DE69229278T2

DE69229278T2 - Humanisierter b-b10, ein anti-il-2-rezeptor-antikörper

Info

Publication number: DE69229278T2
Application number: DE69229278T
Authority: DE
Inventors: Hideyuki Gomi; Tomoyuki Nakatani; Hiroshi Noguchi; John Wijdenes
Original assignee: Biotest Pharma GmbH; Diaclone SAS
Current assignee: Opi Limonest Fr
Priority date: 1991-12-06
Filing date: 1992-12-03
Publication date: 2000-01-05
Anticipated expiration: 2012-12-04
Also published as: JPH05244982A; WO1993011238A1; EP0616641A1; DE69229278D1; ATE180511T1; US5886152A; EP0616641B1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft einen humanisierten Antikörper, der für einen menschlichen IL-2-Rezeptor spezifisch ist. Insbesondere betrifft sie einen humanisierten Antikörper, der durch Transplantation des die Komplementarität bestimmenden Bereichs (nachstehend bezeichnet als CDR) des monoclonalen Maus-Antikörpers B-B10, der für einen menschlichen IL-2-Rezeptor spezifisch ist, in einen menschlichen Antikörper erhalten wird, und eine Zusammensetzung, die diesen Antikörper als einen wirksamen Bestandteil umfaßt.

Hintergrund der Erfindung

Zuerst wird die Struktur und die Funktion des mit der vorliegenden Erfindung in Beziehung stehenden Antikörpers erklärt. Diese Struktur und Funktion wird nämlich bei Kabat et al.: Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4. Auflage, 1989, NIH, USA, sowie Roitt et al.: Immunology, z. Auflade, 1989, Gower Medical Publishing, USA & GB, ausführlich beschrieben.
Der Antikörper (Immunglobulin) ist ein antigen-spezifisches Glycoprotein, wie es von B-Lymphocyten produziert wird, wenn ein Individuum mit einem Antigen sensibilisiert wird, das eine fremde Substanz für das Individuum ist. Als menschliches Immunglobulin sind 5 Klassen bekannt, d. h. IgG, IgM, IgA, IgD und IgE. Im Fall von IgG weist es zwei leichte Polypeptidketten (L-Ketten) mit einem Molekulargewicht von etwa 2.000 und zwei schwere Polypeptidketten (H-Ketten) mit einem Molekulargewicht von etwa 51.000 auf. Zwischen H-L-Ketten und zwischen H-H-Ketten liegt üblicherweise eine Disulfidbrücke vor, die die zwei Ketten verbindet. Eine etwa 100 Aminosäuren am N-Terminus einer jeden der H- und L-Ketten aufweisende Aminosäuresequenz, ist antigen-spezifisch und stellt eine Antigen- Bindungsstelle dar. Dieser Teil wird als variabler (V) Bereich bezeichnet. Die folgende Aminosäuresequenz, die 400 Aminosäuren in der H-Kette bzw. 150 Aminosäuren in der L-Kette aufweist, wird als konstanter (C) Bereich bezeichnet, der bei allen Immunglobulinen, die zu einer Ig-Klasse wie die IgG- oder IgM-Klasse gehören, oder jenen, die zu einer Unterklasse wie IgG&sub1; oder IgG&sub2; gehören, identisch sind. Es ist bekannt, daß menschliches IgG Cκ oder Cλ in der L-Kette und Cγ1, Cγ2, Cγ3 oder Cγ4 in der H-Kette aufweisen kann. L- und H-Ketten, die eine dieser identifizierten Teilstrukturen aufweisen, werden als κ-, λ-, γ1-, γ2-, γ3- bzw. γ4-Kette bezeichnet.
H- und L-Kette enthalten "Domänenstrukturen". Zum Beispiel setzt sich die H-Kette aus VH-, CH1-, CH2- und CH3-Domänen und Gelenkbereichen, die die CH1- und CH&sub2;-Domänen verbinden, zusammen.
Der variable Bereich umfaßt vier Gerüstbereiche, in denen relativ konservative Aminosäuresequenzen bei verschiedenen Antikörpern beibehalten werden, und drei CDRs, die hinsichtlich der Aminosäuresequenz bei verschiedenen Antikörpern relativ variabel sind. In einem Molekül eines Antikörpers, der zwei H-Ketten und zwei L-Ketten umfaßt, liegen sechs von VH- und VL-Bereichen stammende CDRs vor, die sterische Konfigurationen einnehmen, die eng aneinander angrenzen, um eine Antigen-Bindungsstelle zu bilden.
Die Zusammenfassung der Struktur und der Funktion des Antikörpers ist wie vorstehend angegeben.
Der monoclonale Antikörper (nachstehend bezeichnet als "MAb") ist weitverbreitet zur Diagnose und zur Therapie auf dem Gebiet der Medizin und als Reagens, Affinitätssäulenmaterial, etc. in der Industrie. Der Maus-MAb wird leicht durch das Maus/Maus- Hybridom-Verfahren erhalten.
Zur Herstellung eines menschlichen MAb, der zur menschlichen Therapie nützlicher ist als ein Maus-MAb, wurden verschiedene Verbesserungen vorgeschlagen, aber es wurde kein zuverlässiges Verfahren zur Etablierung einer herstellbaren Zellinie mit guter Reproduzierbarkeit und hoher Effizienz entwickelt. Aus diesem Grund ist die klinische Nutzung des menschlichen MAb sehr begrenzt. Auch ist die Herstellung eines menschlichen Antikörpers gegen ein vom Menschen stammendes Antigen außer in speziellen Fällen im allgemeinen unmöglich.
Im Fall einer Maus kann ein MAb, der für verschiedene Antigene einschließlich Antigene menschlichen Ursprungs spezifisch ist, leicht erhalten werden, aber bei der Verabreichung an einen Menschen tritt das Problem der Antigenität auf. Einige Versuche wurden unternommen, um einen Antikörper, der hinsichtlich der Antigenität für den menschlichen Körper abgeschwächt ist, aus dem Maus-MAb herzustellen. Insbesondere sind die Versuche auf die Herstellung eines humanisierten Antikörpers gerichtet, in dem nur ein CDR, von dem angenommen wird, daß er eine Antigen-Bindungsstelle bildet, im variablen Bereich des Maus-MAb belassen wird und alle anderen Bereiche durch die menschlichen Bereiche ersetzt werden.
Zum Beispiel wird bei dem Verfahren, so wie es in der EP-A-87302620 offenbart ist, der CDR des Maus-MAb durch die Anwendung der ortsspezifischen Mutation mit einem langen Oligonucleotid in den menschlichen MAb-V-Bereich transplantiert. Als Beispiel zum Erhalt eines humanisierten Antikörpers, wie vorstehend erläutert, ist ein Versuch zur Humanisierung des Ratten-MAb Campath-1, der das CDw52-Antigen auf menschlichen T-Zellen erkennt, bekannt (EP-A-89301291).
Als einer der Maus-MAbs, bei denen eine Humanisierung wirksam wäre, ist der anti-Mensch-IL-2-Rezeptor-Antikörper B-B10 bekannt (Japanische Patentveröffentlichung (ungeprüft) Nr. 2-13371). Dieser Antikörper wirkt der Bindung von IL-2 an den IL-2-Rezeptor auf menschlichen T-Zellen entgegen und hemmt das IL-2-abhängige Wachstum aktivierter T-Zellen. Er hemmt auch die menschliche gemischte Lymphocyten-Reaktion. Demgemäß ist dieser MAb zur Behandlung von und zur Vorbeugung vor Krankheiten, die durch eine Transplantat-Wirt-Reaktion oder eine Wirt-Transplantat-Reaktion hervorgerufen werden, zur Verhinderung einer Abstoßung bei der Transplantation von Knochenmark, Niere, Herz, Lunge, Bauchspeicheldrüse, Haut, Leber, etc., zur Therapie einer T-Zell-abhängigen Allergie oder von Autoimmunkrankheiten (z. B. Myocarditis, Diabetes mellitus, Myasthenia gravis, Lupus erythematosus, Morbus Crohn, Multiple Sklerose, AIDS, Meningitis, Arthritis) und zur Therapie von Tumoren, die den IL-2-Rezeptor exprimieren, wie der T-Zell- Leukämie, nützlich.
In der Tat erzielt die Verabreichung von B-B10 bei der Transplantat-Wirt-Reaktion, so wie sie nach der Knochenmarktransplantation hervorgerufen wird, oder die vorbeugende Verabreichung von B-BIO bei der Abstoßung der Lebertransplantation eine bestimmte Wirkung (Blood, Bd. 75 (1990), 1017; Lancet, Bd. 335 (1990), 196).
Bei der praktischen Therapie jedoch wird die Verabreichung von B-B10 infolge des Problems der Antigenität des Maus-MAb nur für einen kurzen Zeitraum durchgeführt. Auch gibt es ein klinisches Beispiel, wo ein Antikörper gegen den Maus-MAb in einem Patienten nachgewiesen wurde, dem der Maus-MAb verabreicht wurde. Die Verabreichung über einen langen Zeitraum ist folglich vom praktischen Gesichtspunkt her sehr schwierig. Aus dem Vorstehenden wird verständlich, daß die Verabreichung von B-B10 auf Grund der Tatsache, daß er eine Art eines Maus-MAb ist, begrenzt ist, und daß die therapeutische Wirkung ebenfalls beschränkt ist.
Zur Lösung des vorstehenden Problems ist es erforderlich, die von dem Maus-Antikörper ausgehende Antigenität durch eine Humanisierung zu vermindern. Was humanisierte Antikörper anbetrifft, gibt es ergänzend zu den vorstehend erwähnten einige andere Beispiele. Zum Beispiel wird ein anti-Tac-Antikörper durch Transplantation von neun Aminosäureresten in das Gerüst zusätzlich zum CDR humanisiert, und als Ergebnis der Humanisierung wird die Aktivität auf 1/3 verringert (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 86 (1989), 10029). Auch werden bei den humanisierten Antikörpern gegen das gB-Glycoprotein und das gD- Glycoprotein des Herpes simplex-Virus zwei Aminosäurereste bzw. acht Aminosäurereste, zusätzlich zum CDR, in das Gerüst transplantiert, und ihre Aktivitäten betragen 1/2 bzw. 1 im Vergleich zum Maus-MAb (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 88 (1991), 2869). Ferner wird der humanisierte Antikörper gegen das menschliche CD4 zusätzlich zum CDR mit einem Aminosäurerest transplantiert, und seine Aktivität beträgt 1/3 im Vergleich zum Maus-MAb (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 88 (1991), 4181).
Wie aus dem Vorstehenden verständlich wird, ist es zum Erhalt eines humanisierten Antikörpers, der eine mit dem Maus-MAb vergleichbare Aktivität aufweist, erforderlich, nicht nur den CDR sondern auch einen Aminosäurerest oder Aminosäurereste zu transplantieren, der bzw. die einen wichtigen Einfluß auf die Antigen-Antikörper-Bindung im Gerüst des Maus-MAb erlauben würde(n). Jedoch ist ein solcher Aminosäurerest oder sind solche Aminosäurereste in Abhängigkeit von der Art des Antikörpers verschieden; in der Tat zeigen die Beispiele, wie vorstehend angeführt, daß einige Aminosäurereste unter ihnen häufig sind und einige andere nicht. Es ist folglich erforderlich, den (die) notwendigen Aminosäurerest(e) in jedem Antikörper zu bestimmen. Wie im Fall des humanisierten Antikörpers gegen das gD-Glycoprotein des Herpes simplex-Virus umfaßt ein solches Verfahren das Belassen der Aminosäuresequenz, von der erwartet wird, daß sie an der Antigen- Antiköper-Bindung beteiligt ist, so wie beim Maus-MAb, in dem Gerüst. In diesem Fall jedoch erhöht der gleiche Aminosäurerest wie im Maus-MAb die Antigenität, so daß die Antigenität des Maus-MAb erhöht wird.
Wenn das Gerüst des Maus-MAb einen oder mehrere Aminosäurereste enthält, die in menschlichen Antikörpern selten vorkommen, werden sie grundsätzlich durch andere Aminosäurereste ersetzt, die bei menschlichen Antikörpern sehr verbreitet sind. So wurden in diesem Fall 16 Aminosäurereste in dem Gerüst ersetzt. Wie aus dem Vorstehenden verständlich wird, ist es zum Erhalt eines humanisierten Antikörpers erforderlich, einen Aminosäurerest oder Aminosäurereste in dem Gerüst zu identifizieren, der bzw. die zur Beibehaltung der Aktivität wesentlich zu sein scheinen und sie zusammen mit dem CDR in den menschlichen Antikörper zu transplantieren. Es ist jedoch sehr schwierig, einen oder mehrere solche wesentlichen Aminosäurereste vorherzubestimmen. Demgemäß ist die Transplantation aller Aminosäurereste in das Gerüst, die möglicherweise an der Antigen-Bindungsaktivität beteiligt sind, bei der Herstellung eines humanisierten Antikörpers wünschenswert. Jedoch ist beabsichtigt, daß der auf diese Weise hergestellte humanisierte Antikörper viele Aminosäurereste einschließt, die vom Maus-Antikörper stammen, und daher kann die Antigenität des humanisierten Antikörpers unvermeidlich hoch sein.

Offenlegung der Erfindung

Unter den Umständen, wie vorstehend angegeben, versuchten die hier genannten Erfinder die Humanisierung des Maus-B-B10. Als Ergebnis gelang es, einen humanisierten B-B10, der eine mit dem Maus-B-B10 vergleichbare Aktivität aufweist, durch Transplantation einer minimalen Aminosäuresequenz in das Gerüst herzustellen. Und zwar wurde die cDNA des V-Bereichs des Antikörpers aus der den Maus-B-B10 produzierenden Hybridomzellinie durch ein an sich herkömmliches Verfahren, wie das Polymerasekettenreaktions (PCR)-Verfahren, erfolgreich cloniert, und die Aminosäuresequenz wurde bestimmt. Danach wurde der V-Bereich eines menschlichen Antikörpers mit einer großen Homologie zu einer solchen Aminosäuresequenz ausgewählt, und das Gerüst dieses menschlichen Antikörpers wurde mit dem B-B10-V-Bereich-CDR und einem Teil des Gerüsts verknüpft, um mehrere Formen des humanisierten B-B10-V-Bereichs zu konstruieren. Ein solcher humanisierter B- B10 ist vom Maus-B-B10 hinsichtlich der Aminosäurereste des Gerüsts, von dem ein Teil transplantiert wurde, verschieden. Die diese Aminosäurereste codierende DNA-Sequenz wurde synthetisiert, und ein den humanisierten B-B10 exprimierendes Plasmid wurde konstruiert. Das Plasmid wurde in eine Maus-Myelomzellinie einge bracht, um eine den humanisierten B-B10 produzierende Zelle zu erhalten.
Die Produktivität des Antikörpers wurde durch Amplifikation des den Antikörper codierenden Gens erhöht, und die so erhaltenen mehreren humanisierten B-B10-Antikörper wurden gereinigt und hinsichtlich ihrer Aktivitäten beurteilt. Als Ergebnis wurden die Aminosäurereste in dem Gerüst, die einen starken Einfluß auf die B-B10-Aktivität haben und die als "M5" bezeichnet werden, identifiziert. Es wurde erwartet, daß der aktivste humanisierte B-B10 derjenige ist, in dem so viele Aminosäurereste wie möglich in das Gerüst des Maus-B-B10, einschließlich M5, transplantiert wurden. Wider Erwarten jedoch ergab die Bewertung der Aktivitäten, daß der humanisierte B-B10, der durch einen minimalen Transplantationsgrad erhalten wurde, am aktivsten war, so weit er M5 einschließt. Von diesem humanisierten Antikörper (M5) wird erwartet, daß er im Hinblick auf die Antigenität vorteilhaft ist, und dennoch zeigte er praktisch den gleichen Aktivitätswert wie der des Maus-B- B10. Der vorliegenden Erfindung liegt diese Erkenntnis zugrunde.
Da das Gen, das den humanisierten B-B10 codiert, bestimmt wurde, wurde die Herstellung verschiedener humanisierter B-B10-Derivate mittels der DNA-Rekombinationstechnik möglich. Solche B-B10-Derivate schließen Fv, Fab und ein Fusionsprotein, das aus dem humanisierten B-B10 und einem proteinähnlichen Toxin oder einem Enzym besteht, ein.
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend ausführlicher erklärt.
Die vorliegende Erfindung stellt humanisierte Antikörper bereit, die von dem Maus-anti-Mensch-IL-2-Rezeptor-Antikörper, B-B10-MAb, abgeleitet sind. Die erfindungsgemäßen Antikörper sind dadurch gekennzeichnet, daß sie den folgenden CDR im V-Bereich und die folgenden partiellen Aminosäuresequenzen im Gerüst umfassen.
H-Kette-V-Bereich
CDR1: SEQ ID No. 1
CDR2: SEQ ID No. 2
CDR3: SEQ ID No. 3
L-Kette-V-Bereich
CDR1: SEQ ID No. 4
CDR2: SEQ ID No. 5
CDR3: SEQ ID No. 6
H-Kette-V-Bereich
27.-30. Aminosäure: SEQ ID No. 7
94. Aminosäure: Arg
L-Kette-V-Bereich
49. Aminosäure: Lys
Die vorliegende Erfindung stellt ferner humanisierte Antikörper bereit, die durch die V-Bereich-Sequenzen, wie nachstehend angegeben, gekennzeichnet sind.
H-Kette-V-Bereich: SEQ ID No. 8
L-Kette-V-Bereich: SEQ ID No. 9
Die vorliegende Erfindung schließt einen reifen (vollständigen) humanisierten B-B10-Antikörper und dessen Fragmente, wie Fv, Fab und (Fab)'&sub2;, ein.
Der erfindungsgemäße humanisierte Antikörper und dessen Fragmente können ein zusätzliches funktionelles Molekül enthalten. Zum Beispiel können sie mit einem funktionellen Molekül, wie einem Toxin (z. B. Lysin), einem Enzym oder einer bestimmten Art von Cytokin verbunden sein.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt die DNA-Sequenz, die den Maus-B-B10-V-Bereich (H-Kette) codiert, und die dadurch codierte Aminosäuresequenz.
Fig. 2 zeigt die DNA-Sequenz, die den Maus-B-B10-V-Bereich (L-Kette) codiert, und die dadurch codierte Aminosäuresequenz.
Fig. 3 zeigt einen Vergleich der Aminosäuresequenz des humanisierten B-B10M0 mit den Aminosäuresequenzen des Maus-B-B10 und der menschlichen Antikörper KAS und PAY, die als Matrizen verwendet wurden. Die Position der Mutation M1-5 ist ebenfalls angegeben. Bei M1-5 sind alle der in der Figur gezeigten Aminosäurereste durch die Aminosäurereste des Maus-B-B10 ersetzt. FR bedeutet Gerüst.
Fig. 4 zeigt die synthetisierte DNA-Sequenz des humanisierten B-B10M0-V-Bereichs (H-Kette). Die eingerahmte Sequenz codiert den V-Bereich. Die andere Sequenz stammt vom FK-001-Antikörper-Gen. Die Unterstreichung gibt die Position eines bei der Gensynthese verwendeten Primers an.
Fig. 5 zeigt die synthetisierte DNA-Sequenz des humanisierten B-B10M0-V-Bereichs (L-Kette). Die eingerahmte Sequenz codiert den V-Bereich. Die andere Sequenz stammt vom FK-001-Antikörper-Gen. Die Unterstreichung gibt die Position eines bei der Gensynthese verwendeten Primers an.
Fig. 6 (a) zeigt das Expressionsplasmid für die humanisierte B-B10-H-Kette, und (b) zeigt das Expressionsplasmid für die humanisierte B-B10-L-Kette. Die Symbole B-Ia bzw. dhfr bedeuten Lactamase-Gen und Dihydrofolatreduktase-Gen. VH, VK, Cγ1 bzw. Ck bedeuten H-Kette-V-Bereich-Gen, k-Kette-V-Bereich-Gen, γ1-Kette-konstanter Bereich-Gen und k-Kette-konstanter Bereich-Gen.
Fig. 7 zeigt die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese des gereinigten humanisierten B-B10. Die Bahnen von links nach rechts entsprechen M0, M1, M2, M3, M4, M5, M123, M45, M12345 und Maus-B-B10. H und L zeigen die Position der H-Kette bzw. der L-Kette an.
Fig. 8 zeigt die Hemmung der IL-2-abhängigen T-Zell-Proliferation auf Grund eines humanisierten B-B10. Der OD-Wert auf der Ordinate ist ein Index für die Anzahl der lebenden Zellen.
Fig. 9 zeigt die Hemmung der IL-2-abhängigen T-Zell-Proliferation auf Grund eines humanisierten B-B10. Der OD-Wert auf der Ordinate ist ein Index für die Anzahl der lebenden Zellen.
Erfindungsgemäß kann der humanisierte B-B10-Antikörper hergestellt werden durch:
1) Konstruktion eines Gens, das einen humanisierten Antikörper codiert, in dem mindestens der CDR im V-Bereich vom Maus-B-B10-MAb stammt und der andere Teil vom menschlichen Antikörper stammt;
2) Insertion des Gens, das den humanisierten Antikörper codiert, in einen Vektor, der fähig ist, in einer Wirtszelle fortzubestehen, um ein Expressionsplasmid zu erhalten;
3) Transfektion der Wirtszelle mit dem Plasmid, um eine den humanisierten B-B10-MAb produzierende Zelle zu etablieren; und
4) Züchtung der Zelle, um den humanisierten B-B10-MAb herzustellen.
Die Herstellung eines erfindungsgemäßen humanisierten Antikörpers mit Hilfe der DNA-Rekombinationstechnik wird nachstehend erläutert.

(i) Isolierung von RNA aus dem den Maus-B-B10-Antikörper produzierenden Hybridom

Mehrere herkömmliche Verfahren stehen zur Isolierung von RNA aus dem den Maus-B-B10-Antikörper produzierenden Hybridom zur Verfügung. Jedoch sind die prinzipi ellen Verfahren, die ihnen gemeinsam sind, die Zellyse in Gegenwart eines Protein denaturierenden Mittels (z. B. Guanidinthiocyanat) und die Isolierung von RNA durch Phenolextraktion oder Cäsiumchlorid-Dichtegradientenzentrifugation. Eine Oligo-dT-Cellulose-Säulenchromatographie ist gegebenenfalls zur weiteren Reinigung nützlich. Standardprotokolle für die Verfahren findet man in Lehrbüchern, zum Beispiel Sambrook J., Molecular Cloning, A Laboratory Manual; 2. Auflage, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA. Das nachstehend beschriebene Beispiel 1 gibt ein Beispiel für die Isolierung an.

(ii) Isolierung und Identifizierung von V-Bereich-cDNA

V-Bereich-cDNA kann aus der in (i) isolierten RNA unter Verwendung eines für den Maus-V-Bereich spezifischen Primers und einer reversen Transkriptase hergestellt werden. Die auf diese Weise erhaltene V-Bereich-cDNA kann durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung eines spezifischen Primers amplifiziert werden. Der für den Maus-V-Bereich spezifische Primer kann gemäß der Lehre von Coloma M. J., Biotechniques, Bd. 11 (1991), 152; Orlandi R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 86 (1989), 3833; oder Sastry L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 86 (1989), 5728 hergestellt werden. Eine ausführliche Erläuterung der PCR ist in dem vorstehend erwähnten Text von Sambrook J., insbesondere in Kapitel 14, angegeben. Die auf diese Weise erhaltene V-Bereich-cDNA kann unter Verwendung eines Plasmid- oder eines Phagenvektors cloniert werden. Die Aminosäuresequenz der clonierten cDNA kann durch das Didesoxysequenzierungs- (Messing J., Method in Enzymology, Bd. 101 (1983), 20) oder das Maxam-Gilbert-Verfahren (Maxam A. M. & Gilbert W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 74 (1977), 560) bestimmt werden. Unter Zugrundelegung der bestimmten DNA-Sequenz kann die entsprechende Aminosäuresequenz abgeleitet werden. Die Richtigkeit eines Teils der abgeleiteten Aminosäuresequenz kann durch den Vergleich mit der entsprechenden Aminosäureteilsequenz des Antikörperpeptids, die durch ein Proteinsequenzanalyseberät bestimmt wurde, bestätigt werden. Die Aminosäuresequenz des auf diese Weise identifizierten Maus-B-B10-V-Bereichs ist in den Fig. 1 und 2 gezeigt.

(iii) Konstruktion einer Aminosäuresequenz eines humanisierten B-B10-V-Bereichs

Ein menschlicher Antikörper, in den der Maus-B-B10-CDR transplantiert werden soll, kann unter Verwendung einer Datenbank, wie Genbank oder EMBL, ausgewählt wer den. Ein menschlicher Antikörper-V-Bereich mit einer großen Homologie zu der Aminosäuresequenz eines Maus-B-B10-V-Bereichs wird ausgewählt. Insbesondere wird der KAS- Antikörper für VH und der PAY-Antikörper für Vk empfohlen. Für die Aminosäurereste im Gerüst, die wie der CDR transplantiert werden sollen, kann man in Betracht ziehen, daß die Aminosäurereste, von denen vermutet wird, daß sie die Ausbildung der dreidimensionalen Struktur des CDR beeinflussen, mit einer gewissen Sicherheit auf der Basis der Analyse einer dreidimensionalen Struktur eines bekannten Antikörpers (kanonisches Strukturmodell; Nature, Bd. 342 (1989), 877) bestimmt wurden. Eine zusätzliche nützliche Information ist, daß die Aminosäurereste in dem Gerüst, die nahe dem CDR vorliegen, einen Einfluß auf die dreidimensionale Struktur des CDR haben können. Die dreidimensionale Struktur eines konstruierten humanisierten B-B10-V-Bereichs kann unter Verwendung eines geeigneten Computerprogramms, vorzugsweise BIOCES, erhältlich von Sumitomo Chemical Company, Limited, und Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited, vorhergesagt werden. Eine beispielhafte Konstruktion für erfindungsgemäße humanisierte Antikörper ist in Fig. 3 der beigefügten Zeichnungen und in Beispiel 5 gezeigt.

(iv) Konstruktion von DNA, die den V-Bereich eines humanisierten B-B10 codiert

Eine den V-Bereich eines humanisierten B-B10 codierende DNA kann durch eine Totalsynthese oder eine wiederholte PCR unter Verwendung einer Maus-B-B10- oder einer menschlichen V-Bereich-DNA als Matrize konstruiert werden. Zusätzliche zur Expression erforderliche DNA-Sequenzen, wie eine Signalsequenz und ein Intron, können mit der den V-Bereich eines humanisierten B-B10 codierenden DNA am 5'- oder 3'-Ende verknüpft sein. Das nachstehend beschriebene Beispiel 6 veranschaulicht die DNA-Synthese für einen humanisierten B-B10-V-Bereich mittels PCR unter Verwendung einer Maus-B-B10-V-Bereich-DNA als Matrize und die Verknüpfung der so erhaltenen DNA mit der den V-Bereich des menschlichen Antikörpers FK-001 (Japanische Patentveröffentlichung (ungeprüft) Nr. 26729/1988) codierenden DNA am 5'- oder 3'-Ende.
Eine beliebige Aminosäuresequenz im V-Bereich kann unter Anwendung der ortsspezifischen Mutagenese in vitro durch eine gewünschte Sequenz ersetzt werden.
Verschiedene humanisierte B-B10-V-Bereich-DNAs, die in der Weise erhalten wurden, wie vorstehend beschrieben, werden in Beispiel 7 veranschaulicht.

(v) Konstruktion eines Expressionsplasmids für einen humanisierten B-B10

Gegebenenfalls kann ein Translationsinitiationssignal, ein Transkriptionsinitiationssignal (Promotor), ein Enhancer, etc. an die humanisierte B-B10-V-Bereich-DNA angehängt werden. Spezifische Beispiele von Promotoren und Enhancern sind zum Beispiel SV40-Sequenzen (J. Mol. Appl. Genet., Bd. 1 (1983), 327), die vom Cytomegalievirus stammende Promotor/Enhancer-Sequenz (Cell, Bd. 41(1985), 521) und die LTR-Sequenz vom Roussarkomvirus (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 76 (1982), 6777). Beispiel 6 veranschaulicht die Verwendung der Promotor/Enhancer-Sequenz des Gens für den menschlichen FK-001-Antikörper. Die Verknüpfung der menschlichen B-B10-V-Bereich-DNA stromabwärts mit einem Gen für einen konstanten (c) Bereich stellt ein humanisiertes Antikörpergen bereit.
Gene für den konstanten Bereich sind von JCRB erhältlich. Die humanisierte B-B10-H-Kette und -L-Kette kann in verschiedene Vektoren oder den gleichen Vektor eingebracht werden, um ein Expressionsplasmid zu konstruieren. Beispiele für Expressionsvektoren sind der von SV40 abgeleitete Vektor (J. Mol. Appl. Genet., Bd. 1 (1982), 327) und der Rinderpapillomavirus-Vektor (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 79 (1982), 7147). Die Beispiele 8 und 9 veranschaulichen die Verwendung von pSV2dhfr (Mol. Cell. Biol., Bd. 1 (1981), 854) bzw. pUC 118 (Methods Enzymol., Bd. 153 (1987), 3).

(vi) Transfektion eines Expressionsplasmids für einen humanisierten B-B10

Einen humanisierten B-B10-Antikörper produzierende Zelten, die fähig sind, das humanisierte B-B10-Antikörper-Gen zu exprimieren, können mittels einer herkömmlichen DNA-Einführung unter Verwendung einer tierischen Zelle, die keine Antikörper produziert, vorzugsweise einer Maus-Myelomzelle, erhalten werden. Das Expressionsplasmid für das humanisierte B-B10-Antikörper-Gen kann gegebenenfalls zusammen mit einem Markerplasmid in eine Wirtszelle durch herkömmliche Verfahren, wie das Erythrocyten-Geisterverfahren (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 77 (1980), 2163), das DEAE-Dextran-Verfahren (Nature, Bd. 293 (1981), 79), das Calciumphosphatverfahren (Virology, Bd. 52 (1973), 456), das Protoplastenfusionsverfahren (Cell, Bd. 33 (1981), 717), das Elektroporationsverfahren (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 81 (1984), 7161) und das Lipofektionsverfahren (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 84 (1987), 7413) eingebracht werden.
Zellen, in die DNA eingebracht wurde, können durch Züchtung der transfizierten Zellen in einem G-418 oder Mycophenolsäure enthaltendem Selektionsmedium selektiert werden. Ein humanisierter B-B10-Antikörper in einem Kulturüberstand kann durch einen Enzymimmuntest (z. B. ELLSA) nachgewiesen werden, und eine den humanisierten B-B10 produzierende Zelle kann aus wirkstoffresistenten Zellen selektiert werden. Durch Züchtung der den humanisierten B-B10 produzierenden Zelle kann der humanisierte B-B10 aus dem Überstand erhalten und unter Anwendung einer herkömmlichen Chromatographie gereinigt werden. Die Produktivität des Antikörpers kann unter Verwendung eines Markers, der zur Genamplifikation fähig ist, und durch Zugabe eines selektiven Wirkstoffs zu dem Kulturmedium, wodurch die Amplifikation des Antikörpergens induziert wird, erhöht werden. Die Beispiele 10, 12 und 13 veranschaulichen die Konstruktion eines Expressionsplasmids für einen humanisierten B-B10 unter Verwendung einer Expressionseinheit des FK-001-Antikörpergens, die Etablierung einer den humanisierten B-B10 produzierenden Zelle durch Transfektion der Maus-Myelomzelle Sp2/0-Ag14 (erhältlich von der ATCC) als Wirtszelle und die Gewinnung des humanisierten B-B10.
Der gereinigte humanisierte B-B10 kann durch herkömmliche Verfahren, die üblicherweise bei der Herstellung eines biologischen Präparats angewendet werden, formuliert werden. Im wesentlichen wird der gereinigte Antikörper sterilfiltriert, zum Beispiel mit einem Membranfilter, gefolgt von der Zugabe eines Stabilisators.

(vii) Bewertung des humanisierten B-B10

Ein Enzymimmuntest, insbesondere ein ELISA, kann zur Bewertung des humanisierten B-B10 verwendet werden (Harlow E. und Lane D., Antibodies: A Laboratory Manual (1988), Cold Spring Harbor Laboratory, USA; besonders Absatz 14). Die in einem Kulturmedium vorhandene Menge des Antikörpers kann durch einen ELISA bestimmt werden, der einen Platte verwendet, an die ein Antikörper gegen den H-Kette-C-Bereich adsorbiert wurde.
Die biologische Aktivität eines humanisierten B-B10 kann durch Bestimmung der Hemmung der IL-2-abhängigen Proliferation aktivierter T-Zellen gemessen werden, wie in den Beispielen 11 und 14 veranschaulicht ist.
Der erfindungsgemäße humanisierte B-B10-Antikörper wird in einer Dosis von etwa 0,05-500 mg zur Behandlung von und zur Vorbeugung vor Erkrankungen, die durch eine Transplantat-Wirt-Reaktion oder eine Wirt-Transplantat-Reaktion hervorgerufen wer den, zur Vorbeugung vor einer Abstoßung bei der Transplantation von Knochenmark, Niere, Herz, Lunge, Bauchspeicheldrüse, Haut, Leber, etc., zur Therapie einer T-Zell-abhängigen Allergie oder von Autoimmunkrankheiten (z. B. Myocarditis, Diabetes mellitus, Myasthenia gravis, Lupuserythematosus, Morbus Crohn, Multiple Sklerose, AIDS, Meningitis, Arthritis) und zur Therapie von Tumoren, die den IL-2-Rezeptor exprimieren, wie T-Zell-Leukämie, parenteral verabreicht.

Vorteilhafte Wirkung der Erfindung

1) Die Halbwertszeit eines Maus-MAb im Blut beträgt etwa 15 Stunden, wenn er an einen Menschen verabreicht wird (J. Natl. Cancer Inst., Bd. 80 (1988), 937), während die Halbwertszeit von menschlichem IgG I etwa 2 Wochen beträgt. Der erfindungsgemäße humanisierte Antikörper ist mit dem menschlichen Antikörper eng verwandt und kann daher möglicherweise eine mit dem menschlichen Antikörper vergleichbare Halbwertszeit aufweisen. Es wird erwartet, daß der humanisierte B-B10 eine viel längere Halbwertszeit im Blut aufweist und im Vergleich mit dem Maus-B-B10 für einen längeren Zeitraum wirksam bleibt.
2) Die unter dem vorstehenden Punkt 1) beschriebene Wirkung ermöglicht es, die Häufigkeit der Verabreichung und die Dosis des Antikörpers zu verringern.
3) Die Antigenität eines humanisierten B-B10 ist viel geringer als die des Maus- B-B10. In der Tat induzierte die Verabreichung des humanisierten Antikörpers Campath-1H in zwei Fällen keinen anti-Campath-1H-Antikörper (Lancet, Bd. 2 (1988), 1394).
Demgemäß wird erwartet, daß ein humanisierter B-B10 bei der Verabreichung an einen Menschen im Gegensatz zum Maus-B-B10 höchstwahrscheinlich keinen unerwünschten neutralisierenden Antikörper induziert. Dies erlaubt die häufige Verabreichung eines humanisierten B-B10 über einen langen Zeitraum, was die therapeutischen Wirkungen verstärkt und den Umfang der Anwendungen erweitert.
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend durch Beispiele erläutert, ist aber nicht auf diese Beispiele begrenzt.

Beispiel 1

Extraktion und Reinigung von RNA aus einem B-B10-produzierenden Hybridom

Hybridome, die B-B10 produzieren, wurden in 4 M Guanidinthiocyanat (60ºC) suspendiert und mit einer 18 G-Nadel verbundenen Spritze behandelt; um die Viskosität zu verringern. Zu der Suspension wurde ein Äquivalent Phenol (60ºC) zugegeben und das Gemisch kräftig geschüttelt. Nach Zugabe von 1/4 Volumen 0,1 M Natriumacetat (pH 5,2)/10 mM Tris-HCl (pH 7,4)/1 mM EDTA und 1/2 Volumen eines Gemisches von Chloroform/Isoamylalkohol (24 : 1) wurde die Suspension kräftig geschüttelt, eisgekühlt und zentrifugiert. Die wäßrige Phase wurde aufgenommen und die RNA wurde durch eine Ethanolfällung wiedergewonnen.

Beispiel 2

Clonierung von cDNA, die den V-Bereich von B-B10 codiert

Die zwei cDNAs, die jeweils den VH- und Vk-Bereich des Maus-B-B10 codieren, wurden unter Verwendung eines spezifischen Primers synthetisiert, durch PCR amplifiziert, cloniert und wie folgt sequenziert. Die Primer "VH-rückwärts" und "VH-vorwärts", die sich an die N- bzw. C-Enden von VH anlagern, und die Primer "Vk-vorwärts " und "Vk-rückwärts", die sich an die N- bzw. C-Enden von Vk anlagern, wurden unter Verwendung eines Applied Biosystems Modell 380A-DNA-Synthetisiergeräts synthetisiert. Die Sequenzen dieser Primer sind nachstehend gezeigt.
VH-rückwärts: SEQ ID No. 10
SEQ ID No. 11
VH-vorwärts: SEQ ID No. 12
SEQ ID No. 13
Vk-rückwärts: SEQ ID No. 14
SEQ ID No. 15
Vk-vorwärts: SEQ ID No. 16
Der VH-vorwärts-Primer wurde an B-B10-RNA angelagert, um B-B10-VH-cDNA zu erhalten, daran schloß sich eine PCR unter Verwendung der VH-vorwärts- und VH- rückwärts-Primer an. Der Vk-vorwärts-Primer wurde an B-B10-RNA angelagert, um B-B10- Vk-cDNA zu erhalten, daran schloß sich eine PCR unter Verwendung der Vk-vorwärts- und Vk-rückwärts-Primer an. Die cDNA wurde in einem 20 ul-Reaktionsgemisch, enthaltend 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 1,5 mM MgCl&sub2;, 0,001% Gelatine, je 0,8 mM dATP, dGTP, dCTP und dTTP, 2 ul RNA und 1 uM Primer in Gegenwart von 20 Einheiten reverse Transkriptase(RAV-2, Takara Shuzo) für 30 Minuten bei 42ºC synthetisiert. Nach 5-minütigem Erwärmen des Gemisches auf 95ºC wurde eine PCR in einem 100 ul-Reaktionsgemisch, enthaltend 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 1,5 mM MgCl&sub2;, 0,001% Gelatine, je 0,4 mM dATP, dGTP, dCTP und dTTP unter Verwendung von 1 uM Primer durch 40maliges Wiederholen eines Reaktionszyklus, bestehend aus Erwärmen auf 95ºC für 30 Sekunden, 55ºC für 30 Sekunden und 72ºC für 1 Minute, durchgeführt. Die Produkte der PCR wurden dann unter Verwendung von T4-Polynucteotidkinase (Takara Shuzo) am 5'-Ende phosphoryliert und in die HincII-Stelle des Plasmidvektors pUC19 cloniert. Die DNA- Sequenz wurde durch das Didesoxyverfahren unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Primers für die Umgebung der Multiclonierungsstellen und eines Sequenase Version 2.0- DNA-Sequenzierungskits (United States Biochemical Corporation, USA) gemäß den vom Hersteller empfohlenen Protokollen bestimmt. Die identifizierten Sequenzen von DNA und, abgeleitet, von Aminosäuren können in den N- und C-terminalen Bereichen fehlerhaft sein. Jedoch wurde eine fehlerlose Sequenz des N-terminalen Bereichs von Vk ohne die Hilfe eines Primers erhalten, da sich der Vk-rückwärts-Primer oberhalb vom 5'-Ende von Vk anlagerte. Die fehlerlosen Sequenzen wurden wie in den Beispielen 3 und 4 beschrieben erhalten und in den beigefügten Zeichnungen, Fig. 1 und 2, angegeben.

Beispiel 3

Bestätigung der Aminosäuresequenz der N-terminalen Bereiche des Maus-B-B10-VH durch ein Gasphasen-Proteinsequenzanalysegerät

Der gereinigte Maus-B-B10-Antikörper wurde mit einer äquivalenten Menge eines Ladepuffers (125 mM Tris-HCl, pH 6,8, 4% Natriumdodecylsulfat (SDS), 10% Mercaptoethanol, 0,01% Bromphenolblau (BPB)) gemischt. Nach 5-minütigem Erwärmen auf 100ºC wurde das Gemisch auf einem 12,5%igen Polyacrylamidgel einer ELektrophorese (SDS- PAGE) unterzogen, durch Elektroblotting auf eine PVDF-Membran (Millipore, USA) in 10 mM CAPS (3-Cyclohexylaminopropansulfat, Dojin Chemicals, Inc.) übertragen und durch Färben mit Coomassie-Brillantblau R 250 (Wako Junyaku, Japan) sichtbar gemacht. Die die H-Kette enthaltende Bande wurde ausgeschnitten und die N-terminalen Aminosäuresequenzen gesammelter Peptidfragmente wurden durch ein Applied Biosystems Modell 470A/120A-Gasphasen-Proteinsequenzanalysegerät (J. Biol. Chem. 262 (1987), 10035) bestimmt. Die Ergebnisse sind nachstehend gezeigt.
N-terminale VH-Aminosäuresequenz: SEQ ID No. 17

Beispiel 4

Bestätigung der Aminosäuresequenz der C-terminalen Bereiche von Maus-B-B10-VH und -Vk

Die DNA-Sequenzen, die jeweils den C-terminalen Bereich von Maus-B-B10-VH und -Vk codieren, wurden durch PCR amplifiziert, cloniert und sequenziert. Die Primer VH2, MIG-1, Vk2 und MIK-1, die sich an VHCDR1, den N-terminalen Bereich von CH1, VkCDR1 bzw. den N-terminalen Bereich von Ck anlagern, wurden synthetisiert. Die Sequenzen dieser Primer sind nachstehend gezeigt.
VH2: SEQ ID No. 18
Vk2: SEQ ID No. 19
MIG-1: SEQ ID No. 20
MIK-1: SEQ ID No. 21
Der MIG-1-Primer wurde an B-B10-RNA angelagert, um B-B10-VH-cDNA zu erhalten, daran schloß sich eine PCR unter Verwendung der VH2- und MIG-1-Primer an. Der MIK-1-Primer wurde an B-B10-RNA angelagert, um B-B10-Vk-cDNA zu erhalten, daran schloß sich eine PCR unter Verwendung der Vk2- und MIK-1-Primer an. Die cDNA wurde in einem 50 ul-Reaktionsgemisch, enthaltend 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 1,5 mM MgCl&sub2;, 0,001% Gelatine, je 0,2 mM dATP, dGTP, dCTP und dTTP, 2 ul RNA und 1 uM Primer in Gegenwart von 20 Einheiten reverse Transkriptase (RAV-2, Takara Shuzo) für 1 Stunde bei 42ºC synthetisiert. Nach 10-minütigem Erwärmen des Gemisches auf 95ºC wurden 10 ul des Reaktionsgemisches einer PCR unterzogen, die in einem 100 ul-Reaktionsgemisch, enthaltend 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 1,5 mM MgCl&sub2;, 0,001% Gelatine, je 0,4 mM dATP, dGTP, dCTP und dTTP und 1 uM Primer durch 30maliges Wiederholen eines Reaktionszyklus, bestehend aus Erwärmen auf 95ºC für 1 Minute, 50ºC für 1 Minute und 72ºC für 2 Minuten, durchgeführt wurde. Die Produkte der PCR wurden durch eine Gelelektrophorese aufgetrennt und das gewünschte Produkt wurde aus dem Gel extrahiert und gereinigt. Das so erhaltene PCR-Produkt wurde unter Verwendung von T4- Polynucleotidkinase (Takara Shuzo) am 5'-Ende phosphoryliert und in die HineII-Stelle des Plasmidvektors pUC 19 cloniert. Die clonierte DNA wurde durch das Didesoxyverfahren unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Primers für die Umgebung der Multiclonierungsstellen und eines Sequenase Version 2.0-DNA-Sequenzierungskits (United States Biochemical Corporation, USA) gemäß den vom Hersteller empfohlenen Protokollen sequenziert. Die identifizierte DNA-Sequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz sind in den in den Fig. 1 und 2 gezeigten Sequenzen enthalten.

Beispiel 5

Konstruktion der Aminosäuresequenz humanisierter B-B10-VH- und Vk-Bereiche

Die Prinas-Datenbank wurde auf den VH-Bereich eines menschlichen Antikörpers mit einer Aminosäuresequenz, die die größte Homologie mit der Aminosäuresequenz des Maus-B-B10-VH-Bereichs aufweist, abgesucht, um den VH-Bereich des menschlichen Antikörpers KAS (63% Homologie) zu selektieren. Der Vk-Bereich des menschlichen Antikörpers PAY, der die größte Homologie mit dem Vk-Bereich des Maus-B-B10-Vk-Bereichs (57,0% Homologie) aufweist, wurde ebenfalls selektiert und in der gleichen Weise erhalten. Ein humanisierter B-B10-V-Bereich wurde konstruiert durch Vereinigen der Gerüste dieser menschlichen Antikörper mit dem Maus-B-B10-CDR, außer daß die Aminosäuren, die sich bei an Nrn. 27 bis 30 und 94 befinden, die innerhalb der Gerüste positioniert sind, als diejenigen des Maus-B-B10 belassen wurden. Der Grund dafür ist, daß die Aminosäuren aus den Gerüsten ausgewählt wurden, die einen Einfluß auf den CDR gemäß dem kanonischen Strukturmodell haben. Der so erhaltene humanisierte B-B10 wurde als M0 bezeichnet. Varianten wurden auch durch den Austausch einer Aminosäure oder mehrerer Aminosäuren eines humanisierten B-B10 durch die der Maus erhalten. Auf diese Weise wurden durch das Ersetzen der Aminosäure oder der Aminosäuren eines VH-Bereichs eines humanisierten B- B10 durch eine Aminosäure oder Aminosäuren der Maus die folgenden Varianten hergestellt. M1: an Nr. 48; M2 an Nrn. 66 und 67; und M3 an Nr. 105. Durch Ersetzen der Aminosäuren eines Vk-Bereichs eines humanisierten B-B10 durch eine Aminosäure oder Aminosäuren der Maus wurden folgende Varianten hergestellt: M4 an Nrn. 1 und 3; und M5 an Nr. 49. Bei den Varianten bei M1, 2, 3 und 5 wurden die auszutauschenden Aminosäuren ausgewählt, weil sie nahe dem CDR liegen und daher einen Einfluß auf die Struktur des CDR haben können. Es wird angenommen, daß die Aminosäure oder die Aminosäuren, die einen signifikanten Unterschied zwischen dem Maus-B-B10 und M0 beim Vergleich der vorhergesagten sterischen Strukturen, die durch BIOCES erhalten wurden, hervorruft bzw. hervorrufen, eine entgegengesetzte Wirkung auf die Aktivität haben, und daher wurde(n) sie durch die der Maus ausgetauscht. Als Ergebnis wurden M4 und M5 selektiert. Die Varianten, die die vorstehenden M1, M2 und M3 aufweisen, wurden als M123 bezeichnet, jene mit den M4 und M5 wurden als M45 bezeichnet, und diejenigen mit den M1, M2, M3, M4 und M5 wurden als M12345 bezeichnet. Die vorstehend erwähnten Bezeichnungen wurden zur Bezeichnung der Aminosäurevarianten selbst, von Antikörpern, die dieselben enthalten, und von Stämmen, die die Antikörper produzieren, gemeinsam verwendet. Die Beziehungen zwischen diesen Aminosäuresequenzen sind in Fig. 3 angegeben. Die Aminosäuren wurden gemäß der Lehre von Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4. Auflage, 1987, NIH, USA) durchnummeriert.

Beispiel 6

Synthese eines humanisierten B-B10-M0 durch PCR

Humanisierte B-B10-VH- und Vk-Gene wurden durch PCR unter Verwendung von cDNA, die Maus-B-B10-VH- und Vk-Breiche codiert, und eines Gens, das den menschlichen FK-001-Antikörper codiert (Biotechnology, Band 7 (1989), 805-810), synthetisiert. Die DNA-Sequenz eines humanisierten B-B10-V-Bereichs wurde konstruiert, wie in Fig. 4 und 5 gezeigt, so daß ein Signalpeptid und/oder ein Intron, das von einem Gen stammt, das den FK-001-Antikörper codiert, mit dem 5'- und 3'-Ende des Bereichs, der den humanisierten B-B10-V-Bereich codiert, ligiert werden kann. Das so erhaltene Gen enthielt die VH codierende DNA und die Vk codierende DNA, wobei jede von ihnen als ein SacI-BalJ- Fragment bzw. BamHI-HindIII-Fragment für die Clonierung isoliert werden kann. Die in den Fig. 4 und 5 gezeigten Primer wurden verwendet, um Maus-VH- und -Vk-DNAs zu erhalten und die PCR wurde unter Verwendung eines Gens, das den FK-001-Antikörper codiert, als Matrize schrittweise durchgeführt. Primer innerhalb des V-Bereichs können sich an das Maus-V-Bereich-Gen innerhalb des CDR-Bereichs anlagern. Die für die PCR verwen deten Bedingungen sind die gleichen, wie die in Beispiel 3 beschriebenen. Kurze PCR- Produkte wurden synthetisiert und die benachbarten zwei Produkte wurden kombiniert, um eine Matrize für die nächste PCR zu erhalten, usw. Schließlich wurden PCR-Produkte, die das gewünschte. Gen enthielten, das den V-Bereich eines humanisierten B-B10 codiert, erhalten und in den Phagenvektor M13mp 19 oder den Plasmidvektor pUC 18 cloniert. Die DNA-Sequenz des clonierten PCR-Produkts wurde durch das Didesoxyverfahren unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Primers (Takara Shuzo) für die Umgebung der Multiclonierungsstellen und eines Sequenase Version 2.0-DNA-Sequenzierungskits (United States Biochemical Corporation, USA) gemäß den vom Hersteller empfohlenen Protokollen bestimmt.
Das synthetisierte Gen, das den humanisierten B-B10-VH-Bereich codiert, wurde als ein SacI-BalI-Fragment ausgeschnitten und in die SacI-BalI-Stelle eines VH-Genfragments des FK-001-Antikörpers insertiert und schließlich in pUC18 als ein 5,2 kb-BamHI- HindIII-Fragment cloniert, das den FK-001-VH-Promotor, das den VH-Bereich codierende Gen des humanisierten B-B10 und den IgG-Enhancer enthielt. Das so erhaltene Plasmid wurde als Plasmid phB-B10VHEM0 bezeichnet.
Das Plasmid phB-B10VkM0 wurde durch Insertion eines 1,5 kb-BamHI-BamHI- Fragments, das den FK-001-Vk-Gen-Promotor enthielt, in eine BamHI-Stelle von Plasmid pUC 18, das das den humanisierten B-B10-Vk-Bereich codierende Gen cloniert in die BamHI-HindIII-Stelle umfaßt, konstruiert.

Beispiel 7

Einführung der Mutationen M1, M2, M3, M4 und M5 in VH- und Vk-Bereiche eines humanisierten B-B10 durch ortsspezifische in vitro-Mutagenese

Ein 5,2 kb-BamHI-HindIII-Fragment, das das VH-Gen von B-B10, den H-Kette- Promotor und den H-Kette-Enhancer enthielt, wurde durch Spaltung des Plasmid phB- B10VHEM0 mit den Restriktionsenzymen BamHI und HindIII, Aussetzen des Plasmids einer Elektrophorese auf einem Agarosegel und Extraktion des DNA-Fragments mittels Geneclean II erhalten.
Das DNA-Fragment wurde dann in die BamHI-HindIII-Stelle des Charomids pUC118 (Takara Shuzo) insertiert, um das Plasmid phB-B10VHE (118) zu erhalten. In der gleichen Weise wie vorstehend wurde das Plasmid phB-B10Vk (118) durch Übertragung eines 2,1 kb-SacI-HindIII-Fragments, das das Vk-Gen von Plasmid phB-B10VkM0 enthielt, in pUC 118 erhalten. Diese Plasmide wurden in E. coli MV 1184 (Nihon Gene) eingeschleust. Die so erhaltenen Transformanten wurden mit dem Helferphagen M 13K07 (Takara Shuzo) transfiziert und gezüchtet, wobei phagenähnliche Partikel erhalten wurden, die ringförmige einzelsträngige DNA enthielten. Nach der Reinigung der phagenähnlichen Partikel wurden die darin enthaltenen ringförmigen einzelsträngigen DNAs extrahiert und gereinigt, um sie als Matrize für die ortsspezifische in vitro-Mutagenese zu verwenden. Die Herstellung der ringförmigen einzelsträngigen DNA wurde gemäß dem Protokoll durchgeführt, das den pUC118-Produkten vom Lieferanten beigefügt worden war. Die für die ortsspezifische in vitro-Mutagenese verwendeten Primer wurden synthetisiert und gereinigt. Die Nucleotidsequenzen dieser DNAs sind nachstehend gezeigt.
Primer für Mutation M1: SEQ ID No. 22
Primer für Mutation M2: SEQ ID No. 23
Primer für Mutation M3: SEQ ID No. 24
Primer für Mutation M4: SEQ ID No. 25
Primer für Mutation M5: SEQ ID No. 26
Die ortsspezifische in vitro-Mutagenese wurde unter Verwendung des Primers M1, M2 oder M3, wenn die Matrize phB-B10VHE (118) war und des Primers M4 oder M5, wenn die Matrize phB-B10Vk (118) war, durchgeführt. Der Primer und die Matrize wurden gemischt und bei 70ºC für 3 Minuten inkubiert und dann bei 37ºC für 30 Minuten zur Primer- Anlagerung inkubiert. Das hybridisierte Produkt wurde dann in Gegenwart von dCTPαS, 6 Einheiten des Klenow-Fragments und 6 Einheiten der T4-DNA-Ligase bei 16ºC für 15 Stunden zur Verlängerung und Ligierung umgesetzt, und die nicht umgesetzten Matrizen- DNAs wurden entfernt. Durch die Behandlung mit dem Restriktionsenzym NciI (5 Einheiten) bei 37ºC für 90 Minuten wurde ein Einzelstrangbruch in die Matrizen-DNA eingeführt. Der größte Teil der Matrizen-DNAs wurden durch eine 30-minütige Behandlung mit 50 Einheiten ExoIII-Nuclease bei 37ºC entfernt. Am Ende des Prozesses wurde das so erhaltene Produkt in Gegenwart von 3 Einheiten E. coli-DNA-Polymerase I und 2 Einheiten T4-DNA-Ligase bei 16ºC für 3 Stunden umgesetzt, um eine ringförmige doppelsträngige DNA mit der eingeführten Mutation zu erhalten. Bei den vorstehenden Verfahren wurden die Reagenzien, die Puffer und die Säule zur Reinigung aus dem Oligonucleotid-gerichteten in vitro-Mutage nesesystem Version 2 (Amersham, Inc.) erhalten und gemäß dem vom Lieferanten gelieferten Protokoll verwendet. Das die DNA mit der eingeführten Mutation enthaltende Reaktionsgemisch wurde zur Transformation in E. coli JM109 verwendet, um Plasmid-DNA herzustellen. Die DNA wurde verwendet, um die. DNA-Sequenz an der Mutationsstelle durch das Didesoxysequenzierungsverfahren zu bestätigen. Für die Sequenzierung wurden der vorstehend erwähnte M1-, M2-, M3-, M4- oder M5-Primer oder ein im Handel erhältlicher Primer (Takara Shuzo) in der Umgebung der Multiclonierungsstelle von pUC19 als Primer und der Sequenase Version 2.0-DNA-Sequenzierungskit (United States Biochemical Corporation, USA) für die Reaktion verwendet. Diese wurden gemäß dem vom Lieferanten gelieferten Protokoll verwendet. Die mehrfache Mutagenese für M123 und M45 wurde durch die Wiederholung der vorstehend erwähnten Verfahren durchgeführt. Die Stellen der Mutationen sind in Fig. 3 angegeben.

Beispiel 8

Konstruktion eines H-Kette-Expressionsplasmids

Die Plasmide phB-B10VHEM0, -M1, -M2, -M3 und -M123, die jeweils ein 5,2 kb- BamHI-HindIII-Fragment, das das VH-Gen verschiedener B-B10-Antikörper, den H-Kette- Promotor und den H-Kette-Enhancer codiert, enthielten, wurden mit BamHI und HindIII gespalten, und die so erhaltenen Fragmente wurden einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, um das vorstehend angeführte gewünschte Fragment abzutrennen, das dann mittels Geneclean II extrahiert und gereinigt wurde. Ein anderes Plasmid, das ein getrennt cloniertes Gen enthielt, das den konstanten Bereich der menschlichen γ1-Kette (Cγ1) codiert, wurde mit HindIII und EcoRI gespalten und einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, um ein 16,9 kb-HindIII-EcoR1-Fragment abzutrennen, das das Cγ1-Gen enthält, das dann mittels Geneclean II extrahiert und gereinigt wurde. In der gleichen Weise wie vorstehend wurde das 4,2 kb-BamHI-EcoRl-Fragment aus Plasmid pSV2dhfr isoliert und gereinigt.
Die vorstehend angeführten drei DNA-Fragmente wurden kombiniert und unter Verwendung der T4-DNA-Ligase miteinander verknüpft, um die Plasmide phB-B10dhfr HG1M0, -M1, -M2, -M3 und -M123 zu erhalten, die verschiedene B-B10-H-Ketten exprimieren.

Beispiel 9

Konstruktion eines k-Kette-Expressionsplasmids

Das das clonierte FK-001-k-Kette-Gen enthaltende Plasmid (Biotechnology, Bd. 7 (1989), 805-810) wurde mit dem Restriktionsenzym HindIII gespalten, und die Spaltprodukte wurden einer Elektrophorese auf einem Agarosegel unterzogen, um ein 5,6 kb-HindIII- HindIII-Fragment abzutrennen, das das Gen für den konstanten Bereich der k-Kette (Ck) enthält, das dann unter Verwendung von Geneclean II extrahiert und gereinigt wurde. Die Plasmide phB-B10VkM0, -M4, -M5 und -M45, die jeweils ein Vk-Gen verschiedener B- B10-Antikörper enthielten, wurden mit dem Restriktionsenzym HindIII gespalten, gefolgt von einer BAP-Behandlung. Die Plasmide und das 5,6 kb-HindIII-HindIII-Fragment wurden mit T4-DNA-Ligase behandelt, was die Insertion der 5,6 kb-HindIII-HindIII-Fragmente in die HindIII-Stelle eines jeden Plasmids zur Folge hatte, um die Expressionsplasmide für verschiedene B-B10K-Ketten, phB-B10HKM0, -M4, -M5 und M45 zu erhalten.

Beispiel 10

Etablierung von verschiedene B-B10-Antikörper produzierende Zellinien durch das Lipofectinverfahren

Die Maus-Myelomzellinie Sp2/0-Ag14 (Sp2/0, ATCC CRL-1581) wurde in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM, Nissui, Japan), supplementiert mit 10% fötalem Kälberserum (FCS, Hyclone, USA), gezüchtet, bis sie die logarithmische Wachstumsphase erreichte. Von der Kultur wurden 5 · 10&sup6; Zellen durch Zentrifugation geerntet, in 0,5 ml serumfreiem Medium (Celgrosser H, Sumitomo Pharmaceuticals) suspendiert und in eine Vertiefung auf einer Platte mit 6 Vertiefungen eingebracht. 10 ug eines jeden der H-Kette-Expressionsplasmide, 10 ug L-Kette-Expressionsplasmid und 5 ug pSV2neo wurden mit dem Restriktionsenzym PvuI (Takara Shuzo) gespalten, um lineare DNAs zu erzeugen, und dann mit Ethanol ausgefällt, um die DNAs zu gewinnen. Die DNAs wurden in 250 ul Celgrosser H suspendiert.
50 ul Lipofectin wurden mit 200 ul Celgrosser H verdünnt und mit der vorstehenden DNA-Lösung gemischt, um den DNA/Lipofectin-Komplex herzustellen. Der DNA/Lipofectin-Komplex wurde zu den Zellen in der Platte mit 6 Vertiefungen zugetropft, und das so erhaltene Gemisch wurde bei 37ºC unter einer 5%igen CO&sub2;-Atmosphäre für 7 Stunden inku biert. Die Zellen wurden geerntet, in 10% FCS enthaltendem DMEM in einer Zelldichte von 5-10 · 10&sup4;/ml suspendiert, und die Suspension wurde in einer Menge von 100 ul pro Vertiefung auf eine Platte mit 96 Vertiefungen verteilt. Nach 1-2 Tagen wurden 100 ul DMEM, enthaltend 800 ug/ml G-418 (Gibco, USA) und 10% FCS, zu jeder Vertiefung zugegeben. Danach wurde die Hälfte des Mediums durch DMEM, enthaltend 400 ug/ml G- 418 und 10% FCS, alle 2-3 Tage ersetzt. Acht G-418-resistente Kolonien wurden nach etwa 2-wöchiger Züchtung gefunden. Die Menge des Antikörpers im Kulturüberstand aus jeder Vertiefung wurde durch einen Enzym-gebundenen Immunsorptionstest (ELISA) bestimmt, wie im folgenden Beispiel beschrieben wird, und die Vertiefungen, die eine verhältnismäßig hohe Antikörperkonzentration enthielten, wurden ausgewählt, und die Zellen aus solchen Vertiefungen wurden zur Verwendung als Antikörper-produzierende Zelle vereinigt.

Beispiel 11

Bestimmung der Menge des humanisierten B-B10 (menschliches IgG (γ, k)) durch einen ELISA

Die Bestimmung der Menge des humanisierten B-B10 (menschliches IgG (γ, k)) wurde wie folgt durchgeführt.
Ein anti-Mensch-IgG (γ-Kette)-Antikörper (Cappel, USA) wurde in Phosphatpuffer (pH 7,2, NaCl (8 g/l), KCl (0,2 g/l), NaHPO&sub4; · 12H&sub2;O (2,99 g/l) und KH&sub2;PO&sub4; (0,2 g/l)) (PBS) in einer Konzentration von 10 ug/ml gelöst und in eine Mikroplatte mit 96 Vertiefungen (Falcon, USA) ("Mikroplatte") in einer Menge von 100 ul pro Vertiefung eingebracht und dann bei 37ºC für 2 Stunden inkubiert.
120 ul PBS-Lösung, enthaltend 1% Rinderserumalbumin (BSA), wurden jeder Vertiefung zugegeben und bei 37ºC für 2 Stunden inkubiert, um den Bereich ohne gebundenes Protein auf der Mikroplatte zu blockieren.
Proben, die auf die Menge des Antikörpers getestet werden sollen, wurden mit PBS, enthaltend 0,05% Tween 20 (nachstehend bezeichnet als PBST), geeignet verdünnt und zu jeder Vertiefung in einem Verhältnis von 100 ul pro Vertiefung gegeben und bei 37ºC für 2 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Proben entfernt, und die Vertiefungen wurden 3mal mit PBST gewaschen, gefolgt von der Zugabe von 100 ul der zweiten Antikörperlösung pro Vertiefung und einer anschließenden 2-stündigen Inkubation bei 37ºC. Als zweiter Antikörper wurde ein Phosphatase-markierter, affinitätsgereinigter anti-Mensch- Immunglobulin-k-Kette-Antikörper (Tago, USA) verwendet. Nach Entfernung des zweiten Antikörpers und dreimaligem Waschen mit PBST wurden 100 ul eines Farb-entwickelnden Substrats (1 mg/ml Dinatrium-p-nitrophenylphosphat in 10% Diethanolaminpuffer (pH 9,1), enthaltend NaN&sub3; (0,2 mg/ml) und MgCl&sub2; · 6H,0 (0,1 mg/ml)) zu jeder Vertiefung gegeben und bei 37ºC umgesetzt. Nach der Umsetzung wurde die optische Dichte jeder Vertiefung bei 405 nm unter Verwendung einer Multiscan-Vorrichtung (Titertek) gemessen.
Dieser Test erlaubt nur die Messung des normalen menschlichen Ig, in dem die γ- Kette und die k-Kette miteinander verbunden sind.

Beispiel 12

Amplifikation des Antikörpergens durch die Verwendung von MTX und die erhöhte Produktion des Antikörpers

Die im vorhergehenden Beispiel beschriebene Antikörper-produzierende Zelle wurde in DMEM/10% FCS, enthaltend 50 nM MTX (Methotrexat, Gibco, USA) bei 1-5 · 10&sup5; Zellen/ml suspendiert, und das 100-200 ul-Aliquot wurde in jede Vertiefung einer Multiplatte mit 96 Vertiefungen verteilt und dann bei 37ºC unter einer 5%igen CO- Atmosphäre gezüchtet. Nach etwa 2-wöchiger Züchtung wurde die Menge des Antikörpers im Kulturüberstand aus jeder Vertiefung durch einen ELISA gemäß Beispiel 11 bestimmt.
Zellen wurden nur aus den Vertiefungen gesammelt, die einen hohen OD-Wert zeigten, d. h. eine hohe Produktionsrate des Antikörpers, und im großen Maßstab gezüchtet, um eine 50 nM MTX-resistente Zellinie zu etablieren. In ähnlicher Weise wurde eine 100 nM, 200 nM oder 400 nM MTX-resistente Zellinie in der gleichen Weise wie bei der 50 nM- resistenten Zellinie etabliert.
Die Antikörperkonzentration des Kulturüberstands einer jeden der Zellinien wurde durch einen ELISA unter Verwendung eines gereinigten MO-Antikörpers als Standard, der über eine Protein A-Säule affinitätsgereinigt worden war, wie im nachfolgenden Beispiel beschrieben, bestimmt.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1
Bei diesen Zellinien wurde eine erhöhte Menge des Antikörpers mit einer Zellinie mit erhöhter MTX-Resistenz produziert. Diese MTX-resistenten Zellinien wurden im größeren Maßstab gezüchtet und schließlich einmal in serumfreiem Medium (Cellgrowther- H, Sumitomo Pharmaceuticals) subkultiviert, um einen serumfreien Kulturüberstand zu erhalten.

Beispiel 13

Reinigung von Antikörpern

Der serumfreie Kulturüberstand, der verschiedene B-B10-Antikörper enthielt, wurde über eine Filtereinheit (Nalge, USA) mit einer Porengröße von 0,22 um gefiltert und auf eine Protein A-Cellophaine-Säule (0,5 ml) (Seikagaku Kogyo, Japan) in einer Durchflußrate von 1-2 ml/Minute aufgetragen. Nach Waschen der Säule mit 10 ml Immuno PureTM- Bindungspuffer (Pierce, USA) wurden die an die Säule gebundenen Antikörper mit 2 ml Immuno PureTM-Elutionspuffer (Pierce, USA) eluiert. Der Eluent wurde mit 0,2 ml 1 M Tris- HCl (pH 8,0) neutralisiert, gegen PBS dialysiert und durch Filtration unter Verwendung eines Filters mit einer Porengröße von 0,22 um sterilisiert, um einen gereinigten B-B10 zu erhalten. Die kolorimetrische Analyse unter Verwendung des BCATM-Protein-Testreagens (Pierce, USA) und gereinigtem Rinder-IgG (BioRad, USA) als Standard wies den Proteingehalt des gereinigten B-B10 nach. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2
Die vorstehenden Proben wurden einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese gemäß dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren unterzogen. Alle Proben, ausgenommen M123, zeigten keine andere Bande als H- und L-Kette-Banden, was zeigte, daß die Proben ausreichend gereinigt worden waren. Die Menge der Verunreinigung, die die bei M123 beobachtete zusätzliche Bande verursachte, war sehr gering, und daher wird angenommen, daß sie bei der Bewertung der Aktivität der Probe nicht kritisch ist.

Beispiel 14

Bewertung der biologischen Aktivitäten verschiedener B-B10-Antikörper-Varianten

Die biologischen Aktivitäten verschiedener gereinigter B-B10-Antikörper, die in den vorhergehenden Beispielen erhalten wurden, wurden untersucht. Die Bewertung der biologischen Aktivitäten verschiedener B-B10-Antikörper wurde durch den Vergleich ihrer Aktivitäten bezüglich der Hemmung der Proliferation von IL-2-abhängigen menschlichen aktivierten T-Zellen durchgeführt. So wurden durch Phytohämagglutinin (PHA) aktivierte menschliche T-Zellen und rekombinantes menschliches IL-2 (Colaborative Research, USA) auf eine Multiplatte mit 96 Vertiefungen (Falcon, USA) zur Zellkultur in Endkonzentrationen von 4-10 · 10&sup4; Zellen/100 ul/Vertiefung bzw. 0,25 ng/100 ul/Vertiefung ausplattiert. Nach Zugabe von B-B10-Proben verschiedener Konzentrationen wurde die Platte bei 37ºC drei Tage unter 5% CO&sub2; inkubiert. Zu jeder der Vertiefungen wurden 20 ul 2,5 mg/ml MTT (3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid, suspendiert in PBS) gegeben, und eine 4-stündige Züchtung wurde bei 37ºC unter 5% CO&sub2; durchgeführt. Das in lebenden Zellen erzeugte Formazan wurde in 40 mM HCl/Isopropanol gelöst, das zu den Vertiefungen in einer Konzentration von 100 ul/Vertiefung zugegeben worden war. Der OD&sub5;&sub7;&sub0;-Wert für jede Vertiefung wurde unter Verwendung des OD&sub6;&sub3;&sub0;-Werts als Referenz bestimmt und als ein Hinweis auf die Anzahl der lebenden Zellen verwendet. Die Ergebnisse sind in Fig. 8 gezeigt, die zeigt, daß die Proliferation von T-Zellen in Abhängigkeit von der Konzentration von B-B10 gehemmt wird. Unter den humanisierten B-B10-Antikörpern zeigte M5 die größte Hemmwirkung, für die nach dem Vergleich ihrer Arbeitskonzentrationen geschätzt wurde, daß sie nahezu der des Maus-B-B10 entspricht. Die M5-Aktivität war höher als die der multiplen Varianten M45 und M12345, die M5 enthielten.
SEQ ID No: 1
SEQUENZTYP: Aminosäure
SEQUENZLÄNGE: 5
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLTYP: Peptid
SEQ ID No: 2
SEQUENZTYP: Aminosäure
SEQUENZLÄNGE: 17
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLTYP: Peptid
SEQ ID No: 3
SEQUENZTYP: Aminosäure
SEQUENZLÄNGE: 9
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLTYP: Peptid
SEQ ID No: 4
SEQUENZTYP: Aminosäure
SEQUENZLÄNGE: 11
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLTYP: Peptid
SEQ ID No: 5
SEQUENZTYP: Aminosäure
SEQUENZLÄNGE: 7
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLTYP: Peptid
SEQ ID No: 6
SEQUENZTYP: Aminosäure
SEQUENZLÄNGE: 9
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLTYP: Peptid
SEQ ID No: 7
SEQUENZTYP: Aminosäure
SEQUENZLÄNGE: 4
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLTYP: Peptid
SEQ ID No: 8
SEQUENZTYP: Aminosäure
SEQUENZLÄNGE: 118
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLTYP: Peptid
SEQ ID No: 9
SEQUENZTYP: Aminosäure
SEQUENZLÄNGE: 107
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLTYP: Peptid
SEQUENZTYP: Nucleinsäure
SEQUENZLÄNGE: 22 Basenpaare
MOLEKÜLTYP: Synthetische DNA
SEQ ID No: 11
TYP: Nucleinsäure
SEQUENZLÄNGE: 22 Basenpaare
MOLEKÜLTYP: Synthetische DNA
SEQ ID No: 12
TYP: Nucleinsäure
SEQUENZLÄNGE: 20
MOLEKÜLTYP: Synthetische DNA
SEQ ID No: 13
SEQUENZTYP: Nucleinsäure
SEQUENZLÄNGE: 20
MOLEKÜLTYP: Synthetische DNA
SEQ ID No: 14
SEQUENZTYP: Nucleinsäure
SEQUENZLÄNGE: 16
MOLEKÜLTYP: Synthetische DNA
SEQ ID No: 15
SEQUENZTYP: Nucleinsäure
SEQUENZLÄNGE: 16
MOLEKÜLTYP: Synthetische DNA
SEQ ID No: 16
SEQUENZTYP: Nucleinsäure
SEQUENZLÄNGE: 15
MOLEKÜLTYP: Synthetische DNA
SEQ ID No: 17
SEQUENZTYP: Aminosäure
SEQUENZLÄNGE: 20
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLTYP: Peptid
SEQ ID No: 18
SEQUENZTYP: Nucleinsäure
SEQUENZLÄNGE: 24
MOLEKÜLTYP: Synthetische DNA
SEQ ID No: 19
SEQUENZTYP: Nucleinsäure
SEQUENZLÄNGE: 28
MOLEKÜLTYP: Synthetische DNA
SEQ ID No: 20
SEQUENZTYP: Nucleinsäure
SEQUENZLÄNGE: 24
MOLEKÜLTYP: Synthetische DNA
SEQ ID No: 21
SEQUENZTYP: Nucleinsäure
SEQUENZLÄNGE: 24
MOLEKÜLTYP: Synthetische DNA
SEQ ID No: 22
SEQUENZTYP: Nucleinsäure
SEQUENZLÄNGE: 28
MOLEKÜLTYP: Synthetische DNA
SEQ ID No: 23
SEQUENZTYP: Nucleinsäure
SEQUENZLÄNGE: 28
MOLEKÜLTYP: Synthetische DNA
SEQ ID No: 24
SEQUENZTYP: Nucleinsäure
SEQUENZLÄNGE: 28
MOLEKÜLTYP: Synthetische DNA
SEQ ID No: 25
SEQUENZTYP: Nucleinsäure
SEQUENZLÄNGE: 28
MOLEKÜLTYP: Synthetische DNA
SEQ ID No: 26
SEQUENZTYP: Nucleinsäure
SEQUENZLÄNGE: 28
MOLEKÜLTYP: Synthetische DNA

Claims

1. Humanisierter Antikörper mit einer spezifischen Bindungsaktivität für menschlichen IL-2-Rezeptor und mit einem variablen Bereich, der die Komplementarität bestimmende Bereiche (CDR) und Teilgerüste aufweist, wobei deren Aminosäuresequenzen, die gemäß der Kabat- Numerierung von Aminosäuren numeriert sind, folgendermaßen sind:

H-Kette-V-Bereich

CDR1: SEQ ID No. 1

CDR2: SEQ ID No. 2

CDR3: SEQ ID No. 3

L-Kette-V-Bereich

CDR1: SEQ ID No. 4

CDR2: SEQ ID No. 5

CDR3: SEQ ID No. 6

H-Kette-V-Bereich

27.-30. Aminosäure: SEQ ID No. 7

94. Aminosäure: Arg

L-Kette-V-Bereich

49. Aminosäure: Lys

2. Humanisierter Antikörper nach Anspruch 1, wobei der variable Bereich die folgende Aminosäuresequenz aufweist:

H-Kette-V-Bereich: SEQ ID No. 8

L-Kette-V-Bereich: SEQ ID No. 9

3. Humanisierter Antikörper nach Anspruch 1 oder 2, der ein reifes Antikörpermolekül, (Fab')&sub2;, Fab oder Fv umfaßt.

4. Humanisierter Antikörper nach Anspruch 1, 2 oder 3, der mit einem funktionellen Molekül verbunden ist.

5. Verfahren zur Produktion eines humanisierten Antikörpers, umfassend die Herstellung eines Plasmids, das einen humanisierten Antikörper nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4 exprimiert, das Einbringen des Plasmids in eine Wirtszelle, die Gewinnung einer stabilen Transformantenzelle und die Züchtung der erhaltenen Zelle, die den humanisierten Antikörper produziert.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Wirtszelle eine tierische oder menschliche Zelle ist.

7. Medikament in einer Dosierungsform für die parenterale Verabreichung, umfassend als wirksamen Bestandteil einen humanisierten Antikörper nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4.

8. Humanisierter Antikörper nach Anspruch 2, der den konstanten Bereich der menschlichen γ1-Kette (Cγ1) enthält.

9. Verfahren zur Produktion eines humanisierten Antikörpers, umfassend die Herstellung eines Plasmids, das einen humanisierten Antikörper nach Anspruch 8 exprimiert, das Einbringen des Plasmids in eine Wirtszelle, die Gewinnung einer stabilen Transformantenzelle und die Züchtung der erhaltenen Zelle, die den humanisierten Antikörper produziert.

10. Medikament in einer Dosierungsform für die parenterale Verabreichung, umfassend als einen wirksamen Bestandteil einen humanisierten Antikörper nach Anspruch 8.