24–49% Stearinsäure und 6–18% Palmitinsäure in den Triacylglycerinen, und es vorgeschlagen worden, dieses Öl ist als einen Kakaobutter-Ersatzstoff zu verwenden (Osman S.M., "Mango Fat", in New Sources of Fats and Oils (1981), Hrsg. Pryde E.H., Princen L.H. und Mukherjee K.D., American Oil Chemists Society). Ähnlich zu den oben beschriebenen Beispielen kann eine Thioesterase mit einer 18:0-ACP-Spezifität durch einen biochemischen Test von Embryoextrakten nachgewiesen werden.
B. Isolierung von Thioesterase-Genen
Durch Erhalt der Sequenz (Aminosäure und DNA) für die Lorbeerbaum- und Färberdistel-Thioesterase können ähnliche Gene aus anderen pflanzlichen Quellen, wie die oben identifizierten, ohne weiteres isoliert werden. In diesem Beispiel werden zwei Verfahren zur Isolierung von anderen Thioesterase-Genen beschrieben: (1) mittels DNA-Hybridisierungstechniken unter Verwendung von Sequenzen oder einer Peptidsequenz information aus dem Lorbeerbaum- und Färberdistel-Thioesterase-Gen, und (2) durch immunologische Kreuzreaktivität unter Verwendung von Antikörpern gegen das Lorbeerbaum-Protein als eine Sonde.
Bei jeder dieser Techniken sind cDNA- oder genomische Banken der gewünschten Pflanzen erforderlich. Viele Methoden zur Konstruktion von cDNA- oder genomischen Banken sind zum Beispiel in Kapitel 8 und 9 von Maniatis et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite Auflage (1989), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) angegeben.
Sonden zur Verwendung bei DNA-Hybridisierungen zur Isolierung von anderen pflanzlichen Thioesterase-Genen können aus den bereitgestellten Thioesterase-Gensequenzen des Lorbeerbaums und der Färberdistel oder alternativ mittels PCR unter Verwendung von Oligonucleotiden aus Thioesterase-Peptidsequenzen erhalten werden.
In diesem Beispiel wird ein mittels PCR erzeugtes DNA-Fragment als eine Sonde verwendet. Eine Northern-Analyse von Embryo-RNA aus der gewünschten Pflanzenart wird durchgeführt, um geeignete Hybridisierungsbedingungen festzulegen. Die RNA wird auf einem Formaldehyd/Agarose-Gel einer Elektrophorese unterworfen und auf einen Nylonmembranfilter übertragen, wie durch Fourney et al. (Focus 10 (1988), 5–7, Bethesda Research Laboratories/Life Technologies, Inc.) beschrieben. Eine ³²-P-markierte Sonde (Random Primed DNA Labeling Kit, Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) wird zu einer Hybridisierungslösung, enthaltend 50% Formamid, 6× SSC (oder 6× SSPE), 5× Denhardt-Reagens, 0,5% SDS und 100 μg/ml denaturierte Lachssperma-DNA-Fragmente, zugegeben.
Die Hybridisierungslösung, welche die markierte Sonde enthält, wird mit dem Northern-Filter bei etwa 40°C für 18 Stunden oder länger inkubiert, um die Hybridisierung der Sonde mit homologen (50–80%) Sequenzen zu ermöglichen. Der Filter wird dann bei niedriger Stringenz (Raumtemperatur bis 42°C in etwa 1× SSC) gewaschen. Die Hybridisierungs- und Waschtemperaturen können basierend auf der abgeschätzten Schmelztemperatur der Sonde angepaßt werden, wie bei Beltz et al. (Methods in Enzymology 100 (1983), 266–285) besprochen ist. In weiteren Experimenten kann die Temperatur entweder in den Hybridisierungs- oder den Waschschritten erhöht werden, und/oder der Salzgehalt wird verringert, um den Nachweis der spezifischen, hybridisierenden Sequenz zu verbessern.
Eine nützliche Sonde und geeignete Hybridisierungs- und Waschbedingungen sind identifiziert worden, wie oben beschrieben. cDNA-Banken werden unter Verwendung des ³²P-markierten Fragments und optimierten Bedingungen durchmustert.
Zum Beispiel wird ein 600 bp großes BamHI/XhoI-Fragment des Thioesterase-Clons pCGN3263 radiomarkiert und als eine heterologe Sonde verwendet, um einen Thioesterase-Clon aus einer Embryo-cDNA-Bank von B. campestris zu isolieren. Die DNA-Sequenz eines Thioesterase-cDNA-Clons aus Brassica ist zusammen mit der translatierten Aminosäuresequenz beginnend bei dem angenommenen ATG-Startcodon in
6 dargestellt. Weitere Brassica-Clone, welche einige Variationen in der DNA-Sequenz zeigen, werden auch analysiert.
Zusätzlich zu direkten Hybridisierungstechniken unter Verwendung von heterologen Thioesterase-Genen als Sonden können auch PCR-Techniken angewendet werden, um Sonden für die Hybridisierung zu erzeugen oder um Thioesterase codierende Sequenzen von mRNA oder DNA aus der gewünschten pflanzlichen Quelle zu erzeugen. Zum Beispiel kann ein Thioesterase-Clon von Kampfer (Cinnamomum camphora) unter Verwendung der Nucleinsäure- und Aminosäuresequenzinformation aus den Lorbeerbaum- und Färberdistel-Thioesterase-Clonen isoliert werden. Die Homologie des Thioesterase-cDNA-Clons des Lorbeerbaums zu der RNA, welche aus sich entwickelnden Kampfer-Embryonen isoliert wurde, wird wie folgt mittels einer Northern-Analyse beobachtet. Die gesamte RNA wird aus 1 g der sich entwickelnden Kampfer-Embryonen durch Anpassung der SDS/Phenol-Extraktionsmethode, beschrieben in Current Protocols in Molecular Biology, Seiten 4.3.1–4.3.4 (Ausubel et al., Hrsg. (1987); John Wiley & Sons), isoliert. Der Pulverisierungspuffer für diese Extraktion enthält 100 mM LiCl, 100 mM Tris, pH 9, 10 mM EDTA, 1% SDS und 0,5%_– Mercaptoethanol. Zur Extraktion aus 1 g Embryonen werden 10 ml Pulverisierungspuffer plus 3 ml Phenol, äquilibriert auf pH 8, zu den pulverisierten Embryonen zugegeben. Der Homogenisierungsschritt kann in einem Mörser anstatt mit einem Polytron, wie bei der veröffentlichten Methode beschrieben, durchgeführt werden, und der Erwärmungsschritt, welcher sich bei dieser Methode an die Homogenisierung anschließt, wird weggelassen. Die Zentrifugation, die Phenol/Chloroform-Extraktionen der Probe und die LiCl-Fällung der RNA sind wie beschrieben.
Die gesamte RNA (10–20 μg) wird auf einem Formaldehyd/Agarose-Gel einer Elektrophorese unterzogen und auf einen Nylonmembranfilter übertragen, wie durch Fourney et al. (a.a.O.) beschrieben. Eine Sonde zur Hybridisierung des Northern-Filters wird aus einem SalI-Spaltprodukt von pCGN3822, das die Lorbeerbaum-Thioesterase-cDNA vollständiger Länge enthält, mittels PCR unter Verwendung von Oligonucleotiden für die Färberdistel-Thioesterase-cDNA-Sequenz hergestellt, um ein etwa 1300 bp großes Fragment zu erzeugen. Der Vorwärtsprimer enthält die Nucleotide 212 bis 228 der Färberdistel-Thioesterase-cDNA-Sequenz (SEQ ID Nr.: 3 8), und der Rückwärtsprimer ist der Komplementärstrang zu den Nucleotiden 1510–1526 der cDNA-Sequenz. Das Fragment wird unter Verwendung eines Präp-A-Gen-DNA-Reinigungskits (Bio-Rad; Richmond, CA) auf einem Gel gereinigt und unter Verwendung eines Zufallsprimer-Markierungskits von Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN) radiomarkiert. Der Northern-Filter wird über Nacht in 50% Formamid, 5× SSC, 50 mM Natriumphosphat (pH 7), 5× Denhardt-Lösung, 0,1% SDS, 5 mM EDTA und 0,1 mg/ml denaturierte DNA bei 30°C hybridisiert. Der Filter wird zweimal (15 Minuten bei jedem Waschen) in 0,1× SSC, 0,1 % SDS gewaschen. Eine Autoradiographie des hybridisierten Filters ergab ein starkes Hybridisierungssignal mit einer etwa 1300 bp großen RNA-Bande in der Kampfer- Embryoprobe. Diese Bande weist etwa die gleiche Größe wie die Lorbeerbaum-Thioesterase-mRNA auf.
Um ein Fragment des Kampfer-Thioesterase-Gens zu erhalten, wird eine PCR unter Verwendung von Oligonucleotiden für Peptide, welche zwischen den Lorbeerbaum- und Färberdistel-Thioesterasen konserviert sind, durchgeführt. Ein Vergleich der translatierten Aminosäuresequenz der Färberdistel- und der Lorbeerbaum-Thioesterase ist in 8 gezeigt.

Polymerasekettenreaktionen werden unter Verwendung der umgekehrt transkribierten Kampfer-RNA als Matrize durchgeführt. Die Reaktionen werden in einem Biosycler-Ofen (Bios Corp.; New Haven, CT) ausgeführt, welcher für die folgenden Zyklen programmiert ist:

N	P
95°C für 2 min	95°C für 15 sec
1 sec Abfall auf 65°C	1 sec Abfall auf 65°C
Halten bei 65°C für 1 sec	Halten bei 65°C für 1 sec
2 min Abfall auf 45°C	2 min Abfall auf 55°C
Halten bei 45°C für 30 sec	Halten bei 55°C für 15 sec
1 sec Erhöhung auf 72°C	1 sec Erhöhung auf 72°C
Halten bei 72°C für 30 sec	Halten bei 72°C für 15 sec
1 sec Erhöhung auf 95°C	1 sec Erhöhung auf 95°C

Der Zyklus N wird ausgeführt und 6mal wiederholt, danach wird Zyklus P ausgeführt und 37mal wiederholt.
Eine etwa 500–600 bp große Bande wird mittels Agarosegelelektrophorese der PCR-Produkte identifiziert. Dies ist die ungefähre Fragmentgröße, welche aus der Analyse des Abstands zwischen den Peptiden in der Lorbeerbaum-Thioesterase-Sequenz vorhergesagt wurde. Das PCR-Fragment wird in einen geeigneten Clonierungsvektor subcloniert und die DNA-Sequenz davon wird bestimmt, um die Thioesterase-Sequenz zu überprüfen.
Die DNA-Sequenz des Kampfer-PCR-Fragments ist in 5A dargestellt. Das Fragment kann dann zum Durchmustern einer cDNA- oder genomischen Bank von Kampfer verwendet werden, um einen Kampfer-Thioesterase-Clon zu isolieren.
Als Alternative zum Durchmustern von Genbanken können zusätzliche PCR-Techniken angewendet werden, um Sequenzen zu gewinnen, welche die vollständige Thioesterase codieren. Zum Beispiel wird die PCR-Fragmentsequenz der Kampfer-Thioesterase verwendet, um eine zusätzliche Sequenz zu erzeugen, welche die Thioesterase codiert. Für Sequenzen 3' zu dem PCR-Fragment wird das RACE-Verfahren von Frohman et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. 85 (1988), 8998–9002) angewendet. Kurz zusammengefaßt wird eine cDNA aus Kampfer-Endosperm-Poly(A)+-RNA unter Verwendung von 200 ng RNA, einem Poly(T)-Oligonucleotid (mit 5'-Restriktionserkennungsstellen für EcoRI, XhoI und SalI) und einer reversen Transkriptase erzeugt. Das Produkt dieser Reaktion wird in einer PCR-3'-RACE mit einem Oligonucleotid, welches EcoRI-, XhoI- und SalI-Erkennungsstellen codiert, und einem Oligonucleotid, welches die Nucleotide 443–463 des Kampfer-Genfragments von 5A wiedergibt, verwendet. Die Reaktion wird in einem Biosycler-Ofen mit dem folgenden Programm ausgeführt:

1 Zyklus bei: 94°C für 40 sec 50°C für 2 min 72°C für 40 min
40 Zyklen bei: 94°C für 40 sec 50°C für 2 min 72°C für 3 min

Auf diese Weise wird ein etwa 700 by großes Fragment erhalten, welches den 3'-Teil der Kampfer-Thioesterase-Gensequenz wiedergibt.
Zusätzlich kann auch die 5'-Sequenz der die Kampfer-Thioesterase codierenden Sequenz mittels PCR erhalten werden. Für diese Reaktion wird eine cDNA für die Kampfer-Endosperm-Poly(A)+-RNA unter Verwendung von Hexameroligonucleotid-Zufallsprimern in einer reversen Transkriptionsreaktion erzeugt, im wesentlichen wie durch Frohman et al. (a.a.O.) beschrieben ist. Das cDNA-Produkt dieser Reaktion wird unter Verwendung einer terminalen Desoxynucleotidtransferase mit einem A-Schwanz versehen und in einer PCR verwendet. Oligonucleotidprimer für diese Reaktion sind MET-1-2898, welcher die Nucleotide 140–155 der Lorbeerbaum-Thioesterase-Sequenz in 1A und eine 5'-BamHI-Erkennungsstelle enthält, und 2356. ein degeneriertes Oligonucleotid, enthaltend eine Sequenz, welche komplementär ist zu den Nucleotiden 115–126 des Kampfer-Thioesterase-Genfragments von 5A. Die Reaktion wird in einem Biosycler-Ofen mit dem folgenden Programm ausgeführt:

35 Zyklen bei: 94°C für 1 min 55°C für 1,5 min 72°C für 2,5 min

Auf diese Weise wird ein etwa 450 by großes Fragment erhalten, welches den 5'-Teil der Kampfer-Thioesterase-Gensequenz wiedergibt.
Die verschiedenen Kampfer-Thioesterase-Genfragmente werden in einem geeigneten Clonierungsvektor unter Verwendung von Restriktionsstellen, wie durch die PCR-Verfahren inseriert, kombiniert. Die vorläufige Nucleinsäuresequenz und die translatierte Aminosäuresequenz des auf diese Weise erzeugten Kampfer-Thioesterase-Gens sind in 5B dargestellt.
DNA-Sequenzen, welche der Cuphea-Thioesterase entsprechen, können auch mittels PCR-Verfahren erhalten werden. Degenerierte Oligonucleotide zur Verwendung als Primer können aus Peptidfragmenten konstruiert werden, welche zwischen den Lorbeerbaum-, Färberdistel- und Kampfer-Thioesterase-cDNA-Clonen konserviert sind. Der Vor wärtsprimer, TECU3, enthält 18 Nucleotide, welche allen möglichen, codierenden Sequenzen für die Aminosäuren 283–288 der Lorbeerbaum (1B)- und der Kampfer ( 5B)-Thioesterase-Proteine und den Aminosäuren 282–287 der Färberdistel-Thioesterase von 4A entsprechen. Der Rückwärtsprimer, TECU4A, enthält 17 Nucleotide, welche allen möglichen, codierenden Sequenzen für die Aminosäuren 315–320 der Lorbeerbaum (1B)- und der Kampfer (5B)-Thioesterase-Proteine und den Aminosäuren 314-319 der Färberdistel-Thioesterase von 4A entsprechen. Außerdem enthalten die Vorwärts- und Rückwärtsprimer BamHI- bzw. XhoI-Restriktionsstellen am 5'-Ende und ein Inosin-Nucleotid am 3'-Ende. Es ist berichtet worden, daß Inosinreste am 3'-Terminus die Amplifikation durch degenerierte Oligonucleotidprimer erhöhen (Batzer et al., Nucl. Acids Res. 19 (1991), 5081). Die Färberdistel-Proteine unterscheiden sich von den Lorbeerbaum- und Kampfer-Sequenzen durch eine Aminosäure in jeder der gekennzeichneten Peptidregionen, und folglich ist die Degeneration der Oligonucleotidprimer derart, daß sie sowohl die Färberdistel- als auch die Lorbeerbaum/Kampfer-Sequenzen codieren.
Proben für die Polymerasekettenreaktion (100 μl) werden unter Verwendung einer umgekehrt transkriptierten RNA aus Cuphea hookeriana als Matrize und 1 μM jedes Oligonucleotidprimers hergestellt. Die Proben werden für 5 Minuten gekocht und vor der Zugabe des Taq-Enzyms auf 75°C gekühlt. Die PCR wird in einer Perkin-Elmer Thermocycler-Vorrichtung durchgeführt, welche für den folgenden Temperaturwechsel programmiert ist:

94°C für 1 min
65°C für 1 sec
2 min Abfall auf 40°C
Halten bei 40°C für 30 sec
1 min Erhöhung auf 72°C
1 sec Erhöhung auf 94°C
Wiederholen des Zyklus 40mal.

Ein Terminationszyklus von 2 Minuten bei 72°C wird anschließend ausgeführt.
Die PCR-Produkte werden mittels Agarosegelelektrophorese analysiert, und ein etwa 120 bp großes DNA-Fragment, die vorhergesagte Größe aus den Thioesterase-Peptidsequenzen, wird beobachtet. Das DNA-Fragment wird isoliert und in einen geeigneten Plasmidvektor unter Verwendung der mittels PCR inserierten BamHI- und XhoI-Restriktionsspaltstellen cloniert. Die clonierten Fragmente werden sequenziert, und drei Clone werden identifiziert, welche mit 21 von 38 Aminosäuren der entsprechenden Lorbeerbaum-Thioesterase-Sequenz (1B) (einschließlich der 12 Aminosäuren, die durch die Primer codiert werden) übereinstimmen. Ein weiterer Vergleich eines Clons, CUPHEA-14-2, zeigt, daß die translatierte Peptidsequenz mit 25 Aminosäuren in der entsprechenden Lorbeerbaum D-Region (3), mit 22 Aminosäuren in der Kampfer-Thioesterase und mit 22 bzw. 23 Aminosäuren in den durch 2–1 und 5–2 codierten Färberdistel-Thioesterase-Sequenzen übereinstimmt. Die DNA-Sequenz des CUPHEA-14-2-Clons und die Aminosäuretranslation der die Thioesterase codierenden Region sind in 12 dargestellt. Das die Thioesterase codierende Fragment wird markiert und zum Durchmustern einer cDNA-Bank von Cuphea hookeriana verwendet, um die entsprechende Thioesterase-cDNA zu isolieren.
Analyse von Thioesterase-Sequenzen
Die durch DNA-Hybridisierung oder immunologische Screeningtechniken identifizierten Clone werden dann gereinigt, und die DNA wird mittels Techniken, wie bei Maniatis et al. (a.a.O.) vorgesehen, isoliert. Die DNA-Sequenz der Gene wird bestimmt, um zu überprüfen, ob die Clone eine verwandte Thioesterase codieren. Alternativ wird das Protein in E. coli exprimiert, um zu zeigen, daß es die gewünschte Aktivität besitzt. Die neu isolierten pflanzlichen Thioesterase-Sequenzen können auch verwendet werden, um Gene für Thioesterasen aus anderen Pflanzenarten mittels der oben beschriebenen Techniken zu isolieren.
Zum Beispiel zeigt der Vergleich von Aminosäure- und Nucleinsäuresequenzen der Lorbeerbaum-, Kampfer- und Färberdistel-Thioesterasen eine Homologie auf, welche für die Isolierung weiterer Thioesterase-Gene nützlich ist. Die Lorbeerbaum- und Kampfer-Clone zeigen eine weitgehende Homologie, insbesondere auf der Aminosäureebene. und können für die Isolierung anderer Thioesterasen mit ähnlichen kurz- oder mittelkettigen Acyl-ACP-Substratspezifitäten, wie Cuphea, Ulme, Muskat etc., nützlich sein. In ähnlicher Weise können die langkettigen Thioesterase-Gene von Färberdistel oder Brassica, welche eine signifikante Homologie aufweisen, für die Isolierung von pflanzlichen Thioesterasen mit Spezifitäten für längerkettige Acyl-ACP-Substrate nützlich sein, wie solchen, welche im Chinesischen Kerzenbaum oder in der Baumwolle mit einer Spezifität für 16:0-Fettacyl-ACP und in der Mango (18:0) identifiziert wurden.
Weiterhin zeigen Regionen der langkettigen Thioesterase-Proteine und die kurz- oder mittelkettigen, spezifischen Thioesterase-Proteine auch eine Homologie. Diese homologen Regionen können zur Konstruktion von degenerierten Oligonucleotiden zur Verwendung in einer PCR nützlich sein, um weitere pflanzliche Thioesterasen zu isolieren. Zum Beispiel, wie oben beschrieben, wurden Oligonucleotide für Lorbeerbaum- und Färberdistel-Thioesterase-Regionen verwendet, um eine Sequenz zu erhalten, welche die Kampfer-Thioesterase codiert. Diese konservierte Region entspricht den Aminosäuren 113–119 der Lorbeerbaum- und Kampfer-Aminosäuresequenzen in den 1B bzw. 5B und den Aminosäuren 108–114 der Färberdistel-Aminosäuresequenz in 4A. In ähnlicher Weise sind andere konservierte Regionen in den Lorbeerbaum-, Kampfer- und Färberdistel-Aminosäuresequenzen zu finden (wie in den 1B, 5B bzw. 4B gezeigt), wie bei 174–188 von Lorbeerbaum und Kampfer und 169–183 der Färberdistel; 219- 229 von Lorbeerbaum und Kampfer und 214–224 der Färberdistel; und 138–145 von Lorbeerbaum und Kampfer und 133–140 der Färberdistel.
Die oben beschriebenen pflanzlichen Acyl-ACP-Thioesterasen sind zum Zentrum der Proteine hin stärker konserviert als an entweder den Carboxy- oder Aminotermini. Die konservierten Regionen können Bereiche darstellen, welche mit dem katalytischen Zentrum des Enzyms in Beziehung stehen, und die beobachteten Unterschiede bezüglich der Substratspezifität können mit den Unterschieden in der Aminosäuresequenz in den Regionen an jedem Ende der Polypeptidkette in Beziehung gebracht werden. Die pflanzlichen Acyl-ACP-Thioesterase-Proteinsequenzen enthalten keine Konsensussequenz eines katalytischen Zentrums (GHS×G), welche in Thioesterasen aus Tieren und der Hefe und in anderen Enzymen der Fettsäuresynthese zu finden ist, oder das Motiv eines katalytischen Zentrums der Hydrolasen auf Cystein-Basis (Aitken (1990) in Identification of Protein Consensus Sequences, Ellis Horwood, London, S. 81–91). Da Hemmstoff-Studien zeigen, daß die pflanzlichen Thioesteraseenzyme gegen Sulfhydrylspezifische Reagenzien wie N-Ethylmaleimid empfindlich sind (Pollard et al., a.a.O.), kann ein Cysteinrest an dem katalytischen Zentrum beteiligt sein.
Folglich können andere pflanzliche Thioesterase-Gene durch die oben beschriebenen Methoden isoliert und zur Expression von pflanzlichen Thioesterasen verwendet werden. Insbesondere ist die Expression in E. coli nützlich, um die Acylkettenlängenspezifität dieser Thioesterasen zu überprüfen, und die Expression in Pflanzensamen ist nützlich, um modifizierte Öle herzustellen.
Beispiel 6 – Pflanzliche Thioesterasen und Dehydrasen in Pflanzen
Das Enzym 3-Hydroxydecyano-Tragerprotein]-Dehydratase (EC 4.2.1.60), hierin auch als Dehydrase bezeichnet, katalysiert die Dehydratisierung von 3-Hydroxydecanoyl-ACP (C10:0-ACP) zu 2-Decenoyl-ACP (C10:1-ACP), ein wichtiger Schritt bei der Herstellung von ungesättigten Fettsäuren in Bakterien. Die Expression dieses Enzyms in Pflanzensamen ist für die Herstellung von ungesättigten mittelkettigen Acyl-ACPs in Pflanzen nützlich, welche auch das mittelkettige Acyl-ACP-Thioesterase-Gen aus dem Lorbeerbaum enthalten. Auf diese Weise werden mittelkettige, ungesättigte, freie Fettsäuren als Ergebnis einer hydrolytischen Aktivität der Lorbeerbaum-Thioesterase für C12:1- und C14:1-Substrate gebildet.
Ein nützliches Konstrukt für die Expression einer Dehydrase in Pflanzensamen sorgt für die Expression des Enzyms in Pflanzensamengewebe unter Kontrolle einer Napin-Promotorregion. Außerdem wird eine Transportpeptid-Region für den Transport des Dehydraseenzyms in die Plastide bereitgestellt.
Eine Dehydrase-Nucleinsäuresequenz aus dem E. coli-Dehydrase-Gen (Cronan et al., J. Biol. Chem. 263 (1988), 4641–4646) wird konstruiert, welches sämtliche Aminosäuren, bis auf die erste Met-Aminosäure des Dehydraseenzyms codiert. Ein PCR-DNA-Fragment, welches das Färberdistel-Thioesterase-Transportpeptid und 6 Aminosäuren der reifen Färberdistel-Thioesterase (aus Clon 2–1) codiert, wird unmittelbar 5' zu der Dehydrase inseriert, so daß die Transportpeptid- und Dehydrase-Sequenzen im gleichen Leseraster vorliegen. Die Färberdistel-Thioesterase-Transport/Dehydrase-Sequenz wird in die Napin-Expressionskassette, pCGN3223, zwischen die 5'- und 3'-regulatorischen Napin-Sequenzen inseriert.
Das Dehydrase-Expressionskonstrukt wird in ein binäres Konstrukt zur Pflanzentransformation eingeschleust. Ein Vektor, welcher einen anderen selektierbaren Marker als Kanamycin codiert, wird bevorzugt. Auf diese Weise können transgene Brassica-Pflanzen, die mittelkettige Acyl-ACP-Fettsäuren als Ergebnis eines inserierten Lorbeerbaum-Thioesterase-Konstrukts herstellen (wie die in Beispiel 4 beschriebenen), noch einmal mit dem Dehydrase-Expressionskonstrukt transformiert werden. Zum Beispiel kann das Dehydrase-Expressionskonstrukt in einen binären Vektor, pCGN2769 (nachstehend beschrieben), inseriert werden, welcher eine Resistenz gegen das Antibiotikum Hygromycin B codiert. Agrobacterium-Zellen, enthaltend das resultierende Konstrukt, werden erhalten und in Brassica-Transformationsmethoden, wie in Beispiel 3 beschrieben, verwendet.
Der binäre Vektor, pCGN2769, enthält die rechte und die linke Grenze der Agrobacterium-T-DNA und zwischen diesen Grenzen ein 35S/Hygromycin/tr7-Konstrukt zur Selektion von transformierten Pflanzenzellen. Der Vektor wurde derart konstruiert, daß er direkt analog zu den binären Vektoren ist, welche durch McBride und Summerfelt (a.a.O.) beschrieben sind, bis auf die Verwendung eines anderen selektierbaren Markers. Das hph-Gen, welches die Hygromycin B-Phosphotransferase codiert, wird durch Gritz und Davies (Gene 25 (1983), 179–188) beschrieben. Ein DNA-XhoI-Fragment, enthaltend die folgenden hph- und pflanzlichen regulatorischen Sequenzen, wurde durch Techniken der Polymerasekettenreaktion konstruiert: –289 bis +114 (relativ zum Transkriptionsstartpunkt) eines CaMV35S-Promotors; die Nucleotide 211–1236 der hph codierenden Region (Gritz und Davies, a.a.O.) zusammen mit dem ATG-Initiationscodon, welches in der Sequenz ATCATGAAA enthalten ist, um eine pflanzliche Konsensus-Translationsinitiationssequenz bereitzustellen (Kozak, J. Cell. Biol. 108 (1989), 229–241); und eine Transkriptionsterminationsregion des Agrobacterium-Transkripts 7 (tr7) von Nucleotid 2921 bis 2402 der T-DNA, nach der Numerierung durch Barker et al. (Plant Mol. Biol. 2 (1983), 335–350). Das XhoI-hph-Expressionsfragment wurde in pCGN1541 ligiert, um pCGN2768 zu erzeugen, enthaltend ein BglII-Fragment, welches die linke Grenze der pTiA6-T-DNA, das hph-Expressionskonstrukt, ein HaeII-Fragment, enthaltend die 425 bp-Region, welche lac-alpha aus E. coli codiert, und die rechte Grenze der pTiA6-T-DNA enthält (die T-DNA-Grenzen und die lac-_-Regionen sind bei McBride et al. (a.a.O.) beschrieben). Das oben beschriebene BglII-Fragment wird in das einmalige BamHI-Fragment von pCGN1532, McBride et al. (a.a.O.), cloniert, wobei pCGN2769 erhalten wird.
Alternativ können das Dehydrase-Expressionskonstrukt und ein Lorbeerbaum-Thioesterase-Expressionskonstrukt (wie pCGN3828) beide in einen einzigen binären Vektor cloniert werden, wie die Vektoren von McBride et al. (a.a.O.), welche einen Marker zur Selektion von Kanamycin-resistenten Pflanzen enthalten. Bei jeder dieser Methoden werden Pflanzen erzeugt, welche in der Lage sind, mittelkettige, ungesättigte und gesättigte Fettsäuren herzustellen.
Sämtliche Veröffentlichungen und Patentanmeldungen, welche in dieser Beschreibung erwähnt werden, dienen als Beispiele für den Kenntnisstand der Fachleute, auf welchen sich diese Erfindung bezieht.
Obwohl die vorstehende Erfindung in einigen Einzelheiten veranschaulichend und beispielhaft zum Zwecke der Klarheit des Verständnisses beschrieben worden ist, ist naheliegend, daß bestimmte Änderungen und Modifikationen innerhalb des Schutzumfangs der beigefügten Patentansprüche durchgeführt werden können.

Claims

Verfahren zur Herstellung einer ungesättigten, mittelkettigen, freien Fettsäure, umfassend: das Inkontaktbringen von (1) eines ungesättigten Fettacyl-ACP-Substrats und von (2) einer pflanzlichen mittelkettigen Thioesterase unter Enzymreaktionsbedingungen, und wobei die pflanzliche Thioesterase erhältlich ist durch Expression eines DNA-Strukturgens, welches eine Bay-Thioesterase mit der Sequenz von 1B codiert, und fähig ist, ein gesättigtes Fettacyl-ACP-Substrat mit der gleichen Länge wie das ungesättigte Fettacyl-ACP-Substrat zu hydrolysieren, wodurch eine mittelkettige Fettsäure aus ACP freigesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Inkontaktbringen als Ergebnis der Expression der Bay-Thioesterase innerhalb einer E. coli-Zelle erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei mindestens eines von C12:1 oder C14:1 hergestellt wird.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Inkontaktbringen in einer Pflanzenzelle erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das ungesättigte Fettacyl-ACP-Substrat durch die Schritte des Inkontaktbringens von (a) eines gesättigten Fettacyl-ACP-Substrats und von (b) einer β-Hydroxydecanoyl-Thioesterasedehydrase unter Enzymreaktionsbedingungen hergestellt wird.
Verfahren zur Gewinnung von mittelkettigen Fettsäuren aus einer Bakterienzelle, umfassend: das Züchten einer Bakterienzelle mit einer DNA-Sequenz, codierend eine pflanzliche mittelkettige Thioesterase, welche eine Bay-Thioesterase mit der Sequenz von 1B codiert, unter der Kontrolle von regulatorischen Sequenzen, die in der Zelle unter Bedingungen funktional sind, welche in der Expression der Thioesterase resultieren, wobei die Zelle bezüglich des Fettsäureabbaus defizient ist; und das Gewinnen von Fettsäuresalzen aus einem zellfreien Medium.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Bakterienzelle Acyl-CoA-Synthetasedefizient ist und gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus E. coli fadD und E. coli fadE.
Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, wobei die Bakterienzelle bei einer Temperatur von etwa 25–30°C gezüchtet wird.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 6 bis 8, wobei die Fettsäuresalze extrazellulär abgelagerte Lauratsalzkristalle sind.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Fettsäuresalze ungesättigte Fettsäuren sind.
Pflanzensamen, umfassend mindestens 1,0 Molprozent Laurat in den Fettsäuren insgesamt, wobei das Laurat in mindestens eine Position eines Triglyceridmoleküls eingebaut ist; wobei die Pflanzensamen ein heterologes DNA-Strukturgen enthalten, das eine Bay-Thioesterase mit der Sequenz von 1B codiert, und wobei die Wildtyp-Samen der Pflanze weniger als 1,0 Molprozent Laurat in den Fettsäuren enthalten.
Samen nach Anspruch 11, umfassend mindestens etwa 15 Molprozent Laurat in den Fettsäuren.
Samen nach Anspruch 11, umfassend mindestens etwa 50 Molprozent Laurat in den Fettsäuren.
Samen nach irgendeinem der Ansprüche 11 bis 13, welche Brassica-Samen sind.
DNA-Kontrukt, welches fähig ist, eine pflanzliche Thioesterase in einer Wirtszelle herzustellen, umfassend, in der 5'-3'-Transkriptionsrichtung, eine in der Wirtszelle funktionale Transkriptionsinitiationsregion, eine in der Wirtszelle funktionale Translationsinitiationsregion, ein DNA-Strukturgen, codierend eine Bay-Thioesterase mit der Sequenz von 1B, und eine Transkriptions- und Translationsterminationsregion, welche in der Wirtszelle funktional ist.