DE69231586T2

DE69231586T2 - Pharmazeutische anwendungen auf der basis von peptid-metall-ionen

Info

Publication number: DE69231586T2
Application number: DE69231586T
Authority: DE
Inventors: A. Rhodes; O. Zamora
Original assignee: Rhomed Inc
Current assignee: Rhomed Inc
Priority date: 1992-01-03
Filing date: 1992-12-31
Publication date: 2001-07-19
Anticipated expiration: 2013-01-01
Also published as: ES2155447T3; AU683833B2; ATE197767T1; CA2127284A1; EP0629133B1; DK0629133T3; WO1993012819A1; AU3427293A; EP0629133A1; DE69231586D1; EP0629133A4; CA2127284C

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Markieren von Peptiden mit radioaktiven, paramagnetischen und anderen medizinisch nützlichen Metallionen, und Zusammensetzungen, die solche markierten Peptide für die Erkennung von Thrombi, Krebs, Infektionen, Entzündungen und verschiedenen Lungenerkrankungen, Pathologien und Abnormitäten umfassen.[0001]

Hintergrund

Die Verwendung von Proteinen, insbesondere von Antikörpern, als biologisch aktive Zielmittel für medizinisch nützliche Ionen wurde untersucht. Diese Produkte können dem menschlichen Körper verabreicht werden, um die Funktion verschiedener Teile des Körpers sichtbar zu machen oder zu überwachen und um die Anwesenheit und den Ort bestimmter Antigene, Antikörper, Hormone oder dergleichen zu ermitteln; und sie können für die Behandlung verschiedener Krankheitszustände eingesetzt werden. Antikörper und Antikörperfragmente wurden mit einer Reihe von Radionucliden für die Verwendung in der klinischen Diagnostik markiert. Häufig eingesetzte Radionuclide sind unter anderem ¹³¹I, ¹²&sup5;I, ¹²³I, 99mTc, &sup6;&sup7;Ga und ¹¹¹In für die diagnostische Darstellung; und Radionuclide wie &sup9;&sup0;Y, ¹&sup8;&sup8;Re und ¹&sup6;&sup6;Re, und in einem geringeren Ausmass ¹&sup9;&sup9;Au, ¹³¹I und &sup6;&sup7;Cu für eine zielgerichtete Therapie, vornehmlich bei der Behandlung von Krebs. Es gibt auch nützliche Metalle für die Magnetresonanzdarstellung, einschliesslich Gadolinium, Mangan, Kupfer, Eisen, Gold und Europium, bei denen es sich um Nicht-Radioisotope handelt. Bisher haben nur in begrenztem Umfang Arbeiten mit der Markierung von Positronen emittierenden Radiometallen stattgefunden, obwohl einige Proteintypen, wie z. B. Transferrin und Humanserumalbumin, mit &sup6;&sup8;Ga markiert wurden.[0002]

Antikörpermarkierung

Es wurden zwei primäre Verfahren zur Markierung von Antikörpern mit Radiometallen angewendet, ein besonderer Schwerpunkt wurde dabei auf die Radiomarkierung mit 99mTC gelegt. Bei einem Verfahren wurden bifunktionelle Chelate mit dem Antikörper konjugiert, und das bifunktionelle Chelate wurde dann radiomarkiert. Es wurde eine Reihe verschiedener bifunktioneller Chelate eingesetzt; die meisten beinhalten eine Metallionenbindung an Thiolatgruppen, sie können auch eine Metallionenbindung an Amid-, Amin- oder karboxylierte Gruppen beinhalten. Repräsentative bifunktionelle Chelate sind u. a. Ethylendiamintetraessigsäure (EDTE), Diethylentetrarninpentaessigsäure (DTPE), Chelate von Diamiddimercaptiden (N&sub2;S&sub2;) sowie Variationen der oben Genannten, wie z. B. chelatbildende Verbindungen mit N&sub2;S&sub3;, N&sub2;S&sub4; oder N&sub3;S&sub3; Metallbindungsorten, sowie Metallothionin. Das alternative Verfahren zum Radiomarkieren von Antikörpern beinhaltet die Reduktion von Disulfidbindungen im Protein mit einer nachfolgenden Bindung des Metallions an Thiolatgruppen. Es wurde eine Reihe verschiedener Reduktionsmittel verwendet, einschliesslich Zinnsalze, Dithiothreitol und 2-Mercaptoethanol.[0003]
Antikörper sowie Antikörperfragmente wurden mit einer Reihe von Radionucliden für den Einsatz in der klinischen Diagnostik markiert. Diese Radionuclide sind unter anderem ¹³¹I, ¹²&sup5;I, ¹²³I, 99mTc, &sup6;&sup7;Ga sowie ¹¹¹In. Bisher werden lediglich 99mTc und ¹¹¹In-markierte Antikörperpräparate in klinischen Umgebungen weit verbreitet eingesetzt. Für die diagnostische Abbildung sollten beide Isotope ideal sein; klinische Beschränkungen, einschliesslich Leber- und Nierenaffinitäten, die die Erfassung von abdominalen Erkrankungen begrenzen, haben jedoch zu Forschungsarbeiten nach anderen Abbildungsradionucliden angeregt.[0004]
Antikörper wurden auch mit einer Reihe verschiedener Radionuclide für den potentiellen Einsatz in der gezielten Immuntherapie markiert (Pietersz GA, Kannellos J. Smyth MJ et al., The use of monoclonal antibody conjugates for the diagnosis and treatment of cancer (Einsatz monoklonaler Antikörperkonjugate in der Krebsdiagnostik und -behandlung), Immunol Cell Biol 65: 111- 125, 1987). Zu diesen Radionucliden gehören &sup9;&sup0;Y, ¹&sup8;&sup8;Re und ¹&sup8;&sup6;Re, und in einem geringeren Ausmass ¹&sup9;&sup9;Au und &sup6;&sup7;Cu. Auch ¹³¹I wurde verwendet. Mit Ausnahme von ¹³¹I, beinhalten alle derzeit zum Konjugieren dieser Radiometalle mit Antikörpern verwendeten Verfahren den Einsatz von chelatbildenden Gruppen, die chemisch an den Antikörper gebunden sind. &sup6;&sup7;Cu ist ein Radionuclid, das spezielle für den Einsatz als therapeutisches Radionuclid empfohlen wurde, wenn es an Antikörper gebunden ist (Denardo GL, Raventos A, Hines HH et al. Requirements for a treatment planning system for radioimmunotherapy (Anforderungen an ein Behandlungsplanungssystem für die Radioimmuntherapie), Int J Radiol Oncology Biol Phys 11: 335-348, 1985). ¹&sup9;&sup9;Au-konjugierte monoklonale Antikörper wurden auch für den potentiellen Einsatz als Mittel zur Krebstherapie vorgeschlagen.[0005]
&sup6;&sup7;Cu wurde durch Chelate an monoklonale Antikörper gebunden, z. B. ein makrozyklisches Chelat (6-Paranitrobenzyl- 1,4,8,11-Tetraazacyclotettadecan-N,N,N",N''') (Deshpande SV, DeNardo SJ, Meares CF et all, Copper-67-labeled monoclonal antibody Lym-1, A potential radiopharmaceutical for cancer therapy, labeling and biodistribution in RAJI tumored mice (ein potentielles Radiopharmazeutikum für die Krebstherapie: Markierung und Bioverteilung in Mäusen mit RAJI-Tumor), J Nucl Med 29: 217- 225, 1988), und Porphyrine (Roberts JC, Figard SD, Mercer-Smith JA et all, Preparation and characterization of copper-67 porphyrinantibody conjugates (Herstellung and Charakterisierung von Kupfer- 67-Porphyrin-Antikörperkonjugaten), J Immunol Meth 105: 153-164, 1987). Das makrozyklische Chelat, aber nicht das Porphyrin- Konjugat, wurden in einem Tiermodellsystem beurteilt. Sowohl &sup6;&sup4;Cu als auch &sup6;&sup7;Cu wurden mit dem Porphyrin-Verfahren mit Antikörpern und autoantigenen Peptiden konjugiert (Roberts JC, Newmyer SL, Mercer-Smith JA, Schrerer und Lavallee DK, Labelling antibodies with copper radionuclides using N-4-nitrobenzyl-5-(4- carboxyphenyl)-10,15,20-tris(4-sulfophenyl)porphine (Markierung von Antikörpern mit Kupferradionucliden unter Verwendung von N-4- nitrobenzyl-5-(4-carboxyphenyl)-10,15,20-tris(4-Sulfophenyl) Porphin, Appl Radiat Isot 40: 775-781, 1989). Bioverteilungsstudien von Radiokupfer-markierten Antikörpern haben ergeben, dass die Blutreinigung schnell verläuft und die Aufnahme in die Knochen gering ist (Mercer-Smith JA, Cole DA, Roberts JC et al. The biodistribution of radiocopper-labeled compounds (Die Bioverteilung von Radiokupfer-markierten Verbindungen), in: C Kies (ed), Copper Bioavailabiiity and Metabolism S. 103-121, 1990).[0006]
Antikörper wurden mit ¹&sup9;&sup9;Au in der Form von Goldclustern markiert (Hainseld JF, Foley CJ, Srivastava SC et al. Radioactive gold cluster immunoconjugates: Potential agents for cancer therapy (Radioaktive Goldcluster-Immunkonjugate: potentielle Mittel für die Krebstherapie), Nucl Med Biol 17: 287-294 (1990) sowie mit ¹&sup9;&sup9;Au und ¹&sup9;&sup5;Au, als komplexe Ionen in zitratgepufferter Salzlösung (Anderson P, Vaugen ATM und Varley NR, Antibodies labeled with ¹&sup9;&sup9;Au: Potential use of ¹&sup9;&sup9;Au for radioimmunotherapy (Antibodies labeled with ¹&sup9;&sup9;Au: Potential use of ¹&sup9;&sup9;Au for radioimmunotherapy (Mit ¹&sup9;&sup9;Au markierte Antikörper: Potentieller Einsatz von ¹&sup9;&sup9;Au in der Radioimmuntherapie), Nucl Med Biol 15: 293-297, 1988).[0007]
Antikörper und andere Proteine wurden direkt markiert. Es wurde zwar über mehrere direkte Methoden berichtet, aber das erste direkte Verfahren, das eine ausreichend starke Bindung zwischen dem Protein und Technetium-99m für in vivo Anwendungen erbringen konnte, war das Direkt- oder Vorverzinnungsverfahren, das im US-Patent Nr. 4,424,200 mit dem Titel Method for Radiolabeling Proteins with Technetium-99m (Verfahren zum Radiomarkieren von Proteinen mit Technetium-99m) von Crockford, DR und Rhodes, BR beschrieben wurde. Bei diesem Verfahren wird eine einzelne Reduktionsverbindung eingesetzt, bestehend aus Zinnchlorid [Sn(II)] und anderen Salzen, die zum Reduzieren des Proteins, um so die Disulfidbindungen freizulegen, und zum Reduzieren des Natriumpertechnetats dient. Bei diesem Verfahren können zahlreiche Proteine erfolgreich mit 99mTc radiomarkiert werden. Mehrere Forscher haben über die Anwendung dieses Verfahrens berichtet (Rhodes, BA et al "Technetium-99m labeling of murine monoclonal antibody fragments" (Markierung mit Technetium- 99m von monoklonalen Mäuse-Antikörperfragmenten), J Nucl Med 27: 685-693, 1986; Som, P. et al. "Radioimmunoimaging of experimental thrombi in dogs using technetium-99m-labeled monoclonal antibody fragments reactive with human platelets" (Radioimmunabbildung von experimentellen Thrombi in Hunden mit Technetium-99m-markierten monoklonalen Antikörperfragmenten, die mit menschlichen Blutplättchen reagieren), J Nucl Med 27: 1315- 1320, 1987).[0008]
Es wurde über äquivalente Verfahren zum direkten Markieren berichtet (Schwarz A. und Steinstruaber A "A novel approach to Tc-99m-labeled monoclonal antibodies" (Ein neuer Ansatz zu Tc-99m-markierten monoklonalen Antikörpern), J Nucl Med 28: 721, 1987; Pak KY et al. "A rapid and efficient method for labeling IgG antibodies with Tc-99m and comparison to Tc-99m Fab" (Ein schnelles und effizientes Verfahren zum Markieren von IgG Antikörpern mit Tc-99m und Vergleich mit Tc-99m Fab), J Nucl Med 30: 793, 1989; Granowska., M et al. "A Tc-99m-labeled monoclonal antibody, PR1A3, for radioimmunoscintigraphy" (Ein Tc-99m- markierter monoklonaler Antikörper, PR1A3 für die Radioimmunszintigrafie), J Nucl Med 30: 748, 1989). Bei den äquivalenten Verfahren wurden andere Disulfidreduktionsmittel verwendet als Zinnsalze. Pak et al verwendeten Dithiothreitol für die Reduktion der Disulfidbindungen des Antikörpers; Swartz und Steinsbruaber sowie Granowska et al verwendeten 2-Mercaptoethanol. Auch einige dieser Forscher (Swartz und Steinsbruaber sowie Granowska et al) reduzierten das Tc-99m, bevor sie es dem reduzierten Antikörper zugaben, was zusätzliche Schritte zum ursprünglichen Verfahren bedeutete.[0009]
Reno, J. W. et al. US-Patent Nr. 4,877,868, Radionuclide Antibody Coupling, verwendet Dithiothreitol (DTT) zum Reduzieren der Disulfidgruppen des Proteins, und schützt dann die reaktiven Sulfide mit Zn(II) oder anderen Sulfhydrylgruppen-derivierenden Reagensen. Tartratsalze wurden zum Komplexieren und Transferieren des reduzierten Radionuclids verwendet. Bei diesem Verfahren werden potentiell toxische Chemikalien wie z. B. Dithiothreitol eingesetzt, um die Antikörper zu reduzieren. Es erfordert auch mehrere Schritte zum Radiomarkieren des Proteins.[0010]
Thakur, M. L., US-Patent Nr. 5,001,676, Method to Directly Radiolabel Antibodies for Diagnostic Imaging and Therapy (Verfahren zum direkten Radiomarkieren von Antikörpern für die diagnostische Abbildung und Therapie), verwendete Natriumascorbat zum Reduzieren der Disulfidgruppen von Antikörpern. Dieses Verfahren kann jedoch nicht für eine direkte Einzelschritt- Markierung angepasst werden: Das Radionuclid muss vor seiner Zugabe zu dem mit Natriumascorbat reduzierten Protein reduziert werden. In einer bevorzugten Ausgestaltung des Thakur-Verfahrens wird eine separate Phüole verwendet, in der Natriumdithionit eingesetzt wird, um das Radionuclid zu reduzieren, so dass Dithionit-reduziertes Radionuclid erzeugt wird.[0011]
Es gibt nützliche Metalle für die Magnetresonanzabbildung, wie z. B. Gadolinium, Mangan, Kupfer, Eisen, Gold und Europium, die keine Radioisotopen sind. Beispiele sind auch unter anderem Ionen eines Lanthanoidelementes mit Atomzahlen von 57-70 oder Ionen von Übergangsmetallen mit Atomzahlen von 21-29 und 42-44. Beispiele für Metalle, von denen man erwarten würde, dass sie potentiell für Magnetresonanzabbildungen mit Proteinen nützlich wären, die mit den in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Verfahren markiert wurden, sind u. a. Kupfer, Eisen und Gold sowie kolloidale Eisen- oder Goldpräparate.[0012]
Bisher scheinen Antikörper nicht mit Positronenemittierenden Radiometallen markiert worden zu sein, obwohl andere Proteintypen (Transferrin und Humanserumalbumin) mit &sup6;&sup8;Ga markiert wurden (Green MA und Welch MJ, Gallium radiopharmaceutical chemistry, Nucl Med Biol 16: 435-448, 1989). Die kurze Halbwertszeit in Verbindung mit &sup6;&sup8;Ga, d. h. 68 Minuten, legt den Schluss nahe, dass es sich hierbei häufig nicht um eine geeignete Markierung für Antikörper handelt, die dazu neigen, längere biologische Halbwertszeiten zu haben.[0013]

Peptide als Radiopharmazeutika

Der Einsatz biologisch aktiver Peptide, bei denen es sich um Peptide handelt, die sich an spezifische Zelloberflächenrezeptoren binden, als Radiopharmazeutika wurde einige Beachtung geschenkt. Die kanadische Patentanmeldung 2,016,235, Labeled Chemotactic Peptides to Image Focal Sites of Infection or Inflammation, (Markierte chemotaktische Peptide zur Abbildung von Fokalorten von Infektionen oder Entzündungen) lehrt ein Verfahren zum Erkennen eines Infektions- oder Entzündungsortes sowie ein Verfahren zur Behandlung einer solchen Infektion oder Entzündung durch Verabreichen eines markierten oder therapeutisch konjugierten chemotaktischen Peptids. In dieser Anmeldung werden die chemotaktischen Peptide chemisch mit DTPE konjugiert und nachfolgend mit ¹¹¹In markiert. Der Nutzen von DTPE-Chelaten, die kovalent mit Polypeptiden und ähnlichen Substanzen gekoppelt wurden, ist in der Technik bekannt (Hnatowich DJ, US-Patent Nr. 4,479,930 und Nr. 4,668,503). Auch andere bifunktionelle Chelate für die Radiomarkierung von Peptiden, Polypeptiden und Proteinen sind in der Technik bekannt. Andere beschriebene biologisch aktive Peptide sind unter anderem die, die von Olexa SA, Knight LC und Budzynski AZ im US-Patent Nr. 4,427,646, Use of Radiolabeled Peptide Derived from Crosslinked Fibrin to Locate Thrombi in Vico (Einsatz von radiomarkiertem Peptid, abgeleitet von quervernetztem Fibrin zur In-vivo-Erkennung von Thrombi) offenbart sind, in dem Iodierung als ein Mittel zur Radiomarkierung erörtert wird. In Morgan CA Jr und Anderson DC, im US-Patent Nr. 4,986,979, Imaging Tissue Sites of Inflammation (Abbildung von Entzündungsorten in Gewebe) werden die Verwendung von Chelaten und eine direkte Iodierung offenbart. In Tolman GL, US-Patent Nr. 4,732,864, Trace- Labeled Conjugates of Metallothionein and Target-Seeking Biologically Active Molecules (Spurenmarkierte Konjugate von Metallothionein und zielsuchende biologisch aktive Moleküle) wird der Einsatz von Metallothionein oder Metallothionein-Fragmenten, die mit einem biologisch aktiven Molekül konjugiert werden, einschliesslich Peptiden, offenbart. Alle oben genannten Verfahren verwenden ein Konjugationsmittel mit einem bifunktionellen Chelatbildner, um die Markierung mit einem Radionuclid oder einem anderen medizinisch nützlichen Metallion wie z. B. einem paramagnetischen Kontrastmittel zu bewirken. Die einzige Ausnahme involviert Radioiodierung; die Iodmarkierung von Proteinen oder Peptiden, die Tyrosin- oder Histidinreste beinhalten, ist bekannt, z. B. Verfahren in Verbindung mit Chloramin-T, Iodmonochlorid, Iodogen oder Lactoperoxidase.[0014]
Andere biologische aktive Peptide sind unter anderem Analoge von Formylpeptid-Chemoattraktanten, die sich mit Neutrophilen binden. Diese Peptide basieren auf der Sequenz N- formyl-Met-Leu-Phe. Das "C"-terminale Ende kann so modifiziert werden, dass es zusätzliche Sequenzen beinhaltet, die einen Metallionen bindenden Bereich bilden. Das klinische und diagnostische Abbildungspotential formylierter chemotaktischer Peptide wurde kürzlich von Fischman et al demonstriert (Fischman AJ, Pike MC, Kroon D, Fucello AJ, Rexinger D, tenKate C, Wilkinson R, Rubin RH und Strauss HW: Imaging focal sites of bacterial infection in rats with indium-111-labeled chemotactic peptide analogs (Abbildung von Fokalorten bakterieller Infektionen in Ratten mit Indium-111-markierten chemotaktischen Peptidanalogen), J Nucl Med 32: 483-491, 1991), unter Verwendung chemotaktischer Peptide, die chemisch mit DTPE konjugiert und nachfolgend mit ¹¹¹In markiert wurden. Chemotaktische Peptide wurden auch radioiodiert, indem man formylierte Peptide synthetisierte, die Tyrosinaminosäuren enthielten. Diese Peptide wurden in vitro eingesetzt und haben dieselbe biologische Funktion wie unmarkierte formylierte Peptide (Janeczek AH, Marasco WA, Van Alten PJ und Walter RB: Autoradiographic analysis of formylpeptide chemoattractant binding, uptake and intracellular processing by neutrophils (Autoradiografische Analyse der Formylpeptid- Chemoattraktantbindung, Aufnahme und intrazellulare Verarbeitung durch Neutrophile), J Cell Sci 94: 155-168, 1989).[0015]
Peptidanaloge von Somatostatin wurden nach der Radiomarkierung für die diagnostische Abbildung eingesetzt. Somatostatin ist ein Hormon, das im Hypothalamus erzeugt wird und normalerweise die Freisetzung von Hypophysenwachstumshormon hemmt. Es wurde eine Reihe von Peptidanalogen entwickelt, die pharmakologische Wirkungen haben, die das natürlich vorkommende Hormon imitieren. Octreotidacetat, eines der Somatostatinanaloge, enthält eine Disulfidbindung. Bei normalen Lebewesen haben Somatostatin und seine Analoge die Fähigkeit, die Sekretion von Serotonin und der gastroenteropankreatischen Peptide sowie von Wachstumshormon zu unterdrücken. Es wurde gefunden, dass eine Reihe von Tumortypen Somatostatinrezeptoren expressionieren, und es wurden ¹²&sup5;I-markierte Somatostatinanaloge verwendet, um Kleinzellen-Lungenkrebs abzubilden (Kwekkeboom DJ, Krenning EP, Bakker WH et al: Radioiodinated somatostatin analog scintigraphy in small-cell lung cancer (Radioiodierte Somatostatinanalog- Szintigrafie in Kleinzellen-Lungenkrebs), J Nucl Med 32: 1845-1848, 1991).[0016]
Die potentielle Rolle von Aminosäuresequenzen, die in Peptiden und Proteinen in Bindungsübergangsmetallen gefunden werden, wurde erkannt. In Vallee Bl und Auld DS: Zinc coordination, function, and structure of zinc enzymes and other proteins (Zinkkoordination, Funktion und Struktur von Zinkenzymen und anderen Proteinen), Biochemistry 29: 5648-5659, 1990, werden die allgemeinen Eigenschaften von Nicht-Metallothioneinproteinen beschrieben, die Zinkbindungsorte enthalten. Arnold FH und Haymore BL beschreiben Histidin-haltige Aminosäuresequenzen, die für die Proteinreinigung durch Metallchelatchromatografie eingesetzt werden (Engineered metal-binding proteins: purification to protein folding, Science 252: 1796-1797, 1991). Iverson et al beschreiben ein Mittel zur genetischen Manipulation von Antikörpern, so dass sie Metallbindungsorte in der immunologischen Bindungsregion enthalten, mit dem Ziel, katalytische Antikörper herzustellen (Iverson BL, Iverson SA, Roberts VA, Getzoff ED, Tainer JA, Benkovic SJ und Lerner RA: Metalloantibodies, Science 249: 659-662, 1990). Der Einsatz von Histidin-haltigen Aminosäuresequenzen, die Ru binden, um austauschträge Metallkomplexe zur Erzielung hochstabiler -helikaler Metallopeptide zu bilden, wurde in Ghardiri MR und Fernholz AK: Peptide architecture, Design of stable -helical metallopeptides via a novel exchange-inert RuIII complex (Peptidarchitektur, Entwicklung stabiler -helikaler Metallpeptide über einen neuen austauschträgen RuIII Komplex), J Am Chem Soc 112: 9633-9635, 1990, beschrieben. Die Rolle von isolierten Aminosäureliganden zum Binden von &sup9;&sup9;Tc und 99mTc ist bereits seit langem bekannt; Seifert et al beschreiben die Fähigkeit von Stickstoffspenderatomen, reduzierte Technetium- Spezies mit freiem Lysin, Ornithin und Histidin zu reduzieren (Seifert S. Munze R und Johannsen B: Technetium-99 and 99m chelates with N-donor ligands: a new class of potentially cationic radiopharmaceuticals (Technetium-99 und 99m Chelate mit N-Donor- Liganden: eine neue Klasse potentiell kationischer Radiopharmazeutika), in Technetium in Chemistry und Nuclear Medicine, Deutsch E, Nicolini M und Wagner HN Jr, Herausgeber, Cortina International, Verona, 1983, S. 19-23).[0017]

Lungenabbildung

Pulmonale Radionuclid-Abbildungstechniken, die derzeit allgemein zur Anwendung kommen, beinhalten den Einsatz von a) makroaggregiertem/n Albumin oder Albuminmikrosphären (MAA) b) Radioaerosolen (99mTC-DTPA), c) radioaktiven Gasen und d) Galliumcitrat. Siehe allgemein Anger, K: Radionuclide Studies of the Lung (Radionuclidstudien der Lunge), in: Sperber, M (Redakteur), Radiologic Diagnosis of Chest Disease (Radiologische Diagnostik von Brusterkrankungen), Springer-Verlag, New York, 1990, S. 140-153: Miller RF und O'Doherty MJ: Pulmonary nuclear medicine. Eur J Nucl Med 19(1992) 355-368. MAA ist ein radioaktiver Partikel, der durch Kapillarblockade sequestriert wurde. Nach der Verabreichung radioaktiver Partikel von mehr als 10 m im Durchmesser in eine periphere Vene wirken Lungenkapillare und präkapillare Arteriolen wie ein Sieb, wobei die 99mTc-MAA Partikel vorübergehend blockiert werden, so dass der Tracer bei seiner ersten Passage durch die Lunge eingeschlossen wird. Die Radioaktivitätsverteilung zeigt eine relative Lungenperfusion. Wenn der Blutstrom unterbrochen oder in einem Lungenabschnitt von mehr als 2 cm erheblich verändert wurde, dann wird ein Defekt als Photonmangelbild dargestellt. Die meisten MAA-Partikel (90%) haben einen Durchmesser im Bereich von 10-40 m. MAA-Partikel zerfallen zu kleineren Partikeln, mit einer biologischen Halbwertszeit der Lungenvaskulator von 2-9 Stunden; sie werden durch Phagozytose im retikuloendothelialen System beseitigt.[0018]
Bei vielen Lungenerkrangungen kommt es in den betroffenen Bereichen zu einem veränderten pulmonalen Blutstrom. Mit radiomarkiertem MAA können Bereiche mit verändertem Blutstrom erkannt werden, aber man erhält keine Informationen über ein bestimmtes biochemisches oder metabolisches Ereignis. Eine Perfusionslungenzintigrafie ist zwar äusserst empfindlich, aber nicht spezifisch. Darüber hinaus wurden Perfusionsdefekte (13%) bei nichtrauchenden Freiwilligen ohne Lungenerkrankungen gefunden, und auch Verluste normaler Apex-to-Base-Gradienten (9%) wurden beobachtet (Webber mm, Renick LH, Fouad BI und Victory WK: Variants of the normal lung scan: Correlation with pulmonary function tests (Varianten des normalen Lungenscans: Korrelation mit Lungenfunktionstests), J Nucl Med 13 (1972) 476; Tetalman MR, Hoffer PB, Heck LL et al. Perfusion scans in normal volunteers (Perfusionsscans bei normalen Freiwilligen), Radiology 106 (1973) 593-594). Der Mangel an Spezifizität kann zu Fehldiagnosen, der Notwendigkeit für zusätzliche Testverfahren sowie zu Verzögerungen bei der Durchführung einer Therapie führen. Somit besteht Bedarf an einem diagnostischen Radiopharmazeutikum, das einige oder alle diese Probleme überwinden kann.[0019]
Die Lunge ist ein Organ, das eine erhebliche Verschlechterung und Umgestaltung der extrazellulären Matrix infolge einer Erkrankung erfahren kann. Emphysem, Fibrose, Krebs und andere chronische obstruktive Lungenerkrankungen können zu mikroskopischen und makroskopischen Veränderungen des Luftraums sowie zugehörigen Änderungen der extrazellulären Lungenmatrix und der Genzhaut führen. Ein Radiopharmazeutikum, das spezifische Veränderungen der extrazellulären Moleküle oder ihrer Rezeptoren erkennen kann, kann als spezifische Sonde zum Prüfen des biochemischen und metabolischen Zustands der Lunge in Krankheitsprozessen verwendet werden.[0020]
Laminin ist ein Grenzhaut-Glykoprotein (Mr = 900.000), das verschiedene biologische Aktivitäten einschliesslich der Förderung von Zellbindung, Wachstum und Differenzierung hat. Ein typisches Lamininmolekül besteht aus drei Polypeptidketten - A (440 kd), B1 (200 kd) und B2 (220 kd) - die durch Disulfidbindungen verknüpft sind, um eine asymmetrische Vernetzungsstruktur zu bilden. Mehrere getrennte Adhäsionssequenzen in Laminin scheinen spezifische biologische Funktionen zu katalysieren und sich an separate Zelloberflächenrezeptoren zu binden (Hynes RO: Integrins: versatility, modulation and signaling in cell adhesion, Cell 69 (1992) 11-25: Yamada KM: Adhesive recognition sequences, J Biol Chem 266 (1992) 2809-2812).[0021]
Eine adhäsive Sequenz von der Laminin-A-Kette ist Ile- Lys-Val-Ala-Val (IKVAV), und dieses Peptid sowie längere Laminin- Peptid-Sequenzen, die IKVAV enthalten, erhöhen Berichten zufolge die In-vitro-Adhäsionsfähigkeit einer Reihe von Zelllinien einschliesslich Mastzellen (Thompson HL, Burbelo PD, Yamada Y, Kleinman HK und Metcalfe DD: Identification of an amino acid sequence in the laminin A chain mediating mast cell attachment and spreading (Identifizierung einer Aminosäuresequenz in der Laminin- A-Kette, die Mastzellenbindung und -verteilung katalysiert), Immunology 72 (1991) 144-149; Thompson HL, Burbelo PD, Yamada Y, Kleinman HK und Metcalfe DD: Mast cells chemotax to laminin with enhancement after IgE-mediate activation (Mastzellen-Chemotaxis zu Laminin mit Verbesserung nach IgE-Katalyseaktivierung), J Immunol 143 (1989) 4188-4192), Gehirnzellen (Tashiro K-I, Sephel GC, Weeks B, Sasaki M, Martin GR, Kleinman HK und Yamada Y: A synthetic peptide containing the IKVAV sequence from the A chain of laminin mediates cell attachment, migration and neunte outgrowth (Ein Synthesepeptid, das die IKVAV-Sequenz von der A-Kette von Laminin enthält, katalysiert Zellbindung, Migration und Neuritwachstum), J Biol Chem 27 (1989) 16174-16182; Kleinman HK, Weeks B5, Cannon FB, Sweeney TM, Sephel GC, Clement B, Zain M, Olson MOJ, Jucker M, Burrous BA: Identification of a 100-kDa nonintegrin cell surface laminin-binding protein which recognises an A chain neuritepromoting peptide (Identifizierung eines lamininbindenden Proteins mit 100-kDa Non-Integrin-Zelloberfläche, das ein A-Ketten-Neurit förderndes Peptid erkennt), Arch Biochem Biophys 290 (1991) 320- 325; Skubitz APN, Letourneau PC, Wayner E und Furcht LT: Synthetic peptides from the carboxyl-terminal globular domain of the A chain of laminin: their ability to promote cell adhesion and neunte outgrowth, and interact with heparin and the B1 integrin subunit (Synthetische Peptide aus dem carboxyl-terminalen Globularbereich der Laminin-A-Kette: ihre Fähigkeit, Zelladhäsion und Neuritwachstum zu fördern und mit Heparin und der B1-Integrin- Subeinheit zusammenzuwirken), J Cell Biol 115 (1991) 1137-1148; Sephel GC, Tashiro K-I, Sasaki M, Greatorex D, Martin GR, Yamada Y und Kleinman HK: Laminin A chain synthetic peptide which supports neunte outgrowth (Synthetisches Laminin-A-Ketten-Peptid, das Neuritwachstum unterstützt), Biochem Biophys Res Comm 162 (1989) 821-829), normale mesenchymale Zellen (Kleinman et al. supra, 1991), Tumorzellen (Kleinman et al. supra, 1991) und Hepatocyte (Clement B, Segui-Real B, Savagner P, Kleinman HK und Yamada Y: Hepatocyte attachment to laminin is mediated through multiple receptors (Hepatozyt-Bindung an Laminin wird durch mehrere Rezeptoren katalysiert), J Cell Biol 110 (1990) 185-192). Ein solches längeres Peptid, Cys-Ser-Arg-Ala-Arg-Lys-Gln-Ala-Ala-Ser- Ile-Lys-Val-Ala-Val-Ser-Ala-Asp-Arg (auch als PA22-2 bezeichnet), erhöhte die In-vivo-Lungenkolonialisierung durch Melanomzellen (Kanemoto T, Reich R, Royce L, Greatorex D, Adler SH, Shiraishi N, Martin GR, Yamada Y und Kleinman HK: Identification of an amino acid sequence from the laminin A chain that stimulates metastasis and collagenase IV production (Identifizierung einer Aminosäuresequenz von der Laminin-A-Kette, die Metastase und Kollagenase-IV-Produktion stimuliert), Proc Nat Acad Sci (USAl 87 (1990) 2279-2283). Der Konformationszustand, aber nicht die spezifische Chiralität des IKVAV-Bereiches ist ein begünstigender Faktor für die biologische Aktivität (Nomizu M, Utani A, Shiraishi N, Kibbey MC, Yamada Y und Roller PR: The all-D-configuration segment containing the IKVAV sequence of laminin A chain has similar activities to the all-L-peptide in vitro and in vivo (Das All-D-Configuration-Segment, das die IKVAV-Sequenz der Laminin-A- Kette enthält, hat ähnliche Aktivitäten wie die All-L-Peptide in vitro und in vivo), J Biol Chem 267 (1992) 14118-14121).[0022]

Thrombus-Abbildung

Unter homöostatischen Bedingungen zirkulieren Blutplättchen als scheibenförmige Zellen, die nicht mit anderen zirkulierenden Blutzellen oder dem vaskulären Endothelium zusammenwirken (Buchanan MR: Mechanisms of pathogenesis of arterial thrombosis: potential sites of inhibition by therapeutic compounds (Pathogenesernechanismen der arteriellen Thrombose: potentielle Hemmungsorte durch therapeutische Verbindungen), Sem Thrombosis and Hemostasis 14 (1988) 33-40). Die Freisetzung von Adhäsions- und Koagulationsmitteln in Verbindung mit der Blutplättchenaktivierung wird durch hohe Intraplättchen- und möglicherweise vaskuläre Endothelwerte von cAMP kontrolliert.[0023]
Nach einer Verletzung binden sich Blutplättchen rasch a) an funktionsunfähige oder abgelöste Endothelzellen, und b) an die darunterliegende Grenzhaut und an Gewebe. Differenzen der Blutplättchenreaktion in Korrelation zum Ausmass der Verletzung, sind teilweise auf Differenzen der Gefässwandzusammensetzung der Moleküle zurückzuführen, an denen die Blutplättchen haften. So fördern beispielsweise Kollagene des Typs I und III, die typischerweise mit Glattmuskelzellen assoziiert werden, Blutplättchenadhäsion, -aggregation und -freisetzung. Im Gegensatz dazu erleichtern Kollagene der Typen IV und V, die typischerweise mit dem Endothel in Verbindung gebracht werden, eine Blutplättchenadhäsion, bewirken jedoch im Allgemeinen keine Blutplättchenaktivierung.[0024]
Durch Blutplättchen katalysierte Thrombose ist ein bedeutender pathogener Mechanismus bei der Thrombogenese und einer Reokklusion nach einer erfolgreichen thrombolytischen Therapie, und daher werden Blutplättchen häufig als Vehikel für eine Lokalisierung von Thrombi verwendet. Darüber hinaus wird über eine Suppression der Blutplättchenaggregation häufig Blutgefässokklusion oder Reokklusion verhindert. Es gibt eine Reihe klinischer Zustände, bei denen es zu Blutplättchenakkumulationen kommt: dies sind unter anderem venöse Thrombose, arterielle Thrombose, linksventrikuläre Thrombose, Lungenembolie, inflammatorische Sekundärreaktion nach einem Myokardinfarkt, Endokarditis, Bypass-Graft-Okklusion, Aneurysmen, prosthetische arterielle Graft-Blutplättchenakkumulation oder - okklusion, Gehirnembolie oder -hämorrhagie, traumatische Verletzungen mit Hämorrhagie, gastrointestinale Hämorrhagie und Sekundärthrombose durch Katheter und andere implantierte Geräte.[0025]
Es wurde eine Reihe diagnostischer Modalitäten für Konditionen in Verbindung mit Blutplättchenakkumulation verwendet. Dazu gehören Kontrastvenografie, Impedenz-Plethysmografie und ¹²&sup5;I Fibrinogenaufnahme für venöse Thromboembolie; ¹¹¹In-markierte Blutplättchen für eine Reihe verschiedener Konditionen in Verbindung mit Blutplättchenakkumulation; und Lungenangiografie, Perfusionslungenscanning mit 99mTc-Human-makroaggregiertem Albumin und Ventilations-Perfusionslungenscanning mit radioaktiven Gasen oder Aerosolen für Lungenembolie. Jede dieser Modalitäten hat ernsthafte Einschränkungen und nicht die gewünschte Wirksamkeit. ¹¹¹In-markierte Blutplättchen sind die einzige Modalität, die ein zuverlässiges Direktmass für eine Blutplättchenakkumulation ergibt; dieses Verfahren leidet jedoch an ernsthaften Beschränkungen, einschliesslich technischer Schwierigkeiten bei der Ex-vivo-Markierung. Dazu kommt, dass, da bei ¹¹¹In-markierten Blutplättchen die Markierung ex vivo erfolgt und weil die Blutplättchen vor der Abbildung neu injiziert und akkumulieren gelassen werden, dieses Verfahren kein Mass für eine existierende Blutplättchenakkumulation ergibt. Somit gibt es kein allgemein anwendbares Verfahren, das eine direkte Erkennung einer existierenden Blutplättchenakkumulation im Körper zuliesse.[0026]
Die adhäsive Sequenz RGD enthaltende Peptide werden aktiv als Anti-Thrombosemittel untersucht (Imura Y, Stassen J-M, Dunting S, Stockmans F und Collen D: Antithrombotic properties of L-cysteine, N-(mercaptoacetyl)-D-Tyr-Arg-Gly-Asp-sulfoxide (G4120) in hamster platelet-rich femoral vein thrombosis model (Antithromboseeigenschaften von L-Cystein, N-(Mercaptoacetyl)-D- Tyr-Arg-Gly-Asp-Sulfoxiden (G4120) in einem Modell einer blutplättchenreichen femoralen Hamstervenenthrombose), Blood 80 (1992) 1247-1253). Knight et al (Knight LC, Radcliffe R, Kollman M, Dasika V, Wikander R, Mauer AH, Rodwell JD und Alvarez V: Thrombus imaging with Tc-99m synthetic peptides reactive with activated platelets (Thromboseabbildung mit Tc-99m synthetischen Peptiden, die mit aktivierten Blutplättchen reagieren), J Nucl Med 31 (1990) 757 (Abstrakt)) berichteten über die Verwendung von 99mTc synthetischen Peptid-Metallothionein-Komplexen, die sich an den Blutplättchen-Glykoprotein-IIb/IIa-Komplex binden, um frische Thrombi in Halsvenen abzubilden. Peptide, die auf den Glykoprotein-IIb/IIa-Komplex gerichtet sind, beeinflussen jedoch bekannterweise die Blutplättchenaggregation auf negative Weise, und man würde demzufolge davon ausgehen, dass ein Radiopharmazeutikum auf der Basis eines solchen Ansatzes ernsthafte Dosiseinschränkungen hätte.[0027]
Ausser Peptiden wurden auch radiomarkierte monoklonale Antikörper, die für blutplättchenbezogene Antigene spezifisch sind, als diagnostische Radiopharmazeutika studiert (Shah VO, Zamora P0, Mills SL, Mann PL und Comp PC: In vitro studies with the platelet-reactive antibody 50H.19 and its fragments (In-Vitro- Studien mit Bluttplättchen-reaktivem Antikörper 50H.19 und seinen Fragmenten), Thrombosis Research 58 (1990) 493-504; Som P, Oster ZH, Yamamoto K, Sacker DF, Brill AB, Zamora PO, Newell KD und Rhodes BA: Radioimmunoimaging of experimental thrombi in dogs using Tc-99m labeled monoclonal antibody fragments reactive with human platelets (Radioimmunabbildung experimenteller Thrombi in Hunden mit Tc-99m-markierten monoklonalen Antikörperfragmenten, die mit menschlichen Blutplättchen reagieren), J Nucl Med 27 (1986) 1315-1320).[0028]
Rezeptoren des Integrin-Typs auf Blutplättchen (Glykoprotein Ib, der Glykoprotein-IIb/IIIa-Komplex und Glykoprotein IV) wurden als bedeutende Adhäsionsrezeptoren in Blutplättchen identifiziert, aber diese Glykoproteine scheinen keine Rolle bei der Zusammenwirkung von Blutplättchen mit dem intakten Lamininmolekül zu spielen (Tandon NN, Holland EA, Kralisz U, Kleinman HK, Robey FA und Jamieson GA: Interaction of human platelets with laminin and identification of the 67 kDa laminin receptor an platelets (Zusammenwirken menschlicher Blutplättchen mit Laminin und Identifizieren des 67 kDa Laminin-Rezeptors auf Blutplättchen), Biochern J 274 (1991) 535-542). Blutplättchen binden sich jedoch an Lamininpeptid-Fragmente über diese Rezeptoren (Sonnenberg A, Gehisen KR, Aumailley M und Timpi R: Isolation of a6b1 integrins from platelets and adherent cells by affinity chromatography an mouse laminin fragment E8 and human laminin pepsin fragment (Isolation von a6b1 Integrinen von Blutplättchen und adhärenten Zellen durch Affinitätschromatografie am Mäuse-Lamininfragment E8 und menschlichem Laminin-Pepsin- Fragment), Exp. Cell Res. 197 (1991) 234-244), was den Schluss nahelegt, dass diese Orte in Laminin normalerweise für Blutplättchen kryptisch sind. Ein Nicht-Integrin- Blutplättchenrezeptor für Laminin ist ein 67 kDa Rezeptor, der sich an Laminin-derivierte Peptidsequenzen bindet, die Tyr-Ile- Gly-Ser-Arg (YIGSR) enthalten (Tandon et al. supra). Dieser Blutplättchenrezeptor scheint eine wichtige Rolle bei der Zusammenwirkung von Blutplättchen mit dem intakten Lamininmolekül zu spielen. Die Blutplättchenadhäsion an Laminin über diesen Rezeptor führt an sich nicht zu einer Blutplättchenaktivierung (III CR, Engvall E, und Ruoslahti E: Adhesion of platelets to laminin in the absence of activation (Adhäsion von Blutplättchen an Laminin bei fehlender Aktivierung), J Cell Biol. 99 (1984) 2140-2145).[0029]
Die YIGSR-Peptidsequenz enthaltende Peptide wurden als anti-metastatische Agenzien vorgeschlagen (Yamada Y, Graf JO, Iwamoto Y, Rober F, Kleinman HK, Sasaki M und Martin GR, US-Patent 5,092,885, Peptides with Laminin Activity; Schasteen CS, US-Patent 5,039,662, Peptide with Anti-Metastatic Activity). Diese Patente beinhalten längere Sequenzen, die die YIGSR-Peptidsequenz enthalten, sowie acylierte YIGSR-Peptidsequenzen.[0030]

Zusammenfassung des Standes der Technik

Das Markierungsverfahren der US 4,424,200 (supra), das auf Proteine beschränkt ist, beschreibt die Markierung von z. B. IgG durch Inkubieren des Proteins mit gepuffertem Zinnchlorid und weiteres Inkubieren einer Aliquote der reultierenden Lösung mit radioaktivem Natriumpertechnetat. Es gibt keine klare Erklärung für den beteiligten Mechanismus. Es wird jedoch impliziert, dass ein einzelnes Reduktionsmittel bestehend aus Zinnchlorid (Sn(II)) sowohl zum Reduzieren des Proteins, um so die Disulfidbindungen zu exponieren, als auch zum Reduzieren des Pertechnetat- Markierungsmittels dient. Das beschriebene Verfahren beinhaltet keine Trennung von überschüssigem Reduktionsmittel, und er enthält keine Vorschläge, die andere Übergangsmetalle als Zinn beinhalten.[0031]
Daher hat die Markierung von Peptiden mit Metallionen bisher den Einsatz bifunktioneller Chelatbildner beinhaltet (siehe z. B. WO 90/13317). In einer Reihe der oben aufgeführten Publikationen sind bestimmte potentiell nützliche Sequenzen für eine Therapie beschrieben, aber ohne Vorschläge in Bezug auf eine Markierung.[0032]

Die Erfindung

Die Markierung von Peptiden, insbesondere von kleinen Peptiden, die sich leicht synthetisieren lassen, unterliegt weitaus grösseren Schwierigkeiten, als dies bei grossen Molekülen der Fall ist, die zahlreiche Orte verfügbar haben. Es sind möglicherweise nur ein oder zwei Orte pro Molekül (im Vergleich zu Hunderten oder Tausenden) zur Markierung vorhanden, und es ist eine weitaus höhere Sicherheit nötig. Dadurch wird das Stabilitätsproblem enorm erhöht. Nur mit einem Verfahren, dessen Konzept einfach ist und das nach einem klar verständlichen Mechanismus abläuft, kann eine solche Reproduzierbarkeit erzielt werden. Gleichzeitig muss das Verfahren zu stabilen Produkten führen und das Potential für eine breite Anwendung besitzen, um kommerziell erfolgreich zu sein. Die Erfindung basiert auf der Entdeckung eines solchen Verfahrens nach einer aufwendigen Untersuchung des beteiligten Mechanismus, und beinhaltet Ansprüche für radiomarkierte spezifische Peptide mit einer Struktur, die durch das erfindungsgemässe Verfahren diktiert wird.[0033]
Gemäss einem Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung bereitgestellt, die ein markiertes Peptid enthält, das für die Verabreichung an einen Patienten geeignet ist, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:[0034]
(a) Vorlegen oder Herstellen eines Peptidsubstrats, das einen biologischen Funktionsbereich (BD) und einen medizinisch nützlichen Markierungsmetallion-Bindungsbereich (MD) enthält, wobei das genannte Substrat einer Formel entspricht, die ausgewählt ist aus:
(R&sub1;) - [Y&sub1;]n - (R&sub2;),
(R&sub1;) - [Y&sub1; - (R&sub2;) - Y&sub1;]n - (R&sub3;) und
(R&sub1;) - [Y&sub1; - (R&sub2;) - Y&sub2;]n - (R&sub3;)
worin
R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; jeweils eine Aminosäuresequenz mit 0 bis 20 Aminosäuren bedeuten,
Y&sub1; und Y&sub2; Aminosäuren mit S, N und/oder O bedeuten, die in der Lage sind, mit Ionen eines Übergangsmetalls ausgewählt aus Zn, Cu, Sn, Co und Ni zu komplexieren, und
n eine ganze Zahl von 1 bis 6 bedeutet,
worin
der genannte MD ausgewählt ist aus [Y&sub1;]n [Y&sub1; - (R&sub2;) - Y&sub1;]n und [Y&sub1; - (R&sub2;) - Y&sub2;]n und
der genannte BD R&sub1;, R&sub2; und /oder R&sub3; umfasst und eine Aminosäuresequenz mit 1 bis 20 Aminosäuren beinhaltet;
(b) Reagieren dieses Substrats in einer pharmazeutisch annehmbaren wässrigen Pufferlösung, enthaltend einen Spender von Ionen der genannten Übergangsmetalle, so dass sich Komplexe dieser S, N und/oder O enthaltenden Aminosäure mit den genannten Übergangsmetallionen bilden, und,
(c) Reagieren dieses komplexierten Substrats in dieser Pufferlösung mit einem medizinisch nützlichen markierenden Metallion, wobei dieses markierende Ion einen höheren Bindungsgrad besitzt als das genannte Übergangsmetallion, so dass das an den MD gebundene Übergangsmetallion durch das genannte markierende Metallion ersetzt und in dieser Pufferlösung die genannte Zusammensetzung, enthaltend ein markiertes Peptid, gebildet wird,
vorausgesetzt, dass, wenn das genannte Substrat Disulfidbindungen enthält, diese zunächst durch Inkubation des Substrats mit einem Reduktionsmittel reduziert werden und überschüssiges Reduktionsmittel anschliessend entfernt wird.
[0035] Der Metallionen-Bindungsbereich (MD) beinhaltet vorzugsweise ein oder mehrere Aminosäuresequenzen, die Monosulfidgruppen ohne Disulfidbindungen enthalten, z. B. ausgewählt aus Cystein, Histidin, Penicillamin, deacyliertem Methionin, Lysin, Arginin, Aspartinsäure, Glutaminsäure und Tyrosin.
[0036] Der MD wird vorzugsweise ausgewählt aus
[Cys-(R&sub2;)-Cys]n
[Cys-(R&sub2;)-Pen]n
[His-(R&sub2;)-Cys]n
[His-(R&sub2;)-Pen]n
[His]n und
[His-(R&sub2;)-His]n
wobei n ein Wert von 1 bis 6 und R&sub2; eine Aminosäuresequenz mit 1 bis 20 Aminosäuren bedeuten.
[0037] Der biologische Funktionsbereich (BD) kann ausgewählt werden aus:
Phe-Trp-Lys-Thr,
N-formyl-Met-Leu-Phe,
Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (YIGSR) und
Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV)
[0038] Bevorzugte Peptidsequenzen sind unter anderem:
Arg-Lys-Gln-Ala-Ala-Ser-Ile-Lys-Val-Ala-Val, (RKQAASIKVAV)
Cys-Ser-Arg-Ala-Arg-Lys-Gln-Ala-Ala-Ser-Ile-Lys-Val-Ala-Val- Ser-Ala-Asp-Arg, (CSRARKQAASIKVAVSADR)
Cys-Asp-Pro-Gly-Tyr--Ile-Gly-Ser-Arg (CDPGYIGSR)
[0039] Das bevorzugte Übergangemetallion ist Zinn (Sn(II)). Der Spender dieser Zinnionen kann eine Verbindung beinhalten, die ausgewählt ist aus Zinntartrat, Zinnglukoheptonat, Zinnglukonat, Zinnphosphonat, Zinnchlorid und Zinnfluorid.
[0040] Das bevorzugte Markierungsmetallion ist Tc. In diesem Fall, oder im Allgemeinen, wenn das Übergangsmetallion Zinn ist, kann in Schritt (c) ein Reduktionsmittel zugegeben werden, um den Oxidationszustand des Markierungsmetallions zu reduzieren, das Pertechnetat sein kann.
[0041] Die genannte Pufferlösung kann Anionen von einer oder mehreren Dicarbonsäuren enthalten, die vorzugsweise ausgewählt werden aus Phtalat-, Tartrat- und Zitrationen. Wo das Übergangsmetallion Zinn ist, da beinhaltet die genannte Pufferlösung vorzugsweise Alkalimetalltartrat mit einem pH-Wert von 5 bis 6. Die bevorzugte Pufferlösung besteht im Wesentlichen aus einem Gemisch von 10 mM Tartrat und 40 mM Phthalat. Sie kann auch eine Aminosäure wie Glycin enthalten.
[0042] Das genannte Markierungsion wird vorzugsweise ausgewählt aus den Ionen von Fe, Co, Ni, Cu, Zn, As, Se, Mo, Tc, Ru, Pd, Ag, Cd, In, Re, Os, Ir, Pt, Au, Hg, TI, Pb, Bi, Po und At, insbesondere aus den radioaktiven Ionen Tc, Re, Cu, Ag und In.
[0043] Die Zusammensetzung wird vor Schritt (c) vorzugsweise in Dosierungsphiolen in lyophilisierter Form gelagert und während oder unmittelbar vor Schritt (c) rehydratisiert.
[0044] Gemäss einem zweiten Aspekt der Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, enthaltend ein markiertes Peptid wie oben definiert, geeignet für die Verabreichung an einen Patienten, wobei dieses Peptid einen biologischen Funktionsbereich (BD) und einen medizinisch nützlichen Markierungsmetallion-Bindungsbereich (MD) enthält, der wenigstens eine Schwefel, Stickstoff und/oder Sauerstoff enthaltende Aminosäure aufweist, die in der Lage ist, mit Ionen eines Übergangsmetalls ausgewählt aus Zn, Cu, Sn, Co und Ni zu komplexieren, und ein medizinisch nützliches markierendes Metallion, dadurch gekennzeichnet, dass
(a) der genannte MD nach einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert ist, und
(b) der genannte BD eine der folgenden Sequenzen umfasst:
Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (YIGSR) und
Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV)
(c) das genannte markierende Metallion direkt mit dem genannten Schwefel, Stickstoff und/oder Sauerstoff des MD verbunden ist.
[0045] Das Peptid enthält vorzugsweise eine oder mehrere Sequenzen, die ausgewählt sind aus:
Arg-Lys-Gln-Ala-Ala-Ser-Ile-Lys-Val-Ala-Val, (RKQAASIKVAV)
Cys-Ser-Arg-Ala-Arg-Lys-Gin-Ala-Ala-Ser-Ile-Lys-Val-Ala-Val- Ser-Ala-Asp-Arg, (CSRARKQAASIKVAVSADR) und
Cys-Asp-Pro-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (CDPGYIGSR)
[0046] Das markierende Metallion ist vorzugsweise wie oben definiert, und das Peptid liegt vorzugsweise in einer wässrigen Pufferlösung wie bereits definiert vor.
[0047] Gemäss einem anderen Aspekt stellt die Erfindung eine lyophilisierte oder gefrorene Dosierungseinheit bereit, enthaltend einen Zielwirkstoff, geeignet für die Verabreichung an einen Patienten und (nach Rehydratation) bereit für die direkte Markierung durch Zugabe von radioaktivem Pertechnetat oder Perhenat,
dadurch gekennzeichnet, dass dieser Wirkstoff ein Peptid wie oben definiert ist, umfassend einen biologischen Funktionsbereich (BD) und einen medizinisch nützlichen Markierungsmetallion- Bindungsbereich (MD), wobei
(a) der genannte MD wie oben definiert ist, und
(b) der genannte BD eine der folgenden Sequenzen enthält:
Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (YIGSR) und
Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV)
[0048] Das Peptid enthält vorzugsweise eine oder mehrere Sequenzen, die ausgewählt sind aus:
Arg-Lys-Gln-Ala-Ala--Ser-Ile-Lys-Val-Ala-Val, (RKQAASIKVAV)
Cys-Ser-Arg-Ala-Arg-Lys-Gln-Ala-Ala-Ser-Ile-Lys-Val-Ala-Val- Ser-Ala-Asp-Arg, (CSRARKQAASIKVAVSADR) und
Cys-Asp-Pro-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (CDPGYIGSR)
[0049] Das Peptid liegt vorzugsweise in einer wässrigen Pufferlösung wie oben definiert vor.
[0050] Gemäss einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine Zusammensetzung in dosierter Form bereitgestellt, enthaltend einen Zielwirkstoff, der geeignet ist für die Verabreichung an einen Patienten, bestehend aus rehydratisierten Inhalten einer Dosiseinheit wie oben definiert, die durch die Zugabe eines radioaktiven Markierungsmetallions markiert wurden.
[0051] Das Markierungsmetallion ist vorzugsweise radioaktives Pertechnetat.
[0052] Die Erfindung erstreckt sich auch auf die Verwendung eines Peptids wie oben definiert für die Herstellung einer Zusammensetzung die oben definiert, oder auf eine Dosierungseinheit wie oben definiert für die Verabreichung an einen Patienten für die diagnostische Abbildung der Lunge, wobei der genannte BD die folgende Sequenz umfasst:
Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV).
[0053] Das Peptid enthält vorzugsweise die folgende Sequenz:
Arg-Lys-Gln-Ala-Ala-Ser-Ile-Lys-Val-Ala-Val, (RKQAASIKVAV) oder
Cys-Ser-Arg-Ala-Arg-Lys-Gln-Ala-Ala-Ser-Ile-Lys-Val-Ala-Val- Ser-Ala-Asp-Arg, (CSRARKQAASIKVAVSADR)
[0054] Stärker bevorzugt wird es, wenn das Peptid im wesentlichen aus der folgenden Sequenz besteht:
Cys-Ser-Arg-Ala-Arg-Lys-Gln-Ala-Ala-Ser-Ile-Lys-Val-Ala-Val- Ser-Ala-Asp-Arg (CSRARKQAASIKVAVSADR)
einschliesslich Wiederholungen von IKVAV.
[0055] Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines Peptids wie oben definiert für die Herstellung einer Zusammensetzung wie oben definiert, oder einer Dosierungseinheit wie oben definiert für die Verabreichung an einen Patienten für die Feststellung von Stellen von Anhäufung von Blutplättchen oder von Karzinomen, wobei der genannte BD die folgende Sequenz enthält:
Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (YIGSR)
[0056] Das Peptid enthält vorzugsweise auch die folgende Sequenz: Asp-Pro-Gly.
[0057] Das bevorzugte Peptid besteht im Wesentlichen aus der folgenden Sequenz:
Cys-Asp-Pro-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (CDPGYIGSR)
einschliesslich Wiederholungen von YIGSR.
[0058] Die Erfindung erstreckt sich auch auf die Verwendung eines Peptids wie oben definiert, enthaltend Thiolatgruppen, die über das Schwefelatom der Thiolatgruppen komplexiert sind mit Ionen eines Übergangsmetalls ausgewählt aus Zn, Cu, Sn, Co und Ni für eine direkte Markierung durch Umsetzung des komplexierten Peptids in einen pharmazeutisch annehmbaren Puffer mit einem medizinisch nützlichen Markierungsmetallion, das einen höheren Bindungsgrad besitzt als das genannte Übergangsmetallion, so dass das genannte Übergangsmetallion durch das genannte markierende Metallion ersetzt wird und eine Zusammensetzung entsteht, welche ein markiertes Peptid in der genannten Pufferlösung enthält. Die genannten Übergangsmetallionen sind vorzugsweise Zinnionen.
[0059] Nachfolgend werden bevorzugte Formen der Erfindung beschrieben.
[0060] Mit den erfindungsgemässen Verfahren können Peptide, die Metallionenbindungssequenzen enthalten, direkt mit Metallionen gekoppelt werden, so dass Substanzen entstehen, die für diagnostische und therapeutische In-vivo-Anwendungen nützlich sind. Peptide können für sich alleine, in Kombination mit anderen Peptiden oder chemisch mit einem Wirtsmolekül konjugiert verwendet werden. Die Peptide können in einem Format bereitgestellt werden, das ein Markierungskit ergibt, das wiederum zur Herstellung eines Metallionen-Peptidkomplexes für die In-vivo-Verwendung eingesetzt werden kann. Die Peptide der vorliegenden Erfindung enthalten:
a) biologische Funktionsbereiche, und
b) Metallionen-Bindungsbereiche, die mit medizinisch nützlichen Metallionen komplexieren können.
[0061] Der biologische Funktionsbereich des Peptids ist eine Sequenz aus einer oder mehreren Aminosäuren, die sich an einen biologischen Rezeptor binden, der in Zellen, Geweben, Organen oder Flüssigkeiten anzutreffen ist. Die Peptide können ein Signal zu den Zellen, Geweben oder anderen Materialien in Verbindung mit dem biologischen Rezeptor nach dem Binden senden oder auch nicht. Der biologische Funktionsbereich enthält eine Sequenz aus einer oder mehreren Aminosäuren, die sich an einen biologischen Rezeptor binden, der in anderen Peptiden, Enzymen, Antikörpern oder ähnlichen proteinhaltigen Zusammensetzungen anzutreffen ist, die selbst eine Bindung an einen anderen biologischen Rezeptor aufweisen.
[0062] Der biologische Funktionsbereich kann sich in R&sub1;, R&sub2; und/oder R&sub3; befinden, einschliesslich in Situationen, in denen der biologische Funktionsbereich alle oder einen Teil von zwei oder mehr Resten R&sub1;, R&sub2; oder R&sub3; umfasst. Es ist nicht notwendig, dass der biologische Funktionsbereich die gesamte Aminosäurensequenz von R&sub1;, R&sub2; und/oder R&sub3; bildet; d. h. es ist möglich und denkbar, dass der biologische Funktionsbereich eine Aminosäurensequenz ist, die einen Abschnitt der gesamten Aminosäurensequenz von R&sub1;, R&sub2; und/oder R&sub3; bildet, wobei der Fest dieser Region eine Aminosäurensequenz ist, die nicht der biologische Funktionsbereich ist.
[0063] Der Metallionen-Bindungsbereich des Peptids ist eine Sequenz von einer oder mehreren Aminosäuren, die Schwefel, Stickstoff oder Sauerstoff enthalten, und die mit Metallionen komplexieren kann. Schwefelhaltige Aminosäuren sind vornehmlich Cystein (Cys), Cystin (Cys-Cys) und Penicillamin (Pen), obwohl auch deacyliertes Methionin (Met) verwendet werden kann. Stickstoffhaltige Aminosäuren beinhalten vornehmlich Histidin (His), aber unter bestimmten Umständen auch Lysin (Lys) und Arginin (Arg), die pK&sub3;-Werte von 10,0 und 12,0 haben. Darüber hinaus kann auch die terminale Aminogruppe von Peptiden eingesetzt werden. Sauerstoffhaltige Aminosäuren sind unter anderem Asparaginsäure (Asp) Glutaminsäure (Glu) und Tyrosin (Tyr) sowie die terminale Carbongruppe von Peptiden. Die am nützlichsten einzusetzenden Aminosäuresequenzen sind ein oder mehrere Cys, ein oder mehrere His oder eine Kombination aus Cys und His. Pen, das ein Analog von Cys ist, kann unmittelbar für ein beliebiges Cys substituiert werden. Cys kann im Peptid als Disulfid in der Form von Cystin vorliegen. Die Metallionen-Bindungsbereiche können einmal oder mehrere Male in einem bestimmten Peptid und in jeder beliebigen Kombination auftreten. Der Metallionen-Bindungsbereich und der biologische Funktionsbereich können überlappen.
[0064] Die in den erfindungsgemässen Peptiden anzutreffenden Metallbindungssequenzen werden durch Zugabe eines positiv geladenen Übergangsmetallions von Zn, Cu, Sn, Co oder Ni stabilisiert, das so gewählt wird, dass es eine geringere Bindefestigkeit besitzt. Durch eine Austauschreaktion ersetzt das Übergangsmetallion das H-Ion der Thiolat-, Imidazol- oder Carbongruppe. Die zweiwertigen Zink- und Zinnionen gelten als besonders attraktiv. Die Übergangsmetalle verbinden sich schwach mit dem Peptid.
[0065] Es gibt zwei primäre Peptidkonfigurationen, die geringfügig andere verfahren erfordern, um eine stabile Markierung mit einem Metallion zu erreichen. Eine Peptidkonfiguration beinhaltet einen Metallionen-Bindungsbereich, der eine oder mehrere Disulfidbindungen enthält. Das üblichste Beispiel hierfür lautet:
wobei [Cys-(R&sub2;)-Czs]n der medizinisch nützliche Metallionen- Bindungsbereich ist, der in der Aminosäurensequenz 1 bis etwa 6 mal auftreten kann; und R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; jeweils Aminosäurensequenzen mit 0 bis etwa 20 Aminosäuren sind, wobei wenigstens eine der Aminosäurensequenzen R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; den biologischen
Funktionsbereich enthält. Ein Beispiel für ein Peptidfragment, das diese Kriterium erfüllt, ist:
wobei der biologische Funktionsbereich R&sub2;, nämlich die Sequenz Phe- Trp-Lys-Thr ist; der Metallionen-Bindungsbereich ist [Cys-(R&sub2;)- Cys]n, wobei n 1 ist, nämlich die Sequenz Cys-Phe-Trp-Lys-Thr-Cys; R&sub1; ist die Sequenz ...-Phe; und R&sub3; ist die Sequenz Thr-... Dieses Verfahren beinhaltet auch andere Peptidkonfigurationen, bei denen reduzierbare Disulfidbindungen vorliegen. Dazu gehören die Substitution von Pen für eine oder beide Cys-Aminosäuren, sowie die Modifikation eines nativen Met, um die Bildung einer Disulfidbindung zuzulassen. Der biologische Funktionsbereich kann in R&sub1;, R&sub2; und/oder R&sub3; auftreten und kann auch mehr als eine Region umspannen, so dass der Biologische Funktionsbereich beispielsweise R&sub2; und R&sub3; oder einen Teil von R&sub2; und R&sub3; bilden kann. Eine oder mehrere der Regionen R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; enthalten möglicherweise keine Aminosäuren. Beispiele für Peptide, die Disulfidbindungen enthalten, sind beispielsweise Somatostatin und seine Analoge.
[0066] In denjenigen Peptiden, in denen der Metallionen- Bindungsbereich eine oder mehrere Disulfidbindungen beinhaltet, muss/müssen zunächst die Disulfidbindung(en) reduziert werden.
[0067] Es wurden zahlreiche Reduktionsmittel beschrieben und sind der Fachwelt bekannt. Besonders nützliche Reduktionsmitteltypen sind unter anderem: 2-Mercaptoethanol; 1,4- Dithiothreitol; 2,3-Dihydroxibutan-1,4-dithiol; 2-Aminoethanthiol HCl; 2-Mercaptoethylamin; Thioglycolat; Cyanid; Cystein; reduziertes Glutathion; Sn(II); Cu(I) und Ti(II). Das Reduktionsmittel kann in einem Losungsmittel aufgelöst oder an eine feste Phase gebunden werden. An eine feste Phase gebundene Reduktionsmittel sind im Handel erhältlich, und Verfahren für ihre Anwendung sind in der Fachwelt bekannt. Das Ausmass, in dem das Peptid eine Disulfidbindungsreduktion erfordert, ist abhängig von der Natur des Peptids und seiner beabsichtigten medizinischen Anwendung. In jedem Fall wird die Reduktion unterbrochen, bevor es zu einer zu starken Fragmentierung des Peptids oder zu einem Verlust der biologischen. Funktion des Peptids kommt.
[0068] In einer speziellen Ausgestaltung wird Sn(II) als Reduktionsmittel mit einer Konzentration von 5 mM verwendet. In dieser Ausgestaltung wird das Sn(II) in einem Puffer aufgelöst, der sich aus etwa 10 mM Tartrat und 40 mM Phthalat, pH 5,5, zusammensetzt, und der Sn(II) Puffer wird einem Peptidsubstrat in einer Konzentration von 8,3 mg/ml zugegeben. Die Reduktionsreaktion wird bei Raumtemperatur eine bestimmte Zeit lang fortschreiten gelassen, wobei dieser Zeitraum bei einigen Peptiden mit drei Stunden erfolgreich war, die eine einzelne Disulfidbindung enthielten. Danach wird die Reaktion abgebrochen, indem überschüssige Sn(II)-Ionen durch Molekularsiebchromatografie entfernt wurden. Bei einer Art der Molekularsiebchromatografie wird Sephadex G-25 eingesetzt, mit prä-equilibriertem Chromatograriegel, und das Peptid wird in 0,9% NaCl oder einem anderen geeigneten Puffer eluiert.
[0069] Die Beseitigung des Reduktionsmittels, sei es Sn(II) oder ein anderes Reduktionsmittel, kann mit einer Reihe verschiedener geeigneter Mittel erfolgen, z. B. mit Verfahren wie Dialyse, Ultrafiltration, Positivdruck-Membranfiltration, Ausfällung, präparative Hochleistungs-Flüssigkeitschromatografie, Affinitätschromatografie, andere Formen der Chromatografie und eine präparative isoelektrische Fokussierung. Viele der Reduktionsmittel enthalten Thiole, die, wenn sie im endgültigen Markierungsgemisch vorhanden sind, mit dem medizinisch nützlichen Metallion komplexieren können. Solche Komplexe können ernsthafte und unbekannte Nebeneffekte haben, wenn sie in vivo verabreicht werden. Darüber hinaus haben einige Reduktionsmittel eine unannehmbare Toxizität. Somit begrenzt die Beseitigung des Reduktionsmittels das Ausmass der Reduktion auf das gewünschte, und ergibt eine erhöhte Nützlichkeit und Sicherheit des markierten Präparats durch Beseitigung der toxischen oder auf andere Weise unerwünschten Reduktionsmittel.
[0070] Thiolatgruppen in reduzierten Peptiden sind äusserst reaktiv und können gemeinsam neue Disulfidbindungen bilden. Man ist der Ansicht, dass durch den Einsatz von Sn(II) die Neubildung von Disulfidbindungen minimiert werden kann. Sn(II)-Spender sind u. a. Zinntartrat, Zinnglukoheptonat, Zinnglukonat, Zinnphosphonat, Zinnchlorid und Zinnfluorid. Die Wahl des Sn(II)-Spenders und seiner Endkonzentration ist abhängig von der beabsichtigten medizinischen Anwendung des Peptids, der Natur des Peptids, der relativen und der absoluten Zahl von Thiolatgruppen sowie dem zu verwendenden Metallion. In einer Ausgestaltung wird Zinntartrat in einer Konzentration von 1,25 mM verwendet. Das Zinntartrat wird dem Peptid nach der Beseitigung des Peptid-reduzierenden Mittels zugegeben. Das Zinntartrat wird in einem Puffer hergestellt, der sich aus 10 mM Tartrat und 40 mM Phthalat, pH 5,6, zusammensetzt, und wird dem Peptid bis zu einer Endkonzentration von 1 mg/ml Peptidlösung zugegeben.
[0071] Sn(II) kann mit Hilfe von Dicarbonsäuren wie Phthalat und Tartrat stabilisiert werden. Ebenso kann eine grosse Palette von Dicarbonsäuren, die der Fachwelt bekannt sind, verwendet werden, um das Sn(II) zu stabilisieren und/oder als Puffer zu dienen. Wenn Phthalat und Tartrat in einem Molarüberschuss relativ zum Sn(II) vorliegen, dann stabilisieren diese Dicarbonsäuren auch das medizinisch nützliche Metallion in einer Form, in der es mit dem Peptid reagieren kann. In einer Ausgestaltung werden Tartrat und Phthalat im Sn(II)-Mittel in Konzentrationen von jeweils 10 mM bzw. 40 mM eingesetzt.
[0072] Ebenso können das Sn(II) und das medizinisch nützliche Metallion mit freien Aminosäuren stabilisiert werden, die einzeln oder in Kombination mit anderen Mitteln eingesetzt werden. Der verwendete Aminosäurentyp und die spezifische Konzentration sind abhängig von der Natur des Peptids und seiner beabsichtigten Verwendung. In einer Ausgestaltung wird Glycin in einer Konzentration von 0,1 bis 10 mM verwendet, und in einer anderen Histidin in einer Konzentration von 0,1 bis 10 mM.
[0073] Das Peptid kann nach der Disulfidbindungsreduktion und der Beseitigung von überschüssigem Reduktionsmittel gefroren in grossen Mengen gelagert werden. Alternativ kann (wie nachfolgend in Verbindung mit dem anderen Verfahren beschrieben wird, das keine Reduktion von Disulfidbindungen beinhaltet) das Peptid grossvolumig oder in Dosiseinheiten nach Zugabe des Sn(II) gelagert werden.
[0074] Die andere Peptidkonfiguration beinhaltet eine oder mehrere Aminosäuren, die Schwefel, Stickstoff oder Sauerstoff enthält/enthalten, das für eine Bindung verfügbar ist oder für eine Bindung an Metallionen verfügbar gemacht werden kann. Häufig eingesetzte Aminosäuren sind u. a. Cys, Pen und His oder eine beliebige Kombination davon. Diese Peptidkonfiguration beinhaltet keine Anfangsreduktion von Disulfidbindungen (wobei Schwefel als Monosulfid vorliegt). Der einfachste Fall hat die folgende Form:
(R&sub1;)-[Cys]n(R&sub2;)
wobei [Cys]n der medizinisch nützliche Metallionen-Bindungsbereich und n typischerweise eine Zahl zwischen 1 und etwa 6 ist; R&sub1; und R&sub2; sind jeweils eine Aminosäurensequenz mit 0 bis etwa 20 Aminosäuren, wobei wenigstens R&sub1; und R&sub2; den biologischen Funktionsbereich beinhalten. In dieser und allen verwandten Formen ist zu bemerken, dass R&sub1; und R&sub2; untereinander austauschbar sind; beide können den biologischen Funktionsbereich enthalten, der biologische Funktionsbereich kann R&sub1; und R&sub2; ganz oder teilweise beinhalten, und der biologische Funktionsbereich kann nur einen Teil der Aminosäurensequenz in R&sub1; oder R&sub2; ausmachen. Die Reihenfolge der Komponenten für diese Zwecke kann variiert werden, so dass (R&sub1;)-[Cys]n-(R&sub2;), (R&sub2;)-[Cys]n-(R&sub1;), [CYs]n-(R&sub2;)-(R&sub1;), [Cys]n- (R&sub1;)-(R&sub2;) und die Spiegelbilder dieser letzten beiden Reihenfolgen äquivalent sind, auch wenn sich die resultierenden Peptide in anderen Aspekten möglicherweise erheblich unterscheiden. Ein repräsentatives Beispiel dieser Form ist die folgende Sequenz:
Cys-Asp-Pro-Gly-Try-Ile-Gly-Ser-Arg
wobei Cys [Cys]n ist, wobei n 1 ist, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg ist der biologische Funktionsbereich (R&sub1;), und Asp-Pro-Gly ist (R&sub2;), so dass die Struktur der Sequenz [Cys]n-(R&sub2;)-(R&sub1;) ist.
[0075] Andere Formen derselben allgemeinen Konfiguration können folgendes beinhalten:
(R&sub1;)-[Cys-(R&sub2;)-Cys]n- (R&sub3;)
(R&sub1;)-[Cys-(R&sub2;)-Pen]n-(R&sub3;)
(R&sub1;)-[His-(R&sub2;)-Cys]n-(R&sub3;)
(R&sub1;)-[His-(R&sub2;)-Pen]n-(R&sub3;)
und (R&sub1;)-[His-(R&sub2;)-His]n-(R&sub3;)
wobei die Sequenz [...]n, der medizinisch nützliche Metallionen- Bindungsbereich ist, wobei n typischerweise eine Zahl zwischen 1 und etwa 6 ist; und R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; jeweils eine Aminosäurensequenz mit 0 bis etwa 20 Aminosäuren sind, wobei R&sub1;, R&sub2; und/oder R&sub3; den biologischen Funktionsbereich beinhalten. Auch hier ist die Reihenfolge für die Funktionsbeschreibung irrelevant; so sind z. B. Spiegelbilder der obigen beiden Reihenfolgen, alle Reihenfolgen, in denen die Positionen von His und Cys umgekehrt sind, und Reihenfolgen, in denen der biologische Funktionsbereich in einer der drei Regionen R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; vorhanden ist, jeder Teil der drei Regionen R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; oder eine beliebige Kombination der drei Regionen R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; alle mit der oben aufgeführten dritten Konfiguration (R&sub1;)-[His-(R&sub2;)-Cys]n-(R&sub3;) äquivalent. Jede der anderen oben genannten Konfigurationen kann ebenso beschrieben werden.
[0076] Die positiv geladenen Übergangsmetallionen werden in das Peptid in einer wässrigen Lösung eingeführt, die einen geeigneten Puffer enthält. Der Puffer kann aus Dicarbonsäuren (Tarträt, Phthalat, Citrat), Aminosäuren (Glycin), Borat oder dergleichen bestehen. Für eine Radiomarkierung unter azidischen Bedingungen werden typischerweise 10 mM Tartrat und 40 mM Phthalat, pH 5,6, verwendet. Für eine Radiomarkierung unter basischen Bedingungen wird typischerweise 10 mM Glycin, pH 9,0, verwendet. Der Puffer kann auch eine Reihe von Bindemitteln und/oder Stabilisatoren einschliesslich NaCl, Inositol, Glukoheptonat oder dergleichen enthalten.
[0077] Die Peptide werden nachfolgend mit einem medizinisch nützlichen Metallion inkubiert. Das medizinisch nützliche Metallion wird so ausgewählt, dass es eine stärkere Bindung hat als das positiv geladene Übergangsmetallion, um die Metallbindungssequenzen zu stabilisieren. Es kann eine Reihe von medizinisch nützlichen Metallionen zum Einsatz kommen; Radiometallen sind u. a. Isotope der Elemente Tc, Re, Au, Ag, Pd, As, Cu, Hg und Ru. Radioisotope von Tc sind von besonderem Interesse, und insbesondere 99mTc. Im Falle von 99mTc werden die Peptide mit Natriumpertechnetat umgesetzt, das mit einem Reduktionsmittel behandelt wurde, um Tc mit einem geringeren Oxidationszustand zu erzeugen. Das Reaktionsprodukt zwischen dem Metallion und dem Peptid ist ein Komplex aus dem Metallion und dem Peptid. So könnten beispielsweise die folgenden Strukturen aus der Anwendung der Erfindung mit einer Tc-Markierung von Peptiden
hervorgehen, die Metallionen-Bindungsbereiche bestehend aus Cys- und His-Gruppen als Beispiel enthalten:
wobei R eine Aminosäurensequenz mit 0 bis etwa 20 Aminosäuren und Xn ein Anion wie z. B. ein Halogen wie Fluorid oder Chlorid oder ein Lösungsmittelmolekül wie Wasser ist.
[0078] Die resultierende Tc-Peptidbindung sollte eine ausreichend hohe Bindungsfestigkeit besitzen, um den Austausch des Radionuclids mit Transferrin und Serumalbumin minimal zu halten. Der Komplex sollte unter physiologischen Bedingungen thermodynamisch stabil sein und akzeptable toxikologische Eigenschaften aufweisen.
[0079] Die meisten Zinnreduktionen erfolgen mit einem pH-Wert zwischen etwa 5 und etwa 6. Mit Aminosäurenseitenketten in einer Lösung von pH 5,6 sind die basischen Aminosäuren positiv geladen, die azidischen Aminosäuren sind stark negativ geladen, die alkoholischen Aminosäuren sind neutral, und Methionin ist neutral.
Da sich reduziertes Technetium Teichter an neutrale Wasserstoffspender bindet als an positiv geladene Wasserstoffspender, sind bei einem pH-Bereich von 5 bis 6 nur Cys und His optimale 99mTC-Bindungsortkandidaten. Für Cys und His sind die Radiomarkierungserträge vom pH-Wert abhängig und liegen theoretisch optimal bei oder nahe pKa.
[0080] Das bevorzugte Übergangsmetall ist Sn(II); nützliche Sn(II)-Spender sind u. a. Zinntartrat, Zinnglukoheptonat, Zinnglukonat, Zinnphosphonat, Zinnchlorid und Zinnfluorid. Die Wahl des Sn(II)-Spenders und seiner Endkonzentration ist abhängig von der beabsichtigten medizinischen Anwendung des Peptids, der Natur des Peptids, der relativen und absoluten Zahl von Thiolatgruppen sowie dem verwendeten Metallion. In einer Ausgestaltung wird Zinntartrat mit einer Konzentration von 1,25 mM eingesetzt. Das Zinntartrat wird in einem Puffer aus 10 mM Tartrat und 40 mM Phthalat, pH 5,6, hergestellt und dem Peptid bis zu einer Endkonzentration von 1 mg/ml Peptidlösung zugegeben.
[0081] Wie dies bei dem Verfahren unter Anwendung einer Reduktion von Disulfidbindungen der Fall ist, kann Sn(II) mit Hilfe von Dicarbonsäuren wie z. B. Phthalat und Tartrat stabilisiert werden. Ebenso kann eine breite Palette von Dicarbonsäuren, die der Fachwelt bekannt sind, verwendet werden, um das Sn(II) zu stabilisieren und/oder als Puffer zu dienen. Wenn Phthalat und Tartrat in einem molaren Überschuss relativ zum Sn(II) vorliegen, dann stabilisieren diese Dicarbonsäuren auch das medizinisch nützliche Metallion in einer Form, die mit dem Peptid reagieren kann. In einer Ausgestaltung werden Tartrat und Phthalat in dem Sn(II)-Mittel bei Konzentrationen von jeweils 10 mM bzw. 40 mM eingesetzt.
[0082] Ebenso können Sn(II) und das medizinisch nützliche Metallion durch freie Aminosäuren stabilisiert werden, die einzeln oder in Kombination mit anderen Mitteln verwendet werden. Der verwendete Aminosäurentyp und die spezielle Konzentration sind von der Natur des Peptids und seiner beabsichtigten Verwendung abhängig. In einer Ausgestaltung wird Glycin mit einer Konzentration von 0,1-10 mM verwendet, in einer anderen Ausgestaltung Histidin mit einer Konzentration von 0,1-10 mM.
[0083] Das Peptid kann grossvolumig oder in Dosiseinheiten nach Zugabe des Sn(II) oder eines anderen Übergangsmetalls gelagert werden. So wird beispielsweise das Peptid in einer Ausgestaltung nach der Zugabe des Sn(II) bei -20ºC in Phiolen gelagert. Für die Lyophilisierung von Peptiden angewendete Verfahren sind der Fachwelt bekannt. Es können gefrorene oder lyophilisierte Präparate für einen unbeschränkten Zeitraum gelagert werden, bevor sie durch Zugabe des medizinisch nützlichen Metallions markiert werden.
[0084] In der gefrorenen und der lyophilisierten Lagerform können dem Peptid Bindemittel zugegeben werden, um Schäden minimal zu halten, die aus der Bildung von Eiskristallen oder freien Radikalen entstehen können. Der Bindemitteltyp und die Konzentration sind abhängig von der Natur des Peptids und der beabsichtigten Verwendung. In einer Ausgestaltung werden Glycin und Inositol als Bindemittel in lyophilisierten Präparaten verwendet.
[0085] Ein typisches lyophilisiertes Präparat, das gemäss den oben beschriebenen Ausgestaltungen hergestellt wurde, wurde nach der Rehydratation 10 mM Tartrat, 40 mM Phthalat, 22 g Sn(II), 500 g Peptid, 2 mg/ml Glycin und 2 mg/ml Inositol enthalten. Zum Markieren mit einem medizinisch nützlichen Metallion wird ein typisches lyophilisiertes Präparat durch Zugabe einer Lösung hydratisiert, die 0,9% NaCl (U. S. P.) oder Wasser für die Injektion (U. S. P-) und das medizinisch nützliche Metallion enthält.
[0086] Alternativ ist es möglich, das lyophilisierte Präparat zu hydratisieren und das Metallion in einem nachfolgenden Schritt zuzugeben. Wird ein gefrorenes Präparat verwendet, dann wird es aufgetaut und bis auf Raumtemperatur erwärmen gelassen, danach wird eine das medizinisch nützliche Metallion enthaltende Lösung zugegeben. Natur und Menge des medizinisch nützlichen Metallions sowie die spezifischen Reaktionsbedingungen sind abhängig von der isotopen Natur des Metalls sowie der beabsichtigten medizinischen Verwendung. In einer Ausgestaltung wird 99mTc in der Form eines Pertechnetationes in einer Lösung von 0,9% NaCl zugegeben. Das 99mTc wird typischerweise bis zu 30 Minuten lang inkubiert, um zu gewährleisten, dass die Reaktion mit dem Peptid beendet ist, danach kann das radiomarkierte Präparat direkt medizinisch angewendet werden. In einer anderen Ausgestaltung wird &sup6;&sup7;Cu einer Lösung aus 10 mM Tartrat und 40 mM Phthalat bei pH 5,6 zugegeben. In noch einer weiteren Ausgestaltung wird ¹&sup8;&sup8;Re oder ¹&sup8;&sup6;Re einer Lösung aus 10 mM Tartrat und 40 mM Phthalat, pH 5,6, und mit Sn(II) zugegeben und dann erhitzt, um den Oxidationszustand von Re zu verringern. Die resultierende Lösung wird dann dem lyophilisierten bzw. gefrorenen Präparat zugegeben.
[0087] In der Ausgestaltung, in der 99mTc verwendet wird, liegt das Sn(II) in der peptidhaltigen Lösung in ausreichendem Überschuss vor, um den Oxidationszustand des Tc-Ions zu ändern, so dass es sich an ionisierbare Gruppen binden kann. Ähnliche Ansätze können verwendet werden, um den Oxidationszustand anderer medizinisch nützlicher Metallionen für eine nachfolgende Bindung an ionisierbare Gruppen zu senken. Der Typ des Metallions, seine isotope Natur sowie die Konzentration würden von der beabsichtigten medizinischen Anwendung abhängen.
[0088] Die Metallionenpeptide der vorliegenden Erfindung können direkt für die Verabreichung verwendet werden, oder sie können alternativ mit einem Träger oder einem Zielmolekül konjugiert werden. Die Verfahren zum Konjugieren von Peptiden mit Trägermolekülen sind in der Fachwelt bekannt. Die Konjugationen können kovalente Bindungen durch Kohlehydratreste, Sulfhydrylreste, Aminogruppen (einschliesslich solcher für Lysin) und Carboxylgruppen beinhalten.
[0089] Die erfindungsgemässen Peptide können:
a) natürlich vorkommen,
b) durch chemische Synthese hergestellt werden,
c) durch rekombinante DNA-Technologie hergestellt werden,
d) durch biochemische oder enzymatische Fragmentierung grösserer Moleküle hergestellt werden,
e) durch Verfahren hergestellt werden, die aus einer Kombination von a-d hervorgehen, oder
f) mit einem beliebigen anderen Mittel zur Herstellung von Peptiden hergestellt werden.
[0090] Das erfindungsgemässe Peptid wird mit einem medizinisch nützlichen Metallion reagiert. Das medizinisch nützliche Metallion kann radioaktiv sein und Gammastrahlen, Betapartikel oder Positronen erzeugen, die nach einer Kollision mit Elektronen in Gammastrahlen umgewandelt werden. Alternativ kann das medizinisch nützliche Metallion paramagnetisch sein. Das medizinisch nützliche Metallion kann in diagnostischen Abbildungsverfahren wie Gammaszintigrafie, spezifische Photonenemissions- Computertomografie oder Positronenemissionstomografie verwendet werden. Das medizinisch nützliche Metallion kann auch diagnostisch in der Magnetresonanzabbildung eingesetzt werden. Medizinisch nützliche Metallionen können auch therapeutisch verwendet werden.
[0091] Der Typ des medizinisch nützlichen Metallions ist abhängig von der jeweiligen medizinischen Anwendung. Besonders nützliche Metallionen befinden sich in der Gruppe bestehend aus Elementen 26-30 (Fe, Co, Ni, Cu, Zn), 33-34 (As, Se), 42-50 (Mo, Tc, Ru, Rh, Pd, Ag, Cd, In, Sn) und 75-85 (Re, Os, Ir, Pt, Au, Hg, TI, Pb Bi, Po, At). Isotope der Elemente Tc, Re und Cu sind besonders für den Einsatz in der diagnostischen Abbildung und der Radiotherapie geeignet. Das Isotop 99mTc ist besonders für den Einsatz in der diagnostischen Abbildung geeignet. Andere Radionuclide mit diagnostischen oder therapeutischen Anwendungen sind unter anderem &sup6;²Cu, &sup6;&sup4;Cu, &sup6;&sup7;Cu, &sup9;&sup7;Ru, ¹&sup0;&sup5;Rh, ¹&sup0;&sup9;Pd, ¹&sup8;&sup6;Rh, ¹&sup0;&sup9;Pd, ¹&sup8;&sup6;Re, ¹&sup8;&sup8;Re, ¹&sup9;&sup8;Au, ¹&sup9;&sup9;Au, ²&sup0;³Pb, ²¹¹Pb und ²¹²Bi.
[0092] Das aus den oben dargelegten Verfahren hervorgehende Produkt kann für medizinische und veterinäre Anwendungen eingesetzt werden. Das Produkt wird typischerweise beim Menschen verwendet, kann aber auch in anderen Säugetieren zum Einsatz kommen. Die Hauptanwendungen der Erfindung sind unter anderem menschliche Patienten, aber die Erfindung kann ebenso auf Labor-, Stall-, Zoo-, Wild-, Haus- oder Sporttiere angewendet werden.
[0093] Das Produkt kann zur Überwachung normaler oder anomaler metabolischer Ereignisse verwendet werden, um normale oder anomale Gewebe zu lokalisieren, um Erkrankungen zu lokalisieren und für eine Bindung an Blutbestandteile, einschliesslich Blutzellen wie Lymphozyten, für eine nachfolgende Lokalisierung von Erkrankungen, Infektionen und anomalen Geweben. Anwendung und medizinischer Zweck des Produktes sind abhängig vom Peptidtyp sowie von dem verwendeten Typ des medizinisch nützlichen Metallions.
[0094] Mit Hilfe dieser erfindungsgemässen Verfahren können Peptide mit einem biologischen Funktionsbereich, die wenigstens die Sequenz IKVAV und Eine verbundene Radiomarkierung aufweisen, Materialen hergestellt werden, die für diagnostische In-vivo- Anwendungen nützlich sind, insbesondere für die diagnostische Abbildung der Lungen. Das Peptid umfasst vorzugsweise einen biologischen Funktionsbereich von wenigstens der Sequenz IKVAV und einen Metallionen-Bindungsbereich, umfassend Metallionen- Bindungssequenzen, die direkt mit Metallionen verbunden werden können. Die Peptide können in einem Format hergestellt werden, das ein Markierungskit bereitstellt, das wiederum zur Herstellung eines Metallionen-Peptidkomplexes für die In-vivo-Verwendung benutzt werden kann. Es kann auch eine Markierung eines Peptids mit dem biologischen Funktionsbereich mit einem Metallion in vivo bereitgestellt werden, beispielsweise durch die Verwendung eines Peptid-Avidin-Komplexes, der in vivo injiziert wird, gefolgt von einem Biotin-Metallionen-Komplex, der in vivo injiziert wird, was zur Bildung eines in vivo Peptid-Avidin-Biotin- Metallionenkomplexes führt.
[0095] Die IKVAV-haltigen Peptide der vorliegenden Erfindung enthalten vorzugsweise folgendes:
a) biologische Funktionsbereiche, die wenigstens die Sequenz IKVAV umfassen, und
b) Metallionen-Bindungsbereiche, die mit medizinisch nützlichen Metallionen komplexieren können.
[0096] Der biologische Funktionsbereich des IKVAV-haltigen Peptids ist eine Sequenz der Aminosäuren Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV-Einzelaminosäurecode), und fakultativ von Aminosäuren zusätzlich zu IKVAV, die für die Lungenabbildung und -behandlung nützlich sind. Das IKVAV-Peptid der vorliegenden Erfindung beinhaltet grösstenteils die Sequenz RKQAASIKVAV, am meisten bevorzugt wird die Sequenz CSPARKQAASIKVAVSADR. Häufig gibt es innerhalb der angezeigten Sequenzen Mutationen wie Deletionen, Insertionen oder Substitutionen. Es ist möglich, dass die Sequenz IKVAV ein oder mehrere Male wiederholt wird, um die Lokalisierung zu verbessern. Substitutionen werden grösstenteils vorsichtig erfolgen, wobei Aminosäuren mit im Wesentlichen derselben Konformation und Polarität verwendet werden. Die Peptide können L- Aminosäuren verwenden, oder eine oder mehrere der Aminosäuren können durch D-Aminosäuren (D-Stereoisomer) substituiert werden, die teilweise die Widerstandsfähigkeit gegenüber Proteaseabbau erhöhen können. Insbesondere können ein oder mehrere Alanine substituiert werden. Alternativ können terminale Aminosäuren mit unnatürlicher Chiralität eingesetzt werden. Das Peptid kann auch ein terminales Amid oder eine terminale acylierte Aminosäure beinhalten, besonders acetylierte oder alkylierte, insbesondere methylierte, Aminosäuren. Wo ein Cystein den Metallionen- Bindungsbereich am N-Terminus bereitstellt, da kann das Cystein alkyliert oder auf der Mercaptangruppe unsubstituiert sein.
[0097] Es besteht die Hypothese, dass die Lungenlokalisierung mit dem IKVAV-haltigen Peptid auf dem Rezeptor basiert und teilweise auf eine Lungenendothelzellenbindung und in einigen Fällen auf eine Tumorrezeptorbindung zurückzuführen ist. Es gibt Anzeichen, die den Schluss nahelegen, dass sich das IKVAV-haltige Peptid mit Rezeptoren auf einem Gewebeplasminogenaktivator bindet, der häufig in relativ hohen Konzentration in Tumorzellen vorliegt. Unabhängig vom genauen Mechanismus der auf dem Rezeptor basierenden Lungenlokalisierung bietet ein solcher Mechanismus erhebliche Vorteile für ein 99mTc-Peptid, das die IKVAV-Sequenz über 99mTc-MAA enthält:
a) das Peptid darf an sich die Lungenperfusion nicht ändern,
b) das Peptid soll sich an Prä-kapillar-, Kapillar- und Post- Kapillar-Endothelzellen binden und somit eine repräsentativere Ansicht der tatsächlichen Physiologie der Lungenvaskulator bieten,
c) die Verwendung eines synthetischen Peptids für die Abbildung würde Überlegungen in Bezug auf eine virale (HIV oder dergleichen) Kontamination des Spendermaterials umgehen,
d) die Verwendung eines nicht-partikulären Abbildungsmittels soll gesundheitliche Risiken in hypersensitiven Patientenbevölkerungen minimieren, wie z. B. bei der pädiatrischen Verwendung;
e) eine andere Diagnostik bestimmter Konditionen ist möglich, da chronische obstruktive Bedingungen wie z. B. ein Emphysem als photonenarm und bestimmte Tumore als photonenreich erkannt werden.
[0098] Das IKVAV-haltige Peptidprodukt kann zur Überwachung oder Behandlung normaler oder anomaler Gewebe und metabolischer Ereignisse verwendet werden, insbesondere bei chronischen obstruktiven Lungenerkrankungen wie z. B. Emphysem oder Fibrose, bei denen anomale Gewebe oder metabolische Ereignisse einen photonenarmen Bereich erzeugen, und um primäre oder metastatische Krebstumore zu lokalisieren, und insbesondere Krebstumore der Lunge, wobei Krebstumore im Allgemeinen einen photonenreichen Bereich erzeugen.
[0099] Mit den Verfahren der vorliegenden Erfindung werden mit Peptiden mit einem biologischen Funktionsbereich, der wenigstens die Sequenz YIGSR und eine daran gebundene Radiomarkierung umfassen, Substanzen erhalten, die für diagnostische In-vivo- Anwendungen, insbesondere für die diagnostische Abbildung von Thrombosen und anderen Konditionen nützlich sind, die durch eine Anhäufung von Blutplättchen gekennzeichnet sind. Das Peptid umfasst vorzugsweise einen biologischen Funktionsbereich, der wenigstens die Sequenz YIGSR umfasst, und einen Metallionen- Bindungsbereich, der Metallionen-Bindungssequenzen umfasst, die direkt mit Metallionen verbunden werden können. Die Peptide können in einem Format hergestellt werden, das ein Markierungskit bereitstellt, das wiederum zur Herstellung eines Metallionen- Peptidkomplexes für die In-vivo-Verwendung eingesetzt werden kann. Es ist auch möglich, eine Markierung eines Peptids mit dem biologischen Funktionsbereich mit einem Metallion in vivo zu erreichen, wie beispielsweise mit Hilfe eines Peptid-Avidin- Komplexes, der in vivo injiziert wird, gefolgt von einem Biotin- Metallionenkomplex, der in vivo injiziert wird, was zur Bildung eines in vivo Peptid-Avidin-Biotin-Metallionenkomplexes führt.
[0100] Die YIGSR-haltigen Peptide der vorliegenden Erfindung enthalten vorzugsweise:
a) biologische Funktionsbereiche, die wenigstens die Sequenz YIGSR umfassen, und
b) Metallionen-Bindungsbereiche, die mit medizinisch nützlichen Metallionen komplexieren können.
[0101] Der biologische Funktionsbereich des YIGSR-haltigen Peptids ist eine Sequenz der Aminosäuren Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (YIGSR-Einzelaminosäurecode) und fakultativ von Aminosäuren zusätzlich zu YIGSR. Das Peptid der vorliegenden Erfindung beinhaltet somit vorzugsweise die Sequenz YIGSR, die ein oder mehrere Male wiederholt werden kann. Häufig gibt es innerhalb der angegebenen Sequenzen Mutationen wie Deletionen, Insertionen oder Substitutionen. Substitutionen erfolgen grösstenteils vorsichtig, wobei Aminosäuren mit im Wesentlichen derselben Konformation und Polarität eingesetzt werden können. Die Peptide können L- Aminosäuren aufweisen, oder eine oder mehrere der Aminosäuren können durch D-Aminosäuren (D-Stereoisomer) substituiert werden. Insbesondere können ein oder mehrere Alanine substituiert werden. Alternativ können terminale Aminosäuren mit unnatürlicher Chiralität eingesetzt werden. Das Peptid kann auch ein terminales Amid oder eine terminale acylierte Aminosäure beinhalten, insbesondere acetyliert oder alkyliert, insbesondere methylierte Aminosäuren. Wo ein Cystein den Metallionen-Bindungsbereich am N- Terminus bereitstellt, da kann das Cystein alkyliert oder auf der Mercaptangruppe unsubstituiert sein.
[0101] Das YIGSR-haltige Peptidprodukt kann zur Überwachung oder Behandlung normaler oder anomaler Gewebe und metabolischer Ereignisse verwendet werden, die durch eine Anhäufung von Zellen mit Rezeptoren für YIGSR-haltige Peptide gekennzeichnet sind, wobei diese Anhäufungen im Allgemeinen einen photonenreichen Bereich mit den meisten Abbildungsmodalitäten erzeugen, insbesondere solche, die eine Erfassung von Gammastrahlen beinhalten. Am häufigsten wird das Produkt zur Erfassung von Anhäufungen von Blutplättchen verwendet. Es gibt eine Reihe klinischer Konditionen, bei denen Blutplättchenanhäufungen vorkommen; dazu gehören venöse Thrombose, arterielle Thrombose, linksventrikuläre Thrombose, Lungenembolie, sekundäre inflammatorische Reaktion nach einem Myokardinfarkt, Endokarditis, Bypass-Graft-Okklusion, Aneurysmen, prosthetische arterielle Graft-Blutplättchenanhäufung oder -okklusion, Gehirnembolie oder - hämorrhagie, traumatische Verletzungen mit Hämorrhagie, gastrointestinale Hämorrhagie und sekundäre Thrombose in Verbindung mit Kathetern und anderen implantierten Geräten.
[0103] Das resultierende Produkt der vorliegenden Erfindung kann in einer Reihe verschiedener medizinischer Verfahren wie Gammaszintigrafie, spezifische Photonenemissions- Computertomografie, Positronenemissionstomografie und Magnetresonanzabbildung zur Anwendung kommen. Das Produkt kann auch zur Zuführung einer therapeutischen Strahlungsmenge zu einem Krankheitsort verwendet werden. Die medizinische Anwendung des Produkts der vorliegenden Erfindung ist abhängig vom Peptidtyp und vom Typ des verwendeten nützlichen Metallions.
[0104] Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele ausführlicher illustriert.

1. BEISPIEL - CHEMOTAKTISCHES PEPTIDANALOG

N-formyl-Met-Leu-Phe-Gly-His-Gly-Gly-His-Gly-His-Gly-Gly-His

[0105] Das vorliegende Peptid ist ein chemotaktisches Peptidanalog, insbesondere ein Analog von N-formyl-Met-Leu-Phe, eines von mehreren Peptiden, die für Zellen des Lymphsystems chemotaktisch sind. Die Sequenz His-Gly-Gly-His-Gly-His-Gly-Gly- His dient zum Binden von Tc. Das Peptid wurde direkt in einem 10 mM Tartrat/40 mM Phthalat Puffer, pH 5,6, (P/T-Puffer) aufgelöst, was zu einer Lösung mit 1,4 mg Peptid/ml führte. Diese Lösung wurde in einem Verhältnis von 7 : 3 mit P/T-Puffer vermischt, der 1,25 mM Zinntartrat enthielt. Aliquoten von 0,5 ml wurden dann in einzelne Phiolen gegeben. Jedes Kit enthielt 0,5 mg Peptid, 40 mM Phthalat, 10 mM Tartrat und 22 g Zinntartrat. Alle Lösungen wurden vor der Verwendung mit Stickstoff gespült, und alle Präparate wurden unter einer anaeroben Atmosphäre hergestellt. Die Peptide in den Markierungskits wurden durch Zugabe von 1-2 mCi Natriumpertechnetat (U. S. P.) mit 99mTc markiert, die Reaktion wurde 30 Minuten lang fortschreiten gelassen.

2. BEISPIEL - POTENTIELLE BINDUNG -VERGLEICHSSTUDIE

[0106] Zum Vergleichen der potentiellen Bindung von 99mTc an Histidin und Cystein wurden 99mTc-Bindungen in drei Peptiden mit bekannten Aminosäuresequenzen beurteilt. Ein Peptid, mit der Aminosäuresequenz H&sub2;N-Cys-Asp-Pro-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, enthielt einen einzelnen Cysteinrückstand und keine Histidine und wurde durch direktes Auflösen in 10 mM Tartrat/40 mM Phthalatpuffer, pH 5,6, (P/T-Puffer) hergestellt, so dass sich eine Lösung mit 1,4 mg Peptid/ml ergab. Diese Lösung wurde in einem Verhältnis von 7 : 3 mit P/T-Puffer vermischt, der 1,25 mlvi Zinntartrat enthielt. Aliquoten von 0,5 ml wurden dann in einzelne Phiolen gegeben. Jede Phiole enthielt 0,5 mg Peptid, 40 mM Phthalat, 10 mM Tartrat und 22 g Zinntartrat. Alle Lösungen wurden vor der Verwendung mit Stickstoff gespült, alle Präparate wurden unter einer anaeroben Atmosphäre hergestellt. Das Peptid in den Phiolen wurde durch Zugabe von 1-2 mCi Natriumpertechnetat (U. S. P.) mit 99mTc markiert, die Reaktion wurde 30 Minuten lang fortschreiten gelassen.
[0107] Ein weiteres Peptid mit der Sequenz (Acetyl)-Asp-Arg- Val-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu-Val-Ile-His-Asp enthielt Histidinrückstände, aber keine Cysteine oder Cystin, und wurde wie im ersten Beispiel dargelegt hergestellt und radiomarkiert. Die Kontrolle, Poly-Tyrosin, enthielt weder Histidin noch Cystein; sie wurde wie im vorangegangenen Abschnitt beschrieben hergestellt und radiomarkiert.
[0108] Es entstanden Bindungen des Histidin-haltigen Peptids mit einem Teil, aber nicht mit dem gesamten zugegebenen 99mTc. Das Cystein-haltige Peptid band im Wesentlichen das gesamte zugegebene 99mTc. Mit Poly-Tyrosin, dem negativen Kontrollmaterial, entstand keine Markierung. Diese Ergebnisse wurden durch eine konventionelle Dünnschichtchromatografie bestätigt.

3. BEISPIEL - SYNTHESE VON PEPTIDHALTIGEM BIOLOGISCHEM FUNKTIONSBEREICH UND METALLIONEN-BINDUNGSBEREICH

[0109] Das chemotaktische Peptidanalog N-formyl-Met-Leu-Phe- Gly-His-Gly-Gly-His-Gly-His-Gly-Gly-His wurde mit einem im Handel erhältlichen automatisierten Synthetisierer synthetisiert. Das Peptid wurde lyophilisiert und mit HPLC in Umkehrphase gereinigt. Das Peptid wurde dann mit den Verfahren vom ersten Beispiel markiert.

4. BEISPIEL - HERSTELLUNG VON IKVAV-HALTIGEN PEPTIDKITS FÜR 99mTC- MARKIERUNGEN

[0110] Laminin-deriviertes Peptid der Sequenz CSRARKQAASIKVAVSADR wurde im Handel (Bachem, Inc) als lyophilisiertes Pulver beschafft und ohne zusätzliche Reinigung verwendet. Das N-terminale Thiolat in Verbindung mit dem Cys- Rückstand wurde als Metallionen-Bindungsbereich für die nachfolgende Markierung mit reduziertem 99mTc verwendet.
[0111] Peptidmarkierungskits wurden aseptisch mit stickstoffgespülten Lösungen und nach Möglichkeit unter einer Stickstoffatmosphäre hergestellt. Zur Herstellung der Peptidmarkierungskits wurde das Peptid bis auf eine Eindkonzentration von 1,4 mg/ml in gekühltem, stickstoffgespültem 10 mM Tartrat/40 mM Phthalatpuffer, pH 5,6, (P/T-Puffer) aufgelöst, der 2% Maltose enthielt. Das Peptid und die P/T- Pufferlösung wurden dann in einem Verhältnis von 7 : 3 mit dem P/T- Puffer vermischt, der 1,25 mM Zinntartrat enthielt. Aliquoten (typischerweise 0,5 ml mit 500 g Peptid) wurden dann steril durch einen 0,22 Mikron Filter filtriert und in einzelne Phiolen gegeben. Der Kopfraum jeder Phiole wurde mit Stickstoff gespült, die Phiolen wurden verstöpselt, gecrimpt und bei -70ºC gefroren gelagert.

5. BEISPIEL - 99mTc-MARKIERUNG VON IKVAV-HALTIGEN PEPTIDKITS

[0112] Für die Radiomarkierung wurde eine Phiole des Präparats vom 4. Beispiel aus dem Gefrierschrank genommen und auf Raumtemperatur auftauen gelassen. Die Markierungsreaktion wurde durch Zugabe von 0,5 mis 2,0 mCl 99mTc eingeleitet (Natriumpertechnetat in Salzlösung). Eine radiochemische Analyse wurde 30 Minuten nach der Zugabe des Pertechnetats begonnen.

6. BEISPIEL - RADIOCHEMISCHE ANALYSE DURCH CHROMATOGRAFIE VON IKVAV-HALTIGEN PEPTIDKITS

[0113] Zum Ermitteln der relativen Menge von 99mTc, das an ein bestimmtes Peptidpräparat aus dem 4. Beispiel gebunden war, wurden Aliquoten der 99mTc-markierten Präparate mit dem Verfahren des 5. Beispiels mit Molekularsieb-HPLC, Umkehrphasenchromatografie und Dünnschichtenchromatografie analysiert.
[0114] Molekularsieb-HPLC wurde mit einer 7,5 · 300 mm TSK G3000SW Säule hinter einer TSK-SW 7,5 · 7,5 mm Schutzsäule (TosoHaas, Philadelphia, PA) mit einer Durchflussrate von 1 ml/min einer phosphatgepufferten Salzlösung (0,01 M Phosphat, pH 7,0, enthaltend 0,15 M NaCl.) mit einem UV- und einem Radioisotop- Detektor in Reihe durchgeführt. Das 99mTc-IKVAV-haltige Peptidpräparat eluierte bei 12,8 Minuten mit einer niedrigen chromatografischen Rückgewinnung (unter 10%). Bei Kontrollstudien eluierte Pertechnetat bei 17,8 Minuten mit im Wesentlichen quantitativer chromatografischer Rückgewinnung.
[0115] Für eine Umkehrphasenanalyse wurden Sep-Pak C&sub1;&sub8; Mini- Säulen (Millipore Inc. Bedford, MA) als Umkehrphasen-Adsorbenten verwendet, um die Bindung von 99mTc mit den Peptiden zu beurteilen. Die Säulen wurden mit 10 ml 100% Ethanol, gefolgt von 10 ml 0,001% HCl gespült. 100 l-Aliquoten der Testprobe wurden auf die Säule gegeben, und das ungebundene Material wurde mit 10 ml 0,001% HCl eluiert. Die Säule wurde dann mit einer sortierten Lösungsserie von je 10 ml wässrigem Ethanol (10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% und 100%) eluiert. Die Radioaktivität in jeder Eluierungsfraktion (0,001% HCl durch 100% Ethanol) wurde durch Zählen einer Aliquote (20 l) jeder Fraktion in einem Gammaszintillationszähler ermittelt. Die Säulen selbst wurden ebenso gezählt, nachdem eine entsprechende Zeit für den Zerfall verstrichen war. Alle Zahlen wurden für Zerfall korrigiert und die Radioaktivitätsmengen in jeder Fraktion als Prozentanteil der Assay-Gesamtradioaktivität ausgedrückt. Umkehrphasenchromatografie mit C&sub1;&sub8;-Minisäulen, die mit einer sortierten Ethanolserie eluiert wurden, bestätigte eine 99mTc-Bindung mit dem Peptid (Tabelle 1).
[0116] Mit Dünnschichtchromatografie (TLC) wurde die Menge an peptidgebundenem (und ungebundenem) 99mTc sowie die Menge an radiomarkiertem Aggregat/Kolloid gemessen. Beide Messungen beinhalteten die Verwendung von ITLC-SG (Gelman Sciences, #61886) Chromatografiepapier, gemäss den Anweisungen des Herstellers zu 1,5 · 10 cm Streifen geschnitten und durch Erhitzen bei 110ºC für 30 Minuten aktiviert. Nach dem Erhitzen wurden die Streifen bis zur Verwendung bei Raumtemperatur gelagert.
[0117] Peptidgebundenes 99mTc in den radiomarkierten Präparaten wurde mit TLC in 85% wässrigem Methanol mit ITLC-SG Streifen gemessen. Das Lösungsmittel trennte das lösliche, ungebundene 99mTc (das mit der Lösungsmittelfront wandert) von 99mTc, das an Peptid gebunden ist (das am Ursprung bleibt). Der Prozentanteil an ungebundenem 99mTc wurde als CPM in der Ursprungshälfte des Streifens ausgedrückt, dividiert durch den CPM-Gesamtwert, wobei alle Werte auf Hintergrund korrigiert wurden.
[0118] Dünnschichtchromatografie des 99mTc-IKVAV-haltigen Peptidpräparats des 4. Beispiels in Salzlösung über wärmeaktivierter, Silikagel-beschichteter Zellulose (ITLC-SG- Papier) zeigte im Wesentlichen volle Radioaktivität in Verbindung mit dem Peptid (R&sub1; = 0). Die Präparate enthielten keine signifikanten Mengen an ungebundenem 99mTc als Pertechnetat oder 99mTc-Tartrat (R&sub1; = 1,0). TABELLE 1 Eluierung von 99mTc-IKVAV-haltigem Peptidpräparat des vierten Beispiels von C&sub1;&sub8; Umkehrphasensäulen durch Erhöhen der Ethanolkonzentrationen. Tartrat wurde in den Kits als 99mTc-Transfermittel verwendet. Bei Abwesenheit von Peptid hält Tartrat 99mTc, und seine Elution wird hier als Referenz angegeben.

7. BEISPIEL - BIOVERTEILUNG VON IKVAV-HALTIGEM 99mTC-PEPTID IN NAGETIEREN

[0119] Die Bioverteilung des 99mTc-Peptids aus dem 4. Beispiel wurde in erwachsenen weiblichen Swiss-Webster Mäusen (ca 19 g) zu gewählten Zeiten (10, 30 und 120 Minuten) nach der Injektion in die Schwanzvene beurteilt. Jede Experimentengruppe bestand aus wenigstens fünf Tieren, wobei jedes Tier 0,1 ml mit 5 g Peptid (1 Ci/g) erhielt. Die Tiere wurden mit einer Halothan-Überdosis geopfert, ausgewählte Organe wurden zerteilt und gewogen und die zugehörige Radioaktivität ermittelt. Daten wurden mit einem Computerprogramm analysiert, das speziell für 99mTc-markierte Präparate ausgelegt war. Die prozentuale Dosis pro Organ für Blut, Knochen und Muskel wurde auf der Basis von jeweils 7, 8,2 bzw. 40% des Körpergesamtgewichtes für diese Gewebe errechnet.
[0120] Nach der Injektion von 99mTc-IKVAV-haltigem Peptid aus dem 4. Beispiel wurde eine signifikante Menge an Radioaktivität in den Lungen 10 und 30 Minuten nach der Injektion gefunden (Tabelle 2). Bedeutende Anhäufungen wurden auch in Leber und Nieren gefunden. Zwei Stunden nach der Injektion war die Menge an Radiomarkierung in der Lunge auf weniger als 5% abgefallen (von 47% 10 Minuten nach der Injektion, mit einer einhergehenden Zunahme der Nierenaktivität). In anderen Organen wurde nur eine geringfügige Aufnahme des 99mTc beobachtet. TABELLE 2 Bioverteilung von 99mTc-IKVAV-haltigem Peptid des vierten Beispiels in normalen Swiss-Webster-Mäusen zu ausgewählten Zeiten nach der Injektion. Alle Werte sind die mittlere ± Standardabweichung, n = 6 für alle Datenpunkte.
[0121] Einige Studien beinhalteten eine Präinkubation des 99mTc- IKVAV-haltigen Peptids in Vollblut vor der Injektion und die Ermittlung der Bioverteilung. Bei diesen Studien wurde menschliches Vollblut von einem gesunden erwachsenen männlichen Spender genommen und in Vacutainer-Tuben gesammelt, die EDTE enthielten. Nach dem Mischen zur Gewährleistung einer guten Auflösung des EDTE wurden etwa 2,5 ml des Vollbluts entfernt und mit 0,25 ml 99mTc-Peptid vermischt. Das Gemisch wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren gelassen. Für 30 Minuten wurden Aliquoten von 0,1 ml in die Schwanzvene der Mäuse injiziert. Die Menge an Radioaktivität in der Zirkulation für 99mTc-IKVAV-haltiges Peptid, in Vollblut präinkubiert, war höher als bei Tieren, die 99mTc-IKVAV-haltiges Peptid ohne Inkubation in Blut erhielten. Bei Inkubation von 99mTc-Peptid in Vollblut vor der Injektion wurde eine erheblich geringere Lungenaufnahme festgestellt (Tabelle 3). TABELLE 3 Bioverteilung; von 99mTc-IKVAV-Peptiden aus dem 4. Beispiel bei normalen Swiss-Webster-Mäusen nach einer 30-minutigen Präinkubation in Vollblut. Alle Werte sind die mittlere ± Standardabweichung. n = 6 für alle Datenpunkte.
[0122] Die Abbauraten des 99mTC-IKVAV-haltigen Peptids aus dem 4. Beispiel wurden in erwachsenen weiblichen Fischer 344 Ratten 2 Stunden nach der Injektion beurteilt. Jede Experimentengruppe bestand aus drei Tieren. Jedes Tier wurde mit Ketamin anästhetisiert, und Gallengang und Blase wurden kanüliert. Blut wurde nach unterschiedlichen Zeitperioden aus der Halsvene genommen. Das 99mTc-Peptid baute sich rasch, mit einer Rate von 2,4 ml/min. aus dem Plasma von Ratten ab. Nach zwei Stunden waren 10,8 ± 4,9% der injizierten Dosis über den Urin ausgeschieden, während der Galleabbau zum selben Zeitpunkt 0,9 ± 0,3% betrug.

8. BEISPIEL - DOSISREAKTION VON 99mTc-IKAV-PEPTID BEI LUNGENLOKALISATION

[0123] Es wurden die Dosisauswirkungen von 99mTc-IKVAV-haltigem Peptid aus dem 4. Beispiel auf die Lungenlokalisation beurteilt. Die Lokalisation in cer Lunge wurde in allen angewendeten Injektionsdosen (0,05, 0,5 und 5 g) 10 und 30 Minuten nach der Injektion festgestellt. Ähnliche Radioaktivitätsmengen wurden in der Lunge unabhängig von der injizierten Menge 10 Minuten nach der Injektion festgestellt (jeweils 110,6%, 111,9% bzw. 144,4% ID/Gramm Lungengewebe für jeweils 0,05, 0,5 bzw. 5 g). 30 Minuten nach der Injektion wurde ein ausgeprägterer Dosiseffekt festgestellt, wobei bei einer grösseren Injektionsdosis mehr Radioaktivität in der Lunge zurückblieb (48,8%, 68,1% bzw. 91,9% ID/Gramm Lungengewebe für jeweils 0,05, 0,5 bzw. 5 g).

9. BEISPIEL - UNTERSUCHUNG VON IKVAV-HALTIGEN PEPTIDKITS AUF PARTIKELIMPAKTION

[0124] Bestimmte Experimente wurden durchgeführt, um zu ermitteln, ob die hohe Lungenaufnahme von dem Präparat aus dem 4. Beispiel herrührte, das einen Partikel bildet, der in die Lunge geht. Es waren keine Partikel sichtbar, wenn frisch radiomarkiertes 99mTc-IKVAV-Peptid aus dem 4. Beispiel unter einem Phasenkontrastmikroskop untersucht wurde, und in einem Submikron- Filter (Porengrösse 0,2 Mikron) gefiltertes 99mTc-IKVAV-Peptid aus dem 4. Beispiel ging weiterhin in die Lunge. Ausserdem wurde weiterhin, wenn 99mTc-IKVAV-Peptid aus dem 4. Beispiel in die Peritonealhöhle von Mäusen injiziert wurde (zum Sequestrieren von potentiellem Kolloid), dann wurde weiterhin eine Lokalisierung in der Lunge festgestellt. Bei diesen Experimenten wurde das Herz- Lungen-Verhältnis von 99mTc-Peptid aus dem 4. Beispiel 15 Minuten nach der IP-Injektion beurteilt (3 : 1) und erhöht, so dass 60 Minuten nach der Injektion das Verhältnis 9 : 1 betrug. Nach 120 Minuten hatte das Verhältnis abgenommen, betrug aber immer noch nahezu 6 : 1.

10. BEISPIEL - BIOVERTEILUNG VON 99mTc-IKVAV-HALTIGEM PEPTID IN MÄUSEN MIT MELANOMEN

[0125] Es wurden Bioverteilungsstudien an nackten Mäusen mit Melanomen in der Lunge durchgeführt. Aliquoten von B-16 Melanomzellen wurden in die Schwanzvene von erwachsenen nackten Mäusen injiziert (50.000 Zellen in 0,1 ml serumfreiem RPMI-Medium) und wurden etwa 3 Wochen nach der Inokulation in Studien verwendet. Paarstudien wurden mit nackten Mäusen durchgeführt, denen Schein-Injektionen von Salzlösung ohne Zellen verabreicht wurden.
[0126] Die Bioverteilung von 99mTc-IKVAV-Peptid aus dem 4. Beispiel wurde in Tieren mit Tumoren in der Lunge im Vergleich zu solchen ohne Tumoren in der Lunge erheblich geändert. Bei diesen Studien wurden fünf Tiere mit Tumor und fünf Kontrolltiere für jeden Zeitpunkt verwendet, die Ergebnisse sind die ± Standardabweichung. Bei Tieren mit Tumor wurde Lungenaufnahme (% injizierte Dosis) im Vergleich zu Kontrollen zu allen untersuchten Zeitpunkten erhöht, so dass bei Tieren mit Tumor die Lungenaufnahme 38,3 ± 4,0%, 28,1 ± 3,6% und 3,9 ± 1,2% 10, 30 und 120 Minuten nach der Injektion betrug, während bei den nackten Kontrollmäusen zu denselben Zeitpunkten die Lungenaufnahme jeweils 19,0 ± 2,7%, 11,9 ± 2,9%. bzw. 1,6 ± 0,4% betrug.

11. BEISPIEL - BIOVERTEILUNG DES TC-IKVAV-HALTIGEN PEPTIDS IN MÄUSEN BEIM EMPHYSEMMODELL

[0127] Die Bioverteilung wurde auch in einem Lungenkrankheitsmodell untersucht, bei dem Tight-Skin-Mäuse mit genetischem Emphysem verwendet wurden. Die Tight-Skin-Maus (Tsk) ist eine genetische Mutante, die von einem dominanten Genmangel von Serum-Antielastase verursacht wird. Mischerbige (Tsk/+) Tiere zeigen mehrere hautkonnektive Gewebeanomalien, die Skleroderma ähneln, sowie ein erhöhtes Wachstum von Knorpel, Knochen und kleinen Sehnen mit Hyperplasie der Sehnenscheiden. Die Tsk- Eigenschaft wird mit progressivem Lungenemphysem und der Entwicklung von rechtsventrikulärer Hypertrophie sowie mit Lungenkollagenänderungen assoziiert. Diese Mäuse, sowie genetische Kontrollmäuse (Pallid), wurden aus The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) erhalten.
[0128] Die relative Lokalisation von 99mTc-IKVAV-Peptid aus dem 4. Beispiel war zu allen untersuchten Zeitpunkten (10, 30 und 120 Minuten nach der Injektion) in den Lungen von Tieren mit Emphysem relativ zu Kontrolltierpaaren verringert. TABELLE 4 Bioverteilung von 99mTc-IKVAV-haltigem Peptid aus dem 4. Beispiel in Tight-Skin-Mäusen (Tsk) und genetischen Kontrollmäusen zu gewählten Zeitpunkten nach der Injektion. Alle Werte sind mittlere ± Standardabweichung. n = 4 für alle Zeitpunkte ausgenommen 7.0 Minuten, wo n = 3.
Bei einer degenerativen Lungenerkrankung wie einem Emphysem würde man annehmen, dass die Gesamtzahl der Rezeptoren aufgrund des Lungenmasseverlustes abnimmt. In einem solchen Fall würde die Lokalisationsmenge von 99mTc-IKVAV-Peptid in der Lunge relativ zur Lokalisation bei genetischen Kontrolltierpaaren abnehmen. Die gemachten Beobachtungen wurden mit dieser Hypothese in Beziehung gebracht.

12. BEISPIEL - HERSTELLUNG VON YIGSR-HALTIGEN PEPTIDKITS FÜR 99mTc-MARKIERUNG

[0129] Laminin-deriviertes Peptid der Sequenz CDPGYIGSR (H&sub2;N- Cys-Asp-Pro-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) wurde kommerziell (Bachem, Inc) als lyophilisiertes Pulver beschafft und ohne zusätzliche Reinigung verwendet. Das N-terminale Thiolat in Verbindung mit dem Cys-Rückstand wurde als Metallionen-Bindungsbereich für die nachfolgende Markierung mit reduziertem 99mTc verwendet.
[0130] Peptidmarkierungskits wurden aseptisch mit stickstoffgespülten Lösungen und nach Möglichkeit unter einer Stickstoffatmosphäre hergestellt. Zur Herstellung der Peptidmarkierungskits wurde das Peptid bis auf eine Endkonzentration von 1,4 mg/ml in gekühltem, stickstoffgespültem Puffer aus 10 mM Tartrat/40 mlvi Phthalat, pH 5,6, (P/T-Puffer) aufgelöst, der 2% Maltose enthielt. Das Peptid und die P/T- Pufferlösung wurden dann in einem Verhältnis von 7 : 3 mit dem P/T- Puffer vermischt, der 1,25 mM Zinntartrat enthielt. Aliquoten (gewöhnlich 0,5 ml mit 500 g Peptid) wurden dann durch einen 0,22 Mikron Filter steril filtriert und in einzelne Phiolen gegeben. Der Kopfraum jeder Phiole wurde mit Stickstoff gespült, die Phiolen wurden verstöpselt und gecrimpt und bei -70ºC gefroren gelagert.

13. BEISPIEL 99mTc-MARKIERUNG VON YIGSR-HALTIGEN PEPTIDKITS

[0131] Für die Radiomarkierung wurde eine Phiole des Präparats aus dem 12. Beispiel aus dem Gefrierschrank genommen und auf Raumtemperatur auftauen gelassen. Die Markierungsreaktion wurde durch Zugabe von 0,5 bis 2,0 mCi 99mTc (Natriumpertechnetat in Salzlösung) eingeleitet. Eine radiochemische Analyse wurde 30 Minuten nach der Zugabe des Pertechnetats begonnen.

14. BEISPIEL - RADIOCHEMISCHE ANALYSE DURCH CHROMATOGRAFIE VON 99mTC-MARKIERTEM YIGSR-HALTIGEM PEPTID

[0132] Zum Ermitteln der relativen Menge von 99mTc, das an ein bestimmtes YIGSR-haltiges Peptidpräparat gebunden war, wurden Aliquoten der 99mTc-markierten Präparate mit dem Verfahren aus dem 13. Beispiel mit Molekularsieb-HPLC, Umkehrphasenchromatografie und Dünnschichtchromatografie analysiert.
[0133] Molekularsieb-HPLC wurde mit einer 7,5 · 300 mm TSK G3000SW Säule hinter einer TSK-SW 7,5 · 7,5 mm Schutzsäule (TosoHaas, Philadelphia, PA) mit einer Durchflussrate von 1 ml/min einer phosphatgepufferten Salzlösung (0,01 M Phosphat, pH 7,0, enthaltend 0,15 M NaCl) mit einem UV- und einem Radioisotop- Detektor in Reihe durchgeführt. Das Präparat aus dem 12. Beispiel, das mit dem Verfahren aus dem 13. Beispiel markiert wurde, eluierte bei 13,9 Minuten mit einer hohen chromatografischen Rückgewinnung (über 95%). Bei Kontrollstudien eluierte Pertechnetat bei 17,8 Minuten mit im Wesentlichen quantitativer chromatografischer Rückgewinnung.
[0134] Für eine Umkehrphasenanalyse wurden Sep-Pak C&sub1;&sub8;-Mini- Säulen (Millipore Inc. Bedford, MA) als Umkehrphasen-Adsorbenten verwendet, um die Bindung von 99mTc mit den Peptiden zu beurteilen. Die Säulen wurden mit 10 ml 100% Ethanol, gefolgt von 10 ml 0,001% HCl gespült. 100 l-Aliquoten der Testprobe wurden auf die Säule gegeben, und das ungebundene Material wurde mit 10 ml 0,001% HCl eluiert. Die Säule wurde dann mit einer sortierten Lösungsreihe von je 10 ml wässrigem Ethanol (10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% und 100%) eluiert. Die Radioaktivität in jeder Eluierungsfraktion (0,001% HCl-100% Ethanol) wurde durch Zählen einer Aliquote (20 1) jeder Fraktion in einem Gammaszintillationszähler ermittelt. Die Säulen selbst wurden ebenso gezählt, nachdem eine entsprechende Zerfallszeit verstrichen war. Alle Zahlen wurden auf Zerfall korrigiert und die Radioaktivitätsmengen in jeder Fraktion als Prozentanteil der untersuchten Gesamtradioaktivität ausgedrückt. Umkehrphasenchromatografie mit C&sub1;&sub8;-Minisäulen, die mit einer sortierten Ethanolserie eluiert wurden, bestätigte eine 99mTC-Bindung mit dem Peptid (Tabelle 5).
[0135] Mit Dünnschichtchromatografie (TLC) wurde die Menge an peptidgebundenem (und ungebundenem) 99mTc sowie die Menge an radiomarkiertem Aggregat/Kolloid gemessen. Beide Messungen beinhalteten die Verwendung von ITLC-SG (Gelman Sciences, #61886) Chromatografiepapier, gemäss den Anweisungen des Herstellers zu 1,5 · 10 cm Streifen geschnitten und durch Erhitzen bei 110ºC für 30 Minuten aktiviert. Nach dem Erhitzen wurden die Streifen bis zur Verwendung bei Raumtemperatur gelagert.
[0136] Peptidgebundenes 99mTc in den radiomarkierten Präparaten wurde mit TLC in 85% wässrigem Methanol mit ITLC-SG Streifen gemessen. Das Lösungsmittel trennte das lösliche, ungebundene 99mTc (das mit der Lösungsmittelfront wandert) von 99mTc, das an das Peptid gebunden ist (das am Ursprung bleibt). Der Prozentanteil an ungebundenem 99mTc wurde als CPM in der Ursprungshälfte des Streifens ausgedrückt, dividiert durch den CPM-Gesamtwert, wobei alle Werte auf Hintergrund korrigiert wurden.
[0137] Dünnschichtchromatografie des 99mTc-IKVAV-haltigen Peptidpräparats aus dem 12. Beispiel in Salzlösung über wärmeaktivierter, Silikagel-beschichteter Zellulose (ITLC-SG- Papier) zeigte im Wesentlichen volle Radioaktivität in Verbindung mit dem Peptid (R&sub1; = 0). Die Präparate enthielten keine signifikanten Mengen an ungebundenem 99mTc als Pertechnetat oder 99mTc-Tartrat (R&sub1; = 1,0). TABELLE 5 Eluierung von 99mTc-YIGSR-haltigem Peptidpräparat des zwölften Beispiels von C&sub1;&sub8; Umkehrphasensäulen durch Erhöhen der Ethanolkonzentrationen. Tartrat wurde in den Kits als 99mTC-Transfermittel verwendet. Bei Abwesenheit von Peptid hält Tartrat 99mTC, und seine Elution wird hier als Referenz angegeben.

15. BEISPIEL - BIOVERTEILUNG VON 99mTc-YIGSR-HALTIGEM PEPTID IN NAGETIEREN

[0138] Die Bioverteilung des 99mTc-YIGSR-Peptids aus dem 12. Beispiel wurde in erwachsenen weiblichen Swiss-Webster Mäusen (ca 19 g) zu gewählten Zeiten (10, 30 und 120 Minuten) nach der Injektion in die Schwanzvene beurteilt. Jede Experimentengruppe bestand aus wenigstens fünf Tieren, wobei jedes Tier 0,1 ml mit 5 g Peptid (1 Ci/g) erhielt. Die Tiere wurden mit einer Halothan- Überdosis geopfert, ausgewählte Organe wurden zerteilt und gewogen und die zugehörige Radioaktivität ermittelt. Daten wurden mit einem Computerprogramm analysiert, das speziell für 99mTc-markierte Präparate ausgelegt war. Die prozentuale Dosis pro Organ für Blut, Knochen und Muskel wurde auf der Basis von jeweils 7, 8,2 bzw. 40% des Körpergesamtgewichtes für diese Gewebe errechnet. TABELLE 6 Bioverteilung von 99mTc-YIGSR-haltigem Peptid aus dem 12. Beispiel in normalen Swiss-Webster-Mäusen zu gewählten Zeiten nach der Injektion. Alle Werte sind die mittlere ± Standardabweichung, n = 6 für alle Datenpunkte ausser 120 Minuten, wo n = 5.
[0139] Einige Studien beinhalteten eine Präinkubation des 99mTc- YIGSR-haltigen Peptids in Vollblut vor der Injektion und die Ermittlung der Bioverteilung (Tabelle 7). Bei diesen Studien wurde menschliches Vollblut von einem gesunden erwachsenen männlichen Spender genommen und in Vacutainer-Tuben gesammelt, die EDTE enthielten. Nach dem Mischen zur Gewährleistung einer guten Auflösung des EDTE wurden etwa 2,5 ml des Vollbluts entfernt und mit 0,25 ml 99mTc-YIGSR-Peptid vermischt. Das Gemisch wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren gelassen. Für 30 Minuten wurden Aliquoten von 0,1 ml in die Schwanzvene der Mäuse injiziert. Die Menge an Radioaktivität in der Zirkulation für 99mTC-YIGSR-haltiges Peptid aus dem 12. Beispiel, in Vollblut präinkubiert, war ähnlich wie bei Tieren, die 99mTc-YIGSR-haltiges Peptid ohne Inkubation in Blut erhielten. TABELLE 7 Bioverteilung von 99mTc-YIGSR-Peptiden aus dem 12. Beispiel bei normalen Swiss-Webster-Mäusen nach einer 30-minutigen Inkubation in Vollblut. Alle Werte sind die mittlere ± Standardabweichung. n = 5 für alle Datenpunkte.
[0140] Die Abbauraten des 99mTc-YIGSR-haltigen Peptids aus dem 12. Beispiel wurden in erwachsenen weiblichen Sprague-Dawley- Ratten 2 Stunden nach der Injektion beurteilt. Jede Experimentengruppe bestand aus drei Tieren. Jedes Tier wurde mit Ketamin anästhetisiert, und Gallengang und Blase wurden kanüliert. Blut wurde nach unterschiedlichen Zeitperioden aus der Halsvene genommen. Das 99mTc-YIGSR-Peptid baute sich sehr rasch, mit einer Rate von 2,6 ml/min. aus dem Plasma von Ratten ab. Nach zwei Stunden waren 31,2 ± 9,1% der injizierten Dosis über den Urin ausgeschieden, während der Galleabbau zum selben Zeitpunkt 6,9 ± 0,3% betrug. Bei Bioverteilungsstudien wurde die höchste Menge an Radioaktivität in den Nieren festgestellt und steht im Einklang mit den Rattenabbaudaten. Es wurde keine bedeutende Anhäufung von Radioaktivität in einem untersuchten Organ (ausser den Nieren) festgestellt, und nachfolgend (2 und 4 Stunden nach der Injektion) wurde keine Neuverteilung der Radiomarkierung festgestellt.

16. BEISPIEL - IN-VITRO-BINDUNG VON 99mTc-YIGSR-PEPTID MIT BLUTPLÄTTCHEN UND KOLON-KARZINOMZELLEN

[0141] Das YIGSR-haltige Peptid aus dem 12. Beispiel, das als 99mTc wie im 13. Beispiel markiert wurde, wurde zum Messen der relativen Bindung an Kolon-Karzinomzellen, Blutplättchen und induzierte Gerinnsel verwendet. Bei diesen Studien wurde 99mTc- Human-IgG als Kontrolle verwendet. Die Messwerte wurden als Prozentanteil der Endzahlen pro Minute ausgedrückt, wobei die 99mTc-Human-IgG Kontrolle mit 100% angesetzt wurde.
[0142] Für Studien mit LS-174T Bindungen wurden Zellen in einer Zellkultur gezüchtet. Für Studien der Bindung mit Blutplättchen und induzierten Gerinnseln wurde normales menschliches Vollblut in einem Citratpuffer und das blutplättchenreiche Plasma durch Differentialzentrifugierung gesammelt. Blutplättchen wurden entweder direkt verwendet oder koaguliert. Für Koagulationsstudien wurden 2 Tropfen einer gesättigten Lösung aus Kalziumchlorid und Magnesiumchlorid zu 1 ml blutplättchenreichem Plasma gegeben, Gerinnsel wurden entstehen gelassen, in Puffer gespült und in Phosphat-gepufferte Salzlösung gelegt, die 1% Rinderserumalbumin enthielt. Bei allen Experimenten liess man das 99mTc-YIGSR-Peptid und 99mTc-Human-IgG-Präparate 30 Minuten lang bei 37ºC mit den Karzinomzellen, Blutplättchen und Gerinnseln inkubieren. Für Zellen und Blutplättchen erfolgte die Trennung zum Zählen durch Zentrifugation; für Gerinnsel wurde durch Waschen getrennt. TABELLE 8 Bindung von 99mTc-YIGSR-hältigem Peptid und 99mTc- Human-IgG an LS-174T Kolonkarzinomzellen TABELLE 9 Bindung von 99mTc-YIGSR-haltigem Peptid und 99mTc-Human- IgG an menschlichen Blutplättchen und Gerinnseln
[0143] In anderen Experimenten wurde das Peptid aus dem 13. Beispiel, wie im 13. Beispiel markiert, für In-vitro- Bindungsstudien verwendet. In diesen Studien wurde das 99mTc-YIGSRhaltige Peptid 90 Minuten lang entweder mit 0,5 ml Vollblutgerinnseln unter Verwendung von 0,4 bis 50 g radiomarkiertem Peptid oder mit etwa 10&sup7; Blutplättchen unter Verwendung von 2 bis 200 g radiomarkiertem Peptid inkubiert. Dieses Studien zeigten eine Beziehung zwischen Dosis und Reaktion zwischen der Menge des radiomarkierten Peptids und den Blutgerinnseln oder Blutplättchen.

17. BEISPIEL - IN-VIVO-LOKALISATION IN INDUZIERTEN GERINNSELN MIT 99mTC-YIGSR-HALTIGEM PEPTID

[0143] Experimentelle Halsthrombi wurden mit 20 g/0,1 ml Thrombin in erwachsene Fischer 344 Ratten induziert. Studien wurden mit quantitativer Ganzkörper-Autoradiografie durchgeführt. Das YIGSR-haltige Peptid aus dem 12. Beispiels, wie im 13. Beispiel mit 99mTc markiert, wurde intravenös injiziert, 90 Minuten nach der Injektion wurde eine Ganzkörper-Autoradiografie durchgeführt. Die Ganzkörper-Autoradiografie zeigt einen raschen Abbau der Radioaktivität durch Nieren, und in einem geringeren Ausmass durch das Gallensystem. Eine signifikante Anhäufung von Radioaktivität wurde in den induzierten Halsthrombi festgestellt, wobei ein Thrombus-Muskel-Verhältnis von 15 : 1,5 und ein Thrombus- Blut-Verhältnis von 3 : 1 festgestellt wurde.

18. BEISPIEL - MODIFIZIERTES YIGSR-HALTIGES PEPTID MIT MEHREREN REKOGNITIONSEINHEITEN

[0145] Ein Peptid mit einer längeren Sequenz zur Verbesserung der Blutretention und wiederholte Sequenzen von YIGSR zur Verbesserung der Blutplättchenbindung wird synthetisiert. Die Synthese erfolgt mit Festphasen-Synthesetechniken unter Verwendung von mit t-Butyloxycarbonyl (Boc) geschützten Aminosäuren, die sequentiell einem Gly-Harzester zugegeben wurden, gefolgt von Umkehrphasen-HPLC-Reinigung. Die Sequenz des Peptids lautet wie folgt:
CDGGGYIGSRGGYIGSRGGGDC
(Cys-Asp-Gly-Gly-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-Gly-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser- Gly-Gly-Gly-Arg-Cys)
Das obige Peptid hat eine Reinheit von mehr als 98%, die durch Umkehrphasen-HPLC ermittelt wurde. Die Aminosäurenzusammensetzung wird durch Aminosäureanalyse bestätigt.
[0146] Das obige Peptid wird direkt in stickstoffgespültem Puffer aus 10 mM Tartrat und 40 mM Phthalat, pH 5,5, (P/T-Puffer) aufgelöst. Das aufgelöste YIGSR-haltige Peptid wird auf eine Endkonzentration von 1 mg/ml in 10 mM P/T-Puffer eingestellt, der 40 g/ml Zinntartrat enthielt, und unter einer Stickstoffatmosphäre in 5 cm³ Amberserum-Phiolen bis zur Markierung gefroren gelagert. Für die Markierung wird eine Phiole auf Raumtemperatur erwärmen gelassen, und es wird 99mTc als Natriumpertechnetat zugegeben. Die Markierungsreaktion wird 30 Minuten lang fortschreiten gelassen. Im Wesentlichen das gesamte 99mTc wird mit dem Peptid komplexiert, wie durch HPLC-Analyse festgestellt wurde.

19. BEISPIEL - MODIFIZIERTES YIGSR-HALTIGES PEPTID MIT MEHREREN REKOGNITIONSEINHEITEN UND D-AMINOSÄURESEQUENZEN

[0147] Ein D-Aminosäuresequenzen haltendes Peptid wird zum Verleihen metabolischer Widerstandsfähigkeit für die In-vivo- Verwendung benutzt. Das Peptid des 18. Beispiels wird so modifiziert, dass es solche D-Aminosäuresequenzen enthält. Die Synthese erfolgt durch Festphasen-Synthesetechniken unter Verwendung von mit t-Butyloxykarbonyl (Boc) geschützten Aminosäuren, die sequentiell einem Gly-Harzester zugegeben wurden, gefolgt von Umkehrphasen-HPLC-Reinigung. Die Sequenz des Peptids lautet wie folgt:
(D) -Cys-(D)-Asp-Gly-Gly-Gly-(D)-Tyr-Ile-Gly-(D)-Ser-Arg-Gly-Gly-
(D)-Tyr-Ile-Gly-(D)-Ser-Gly-Gly-Gly-Asp-(D)-Cys
Das obige Peptid hat eine Reinheit von mehr als 98%, ermittelt durch Umkehrphasen-HPLC. Die Aminosäurenzusammensetzung wird durch Aminosäureanalyse bestätigt.
[0148] Das obige Peptid wird direkt in stickstoffgespültem Puffer aus 10 mM Tartrat und 40 mM Phthalat, pH 5,5, (P/T-Puffer) aufgelöst. Das aufgelöste YIGSR-haltige Peptid wird auf einer Endkonzentration von 1 mg/ml in 10 mM P/T-Puffer eingestellt, der 40 g/ml Zinntartrat enthielt, und unter einer Stickstoffatmosphäre in 5 cm³ Amberserum-Phiolen bis zur Markierung gefroren gelagert. Für die Markierung wird eine Phiole auf Raumtemperatur erwärmen gelassen, und es wird 99mTc als Natriumpertechnetat zugegeben. Die Markierungsreaktion wird 30 Minuten lang fortschreiten gelassen. Im Wesentlichen das gesamte 99mTc wird mit dem Peptid komplexiert, wie durch HPLC-Analyse festgestellt wurde.

20. BEISPIEL - HERSTELLUNG VON LYOPHILISIERTEN YIGSR-HALTIGEN PEPTID-RADIOMARKIERUNGSKITS

[0149] Es wurden YIGSR-haltige Peptid-Radiomarkierungskits aus dem 12. 18. oder 19. Beispiel hergestellt, mit Zugabe von Glycin und Inositol als Bindemittel. Die Kits wurden dann individuell phiolysiert und lyophilisiert.

21. BEISPIEL - TIERISCHE LOKALISATIONSSTUDIEN MIT 99mTC-YIGSR- HALTIGEN PEPTIDEN

[0150] Die YIGSR-haltigen Peptidkits des 12., 18., 19. oder 20. Beispiels wurden in Tier-Lokalisationsstudien von induzierten Lungenthrombembolien in erwachsenen Swiss-Webster Mäusen mit Kollagen/Adrenalin-induzierten Lungenembolien verwendet. Unmittelbar vor der Verwendung in den Studien wurden die Tiere durch eine intermuskuläre Injektion von Pentobarbital anästhesiert. Jeder Maus wurde 0,1 ml Salzlösung injiziert, die 10 g Kollagen und 5 g Adrenalin enthielt. Diese Behandlung führte zur Aggregation von zirkulierenden Blutplättchen und der nachfolgenden Lungenablagerung von Embolien. Auf diese Weise behandelte Tiere zeigten 20-30% Thrombozytopenie im Vergleich zu Kontrolltieren. Kontrolltiere erhielten Schein-Injektionen von 0,1 ml Salzlösung. Nach einer entsprechenden Zeitdauer für die Entwicklung von Lungenthrombembolien (5-15 Minuten) wurden den Tieren 99mTc-YIGSR-haltige Peptide aus dem 12., 18., 19. Oder 20. Beispiel injiziert, und nach 10 und 30 Minuten wurden Bioverteilungsstudien durchgeführt.

22. BEISPIEL - DIAGNOSTISCHE Abb. VON THROMBOSEN MIT 99mTc- YIGSR-HALTIGEN PEPTIDKITS

[0151] Ein Kit aus dem 12., 18., 19. oder 20. Beispiel wurde zum Lokalisieren von Thrombembolien in einem Patienten verwendet. Nach der Radiomarkierung mit 99mTc wie im 13. Beispiel wurde das 99mTC-YIGSR-Peptid intravenös injiziert. Unmittelbar nach der Injektion beginnend, wurde der Patient mit konventioneller Gammaszintigrafie oder SPECT-Abbildung und danach in 30-Minuten- Intervallen abgebildet. Orte von Thrombembolien erscheinen durch Szintigrafie als photonenreiche Abbildungsorte im Einklang mit zirkulatorischer Verteilung.

23. BEISPIEL - ANDERE RADIOMARKIERTE PEPTIDE

[0152] Ausser den obigen speziellen Beispielen wurden die erfindungsgemässen Verfahren auch auf die folgenden Peptide erfolgreich angewendet:
a) Angiotensin I,
b) Renin-Substrat-Tetradecapeptid,
c) Hyperkalzämie von Malignanzfaktor-Fragment 1-16,
d) Parathormon-Fragment 1-34,
e) Poly(histidin-glutaminsäure)-poly-alanin-poly-lysin, und
f) zusätzliche chemotaktische Peptidanaloge.

Claims

1. Methode zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltend ein markiertes Peptid, geeignet für die Verabreichung an einen Patienten, dadurch gekennzeichnet, dass man

(a) ein Peptidsubstrat vorlegt oder herstellt, welches einen biologischen Funktionsbereich (BD) und einen medizinisch nützlichen Markierungsmetallion-Bindungsbereich (MD) enthält, und dieses Substrat einer Formel entspricht, die ausgewählt ist aus:

(R&sub1;)-[Y&sub1;]n-(R&sub2;)

(R&sub1;)-[Y&sub1;-(R&sub2;)-[Y&sub1;]n-(R&sub3;) und

(R&sub1;)-[Y&sub1;-(R&sub2;)-Y&sub2;]n-(R&sub3;),

worin

R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; unabhängig voneinander eine Aminosäurensequenz enthaltend 0 bis 20 Aminosäuren, bedeuten,

Y&sub1; und Y&sub2; Aminosäuren enthaltend S, N, und/oder O, bedeuten, welche befähigt sind, mit Ionen eines Übergangsmetalls ausgewählt aus Zn, Cu, Sn, Co und Ni, zu komplexieren, und n eine ganze Zahl von 1 bis 6 bedeutet,

worin

der genannte MD ausgewählt ist aus [Y&sub1;]n, [Y&sub1;-(R&sub2;)-Y&sub1;]n und [Y&sub1;- (R&sub2;)-Y&sub2;]n, und

der genannte BD mindestens einen Rest, ausgewählt aus R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; enthält, und eine Aminosäurensequenz mit 1 bis 20 Aminosäuren beinhaltet,

(b) dieses Substrat in einer pharmazeutisch annehmbaren wässerigen Pufferlösung, enthaltend einen Spender von Ionen der genannten Übergangsmetalle, zur Reaktion bringt, so dass sich Komplexe dieser S, N und/oder O enthaltenden Aminosäure mit den genannten Übergangsmetallionen bilden, und

(c) dieses komplexierte Substrat in dieser Pufferlösung mit einem medizinisch nützlichen markierenden Metallion zur Reaktion bringt, wobei dieses markierende Metallion einen höheren Bindungsgrad besitzt als das genannte Übergangsmetallion, so dass das an den MD gebundene Übergangsmetallion durch das genannte markierende Metallion ersetzt und in dieser Pufferlösung die genannte Zusammensetzung, enthaltend ein markiertes Peptid, gebildet wird,

wobei, wenn das Substrat Disulfidbindungen enthält, diese vorgängig durch Inkubation des Substrats mit einem Reduktionsmittel reduziert werden und ein Überschuss an Reduktionsmittel anschliessend entfernt wird.

2. Methode nach Anspruch 1, worin der genannte MD eine oder mehrere Aminosäurensequenzen umfasst, welche Monosulfidgruppen ohne Disulfidbindungen enthalten.

3. Methode nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin der genannte MD eine Aminosäurensequenz enthält, ausgewählt aus Cystein, Histidin, Penicillamin, deacyliertem Methionin, Lysin, Arginin, Aspartinsäure, Glutaminsäure und Tyrosin.

4. Methode nach einem der voran gehenden Ansprüche, worin der genannte MD ausgewählt ist aus

[Cys-(R&sub2;)-Cys]n

[Cys-(R&sub2;)-Pen]n

[His-(R&sub2;)-Cys]n

[His-(R&sub2;)-Pen]n

[His]n und

[His-(R&sub2;)-His]n

worin n einen Wert von 1 bis 6 und R&sub2; eine Aminosäurensequenz enthaltend 1 bis 20 Aminosäuren, bedeuten.

5. Methode nach einem der voran gehenden Ansprüche, worin der genannte BD ausgewählt ist aus

Phe - Trp - Lys - Thr,

N-Formyl - Met - Leu - Phe,

Tyr - Ile - Gly - Ser - Arg (YIGSR) und

Ile - Lys - Val - Ala - Val (IKVAV)

6. Methode nach Anspruch 4 oder Anspruch 5, worin das Peptid eine Sequenz enthält, die ausgewählt ist aus

Arg - Lys - Gln - Ala - Ala - Ser - Ile - Lys - Val - Ala - Val (RKQAASIKVAV)

Cys-Ser-Arg-Ala-Arg-Lys-Gln-Ala-Ala-Ser-Ile-Lys-Val-Ala-Val-Ser- Ala-Asp-Arg (CSRARKQAASIKVAVSADR) und

Cys - Asp - Pro - Gly - Tyr - Ile - Gly -Ser -Arg (CDPGYIGSR).

7. Methode nach einem der voran gehenden Ansprüche, worin das genannte Übergangsmetallion ein Zinn Sn(II) ist.

8. Methode nach Anspruch 7, worin der Spender dieser Zinn-Ionen eine Verbindung beinhaltet, ausgewählt ist aus Zinntartrat, Zinnglucoheptonat, Zinngluconat, Zinnphosphonat, Zinnchlorid und Zinnfluorid.

9. Methode nach einem der voran gehenden Ansprüche, worin das markierende Metallion Tc ist und dass bei Durchführung der Stufe (c) ein Reduktionsmittel zugegeben wird, um den Oxidationszustand dieses markierenden Metallions zu reduzieren.

10. Methode nach Anspruch 6 oder Anspruch 7, worin bei Durchführung der Stufe (c) ein Reduktionsmittel zugefügt wird, um den Oxidationszustand des markierenden Metallions zu reduzieren, und worin der Spender der Zinn-Ionen und das Reduktionsmittel, beide jeweils im wesentlichen aus Zinntartrat bestehen.

11. Methode nach einem der voran gehenden Ansprüche, worin die genannte Pufferlösung Anionen von einer oder mehreren Dicarbonsäuren enthält.

12. Methode nach Anspruch 11, worin das genannte Dicarbonsäureanion bzw. Anionen ausgewählt sind von Phtalat-, Tartrat- und Citratanionen.

13. Methode nach einem der voran gehenden Ansprüche, worin das übergangsmetallion Zinn darstellt und die Pufferlösung Alkalimetalltartrat bei einem pH von 5 bis 6, enthält.

14. Methode nach einem der voran gehenden Ansprüche, worin die Pufferlösung im wesentlichen aus einer Mischung von 10 mM Tartrat und 40 mM Phthalat besteht.

15. Methode nach einem der Ansprüche 11 bis 14, worin der genannte Puffer zusätzlich eine Aminosäure enthält.

16. Methode nach Anspruch 15, worin diese Aminosäure Glycin ist.

17. Methode nach einem der voran gehenden Ansprüche, worin das markierende Ion ausgewählt ist aus den Ionen Fe, Co, Ni, Cu, Zn, As, Se, Mo, Tc, Ru, Pd, Ag, Cd, In, Re, Os, Ir, Pt, Au, Hg, Tl, Pb, Bi, Po, und At.

18. Methode nach einem der voran gehenden Ansprüche, worin das markierende Ion ausgewählt ist aus radioaktiven Ionen von Tc, Re, Cu, Ag, Hg, Au und In.

19. Methode nach einem der voran gehenden Ansprüche, worin die Zusammensetzung vorgängig zu Stufe (c) in Dosierungsbehältern in lyophilisierter Form gelagert wird und während oder direkt vor der Stufe (c) rehydratisiert wird.

20. Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend ein markiertes Peptid gemäss Anspruch 1, geeignet für die Verabreichung an einen Patienten, wobei dieses Peptid einen biologischen Funktionsbereich (BD) und einen medizinisch nützlichen Markierungsmetallion- Bindungsbereich (MD) enthält, welcher mindestens eine Schwefel, Stickstoff und/oder Sauerstoff enthaltende Aminosäure aufweist, welche befähigt ist, mit Ionen eines Übergangsmetalls, ausgewählt aus Zn, Cu, Sn, Co und Ni, zu komplexieren, und ein medizinisch nützliches markierendes Metallion, dadurch gekennzeichnet, dass

(a) der genannte MD gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert ist, und

(b) der genannte BD eine der Sequenzen von

Tyr - Ile - Gly - Ser - Arg (YIGSR) und

Ile - Lys - Val- Ala - Val (IKVAV)

enthält,

(c) das genannte markierende Metallion direkt mit dem genannten Schwefel, Stickstoff und/oder Sauerstoff des MD verbunden ist.

21. Zusammensetzung nach Anspruch 20, worin das Peptid eine oder mehrere Sequenzen enthält, welche ausgewählt sind aus

Arg - Lys - Gln - Ala - Ala - Ser - Ile - Lys - Val - Ala - Val (RKQAASIKVAV)

Cys - Asp - Pro - Gly - Tyr - Ile - Gly -Ser -Arg (CDPGYIGSR).

22. Zusammensetzung nach Anspruch 20 oder Anspruch 21, worin das markierende Metallion der Definition von Anspruch 17 oder Anspruch 18 entspricht.

23. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 20 bis 22, worin das Peptid in einer wässerigen Pufferlösung, gemäss einem der Ansprüche 11 bis 16, anwesend ist.

24. Lyophilisierte oder gefrorene Dosierungseinheit enthaltend einen Zielwirkstoff geeignet für die Verabreichung an einen Patienten und (nach Rehydratation) bereit ist für die direkte Markierung durch Zugabe von radioaktivem Pertechnetat oder Perhenat, dadurch gekennzeichnet, dass dieser Wirkstoff ein Peptid gemäss der Definition von Anspruch 1 enthält, und einen biologischen Funktionsbereich (BD) und einen medizinisch nützlichen Markierungsmetallion-Bindungsbereich (MD) aufweist, worin

(a) der genannte MD gemäss einem der Ansprüche 2 bis 4 definiert ist, und

(c) der genannte BD eine der Sequenzen

Tyr - Ile - Gly - Ser - Arg (YIGSR) und

Ile - Lys - Val- Ala - Val (IKVAV)

enthält.

25. Dosierungseinheit nach Anspruch 24, worin das genannte Peptid eine oder mehrere Sequenzen enthält, welche ausgewählt sind aus

Arg - Lys - Gln - Ala - Ala - Ser - Ile - Lys - Val - Ala - Val (RKQAASIKVAV)

Cys - Asp - Pro - Gly - Tyr - Ile - Gly -Ser -Arg (CDPGYIGSR).

26. Dosierungseinheit nach Anspruch 24 oder Anspruch 25, worin das Peptid in einem wässerigen Puffer anwesend ist, wie in einem der Ansprüche 11 bis 16 definiert.

27. Zusammensetzung in dosierter Form enthaltend einen Zielwirkstoff geeignet für die Verabreichung an einen Patienten bestehend aus rehydratisierten Inhalten einer Dosierungseinheit gemäss einem der Ansprüche 24 bis 26, welche durch die Zugabe eines radioaktiven Markierungsmetallions markiert wurden.

28. Zusammensetzung nach Anspruch 27, worin das Markierungsmetallion radioaktives Pertechnetat darstellt.

29. Verwendung eines Peptids gemäss Anspruch 5 oder Anspruch 6 für die Herstellung einer Zusammensetzung gemäss einem der Ansprüche 20 bis 23 oder 28 oder 29, oder einer Dosierungseinheit nach einem der Ansprüche 24 bis 26 für die Verabreichung an einen Patienten für die diagnostische Abbildung der Lunge, worin der genannte BD die Sequenz

Ile - Lys - Val - Ala - Val (IKVAV)

enthält.

30. Verwendung nach Anspruch 29, worin das Peptid die Sequenz Arg - Lys - Gln - Ala - Ala - Ser - Ile - Lys - Val - Ala - Val (RKQAASIKVAV) oder

Cys-Ser-Arg-Ala-Arg-Lys-Gln-Ala-Ala-Ser-Ile-Lys-Val-Ala-Val-Ser- Ala-Asp-Arg (CSRARKQAASIKVAVSADR)

enthält.

31. Verwendung nach Anspruch 30, worin das Peptid im wesentlichen aus der Sequenz

einschliesslich Wiederholungen von IKVAV, besteht.

32. Verwendung eines Peptids gemäss Anspruch 5 oder Anspruch 6 für die Herstellung einer Zusammensetzung gemäss einem der Ansprüche 20 bis 23 oder 27 oder 28, oder einer Dosierungseinheit nach einem der Ansprüche 24 bis 26 für die Verabreichung an einen Patienten für die Feststellung von Stellen von Anhäufung von Blutplättchen oder von Karzinomen, worin der genannte BD die Sequenz

Tyr - Ile - Gly - Ser - Arg (YIGSR)

enthält.

33. Verwendung nach Anspruch 32, worin das Peptid auch die Sequenz Asp - Pro - Gly enthält.

34. Verwendung nach Anspruch 33, worin das Peptid im wesentlichen aus der Sequenz

Cys - Asp - Pro - Gly - Tyr - Ile - Gly -Ser -Arg (CDPGYIGSR)

einschliesslich Wiederholungen von YIGSR besteht.

35. Verwendung eines Peptides gemäss Anspruch 1, enthaltend Thiolatgruppen, welche über das Schwefelatom der Thiolatgruppen komplexiert sind mit Ionen eines Übergangmetalles ausgewählt von Zn, Cu, Sn, Co und Ni, zwecks direkter Markierung durch Umsetzung des komplexierten Peptides in einem pharmazeutisch annehmbaren Puffer mit einem medizinisch nützlichen markierenden Metallion, welches einen höheren Bindungsgrad besitzt als das genannte Übergangsmetallion, so dass das Übergangsmetallion durch das genannte markierende Metallion ersetzt wird und eine Zusammensetzung entsteht, welche ein markiertes Peptid in der genannten Pufferlösung enthält.

36. Verwendung nach Anspruch 35, worin diese Übergangsmetallionen Zinnionen sind.