DE69534815T2

DE69534815T2 - Wachsester in transformierten pflanzen

Info

Publication number: DE69534815T2
Application number: DE69534815T
Authority: DE
Inventors: Michael Davis LASSNER; George James Davis METZ
Original assignee: Calgene LLC
Current assignee: Monsanto Co
Priority date: 1994-06-01
Filing date: 1995-06-01
Publication date: 2006-11-16
Anticipated expiration: 2015-06-02
Also published as: DE69534815D1; EP0711351B1; WO1995033055A2; WO1995033055A3; ATE318911T1; CA2168042A1; JPH09501325A; US5723747A; EP0711351A1; CN1129014A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Wachsestern in einer speziell transformierten Pflanzenzelle.
Durch die Entwicklung von gentechnischen Methoden für Pflanzen ist es möglich, eine Vielzahl von Pflanzenspezies zu transformieren und zu regenerieren und dadurch Pflanzen mit neuen und wünschenswerten Eigenschaften zu erhalten. Ein interessanter Bereich für solche gentechnische Methoden bei Pflanzen ist die Produktion von wertvollen Produkten in Pflanzengeweben. Solche Anwendungen erfordern die Verwendung verschiedener DNA-Konstrukte und Nucleinsäuresequenzen zur Verwendung bei Transformationsereignissen unter Bildung von Pflanzen, die das gewünschte Produkt produzieren. Zum Beispiel sind für eine geeignete Expression von Gensequenzen pflanzenfunktionelle Promotoren erforderlich, wobei die Expression entweder in der gesamten Pflanze oder in ausgewählten Pflanzengeweben erfolgt. Außerdem werden häufig Selektionsmarkersequenzen verwendet, um das transformierte Pflanzenmaterial zu identifizieren. Solche Pflanzenpromotoren und Selektionsmarker liefern wertvolle Werkzeuge, die nützlich sind, um die neuen Pflanzen zu erhalten.
Fettsäuren sind organische Säuren, die eine Kohlenwasserstoffkette mit etwa 4 bis 24 Kohlenstoffatomen aufweisen. Es sind viele verschiedene Arten von Fettsäuren bekannt, die sich in Bezug auf die Kettenlänge sowie die Anwesenheit, Zahl und Position von Doppelbindungen voneinander unterscheiden. In Zellen liegen Fettsäuren typischerweise in kovalent gebundenen Formen vor, wobei der Carboxylteil als Fettacylgruppe bezeichnet wird. Die Kettenlänge und der Sättigungsgrad dieser Moleküle wird häufig durch die Formel CX:Y angege ben, wobei "X" die Zahl der Kohlenstoffatome und "Y" die Zahl der Doppelbindungen angibt.
Fettacylgruppen sind die Hauptkomponenten vieler Lipide, und ihre lange unpolare Kohlenwasserstoffkette ist für die wasserunlösliche Natur dieser Lipidmoleküle verantwortlich. Die Art der kovalenten Bindung der Fettacylgruppe an andere Faktoren kann variieren. Zum Beispiel kann sie in Biosynthesereaktionen je nach der besonderen enzymatischen Reaktion über eine Thioesterbindung kovalent an ein Acyl-Carrierprotein (ACP) oder an Coenzym A (CoA) gebunden sein. Bei Wachsen sind die Fettacylgruppen über eine Esterbindung an Fettalkohole gebunden, und Triacylglycerine haben drei Fettacylgruppen, die über eine Esterbindung an ein Glycerinmolekül gebunden sind.
Es wurden viele Pflanzen untersucht, die Lipide als Triacylglycerine speichern, welche in erster Linie aus langkettigen (mit 16 oder 18 Kohlenstoffatomen) Fettacylgruppen bestehen. Sehr langkettige (mit 20-24 Kohlenstoffatomen), einfach ungesättigte Fettacylgruppen werden über einen Acyl-CoA-Verlängerungsweg aus C18:1 gebildet und sind in vielen Pflanzensamen zu finden, insbesondere bei Vertretern der Kreuzblütler (Cruciferae).
Der Wüstenstrauch Simmondsia chinensis, der besser als Jojobastrauch bekannt ist, ist unter den höheren Pflanzen (Samenpflanzen) ungewöhnlich in Bezug auf seine Fähigkeit, große Mengen an flüssigem Wachs als Hauptkomponente seines Samenspeicherlipids zu produzieren und zu speichern. Diese einfachen Wachsverbindungen sind Sauerstoffester von sehr langkettigen, einfach ungesättigten Fettacylgruppen und Alkoholen (Ohlrogge et al.; Lipids (1978), 13: 203-210). WO 93/10241, veröffentlicht am 27. Mai 1993, beschreibt Verfahren zum Exprimieren einer Wachssynthase in einer Pflanzenzelle in Verbindung mit einer Reductase unter Bildung von Wachsestern. In WO 92/14816, veröffentlicht am 3. September 1992, ist die Nucleinsäuresequenz zur Jojoba-Fettacyl-Reduktase offenbart.
Viele andere Organismen produzieren Wachsester aus Alkohol- und Acylsubstraten. Zum Beispiel produzieren Pflanzen epidermales oder kutikuläres Wachs (Kolattukudy (1980) in The Biochemistry of Plants (Stumpf, P.K. und Conn, E.E., Hrsg.), Band 4, S. 571-645). Wachs wurde auch für verschiedene Bakterienspezies beschrieben, wie Acinetobacter (Fixter et al. (1986), J. Gen. Microbiol. 132: 3147-3157) und Micrococcus (Lloyd (1987), Microbios 52: 29-37), und für den Einzeller Euglena (Khan und Kolattukudy (1975), Arch. Biochem. Biophys. 170: 400-408). Außerdem wurde über eine Wachsproduktion bei mikrosomalen Präparaten aus Meibomschen Drüsen von Rindern (Kolattukudy et al. (1986), J. Lipid Res. 27: 404-411), Vogel-Bürzeldrüsen und verschiedenen Insekten und Meeresorganismen berichtet.
Die Zusammensetzung und der Biosyntheseweg dieser Wachse kann sich von denen des Jojobasamenwachses unterscheiden. Für Jojoba wurde angenommen, dass die Reduktion eines sehr langkettigen Fettacyl-CoA zu dem entsprechenden Alkohol von einem einzigen Enzym abhängt, dessen Aktivität bei Rohextrakten aus sich entwickelnden Jojobasamen beobachtet wurde (Pollard et al. (1979), Lipids 14: 651-662; Wu et al. (1981), Lipids 16: 897-902). Zum Vergleich wurde für die Bildung von kutikulären Pflanzenwachsen ein zweistufiger Vorgang beschrieben (Kolattukudy (1980) in The Biochemistry of Plants (Stumpf, P.K. und Conn, E.E., Hrsg.), Band 4, S. 571-645). Das Fettacyl-CoA wird durch die Einwirkung einer NADH-abhängigen Reductase in einen freien Aldehyd umgewandelt, und der Alkohol wird anschließend durch die Einwirkung einer NADPH-abhängigen Fettaldehyd-Reductase gebildet.
Die Solubilisierung eines Multienzymkomplexes aus Euglena gracilis mit Fettacyl-CoA-Reductase-Aktivität wird von Wildner und Hallick beschrieben (Abstract from The Southwest Consortium Fifth Annual Meeting, 22.-24. April 1990, Las Cruces, NM). Bei der Bildung von Euglena-Speicherwachs wird der Alkoholteil durch eine NADH-abhängige Reduktion einer Fettacylverbindung, die von einer Fettacyl-CoA-Reductase katalysiert wird, gebildet.
Außerdem ist die Produktion von Wachsestern in transgenen Pflanzen durch Transformation der Pflanzen mit dem Jojoba-Fettacyl-Reductase-Gen in WO 93/10241 und WO 92/14816 offenbart.
Kurzbeschreibung der Figuren
1. Die Nucleinsäuresequenz und translatierte Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 19) einer Jojoba-Fettacyl-Reductase wird angegeben.
2. Nucleinsäuresequenz und translatierte Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 20) einer resynthetisierten Jojoba-Fettacyl-Reductase.
3. Hochtemperatur-Gaschromatographie-Vergleich eines transgenen Öls aus einer pCGN7677-transformierten Reston-Rapspflanze, das gegen Spuren von Jojobaöl und Öl aus einer Kontroll-Reston-Rapspflanze aufgetragen ist.
Kurzbeschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung von Wachsestern in einer Pflanzenzelle bereit, die natürlicherweise keine Jojoba-Fettacyl-Reductase erzeugt, wobei das Verfahren das Züchten einer Pflanzenzelle umfasst, die eine Nucleinsäuresequenz, die eine Jojoba-Fettacyl-Reductase codiert, unter der Kontrolle von regulatorischen Elementen aufweist, die in der Pflanzenzelle die Erzeugung einer Jojoba-Fettacyl-Reductase bewirken, wobei das Verfahren das Exprimieren der Reductase ausgehend von einer resynthetisierten Sequenz mit einem AT-Gehalt von weniger als 55% umfasst und wobei die codierende Sequenz die in 2 gezeigte resynthetisierte Sequenz ist.
Es werden vorzugsweise Pflanzenzellen gezüchtet, die eine Reductase aufweisen, die ausgehend von einem rekombinanten Konstrukt exprimiert wird, das eine Nucleinsäuresequenz umfasst, die eine Jojoba-Fettacyl-Reductase unter der Kontrolle von regulatorischen Elementen, die in der Pflanzenzelle funktionell sind, codiert. Kreuzblütler-Samenzellen, die eine Jojoba-Reductase exprimieren und Wachsester produzieren, seien als Beispiele genannt, insbesondere Brassica- und Arabidopsis-Zellen. Die Erfindung kann also verwendet werden, um Wachsester in Pflanzenzellen zu produzieren, von denen nicht bekannt ist, dass sie natürlicherweise Wachsester produzieren.
Der Mechanismus, mit dem Wachsester in Zellen, die die Reductase-Sequenz exprimieren, produziert werden, ist nicht bekannt. Es ist möglich, dass auch andere Pflanzenzellen als Jojobazellen eine gewisse Aktivität enthalten, die in der Lage ist, Wachsester aus dem durch die Reductase produzierten Fettalkohol und einem eigenen Fettacyl-Substrat der Pflanzenzellen zu synthetisieren. Verfahren zur Bestimmung von Pflanzenzellen, die die Fähigkeit zum Synthetisieren von Wachs enthalten, werden hier ebenfalls beschrieben.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendete Reductase kann gegenüber einer Vielzahl von Fettacyl-Substraten einschließlich Acyl-CoAs und Acyl-ACPs aktiv sein. Die Kohlenstoffkettenlänge dieser Substrate kann variieren, doch kann eine gegebene Reductase eine Präferenz für ein Acyl-Substrat mit einer speziellen Kettenlänge zeigen oder kann einen weiten Bereich von Acyl-Substraten in Bezug auf die bevorzugten Kohlenstoffkettenlängen haben. Die als Beispiel genannte Reductase-Sequenz ist eine von Jojoba erhältliche Langketten-Fettacyl-Reductase, doch werden auch Verfahren angegeben, mit denen andere Fettacyl-Reductasen verwendet werden können, um Wachsester in einer Pflanzenzelle zu produzieren.
Jojobaöl wurde als Spermöl-Ersatz beworben, der für Extremdruckbedingungen geeignet ist, zum Teil weil der Import eines beliebten Öls für diesen Zweck, nämlich Spermöl, verboten wurde. Jojobaöl besteht aus mehr als 97% Wachsestern, ohne Triacylglyceride. Spermöl enthält eine beträchtliche Menge an Triacylglyceriden, bis zu 20% oder mehr der Gesamtlipide. Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, die vielen Schwierigkeiten zu vermeiden, denen man bei dem Versuch begegnet ist, die Jojobapflanze wegen ihrer Samen zu kultivieren.
Die Erfindung stellt auch ein Pflanzenöl sowie Wachszusammensetzungen bereit. Es werden Ölzusammensetzungen bereitgestellt, die einen Wachsesteranteil von bis zu etwa 7% der Gesamtlipide aufweisen, wobei der Rest aus Triacylglyceriden besteht. Außerdem stellt die Erfindung eine Wachsesterzusammensetzung bereit, bei der die vorwiegende Wachskomponente ein langkettiger 44:2-Wachsester ist. Der 44:2-Wachsester kann in einer Menge von bis zu etwa 60% oder mehr der Wachszusammensetzung vorhanden sein.
Die Eigenschaften von Wachsestern variieren je nach der Kettenlänge und dem Grad der Sättigung des Fettalkohols und der Fettacyl-Gruppen. Der Fachmann wird erkennen, dass es mehrere Mechanismen gibt, mit denen Pflanzenzellen erzeugt werden können, die eine Vielzahl von wünschenswerten Wachsesterprodukten aufweisen. Die Veränderung der Substrate, für die eine Wirtspflanzenzelle sorgt, ist ein Mechanismus zur Beeinflussung einer Änderung in dem von der Zelle produzierten Wachsester, doch durch Veränderung der Spezifität der Jojoba-Reductase-codierenden Sequenz oder durch Verwendung einer Reductase-codierenden Sequenz aus einer anderen Quelle kann der von der Zelle produzierte Wachsester ebenfalls variiert werden. Außerdem kann es notwendig sein, eine alternative Reductase-codierende Sequenz zu verwenden, zum Beispiel, wenn die Pflanzenzelle kein endogenes langkettiges Fettacyl-Substrat der Jojoba-Reductase enthält oder wenn eine Pflanzenwirtszelle keine Wachssynthesefähigkeit enthält, die gegenüber dem von der Jojoba-Reductase produzierten langkettigen Fettalkohol aktiv ist. Folglich werden in der Erfindung Wachsester mit verschiedenen Eigenschaften in Betracht gezogen, die von den in der Wirtszelle vorliegenden Substraten und der Aktivität und der Reductase abhängen.
Potentielle Quellen für Reductase-codierende Sequenzen können anhand ihrer Fähigkeit, Fettalkohole oder Wachsester zu produzieren, identifiziert werden. Es werden Verfahren beschrieben, mit denen aus den Aminosäuresequenzen des hier beispielhaft aufgeführten Reductase-Proteins andere Sequenzen identifiziert und erhalten werden können. Verwendungen der Struktur-Gensequenzen für die Isolierung anderer Reductase-Sequenzen sowie in rekombinanten Konstrukten für die Transcription von Reductase-Nucleinsäuresequenzen und/oder die Expression von Reductase-Proteinen in Wirtszellen werden beschrieben. Verwendungen von anderen Nucleinsäuresequenzen, die mit Reductase-Protein assozi iert sind, werden ebenfalls in Betracht gezogen, wie die Verwendung von 5'- und 3'-nichtcodierenden Bereichen.
In noch einem anderen Aspekt dieser Erfindung werden auch Zellen in Betracht gezogen, die Wachsester dieser Erfindung enthalten. Beispielhaft aufgeführt werden Zellen, die die bevorzugten Substrate der Jojoba-Reductase enthalten, wie die Zellen in Embryos bestimmter Kreuzblütler. Wachsester sind als Komponente der Gesamtlipide einer Samenzelle in einer Menge von bis zu etwa 7% vorhanden.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Eine Fettacyl-Reductase oder "Reductase" bewirkt eine Katalyse der Reduktion einer Fettacylgruppe zu dem entsprechenden Alkohol. Die US-Patentanmeldungen 07/659,975 (eingereicht am 22.02.91) (weitergeführt als 08/149,007 (eingereicht am 8.11.93, jetzt US-Patent 5,411,879)), 07/767,251 (eingereicht am 27.9.91, jetzt US-Patent 5,403,918) und 07/920,430 (eingereicht am 31.7.92, jetzt US-Patent 5,370,996) sind auf solche Reductase-Proteine gerichtet. Informationen bezüglich Jojoba-Reductase einschließlich der Nucleinsäurecodierenden Sequenzen werden auch in WO 92/14816, das am 3. September 1992 veröffentlicht wurde, angegeben.
Eine Fettacyl-Reductase zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung beinhaltet irgendeine Sequenz von Aminosäuren, wie ein Protein, Polypeptid oder Peptidfragment, die eine Katalyse der Reduktion einer Fettacylgruppe zu dem entsprechenden Alkohol bewirkt. "Fettacylgruppe" bedeutet jede Fettacylgruppe, die kovalent an einen Träger, wie ACP oder Coenzym A, gebunden ist.
Durch diese Erfindung wurde bestimmt, dass ein heterologes Fettacyl-Reductase-Protein in einer Pflanzenzelle exprimiert werden kann, so dass die Produktion von Wachsestern bewirkt wird. Die Produktion von Wachsestern in den Pflanzenzellen erfolgt in Abwesenheit einer Wachs-Synthase, die ausgehend von einer bezüglich der Pflanze heterologen Sequenz exprimiert wird. Während die beispielhaft angegebenen Kreuzblütlerzellen durch dieses Verfahren langkettige Wachsester exprimiert haben, kann eine weitere Untersuchung des Reductase-Proteins zu Studien über ortsspezifische Mutagenese führen, um seine katalytischen Eigenschaften weiter zu charakterisieren und zu verbessern oder seine Acyl-Substratspezifität zu verändern. Eine Reductase mit veränderter Substratspezifität kann Anwendung in Verbindung mit anderen FAS-Enzymen finden. Zum Beispiel können eine mittlere Ketten (C12-C14) bevorzugende Pflanzen-Thioesterase (siehe gleichzeitig anhängige US-Patentanmeldung 07/662,007, jetzt US-Patent 5,344,771) und eine geeignete Acyl-Transferase in Verbindung mit einer veränderten Reductase verwendet werden, um mittelkettige Alkohole zu produzieren, die dann von einer Wirtspflanzenzelle durch eine der Pflanzenzelle eigene Wachssynthese-Aktivität in mittelkettige Wachsester umgewandelt werden können.
Weiterhin ist erkannt worden, dass die für die Reinigung der Jojoba-Reductase entwickelten Verfahren jetzt auf die Reinigung von ähnlichen membranassoziierten Acyl-CoA-Reductasen von anderen Organismen angewendet werden können, die dann ähnlich verwendet werden können, um Wachsester in Pflanzenwirtszellen zu produzieren. Auf diese Weise kann eine Vielzahl von Reductasen mit einem Spektrum von Substratpräferenzen oder -spezifitäten erhalten werden. Zu den wünschenswerten Quellen solcher Reductasen gehören Acinetobacter-Spezies, Micrococcus und Grünalgen (Euglena).
Die Gewinnung von im Wesentlichen gereinigten Reductase-Proteinen kann mit einer Vielzahl von Verfahren erfolgen. Zum Beispiel können die Proteine auf Polyacrylamid-Gelen laufen gelassen und dann auf einen Membranträger, wie Nitrocellulose oder Polyvinylidendifluorid (PVDF), übertragen werden. Dann können die Abschnitte dieser Membranen, die die identifizierten Proteine enthalten, erhalten werden, so dass die identifizierten Proteine im Wesentlichen frei von anderen Proteinen sind. Unter Verwendung von Methoden, die in der Technik bekannt und auch in den folgenden Beispielen beschrieben sind, können die Proteine aus den Membranen entfernt und weiter manipuliert werden, so dass ihre Aminosäuresequenzen bestimmt werden.
Zum Beispiel kann eine Aminosäuresequenz bestimmt werden, indem man N-terminale Aminosäurebereiche von einem ganzen Protein sequenziert oder Fragmente des gewünschten Proteins durch Abbau mit der Chemikalie Bromcyan oder alternativ dazu durch enzymatische Spaltung unter Verwendung von Proteasen herstellt. Beispiele für Proteasen, die geeignet sein können, sind Endoproteinase IysC, gluC, AspN und Trypsin. Die auf diese Weise erhaltenen Fragmente können dann nach Verfahren, die dem Fachmann geläufig sind, gereinigt und sequenziert werden.
Es kann auch wünschenswert sein, Reductase-Proteine in Pflanzenzellen zu exprimieren, um Acylalkoholprodukte zu erhalten, die in Pharmaka, Kosmetik, Waschmitteln, Kunststoffen und Schmierölen verwendet werden können. Wie hier beschrieben, führt die Expression der Jojoba-Reductase in transgenen Brassica- und Arabidopsis-Pflanzen zur Produktion von langkettigen Wachsestern in den Samen dieser Pflanzen, welche sich leicht durch bekannte Verseifungs- oder Umesterungsverfahren in die entsprechenden Fettacylalkohol- und Fettacyl-Substrate umwandeln lassen.
In einigen Fällen, zum Beispiel bei der Verwendung alternativer Quellen für Reductase, können für die Expression von Reductase-Aktivität in Zellen verschiedene Manipulationen notwendig sein. Zum Beispiel können Leader-Peptide, die für die Einfügung in die Membran verantwortlich sind, identifiziert werden, und es können Konstrukte hergestellt werden, die nur die Sequenz enthalten, die die reife Reductase codiert. Bei den Reductase-Nucleinsäuren dieser Erfindung kann es sich um genomische DNA oder cDNA handeln, und sie können von cDNA- oder genomischen Bibliotheken oder direkt von isolierter Pflanzen-DNA abgeleitet sein. Verfahren zur Isolierung von Gensequenzen, sobald ein Protein isoliert und/oder die Aminosäuresequenz des Proteins erhalten wurde, sind dem Fachmann bekannt.
Zum Beispiel können Antikörper gegen das isolierte Protein erzeugt und zur Durchmusterung von Expressionsbibliotheken verwendet werden, so dass Klone identifiziert werden, die das Pflanzen-Acyl-Reductase-Protein oder ein antigenes Fragment davon produzieren. Alternativ dazu können ausgehend von den Aminosäuresequenzen Oligonucleotide synthetisiert und bei der Isolierung von Nucleinsäuresequenzen verwendet werden. Die Oligonucleotide können in der PCR nützlich sein, um ein Nucleinsäurefragment zu erzeugen, das dann verwendet werden kann, um cDNA- oder genomische Bibliotheken zu durchmustern. Bei einem anderen Ansatz können die Oligonucleotide direkt zum Analysieren von Northern- oder Southern-Blots verwendet werden, um geeignete Sonden und Hybridisierungsbedingungen zu identifizieren, unter denen diese Oligonucleotide verwendet werden können, um cDNA- oder genomische Bibliotheken zu durchmustern.
Die in dieser Erfindung als Beispiel aufgeführte Acyl-Reductase-Nucleinsäuresequenz entspricht dem Jojoba-Acyl-CoA-Reductase-Protein oder ist eine Sequenz, die aus dem Jojobaprotein oder seiner Nucleinsäuresequenz erhältlich ist. "Entspricht" bedeutet eine Nucleinsäuresequenz, entweder DNA oder RNA, einschließlich solcher, die Jojoba-Acyl-Reductase-Protein oder einen Teil davon codieren, regulatorische Sequenzen, die sich 5' oder 3' von den codierenden Sequenzen befinden und die die Transcription oder Transcription und Translation (Expression) der Reductase in Jojoba-Embryos steuern, Intronsequenzen, die in der cDNA nicht vorhanden sind, sowie Sequenzen, die irgendein Leader- oder Signalpeptid eines Vorläufer-Reductase-Proteins codieren, das für das Einsetzen in die Membran des Endoplasmatischen Retikulums erforderlich sein kann, aber im reifen oder prozessierten Acyl-Reductase-Enzym nicht gefunden wird.
Unter einer Sequenz, die aus der Jojobasequenz oder dem Jojobaprotein "erhältlich" ist, wird jede Nucleinsäuresequenz verstanden, die mit einem gewünschten Fettsäure-Reductase-Protein assoziiert ist, welches aus der Jojoba-Acyl-Reductase-Aminosäuresequenz synthetisiert werden kann, oder alternativ dazu unter Verwendung von Jojoba-Reductase-Nucleinsäuresequenzen oder Antikörpern, die gegen das Jojoba-Reductase-Protein hergestellt wurden, als Sonden in einem anderen Organismus identifiziert und isoliert wurde. Auf diese Weise erkennt man, dass Sequenzen von anderen Acyl-Reductasen, die mit Hilfe der Jojoba-Sequenzen, entweder durch Nucleinsäurehybridisierung oder Anti genverfahren, aus einem gewünschten Organismus isoliert werden, ähnlich verwendet werden können, um noch andere Acyl-Reductasen zu isolieren. Solche Reductasen, die über Samenpflanzen-Reductasen abgeleitet sind, welche über Jojoba-Reductase isoliert wurden, werden hier ebenfalls als "erhältlich" angesehen.
Für die Isolierung von Nucleinsäuresequenzen können cDNA- oder genomische Bibliotheken unter Verwendung von Plasmid- oder viralen Vektoren und dem Fachmann wohlbekannten Techniken hergestellt werden. Geeignete Nucleinsäurehybridisierungsverfahren und immunologische Verfahren, die zur Suche nach den gewünschten Sequenzen verwendet werden können, sind dem Fachmann ebenfalls wohlbekannt und werden zum Beispiel bei Maniatis et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) angegeben.
Typischerweise zeigt eine Sequenz, die unter Verwendung von Nucleinsäuresonden erhältlich ist, 60-70% Sequenzidentität zwischen der Zielsequenz und der gegebenen Sequenz, die das interessierende Acyl-Reductase-Enzym codiert. Lange Sequenzen mit einer Sequenzidentität von nur 50-60 % können aber auch erhalten werden. Die Nucleinsäuresonde kann ein langes Fragment der Nucleinsäuresequenz sein, oder es kann auch eine kürzere, Oligonucleotidsonde, sein. Wenn längere Nucleinsäurefragmente als Sonden verwendet werden (mehr als etwa 100 bp), kann man das Screening mit einer geringeren Stringenz durchführen, um Sequenzen aus der Zielprobe zu erhalten, die eine Abweichung von 20-50 % (d.h. eine Sequenzhomologie von 50-80 %) gegenüber den als Sonde verwendeten Sequenzen haben. Oligonucleotid-Sonden können beträchtlich kürzer als die vollständige, ein Acyl-Reductase-Enzym codierende Nucleinsäuresequenz sein, sollten aber wenigstens etwa 10, vorzugsweise wenigstens etwa 15 und noch mehr bevorzugt wenigstens etwa 20 Nucleotide haben. Wenn im Gegensatz zu längeren Regionen kürzere Regionen verwendet werden, ist ein höherer Grad der Sequenzidentität erwünscht. Somit kann es wünschenswert sein, aktive Zentren des Enzyms zu identifizieren, wo die Aminosäuresequenz identität hoch ist, um Oligonucleotid-Sonden für den Nachweis von homologen Genen zu entwerfen.
Um zu bestimmen, ob ein verwandtes Gen durch Hybridisierung mit einer gegebenen Sequenz isoliert werden kann, wird die Sequenz markiert, um einen Nachweis, typischerweise unter Anwendung von Radioaktivität, zu ermöglichen, obwohl auch andere Verfahren verfügbar sind. Die markierte Sonde wird zu einer Hybridisierungslösung gegeben und mit Filtern, die die gewünschten Nucleinsäuren enthalten, entweder Northern- oder Southern-Blots (zur Suche nach gewünschten Quellen für die Homologie), oder den Filtern, die zu suchende cDNA oder genomische Klone enthalten, inkubiert. Die Hybridisierungs- und Waschbedingungen können dahingehend variiert werden, dass die Hybridisierung der Sonde mit den interessierenden Sequenzen optimiert wird. Niedrigere Temperaturen und höhere Salzkonzentrationen ermöglichen eine Hybridisierung entfernter verwandter Sequenzen (niedrige Stringenz). Wenn unter Bedingungen einer niedrigen Stringenz die Hintergrund-Hybridisierung ein Problem darstellt, kann die Temperatur entweder im Hybridisierungs- oder im Waschschritt erhöht und/oder der Salzgehalt erniedrigt werden, um den Nachweis der speziellen hybridisierenden Sequenz zu verbessern. Die Hybridisierungs- und die Waschtemperatur können auf der Grundlage der geschätzten Schmelztemperatur der Sonde eingestellt werden, wie in Beltz et al. (Methods in Enzymology (1983) 100: 266-285) diskutiert wird.
Wenn eine geeignete Sonde und geeignete Hybridisierungs- und Waschbedingungen identifiziert wurden, wie es oben beschrieben ist, werden cDNA- oder genomische Bibliotheken durchmustert, wobei man die markierten Sequenzen und optimierte Bedingungen verwendet. Die Bibliotheken werden zuerst aus einem festen Agarmedium ausgestrichen, und die DNA wird auf eine geeignete Membran, gewöhnlich Nitrocellulose- oder Nylonfilter, übertragen. Diese Filter werden dann mit der markierten Sonde hybridisiert und gewaschen, wie es oben diskutiert ist, um Klone zu identifizieren, die die verwandten Sequenzen enthalten.
Für die immunologische Durchmusterung können Antikörper gegen die Jojoba-Acyl-Reductase hergestellt werden, indem man Kaninchen oder Mäusen das gereinigte Protein injiziert, wobei solche Verfahren zur Herstellung von Antikörpern dem Fachmann wohlbekannt sind. Es können entweder monoklonale oder polyklonale Antikörper hergestellt werden, obwohl polyklonale Antikörper für die Gen-Isolierung typischerweise besser geeignet sind.
Um gewünschte Pflanzenspezies zu durchmustern, wird eine Western-Analyse durchgeführt, um zu bestimmen, dass in einem Rohextrakt der gewünschten Pflanzenspezies ein verwandtes Protein vorhanden ist, das mit den Antikörpern gegen die Jojoba-Reductase kreuzreagiert. Dies wird durch nach einer Elektrophorese erfolgende Immobilisierung der Pflanzenextraktproteine auf einer Membran, gewöhnlich Nitrocellulose, und Inkubation mit dem Antikörper erreicht. Zum Nachweis des Antikörper/Protein-Komplexes auf den Nitrocellulosefiltern stehen viele verschiedene Systeme zur Verfügung, einschließlich der radioaktiven Markierung des Antikörpers und Konjugatsystemen von zweitem Antikörper/Enzym. Einige verfügbare Systeme wurden von Oberfelder beschrieben (Focus (1989) BRL/Life Technologies, Inc. 11: 1-5). Wenn eine Kreuzreaktivität beobachtet wird, werden Gene, die die verwandten Proteine codieren, isoliert, indem man Expressionsbibliotheken durchmustert, die die gewünschte Pflanzenspezies darstellen. Expressionsbibliotheken können in einer Vielzahl von kommerziell erhältlichen Vektoren aufgebaut werden, einschließlich Lambda gt11, wie es bei Maniatis et al. (loc. cit.) beschrieben ist.
Dann werden die Klone, die gemäß der obigen Beschreibung unter Verwendung von DNA-Hybridisierungs- oder immunologischen Screening-Techniken identifiziert wurden, gereinigt, und die DNA wird mit bekannten Techniken isoliert und analysiert. Auf diese Weise wird überprüft, dass die Klone ein verwandtes Acyl-Reductase-Protein codieren. Andere Samenpflanzen-Fettacyl-Reductasen können erhalten werden, indem man diese Reductasen in derselben Weise verwendet, wie die Jojoba-Reductase verwendet wurde.
Der Fachmann wird sich darüber im Klaren sein, dass die Acyl-Reductase-Nucleinsäuresequenz dieser Erfindung mit Hilfe von Standardtechniken der ortsspezifischen Mutation oder PCR modifiziert werden kann, oder eine Modifizierung der Sequenz kann erreicht werden, indem man eine synthetische Nucleinsäuresequenz herstellt. Diese modifizierten Sequenzen werden ebenfalls als eine Acyl-Reductase-Nucleinsäuresequenz dieser Erfindung angesehen. Zum Beispiel können Wobble-Positionen in Codons geändert werden, so dass die Nucleinsäuresequenz dieselbe Aminosäuresequenz codiert, oder alternativ dazu können Codons so geändert werden, dass konservative Aminosäuresubstitutionen resultieren. In beiden Fällen behält das Peptid oder Protein die gewünschte enzymatische Aktivität bei.
Die neu synthetisierte Nucleinsäuresequenz eines Acyl-Reductase-Enzyms, das bei dem Verfahren dieser Erfindung verwendet wird, kann eine DNA- oder RNA-Sequenz sein.
Somit kann das gesamte oder ein Teil des gewünschten Struktur-Gens (der Teil des Gens, der das Reductase-Protein codiert), unter Verwendung von Codons synthetisiert werden, die von einem ausgewählten Wirt bevorzugt werden. Vom Wirt bevorzugte Codons können beispielsweise aus den Codons bestimmt werden, die am häufigsten bei den Proteinen verwendet werden, die in einer gewünschten Wirtsspezies exprimiert werden. Insbesondere hat die neu synthetisierte Sequenz, die Jojoba-Reductase codiert, einen reduzierten AT-Gehalt. Bestimmte Bereiche innerhalb der Sequenz, die Jojoba-Reductase codiert, haben AT-Verwendungen von bis zu etwa 75% mit einem Durchschnitt von über 57%. Neu synthetisierte codierende Sequenzen haben vorzugsweise eine relativ gleichmäßige AT-Zusammensetzung von weniger als 55%, am meisten bevorzugt in der Größenordnung von 51% oder weniger.
Die obige Nucleinsäuresequenz, die eine Fettacyl-Reductase codiert, kann auf vielerlei Weise mit Fremd-DNA-Sequenzen kombiniert werden. "Fremd"-DNA-Sequenzen bedeutet jede DNA-Sequenz, die man natürlicherweise nicht mit der Reductase verknüpft findet, einschließlich Kombinationen von DNA-Sequenzen von demselben Organismus, die man natürlicherweise nicht miteinander verknüpft findet. Zum Beispiel kann es wünschenswert sein, Sequenzen, die ein Transitpeptid codieren, mit den Reductase-Sequenzen zu verknüpfen. Auf diese Weise kann die Reductase in einen Chloroplasten gelenkt werden, wo Fettacyl-Substrate, insbesondere Fettacyl-ACPs, zur Verfügung stehen. Es kann auch wünschenswert sein, Introns aus der genomischen Jojoba-Desaturase-DNA oder aus anderen genomischen Pflanzen-DNAs als Mittel, um die Expressionsniveaus in bestimmten Pflanzenzellen anzuheben, einzuführen. Introns von Sequenzen, die normalerweise in Samenembryozellen exprimiert werden, wie Introns von genomischen Desaturase- oder Napin-Sequenzen, sind für diesen Zweck geeignet.
Die DNA-Sequenz, die eine Acyl-Reductase codiert, kann in Verbindung mit allen oder einem Teil der Gensequenzen, die normalerweise mit der Reductase assoziiert sind, eingesetzt werden. In ihren Komponententeilen wird eine DNA-Sequenz, die Reductase codiert, in einem rekombinanten Konstrukt kombiniert, das in der 5'→3'-Transcriptionsrichtung einen Transcriptionsinitiations-Kontrollbereich, der die Transcription und Translation in einer Wirtszelle fördern kann, die Reductase codierende Nucleinsäuresequenz und einen Transcriptionsterminationsbereich aufweist.
Je nach dem Wirt werden die regulatorischen Bereiche variieren; dazu gehören Bereiche aus viralen, Plasmid- oder chromosomalen Genen. Für die Expression in prokaryontischen oder eukaryontischen Mikroorganismen, insbesondere einzelligen Wirten, kann eine Vielzahl von konstitutiven oder regulierbaren Promotoren eingesetzt werden. Die Expression in einem Mikroorganismus kann eine leicht verfügbare Quelle für das Pflanzenenzym liefern. Zu den Transcriptionsstartbereichen, die beschrieben wurden, gehören Bereiche aus bakteriellen und Hefewirten, wie E. coli, B. subtilis, Saccharomyces cerevisiae, einschließlich Genen wie β-Galactosidase, T7-Polymerase und Tryptophan E.
Der größte Teil der rekombinanten Konstrukte wird regulatorische Bereiche beinhalten, die in Pflanzen funktionieren und für eine Produktion von Acyl- Reductase sorgen. Das offene Leseraster, das für die Pflanzen-Reductase codiert, oder ein funktionelles Fragment davon wird an seinem 5'-Ende mit einem den Transcriptionsstart regulierenden Bereich verbunden. Transcriptionsstartbereiche können auch ausgehend vom 5'-nichtcodierenden Bereich der Reductase-cDNA-Sequenz oder ausgehend vom Translations-Startbereich, der natürlicherweise mit dem Transcriptionsstartbereich des Konstrukts assoziiert ist, wünschenswert sein und bereitgestellt werden. Im Allgemeinen wird die Kombination von die Transcription und die Translation regulierenden Bereichen als Promotor bezeichnet. Es stehen zahlreiche Promotorbereiche zur Verfügung, die für eine Vielzahl von konstitutiven oder regulierbaren, z.B. induzierbaren, Expressionen von Struktur-Genen in Pflanzen sorgen.
Zu den Sequenzen, die bekanntermaßen geeignet sind, in Pflanzen für eine konstitutive Genexpression zu sorgen, gehören regulatorische Bereiche, die mit Agrobacterium-Genen, wie denjenigen für Nopalin-Synthase (Nos), Mannopin-Synthase (Mas) oder Octopin-Synthase (Ocs), verbunden sind, sowie Bereiche, die für die Expression von viralen Genen codieren, wie der 35S- und der 19S-Bereich des Blumenkohlmosaikvirus (CaMV). Der hier verwendete Ausdruck "konstitutiv" zeigt nicht notwendigerweise an, dass ein Gen in allen Zelltypen auf demselben Niveau exprimiert wird, sondern dass das Gen in einem weiten Bereich von Zelltypen exprimiert wird, wenn auch oft eine gewisse Variation der Häufigkeit nachweisbar ist. Andere geeignete Transcriptionsstartbereiche sorgen vorzugsweise für eine Transcription in bestimmten Geweben oder unter bestimmten Wachstumsbedingungen, wie solche von Napin, Samen- oder Blatt-ACP und der kleinen Untereinheit von Rubisco.
Die Verwendung des ganzen oder eines Teils des vollständigen Pflanzen-Acyl-Reductase-Gens kann variabel gewünscht werden, es können nämlich die 5'-stromaufwärts liegenden nichtcodierenden Bereiche (Promotor) zusammen mit der Struktur-Gen-Sequenz und 3'-stromabwärts liegenden nichtcodierenden Bereichen eingesetzt werden. Da die Jojoba-Reductase-cDNA nicht bekannt ist, kann zum Beispiel der mit dem Reductase-Struktur-Gen assoziierte Promotor für die genomische Jojoba-DNA mit Hilfe von PCR oder Hybridisierungstechniken erhalten werden. Wenn ein anderer Promotor gewünscht wird, wie ein Promotor, der der interessierenden Wirtspflanze nativ ist, oder ein modifizierter Promotor, d.h. mit Transcriptionsstartbereichen, die von einer Genquelle stammen, und Translationsstartbereichen, die von einer anderen Genquelle stammen, oder verstärkte Promotoren, wie Doppel-35S-CaMV-Promotoren, können die Sequenzen mit Hilfe von Standardtechniken miteinander verbunden werden.
Für Anwendungen, bei denen 5'-stromaufwärts liegende nichtcodierende Bereiche von anderen Genen erhalten werden, die während der Samenreifung reguliert werden, sind solche wünschenswert, die vorzugsweise in Pflanzenembryogewebe exprimiert werden, wie von ACP und Napin abgeleitete Transcriptionsstart-Kontrollbereiche. Solche "samenspezifischen Promotoren" können gemäß den Lehren der US-Anmeldung Serial No. 07/147,781, eingereicht am 25.1.88 (jetzt US-Anmeldung Serial No. 07/742,834, eingereicht am 8.8.91, jetzt US-Patent 5,420,034), und der US-Anmeldung Serial No. 07/494,722, eingereicht am 16.3.90 (jetzt US-Patent 5,530,194), erhalten und verwendet werden.
Transcriptionsstartbereiche, die vorzugsweise in Samengewebe exprimiert werden, gelten als wünschenswert für die Fettalkoholproduktion, um alle zerstörerischen oder nachteiligen Wirkungen des Genprodukts in anderen Pflanzenteilen zu minimieren.
Regulatorische Transcriptionsterminationsbereiche können ebenfalls in rekombinanten Konstrukten dieser Erfindung bereitgestellt werden. Transcriptionsterminationsbereiche können von der DNA-Sequenz, die die Pflanzen-Acyl-Reductase codiert, oder einem zweckmäßigen Transcriptionsterminationsbereich, der von einer anderen Genquelle abgeleitet ist, bereitgestellt werden, insbesondere dem Transcriptionsterminationsbereich, der natürlicherweise mit dem Transcriptionsstartbereich assoziiert ist. Der Transcriptionsterminationsbereich enthält typischerweise wenigstens etwa 0,5 kb, vorzugsweise etwa 1-3 kb, einer Sequenz 3' des Struktur-Gens, von dem der Terminationsbereich stammt.
Pflanzenexpressionskonstrukte, die eine Pflanzen-Acyl-Reductase als interessierende DNA-Sequenz für deren Expression aufweisen, können mit einer Vielzahl von Pflanzen eingesetzt werden, insbesondere Pflanzen, die sehr langkettige Fettacyl-CoA-Moleküle produzieren, wie Brassica und insbesondere erucasäurereiche Varietäten von Raps. Andere interessierende Pflanzen produzieren wünschenswerte Substrate, wie mittel- oder langkettige Fettacyl-Moleküle; dazu gehören unter anderem Raps (Canola-Varietäten), Arabidopsis, Sonnenblume, Färberdistel, Baumwolle, Cuphea, Sojabohne, Erdnuss, Kokosnuss und Ölpalmen sowie Mais. Je nach dem Verfahren zur Einführung der DNA-Expressionskonstrukte in die Wirtszelle können auch andere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Was wichtig ist: Diese Erfindung ist gleichermaßen auf Zweikeimblättrige und Einkeimblättrige Spezies anwendbar und wird leicht auf neue und/oder verbesserte Transformations- und Regenerationstechniken anwendbar sein.
Das Verfahren der Transformation ist für die vorliegende Erfindung nicht entscheidend, und zur Zeit stehen verschiedene Verfahren zur Pflanzentransformation zur Verfügung. Wenn neuere Verfahren zur Transformation von Kulturpflanzen verfügbar werden, können sie hier direkt angewendet werden. Zum Beispiel können viele Pflanzenspezies, die natürlicherweise anfällig für eine Agrobacterium-Infektion sind, durch Verfahren der Agrobacterium-vermittelten Transformation mit dreiteiligen oder binären Vektoren erfolgreich transformiert werden. Andere Sequenzen, die geeignet sind, um für eine Übertragung von Nucleinsäuresequenzen auf Wirtspflanzenzellen zu sorgen, können von pflanzenpathogenen Viren oder pflanzentransponierbaren Elementen abgeleitet sein. Außerdem wurden Techniken der Mikroinjektion, DNA-Partikelbombardierung und Elektroporation entwickelt, die die Transformation verschiedener Einkeimblättriger und Zweikeimblättriger Pflanzenspezies ermöglichen.
Bei der Entwicklung des rekombinanten Konstrukts werden die verschiedenen Komponenten des Konstrukts oder Fragmente davon normalerweise in einen zweckmäßigen Klonierungsvektor eingesetzt, der zur Replikation in einem bakteriellen Wirt, z.B. E. coli, befähigt ist. Es gibt zahlreiche Vektoren, die in der Literatur beschrieben wurden. Nach jeder Klonierung kann das Plasmid isoliert und einer weiteren Manipulation, wie Restriktionsspaltung, Insertion von neuen Fragmenten, Ligierung, Deletion, Insertion und Resektion, unterzogen werden, um die Komponenten der gewünschten Sequenz maßzuschneidern. Sobald das Konstrukt fertiggestellt ist, kann es dann zur weiteren Manipulation im Einklang mit der Art der Transformation der Wirtszelle auf einen geeigneten Vektor übertragen werden.
Das rekombinante Konstrukt wird normalerweise auch ein Strukturgen umfassen, das die notwendigen regulatorischen Bereiche für die Expression in einem Wirt aufweist und für eine Selektion der transformanten Zellen sorgt. Das Gen kann für eine Resistenz gegen ein cytotoxisches Agens, z.B. gegen ein Antibiotikum, Schwermetall und Toxin, für eine Komplementierung, die einem auxotrophen Wirt Prototrophie verleiht, oder virale Immunität sorgen. Ähnlich sind auch Gene geeignet, die Enzyme codieren, die für eine Produktion einer Verbindung sorgen, die sich anhand einer Farbänderung, wie GUS, oder Lumineszenz, wie Luciferase, identifizieren lässt. Je nach den verschiedenen Wirtsspezies, in die die Expressionskonstrukte eingeführt werden, können ein oder mehrere Marker für die Selektion oder den Nachweis von transformierten Geweben eingesetzt werden, wobei für die verschiedenen Wirte unterschiedliche Bedingungen für die Selektion verwendet werden.
Wenn Agrobacterium für die Pflanzentransformation verwendet wird, kann es wünschenswert sein, dass die Nucleinsäuresequenzen auf einer oder beiden Seiten mit T-DNA-Borderbereichen flankiert sind, insbesondere am linken und rechten Rand und insbesondere wenigstens am rechten Rand. Diese Randbereiche können auch nützlich sein, wenn andere Verfahren der Transformation eingesetzt werden.
Wenn Agrobacterium- oder Rhizogenes-Sequenzen für die Pflanzentransformation verwendet werden, kann ein Vektor verwendet werden, welcher für eine homologe Rekombination mit der T-DNA oder dem im Wirt vorhandenen Ti- oder Ri-Plasmid in einen Agrobacterium-Wirt eingeführt werden kann. Das Ti- oder Ri-Plasmid, das die T-DNA für die Rekombination enthält, kann funktionell (zur Bewirkung einer Gallenbildung befähigt) oder unschädlich gemacht (zur Bewirkung einer Gallenbildung nicht befähigt) sein, wobei Letzteres zulässig ist, solange in dem transformierten Agrobacterium-Wirt ein funktionelles Komplement der vir-Gene vorhanden ist, das trans-agierende Faktoren codiert, die für die Übertragung von DNA auf Pflanzenwirtszellen notwendig sind. Die Verwendung eines funktionellen Agrobacterium-Stamms kann zu einem Gemisch von normalen Pflanzenzellen, von denen einige die gewünschten Nucleinsäuresequenzen enthalten, und Pflanzenzellen, die aufgrund der Anwesenheit von Tumorbildungsgenen zur Gallbildung befähigt sind, führen. Zellen, die die gewünschten Nucleinsäuresequenzen enthalten, denen aber die Tumorgene fehlen, können aus dem Gemisch ausgewählt werden, so dass normale transgene Pflanzen erhalten werden können.
In einem bevorzugten Verfahren, wenn Agrobacterium als Überträger zum Transformieren von Wirtspflanzenzellen verwendet wird, wird das von den T-DNA-Borderbereichen flankierte Expressions- oder Transcriptionskonstrukt in einen Vektor mit einem breiten Wirtsspektrum eingesetzt, der zur Replikation in E. coli und Agrobacterium befähigt ist, wobei Vektoren mit einem breiten Wirtsspektrum in der Literatur beschrieben sind. Häufig verwendet werden pRK2 oder Derivate davon. Siehe zum Beispiel Ditta et al. (Proc. Nat. Acad. Sci., USA (1980) 77: 7347-7351) und EP-A-0 120 515.
Alternativ kann man die in Pflanzenzellen zu exprimierenden Sequenzen in einen Vektor insertieren, der separate Replikationssequenzen enthält, wobei einer davon den Vektor in E. coli und der andere in Agrobacterium stabilisiert. Siehe beispielsweise McBride und Summerfelt (Plant Mol. Biol. (1990) 14: 269-276), wo der pRiHRI-Replikationsstartpunkt (Jouanin et al., Mol. Gen. Genet. (1985) 201: 370-374) verwendet wird und für eine zusätzliche Stabilität der Pflanzen-Expressionsvektoren in Agrobacterium-Wirtszellen sorgt.
Die Verwendung von Vektoren wie die oben beschriebenen, die in Agrobacterium replizieren können, ist bevorzugt. Auf diese Weise ist eine Rekombination von Plasmiden nicht erforderlich, und die Wirts-Agrobacterium-vir-Bereiche können trans-agierende Faktoren liefern, die für die Übertragung der von T-DNA flankierten Sequenzen auf Wirtspflanzenzellen erforderlich sind.
Für die Transformation von Brassica-Zellen können zum Beispiel Agrobacterium-Transformationsverfahren verwendet werden. Ein solches Verfahren wird von Radke et al. beschrieben (Theor. Appl. Genet. (1988), 75: 685-694).
Es werden Verfahren bereitgestellt, mit denen eine Wachssynthesefähigkeit bei Pflanzenzellen bestimmt werden kann. Beispielhaft genannt seien Assays von Embryos von Brassica (sowohl Canola als auch erucasäurereicher Raps (HEAR)) und Arabidopsis, die beweisen, dass jedes eine Wachssyntheseaktivität auf einem niedrigen relativen Niveau im Vergleich zu demjenigen, das für Jojoba-Embryos bestimmt wurde, enthält. Auf diese Weise kann jede Pflanze getestet werden um eine endogene Wachssyntheseaktivität nachzuweisen und so Kandidaten für die Wachsesterproduktion zu bestimmen. Außerdem können bevorzugte Substrate der Wachssyntheseaktivität bestimmt werden, und das Reductase-Konstrukt kann maßgeschneidert werden, so dass es eine codierende Sequenz für eine Reductase, die ein bevorzugtes Fettalkoholsubstrat der endogenen Wachssyntheseaktivität produziert, oder alternativ dazu für eine Reductase, die so gewählt wurde, dass sie die Produktion eines gewünschten Wachsesters verstärkt, enthält.
Die in Brassica-Embryozellen beobachtete Wachssyntheseaktivität scheint eine Aktivität darzustellen, die Fettalkohol, der durch die exprimierte Jojoba-Reductase erzeugt wurde, in Wachsester umwandelt. Es wurde nicht bestimmt, ob eine solche Aktivität für die Umwandlung von Fettalkohol in Wachsester in Zellen, die mit einer zu der Pflanzenzelle homologen Reductase-codierenden Sequenz transformiert sind, verantwortlich ist. Die Aktivität, falls sie dafür verantwortlich ist, kann entweder ein dediziertes Enzym oder ein Enzym mit einer anderen primären Aktivität sein. Zum Beispiel könnte Diacylglycerin-Acyl-Transferase (DAGAT) in der Lage sein, die Ligase-Aktivität anzunähern.
Die Expression des Reductase-Proteins in Wirtspflanzenzellen, die bevorzugte Substrate der Acyl-Reductase enthalten, führt zu Zellen, die eine nachweisbare Wachsesterkomponente aufweisen. Während rohes Öl Wachsester enthält, der durch Hochtemperatur-Gaschromatographie nachweisbar ist, wird der Wachsester in derivatisiertem Öl zurück in seine Fettalkohol- und Fettacyl-Substrate umgewandelt, und somit ist es die Fettacylalkohol-Komponente des Esters, die nachgewiesen wird.
Das von diesen transgenen Pflanzen erhältliche Öl ist ein Gemisch von Wachsestern und Triacylglyceriden. Spermöl ist ebenfalls ein Gemisch solcher Komponenten. Einfache Verfahren, die bekannt sind und schon lange für die Abtrennung von Wachsen aus Pflanzenölen oder von Wachsestern aus Spermöl verwendet werden, können verwendet werden, um die Wachsester- und Triacylglyceridkomponenten des aus transgenen Reductase-Pflanzen erhaltenen Öls abzutrennen. Ein solches Verfahren ist das Ausfrieren, ein Entwachsungsvorgang, bei dem Öl abgekühlt wird, um eine Wachskomponente zu kristallisieren, die dann mechanisch als Feststoff aus dem Öl abgetrennt werden kann. Zahlreiche andere Fraktionierungsverfahren sind für solche Zwecke bekannt, einschließlich Extraktionsverfahren unter Verwendung von organischen Lösungsmitteln. Verschiedene solche Verfahren werden von Gunstone et al. in The Lipid Handbook, 2. Aufl., Chapman & Hall (1994), London, offenbart.
Nachdem die Erfindung nun allgemein beschrieben wurde, wird sie unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele besser zu verstehen sein.
Beispiele
Beispiel 1 – Acyl-CoA-Reductase-Assays
Verfahren zum Testen auf Acyl-CoA-Reductase-Aktivität in mikrosomalen Membranpräparaten oder solubilisierten Proteinpräparaten werden beschrieben.
A. Radioaktiv markiertes Material
Langkettige [1-¹⁴C]-Fettsäuren (spezifische Aktivität 51-56 Ci/mol), nämlich 11-cis-Eicosensäure, 13-cis-Docosensäure und 15-cis-Tetracosensäure werden durch die Reaktion von Kalium[¹⁴C]cyanid mit dem entsprechenden Alkylmesylat und anschließende basische Hydrolyse des Alkylnitrils zur freien Fettsäure hergestellt. Die freien Fettsäuren werden mit Diazomethan in Ether in ihre Methylester umgewandelt und durch präparative Silbernitrat-Dünnschichtchromatographie (DC) gereinigt. Die Fettsäuremethylester werden zu den freien Fettsäuren zurückhydrolysiert. Die radiochemische Reinheit wird durch drei DC-Verfahren bewertet: Normalphasen-Silica-DC, Silbernitrat-DC und C18-Umkehrphasen-DC. Die durch diese Verfahren gemessene radiochemische Reinheit betrug 92-98%. Langkettige [1-¹⁴C]-Acyl-CoAs werden nach dem Verfahren von Young und Lynen (J. Bio. Chem. (1969) 244: 377) aus den entsprechenden freien [1-¹⁴C]-Fettsäuren bis zu einer spezifischen Aktivität von 10 Ci/mol hergestellt. Andere [1-¹⁴C]-Acyl-CoAs, wie [1-¹⁴C]-Tetracosenoyl-CoA, wurden von Amersham (Arlington Heights, IL) bezogen. [1-¹⁴C]-Hexadecanal wird durch die Dichromat-Oxidation von [1-¹⁴C]-Hexadecan-1-ol gemäß einer Mikromaßstab-Modifikation des Verfahrens von Pletcher und Tate (Tet. Lett. (1978) 1601-1602) hergestellt. Das Produkt wird durch präparative Silica-DC gereinigt und als Hexanlösung bis zur Verwendung bei –70 °C aufbewahrt.
B. Assay auf Reductase-Aktivität in einem mikrosomalen Membranpräparat

1. Assay 1: Die Reductase-Aktivität in einem mikrosomalen Membranpräparat wird durch Inkubation von 20 μM [1-¹⁴C]-Acyl-CoA (gewöhnlich Tetracosenoyl-CoA, spezifische Aktivität 2-5 Ci/mol) mit der zu testenden Probe und 2 mM NADPH in einem Gesamtvolumen von 0,25 ml gemessen. Das Inkubationsgemisch enthält auch 10% (w/v) Glycerin, 1 mM DTT und wird mit 50 mM HEPES (4-[2-Hydroxyethyl]-1-piperazinethansulfonsäure) gepuffert (HEPES wird hier und bei späteren Erwähnungen aus einer auf pH 7,5 eingestellten 1 M Stammlösung zugegeben). Der Assay wird durch die Zugabe von Acyl-CoA-Substrat gestartet, und die Inkubation wird eine Stunde lang bei 30 °C durchgeführt. Der Assay wird beendet, indem man das Assayröhrchen auf Eis stellt und sofort 0,25 ml Isopropanol:Essigsäure (5:1 v/v) hinzufügt. Unmarkierte Wachsester (0,1 mg) und Oleylalkohol (0,1 mg) werden als Träger hinzugefügt. Die [¹⁴C]-Lipide werden durch die Vorschrift von Hara und Radin (Anal. Biochem. (1978) 90: 420) im heruntergesetzten Maßstab extrahiert. Zu dem beendeten Assay werden 6 ml Hexan/Isopropanol (3:2, v/v) gegeben. Die Probe wird mit dem Wirbelmischer gemischt, 2 ml wässrige Natriumsulfatlösung (5,5% w/v) werden hinzugefügt, und die Probe wird erneut mit dem Wirbelmischer gemischt.
2. Assay 2: Die Reductase-Aktivität in einem mikrosomalen Membranpräparat wird durch Inkubation von 20 μM [1-¹⁴C]-Acyl-CoA (gewöhnlich Tetracosenoyl-CoA, spezifische Aktivität 2-5 Ci/mol) mit der zu testenden Probe und 2 mM NADPH in einem Gesamtvolumen von 0,25 ml gemessen. Das Inkubationsgemisch enthält auch 10% (w/v) Glycerin, 1 mM DTT und wird mit 50 mM HEPES (4-[2-Hydroxyethyl]-1-piperazinethansulfonsäure) gepuffert (HEPES wird hier und bei späteren Erwähnungen aus einer auf pH 7,5 eingestellten 1 M Stammlösung zugegeben). Wenn man eine Acyl-CoA:Alkohol-Acyl-Transferase-Aktivität, die ebenfalls in dem Membranpräparat vorhanden ist (und die das Produkt der Reductase-Reaktion verbraucht) hemmen möchte, werden 0,3% (w/v) CHAPS in dem Assaygemisch mitverwendet. Diese CHAPS-Konzentration hat eine minimale Wirkung auf das Reductase-Enzym, hemmt aber die Acyl-Transferase-Reaktion vollständig und vereinfacht so die Quantifizierung der Reductase-Aktivität.

Der Assay wird durch die Zugabe von Acyl-CoA-Substrat gestartet, und die Inkubation wird eine Stunde lang bei 30 °C durchgeführt. Der Assay wird beendet, indem man das Assayröhrchen auf Eis stellt und sofort 0,25 ml Isopropanol:Essigsäure (4:1 v/v) hinzufügt. Unmarkierte Wachsester (25 μg), Oleylalkohol (50 μg) und Oleinsäure (50 μg) werden als Träger hinzugefügt. Die [¹⁴C]-Lipide werden durch die Vorschrift von Hara und Radin (Anal. Biochem. (1978) 90: 420) im heruntergesetzten Maßstab extrahiert. Zu dem beendeten Assay werden 4 ml Hexan/Isopropanol (3:2, v/v) gegeben. Die Probe wird mit dem Wirbelmischer gemischt, 2 ml wässrige Natriumsulfatlösung (6,7% w/v) werden hinzugefügt, und die Probe wird erneut mit dem Wirbelmischer gemischt.
C. Assay auf solubilisierte Reductase-Aktivität
Zum Bestimmen der solubilisierten Reductase-Aktivität sind mehrere Veränderungen einschließlich der Zugabe eines Salzes zur Enzymaktivierung erforderlich. Der Assaypuffer für einen solubilisierten Reductase-Assay entspricht dem, der oben für den Assay des mikrosomalen Membranpräparats angegeben ist, mit den folgenden Änderungen:

a. NaCl wird bis zu einer Endkonzentration zwischen 0,3 und 0,5 M hinzugefügt;
b. EDTA wird in einer Konzentration von ca. 1 mM mitverwendet; und
c. die zu testende Enzymprobe, die typischerweise 0,75% CHAPS enthält, wird auf ≤ 0,3% verdünnt (die CMC für CHAPS beträgt ca. 0,5%).

D. Analyse von Assayprodukten
Zum Analysieren der Produkte entweder des Reductase-Assays am mikrosomalen Membranpräparat oder des solubilisierten Reductase-Assays wurden zwei Vorschriften entwickelt. Eine Vorschrift, die unten als "extensiver Assay" beschrieben ist, ist zeitraubender, liefert jedoch in höherem Maße quantitative Ergebnisse. Die andere Vorschrift, die unten als "schneller Assay" beschrieben ist, liefert ebenfalls ein Maß für die Reductase-Aktivität, ist aber schneller, bequemer und weniger quantitativ.

1. Extensive Analyse: Nach der Zugabe des Natriumsulfats und dem Mischen der Probe mit dem Wirbelmischer wird die obere, organische Phase entfernt, und die untere, wässrige Phase wird mit 4 ml Hexan/Isopropanol (7:2 v/v) gewaschen. Die organischen Phasen werden vereinigt und unter Stickstoff zur Trockne eingedampft. Der Lipidrückstand wird in einem kleinen Volumen Heptan resuspendiert, und von einem Aliquot wird die Radioaktivität mit einem Flüssig szintillationszähler bestimmt. Der Rest der Probe kann entweder für eine DC-Analyse der markierten Klassen oder zur Derivatisierung unter Spaltung der Wachsester verwendet werden und dadurch ein Maß für den produzierten Gesamtalkohol ergeben.

Für die Lipidklassenanalyse wird die Probe auf eine Silica-DC-Platte aufgetragen, und die Platte wird in Hexan/Diethylether/Essigsäure (wie 80:20:1 oder 70:30:1 v/v/v) entwickelt. Die Verteilung der Radioaktivität zwischen den Lipidklassen, größtenteils Wachsester (wenn Ligase vorhanden ist, wie im Assay mit dem mikrosomalen Membranpräparat), freien Fettsäuren, Fettalkoholen und polaren Lipiden am Ursprung wird mit Hilfe eines AMBIS-Radioanalyse-Bildgebungssystems (AMBIS Systems Inc., San Diego, CA) gemessen. Falls notwendig, können die einzelnen Lipidklassen zur weiteren Analyse von der DC-Platte zurückgewonnen werden.
Zur Spaltung der Wachsester wird eine Vorschrift auf der Basis der Grignard-Derivatisierungsvorschrift von Pina et al. (Lipids (1987) 22: 358-361) im verkleinerten Maßstab verwendet. Die Probe plus 200 μg Trägerwachsester wird in einem Glasröhrchen, das mit einem teflonbeschichteten Schraubverschluss ausgestattet ist, heruntergetrocknet. Trockener Diethylether (0,4 ml), Ethylacetat (3 μl) und 3 M Ethylmagnesiumbromid in Diethylether (0,1 ml) werden nacheinander hinzugefügt. Die Probe wird mit dem Wirbelmischer gemischt und wenigstens 2 Stunden lang bei Raumtemperatur stehen gelassen, und danach wird wassergesättigter Diethylether vorsichtig hinzugefügt, um überschüssiges Reagens zu zerstören. Jeweils 2 ml 1 M HCl und Hexan werden hinzugefügt, und die Probe wird mit dem Wirbelmischer gemischt. Die obere, organische Phase wird mit Wasser (2 × 2 ml) gewaschen und in Gegenwart von 50-100 μl Ethanol zur Trockne eingedampft.
Die Probe wird in 50-100 μl Hexan resuspendiert und auf eine DC-Platte aufgetragen. Sowohl Normal- als auch Umkehrphasen-DC-Systeme wurden für die Analyse verwendet. Bei Normalphasen-DC wird eine Silica-DC-Platte verwendet, die mit Hexan/Diethylether/Essigsäure (70:30:2 v/v/v) entwickelt wird. Bei dem Umkehrphasensystem werden C18-Platten verwendet, die in Methanol entwickelt werden.

2. Schnelle Analyse: Nach der Zugabe des Natriumsulfats und dem Mischen der Probe mit dem Wirbelmischer wird ein bekannter Prozentsatz der organischen Phase entfernt und mit dem Flüssigszintillationszähler gezählt. Diese Berechnung wird verwendet, um die Gesamtradioaktivität in der organischen Phase abzuschätzen. Dann wird ein anderer Teil der organischen Phase entfernt, unter Stickstoff heruntergetrocknet, in Heptan wieder aufgelöst und auf DC-Platten getüpfelt und entwickelt und abgetastet, wie es für den ausführlichen Assay beschrieben ist. Auf diese Weise wird der Prozentsatz der Gesamtradioaktivität, die in Alkohol eingebaut ist, bestimmt.

Beispiel 2 – Charakterisierung von Jojoba-Acyl-CoA-Reductase
Verfahren, um Proteinpräparate mit Reductase-Aktivität zu erhalten, und Ergebnisse von Studien dieser enzymatischen Aktivität werden beispielhaft unter Verwendung von Jojoba beschrieben.
A. Samenentwicklung und Acyl-CoA-Reductase-Aktivitätsprofile
Die embryonale Entwicklung wurde über zwei Sommer hinweg an fünf Pflanzen in Davis, CA, verfolgt. Es zeigte sich, dass das Frisch- und Trockengewicht der Embryos von etwa Tag 80 bis etwa Tag 130 mit einer einigermaßen stetigen Geschwindigkeit zunahm. Lipidextraktionen zeigen Folgendes: Wenn das Frischgewicht der Embryos etwa 300 mg erreicht (etwa Tag 80), erreicht das Verhältnis von Lipidgewicht zu Trockengewicht das maximale Niveau von 50%.
Die Acyl-CoA-Reductase-Aktivität wurde in sich entwickelnden Embryos gemessen, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Da bestimmt wurde, dass die Hüllen der Jojobasamen die Quelle eines oder mehrerer hemmender Faktoren sind, wurden die Samenhüllen entfernt, bevor die Embryos zur Lagerung in flüssigem Stickstoff bei –70 °C eingefroren wurden.
Die Entwicklungsprofile für Acyl-CoA-Reductase-Aktivitäten, wie sie entweder in einem zellfreien Homogenisat oder einer Membranfraktion gemessen wurden, weisen auf eine starke Induktion der Reductase-Aktivität hin, die ungefähr 115 Tage nach der Blüte ihren Spitzenwert erreicht. Embryos für enzymologische Studien wurden also etwa 90 bis 110 Tage nach der Blüte geerntet, einer Zeit, wenn die Reductase-Aktivität hoch ist, die Lipidablagerung noch keine Maximalwerte erreicht hat und sich die Samenhülle leicht entfernen lässt. Die höchste Geschwindigkeit der Zunahme der Reductase-Aktivität wird zwischen den Tagen 80 und 90 nach der Blüte beobachtet. Embryos für den Aufbau einer cDNA-Bibliothek wurden also etwa 80 bis 90 Tage nach der Blüte geerntet, wenn die Synthesegeschwindigkeit des Reductase-Proteins vermutlich am größten ist. Entsprechend würde man annehmen, dass die Konzentration an mRNA, die Acyl-CoA-Reductase codiert, in diesem Stadium maximal ist.
B. Fraktionierungsstudien
Frühe Versuche, Proben von Jojoba-Embryos zu fraktionieren, führten zu einer _variablen Verteilung der Reductase-Aktivität in der Fettschicht, im Überstand und in den teilchenförmigen Fraktionen, die sich aus der Zentrifugation ergaben. Eine große Zahl von Behandlungen, die potentiell die Verteilung der Aktivität beeinflussen könnten, wurde getestet, wie Ultraschallbehandlung, Flotationsgradienten und die Zugabe verschiedener Agentien zum Extraktionspuffer. Die Mitverwendung von Salzen im Extraktionspuffer führte zur größten Verbesserung de_r Rückgewinnung von Ligase-Aktivität in der Überstandsfraktion nach einer Stunde Zentrifugation mit 100 000 × g. Der Extraktionspuffer besteht aus 3 M NaCl, 0,3 M Saccharose, 100 mM HEPES, 2 mM DTT und den Protease-Inhibitoren 1 mM EDTA, 0,7 mg/ml Leupeptin, 0,5 mg/ml Pepstatin und 17 mg/ml Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF).
C. Mikrosomale Membranpräparate
Teilchen mit hohem Grad an Reductase-Aktivität können entweder durch Dialyse mit anschließender Zentrifugation mit 100 000 × g oder durch Ammoniumsulfat- Fraktionierung aus der oben beschriebenen Überstandsfraktion erhalten werden. Das Dialyseverfahren wird ausführlich in Beispiel 3 beschrieben. Bei der weiteren Analyse dieser Teilchen mit Reductase-Aktivität, wie Dichtegradientenzentrifugation, Gelpermeationschromatographie und Protein/Phospholipid-Analyse, wird festgestellt, dass diese Teilchen eine Membranfraktion darstellen. Dieses Membranpräparat hat auch eine hohe Cytochrom-c-Reductase-Aktivität, eine Aktivität, die als Marker für Membranen des Endoplasmatischen Retikulums (ER) verwendet wird. Bei diesen Studien wird also festgestellt, dass das Reductase-Protein mit Membranen assoziiert ist.
Für die Ammoniumsulfat-Fraktionierung wird der Überstand aus der Zentrifugation mit 100 000 × g im Wesentlichen so, wie es in Beispiel 3 beschrieben ist, aus Jojoba-Embryos erhalten. Ein gleiches Volumen an Ammoniumsulfatlösung (33,2 g/100 ml) wird langsam zu der Überstandsfraktion gegeben (unter Rühren), so dass die Ammoniumsulfatkonzentration auf 30% gebracht wurde, eine Konzentration, die das Reductase-Enzym effektiv ausfällt. Nach weiteren 30 min Rühren wird die Suspension 30 min lang mit 26 000 × g zentrifugiert, und das Sediment wird in einem Zehntel des Volumens der ersten Überstandsfraktion 51 resuspendiert, wobei man eine Lösung verwendete, die aus 25 mM HEPES, 1 M NaCl, 1 mM DTT und 0,1 mM PMSF bestand. Die Suspension wird eine Stunde lang mit 100 000 × g zentrifugiert, und das resultierende Sediment wird in 25 mM HEPES, 10% Glycerin, resuspendiert (wiederum in 1/10 des S1-Volumens). Eine Zentrifugation dieser Suspension mit 100 000 × g ergibt das gewaschene mikrosomale Sediment P4, das in 1/20 des S1-Volumens an 25 mM HEPES, 10% Glycerin, resuspendiert wird, was eine Proteinkonzentration von etwa 3-4 mg/ml ergibt. Aliquote werden zur späteren Verwendung bei –70 °C eingefroren.
D. Untersuchung der Membranassoziation der Reductase-Aktivität
Das von Bordier beschriebene Triton^®-X114-Phasenfraktionierungsverfahren wird verwendet, um zu bestimmen, ob die Jojoba-Reductase ein integrales Membranprotein ist oder lockerer mit der Membranschicht assoziiert ist (hydrophilere Proteine). Diese Technik beinhaltet im Wesentlichen die Inkubation der Membranen mit 1% Triton^® X114 auf Eis und die anschließende Erhöhung der Temperatur des Gemischs über den Trübungspunkt des Tensids unter diesen Bedingungen (der Trübungspunkt ist die Temperatur, bei der sich spontan sehr große Micellen zu bilden beginnen; für 1% Triton^® X114 ist dies ca. 20 °C). Nach der Zentrifugation können zwei getrennte Phasen beobachtet werden, eine untere tensidreiche Phase und eine obere tensidabgereicherte Phase (die hier als wässrige Phase bezeichnet wird). Es hat sich gezeigt, dass integrale Membranproteine vorzugsweise in die tensidreiche Phase übergehen, während hydrophilere Proteine in der wässrigen Phase gewonnen werden. Wenn Jojoba-Membranpräparate dieser Triton^®-X114-Phasenfraktionierungsvorschrift unterzogen werden, ist die Reductase-Aktivität mit der tensidangereicherten Phase assoziiert, und in der wässrigen Phase wird keine Reductase-Aktivität nachgewiesen. Dies beweist, dass das Reductase-Enzym ein integrales Membranprotein ist.
E. Weitere Charakterisierung des Reductase-Enzyms
Das oben beschriebene mikrosomale Membranpräparat wird für die weitere Charakterisierung des Reductase-Enzyms verwendet. Es zeigte sich, dass das Reductase-Enzym über einen Bereich von pH 5-9 aktiv ist. Charakterisierungsexperimente wurden bei pH 7,5 durchgeführt, was nahe am mutmaßlichen physiologischen pH-Wert des Cytoplasmas ist.

1. Salzeffekte: Eine Vielzahl von Salzen wurde auf ihre Wirkung auf die Reductase-Aktivität untersucht, wobei für einbasige Salze eine Standardkonzentration von 0,5 M verwendet wurde. Salze mit zweiwertigen Kationen oder Anionen wurden in einer Konzentration von 0,167 M (was dieselbe Ionenstärke wie die 0,5 M einbasigen Salze ergibt) und auch 0,5 M untersucht. Bei der Zugabe von 0,5 M NaCl wird eine Stimulierung von bis zum 15fachen beobachtet. Es zeigte sich, dass auch andere Salze, sowohl einwertige als auch zweiwertige (wie LiCl, KCl, MgCl₂, CaCl₂ nd Na₂SO₄), die Reductase-Aktivität stimulieren, wenn auch im Allgemeinen in einem geringeren Ausmaß als die NaCl-Stimulierung. Stark chaotrope Salze, KSCN und NaSCN, ergaben keine Stimulierung oder nur eine marginale Stimulierung der Reductase-Aktivität.
2. Weitere Effektoren: Es zeigte sich, dass Dithiothreit (DTT) die Reductase-Aktivität stimuliert, aber nicht obligatorisch dafür ist, während Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) eine gewisse Stimulierung ergab, wobei die optimale Konzentration 2,5 mM betrug. Bei niedrigen (0,02-0,075 mg/ml) Konzentrationen an BSA (Rinderserumalbumin) wurde eine geringe Stimulierung der Aktivität beobachtet, während bei BSA-Konzentrationen von 0,2 mg/ml und darüber eine Hemmung der Aktivität beobachtet wurde. Frühere Beobachtungen, dass die Acyl-CoA-Reductase eine NADPH-spezifische Aktivität ist (Pollard et al., loc. cit.), wurden bestätigt. Keine NADH-abhängige Aktivität über der Hintergrundaktivität (< 2% der NADPH-abhängigen Aktivität) war messbar. Außerdem ergeben beide wasserlöslichen Endprodukte der Reductase-Reaktion, CoA und NADP+, eine erhebliche Hemmung der Aktivität (bei millimolaren Konzentrationen), während NADH und NAD+ nur marginale Wirkungen auf die Aktivität haben.
3. Substratspezifität: Die Thioester von Fettsäuren verschiedener Kettenlänge, Acyl-ACPs und Acyl-CoAs, wurden als Substrate für das Reductase-Enzym miteinander verglichen. Tests wurden bei Substratkonzentrationen von 10 μM durchgeführt, da das Substrat Tetracosenoyl-CoA (24:1-CoA) bei größeren Konzentrationen eine starke Substrathemmung zeigt. Die NaCl-Konzentration in diesen Assays beträgt 0,5 M. Ergebnisse des Substratspezifitätsexperiments sind in der folgenden Tabelle 1 aufgeführt.

Tabelle 1: Acyl-Spezifität der Reductase
Tetracosenoyl-CoA hat die höchste Substrataktivität von den getesteten Substraten und wird daher für Reductase-Assays in weiteren Enzymreinigungs- und Charakterisierungsexperimenten verwendet. Interessanterweise wurden Palmitoyl-CoA (C16:0-CoA) und Palmitoyl-ACP (C16:0-ACP) als Substrate direkt miteinander verglichen. Die Aktivität gegenüber Palmitoyl-CoA lag kaum über der Hintergrundaktivität, während die Aktivität gegenüber Palmitoyl-ACP hoch war. Schon früher wurde gezeigt, dass Stearoyl-ACP (C18:0-ACP) Aktivität als Substrat aufweist (Pollard et al., loc. cit.).
Was ebenfalls interessant ist: Palmitoyl-CoA scheint zwar ein schlechtes Substrat für das Reductase-Enzym zu sein, doch trat in einem Experiment zur kompetitiven Hemmung, das unter Verwendung von unmarkiertem Palmitoyl-CoA (0-30 mM) und [1-¹⁴C]-Tetracosenoyl-CoA (20 mM) durchgeführt wurde, eine 50%ige Hemmung der Reductase-Aktivität gegenüber Tetracosenoyl-CoA bei 5 mM Palmitoyl-CoA auf. Palmitoyl-CoA ist also unter den Assaybedingungen zwar ein schlechtes Substrat, doch ein effektiver Inhibitor.

4. Reductase-Inhibitor-Assays: Mehrere bekannte Inhibitoren anderer Typen von Reductase-Proteinen wurden auf ihre Wirkung auf die Aktivität der Jojoba-Acyl-CoA-Reductase getestet. Mevinolin, das ein starker Inhibitor der HMG-CoA- Reductase (3-Hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzym-A-Reductase) ist, hat eine Wirkung nur bei relativ hohen Konzentrationen (100 μM) im Vergleich zu den Konzentrationen, bei denen HMG-CoA-Reductase gehemmt wird (Ki von ungefähr 1 nM). Es ist wohlbekannt, dass Cerulinen kovalent an β-Ketoacyl-Thioester-Synthasen bindet, doch hat es keine starke hemmende Wirkung auf die Jojoba-Acyl-CoA-Reductase.

Sulfhydryl-Blockierungsmittel wurden ebenfalls auf ihre Wirkung auf die Reductase-Aktivität durchmustert. Es zeigte sich, dass N-Ethylmaleinimid die Aktivität stark hemmt, während para-Hydroxymercuribenzoat ebenfalls eine gewisse hemmende Wirkung hat und Iodacetamid keine Wirkung hat. Dieses Beweismaterial führt zu dem Schluss, dass die Acyl-CoA-Reductase eine essentielle Sulfhydrylgruppe aufweist, die eine erhebliche Selektivität gegenüber verschiedenen Sulfhydryl-Blockierungsmitteln zeigt.
Beispiel 3 – Reinigung von Acyl-CoA-Reductase
Verfahren werden beschrieben, die für die Isolierung eines Jojoba-Membranpräparats mit Reductase-Aktivität, Solubilisierung der Reductase-Aktivität und weitere Reinigung des Reductase-Proteins verwendet werden können.
A. Mikrosomales Membranpräparat
Jojoba-Embryos werden ungefähr 90-110 Tage nach der Blüte geerntet, was durch Messung des Wassergehalts der Embryos (45-70%) abgeschätzt wird. Die äußeren Schalen und Samenhüllen werden entfernt, und die Keimblätter werden schnell in flüssigem Stickstoff eingefroren und für die zukünftige Verwendung bei –70 °C gelagert. Für ein Anfangsproteinpräparat werden gefrorene Embryos durch Zerstoßen in einem Stahlmörser bei der Temperatur des flüssigen Stickstoffs pulverisiert. In einem typischen Experiment werden 70 g Embryos verarbeitet.
Das Pulver wird in einem Verhältnis von 280 ml Lösung pro 70 g Embryos zu der folgenden Lösung mit hoher Salzkonzentration gegeben: 3 M NaCl, 0,3 M Saccha- rose, 100 mM HEPES, 2 mM DTT und die Protease-Inhibitoren 1 mM EDTA, 0,7 mg/ml Leupeptin, 0,5 mg/ml Pepstatin und 17 mg/ml PMSF. Ein zellfreies Homogenisat (CFH) wird gebildet, indem man die pulverisierten Embryos ungefähr 30 Sekunden lang mit einem Polytron-Gewebehomogenisator in dem Puffer dispergiert. Das Homogenisat wird über drei Schichten Miracloth (CalBio-Chem, LaJolla, CA) filtriert, und das Filtrat wird eine Stunde lang mit 100 000 × g zentrifugiert.
Die resultierende Probe besteht aus einem Sediment, einem Überstand und einer aufschwimmenden Fettschicht. Die Fettschicht wird entfernt, und die Überstandfraktion wird isoliert und über Nacht (mit dreimaligem Austausch der Pufferlösung) gegen eine Lösung dialysiert, die 1 M NaCl, 100 mM HEPES, 2 mM DTT und 1 mM EDTA enthielt. Das Dialysat wird eine Stunde lang mit 200 000 × g zentrifugiert, was ein Sediment DP2 ergab. Das Sediment wird in 25 mM HEPES (pH 7,5), 10% (w/v) Glycerin, 1 mM EDTA und 0,5 M NaCl in ungefähr 1/20 des ursprünglichen CFH-Volumens suspendiert, was das mikrosomale Membranpräparat ergab.
Die Aktivität wird so bestimmt, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Der Rückgewinnungsgrad der Acyl-CoA-Reductase-Aktivität wird auf ungefähr 30% der ursprünglichen Aktivität im zellfreien Homogenisat geschätzt. Die Acyl-CoA-Reductase-Aktivität in diesem Präparat ist stabil, wenn es bei –70 °C gelagert wird.
B. Solubilisierung von Reductase-Protein
Festes CHAPS (3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat) wird zu dem mikrosomalen Membranpräparat gegeben, was eine Endkonzentration von 2% (w/v) ergibt. Die Probe wird ungefähr eine Stunde lang auf Eis mit einer langsamen schaukelnden Bewegung inkubiert und dann mit 25 mM HEPES (pH 7,5), 10% Glycerin, 0,34 M NaCl, 1 mM EDTA verdünnt, um die CHAPS-Konzentration auf 0,75% und die von NaCl auf ungefähr 0,4 M zu senken. Dann wird die Probe eine Stunde lang mit 200 000 × g zentrifugiert, und der Überstand wird isoliert und auf Reductase-Aktivität getestet, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Typischerweise werden 85% der Reductase-Aktivität aus dem mikrosomalen Membranpräparat in der Überstandsfraktion isoliert. Die solubilisierte Reductase-Aktivität ist stabil, wenn sie bei –70 °C gelagert wird.
C. Blue-A-Säulenchromatographie
Eine Säule (1,8 × ca. 10 cm) mit einem Bettvolumen von ungefähr 25 ml, die Blue A (Cibacron Blue F3GA; Amicon Division, W.R. Grace & Co.) enthält, wird hergestellt, und die Säule wird mit Puffer A äquilibriert (25 mM HEPES (pH 7,5), 20% (w/v) Glycerin, 0,75% CHAPS, 1 mM EDTA), der 0,4 M NaCl enthält. Das oben beschriebene solubilisierte Reductase-Präparat wird auf die Blue-A-Säule geladen.
Die Säule wird mit mehreren Säulenvolumina Puffer A, der 0,4 M NaCl enthält, gewaschen und dann weiter mit Puffer A, der 0,5 M NaCl enthält, gewaschen. Mehr als 90% der Reductase-Aktivität binden an die Säule, während mehr als 85% der anderen Proteine hindurchlaufen. Reductase-Aktivität wird mit Puffer A, der 1,0 M NaCl enthält, aus der Säule eluiert. Fraktionen werden aufgefangen und auf Reductase-Aktivität getestet, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Fraktionen, die Reductase-Aktivität enthalten, werden vereinigt und bei –70 °C gelagert. Typischerweise werden 30-50% der geladenen Reductase-Aktivität durch Elution mit dem 1,0 M NaCl-Puffer gewonnen.
D. Ausschlusschromatographie
Die vereinigten aktiven Fraktionen aus der Blue-A-Säule werden durch Ultrafiltration in einer Druckzelle, die mit einer YM30-Membran (Amicon Division, W.R. Grace) ausgestattet ist, konzentriert. Typischerweise wird die Aktivität in ca. 90 ml von der Blue-A-Säule eluiert und auf ca. 8 ml konzentriert und wie folgt auf zwei Sephacryl^®-S100-Säulen aufgetragen. Die Säulen (2,5 × 75 cm) werden mit S100HR-Medium (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ) gepackt und mit Puffer A, der 0,5 M NaCl enthält, äquilibriert. Die Säulen werden mit den folgenden Proteinstandards in Bezug auf die Größe geeicht: Rinderserumalbumin (66 kD), Kohlensäure-Anhydrase (29 kD), Cytochrom c (12,4 kD) und blaues Dextran (verwendet, um das Hohlraumvolumen zu bestimmen). Auf jede der S100-Säulen wird ein 4-ml-Aliquot der konzentrierten Probe aufgetragen, und die Säulen werden mit einer linearen Fließgeschwindigkeit von ungefähr 17 cm/h entwickelt. Fraktionen werden ca. 4 Stunden lang aufgefangen, und die Reductase-Aktivität in den Fraktionen wird so gemessen, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist.
Mehr als 60% der aufgeladenen Aktivität werden in einem Hauptpeak gewonnen, der bei einer scheinbaren Molekülmasse von ungefähr 49 kD eluiert. Das Volumen der vereinigten aktiven Fraktionen beträgt ca. 30-35 ml/Säule.
E. Affinitätschromatograghie
Eine Säule (1,5 × ca. 2 cm) wird mit Palmitoyl-CoA-Agarose (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) gepackt und mit Puffer B (Puffer A, der 0,1 M NaCl enthält) äquilibriert. Die vereinigten aktiven Fraktionen aus den Gelfiltrationssäulen werden durch Ultrafiltration ca. 16fach konzentriert, wie es oben beschrieben ist. Dann wird die NaCl-Konzentration in der konzentrierten Probe durch Verdünnung mit Puffer A von 0,5 M auf ca. 0,1 M reduziert. Die verdünnte Probe wird auf die Säule aufgetragen, die dann mit mehreren Säulenvolumina Puffer B gewaschen wird. Dann wird die Säule mit 10 ml Puffer B, der 15 mM NADH enthält, und anschließend weiter mit Puffer B gewaschen. Die Reductase-Aktivität wird eluiert, indem man 15 ml 15 mM NADPH in Puffer B durch die Säule gibt. Typischerweise wird bei jedem Mal das Material aus einer einzigen Gelfiltrationssäule auf der Affinitätssäule verarbeitet, und mehr als 70% der auf die Säule aufgetragenen Aktivität werden durch Elution mit NADPH gewonnen. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und auf Reductase-Aktivität, Proteinkonzentration und Polypeptidzusammensetzung analysiert. Proteinkonzentrationen werden unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits (Bio-Rad Laboratories, Inc., Richmond, CA) auf der Basis des von Bradford beschriebenen Farbstoffbindungsverfahrens (Analy. Biochem. (1976) 72: 248-254) abgeschätzt. BSA wird als Referenzprotein verwendet.
F. Reinigungstabelle
Die Proteinausbeute und die Reductase-Aktivität in jedem Schritt in einem typischen Reinigungsexperiment sind in der folgenden Tabelle 2 aufgeführt.
Tabelle 2: Reinigung von Jojoba-Reductase
G. SDS-PAGE-Analyse
Die Polypeptidzusammensetzung der Probe wird durch SDS-PAGE analysiert (Laemmli, UK (1970), Nature (London) 227: 680-685). Die Proben werden durch Zugabe von SDS und Dithiothreit aus Stammlösungen bis zu einer Endkonzentration von 2% bzw. 30 mM für die Elektrophorese vorbereitet. Ungefähr 50 μl der Probe werden auf den Napf eines Acrylamid-Gels, das ein 12%iges Trenngel aufweist (NOVEX, San Diego, CA), gegeben. Die Molekülmassestandards wurden von Bio-Rad Laboratories bezogen. Das Protein wird durch Silberfärbung nachgewiesen (Blum et al., Electrophoresis (1987), 8: 93-99).
In der aktiven Probe aus der Affinitätssäule werden zwei deutliche Polypeptidbanden mit scheinbaren Molekülmassen von ungefähr 52 und 54 kD nachgewiesen, die zusammen > 95% des Proteins in diesem Präparat ausmachen. Weitere Analysen dieser Proben unter Verwendung eines Proteingröße-Markersystems, das einen 55-kD-Proteinstandard beinhaltet, führen zu alternativen Schätzungen der Molekülmasse von 54 kD und 56 kD. Da die scheinbare Größe des Reductase-Enzyms im nativen Zustand ungefähr 49 kD beträgt (bestimmt durch Ausschlusschromatographie und oben beschrieben), stellen diese Banden wahrscheinlich verwandte Formen des Reductase-Enzyms und nicht zwei verschiedene Untereinheiten eines einzigen Enzyms dar.
H. Übertragen von Proteinen auf Membranen durch Blotting
Die oben beschriebenen Reductase-Polypeptide werden weiter für die Aminosäuresequenzierung isoliert, indem man diese Proteine nach der SDS-PAGE auf Membranen aus entweder Nitrocellulose oder PVDF, entweder Immobilon-P (Millipore; Bedford, MA) oder ProBlott (Applied Biosystems; Foster City, CA) überträgt. Nitrocellulose wird bevorzugt, wenn die Proteine anschließend enzymatisch verdaut werden, während PVDF für N-terminale Sequenzierungverfahren und zum Sequenzieren von Peptiden, die aus einem Bromcyan-Abbau resultieren, geeignet ist.

1. Blotting auf Nitrocellulose: Wenn Protein durch Elektroblotting auf Nitrocellulose übertragen wird, beträgt die Blottingzeit typischerweise 1-5 Stunden in einem Puffer wie 25 mM Tris, 192 mM Glycin in 5-20% Methanol. Nach dem Elektroblotting werden die Membranen 2 Minuten lang in 0,1% (w/v) Ponceau S in 1% (v/v) Essigsäure angefärbt und in 2- bis 3mal ausgetauschter 0,1% (v/v) Essigsäure entfärbt, 2 Minuten nach jedem Austausch. Dann werden diese Membranen nass bei –20 °C in einem wärmeisolierten Kunststoffbeutel aufbewahrt. Wenn die Zeit es erlaubt, werden die Blots nicht eingefroren, sondern sofort zum Verdau verwendet, um Peptide für die Bestimmung der Aminosäuresequenz herzustellen, wie es unten beschrieben ist.
2. Blotting auf PVDF: Wenn Protein durch Elektroblotting auf Immobilon P PVDF übertragen wird, beträgt die Blottingzeit im Allgemeinen etwa 1-2 Stunden in einem Puffer wie 12,5 mM Tris/5 mM Glycin in 10% (v/v) Methanol. Nach dem Elektroblotting auf PVDF werden die Membranen 5 Minuten lang in 0,1% (w/v) Coomassie Blue in 50% (v/v) Methanol/10% (v/v) Essigsäure angefärbt und in 2- bis 3mal ausgetauschtem 50% (v/v) Methanol/10% (v/v) Essigsäure entfärbt, 2 Minuten nach jedem Austausch. Dann werden die PVDF-Membranen 30 Minuten lang an der Luft trocknen gelassen und dann trocken bei –20 °C in wärmeisolierten Kunststoffbeuteln aufbewahrt. Protein, das auf PVDF-Membranen, wie Pro Blott, übertragen wurde, kann direkt verwendet werden, um die N-terminale Sequenz des intakten Proteins zu bestimmen. Eine Vorschrift für das Elektroblotting von Proteinen auf ProBlott ist unten in Beispiel 4 A beschrieben.

Beispiel 4 – Bestimmung der Aminosäuresequenz
In diesem Beispiel werden Verfahren zur Bestimmung von Aminosäuresequenzen von Pflanzenproteinen, die mit Acyl-CoA-Reductase-Aktivität assoziiert sind, beschrieben.
A. Bromcyan-Spaltung von Protein und Trennung von Peptiden
Mit dem interessierenden Protein wird eine Bromcyan-Spaltung durchgeführt, wobei man die Methoden verwendet, die im technischen Handbuch des Probe-Design Peptide Separation System von Promega, Inc. (Madison, WI) beschrieben sind. Die Reductase-Proteine werden auf eine PVDF-Membran übertragen, wie es oben beschrieben ist. Proteinbanden werden aus dem Blot herausgeschnitten, in eine Lösung von Bromcyan in 70% (v/v) Ameisensäure gegeben und in dieser Lösung über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dieser Inkubation werden die Bromcyan-Lösungen entfernt, vereinigt und unter einem kontinuierlichen Stickstoffstrom unter Verwendung eines Reacti-Vap Evaporator (Pierce, Rockford, IL) getrocknet. Eine zusätzliche Elution von Bromcyan-Peptiden kann durchgeführt werden, um eine vollständige Entfernung zu gewährleisten, wobei man ein Peptidelutionslösungsmittel, wie 70% (v/v) Isopropanol, 0,2% (v/v) Trifluoressigsäure, 0,1 mM Lysin und 0,1 mM Thioglycolsäure, verwendet. Dann werden die Elutionslösungsmittel entfernt und zu dem Röhrchen, das die getrocknete Bromcyanlösung enthält, gegeben und getrocknet, wie es oben beschrieben ist. Das Elutionsverfah ren kann mit frischem Elutionslösungsmittel wiederholt werden. Dann werden 50 μl Wasser in HPLC-Qualität zu den getrockneten Peptiden gegeben, und das Wasser wird durch Verdampfung in einem Speed-Vac (Savant, Inc., Farmingdale, NY) entfernt.
Peptide werden getrennt, wobei man ein Tris/Tricine-SDS-PAGE-System verwendet, das demjenigen, das Schägger und von Jagow beschreiben (Anal. Biochem. (1987) 166: 368-379), ähnlich ist. Die Gele werden ungefähr 1 Stunde lang, oder bis der Tracking-Farbstoff vom unteren Rand des Gels herunterzulaufen beginnt, mit einer konstanten Spannung von 125-150 Volt laufen gelassen. Die Gele werden vor der Übertragung 15-30 Minuten lang in Übertragungspuffer (125 mM Tris, 50 mM Glycin, 10% (v/v) Methanol) getränkt. Die Gele werden 2 Stunden lang einem Blotting auf ProBlott-Sequenzierungsmembranen (Applied Biosystems, Foster City, CA) mit einer konstanten Spannung von 50 Volt unterzogen. Die Membranen werden mit Coomassie-Blau (0,1% in 50% (v/v) Methanol/10% (v/v) Essigsäure) angefärbt und 3 × 2 min lang in 50% (v/v) Methanol/10% (v/v) Essigsäure entfärbt. Die Membranen werden 30-45 Minuten lang an der Luft getrocknet, bevor sie trocken bei –20 °C aufbewahrt werden.
Auf ProBlott übertragene Peptide können direkt ohne Zugabe eines Polybren-beschichteten Glasfaserfilters auf die Sequencerkartusche des Proteinsequencers geladen werden. Die Peptide werden mit Hilfe eines von Applied Biosystems gelieferten, leicht modifizierten Reaktionszyklus BLOT-1 sequenziert. Außerdem wird Lösung S3 (Butylchlorid) durch eine 50:50-Mischung von S1 und S2 (n-Heptan und Ethylacetat) ersetzt. Diese beiden Modifikationen werden immer dann verwendet, wenn auf ProBlott übertragene Proben sequenziert werden.
B. Protease-Verdau und Trennung von Peptiden
Auf Nitrocellulose übertragene Proteine können einem Verdau mit Proteasen unterzogen werden, um Peptide zum Sequenzieren zu erhalten. Das verwendete Verfahren ist das Verfahren von Aebersold et al. (PNAS (1987) 84: 6970). Banden von den Reductase-Proteinen und auch eine gleiche Menge leere Nitrocellulose, die als Kontrolle verwendet werden soll, werden aus der Nitrocellulosemembran ausgeschnitten und mehrmals mit Wasser in HPLC-Qualität gewaschen, um das Ponceau S zu entfernen. Nach diesem Waschvorgang werden 1,0 ml 0,5% Polyvinylpyrrolidon (PVP-40, Aldrich, Milwaukee, WI) in 0,5%iger Essigsäure zu den Membranstücken gegeben, und dieses Gemisch wird 30 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Um das PVP-40 vollständig zu entfernen, werden Nitrocellulosestücke mit vielen Volumina Wasser in HPLC-Qualität (8 × 5 ml) gewaschen, wobei die Extinktion der Waschflüssigkeiten bei 214 nm auf einem Spektrophotometer überprüft wurde. Außerdem kann PVP-40 leichter entfernt werden, wenn die Banden erst nach der PVP-40-Behandlung und dem Waschen in kleine Stücke geschnitten werden. Durch diese beiden Modifikationen werden Probleme einer Störung durch das PVP-40 beseitigt.
Dann werden die Stücke in einem geeigneten Verdaupuffer suspendiert, zum Beispiel Trypsin-Verdaupuffer, 100 mM Natriumhydrogencarbonat, pH 8,2, oder Endoproteinase-gluC-Puffer, 25 mM Ammoniumcarbonat/1 mM EDTA, pH 7,8. Acetonitril wird bis zu einer Konzentration von 5-10% (v/v) zu dem Verdaugemisch gegeben. Protease wird in Verdaupuffer verdünnt und zu dem Verdaugemisch gegeben, typischerweise in einem Verhältnis von 1:10 (w/w) Protease zu Protein. Die Verdaumischungen werden 18-24 Stunden lang inkubiert. Zum Beispiel werden Trypsin-Verdaumischungen bei 37 °C inkubiert, und Endoproteinase-gluC-Verdaumischungen werden bei Raumtemperatur inkubiert. Ähnlich können auch andere Proteasen verwendet werden, um die Reductase-Proteine zu verdauen, einschließlich IysC und aspN. Während die einzelnen Verdaupufferbedingungen unterschiedlich sein können, sind die Vorschriften für den Verdau, die Peptidtrennung, Reinigung und Sequenzierung im Wesentlichen dieselben, wie sie für den Verdau mit Trypsin und gluC beschrieben wurden.
Nach der Inkubation über Nacht werden die Verdaureaktionen durch die Zugabe von 10 ml 10% (v/v) Trifluoressigsäure (TFA) oder 1 μl 100% TFA abgebrochen. Das Verdaugemisch wird von den Nitrocellulosestücken entfernt, die Nitrocellulosestücke werden mit 1-5 100-ml-Volumina Verdaupuffer mit 5-10% Acetonitril gewaschen, und diese Volumina werden in einem Speed-Vac auf ein Volumen von weniger als 100 ml konzentriert. Die Peptide werden auf einer Vydac-Umkehrphasen-C18-Säule (2,1 mm × 100 mm) getrennt, die in einem High Performance Liquid Chromatograph (HPLC) Modell 130 von Applied Biosystems (Foster City, CA) installiert war. Die zum Eluieren verwendeten mobilen Phasen sind: Puffer A: 0,1 mM Natriumphosphat, pH 2,2; Puffer B: 70% Acetonitril in 0,1 mM Natriumphosphat, pH 2,2. Ein dreistufiger Gradient von 10-55% Puffer B über zwei Stunden, 55-75% Puffer B über 5 Minuten und 75% Puffer B isokratisch über 15 Minuten bei einer Fließgeschwindigkeit von 50 ml/Minute wird verwendet. Peptide werden bei 214 nm nachgewiesen, von Hand gesammelt und dann bei –20 °C aufbewahrt.
C. N-terminales Sequenzieren von Proteinen und Peptiden
Alle Sequenzierungen werden durch Edman-Abbau mit einem 477A Pulsed-Liquid Phase Protein Sequencer von Applied Biosystems durchgeführt; Phenylthiohydantoin(PTH)-Aminosäuren, die vom Sequencer produziert werden, werden mit einem direktgekoppelten 120A PTH Analyzer von Applied Biosystems analysiert. Daten werden mit Hilfe eines Datenanalysesystems Modell 610A von Applied Biosystems für den Apple Macintosh und auch auf einem Digital Microvax mit Hilfe einer ACCESS*CHROM-Software von PE Nelson, Inc. (Cupertino, CA) gesammelt und gespeichert. Sequenzdaten werden von einem Registrierschreiber, der die Eingabe vom PTH Analyzer empfängt, abgelesen und unter Verwendung von quantitativen Daten, die von der Software Modell 610A erhalten werden, bestätigt. Alle Sequenzdaten werden unabhängig von zwei Bedienern mit Hilfe des Datenanalysesystems abgelesen.
Für Peptidproben, die als Peaks aus einer HPLC erhalten werden, wird die Probe auf einen Polybren-beschichteten Glasfaserfilter (Applied Biosystems, Foster City, CA) aufgebracht, der vorab 3 Zyklen im Sequencer unterzogen worden war. Für Peptide, die reduziert und alkyliert wurden, wird ein Teil des PTH-Aminosäureprodukt-Materials aus jedem Sequenzierungszyklus in einem Flüssigszintillationszähler gezählt. Bei Proteinproben, die durch Elektroblotting auf Immobilon-P übertragen wurden, wird die interessierende Bande ausgeschnitten und dann auf einen Polybren-beschichteten Glasfaserfilter gelegt, wie oben vorab Zyklen unterworfen, und die Reaktionskartusche wird gemäß den Spezifikationen des Herstellers montiert. Bei Proteinproben, die durch Elektroblotting auf ProBlott übertragen wurden, ist der Glasfaserfilter nicht erforderlich.
Zum Erhalt von Proteinsequenzen aus kleinen Probenmengen (5-30 pmol) werden der Umwandlungszyklus des 477A und der Analyzer 120A gemäß der Beschreibung von Tempst und Riviere (Anal. Biochem. (1989) 183: 290) modifiziert.
D. Aminosäuresequenz von Reductase-Peptiden
Gereinigte Reductase-Präparate werden auf SDS-PAGE aufgetragen, um die 54-kD- und die 56-kD-Proteine zu trennen. Das getrennte Material wird auf eine Membran des Nitrocellulosetyps (Immobilon N) übertragen und mit Ponceau Red angefärbt, um die Banden zu lokalisieren. Herausgeschnittene Teile der Blots, die entweder das 56-kD- oder das 54-kD-Protein enthalten, werden mit Trypsin behandelt, und die tryptischen Peptide werden durch Umkehrphasen-HPLC aufgetrennt. Sequenzinformationen, die von mehreren Peptiden (SEQ ID Nr. 1-18) von jedem Reductase-Protein erhalten wurden, sind unten in Tabelle 3 aufgeführt.
Tabelle 3: Peptidsequenzen von 54-kD- und 56-kD-Reductase-Proteinen
56-kD-Reductase-Peptide

1) AILVTGATGSLAK (SEQ ID NO: 1)
2) LQNExFGKELFK (SEQ ID NO: 2)
3) VTVVPGDITGEDL (SEQ ID NO: 3)
4) LGLDINVEK (SEQ ID NO: 4)
5) TIDNVPVYYGK (SEQ ID NO: 5)
6) YVEPVTYHVGSSAANPM (SEQ ID NO: 6)
7) LSALPEMAHR (SEQ ID NO: 7)
8) LVDIYK (SEQ ID NO: 8)
9) EGIVEADMFYFD (SEQ ID NO: 9)
10) AINWEDYFLKTxFPGVVExVL (SEQ TD NO: 10)

54-kD-Reductase-Peptide

1) AILVTGATGSLAK (SEQ ID NO: 11)
2) LGLDINVEK (SEQ ID NO: 12)
3) TIDNVPVYYG (SEQ ID NO: 13)
4) YVEPVTYxVGSSAAN (SEQ ID NO: 14)
5) LVDIYKp (SEQ ID NO : 15)
6) EGIVEADMFYF (SEQ ID NO: 16)
7) AINWEDYFL (SEQ ID NO: 17)
8) THFPGVVEHVL (SEQ ID NO: 18)

Die Peptidsequenzen sind unter Verwendung des Standard-Ein-Buchstaben-Codes für Aminosäuren aufgeführt. Ein "x" zeigt an, dass die Aminosäure in dieser Position nicht identifiziert wurde. Aminosäurebezeichnungen in Kleinbuchstaben zeigen an, dass die Identifizierung für diese Aminosäure vorläufig war.
Die Ähnlichkeit zwischen den beiden Reductase-Proteinen geht aus den obigen Peptidsequenzen hervor. Alle Peptide aus dem 54-kD-Protein findet man auch in den sequenzierten 56-kD-Peptiden. Es gibt nur eine Diskrepanz zwischen den bestimmten Aminosäuresequenzen und der Reductase-Aminosäuresequenz, die aus der cDNA abgeleitet ist, die die 56-kD-Reductase codiert (1 (SEQ ID Nr. 19)). Aminosäure 460 ist gemäß den cDNA-Sequenzdaten ein Serin. Informationen aus den 54-kD- und 56-kD-Peptiden 6 bzw. 9 zeigen an, dass sich auf dieser Position ein Glycin befindet.
E. Western-Analyse
Ein Teil der Reductase-cDNA (Beispiel 5), die die Aminosäuren 167-235 des Reductase-56-kD-Proteins codiert (siehe 1), wird in einen E.-coli-pGEX-Expressionsvektor (AMRAD; Burwood, Victoria; Australien) ligiert, und zwar im Raster für eine Expression des Reductase-Peptids ausgehend vom Taq-Promotor. Das resultierende Konstrukt wird verwendet, um E.-coli-Zellen für die Produktion des Reductase-Peptids zu transformieren. Das aus 69 Aminosäuren bestehende Peptid, das so produziert wird, wird gereinigt (Smith et al. (1988), Gene 67: 31- 40) und verwendet, um einen polyklonalen Antikörper gegen das Reductase-Peptid zu erhalten.
Ein Western-Blot eines gereinigten Reductase-Präparats, der die 56-kD- und 54-kD-Banden und ein zellfreies Jojoba-Homogenisat (Beispiel 3A) enthält, wird zur Analyse der Reductase-Präparate unter Verwendung des oben beschriebenen Antikörperpräparats hergestellt. Die 56-kD-Bande wird sowohl im zellfreien Homogenisat als auch in den gereinigten Reductase-Präparaten nachgewiesen, während die 54-kD-Bande nur im gereinigten Reductase-Präparat nachgewiesen wird. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass die 54-kD-Bande, die in dem gereinigten Reductase-Präparat beobachtet wird, ein Abbauprodukt des 56-kD-Proteins ist, das aus dem Reductase-Reinigungsverfahren resultiert.
Weiterhin führt eine Southern-Blot-Analyse von mit Restriktionsenzym verdauter genomischer Jojoba-DNA unter Verwendung von vier verschiedenen Restriktionsenzymen zum Nachweis einer größeren Bande und einer kleineren Bande, die mit der Reductase-cDNA-Sonde (Beispiel 5) hybridisieren.
Beispiel 5 – Jojoba-Reductase-cDNA
A. Jojoba-RNA-Isolierung
RNA wird nach einem Verfahren, das ursprünglich von Jackson und Larkins beschrieben wurde (Plant Physiol. (1976) 57: 5-10), gemäß einer Modifikation von Goldberg et al. (Developmental Biol. (1981) 83: 201-217) aus Polyribosomen isoliert. Bei diesem Verfahren werden alle Schritte, wenn nicht ausdrücklich etwas anderes angegeben ist, bei 4 °C durchgeführt. 10 g Jojoba-Embryos, die 80-90 Tage nach der Blüte gesammelt wurden, werden in einem Waring-Mischer in flüssigem Stickstoff gemahlen, bis das Gewebe zu einem feinen Pulver wird. Nachdem der flüssige Stickstoff verdampft ist, werden 170 ml Extraktionspuffer (200 mM Tris, pH 9,0, 160mM KCl, 25 mM EGTA, 70 mM MgCl₂, 1% Triton X-100, 05% Natriumdesoxycholat, 1 mM Spermidin, 10 mM β-Mercaptoethanol und 500 mM Saccharose) hinzugefügt, und das Gewebe wird etwa 2 Minuten lang homogenisiert. Das Homogenisat wird über steriles Miracloth filtriert und 20 Minuten lang mit 12 000 × g zentrifugiert. Der Überstand wird in einen sterilen 500-ml-Kolben dekantiert, und 1/19 Volumen einer 20%igen Tensidlösung (20% Brij 35, 20% Tween^® 40, 20% Noidet p-40 w/v) wird bei Raumtemperatur hinzugefügt. Die Lösung wird 30 Minuten lang bei 4 °C mit mäßiger Geschwindigkeit gerührt, und dann wird der Überstand 30 Minuten lang mit 12 000 × g zentrifugiert.
Etwa 30 ml Überstand werden in sterile Ti-60-Zentrifugenröhrchen aliquotiert und mit 7 ml einer Lösung unterschichtet, die 40 mM Tris, pH 9,0, 5 mM EGTA, 200 mM KCl, 30 mM MgCl₂, 1,8 M Saccharose, 5 mM β-Mercaptoethanol enthält. Die Röhrchen werden bis oben mit Extraktionspuffer gefüllt und 4 Stunden lang bei 4 °C in einem Ti60-Rotor mit 60 000 U/min zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wird der Überstand abgesaugt, und 0,5 ml Resuspensionspuffer (40 mM Tris, pH 9,0, 5 mM EGTA, 200 mM KCl, 30 mM MgCl₂, 5 mM β-Mercaptoethanol) werden in jedes Röhrchen gegeben. Die Röhrchen werden 10 Minuten lang auf Eis gelegt, und danach werden die Sedimente gründlich resuspendiert und vereinigt. Dann wird der Überstand 10 Minuten lang mit 120 × g zentrifugiert, um unlösliches Material zu entfernen. Ein Volumen selbstverdauter 1 mg/ml Proteinase K in 20 mM Tris, pH 7,6, 200 mM EDTA, 2% N-Laurylsarcosinat wird zu dem Überstand gegeben, und das Gemisch wird 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.
RNA wird ausgefällt, indem man 1/10 Volumen Natriumacetat und 2 Volumina Ethanol hinzufügt. Nach mehreren Stunden bei –20 °C wird RNA durch 30 Minuten Zentrifugation mit 12 000 × g bei 4 °C sedimentiert. Das Sediment wird in 10 ml TE-Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA) resuspendiert und mit dem gleichen Volumen Phenol, das mit Tris pH 7,5 gesättigt ist, extrahiert. Die Phasen werden getrennt, indem man 20 Minuten lang bei 4 °C mit 10 000 × g zentrifugiert. Die wässrige Phase wird entfernt, und die organische Phase wird mit einem Volumen TE-Puffer erneut extrahiert. Die wässrigen Phasen werden dann vereinigt und mit einem Volumen Chloroform extrahiert. Die Phasen werden wiederum durch Zentrifugation getrennt, und die wässrige Phase wird mit Ethanol ausgefällt, wie es oben beschrieben wurde, was die polyribosomale RNA ergibt.
Polysaccharid-Kontaminanten in dem polyribosomalen RNA-Präparat werden entfernt, indem man die RNA über eine Cellulosesäule (Sigma-cell 50) in Puffer mit hohem Salzgehalt (0,5 M NaCl, 20 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,1% SDS) laufen lässt. Die Kontaminante bindet an die Säule, und die RNA wird im Eluent aufgefangen. Die Eluentfraktionen werden vereinigt, und die RNA wird mit Ethanol ausgefällt. Dann wird die ausgefällte Gesamt-RNA in einem kleineren Volumen resuspendiert und auf eine Oligo-d(T)-Cellulosesäule aufgetragen, um die polyadenylierte RNA zu isolieren.
B. Aufbau einer cDNA-Bibliothek in einem Plasmidvektor
Polyadenylierte RNA wird verwendet, um eine cDNA-Bibliothek in dem Plasmid-Klonierungsvektor pCGN1703 aufzubauen, der von dem kommerziellen Klonierungsvektor Bluescribe M13- (Stratagene Cloning Systems; San Diego, CA) abgeleitet ist und wie folgt hergestellt wird. Der Polylinker von Bluescribe M13- wird durch Verdau mit BamHI, Behandlung mit Mungbohnen-Endonuclease und Ligierung der glatten Enden verändert, wobei ein BamHI-deletiertes Plasmid pCGN1700 entsteht. pCGN1700 wird mit EcoRI und SstI (benachbarte Restriktionsstellen) verdaut und mit einem synthetischen Linker assoziiert, der Restriktionsstellen für BamHI, PstI, XbaI, ApaI und SmaI, einen 5'-Überhang von AATT und einen 3'-Überhang von TCGA aufweist. Durch das Einsetzen des Linkers in pCGN1700 wird die EcoRI-Stelle^–beseitigt, die SstI-Stelle, die man in Bluescribe findet, regeneriert (hier auch zuweilen als "SacI" bezeichnet), und es werden die im Linker enthaltenen neuen Restriktionsstellen hinzugefügt. Das resultierende Plasmid pCGN1702 wird mit HindIII verdaut und mittels Klenow-Enzym mit glatten Enden versehen; die lineare DNA wird mit PvuII partiell verdaut und mit T4-DNA-Ligase in verdünnter Lösung ligiert. Eine Transformante, bei der der lac-Promotor-Bereich deletiert ist, wird ausgewählt (pCGN1703) und als Plasmid-Klonierungsvektor verwendet.
Kurz gesagt, das Klonierungsverfahren für die cDNA-Synthese ist wie folgt. Der Plasmid-Klonierungsvektor wird mit SstI verdaut, und an den resultierenden klebrigen 3'-Überhang-Enden werden Homopolymer-T-Schwänze erzeugt, wobei man terminate Desoxynucleotidyl-Transferase verwendet. Das Plasmid mit dem Schwanz wird durch Oligo(dA)-Cellulose-Chromatographie von unverdautem oder schwanzlosem Plasmid abgetrennt. Der resultierende Vektor dient als Primer für die Synthese von ersten cDNA-Strängen, die kovalent an beide Enden des Vektorplasmids gebunden sind. Die cDNA-mRNA-Vektorkomplexe werden in Gegenwart von Desoxyguanosintriphosphat mit terminaler Transferase behandelt, wobei G-Schwänze an den Enden der cDNA-Stränge entstehen. Der zusätzliche cDNA-mRNA-Komplex neben der BamHI-Stelle wird durch BamHI-Verdau entfernt, wobei ein cDNA-mRNA-Vektorkomplex mit einem klebrigen BamHI-Ende an einem Ende und einem G-Schwanz am anderen zurückbleibt. Dieser Komplex wird zyklisiert, wobei man einen assoziierten synthetischen Zyklisierungslinker verwendet, der ein klebriges 5'-BamHI-Ende, Erkennungssequenzen für die Restriktionsenzyme NotI, EcoRI und SstI und ein 3'-C-Schwanz-Ende aufweist. Nach der Ligierung und Reparatur wird der E.-coli-Stamm DH5a (BRL, Gaithersburg, MD) mit den zirkulären Komplexen transformiert, um die cDNA-Bibliothek zu erzeugen. Die Jojoba-Embryo-cDNA-Bank enthält ungefähr 1,5 × 10⁶ Klone mit einer mittleren Größe der cDNA-Inserts von ungefähr 500 Basenpaaren.
C. Aufbau einer cDNA-Bibliothek in einem Lambdavektor
Polyadenylierte Jojoba-RNA wird ebenfalls verwendet, um eine cDNA-Bibliothek im Klonierungsvektor IZAPII/EcoRI (Stratagene, San Diego, CA) aufzubauen. Die Bibliothek wird mit Hilfe von Vorschriften, DNA und Bakterienstämmen aufgebaut, wie sie vom Hersteller geliefert werden. Klone werden mit Hilfe von Gigapack-Gold-Verpackungsextrakten (Stratagene) verpackt, ebenfalls gemäß den Empfehlungen des Herstellers. Die auf diese Weise aufgebaute cDNA-Bibliothek enthält ungefähr 1 × 10⁶ Klone mit einer mittleren Größe der cDNA-Inserts von ungefähr 400 Basenpaaren.
D. Isolierung von Reductase-cDNA
PCR-Techniken mit Primern, die ausgehend von Reductase-Peptidsequenzen entworfen wurden, werden verwendet, um einen ungefähr 1 kb großen Teil einer Reductase-Nucleinsäuresequenz zur Durchmusterung der Jojoba-Bibliothek im bakteriellen Vektor pCGN1703 zu erzeugen.
Die Bibliothek wird mit Hilfe von in der Technik bekannten Techniken durchmustert, wie sie bei Maniatis et al. (loc. cit.) beschrieben sind. Ein Klon pCGN7571 für das 56-kD-Reductase-Protein wird erhalten, und die DNA-Sequenz wird bestimmt. Die Nucleinsäure- und davon abgeleitete Aminosäuresequenz von pCGN7571 (SEQ ID Nr. 19) sind in 1 dargestellt.
E. Expression von Reductase-cDNA in E. coli
pCGN7571 wird einer in-vitro-Mutagenese unterzogen, um eine NdeI-Stelle am ersten ATG der Reductase-codierenden Sequenz und eine BglII-Stelle unmittelbar stromaufwärts der NdeI-Stelle einzuführen. BamHI-Linker werden in die SphI-Stelle stromabwärts des Reductase-codierenden Bereichs eingeführt. Das 1,5-kb-BglII-BamHI-Fragment wird einer Gelreinigung unterzogen und in mit BglII-BamHI verdautes pCGN3686 (siehe unten) kloniert, was zu pCGN7582 führt.
pCGN3686 ist ein Klonierungsvektor, der von Bluescript KS+ (Stratagene Cloning Systems; San Diego, CA) abgeleitet ist, aber ein Chloramphenicol-Resistenz-Gen und einen modifizierten Linkerbereich aufweist. Die Quelle des Chloramphenicol-Resistenz-Gens, pCGN565, ist ein auf pUC12-cm basierender Klonierungsvektor (K. Buckley, Doktorarbeit, Regulation and expression of the phi X174 lysis gene, University of California, San Diego, 1985), der aber pUC18-Linker enthält (Yanisch-Perron et al., Gene (1985), 53: 103-119). pCGN565 wird mit HhaI verdaut, und das Fragment, das das Chloramphenicol-Resistenz-Gen enthält, wird herausgeschnitten, durch Verwendung von Mungbohnen-Nuclease mit glatten Enden versehen und in die EcoRV-Stelle von Bluescript KS- (Stratagene; La Jolla, CA) eingesetzt, wobei pCGN2008 entsteht. Das Chloramphenicol-Resistenz-Gen von pCGN2008 wird durch EcoRI/HindIII-Verdau entfernt. Nach einer Behandlung mit Klenow-Enzym, um glatte Enden zu erzeugen, wird das Fragment mit DraI-verdautem Bluescript KS+ ligiert. Ein Klon, der das DraI-Fragment aufweist, bei dem die Ampicillin-Resistenz durch die Chloramphenicol-Resistenz ersetzt ist, wird ausgewählt und als pCGN2015 bezeichnet. Der Linkerbereich von pCGN2015 wird modifiziert, wobei man pCGN3686 erhält, das die folgenden Restriktionsstellen 5' nach 3' im lacZ-Linkerbereich enthält: PstI, BglII, XhoI, HincII, SalI, HindIII, EcoRV, EcoRI, PstI, SmaI, BamHI, SpeI, XbaI und SacI.
Da die BamHI-Stelle stromabwärts des Reductase-Gens während des Aufbaus von pCGN7582 zerstört wird, werden BamHI-Linker an der XbaI-Vektorstelle stromabwärts des Reductase-Gens in pCGN7582 eingesetzt, und das NdeI-BamHI-Fragment, das das Reductase-Gen enthält, wird in BamHI-NdeI-verdautes pET3A kloniert (Studier et al. (1990) Methods Enzymol. 185: 60-89). Dieses Plasmid wird als pCGN7800 bezeichnet. E. coli BL21 (Studier et al., loc. cit.), das die T7-RNA-Polymerase unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors aufweist, wird mit pCGN7800 transformiert.
BL21-E.-coli-Zellen, die das Reductase-Konstrukt enthalten (BL21(pCGN7800)), werden mit Kontroll-BL21-Zellen verglichen, die nur den pET3A-Vektor aufweisen. Kulturen werden über Nacht in ECLB mit 40 μg/ml Carbenicillin gezüchtet, in frischem ECLB mit 40 μg/ml Carbenicillin auf 1/10 verdünnt und 1 Stunde lang wachsen gelassen. IPTG wird bis zu 1 mM hinzugefügt, und die Zellen werden vor dem Ernten weitere 3 Stunden wachsen gelassen. Die Zellen werden durch Zentrifugation geerntet, und das Zellsediment wird bei –70 °C gelagert. Die Zellen werden in einer French-Presse aufgebrochen, und der Proteinextrakt wird auf Reductase-Aktivität getestet, wobei man den in Beispiel 1C beschriebenen Reductase-Assay verwendet, außer dass die Konzentration von NADPH von 2 mM auf 5 mM erhöht wird. Die Testprodukte werden so analysiert, wie es in Beispiel 1D beschrieben ist. Eine Analyse der Testprodukte von BL21(pCGN7800)-Zellextrakten durch Dünnschichtchromatographie (DC) zeigt eine Alkoholbildung, während die Extrakte von BL21(pET3A)-Kontrollzellen die Alkoholbildung nicht katalysieren. Außerdem zeigt die SDS-PAGE-Analyse von BL21(pCGN7800)- und BL21(pET3A)-Zellen, dass das 56-kD-Protein in den BL21(pCGN7800)-Zellen vorhanden ist und in den BL21(pET3A)-Zellen fehlt.
Um zu bestimmen, ob die Reductase-exprimierenden E.-coli-Zellen Alkohol produzieren, werden die Gesamtlipide durch Extraktion mit Hexan:Isopropanol (3:2) (über Nacht auf einer Schüttelvorrichtung) aus BL21(pCGN7800)-Zellen und Kontrollzellen extrahiert. Die organische Phase wird zur Trockne eingedampft, und die Lipide werden in einem kleinen Volumen Hexan gelöst, durch DC analysiert und durch Iodfärbung sichtbar gemacht. Diese Analyse weist darauf hin, dass aus BL21(pCGN7800)-Zellen extrahierte Lipide Alkohole enthalten, während die aus den Kontrollzellen extrahierten Lipide keinen Alkohole enthalten.
Um die Kohlenstoffkettenlänge des in den BL21(pCGN7800)-Zellen produzierten Alkohols zu bestimmen, wird die Alkoholbande von DC-Platten gekratzt und durch Umkehrphasen-DC und Gaschromatographie (GC) analysiert. Die GC-Analyse wird so durchgeführt, wie es von Pina et al. (Lipids (1987) 22: 358-361) beschrieben wird, wobei man eine Quarzglas-Kapillarsäule 30m SUPELCOWAX^TM 10 (Supelco, Inc.; Bellefonte, PA) verwendet (0,32 mm Innendurchmesser; 0,2 mm Filmdicke). Die Programmparameter sind wie folgt: 190 °C während 15 Minuten, dann eine Temperaturerhöhung von 5° pro Minute bis 250 °C, 3 Minuten Halten auf 250 °C. Auf diese Weise wird bestimmt, dass 16:0- und 18:1-Alkohole die vorwiegenden Alkohole sind, die in E. coli als Ergebnis der Expression der Jojoba-Reductase produziert werden. Keine Wachse werden in der transformierten E. coli nachgewiesen, die anscheinend keine endogene Wachssynthese-Aktivität enthält, welche gegenüber diesen Fettalkoholsubstraten aktiv ist.
Beispiel 6 – Konstrukte für die Pflanzenexpression
A. Expressionscassetten
Expressionscassetten, die 5'- und 3'-regulatorische Bereiche von Genen enthalten, die vorzugsweise in Samengeweben exprimiert werden, können aus den Genen von Napin, Bce4 und ACP hergestellt werden, wie es zum Beispiel in WO 92/03564 beschrieben ist.
Zum Beispiel können Napin-Expressionscassetten wie folgt hergestellt werden. Eine Napin-Expressionscassette, pCGN1808, die für die Expression von Wachs-Synthase- oder Reductase-Gen-Konstrukten verwendet werden kann, ist bei Kridl et al. (Seed Science Research (1991) 1: 209-219) beschrieben.
Alternativ dazu kann pCGN1808 so modifiziert werden, dass es flankierende Restriktionsstellen enthält, um dadurch die Bewegung nur der Expressionssequenzen und nicht der Antibiotika-Resistenz-Marker auf binäre Vektoren, wie pCGN1557 (McBride und Summerfelt, loc. cit.), zu ermöglichen. Synthetische Oligonucleotide, die KpnI-, NotI- und HindIII-Restriktionsstellen enthalten, werden mit der einzelnen HindIII-Stelle von pCGNi808 assoziiert und ligiert, so dass nur eine HindIII-Stelle gewonnen wird. Das resultierende Plasmid pCGN3200 enthält einzelne HindIII-, NotI- und KpnI-Restriktionsstellen am 3'-Ende der 3'-regulatorischen Sequenzen von Napin, was durch Sequenzanalyse bestätigt wird.
Der größte Teil der Napin-Expressionscassette wird von pCGN3200 durch Verdau mit HindIII und SacI und Ligierung mit durch HindIII und SacI verdautem pIC19R (Marsh et al. (1984) Gene 32: 481-485) subkloniert, wobei pCGN3212 entsteht. Die äußersten 5'-Sequenzen des Napin-Promotorbereichs werden durch PCR rekonstruiert, wobei pCGN3200 als Matrize und zwei Primer verwendet werden, die die SacI-Stelle und die Verbindung des Napin-5'-Promotors und des pUC-Gerüsts von pCGN3200 aus dem pCGN1808-Konstrukt flankieren. Der Vorwärtsprimer enthält ClaI-, HindIII-, NotI- und KpnI-Restriktionsstellen sowie die Nucleotide 408-423 der Napin-5'-Sequenz (aus der EcoRV-Stelle), und der Rückwärtsprimer enthält das Komplement zu den Napinsequenzen 718-739, die die einzelne SacI-Stelle im 5'-Promotor beinhalten. Die PCR wird unter Verwendung eines Thermocyclers von Perkin Elmer/Cetus gemäß den Angaben des Herstellers durchgeführt. Das PCR-Fragment wird als glattendiges Fragment in pUC8 (Vieira und Messing (1982) Gene 19: 259-268) subkloniert und mit HincII verdaut, was pCGN3217 ergibt. Die Sequenz von pCGN3217 über das Napin-Insert hinweg bestätigt, dass durch die PCR keine unpassenden Nucleotide eingeführt wurden. Die Napin-5-Sequenzen in pCGN3217 werden durch Verdau mit ClaI und SacI und Ligierung mit durch ClaI und SacI verdautem pCGN3221 mit dem Rest der Napin-Expressions cassette ligiert. Die resultierende Expressionscassette pCGN3221 wird mit HindIII verdaut, und die Napin-Expressionssequenzen werden durch Gelreinigung entfernt und mit durch HindIII verdautem pIC20H (Marsh, loc. cit.) ligiert. Die endgültige Expressionscassette ist pCGN3223, das in einem ampicillinresistenten Hintergrund im Wesentlichen identische 1.725-Napin-5'- und 1.265-3'-regulatorische Sequenzen enthält, wie man sie in pCGN1808 findet. Die regulatorischen Bereiche sind von HindIII-, NotI- und KpnI-Restriktionsstellen flankiert, und einzelne SalI-, BglII-, PstI- und XhoI-Klonierungsstellen befinden sich zwischen dem 5'- und dem 3'-nichtcodierenden Bereich.
Ähnlich kann auch eine Cassette zum Klonieren von Sequenzen für die Transcriptionsregulation unter der Kontrolle von 5'- und 3'-Bereichen aus einem Oleosin-Gen hergestellt werden. Die Sequenz eines Brassica-napus-Oleosin-Gens wird von Lee und Huang angegeben (Plant Phys. (1991) 96: 1395-1397). Primer zu der veröffentlichten Sequenz werden in PCR-Reaktionen verwendet, wobei man den 5'- und den 3'-regulatorischen Bereich eines Oleosin-Gens aus Brassica napus cv. Westar erhält. Zwei PCR-Reaktionen werden durchgeführt, eine zum Amplifizieren von ungefähr 950 Nucleotiden stromaufwärts des ATG-Startcodons für das Oleosin-Gen und eine zum PCR-Amplifizieren von ungefähr 600 bp einschließlich und stromabwärts des TAA-Stopcodons für das Oleosin-Gen. Die PCR-Produkte werden gemäß den Vorschriften des Herstellers in den Plasmidvektor pAMP1 (BRL) kloniert, was die Plasmide pCGN7629, das den 5'-flankierenden Bereich von Oleosin enthält, und pCGN7630, das den 3'-flankierenden Bereich enthält, ergibt. Die PCR-Primer enthielten zweckmäßige Restriktionsstellen zum Klonieren des 5'- und des 3'-flankierenden Bereichs zusammen in eine Expressionscassette. Ein PstI-Fragment, das den 5'-flankierenden Bereich von pCGN7629 enthält, wird in PstIverdautes pCGN7630 kloniert, was das Plasmid pCGN7634 ergibt. Das Fragment BssHII (New England BioLab) von pCGN7634, das die gesamte Oleosin-Expressionscassette enthält, wird in BssHII-verdautes pBCSK+ (Stratagene) kloniert, was die Oleosin-Cassette in einem Plasmid pCGN7636 ergibt. Die Sequenz der Oleosin-Cassette in pCGN7636 ist in 4 angegeben. Die Oleosin-Cassette wird von BssHII-, KpnI- und XbaI-Restriktionsstellen flankiert und enthält SalI-, BamHI- und PstI-Stellen für die Insertion von Wachs-Synthase, Reductase oder anderen interessierenden DNA-Sequenzen zwischen den 5'- und den 3'-Oleosin-Bereich.
Die Gensequenzen werden in solche Cassetten eingesetzt, was Expressionskonstrukte für Pflanzentransformationsverfahren ergibt. Zum Beispiel können solche Konstrukte in binäre Vektoren für die Agrobacterium-vermittelte Transformation eingesetzt werden, wie im Folgenden beschrieben ist.
B. Vektoren für die Pflanzentransformation
Binäre Vektoren werden aus pCGN1578, pCGN1559 und anderen Vektoren, die von McBride et al. beschrieben werden (loc. cit.), durch Substitution der pCGN1578- und pCGN1559-Linkerbereiche durch einen Linkerbereich, der die folgenden Restriktionsstellen enthält, hergestellt: Asp718/AscI/PacI/XbaI/BamHI/SwaI/Sse8387(PstI)/HindIII. Dies führt zu pCGN1578PASS oder pCGN1559PASS und anderen modifizierten Vektoren, die ähnlich bezeichnet werden. AscI, PacI, SwaI und Sse8387 haben 8-basige Restriktionserkennungsstellen. Diese Enzyme sind von New England BioLabs erhältlich: AscI, PacI; dieses von Boehringer Mannheim: SwaI; und dieses von Takara (Japan): Sse8387.
C. Reductase-Konstrukte für die Pflanzentransformation
Konstrukte für die Expression von Reductase in Pflanzenzellen unter Verwendung von 5'- und 3'-regulatorischen Bereichen aus einem Napin-Gen werden wie folgt hergestellt.
Eine Reductase-cDNA (in dem oben beschriebenen pCGN1703-Vektor), die als pCGN7571 bezeichnet wird, wird mit SphI verdaut (Stelle in 3'-untranslatierter Sequenz an den Basen 1594-1599), und ein SalI-Linker wird an dieser Stelle eingefügt. Das resultierende Plasmid wird mit BamHI und SalI verdaut, und das Fragment, das die Reductase-cDNA enthält, wird einer Gelreinigung unterzogen und in BglII/XhoI-verdautes pCGN3223, die oben beschriebene Napin-Cassette, kloniert, was zu pCGN7585 führt.
Ein HindIII-Fragment von pCGN7585, das das Napin-5'/Reductase/Napin-3'-Konstrukt enthält, wird in HindIII-verdautes pCGN1578 (McBride und Summerfelt, loc. cit.) kloniert, was zu pCGN7586 führt, einem binären Vektor für die Pflanzentransformation.
Das Pflanzentransformationskonstrukt pCGN7589, das auch das Jojoba-Reductase-Gen unter der Expression eines Napin-Promotors enthält, wird wie folgt hergestellt.
pCGN7571 wird einer in-vitro-Mutagenese unterzogen, um eine NdeI-Stelle am ersten ATG der Reductase-codierenden Sequenz und eine BglII-Stelle unmittelbar stromaufwärts der NdeI-Stelle einzuführen. BamHI-Linker werden in die SphI-Stelle stromabwärts des Reductase-codierenden Bereichs eingeführt. Das 1,5-kb-BglII-BamHI-Fragment wird einer Gelreinigung unterzogen und in BglII-BamHI-verdautes pCGN3686 (siehe unten) kloniert, was zu pCGN7582 führt.
pCGN3686 ist ein Klonierungsvektor, der von Bluescript KS+ (Stratagene Cloning Systems; San Diego, CA) abgeleitet ist, aber ein Chloramphenicol-Resistenz-Gen und einen modifizierten Linkerbereich aufweist. Die Quelle für das Chloramphenicol-Resistenz-Gen, pCGN565, ist ein Klonierungsvektor auf der Basis von pUC12-cm (K. Buckley, Doktorarbeit, Regulation and expression of the phi X174 lysis gene, University of California, San Diego, 1985), der aber pUC18-Linker enthält (Yanisch-Perron et al., Gene (1985), 53: 103-119). pCGN565 wird mit HhaI verdaut, und das Fragment, das das Chloramphenicol-Resistenz-Gen enthält, wird herausgeschnitten, durch Verwendung von Mungbohnen-Nuclease mit glatten Enden versehen und in die EcoRV-Stelle von Bluescript KS- (Stratagene; La Jolla, CA) eingesetzt, wobei pCGN2008 entsteht. Das Chloramphenicol-Resistenz-Gen von pCGN2008 wird durch EcoRI/HindIII-Verdau entfernt. Nach einer Behandlung mit Klenow-Enzym, um glatte Enden zu erzeugen, wird das Fragment mit DraI-verdautem Bluescript KS+ ligiert. Ein Klon, der das DraI-Fragment aufweist, bei dem die Ampicillin-Resistenz durch die Chloramphenicol-Resistenz ersetzt ist, wird ausgewählt und als pCGN2015 bezeichnet. Der Linkerbereich von pCGN2015 wird modifiziert, wobei man pCGN3686 erhält, das die folgenden Restriktionsstellen 5' nach 3' im lacZ-Linkerbereich enthält: PstI, BglII, XhoI, HincII, SalI, HindIII, EcoRV, EcoRI, PstI, SmaI, BamHI, SpeI, XbaI und SacI.
Ein XhoI-Linker wird an der XbaI-Stelle von pCGN7582 eingefügt. Das BglII-XhoI-Fragment, das das Reductase-Gen enthält, wird isoliert und in BglII-XhoI-verdautes pCGN3223 kloniert. Das resultierende Plasmid, dem die 5'-untranslatierte Leadersequenz aus dem Jojoba-Gen fehlt, wird als pCGN7802 bezeichnet. Das Napin/Reductase-Fragment aus pCGN7802 wird mit HindIII herausgeschnitten und in HindIII-verdautes pCGN1578 kloniert, was pCGN7589 ergibt.
Ein zusätzliches Napin/Reductase-Konstrukt wird wie folgt hergestellt. Die Reductase-cDNA pCGN7571 (1) wird so mutagenisiert, dass SalI-Stellen 5' vom ATG-Startcodon (bei der Stelle handelt es sich um 8 Basenpaare 5' von ATG) und unmittelbar 3' vom TAA-Translationsstopcodon eingefügt werden, was zu pCGN7631 führt. pCGN7631 wird mit SalI verdaut, und das ungefähr 1,5 kb große Fragment, das die Reductase-codierende Sequenz enthält, wird in die SalI/XhoI-verdaute Napin-Cassette pCGN3223 kloniert. Ein resultierendes Plasmid, das die Reductase-Sequenz in Sense-Orientierung enthält, wird als pCGN7640 bezeichnet. pCGN7640 wird mit HindIII verdaut, und das Fragment, das das Oleosin/Reductase-Konstrukt enthält, wird in den HindIII-verdauten binären Vektor pCGN1559PASS kloniert, was zu dem binären Konstrukt pCGN7642 führt.
Ein Konstrukt für die Expression von Reductase unter der Kontrolle von regulatorischen Bereichen von Oleosin wird wie folgt hergestellt. Die Reductase-codierende Sequenz wird durch Verdau von pCGN7631 mit SalI erhalten und in SalI-verdautes pCGN7636, die Oleosin-Cassette, ligiert. Ein resultierendes Plasmid, das die Reductase-Sequenz in der Sense-Orientierung enthält, wird als pCGN7641 bezeichnet. pCGN7641 wird mit XbaI verdaut, und das Fragment, das das Oleosin/Reductase-Konstrukt enthält, wird in den XbaI-verdauten binären Vektor pCGN1559PASS kloniert, was zu dem binären Konstrukt pCGN7643 führt.
D. Resynthese des Reductase-Gens
Das Jojoba-Reductase-Gen wurde so resynthetisiert, dass sein AT-Gehalt von einem Wert von 57,5% auf etwa 51% reduziert wurde. Dies geschah ohne Änderung der Aminosäurezusammensetzung des Proteins (2) und führt zu einer Sequenz mit einem durchweg relativ gleichmäßigen AT-Gehalt. Die codierende Jojoba-Sequenz hat vor der Resynthese lokalisierte Bereiche, die sich einem AT-Gehalt von 75% annähern. Die Gen-Resynthese wurde nach der Vorschrift von Bambot und Russell durchgeführt (Bamot, S.B. und Russell, A.J. (1993), PCR methods and applications 2: 266-271), und das Plasmid, das das resynthetisierte Gen enthält, wurde als pCGN7675 bezeichnet.
Das XhoI-BamHI-Fragment des resynthetisierten Reductase-Gens von pCGN7675 wurde in die SalI- und BamHI-verdaute Oleosin-Cassette pCGN7636 (oben beschrieben) kloniert.
Die Oleosin-Reductase-Gen-Fusion wurde unter Verwendung von ASP718 in den Pflanzentransformationsvektor pCGN1559PASS kloniert, wobei pCGN7677 entstand. Das Plasmid pCGN7677 ist also im Wesentlichen dasselbe wie pCGN7643, mit der Ausnahme, dass das Jojoba-Acyl-CoA-Reductase-Gen aus pCGN7643 durch das synthetische Gen mit dem geringeren AT-Gehalt ersetzt wurde.
Dasselbe Fragment wurde auch in die SalI- und BglII-verdaute Napin-Cassette von pCGN3223 kloniert. Dann wurde die Napin-Reductase-Gen-Fusion unter Verwendung von ASP718 in den Pflanzentransformationsvektor pCGN1559PASS kloniert, wobei pCGN7698 entstand. Das Plasmid pCGN7698 ist im Wesentlichen dasselbe wie pCGN7642, nur dass das Jojoba-Acyl-CoA-Reductase-Gen aus pCGN7642 durch das synthetische Gen mit dem geringeren AT-Gehalt ersetzt wurde.
Mit binären Vektorkonstrukten werden Agrobacterium-Zellen, wie der Stamm EHA101 (Hood et al., J. Bacteriol. (1986) 168: 1291-1301), nach dem Verfahren von Holsters et al. (Mol. Gen. Genet. (1978) 163: 181-187) transformiert und in Pflanzentransformationsverfahren verwendet, wie es unten beschrieben ist.
Beispiel 7 – Assay auf Wachs-Synthese-Aktivität
Verfahren zum Bestimmen von Wachs-Synthase oder von Wachs-Synthese-Fähigkeit werden beschrieben.
A. Radioaktiv markiertes Material
Das Substrat, das allgemein in den Wachs-Synthase-Assays verwendet wird, [1-¹⁴C]Palmitoyl-CoA, wird von Amersham (Arlington Heights, IL) bezogen. Substrate mit anderer Kettenlänge wurden synthetisiert, um Kettenlänge-Spezifizierungsstudien durchzuführen. Langkettige [1-¹⁴C]-Fettsäuren (spezifische Aktivität 51-56 Ci/mol), nämlich 11-cis-Eicosensäure, 13-cis-Docosensäure und 15-cis-Tetracosensäure, werden durch die Reaktion von Kalium[¹⁴C]cyanid mit dem entsprechenden Alkoholmesylat und anschließende basische Hydrolyse des Alkoholnitrils zur freien Fettsäure hergestellt. Die freien Fettsäuren werden mit Diazomethan in Ether in ihre Methylester umgewandelt und durch präparative Silbernitrat-Dünnschichtchromatographie (DC) gereinigt. Die Fettsäuremethylester werden zu den freien Fettsäuren zurückhydrolysiert. Die radiochemische Reinheit wird durch drei DC-Verfahren bewertet: Normalphasen-Silica-DC, Silbernitrat-DC und C18-Umkehrphasen-DC. Die durch diese Verfahren gemessene radiochemische Reinheit betrug 92-98%. Langkettige [1-¹⁴C]-Acyl-CoAs werden nach dem Verfahren von Young und Lynen (J. Bio. Chem. (1969) 244: 377) aus den entsprechenden freien [1-¹⁴C]-Fettsäuren bis zu einer spezifischen Aktivität von 10 Ci/mol hergestellt. [1-¹⁴C]-Hexadecanal wird durch die Dichromat-Oxidation von [1-¹⁴C]-Hexadecan-1-ol gemäß einer Mikromaßstab-Modifikation des Verfahrens von Pletcher und Tate (Tet. Lett. (1978) 1601-1602) hergestellt. Das Produkt wird durch präparative Silica-DC gereinigt und als Hexanlösung bis zur Verwendung bei –70 °C aufbewahrt.
B. Assay auf Wachs-Synthase-Aktivität
Die Wachs-Synthase-Aktivität wird durch Inkubation von 40 μM [1-¹⁴C]Acyl-CoA (gewöhnlich Palmitoyl-CoA, spezifische Aktivität 5,1-5,6 mCi/mmol) und 200 mM Oleylalkohol mit der zu bestimmenden Probe in einem Gesamtvolumen von 0,25 ml gemessen. Das Inkubationsgemisch enthält auch 20% (w/v) Glycerin, 1 mM DTT, 0,5 M NaCl und ist mit 25 mM HEPES (4-[2-Hydroxyethyl]-1-piperazinethansulfonsäure) gepuffert. HEPES wird hier und bei späteren Erwähnungen aus einer auf pH 7,5 eingestellten 1 M Stammlösung zugegeben.
Ein Substratgemisch wird in einem Glasvial hergestellt, wobei Oleylalkohol unmittelbar vor der Verwendung hinzugefügt wird, und zu Proben gegeben. Eine Inkubation wird bei 30 °C während einer Stunde durchgeführt. Der Assay wird beendet, indem man das Assayröhrchen auf Eis legt und sofort 0,25 ml Isopropanol:Essigsäure (4:1 v/v) hinzufügt. Unmarkierte Wachsester (0,1 mg) und Oleylalkohol (0,1 mg) werden als Träger hinzugefügt. Die [¹⁴C]-Lipide werden durch die Vorschrift von Hara und Radin (Anal. Biochem. (1978) 90: 420) im heruntergesetzten Maßstab extrahiert. Zu dem beendeten Assay werden 4 ml Hexan/Isopropanol (3:2, v/v) gegeben. Die Probe wird mit dem Wirbelmischer gemischt, 2 ml wässrige Natriumsulfatlösung (6,6% w/v) werden hinzugefügt, und die Probe wird erneut mit dem Wirbelmischer gemischt.
C. Analyse der Assayprodukte
Die Produkte des Wachs-Synthase-Assays werden wie folgt analysiert.
Nach der Zugabe des Natriumsulfats und dem Mischen der Probe mit dem Wirbelmischer wird ein bekannter Prozentsatz der organischen Phase entfernt und die Radioaktivität mit einem Flüssigszintillationszähler bestimmt. Diese Berechnung wird verwendet, um die Gesamtradioaktivität in der organischen Phase abzuschätzen. Dann wird ein anderer Teil der organischen Phase entfernt, unter Stickstoff heruntergetrocknet und in Hexan wieder aufgelöst.
Für die Lipidklassenanalyse wird die Probe auf eine Silica-DC-Platte aufgetragen, und die Platte wird in Hexan/Diethylether/Essigsäure (80:20:1 v/v/v) entwickelt. Die Verteilung der Radioaktivität zwischen den Lipidklassen, größtenteils Wachsester, freie Fettsäuren, Fettalkohole und polare Lipide am Anfang, wird mit Hilfe eines AMBIS-Radioanalyse-Bildgebungssystems (AMBIS Systems Inc., San Diego, CA) gemessen. Falls notwendig, können die einzelnen Lipidklassen zur weiteren Analyse von der DC-Platte zurückgewonnen werden.
D. Substratspezifität
Acyl-CoA- und Alkoholsubstrate mit unterschiedlichen Kohlenstoffkettenlängen und Graden der Unsättigung wurden zu einer mikrosomalen Membranfraktion mit Wachs-Synthase-Aktivität gegeben, um den Bereich der Substrate zu bestimmen, die von der Jojoba-Wachs-Synthase erkannt werden. Die Wachs-Synthase-Aktivität wurde gemäß der Beschreibung in Beispiel 1 gemessen, wobei die Acyl-Spezifität unter Verwendung von 80 mM Acyl-CoA-Substrat und 100 mM radioaktiv markiertem Oleylalkohol gemessen wurde. Die Alkoholspezifität wurde unter Verwendung von 100 mM Alkoholsubstrat und 40 mM radioaktiv markiertem Eicosenoyl-CoA gemessen. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in der folgenden Tabelle 4 aufgeführt.
Tabelle 4 Acyl- und Alkohol-Substratspezifität der Jojoba-Wachs-Synthase
Die obigen Ergebnisse beweisen, dass die Jojoba-Wachs-Synthase einen breiten Bereich von Fettacyl-CoA- und Fettalkoholsubstraten verwendet.
Außerdem wurde die Wachs-Synthase-Aktivität gegenüber verschiedenen Acylthioester-Substraten in ähnlicher Weise getestet, wobei Palmitoyl-CoA, Palmitoyl-ACP und N-Acetyl-S-palmitoylcysteamin als Acylsubstrate verwendet wurden. Die größte Aktivität wurde gegenüber dem Acyl-CoA-Substrat beobachtet. Eine erhebliche Aktivität (ca. 10% derjenigen von Acyl-CoA) wurde bei Acyl-ACP beobachtet, aber gegenüber dem N-Acetyl-S-palmitoylcysteamin-Substrat war keine Aktivität nachweisbar.
Beispiel 8 – Pflanzentransformationsverfahren
Eine Vielzahl von Verfahren ist entwickelt worden, um eine interessierende DNA-Sequenz so in das Genom einer Wirtspflanze einzufügen, dass man die Transcription oder Transcription und Translation der Sequenz erhält, um phänotypische Änderungen zu bewirken.
Brassica-Transformation
Samen von erucasäurereichen Varietäten, wie der Sorte Reston, oder von Varietäten des Canola-Typs von Brassica napus werden 2 min lang in 95% Ethanol getränkt, 45 min lang in einer 1,0%igen Lösung von Natriumhypochlorit, die einen Tropfen Tween 20 enthielt, oberflächensterilisiert und dreimal in sterilem, destilliertem Wasser abgespült. Dann werden die Samen in Magenta-Boxen mit 1/10 Konzentration von Murashiges Minimalorganikmedium (Gibco; Grand Island, NY) ausgelegt, das mit Pyridoxin (50 μg/l), Nicotinsäure (50 μg/l), Glycin (200 μg/l) und 0,6% Phytagar (Gibco), pH 5,8, ergänzt ist. Die Samen werden in einer Percival-Kammer bei 22 °C mit einer Hellperiode von 16 h mit kühlem fluoreszentem und rotem Licht einer Intensität von ungefähr 65 Mikroeinstein pro Quadratmeter pro Sekunde (μEm^–2s^–1) (μmol Photonen/m²/s) keimen gelassen.
Aus 5-7 Tagen alten Keimlingen werden die Hypokotylen herausgeschnitten, in Stücke mit einer Länge von ungefähr 4 mm geschnitten und auf Feeder-Platten ausgelegt (Horsch et al., Science (1985) 227: 1229-1231). Feeder-Platten werden einen Tag vor der Verwendung hergestellt, indem man 1,0 ml einer Tabaksuspensionskultur auf einer Petri-Schale (100 × 25 mm) ausstreicht, die etwa 30 ml MS-Salzbasis (Carolina Biological, Burlington, NC), 100 mg/l Inosit, 1,3 mg/l Thiamin-HCl, 200 mg KH₂PO₄ mit 3% Saccharose, 2,4-D (1,0 mg/l), 0,6% (w/v) Phytagar enthält, und der pH wird auf 5,8 eingestellt, bevor autoklaviert wird (MS-0/1/0-Medium). Vor der Verwendung wird eine sterile Filterpapierscheibe (Whatman 3 mm) auf die Feeder-Schicht gelegt. Tabaksuspensionskulturen werden wöchentlich durch Übertragung von 10 ml Kultur auf 100 ml frisches MS-Medium, wie es für die Feeder-Platten beschrieben wurde, mit 2,4-D (0,2 mg/l), Kinetin (0,1 mg/l) subkultiviert. In Experimenten, bei denen keine Feeder-Zellen verwendet werden, werden Hypokotyl-Explantate geschnitten und auf eine Filterpapierscheibe auf MS-0/1/0-Medium gelegt. Alle Hypokotyl-Explantate wurden 24 h lang auf Feeder-Platten bei 22 °C unter kontinuierlichem Licht einer Intensität von 30 μEm^–2s^–1 bis 65 μEm^–2s^–1 (umol Photonen/m²/s) vorinkubiert.
Einzelne Kolonien des A.-tumefaciens-Stamms EHA101, die ein binäres Plasmid mit dem gewünschten Genkonstrukt enthalten, werden auf 5 ml MG/L-Brühe übertragen und über Nacht bei 30 °C wachsen gelassen. Hypokotyl-Explantate werden in 7-12 ml MG/L-Brühe eingetaucht, wobei die Bakterien auf 1 × 10⁸ Bakterien/ml verdünnt sind, und nach 10-15 min werden sie auf Feeder-Platten gelegt. Pro Liter enthält MG/L-Brühe 5 g Mannit, 1 g L-Glutaminsäure oder 1,15 g Natriumglutamat, 0,25 g KH₂PO₄, 0,10 g NaCl, 0,10 g MgSO₄·7H₂O, 1 mg Biotin, 5 g Trypton und 2,5 g Hefeextrakt, und die Brühe wird auf pH 7,0 eingestellt. Nach 48 Stunden Coinkubation mit Agrobacterium werden die Hypokotyl-Explantate auf B5-0/1/0-Kallus-Induktionsmedium übertragen, das sterilfiltriertes Carbenicillin (500 mg/l, nach dem Autoklavieren hinzugefügt) und Kanamycinsulfat (Boehringer Mannheim; Indianapolis, IN) in Konzentrationen von 25 mg/l enthält.
Nach 3-7 Tagen in Kultur unter kontinuierlichem Licht von 65 μEm^–2s^–1 (μmol Photonen/m²/s) ist Kallusgewebe auf der Schnittfläche sichtbar, und die Hypokotyl-Explantate werden auf Spross-Induktionsmedium B5BZ übertragen (B5-Salze und Vitamine, ergänzt mit 3 mg/l Benzylaminopurin, 1 mg/l Zeatin, 1% Saccharose, 0,6% Phytagar und pH auf 5,8 eingestellt). Dieses Medium enthält auch Carbenicillin (500 mg/l) und Kanamycinsulfat (25 mg/l). Die Hypokotyl-Explantate werden alle zwei Wochen auf frisches Spross-Induktionsmedium subkultiviert.
Nach einem bis drei Monaten regenerieren Sprosse aus den Hypokotyl-Kalli. Grüne Sprosse, die wenigstens 1 cm hoch sind, werden von den Kalli abgeschnitten und auf Medium gesetzt, das B5-Salze und Vitamine, 1% Saccharose, Carbenicillin (300 mg/l), Kanamycinsulfat (50 mg/l) und 0,6% (w/v) Phytagar enthält. Nach 2 bis 4 Wochen werden Sprosse, die grün geblieben sind, an der Basis abgeschnitten und in Magenta-Boxen übertragen, die Wurzelinduktionsmedium enthalten (B5- Salze und Vitamine, 1% Saccharose, 2 mg/l Indolbuttersäure, 50 mg/l Kanamycinsulfat und 0,6% Phytagar). Grüne bewurzelte Sprosse werden auf Thioesterase-Aktivität getestet.
Arabidopsis-Transformation
Transgene Arabidopsis-thaliana-Pflanzen können durch Agrobacterium-vermittelte Transformation erhalten werden, wie es von Valverkens et al. beschrieben wurde (Proc. Nat. Acad. Sci. (1988) 85: 5536-5540). Mit den Konstrukten werden Agrobacterium-Zellen, wie der Stamm EHA101 (Hood et al., J. Bacteriol. (1986) 168: 1291-1301), nach dem Verfahren von Holsters et al. (Mol. Gen. Genet. (1978) 163: 181-187) transformiert.
Erdnuss-Transformation
Interessierende DNA-Sequenzen können als Expressionscassetten, die wenigstens einen Promotorbereich, ein interessierendes Gen und einen Terminationsbereich umfassen, über Partikelbombardierung in ein Pflanzengenom eingeführt werden.
Kurz gesagt, Wolfram- oder Goldpartikel mit einer Größe im Bereich von 0,5 mM bis 3 mM werden mit DNA einer Expressionscassette beschichtet. Diese DNA kann in Form eines wässrigen Gemischs oder eines trockenen DNA/Partikel-Niederschlags vorliegen.
Gewebe, das als Ziel für die Bombardierung verwendet wird, kann aus Kotyledon-Explantaten, Spross-Meristemen, unreifen Blättchen oder Staubbeuteln stammen. Die Bombardierung des Gewebes mit den DNA-beschichteten Partikeln erfolgt unter Verwendung einer Biolistics^TM-Partikelkanone (Dupont; Wilmington, DE). Die Partikel werden in variablen Abständen im Bereich von 1 cm bis 14 cm von der Mündung im Lauf platziert. Das zu bombardierende Gewebe wird unter die Sperrplatte gelegt; die Tests werden an dem Gewebe in Abständen von bis zu 20 cm durchgeführt. Zum Zeitpunkt der Entladung wird das Gewebe mit einem Nylonnetz oder einer Kombination von Nylonnetzen mit Maschenweiten im Bereich von 10 mM bis 300 mM geschützt.
Nach der Bombardierung können Pflanzen nach dem Verfahren von Atreya et al. (Plant Science Letters (1984) 34: 379-383) regeneriert werden. Kurz gesagt, Embryo-Achsengewebe oder Keimblattsegmente werden auf MS-Medium (Murashige und Skoog, Physio. Plant. (1962) 15: 473) (MS plus 2,0 mg/l 6-Benzyladenin (BA) für die Keimblattsegmente) gelegt und 1 Woche lang im Dunkeln bei 25 ± 2 °C inkubiert und anschließend in kontinuierliches kühles weißes Fluoreszenzlicht (6,8 W/m²) übertragen. Am 10. Tag der Kultur werden die Pflänzchen auf Töpfe, die sterile Erde enthalten, übertragen und 3-5 Tage lang im Schatten gehalten und schließlich ins Treibhaus gebracht. Die mutmaßlichen transgenen Sprosse werden eingepflanzt. Die Integration von exogener DNA in das Pflanzengenom kann durch verschiedene Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, bestätigt werden.
Beispiel 9 – Analyse von transformierten Pflanzen
Sich entwickelnde Samen aus Arabidopsis-Pflanzen, die mit dem pCGN7586-Napin/Reductase-Konstrukt transformiert sind, werden auf Reductase-Aktivität analysiert, wie es in Beispiel 1C beschrieben ist. Von fünfzehn analysierten Pflanzen zeigte sich bei elf, dass sie eine Reductase-Enzymaktivität haben, wobei die spezifischen Aktivitäten im Bereich von 5 bis 30 pmol/min/mg Protein liegen. Die Western-Analyse zeigt, dass die Menge der in transgenen Arabidopsis-Embryos vorhandenen Reductase ungefähr 0,01% des Gesamtproteins beträgt.
Transformierte Pflanzen werden getestet, um Fettalkohol- und Wachsesterkomponenten zu messen, wie es hier beschrieben ist. Solche Pflanzen können durch Agrobacterium-Transformationsverfahren hergestellt werden, wie es oben beschrieben ist. Pflanzen können auf die Anwesenheit von Wachsestern getestet werden, zum Beispiel durch die Trennung von Triacylglyceriden (TAG) von Wachsestern durch DC. GC-Analyseverfahren können verwendet werden, um die resultierenden Wachse weiter zu analysieren.
A. Analyse von transformierten Pflanzen durch Gaschromatoaraphie (GC)
Der Gehalt an unverestertem oder rohem Öl gelangt aufgrund der hohen Temperaturen, die zum Abbrennen der TAG-Komponente notwendig sind (ungefähr 350 °C bis 365 °C) nicht durch eine typische GC-Säule. Die SUPELCOWAX^TM-10-Säule hat zum Beispiel einen oberen Temperaturbereich von ungefähr 280 °C.
Lipide werden aus reifen Samen von Arabidopsis extrahiert, derivatisiert (Browse et al. (1986), Anal. Biochem. 152: 141-145) und durch GC auf ihren Alkoholgehalt analysiert, wie es oben beschrieben ist. Diese Analysen zeigen die Anwesenheit von 20:1-Alkohol in 3 der transformierten Arabidopsis-Pflanzen.
Das Öl von Samen von Kontrollrapspflanzen und pCGN7643-Rapspflanzen wird in ähnlicher Weise in Methanol/H₂SO₄ nach dem folgenden Verfahren umgeestert. Fünfundzwanzig (25) Samen von jeder Pflanze werden 90 Minuten lang in 4 ml H₂SO₄ in Methanol (5%) bei 80 °C inkubiert. Zu diesem inkubierten Gemisch werden 1 ml 0,9%iges NaCl und 1 ml Hexan gegeben, und die obere organische Phase wird zur Analyse entnommen. Eine Analyse durch Gaschromatographie (GC) auf einer SUPELCOWAX^TM-10-Säule zeigt, dass die pCGN7643-Proben 22:1-Alkohol enthalten, während die untransformierten Kontrollpflanzen den Alkohol nicht enthalten. Die Identität dieses Peaks als Alkohol wird mit Hilfe eines Massenspektrometers (MS) bestätigt.
Rohes Öl aus den T2-Samen wird ebenfalls analysiert. Fünfundzwanzig (25) Samen von jeder Pflanze werden vereinigt und in 2 ml Hexan homogenisiert. Der Extrakt wird filtriert, und eine Hochtemperatur-GC-Analyse wird durchgeführt, wobei man eine CHROMPAK^TM-Triglycerid-Säule (maximale Temperatur ungefähr 370 °C) verwendet. Diese Säule ist für die Analyse von TAG sowie von Wachsen geeignet. In den pCGN7643-Proben werden mehrere Peaks mit Retentionszeiten nachgewiesen, die mit Wachsestern vereinbar waren, doch werden keine Peaks beobachtet, die mit einem Fettalkohol vereinbar wären. Die Wachsesterpeaks sind in den untransformierten Kontrollproben nicht vorhanden. Der herausragendste Peak hat eine Retentionszeit, die damit vereinbar ist, dass es sich um einen 40:2- Wachsester handelt. Der einzige nachgewiesene Fettalkohol in dem umgeesterten Öl ist 22:1-Alkohol, und vermutlich umfasst dieser herausragende Wachsester eine 18:1-Fettsäure, die mit einem 22:1-Fettalkohol verestert ist.
Eine Hochtemperatur-GC-Analysevorschrift wird verwendet, um das transformierte Rapsöl, das in Methanol/H₂SO₄ umgeestert wurde, weiter zu analysieren. In dem umgeesterten Öl aus pCGN7643-Pflanzen sind keine Wachsesterpeaks vorhanden. Dies ist zu erwarten, da bei der Umesterung Fettsäuremethylester und Alkohole aus der Wachskomponente des Öls entstehen. Die 22:1-Fettalkoholkomponente des derivatisierten Öls ist in Samen einiger der transformierten Rapspflanzen als Komponente vorhanden, die schätzungsweise etwa 0,5% Gesamtlipide, gemessen anhand des Gewichts, umfasst.
Eine Hochtemperatur-GC/MS-Analyse wird an dem T2-Samenöl von Rapspflanzen unter Verwendung der CHROMPAK^TM-Triglyceridsäule durchgeführt. Massenchromatogramme (ausgewählte Ionenüberwachung) des T2-Öls zeigte Peaks mit Retentionszeiten und Massen, die mit der Anwesenheit von 38:2-, 40;2-, 42:2-und 44:2-Wachsestern in dem transgenen Öl vereinbar waren. Diese Peaks werden im Kontrollöl nicht nachgewiesen. Das Massenspektrum des 40:2-Wachsesterpeaks von Öl aus einer pCGN7643-Pflanze bestätigte, dass dieses aus einem 22:1-Alkohol und einer 18:1-Fettsäure besteht.
Eine Hochtemperatur-GC-Analyse des Öls aus T3-Samen einer pCGN7643-Pflanze unter Verwendung der Triglyceridsäule zeigt, dass das transgene Öl den 40:2-Wachsesterpeak enthält, der im T2-Samenöl durch GC/MS-Analyse charakterisiert wurde. Der Wachsesterpeak wird in dem untransformierten Kontrollöl nicht nachgewiesen.
Vereinigte T2-Samen von 30 transgenen Reston-Pflanzen, die unter Verwendung des Plasmids pCGN7677 erzeugt wurden, wurden auf ihre Ölzusammensetzung analysiert. In der Hälfte der Pflanzen, die mit diesem Konstrukt derivatisiert wurden, zeigte das derivatisierte Öl höhere Alkoholkonzentrationen als Öl aus der besten Pflanze, die mit pCGN7643 transformiert war. Die besten Pflanzen haben ca. 0,9% Fettalkohol bei den vereinigten T2-Samen, während die beste vereinigte T2-Samen-Ölzusammensetzung aus einer pCGN7643-Pflanze 0,16% Alkohol enthielt.
Von den pCGN7677-Pflanzen mit dem höchsten Fettalkoholgehalt wurden 50 Halbkörner analysiert. Halbkörner sind ein besseres Maß für transgene Effekte, da T2-Samen ein segregierender Samen ist und daher nichtexprimierenden und heterozygoten Samen sowie Samen, der in Bezug auf die transgene Eigenschaft homozygot ist, umfasst. Derivatisiertes Öl aus einzelnen T2-Halbkörnern von den Pflanzen 7677-R-15 und 7677-R-16 zeigten die höchsten Alkoholkonzentrationen. Immerhin 3,5% der Lipide, die man in individuell derivatisiertem Samenöl von diesen Pflanzen findet, sind Fettalkohole. Da das Fettalkoholsubstrat des Wachsesters ungefähr die Hälfte zum Gesamtgewicht des Wachsesters beiträgt, erkennt man, dass Wachsester in Öl von transformierten Pflanzen als Komponente mit bis zu etwa 7,0 Gew.-% produziert werden kann.
Eine Hochtemperatur-GC-Analyse von Öl aus einem einzelnen T2-Samen (7677-R-15-49) zeigt die Anwesenheit einer Reihe von Wachsestern mit den wahrscheinlichen Zusammensetzungen 38:1, 38:2, 40:1, 40:2, 40:3, 40:4, 42:1, 42:2, 42:3, 44:1, 44:2 und 44:3 (3). Von diesen sind nur die Zusammensetzungen 38:2, 40:2, 42:2, und 44:2 in signifikanten Mengen vorhanden. Tabelle 5 zeigt die Ergebnisse einer solchen GC-Analyse, die die relative Menge von Wachsestern in der Wachskomponente von Öl aus mehreren individuellen 7677-R-15-Samen zeigt, welche als Prozentsatz des Gesamtwachses angegeben ist.
Tabelle 5
In Öl von vielen der 7677-R-15-Halbkörner sind die häufigsten Wachsester in der Reihenfolge abnehmender Häufigkeit 44:2, 40:2 und 42:2. Dagegen war der häufigste Wachsester, den man in Öl von 7643 transformierten Reston-Pflanzen fand, ein 40:2-Wachsester. In einigen Halbkörnern aus dem 7677-R-15-Ereignis umfasste der 44:2-Wachsester mehr als 60% der Wachskomponente, die man in dem Öl findet. Dies zeigt sich dramatisch in der Hochtemperatur-GC-Graphik-Spur des Öls, das daraus entnommen wurde (3).
Das Profil im Öl aus diesen 7677-R-15-Pflanzen stellt eine erhebliche Abweichung gegenüber dem Wachsesterprofil dar, das man in Jojoba findet, wo der 42:2-Wachsester typischerweise 47% des Wachses umfasst und die 44:2-Wachsesterkomponente nur in einer Menge von etwa 8% des Öls vorhanden ist.
Wachszusammensetzungen, die 44:2 als vorwiegenden Wachsester umfassen, haben gegenüber Jojobaöl gewisse Vorteile. Durch das höhere Molekulargewicht des vorwiegenden Wachsesters hat die transgene Wachszusammensetzung einen höheren Schmelzpunkt, eine höhere Stabilität und eine höhere Beständigkeit gegenüber Scherspannungen. Eine Ölzusammensetzung mit 60% oder mehr 44:2-Wachsester ist leicht durch die Fraktionierung von gemischtem Triacylglycerid/Wachsester-Öl aus stark exprimierenden T2-Pflanzen durch Kristallisations- oder Lösungsmittelextraktionsverfahren in die entsprechenden Wachs- und Triacylglyceridkomponenten erhältlich.
B. Analyse von gereinigten Wachsfraktionen
Präparative Dünnschichtchromatographie wird verwendet, um die Rapsölproben in Wachsen anzureichern und Triglyceride aus dem Öl zu beseitigen. Die Ölproben werden auf Silica-G-DC-Platten aufgetüpfelt und in Hexan : Ethylacetat (95:5) entwickelt. Der Ort der Wachsbanden wird durch Anfärben mit Iod identifiziert. Die Wachsfraktion wird mit Hexan:Ethylacetat (70:30) aus dem Silica-Medium eluiert, unter Stickstoffgas getrocknet und in Hexan resuspendiert. Dann werden die Wachsfraktionen durch Hochtemperatur-GC unter Verwendung der Triglyceridsäule analysiert. Der 40:2-Wachsesterpeak ist eine der häufigsten Spezies, die in den Proben aus pCGN7643-Pflanzen vorhanden sind, ist aber in untransformierten Kontrollproben nicht vorhanden.
Dann wird das DC-gereinigte Wachs mit Methanol/H₂SO₄ umgeestert. Die Hochtemperatur-GC-Analyse zeigt, dass die Wachspeaks in den Proben nicht mehr vorhanden sind. Dies ist zu erwarten, da bei der Umesterung Fettsäuremethylester und Alkohole aus Wachsestern entstehen sollten.
Die GC-Analyse der umgeesterten Wachsfraktionen unter Verwendung der SUPELCOWAX^TM-10-Säule zeigt, dass die transgenen Proben aus pCGN7643-Pflanzen einen herausragenden 22:1-Fettalkoholpeak enthalten. Die Fraktion aus den Kontrollproben enthält den Fettalkohol nicht.
DC-gereinigtes Wachs wurde auch durch Silbersäulen-HPLC analysiert. In dem Öl, das aus transgenen pCGN7643-Pflanzen extrahiert wurde, gibt es Peaks, die mit Retentionszeiten eluieren, die mit denjenigen von 44:2-, 42:2-, 40:2- und 38:2-Jojobawachs-Standards identisch sind. Diese Peaks fehlen in untransformiertem Kontrollöl.
Eine Kombination von Normalphasen-DC und Silber-HPLC wurde verwendet, um den 40:2-Wachsester aus dem 7643-Öl zu reinigen. Dieser gereinigte Wachsester wurde umgeestert. Die GC-Analyse zeigte, dass der Wachsester aus einer 18:1-Fettsäure und einem 20:1-Fettalkohol bestand. Hochtemperatur-GC und Silbersäulen-HPLC an dieser gereinigten Probe zeigten Folgendes: Wenn der aus dem transgenen Öl isolierte Wachsester mit einem Referenzstandard gemischt wurde, eluierten die beiden Verbindungen als ein einziger Peak.
Der gereinigte Wachsester wurde auch durch IR-Spektrometrie, NMR und hochauflösende Massenspektrometrie analysiert. Die IR- und NMR-Spektren wurden mit den Spektren eines Referenzstandards verglichen und bestätigten die Identität des 40:2-Wachsesters in dem transgenen Öl. Das hochauflösende Massenspektrum des Wachsesters zeigte, dass es die erwartete Molekülmasse und Molekülformel für einen 40:2-Wachsester hat.
Die obigen Ergebnisse beweisen die Möglichkeit, Wachsester in einer Pflanzenzelle nach einem Verfahren zu produzieren, das den Schritt des Züchtens einer Pflanzenzelle umfasst, die eine Fettacyl-Reductase aufweist, die ausgehend von einer Sequenz exprimiert wird, die für die Pflanze heterolog ist. Zellen, die langkettigen Wachsester enthalten und mit Jojoba-Reductase-Nucleinsäuresequenzen transformiert wurden, werden als Beispiele genannt. Es werden Verfahren bereitgestellt, mit denen andere Reductase-Proteine und codierende Sequenzen erhalten werden können, um alternative Fettalkohole und Wachse in Pflanzenzellen zu produzieren.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Wachsesters in einer Pflanzenzelle, die natürlicherweise keine Jojoba-Fettacyl-Reductase erzeugt, wobei das Verfahren das Züchten einer Pflanzenzelle umfasst, die eine Nucleinsäuresequenz, die eine Jojoba-Fettacyl-Reductase codiert, unter der Kontrolle von regulatorischen Elementen aufweist, die in der Pflanzenzelle die Erzeugung einer Jojoba-Fettacyl-Reductase bewirken, wobei das Verfahren das Exprimieren der Reductase ausgehend von einer resynthetisierten Sequenz mit einem AT-Gehalt von weniger als 55% umfasst und wobei die codierende Sequenz die in 2 gezeigte resynthetisierte Sequenz ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Reductasesequenz einen AT-Gehalt von weniger als 52% hat.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Reductasesequenz einen AT-Gehalt von etwa 51% hat.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Pflanzenzelle eine Samenembryozelle ist.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die Zelle eine Brassica-Zelle ist.
Samenembryozelle, die einen Wachsester umfasst, wobei die Zelle natürlicherweise keine Jojoba-Fettacyl-Reductase erzeugt, eine Nucleinsäuresequenz, die eine Jojoba-Fettacyl-Reductase codiert, unter der Kontrolle von regulatorischen Elementen, die in der Pflanzenzelle die Erzeugung einer Jojoba-Fettacyl-Reductase bewirken, aufweist und die Reductase ausgehend von einer resynthetisierten Sequenz mit einem AT-Gehalt von weniger als 55%, bei der es sich um die in 2 gezeigte resynthetisierte Sequenz handelt, exprimieren kann.
Samenembryozelle gemäß Anspruch 6, bei der es sich um eine Brassica-Zelle handelt.
Pflanzen-Samenembryozelle, die eine interne Lipidreserve von mehr als etwa 1,0 Gew.-% Wachsester umfasst, wobei die Zelle natürlicherweise keine Jojoba-Fettacyl-Reductase erzeugt, eine Nucleinsäuresequenz, die eine Jojoba-Fettacyl-Reductase codiert, unter der Kontrolle von regulatorischen Elementen, die in der Pflanzenzelle die Erzeugung einer Jojoba-Fettacyl-Reductase bewirken, aufweist und die Reductase ausgehend von einer resynthetisierten Sequenz mit einem AT-Gehalt von weniger als 55%, bei der es sich um die in 2 gezeigte resynthetisierte Sequenz handelt, exprimieren kann.
Zelle gemäß Anspruch 8, wobei die interne Lipidreserve mehr als etwa 5,0 Gew.-% Wachsester umfasst.
Zelle gemäß Anspruch 9, wobei die interne Lipidreserve 7,0 Gew.-% Wachsester umfasst.
Zelle gemäß Anspruch 8, bei der es sich um eine Brassica-Zelle handelt.
Zelle gemäß Anspruch 8, wobei der Wachsester vorwiegend ein 44:2-Wachsester ist.
Zelle gemäß Anspruch 12, wobei der 44:2-Wachsester mehr als 50% der Wachsesterkomponente der internen Lipidreserven umfasst.
Zelle gemäß Anspruch 13, wobei der 44:2-Wachsester mehr als 60% der Wachsesterkomponente der internen Lipidreserven umfasst.
Öl, das aus einer Zelle gemäß einem der Ansprüche 8 bis 14 erhältlich ist.
Ölzusammensetzung, die aus einer Zelle gemäß einem der Ansprüche 8 bis 14 erhältlich ist und mehr als etwa 10% eines 44:2-Wachsesters umfasst.
Ölzusammensetzung gemäß Anspruch 16, die mehr als etwa 50% eines 44:2-Wachsesters umfasst.
Ölzusammensetzung gemäß Anspruch 17, die mehr als etwa 60% eines 44:2-Wachsesters umfasst.