ES2346868T3

ES2346868T3 - Antagonistas de receptor nogo.

Info

Publication number: ES2346868T3
Application number: ES03785123T
Authority: ES
Inventors: Daniel H. S. Lee; R. Blake Pepinsky; Weiwei Li; Sylvia A. Rabacchi; Jane K. Relton; Dane S. Worley; Stephen M. Strittmatter; Dinah Y. W. Sah
Original assignee: Yale University; Biogen Idec Inc; Biogen Idec MA Inc
Current assignee: Yale University; Biogen Inc; Biogen MA Inc
Priority date: 2002-08-10
Filing date: 2003-08-07
Publication date: 2010-10-21
Anticipated expiration: 2023-08-07
Also published as: CN1681838A; ZA200601909B; BR0313331A; ATE469913T1; NO20050685L; US7465705B2; RS20050129A; PL375301A1; IL173559A0; EA200500330A1; AU2003264033A1; US20050271655A1; PT1534736E; RS20060089A; KR20050062525A; JP2010207239A; JP2011173899A; DK1534736T3; CA2495121A1; US8030456B2

Abstract

Un polipéptido seleccionado entre el grupo constituido por SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, y SEQ ID NO: 5.

Description

Antagonistas de receptor Nogo.

Campo técnico de la invención

Esta invención está relacionada con la neurobiología y la biología molecular. Más especialmente, esta invención se refiere a polipéptidos inmunogénicos del receptor de Nogo 1, anticuerpos del receptor Nogo 1, fragmentos de unión de su antígeno, los receptores de Nogo solubles y sus proteínas de fusión y los ácidos nucléicos que los codifican. Esta invención además se refiere a las composiciones que comprenden, y los métodos para fabricar y utilizar, tales anticuerpos de receptores Nogo, y fragmentos de unión de su antígeno, los polipéptidos inmunogénicos del receptor Nogo 1, los receptores Nogo solubles y sus proteínas de fusión y los ácidos nucléicos que los codifican.

Antecedentes de la invención

Los axones y las dendritas de las neuronas son extensiones celulares alargadas de las neuronas. El extremo distal de un axón en extensión o neurita comprende una región especializada, conocida como el cono de crecimiento. Los conos de crecimiento perciben el entorno local y guían el crecimiento axonal hacia la célula diana de las neuronas. Los conos de crecimiento responden a varias indicaciones del entorno, por ejemplo, la adhesividad de la superficie, los factores de crecimiento, los neurotransmisores y los campos eléctricos. La orientación de crecimiento del cono implica varias clases de moléculas de adhesión, señales intracelulares, así como factores que estimulan e inhiben los conos de crecimiento. El cono de crecimiento de una neurita en crecimiento avanza a diferentes velocidades, pero típicamente a una velocidad de uno o dos milímetros diarios.

Los conos de crecimiento tienen forma de mano, con una extensión ancha plana (microespículas o filopodia) que se adhieren de manera diferente a las superficies en el embrión. Los filopodia están continuamente activos, algunos filopodia se retraen dentro del cono de crecimiento, mientras que otros continúan elongándose a través del substrato. Las elongaciones entre diferentes filopodia forman los lamelipodios.

El cono de crecimiento explora el área que está delante de él y a ambos lados con los lamelipodios y los filipodios. Cuando una elongación contacta con una superficie que es desfavorable al crecimiento, se retira. Cuando una elongación contacta con una superficie favorable al crecimiento, continúa extendiéndose y guía el crecimiento del cono en esa dirección. El crecimiento del cono puede guiarse por pequeñas variaciones de las propiedades de la superficie de los substratos. Cuando el cono de crecimiento alcanza una célula diana adecuada se crea una conexión
sináptica.

La función de las células nerviosas está muy influenciada por el contacto entre la neurona y otras células de su entorno inmediato (U. Rutishauser, T. M. Jessel, Physiol. Rev. 1988, 68, p.819). Está células incluyen las células gliales especializadas, los oligodendrocitos en el sistema nervioso central (SNC), y las células de Schwann en el sistema nervioso periférico (SNP), que envuelven el axón neuronal con mielina (una estructura aislante de membranas multicapa) (G. Lemke, en Una Introducción a la Neurobiologia molecular, Z. Hall, Ed [Sinauer, Sunderland, Mass., 1992], p. 281).

Mientras que las neuronas del SNC tienen capacidad de regenerarse después de una lesión, se reprimen de hacerlo debido a la presencia de proteínas inhibidoras presentes en la mielina y posiblemente por otro tipo de moléculas que se encuentran normalmente en su entrono local (Brittis and Flanagan, Neuron 2001, 30, pp. 11-14; Jones et al., J. Neurosci. 2002, 22, pag. 2792-2801; Grimpe et al., J. Neurosci. 2002, 22 pp. 3144-3160).

Se han caracterizado varias proteínas inhibidoras de mielina que se encuentran en los oligodendrocitos, p.ej. NogoA (Chen et al., Nature 2000, 403, 434-439; Grandpre et al., Nature 2000, 403, 439-444), glicoproteínas asociadas a mielina (MAG, McKerracher et al., Neuron 1994, 13, 805-811; Mukhopadhyay et al, Neuron 1994, 13, 757-767) y glicoproteínas de oligodendrocitos (OM-gp, Mikol and Stefansson, J. Cell. Biol. 1988, 106, 1273-1279). Cada una de estas proteínas por separado ha demostrado ser un ligando para el receptor neuronal 1 de Nogo (Wang et al., nature 2002, 417, 941-944; Liu et al., Science, 2002, 297, 1190-93; Grandpre et al., Nature 2000, 403, 439-444; Chen et al., Nature, 2000, 403, 434-439; Domeniconi et al., Neuron, 2002, 35, 283-90).

El receptor Nogo 1 es una proteína GPI anclada en la membrana que contiene 8 repeticiones ricas en leucina (Fournier et al., Nature 2001, 409, 341-346; WO 01/51520). En interacción con una proteína inhibidora (p. ej. NogoA, MAG y OM-gp), el complejo receptor Nogo 1 transduce las señales que conducen al colapso del cono de crecimiento y a la inhibición del crecimiento de neuritas.

Existe una necesidad urgente de moléculas que inhiban la unión del receptor Nogo 1 a sus ligandos y que atenúen el colapso del cono de crecimiento en presencia de mielina y la inhibición del crecimiento de neuritas.

Compendio de la invención

La materia objeto de la presente invención se establece en las reivindicaciones adjuntas. De manera más general, sin embargo, la presente descripción se refiere a polipéptidos solubles del receptor Nogo 1 y proteínas de fusión que los comprenden, y anticuerpos y sus fragmentos antigénicos dirigidos contra regiones inmunogénicas específicas del receptor Nogo 1. La descripción también se refiere a polipéptidos inmunogénicos del receptor Nogo 1 que se unen a los anticuerpos de la descripción. La descripción se refiere además a ácidos nucléicos que codifican los polipéptidos de esta descripción, los vectores y células hospedadoras que comprenden tales ácidos nucléicos y métodos para la preparación de los estos péptidos. Los anticuerpos, los receptores solubles y las proteínas de fusión receptoras de esta descripción antagonizan o bloquean los receptores Nogo 1 y son útiles para inhibir la unión del receptor Nogo 1 a sus ligandos, inhiben el colapso del cono de crecimiento en una neurona y disminuyen la inhibición del crecimiento o expansión (sprouting) de neuritas en una neurona.

En algunos casos, la descripción proporciona un polipéptido inmunogénico seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5.

En algunos casos, la descripción proporciona ácidos nucléicos que codifican polipéptidos inmunogénicos, vectores que comprenden tales ácidos nucléicos y células hospedadoras que comprenden tales ácidos nucléicos o vectores. En algunos casos, el ácido nucléico está unido operativamente a una secuencia de control de la expresión.

En algunos casos, la descripción proporciona un método para producir el polipéptido inmunogénico que comprende las etapas de (a) cultivar una célula hospedadora que comprende el ácido nucleico que codifica el péptido inmunogénico o el vector que codifica el mismo; y (b) recuperar el polipéptido de la célula hospedadora o del medio de cultivo.

En algunos casos, la descripción proporciona un método de producción de un anticuerpo que se une específicamente a un receptor Nogo 1, que comprende las etapas de (a) inmunizar un hospedador con un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5 o una célula hospedadora que expresa dicho polipéptido; y (b) recuperar el anticuerpo. En algunos casos, el anticuerpo o el fragmento de unión de su antígeno se producen por este método. En algunos casos, el anticuerpo o el fragmento de unión de su antígeno se une específicamente a un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5. En algunos casos, el anticuerpo o el fragmento de unión de su antígeno (a) inhibe el colapso del cono de crecimiento de una neurona; (b) disminuye la inhibición del crecimiento o expansión de neuritas en una neurona; y (c) inhibe la unión del receptor Nogo 1 a un ligando. En algunos casos, el anticuerpo o el fragmento de unión de su antígeno promueven la supervivencia de una neurona en peligro de muerte. En algunos casos, la neurona en peligro de muerte es de un animal, p ej., de un mamífero. En algunos casos, el crecimiento y la expansión de neuritas es un crecimiento axonal. En algunos casos, la neurona es una neurona del sistema nervioso central (SNC).

En algunos casos, el anticuerpo o el fragmento de unión de su antígeno es un anticuerpo monoclonal. En algunos casos, el anticuerpo o el fragmento de unión de su antígeno es un anticuerpo murino. En algunos casos, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico o un anticuerpo de cadena sencilla.

En algunos casos, la presente descripción proporciona una línea celular de un hibridoma seleccionada del grupo que consiste en HB 7E11 (ATCC® Nº de acceso PTA-4587), HB 1H2 ((ATCC® Nº de acceso PTA-4584), HB 3G5 (ATCC® Nº de acceso PTA-4586), HB 5B10 (ATCC® Nº de acceso PTA-4588) y HB 2F7 (ATCC® Nº de acceso PTA-4585). En algunos casos, la presente descripción proporciona un anticuerpo o fragmento de unión de su antígeno que se produce por la línea celular del hibridoma.

En algunos casos, el anticuerpo o fragmento de unión de su antígeno comprende una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (a) la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 15; (b) la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 16; y una secuencia de aminoácidos que comprende las secuencias de aminoácidos CDR1, CDR2 y CDR3 de SEQ ID NOs: 22, 23 y 24. En algunos casos, el anticuerpo y fragmento de unión de su antígeno comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (a) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; (b) las secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; y (c) una secuencia de aminoácidos que comprende las secuencias de aminoácidos CDR1, CDR2 y CDR3 de SEQ ID NOs: 19, 20 y 21. En algunos ejemplos, la presente descripción proporciona un ácido nucleico que codifica dicho anticuerpo o el fragmento de unión de su antígeno. En algunos casos, el ácido nucléico está unido operativamente a una secuencia de control de la expresión. En algunos casos, la descripción comprende un vector que comprende dicho ácido nucléico. En algunos casos, la descripción comprende una célula hospedadora que comprende dicho ácido nucléico o comprende un vector que comprende el ácido nucléico.

En algunos casos, el anticuerpo o el fragmento de unión de su antígeno inhibe competitivamente la unión de un anticuerpo producido por la línea celular del hibridoma de la presente descripción al receptor Nogo 1 o a un polipéptido inmunogénico seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5.

En algunos casos, la descripción proporciona un método para inhibir la unión del receptor Nogo 1 a un ligando, que comprende la etapa de contactar el receptor Nogo 1 con un anticuerpo o un fragmento de unión de su antígeno de esta descripción. En algunos casos, el ligando se selecciona del grupo que consiste en NogoA, NogoB, NogoC, MAG y OM-gp.

En algunos casos, la descripción proporciona un método para inhibir el colapso del cono de crecimiento de una neurona, que comprende la etapa de contactar la neurona con el anticuerpo o el fragmento de unión de su antígeno de esta descripción. En algunos casos, la descripción proporciona un método para disminuir la inhibición del crecimiento o expansión de neuritas en una neurona, que comprende la etapa de contactar la neurona con el anticuerpo o el fragmento de unión de su antígeno de esta descripción. En algunos casos, la neurona es una neurona del SNC. En algunos de estos métodos, el crecimiento o expansión de neuritas es un crecimiento axonal.

En algunos casos, la descripción proporciona un método para estimular la supervivencia de una neurona en peligro de muerte, que comprende contactar la neurona con una cantidad efectiva de (a) un anticuerpo anti-receptor Nogo 1 o el fragmento de unión de su antígeno o (b) un polipéptido de receptor Nogo 1. En algunos casos, el polipéptido del receptor Nogo 1 soluble es una proteína de fusión, p.ej., una proteína de fusión Fc. En algunos casos, la proteína de fusión es la proteína sNogoR344-Fc. En algunos casos, la neurona está in vitro. En algunos casos, la neurona es una neurona de mamífero que presenta signos o síntomas de, p. ej., esclerosis múltiple, ELA, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, neuropatía diabética, ictus, traumatismos craneoencefálicos y lesiones de la médula espinal.

En algunos casos, la descripción proporciona un método para estimular la supervivencia de una neurona en peligro de muerte, siendo la neurona de un mamífero, que comprende (a) proporcionar el cultivo de una célula hospedadora que expresa (i) un anticuerpo anti-receptor Nogo 1 o un fragmento de unión de su antígeno; o (ii) un polipéptido soluble del receptor Nogo 1; y (b) introducir la célula hospedadora en el mamífero en o cerca de la zona de la neurona.

En algunos casos, la descripción proporciona un método de terapia génica para estimular la supervivencia de una neurona en un mamífero, cuya neurona está en peligro de muerte, que comprende administrar en o cerca de la zona de la neurona un vector viral que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica (a) un anticuerpo anti-receptor Nogo 1 o un fragmento de unión de su antígeno; o (b) un polipéptido soluble del receptor Nogo 1, donde el anticuerpo anti-receptor Nogo 1, el fragmento de unión de su antígeno o el polipéptido soluble del receptor Nogo 1 se expresa a partir de la secuencia nucleotídica del mamífero en una cantidad suficiente para estimular la supervivencia de la neurona.

En algunos casos, la descripción proporciona un polipéptido soluble del receptor Nogo 1 que consiste esencialmente en un dominio N-terminal (NT), 8 dominios repetidos ricos en leucina (LRR) y un dominio C-terminal LRR (LRRCT) del receptor Nogo 1. En algunos casos, dicho polipéptido soluble del receptor Nogo 1 está unido a una secuencia señal. En algunos casos, el LRR comprende un LRR heterólogo. En algunos casos, la descripción proporciona un polipéptido soluble del receptor Nogo 1 seleccionado del grupo que consiste en: los restos aminoácidos 26-344 de SEQ ID NO: 6; Los restos aminoácidos 26-310 de SEQ ID NO: 7; los restos aminoácidos 26-344 de SEQ ID NO: 8; los restos aminoácidos 26-310 de SEQ ID NO: 9; los restos aminoácidos 27-344 de SEQ ID NO: 8; y los restos aminoácidos 27-310 de SEQ ID NO: 9. En algunos casos, la descripción proporciona un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido del receptor de Nogo 1 soluble. En algunos casos, el ácido nucléico está unido operativamente a una secuencia control de la expresión. En algunos casos, la descripción proporciona un vector que comprende dicho ácido nucléico. En algunos casos, la descripción proporciona una célula hospedadora que comprende dicho ácido nucléico o un vector que comprende el ácido nucléico.

En algunos casos, la descripción proporciona un método para producir un polipéptido soluble del receptor Nogo 1 de la descripción que comprende las etapas de (a) cultivar la célula hospedadora que comprende el ácido nucléico que codifica el polipéptido soluble del receptor Nogo 1 o un vector que comprende dicho ácido nucléico; y (b) recuperar el polipéptido a partir de la célula hospedadora o del medio de cultivo.

En algunos casos, la descripción proporciona una proteína de fusión del receptor Nogo 1 que comprende un receptor Nogo 1 soluble y un polipéptido heterólogo. En algunos casos, el polipéptido soluble del receptor Nogo 1 consiste esencialmente en un dominio N-terminal (NT), 8 dominios repetidos ricos en leucina (LRR) y un dominio C-terminal LRR (LRRCT) del receptor Nogo 1. En algunos casos, dicho polipéptido soluble del receptor Nogo 1 está unido a una secuencia señal. En algunos casos, la proteína de fusión del receptor Nogo 1 comprende un LRR heterólogo. En algunos casos, la proteína de fusión del receptor Nogo 1 comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: los restos aminoácidos 26-344 de SEQ ID NO: 6; los restos aminoácidos 26-310 de SEQ ID NO: 7; los restos aminoácidos 26-344 de SEQ ID NO: 8; los restos aminoácidos 26-310 de SEQ ID NO: 9; los restos aminoácidos 27-344 de SEQ ID NO: 8; y los restos aminoácidos 27-310 de SEQ ID NO: 9. En algunos casos, el polipéptido heterólogo comprende un región constante de una inmunoglobulina. En algunos casos, la región constante de la inmunoglobulina es una región constante de una cadena pesada de una inmunoglobulina. En algunos casos, la región constante de una cadena pesada de la inmunoglobulina es una región constante de una cadena pesada de una IgG. En algunos casos, el polipéptido heterólogo es una región Fc. En algunos casos, la proteína de fusión del receptor Nogo 1 es un dímero.

En algunos casos, la descripción proporciona una ácido nucléico que codifica una proteína de fusión del receptor Nogo 1. En algunos casos, el ácido nucléico que codifica la proteína de fusión del receptor Nogo 1 está unido operativamente a una secuencia de control de la expresión.

En algunos casos, la descripción proporciona un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión del receptor Nogo 1. En algunos ejemplos, el ácido nucleico codifica la proteína de fusión del receptor Nogo 1 unida operativamente a una secuencia de control de la expresión.

En algunos casos, la descripción proporciona un vector que comprende el ácido nucléico que codifica la proteína de fusión del receptor Nogo 1.

En algunos casos, la descripción proporciona una célula hospedadora que comprende el ácido nucléico que codifica la proteína de fusión del receptor Nogo 1 o el vector que comprende el ácido nucléico que codifica la proteína de fusión del receptor Nogo 1.

En algunos casos, la descripción proporciona un método para producir una proteína de fusión del receptor Nogo 1 que comprende las etapas de (a) cultivar la célula hospedadora que comprende un ácido nucléico que codifica la proteína de fusión del receptor Nogo 1 o un vector que comprende dicho ácido nucléico; y (b) recuperar la proteína de fusión del receptor Nogo 1 a partir de la célula hospedadora o del medio de cultivo.

En algunos casos, la descripción proporciona un método para inhibir la unión del receptor Nogo 1 a un ligando, que comprende la etapa de contactar el ligando con el polipéptido soluble del receptor Nogo 1 o con la proteína de fusión del receptor Nogo 1 de está descripción.

En algunos casos, la descripción proporciona un método para modular una actividad del ligando del receptor Nogo 1, que comprende la etapa de contactar un ligando del receptor Nogo 1 con un polipéptido soluble del receptor Nogo 1 o con una proteína de fusión del receptor Nogo 1 de está descripción.

En algunos casos la descripción proporciona un método para inhibir el colapso del cono de crecimiento de una neurona, que comprende la etapa de contactar un ligando del receptor Nogo 1 con el polipéptido soluble del receptor Nogo 1 o con la proteína de fusión del receptor Nogo 1 de está descripción. En algunos casos, la descripción proporciona un método para disminuir la inhibición del crecimiento o expansión de neuritas en una neurona, que comprende la etapa de contactar un ligando del receptor Nogo 1 con un polipéptido soluble del receptor Nogo 1 o con una proteína de fusión del receptor Nogo 1 de está descripción. En algunos casos, la neurona es una neurona del SNC. En algunos casos, el ligando se selecciona del grupo que consiste en NogoA, NogoB, NogoC, MAG y OM-gp. En algunos casos, el crecimiento o expansión de neuritas es un crecimiento axonal.

En algunos casos, la descripción proporciona una composición que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y un componente seleccionado entre (a) un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno según esta descripción; (b) un polipéptido soluble del receptor Nogo 1 según esta descripción; y (c) una proteína de fusión del receptor Nogo 1 según esta descripción. En algunos casos, la composición comprende además uno o más agentes terapéuticos adicionales.

Ahora según se ha establecido anteriormente, una parte de esta descripción aquí contenida proporciona la materia objeto de la presente invención, tal y como se define en las reivindicaciones adjuntas. Sin embargo, la descripción en su totalidad aquí contenida debe tenerse en cuanta para interpretar las reivindicaciones.

Descripción breve de las figuras

La figura 1 es una representación esquemática de la estructura del receptor Nogo 1. El sNogoR310 humano contiene los restos 26-310 y sNogoR344 contiene los restos 26-344. El sNogoR310 de rata contiene los restos 27-310 y sNogoR344 contiene los restos 27-344.

La figura 2 representa un gráfico de antigenicidad de la proteína del receptor Nogo 1 utilizando el programa Vectir Nti^{TM}. P-617 de rata es SEQ ID NO: 10 y P-618 de rata es SEQ ID NO: 11.

La figura 3A es un gráfico que representa la actividad de unión del anticuerpo anti-receptor Nogo 1, 7E11. El gráfico representa el efecto de la concentración de 7E11 en la unión de Nogo 66 al receptor Nogo 1. La figura 3B representa la actividad de unión del anticuerpo anti-receptor Nogo 1, 1H2. El gráfico presenta el efecto de la concentración de 1H2 en la unión de Nogo66 a sNogoR344-Fc (al que también nos referimos aquí y en la solicitud de patente de Estados Unidos 60/402.866 como Fc-sNogoR344 o sNogoR344Ig). Fc-MAG no compitió con Nogo66 en la unión a sNogoR344-Fc.

La figura 4 representa los resultados de ELISA para los anticuerpos 1H2, 3G5 y 2F7antiNogo-R-1. Se determinó el efecto de los anticuerpos en OD_{450} en presencia de antígenos inmovilizados. Los antígenos inmovilizados fueron sNogoR310-Fc (al que también nos referimos aquí y en la solicitud de patente de Estados Unidos 60/402.866 como Fc-sNogoR310 o sNogoR310Ig), sNogoR44-Fc, p-617, p-618, p-4, p-5 y ovoalbúmina y BSA (albúmina de suero bovina).

La figura 5 es un gráfico que representa los efectos de los anticuerpos monoclonales, 7E11, en el crecimiento de neuritas de DRG de rata en presencia de cantidades variables de mielina.

La figura 6a es un gráfico que representa el efecto de la unión de sNogoR310 a ^{125}I-Nogo66 y ^{125}I-Nogo40 en presencia de los siguientes competidores: Nogo66, Nogo40 y el sobrenadante del anticuerpo monoclonal anti-receptor Nogo 1.

La figura 6B representa la actividad de unión de ^{125}I-Nogo66 a sNogoR310.

La figura 7 es un gráfico que representa el efecto de sNogoR310-Fc en la unión de ^{125}I-Nogo40 a sNogoR310.

La figura 8 es un gráfico que representa la actividad de unión de sNogoR310-Fc en ^{125}I-Nogo40.

La figura 9 es un gráfico del efecto de sNogoR310 en el crecimiento de neuritas/célula en presencia o ausencia de mielina. La figura 9B es un gráfico del efecto de sNogoR310 en el crecimiento de neuritas en presencia o ausencia de mielina.

La figura 10A es un gráfico que representa el efecto de sNogoR310-Fc en el crecimiento de neuritas DGR p4 de rata en presencia o ausencia de cantidades crecientes de mielina. La figura 10B representa el número de neuritas/célula después de tratamiento con PBS, PBS + sNogoR310-Fc, 20ng de mielina y mielina + sNogoR310-Fc.

La figura 11 es un gráfico que representa el efecto de anticuerpo monoclonal 5B10 en el crecimiento de neuritas DRG/célula en presencia de cantidades crecientes de mielina.

La figura 12 es un gráfico que representa el efecto de sNogoR310-Fc según la puntuación BBB hasta 30 días después de la inducción de la lesión en un modelo de transección de la médula espinal de rata.

Las figuras 13A y 13B presentan la puntuación locomotora BBB en función del tiempo transcurrido después de la hemisección dorsal en WT (silvestres) o en ratones transgénicos de la Línea 08 o de la Línea 01. La figura 13C representa el ángulo plano inclinado máximo tolerado en función del tiempo transcurrido tras la lesión para WT y ratones transgénicos. La figura 13D muestra los fallos de las patas traseras durante el recorrido por una rejilla inclinada en función del tiempo transcurrido tras la lesión. En todos los gráficos se presentan los promedios \pm s.e.m. (error estándar) de 7-9 ratones de cada grupo. Los valores del grupo de transgénicos son diferentes estadísticamente a los de los ratones WT. (asteriscos dobles, P < 0,01; test de T de Student).

La figura 14A muestra la puntuación locomotora BBB en función del tiempo transcurrido después de la hemisección dorsal en el vehículo o en animales tratados con sNogoR310-Fc. La figura 14B muestra los errores de las patas traseras durante el recorrido por la rejilla en función del tiempo transcurrido desde la lesión. La figura 14B muestra el análisis de la huella revelando una longitud del paso más corta y una amplitud de paso mayor en las ratas control que en las ratas no lesionadas o lesionadas + sNogo R310-Fc. En todos los gráficos, se presento el promedio \pm s.e.m. de 7-9 ratas por cada grupo. Los valores del grupo sNogoR310-Fc son diferentes estadísticamente de los del control (Figuras 14A-B). Los valores del control son diferentes estadísticamente de los de las ratas no-SCI o SCI + sNogoR310-Fc de la figura 14C. (asterisco, p< 0.05; asteriscos dobles, p< 0,01; test de t de Student).

Descripción detallada de la invención Definiciones y técnicas generales

A no ser que se indique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en esta memoria tienen el mismo significado que el habitualmente entendido por el experto en la materia a la que pertenece está invención. En caso de conflicto, prevalecerán las definiciones que se incluyen en la presente solicitud. Además, a no ser que sea requerido de otra forma por el contexto, los términos en singular incluyen los plurales y los términos en plural incluyen el singular.

Aunque los métodos y los materiales similares o equivalentes a esos descritos en la presente memoria se pueden utilizar en la práctica o ensayo de la presente descripción, los materiales y los métodos adecuados se describen posteriormente. Los materiales, métodos y ejemplos son ilustrativos y no pretenden ser limitativos. Otras características y ventajas de la invención resultarán evidentes de la descripción detallada y las reivindicaciones.

A lo largo de esta descripción y reivindicaciones, se entiende que el término "comprenden", o variaciones como "comprende" o "que comprende", implica la inclusión de un número entero indicado o de un grupo de números enteros pero no la exclusión de cualquier otro número entero o grupo de números enteros.

Para definir más a fondo esta invención, se proporcionan los siguientes términos y definiciones.

Según la presente memoria, "anticuerpo" significa una inmunoglobulina intacta, o un fragmento de unión de su antígeno. Los anticuerpos de esta descripción, que incluyen los anticuerpos de la presente invención, pueden ser de cualquier isotipo o clase (p. ej., M, D, G, E y A) o de cualquier subclase (p.ej., (G1-4, A1-2) y pueden tener bien una cadena ligera kappa (\kappa) o lambda (\lambda).

Según la presente memoria, "Fc" significa una parte de una región constante de una cadena pesada de un anticuerpo que se puede obtener por digestión con papaína.

Según la presente memoria, "proteína de fusión de NogoR" significa que comprende una fracción del receptor Nogo 1 soluble fusionada con un polipéptido heterólogo.

Según la presente memoria, "anticuerpo humanizado" significa una anticuerpo en el que por lo menos una parte de las secuencias no humanas se substituyen por secuencias humanas. Se pueden encontrar ejemplos de cómo preparar anticuerpos humanizados en las patentes de Estados Unidos Nº 6.054.297, 5.886.152 y 5.877.293.

Según la presente memoria, "anticuerpo quimérico" significa un anticuerpo que contiene una o más regiones de un primer anticuerpo y una o más regiones de por lo menos otro anticuerpo. El primer anticuerpo y los anticuerpos adicionales pueden de la misma o de distintas especies.

Según la presente memoria y en la solicitud de patente de Estados Unidos 60/402.866, "receptor Nogo", NogoR", "NogoR-1", "NgR" y NgR-1" significan cada uno de ellos receptor Nogo 1.

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Polipéptidos inmunogénicos del receptor Nogo 1

En uno de los aspectos, la presente descripción, que incluye la presente invención, se refiere a los polipéptidos del receptor Nogo 1 que son inmunogénicos. En algunos casos de la presente descripción, el polipéptido inmunogénico consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: LDLS
DNAQLRVVDPTT (rata) (SEQ ID NO: 1); LD-LSDNAQLRSVDPAT (humano) (SEQ ID NO: 2); AVASGPFRPFQT
NQLTDEELLGLPKCCQPDAADKA (rata) (SEQ ID NO: 3); AVATGPYHPIWTGRATDEEPLGLPKCCQPDAAD
KA (humano) (SEQ ID NO: 4); y CRLGQAGSGA (ratón) (SEQ ID NO: 5).

En algunos casos, p.ej., en ciertas realizaciones de la presente invención, la descripción se refiere a una molécula de ácido nucléico que codifica un polipéptido de cualquiera de SEQ ID Nos: 1-5. En algunos casos, p. ej., en algunas realizaciones de la invención, la molécula de ácido nucléico está unida a una secuencia de control de la expresión (p. ej., pCDNA (I)).

La presente descripción se refiere también a un vector que comprende un ácido nucléico que codifica un polipéptido inmunogénico de la descripción. Algunos vectores proporcionan aspectos de la presente invención. En algunos casos, p.ej., en algunas realizaciones de la presente invención, el vector es un vector de clonado. En algunos casos, p. ej., algunas realizaciones de la presente invención, el vector es un vector de expresión. En algunos casos, p.ej., en algunas realizaciones de la presente invención, el vector contiene por lo menos un marcador de selección.

La presente invención se refiere también a las células hospedadoras que comprenden los ácidos nucléicos o vectores descritos anteriormente, p. ej., un ácido nucléico o vector de la presente invención.

La presente invención se refiere también a un método para producir un polipéptido inmunogénico de la presente descripción, p. ej., un polipéptido inmunogénico de la presente invención, que comprende la etapa de cultivar una célula hospedadoras. Las células hospedadoras que comprenden un ácido nucleico o un vector de la presente invención, y los métodos de cultivo de dichas células hospedadoras y la recuperación del polipéptido inmunogénico de la presente invención, forman otros aspectos de la presente invención como se establece en las reivindicaciones. En algunos casos, p.ej., en algunas realizaciones, la célula hospedadora es procariota. En algunos casos, p.ej., en algunas realizaciones, la célula hospedadora es eucariota. En algunos casos, p. ej., en algunas realizaciones, la célula hospedadora es una levadura.

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Anticuerpos

La presente descripción se refiere además a un anticuerpo o a un fragmento de unión de su antígeno que se une específicamente a un polipéptido inmunogénico del receptor Nogo 1 de la descripción, p. ej., un polipéptido inmunogénico del receptor Nogo 1 de la invención. En algunos casos, el anticuerpo o el fragmento de unión de su antígeno se une a un polipéptido que consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 1-5. Los anticuerpos y los fragmentos de unión de su antígeno de la presente invención se establecen en las reivindicaciones adjuntas. El anticuerpo o el fragmento de unión de su antígeno de la presente descripción, p. ej. un anticuerpo o un fragmento de unión de su antígeno de la presente invención, se pueden producir in vivo o in vitro. La producción del anticuerpo o del fragmento de unión de su antígeno se trata a continuación.

Un anticuerpo o su fragmento de unión de su antígeno de la presente descripción, p. ej., según la invención, inhibe la unión del receptor Nogo 1 a un ligando (p. ej., NogoA, NogoB, NogoC, MAG y OM-gp) y disminuye la inhibición del crecimiento o expansión de neuritas en presencia de mielina, especialmente el crecimiento axonal, y atenúa el colapso del cono de crecimiento en presencia de mielina.

En algunos casos, p. ej., en algunas realizaciones, el anticuerpo anti-receptor Nogo 1 o el fragmento de unión de su antígeno es murino. En algunos ejemplos, en algunas realizaciones, el receptor Nogo 1 es de rata. En otros ejemplos, p. ej., en otras realizaciones el receptor-1 Nogo es humano. En algunos ejemplos, p. ej., en algunas realizaciones, el anticuerpo anti-receptor Nogo 1 o el fragmento de unión de su antígeno es recombinante, modificado, humanizado y/o quimérico.

\newpage

En algunos ejemplos, p. ej., en algunas realizaciones, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en: monoclonal 7E11 (ATCC® nº de acceso PTA-4587); monoclonal 1H2 (ATCC® nº de acceso PTA-4584); monoclonal 2F7 (ATCC® nº de acceso PTA-4585); monoclonal 3G5(ATCC® nº de acceso PTA-4586); y monoclonal 5B10(ATCC® nº de acceso No. PTA-4588).

En algunos ejemplos, p. ej., en algunas realizaciones, el anticuerpo es el anticuerpo policlonal 46.

Ejemplos de fragmentos de unión de los antígenos son, Fab, Fab', F(ab')_{2}, Fv, Fd, dAb, y fragmentos que contienen regiones determinantes de la complementariedad (CDR), anticuerpos de cadena sencilla (scFv), anticuerpos quiméricos, diacuerpos y polipéptidos que contienen por lo menos una parte de una inmunoglobulina que sea suficiente para conferir la unión especifica del antígeno al polipéptido (p. ej., inmuno adhesinas).

Según la presente memoria, Fd significa un fragmento que consiste en los dominios V_{H} y C_{H1}; Fv representa un fragmento que consiste en dominios V_{L} y V_{H} de una única rama de un anticuerpo; y dAb significa un fragmento que consiste en un dominio V_{H} (Ward et al., Nature 341:544-546, 1989). Según la presente invención, anticuerpo de cadena sencilla (scFv) significa un anticuerpo en el que una región V_{L} y una región V_{H} se emparejan para formar moléculas monovalentes por medio de un ligando sintético que les permite ser preparados como una proteína de cadena sencilla. (Bird et al., Science 242:423-426, 1988 y Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 85:5879-5883, 1988). Según la presente invención, diacuerpo significa un anticuerpo biespecífico en el que los dominios V_{L} y V_{H} se expresan en una única cadena polipeptídica, pero utilizan un ligando que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios al mismo tiempo, forzando por lo tanto que los dominios se emparejen con dominios complementarios de otras cadenas y crear dos sitios de unión al antígeno (véase p. ej., Holliger, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 90:6444-6448, 1993, y Poljak, R. J., et al., Structure 2:1121-1123, 1994). Según la presente invención, inmuno adhesina que se une específicamente a un antígeno de interés, quiere decir una molécula en la cual se pueden incorporar uno o más CDRs, bien covalente o no covalentemente.

En algunos ejemplos, la descripción proporciona una subunidad de un polipéptido de anticuerpo del receptor Nogo 1 de la presente descripción, p. ej., de un anticuerpo de un receptor de Nogo, donde la subunidad del polipéptido se selecciona del grupo que consiste en: (a) una cadena pesada o su región variable; y (b) una cadena ligera o su región variable.

En algunos casos, la descripción proporciona un ácido nucléico que codifica la cadena pesada o su región variable, o la cadena ligera o su región variable, o una subunidad del polipéptido de un anticuerpo del receptor Nogo 1 de la presente descripción, p. ej. un anticuerpo del receptor Nogo 1 de la presente invención.

En algunos ejemplos, la descripción proporciona una región hipervariable (CDR) de un anticuerpo del receptor Nogo 1 de la presente descripción, p. ej. un anticuerpo del receptor Nogo 1 de la presente invención, o un ácido nucléico que codifica un CDR.

Inmunización

Los anticuerpos de la presente descripción, que incluyen los anticuerpos de la presente invención, pueden generarse por la inmunización del hospedador adecuado (p.ej., vertebrados, que incluyen humanos, ratones, ratas, ovejas, cabras, cerdos, ganado, caballos, reptiles, peces, anfibios, y huevos de pájaros, reptiles y peces). Tales anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales.

En algunos casos de la presente descripción, el hospedador se inmuniza con un polipéptido inmunogénico del receptor Nogo 1 de la presente descripción, p. ej. con un polipéptido inmunogénico del receptor Nogo 1 de la invención. En otros casos, el hospedadora se inmuniza con un receptor Nogo 1 asociado a la membrana celular de una célula intacta o alterada y los anticuerpos de la descripción, p. ej. los anticuerpos de la invención, se identifican por unirse a un polipéptido inmunogénicos del receptor Nogo 1 de la invención. Algunos métodos para producir anticuerpos mediante hospedadores inmunizados proporcionan otros aspectos de la presente invención como se establece en las reivindicaciones adjuntas.

En algunos casos, p. ej. en algunas realizaciones, el antígeno del receptor Nogo 1 se administra con un adyuvante para estimular la respuesta inmune. Los adyuvantes a menudo necesitan administrase junto al antígeno para desencadenar una respuesta inmune en el antígeno. Estos adyuvantes son normalmente substancias insolubles o no degradables que promueven la inflamación inespecífica, con la incorporación de fagocitos mononucleares en sitio de inmunización. Los ejemplos de adyuvantes incluyen, pero se limitan a, adyuvante de Freund's, RIBI (dipéptidos de muramilo), ISCOM (complejos inmuno estimulantes) o sus fragmentos.

Para una revisión de los métodos para preparar anticuerpos, véase p. ej. Harlow and Lane (1988), Antibodies, A Laboratory Manual, Yelton, D.E. et al. (1981); Ann. Rev. Of Biochem., 50. pag. 657-80., y Ausubel et al. (1989); Current Protocols in Molecular Biology (New York: John Willey & Sons). La determinación de la inmuno reactividad con un polipéptido inmunogénico del receptor Nogo 1 de la descripción, p. ej., con un polipéptido inmunogénico del receptor Nogo 1 de la invención se puede por cualquiera de los varios métodos bien conocidos en la técnica, que incluyen, p.ej. prueba de inmuno transferencia y ELISA.

Producción de anticuerpos y líneas celulares que producen anticuerpos

Los anticuerpos monoclonales de la presente descripción, que incluyen los anticuerpos monoclonales de la presente invención, se pueden preparar por los procedimientos estándar como se describe, p. ej. en Harlow and Lane (1988), ya mencionado.

En resumen, en un período de tiempo adecuado el animal se sacrifica y el nódulo linfático y/o las células-B esplénicas se inmortalizan por una cualquiera de las varias técnicas bien conocidas en la técnica, que incluyen pero no se limitan a la transformación, con EBV o por fusión con una línea celular inmortalizada, tal como células de mieloma. A partir de ese momento, las células se clonan separadamente y los sobrenadantes de cada clon se examinan para la producción de un anticuerpo específico para el polipéptido inmunogénico del receptor Nogo 1 de la descripción. p. ej., para un anticuerpo específico para el polipéptido inmunogénico del receptor Nogo 1 de la invención. Los métodos de selección, clonado y expansión de los hibridomas son bien conocidos en la técnica. De manera similar, los métodos para identificar la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de los genes de la inmunoglobulina son conocidos en la técnica.

Otras técnicas adecuadas para producir un anticuerpo de la presente descripción, p. ej. un anticuerpo de la presente invención, implican la exposición in vitro de los linfocitos al receptor Nogo 1 o a un polipéptido inmunogénico de la descripción, p.ej. a un polipéptido inmunogénico de la invención, o bien, la selección de bibliotecas de anticuerpos en fagos o vectores similares. Véase Huse et al., Science, 246, pp. 1275-81 (1989). Los anticuerpos útiles de la presente descripción, p. ej., de la presente invención, se pueden utilizar con o sin modificación.

Los antígenos (en el caso del receptor Nogo 1 o de un polipéptido inmunogénico de la presente descripción) y los anticuerpos pueden marcarse por la unión, bien covalente o no covalentemente, a una sustancia que proporciona una señal detectable. Se conocen en la técnica marcadores y técnicas diversas de conjugación y pueden emplearse en la ejecución de la invención. Los marcadores adecuados incluyen, pero no se limitan a, radionucleótidos, enzimas, substratos, cofactores, inhibidores, agentes fluorescentes, agentes quimioluminiscentes, partículas magnéticas y similares. Las patentes que muestran de estos marcadores incluyen las patentes EE.UU. 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345: 4.277.437; 4.275.149 y 4.366.241. También se pueden producir inmunoglobulinas recombinantes (véase la patente EE.UU. 4.816.567).

En algunos ejemplos de la presente descripción, p. ej., en algunos realizaciones de la invención, un anticuerpo tiene especificidades múltiples de unión, como un anticuerpo bifuncional preparado por una cualquiera de técnicas conocidas por los expertos en la técnica que incluyen la producción de hibridomas híbridos, intercambio de disulfuro, entrecruzamiento químico, adición de ligandos peptídicos entre dos anticuerpos monoclonales, la introducción de dos grupos de cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulinas en una línea celular específica y así sucesivamente (véase más adelante para una discusión más detallada).

Los anticuerpos de esta descripción, p. ej., los anticuerpos de la presente invención, pueden ser también anticuerpos monoclonales humanos, por ejemplo aquellos producidos por células humanas inmortalizadas, por ratones SCID-hu u otros animales no-humanos capaces de producir anticuerpos "humanos".

Bibliotecas de expresión de fagos

Los anticuerpos anti-receptor Nogo 1 de esta descripción, p. ej. los anticuerpos anti-receptor Nogo 1 de la presente invención, se pueden aislar por escrutinio en una biblioteca combinatoria de anticuerpos. Se rastrean modelos de bibliotecas combinatorias que se unan a polipéptidos inmunogénicos del receptor Nogo 1 de la descripción, p. ej. a polipéptidos inmunogénicos del receptor Nogo 1 de la invención, tales como una biblioteca de expresión del fago scFv, preparada usando ADNc de V_{L} y V_{H} preparados a partir de RNAm derivado de un animal inmunizado con un polipéptido inmunogénico del receptor Nogo 1 de la descripción, p. ej. un polipéptido inmunogénico del receptor Nogo 1 de la invención. Las metodologías para preparar y escrutar estas bibliotecas son conocidas en la técnica. Hay métodos disponibles comercialmente y materiales para generar bibliotecas de expresión de fagos (p. ej. "Pharmacia Recombinant Phage Antibody System", catálogo no. 27-9400-01; el kit de expresión de fagos "The Stratagene SurfZAP^{TM}", catálogo nº 240612; y otros de MorphoSys). Hay también otros métodos y reactivos que se pueden utilizar para generar y escrutar las bibliotecas de expresión de anticuerpos (véase p. ej., Ladner et al Patente EE.UU. nº 5.223.409; Kang et al. Publicación PCT nº WO 92/18619; Dower et al. Publicación PCT Nº WO 91/17271; Winter et al. Publicación PCT Nº WO 92/20791; Maryland et al Publicación PCT Nº WO 92/15679; Breitling et al. Publicación PCT Nº WO 93/01288; McCafferty et al. Publicación PCT Nº WO 92/01047; et al. Publicación PCT Nº WO 92/09690; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226:889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nucl. Acids Res. 19:4133-4137; and Barbas et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982).

Después de escrutar y el aislar un anticuerpo anti-receptor Nogo 1 de la descripción, p. ej. un anticuerpo anti-receptor Nogo 1 de la invención, a partir de una biblioteca de expresión de inmunoglobulina recombinante, el ácido nucleico que codifica el anticuerpo seleccionado se puede recuperar un paquete de expresión (p. ej. del genoma del fago) y subclonar en otros vectores de expresión por técnicas de ADN recombinante estándar. Si se desea, el ácido nucleico puede además manipularse para crear otras formas de anticuerpos de la presente descripción, p. ej. otras formas de anticuerpos de la invención, como se describe a continuación. Para expresar un anticuerpo aislado por escrutinio de una biblioteca combinatoria, el ADN que codifica las regiones de cadena pesada y de cadena ligera o sus regiones variables se clona en un vector de expresión recombinante y se introduce en una célula hospedadora de mamífero, como se describió anteriormente.

Cambio de clase

Los anticuerpos anti-receptor Nogo 1 de la descripción, que incluyen los anticuerpos anti-receptor Nogo 1 de la invención, pueden ser de cualquier isotipo. Se puede introducir un anticuerpo de cualquier isotipo deseado por cambio de clase. Para el cambio de clase, los ácidos nucleicos que codifican V_{L} y V_{H}, que no incluyen ninguna secuencia de nucleótidos que codifica C_{L} o C_{H}, se aíslan utilizando métodos conocidos en la técnica. Los ácidos nucleicos que codifican V_{L} o V_{H} están entonces unidos operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica C_{L} o C_{H} de una molécula de inmunoglobulina de una clase deseada. Esto se puede conseguir utilizando un vector o un ácido nucleico que comprenda una cadena C_{L} o C_{H}, como se describe anteriormente. Por ejemplo, anticuerpo anti-receptor Nogo 1 de la descripción, p. ej. un anticuerpo anti-receptor Nogo 1 de la invención, que fuese originalmente IgM puede cambiarse de clase a una IgG. Además, el cambio de clase se puede utilizar para convertir una subclase de IgG a otra, p. ej. de IgG1 a IgG2.

Anticuerpos Mutados

Los anticuerpos o los fragmentos unión de su antígeno de la presente descripción, p.ej. los anticuerpos o los fragmentos unión de su antígeno de la presente invención, pueden mutarse en los dominios variables de las cadenas pesadas y/o ligeras para alterar una propiedad de unión del anticuerpo. Por ejemplo, se puede hacer una mutación en uno o más regiones CDR para aumentar o disminuir el K_{d} del anticuerpo por el receptor Nogo 1, para incrementar o disminuir K_{off}, o para alterar la especificidad de unión del anticuerpo. Las técnicas de mutagénesis dirigida son bien conocidas en la técnica. Véase p. ej. Sambrook et. al. y Ausubel et al. mencionado anteriormente. En un ejemplo preferido, p. ej. en una realización preferida, las mutaciones se realizan en un resto aminoácido que se sepa que puede ser cambiado comparado con la línea germinal en una región variable de un anticuerpo anti-receptor Nogo 1 de la descripción, p. ej. de un anticuerpo anti-receptor Nogo 1 de la invención, como sea conveniente. En algunos ejemplos, por ejemplo en algunas realizaciones, las mutaciones se realizan en uno o mas restos aminoácidos que se sabe que están cambiados en comparación con la línea germinal en una región variable de un anticuerpo anti-receptor Nogo 1 de la presente descripción, p.ej. un anticuerpo anti-receptor Nogo 1 de la invención, como sea conveniente. En otro ejemplo, p. ej. en otra realización, un ácido nucleico que codifica una región variable de la cadena ligera o de la cadena pesada de un anticuerpo se muta en una o mas regiones del marco. Una mutación se puede realizar en una región del marco o en un dominio constante para incrementar la vida media. Una mutación en una región del marco o en un dominio constante también puede realizarse para alterar la inmunogenicidad de un anticuerpo, para proporcionar un lugar para la unión covalente o no covalentemente a otra molécula, o para alterar propiedades como la fijación complementaria. Las mutaciones se pueden realizar en cada una de las regiones del marco, del domino constante y de las regiones variables en un anticuerpo con una sola mutación. Como alternativa, las mutaciones se pueden realizar en una sola de las regiones del marco, en las regiones variables o en el dominio constante de un anticuerpo con una sola mutación.

Anticuerpos de fusión e Inmuno adhesinas

Se puede preparar un anticuerpo de fusión o una inmuno adhesina que comprende todo o una parte del anticuerpo anti-receptor Nogo 1 de la presente descripción, p.ej. un anticuerpo anti-receptor Nogo 1 de la presente invención, unido a otro polipéptido. En algunos ejemplos, solo la región variable del anticuerpo anti-receptor Nogo 1 está unida al polipéptido. En otros ejemplos, el domino V_{H} del anticuerpos anti-receptor Nogo 1 de la descripción, p. ej. un anticuerpo anti-receptor Nogo 1 de esta invención, está unido a un polipéptido, mientras que el dominio V_{L} del anticuerpo está unido a un segundo polipéptido que se asocia con el primer polipéptido de forma que permite que los dominios V_{H} y V_{L} interaccionen uno con el otro para formar un sitio de unión de anticuerpos. En otros ejemplos, el dominio V_{H} está separado de V_{L} por un ligando que permite que los dominios V_{H} y V_{L} interaccionen uno con el otro (ver a continuación en Anticuerpos de Cadena sencilla). El anticuerpo V_{H}-ligando-V_{L} se une después al polipéptido de interés. El anticuerpo de fusión es útil para dirigir un polipéptido hacia una célula o tejido que expresa el ligando del receptor Nogo 1. El polipéptido de interés puede ser un agente terapéutico, como una toxina, o puede ser un agente de diagnostico, como una enzima que puede visualizarse fácilmente, como la peroxidasa de rábano picante. Además, se pueden crear anticuerpos de fusión en los que dos (o más) anticuerpos de cadena sencilla se unen uno al otro. Esto es útil si se quiere crear un anticuerpo divalente o polivalente en una cadena de polipéptidos sencilla, o si se quiere crear un anticuerpo biespecífico.

Anticuerpos de cadena sencilla

La presente descripción incluye un anticuerpo de cadena sencilla (scFv) que se une a un polipéptido inmunogénico del receptor Nogo 1 de la presente descripción, p. ej. un polipéptido inmunogénico del receptor Nogo 1 de la invención. Para producir el ScFv, el ADN que codifica V_{H} y V_{L} está unido operativamente al ADN que codifica un ligando flexible, p. ej., codifica la secuencia de aminoácidos (Gly_{4}-Ser)_{3} (SEQ ID NO:10), de manera que las secuencias V_{H} y V_{L} pueden expresarse como proteínas de cadena sencilla contiguas, con las regiones V_{H} y V_{L} unidas por el ligando flexible (véase p,ej., Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU 85:5879-5883; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554). El anticuerpo de cadena sencilla puede ser monovalente, si se usa solamente una V_{H} y V_{L}, bivalente, si se usan dos V_{H} y V_{L},, o polivalente, si se usan más de dos V_{H} y V_{L.} Algunos anticuerpos de cadena sencilla de la presente descripción forman un aspecto de la presente invención, como se establece en las reivindicaciones adjuntas.

Anticuerpos Quiméricos

También se proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión biespecífico en el cual una especificidad es para un polipéptido inmunogénico del receptor Nogo 1 de la descripción, p. ej. un polipéptido inmunogénico del receptor Nogo 1 de la invención. Se puede generar un anticuerpo quimérico que se una específicamente a un polipéptido inmunogénico del receptor Nogo 1 de la descripción p. ej. a un polipéptido inmunogénico del receptor Nogo 1 de la invención, por medio de un dominio de unión y a una segunda molécula por medio de un segundo dominio de unión. El anticuerpo quimérico se pude producir por medio de técnicas recombinantes de biología molecular, o pueden ser conjugadas juntas físicamente. Además, se puede generar un anticuerpo de cadena sencilla que contenga más de una V_{H} y V_{L} que se una específicamente a un polipéptido inmunogénico de la descripción, p. ej. a un polipéptido inmunogénico de la invención, y a otra molécula que esté asociada con la atenuación de colapso del crecimiento del cono de crecimiento y la inhibición de crecimiento y expansión de neuritas en presencia de mielina. Se pueden generar estos anticuerpos biespecíficos utilizando técnicas que son bien conocidas en la técnica por ejemplo, Fanger et al. Immunolo Methods 4: 72-81 (1994) y Wright and Harris, mencionado anteriormente y en conexión con (iii) véase p.ej., Traunecker et al. Int. J. Cancer (Suppl.) 7: 51-52 (1992).

En algunos ejemplos, los anticuerpos quiméricos se preparan utilizando una o más regiones variables de un anticuerpo de la presente descripción, p.ej. de un anticuerpo de la invención. En otro caso, el anticuerpo quimérico se prepara utilizando una o más regiones CDR de dicho anticuerpo.

Anticuerpos marcados y derivatizados

Un anticuerpo o un fragmento de unión de su antígeno de la presente descripción, p. ej. un anticuerpo o un fragmento de unión de su antígeno de la invención, se pueden derivatizar o ligar a otra molécula (p. ej., a otro péptido o proteína). En general, el anticuerpo o el fragmento de unión de su antígeno se derivatiza de manera que la unión a un polipéptido inmunogénico de la descripción, p. ej. a un polipéptido inmunogénico de la invención, no se afecta de manera adversa por la derivatización o marcaje. Por ejemplo, un anticuerpo o parte de un anticuerpo de la presente descripción, p. ej. un anticuerpo o parte de un anticuerpo de la invención, se puede unir funcionalmente (por acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o otras formas) a una o más entidades moleculares, tales como otro anticuerpo (p. ej. un anticuerpo biespecífico o un diacuerpo), un agente de detección, un agente citotóxico, un agente farmacéutico, y/o una proteína o péptido que pueda mediar en la asociación del anticuerpo o el fragmento de unión de su antígeno con otra molécula (tales como una región del núcleo de estreptavidina o una cola de polihistidina).

En algunos ejemplo, p. ej. en algunas realizaciones, se produce un anticuerpo derivatizado por entrecruzamiento de dos o más anticuerpos (del mismo tipo o de diferentes tipos, p. ej., para crear anticuerpos específicos). Los agentes de entrecruzamiento incluyen aquellos que son heterobifuncionales, que tienen dos grupos reactivos distintos separados por un espaciador adecuado (p. ej., éster de maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida) o homobifuncionales (p. ej., disuccinimidil suberato). Estos ligandos están disponibles en Pierce Chemical Company, Rockford III.

En algunos casos, p. ej. en algunas realizaciones, el anticuerpo derivatizado es un anticuerpo marcado. Como ejemplos, los agentes de detección con los que se puede derivatizar anticuerpos o porciones de anticuerpos son compuestos fluorescentes, que incluye fluoresceína, isocianato de fluoresceína, rodamina, cloruro de 5-dimetilamina-1-naftalensulfonilo, picoeritrina, fósforos lantánidos y similares. También se puede marcar un anticuerpo con enzimas que son útiles para la detección, como peroxidasa de rábano picante, \beta-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina, glucosa oxidasa y similares. En los ejemplos, p.ej. en las realizaciones que están marcadas con enzimas detectables, el anticuerpo se detecta añadiendo reactivos adicionales que utiliza la enzima para producir un producto de reacción detectable. Por ejemplo, la peroxidasa de rábano picante con peróxido de hidrogeno y diamino benceno. También se puede marcar un anticuerpo con biotina, y detectarlo mediante la medida indirecta de la unión de avidina o estreptavidina. Un anticuerpo también se puede marcar con epítopos polipeptídicos predeterminados reconocidos por un reportero secundario (p. ej. pares de secuencias de cremallera de leucina, sitos de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metales, colas de epitopos).

Un anticuerpo anti-receptor Nogo 1 o su fragmento de unión de su antígeno pueden estar marcados también con un aminoácido marcado radioactivamente. El radiomarcaje se puede usar bien para fines diagnósticos o terapéuticos. El anticuerpo anti-receptor Nogo 1 marcado radiactivamente se puede usar, por ejemplo, para determinar los niveles del receptor Nogo en un sujeto. Además el anticuerpo anti-receptor Nogo 1 marcado radiactivamente se puede utilizar para tratar terapéuticamente la lesión de la médula espinal. Los ejemplos de marcajes para polipéptidos incluyen, aunque no se limitan a, los siguientes radioisótopos o radio nucleótidos - 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99TC, 111In, 125I, 131I.

Un anticuerpo anti-receptor Nogo 1 o su fragmento de unión de su antígeno pueden también derivatizarse con un grupo químico, como el polietilenglicol (PEG), un grupo metilo o etilo, o un grupo carbohidrato. Estos grupos pueden ser útiles para mejorar las características biológicas del anticuerpo, p.ej., para aumentar la vida media o para aumentar la unión al tejido.

Caracterización de los anticuerpos anti-receptor Nogo 1 Clase y subclase de los anticuerpos anti-receptor Nogo 1

Se puede determinar la clase o subclase de los anticuerpos anti-receptor Nogo 1 por cualquier método conocido en la técnica. En general, la clase o subclase de un anticuerpo se pude determinar utilizando anticuerpos que sean específicos para una clase o subclase de anticuerpos en particular. Estos anticuerpos están disponibles comercialmente. La clase o subclase se pueden determinar por ELISA, Inmuno transferencia así como por otras técnicas. Como alternativa, la clase o subclase se pueden determinar secuenciando todos o una parte de los dominios constantes de las cadenas pesadas y/o ligeras del anticuerpo, comparando sus secuencias de aminoácidos con secuencias de aminoácidos conocidas de diversas clases y subclases de inmunoglobulinas, y determinando la clase y subclase de los anticuerpos.

Afinidad de unión del anticuerpo anti-receptor Nogo 1 al receptor Nogo 1

La afinidad de unión y la tasa de disociación de un anticuerpo anti-receptor Nogo 1 de la descripción p.ej. de un anticuerpo anti-receptor Nogo 1 de la invención, a un polipéptido inmunogénico del recepetor-1 de Nogo, p. ej. a un polipéptido inmunogénico del receptor Nogo 1, se puede determinar por cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, la afinidad de unión se puede medir por ELISA competitivos, RIA, BIAcore o tecnología KinExA. La tasa de disociación se puede medir también por BIAcore o tecnología KinExa. La tasa de afinidad o disociación se miden por resonancia del plasmón de superficie utilizando, p.ej. un BIAcore.

Se determinó que las K_{d} de 7E11 y 1H2 eran 1 x 10^{-7} y 2 x 10^{-8} M respectivamente.

Inhibición de la actividad del receptor Nogo 1 por el anticuerpo anti-receptor Nogo 1

En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-receptor Nogo 1 o un fragmento de unión de su antígeno de la presente descripción, p. ej. un anticuerpo anti-receptor Nogo 1 o un fragmento de unión de su antígeno de la invención, inhibe la unión del receptor-1 a un ligando. El IC_{50} de esta inhibición se puede medir por cualquier método conocido en la técnica, p. ej., por ELISA, RIA o Antagonismo Funcional. En algunos casos, p. ej. en algunas realizaciones, el IC_{50} está entre 0,1 y 500 nM. En algunos casos, p. ej. en algunas realizaciones, el p. ej. en algunas realizaciones, el IC_{50} está entre 10 y 400 nM. Aún en otros casos, p. ej. en otras realizaciones, el anticuerpo o parte del mismo tiene un IC_{50} está 60 nM y 400 nM. Se determinó que el IC_{50} de 7E11 y 1H2 era de 400 nM y 60 nM respectivamente, en un ensayo de unión. Véase también la Tabla 3, incluida posteriormente.

En síntesis, un experto en la técnica, provisto de las enseñanzas de esta descripción, incluida esta invención, tiene a disposición una variedad de métodos que pueden ser utilizados para alterar las propiedades biológicas de los anticuerpos de la descripción, que incluyen los anticuerpos de la invención, incluyendo los métodos que incrementarían o disminuirían la estabilidad o vida media, inmunogenicidad, toxicidad, afinidad o producción de una molécula de anticuerpo dada, o alterarla de cualquier otra forma que pueda hacerla más adecuado para una aplicación especial.

Se describen a continuación las composiciones y usos, que comprenden los anticuerpos de la presente descripción p. ej. los anticuerpos de la presente invención

Polipéptidos solubles del receptor Nogo 1 Proteína

Un receptor Nogo 1 completo, consiste en una secuencia señal, una región N-terminal (NT), ocho repeticiones ricas en leucina (LRR), una región LRRCT (un dominio de repetición rico en leucina C-terminal de ocho repeticiones ricas en leucina), una región C-terminal (CT) y un anclaje GPI (véase Fig. 1).

Algunos ejemplos de la presente descripción, que incluyen algunas realizaciones de la invención, proporcionan un polipéptido del receptor Nogo 1. Los polipéptidos del receptor Nogo 1 de la descripción, incluyendo los de la invención, comprenden un dominio NT; 8 LRR y un dominio LRRCT y carecen de una señal de secuencia y de un anclaje GPI funcional (es decir, ningún anclaje GPI o un anclaje GPI que carece de habilidad para asociarse eficazmente a una membrana celular).

En algunos ejemplos de la presente descripción, un polipéptido del receptor Nogo 1 comprende un LRR heterólogo. En algunos ejemplos, un polipéptido del receptor Nogo 1 comprende 2, 3, 4, 5, 6, 7, o 8 LRR heterólogos. Un LRR heterólogo significa un LRR obtenido a partir de una proteína distinta del receptor Nogo 1. Modelos de proteínas de las que se pueden obtener LRR heterólogas son el receptor tipo toll (TLR1.2); proteína rica en repeticiones de leucina de activación de células T, decorin; OM-gp, factor de crecimiento de tipo insulina que se une a la subunidad lábil acida proteica de slit y robo; y receptor 4 tipo toll.

En algunos casos, p. ej. en algunas realizaciones de la presente invención, la descripción proporciona un polipéptido soluble del receptor Nogo 1 de 319 aminoácidos (receptor-1 soluble de Nogo 344, SNogoR1-344, o sNogoR344) (restos 26-344 de SEQ ID NO: 6 y 8 o restos 27-344 de SEQ ID NO:8). En algunos casos, p. ej. en algunas realizaciones de la presente invención, la descripción proporciona un polipéptido soluble del receptor Nogo 1 de 285 aminoácidos (receptor-1 soluble de Nogo 310, SNogoR1-310, o sNogoR310) (restos 26-310 de SEQ ID NO: 7 y 9 o restos 27-310 de SEQ ID NO: 9). Véase Fig. 1

TABLA 1 Secuencias de Polipéptidos del receptor Nogo-1 Humano y de Rata

1

Los polipéptidos solubles del receptor Nogo 1 de la descripción, p.ej. los polipéptidos solubles del receptor Nogo 1 de la invención, se pueden usar para inhibir la unión al ligando del receptor Nogo 1 y actuar como un antagonista de los ligandos del receptor Nogo 1. Los polipéptidos solubles del receptor Nogo 1 de la descripción, p. ej. los polipéptidos solubles del receptor Nogo 1 de la invención, pueden utilizarse para disminuir la inhibición del crecimiento o expansión de neuritas en una neurona, tal como el crecimiento axonal y para inhibir el colapso del cono de crecimiento de una neurona en presencia de mielina. En algunos ejemplos, la neurona es una neurona del SNC.

Sorprendentemente, sNogoR310 y SnogoR344, bloquean la unión de NogoA, NogoB, NogoC, MAG y OM-gp al receptor Nogo 1.

En algunos casos, el polipéptido del receptor Nogo 1 de la descripción, p. ej. el polipéptido del receptor Nogo 1 de la invención, es un componente de una proteína de fusión que comprende además un polipéptido heterólogo. En algunos casos, el polipéptido heterólogo el dominio constante de una inmunoglobulina. En algunos casos, el dominio constante de la inmunoglobulina es una cadena pesada del dominio constante. En algunos casos, el polipéptido heterólogo es un fragmento Fc. En algunos casos el Fc esta unido al extremo C-terminal del polipéptido del receptor Nogo 1 soluble de la descripción, p. ej. del polipéptido del receptor Nogo 1 soluble de la invención. En algunos casos, la proteína de fusión del receptor Nogo 1 es un dímero. Las proteínas de fusión de la invención se establecen en las reivindicaciones adjuntas.

Moléculas de ácido nucleico de la presente invención

La presente descripción proporciona un ácido nucleico que codifica el polipéptido de la descripción, incluyendo los polipéptidos de cualquiera de las secuencias SEQ ID NOS 1-9. Algunos ácidos nucléicos de la presente descripción forman aspectos de la presente invención, éstos se establecen en las reivindicaciones adjuntas. En algunos ejemplos de la descripción, p. ej. en algunas realizaciones de la invención, el ácido nucléico codifica un polipéptido seleccionado entre el grupo que consiste en los restos aminoácidos 26-344 del receptor Nogo 1 como se muestra en SEQ ID NO: 6 y 8 o los restos aminoácidos 27-344 del receptor Nogo 1 como se muestra en la SEQ ID NO: 8. En algunos casos, p.ej. en algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido seleccionado entre el grupo que consiste en los restos aminoácidos 26-310 del receptor Nogo 1 como se muestra en SEQ ID NO: 7 y 9 o los restos aminoácidos 27-310 del receptor Nogo 1 como se muestra en la SEQ ID NO: 9. Según la presente memoria, "ácido nucléico" significa ADN genómico, ADNc, ADNm y moléculas antisentido, así como ácidos nucléicos basados en esqueletos alternativos o que incluyen bases alternativas bien derivadas de fuentes naturales o sintéticos. En algunos casos, p. ej. en algunas realizaciones, el ácido nucléico comprende además un promotor transcripcional y opcionalmente una secuencia señal cada una de los cuales está unida operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de la presente descripción, p. ej. el polipéptido de la presente invención, según se considere adecuado.

También se proporciona un ácido nucléico que codifica una proteína de fusión del receptor Nogo 1 de la presente descripción, p. ej. una proteína de fusión del receptor Nogo 1 de la invención. En algunos ejemplos, p. ej. en algunas realizaciones, el ácido nucléico codifica una proteína de fusión del receptor Nogo 1 de la invención, que incluye una proteína de fusión que comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en restos aminoácidos 26-344 del receptor Nogo 1 como se muestra en SEQ ID NO: 6 y 8 o los restos aminoácidos 27-344 de SEQ ID NO: 8 y los restos aminoácidos 26-310 del receptor Nogo 1 como se muestra en SEQ ID NO: 7 y 9 o los restos aminoácidos 27-310 de SEQ ID NO: 9. En algunos casos, p. ej. en algunas realizaciones, el ácido nucléico que codifica la proteína de fusión del receptor Nogo 1 comprende además un promotor transcripcional y opcionalmente una secuencia señal. En algunos casos, p. ej. en algunas realizaciones, la región constante de la inmunoglobulina es una región constante de la cadena pesada. En algunos casos, p. ej. en algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos codifica además una región constante de la cadena pesada inmunoglobulina unida a una región bisagra. En algunos casos, p. ej. en algunas realizaciones, el ácido nucléico codifica además Fc. En algunos casos, p. ej. en algunas realizaciones, las proteínas de fusión del receptor Nogo 1 comprenden un fragmento Fc.

Los ácidos nucléicos de la presente descripción, p. ej. los de la presente invención, pueden además modificarse de modo que contengan un etiqueta detectable a efectos de diagnóstico o de sondas. Se conoce una variedad de estos marcajes en la técnica y se pueden utilizar fácilmente con las moléculas codificantes descritas en esta memoria. Los marcajes adecuados incluyen, pero no se limitan a, biotina, nucleótidos radiactivos y similares. Un experto en la técnica puede emplear cualquiera de los marcajes conocidos para obtener una molécula de ácido nucléico codificante marcada.

Composiciones

También se proporcionan composiciones que comprenden un polipéptido inmunogénico seleccionado entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5.

Además se proporciona composiciones que comprenden anticuerpos anti-receptor Nogo 1, su fragmento de unión de su antígeno, o un polipéptido soluble del receptor Nogo 1 y una proteína de fusión de la presente descripción, p. ej. de la presente invención. Algunas composiciones de la descripción proporcionan otro aspecto de la presente invención, como se establece en las reivindicaciones adjuntas.

En algunos casos, p. ej. en algunas realizaciones de la presente invención, las composiciones pueden contener vehículos farmacéuticamente aceptables que comprenden excipientes y auxiliares que facilitan el procesado de los compuestos activos en las preparaciones que pueden utilizase farmacéuticamente para su entrega en el sitio de acción. Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral incluyen soluciones acuosas de compuestos activos en formas solubles en agua, por ejemplo, sales solubles en el agua. Además, se pueden administrar suspensiones de ingredientes activos como suspensiones adecuadas para inyecciones oleosas. Los disolventes o vehículos lipofilos adecuados incluyen ácidos grasos, por ejemplo, aceite de sésamo, o esteres de ácidos grasos sintéticos, por ejemplo, oleato de etilo o triglicéridos. Las suspensiones de inyecciones acuosas pueden contener substancias que incrementan la viscosidad de la suspensión incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódico, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspensión puede contener también estabilizantes. También se pueden usar liposomas para encapsular las moléculas de esta descripción, p. ej. las moléculas de esta invención, para su entrega en la célula. Modelos de "vehículos aceptables farmacéuticamente" son cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción y similares que sean compatibles fisiológicamente, agua, suero salino, tampón fosfato salino, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como sus combinaciones. En algunos casos, p. ej. en algunas realizaciones,, las composiciones comprenden agentes isotónicos, por ejemplo, azucares, polialcoholes como manitol, sorbitol, o cloruro de sodio. En algunos casos, p. ej. en algunas realizaciones, las composiciones comprenden substancias farmacéuticamente aceptables como agentes humectantes o cantidades pequeñas de substancias auxiliares como agentes emulsionantes o humectantes, conservantes o tampones, que aumenten la vida útil o eficacia de los anticuerpos, de los fragmentos de unión de su antígeno, de los receptores de Nogo solubles o de las proteínas de fusión de la presente descripción, incluyendo los de la invención.

Las composiciones de la presente descripción, p.ej. las de la invención, pueden estar en gran cantidad de formas, incluyendo, por ejemplo, dosis líquidas, semi-sólidas o sólidas, tales como soluciones líquidas (p. ej., soluciones inyectables e infusibles), dispersiones o suspensiones. La forma preferida depende de la forma de administración pretendida y de la aplicación terapéutica. En un ejemplo, p. ej. en una realización, las composiciones están en forma de soluciones inyectables o infusibles, tales composiciones son similares a la que se utilizan para inmunización pasiva de humanos con otros anticuerpos.

Las composiciones se pueden formular como una disolución, micro emulsión, dispersión, liposoma, u otras estructuras adecuadas para alta concentración de fármacos. Las disoluciones inyectables se pueden preparar incorporando al anticuerpo anti-receptor Nogo 1 en la cantidad requerida en un disolvente adecuado con un ingrediente o una combinaciones de los ingredientes enumerados anteriormente, que sean necesarios, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y el resto de los ingredientes necesarios de los anteriormente enumerados. En el caso de polvos estériles para la preparación de disoluciones inyectables estériles, lo métodos de preparación preferidos son el secado al vacio y la liofilización que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado de una disolución previamente estéril y filtrada de los mismos. La fluidez adecuada de una disolución se puede mantener, por ejemplo, por el uso de un recubrimiento como la lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula deseado en el caso de dispersión y por el uso de tensioactivos. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede obtener incluyendo en la composición una agente que retrase la absorción, por ejemplo, sales de monoestarato y gelatina.

En algunos casos, p. ej. en algunas realizaciones, el componente activo se puede preparar con un vehículo que protegerá al compuesto contra la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos, y sistemas de liberación micro encapsulados. Se pueden utilizar polímeros biodegradables, biocompatibles, como acetato de etilen-vinilo, polianhidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoesteres, y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de estas formulaciones están patentados o son generalmente conocidos por los expertos en la técnica. Veáse p. ej., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

Se pueden también incorporar en las composiciones compuestos activos suplementarios. En algunos casos, p. ej. en algunas realizaciones, los anticuerpos de receptor Nogo 1 y los fragmentos de unión de su antígeno, o los polipéptidos solubles del recepetor-1 de Nogo o las proteínas de fusión de la descripción, incluyendo las de la invención, están coformuladas con y/o coadministradas con uno o más agentes terapéuticos adicionales.

Las composiciones pueden incluir una "cantidad eficaz terapéuticamente" o una "cantidad eficaz profilácticamente" de un anticuerpo, un fragmento de unión de su antígeno, polipéptido(s), o proteína de fusión de la descripción, p. ej. de la invención. Una "cantidad eficaz terapéuticamente" se refiere a una cantidad eficaz, en dosis y durante períodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado terapéutico deseado. Una cantidad eficaz terapéuticamente del anticuerpo de receptor Nogo 1 y el fragmento de unión de su antígeno, del polipéptido soluble del recepetor-1 de Nogo o de la proteína de fusión pueden variar según factores como el estado de la enfermedad, edad, sexo, y peso del individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz es también aquella en la que los efectos tóxicos o perjudiciales cualquiera del anticuerpo, del fragmento de unión de su antígeno, de los péptidos solubles del receptor Nogo 1, o de la proteína de fusión del receptor de Nogo son superados por los efectos terapéuticos beneficiosos. Una "cantidad eficaz profilácticamente" hace referencia a una cantidad eficaz con la dosificación y durante períodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado profiláctico deseado. Normalmente, puesto que la dosis de profilaxis se usa en los sujetos antes o en los estados tempranos de la enfermedad, la cantidad eficaz profilácticamente será inferior que la cantidad eficaz terapéuticamente.

Los regímenes de dosificación se pueden ajustar para proporcionar la respuesta óptima deseada (p. ej una respuesta terapéutica o profiláctica). Por ejemplo, se puede administrar un solo bolus, se pueden administrar varias dosis divididas en el tiempo, o la dosis se puede reducir o aumentar proporcionalmente según indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de dosis unitarias para facilitar la administración y la uniformidad de la forma de dosis unitarias como las utilizadas aquí se refiere a unidades físicamente diferenciadas adecuadas como dosis unitarias para los sujetos mamíferos que van a ser tratados, cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéuticamente requerido. La especificación de las formas de dosis unitarias de la presente descripción, p. ej. de la presente invención, se dictan por y directamente dependiendo de (a) las características especiales del anticuerpo, del fragmento de unión de su antígeno, del polipéptido soluble del receptor-1 o de la proteína de fusión del receptor de Nogo y el efecto terapéutico o profiláctico especifico que se quiere conseguir, y (b) las limitaciones inherentes a la técnica de elaboración de un anticuerpo, fragmento de unión de su antígeno, polipéptido soluble del receptor-1 o de proteína de fusión del receptor de Nogo para el tratamiento de sensibilidad de los individuos. En algunos casos, p. ej. en algunas realizaciones, un intervalo de dosis terapéuticamente eficaz para anticuerpos del receptor Nogo 1 o para los fragmentos de unión de su antígeno es de 0,1-4 mg/Kg al día. En algunos casos, p. ej. en algunas realizaciones, un intervalo de dosis terapéuticamente eficaz para anticuerpos del receptor Nogo 1 o los fragmentos de unión de su antígeno es de 0,2-4 mg/Kg al día. En algunos casos, p. ej. en algunas realizaciones, un intervalo de dosis terapéuticamente eficaz para anticuerpos del receptor Nogo 1 o los fragmentos de unión de su antígeno es de 0,2 mg/Kg al día.

Usos de los anticuerpos, fragmentos de unión de su antígeno, receptores solubles y proteínas de fusión

En algunos ejemplos, la presente descripción proporciona métodos para inhibir la actividad del receptor Nogo 1 mediante administración de anticuerpos anti-receptor Nogo 1, fragmentos de unión de su antígeno de dichos anticuerpos, polipéptidos solubles del recpetor-1 de Nogo, o proteínas de fusión que comprenden estos polipéptidos para un mamífero que los necesite.

En algunos ejemplos, las descripción proporciona un método para inhibir la unión al receptor Nogo 1 a un ligando, que comprende las etapas de contactar el recepetor-1 de Nogo con un anticuerpo o un fragmento de unión de su antígeno de la presente descripción, p. ej. de la presente invención. En algunos ejemplos, el ligando se selecciona del grupo que consiste en NogoA, NogoB, NogoC, MAG y OM-gp.

En algunos ejemplos, la presente descripción proporciona un método para inhibir el colapso del cono de crecimiento en una neurona, que comprende la etapa de contactar la neurona con el anticuerpo o el fragmento de unión de su antígeno de la presente descripción, p. ej. de la presente invención. En algunos ejemplos, la descripción proporciona un método para disminuir la inhibición de crecimiento o expansión de neuritas en una neurona, que comprende la etapa de contactar la neurona con el anticuerpo o el fragmento de unión de su antígeno de la presente descripción, p. ej. de la presente invención. En algunos ejemplos, la neurona es una neurona del SNC. En algunos de estos métodos, el crecimiento y expansión de neuritas es un crecimiento axonal.

En algunos ejemplos, la presente descripción proporciona un método para estimular la supervivencia de una neurona de un mamífero, estando dicha neurona en peligro de muerte, que comprende (a) proporcionar el cultivo de una célula hospedadora que expresa (i) un anticuerpo anti-receptor Nogo 1 o el fragmento de unión de su antígeno; o (ii) un polipéptido soluble del receptor Nogo 1; y (b) introducir la célula hospedadora en el mamífero en la zona de la neurona o cerca de ella. Almudena Ramón-Cueto, M Isabel Cordero, Fernando F. Santos-Benito, y Jesús Ávila (2000) Functional recovery of paraplegic rats and motor axón regeneration in their spinal cords by olfactory ensheathing cells. Neuron 25, 425-425..

En algunos ejemplos, la presente descripción proporciona un método de terapia génica para estimular la supervivencia de una neurona en peligro de muerte, que se encuentra en un mamífero, que comprende administrar en la zona de la neurona o cerca de ella un vector viral que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica (a) un anticuerpo anti-receptor Nogo 1 o un fragmento de unión de su antígeno; o (b) un polipéptido soluble del receptor Nogo 1, donde el anticuerpo anti-receptor Nogo 1, el fragmento de unión de su antígeno o el polipéptido soluble del receptor Nogo 1 se expresa a partir de la secuencia nucleotídica del mamífero en una cantidad suficiente para estimular la supervivencia de la neurona. Los vectores virales y los métodos útiles para estas realizaciones se describen en, p. ej., Noël et al., Human Gene Therapy, 13, 1483-93 (2002).

En algunos ejemplos, la descripción proporciona un método para inhibir la unión del receptor Nogo 1 a un ligando, que comprende la etapa de contactar el ligando con el polipéptido soluble del receptor Nogo 1 o con la proteína de fusión del receptor Nogo 1 de la presente descripción, p. ej. de la presente invención.

En algunos ejemplos, la descripción proporciona un método para modular una actividad de un ligando del receptor Nogo 1, que comprende la etapa de contactar el ligando del receptor Nogo 1 con el polipéptido soluble del receptor Nogo 1 o con la proteína de fusión del receptor Nogo 1 de la presente descripción, p. ej. de la presente invención.

En algunos ejemplos la descripción proporciona un método para inhibir el colapso del cono de crecimiento de una neurona, que comprende la etapa de contactar un ligando del receptor Nogo 1 con un polipéptido soluble del receptor Nogo 1 o con una proteína de fusión del receptor Nogo 1 de la presente descripción, p. ej. de la presente invención. En algunos ejemplos, la descripción proporciona un método para disminuir la inhibición del crecimiento o expansión de neuritas en una neurona, que comprende la etapa de contactar un ligando del receptor Nogo 1 con un polipéptido del receptor Nogo 1 soluble o con una proteína de fusión del receptor Nogo 1 de la presente descripción p. ej. de la presente invención. En algunos ejemplos, la neurona es una neurona del SNC. En algunos ejemplos, el ligando se selecciona del grupo que consiste en NogoA, NogoB, NogoC, MAG y OM-gp. En algunos ejemplos, el crecimiento o expansión de neuritas es un crecimiento axonal.

Cualquiera de los anticuerpos o receptores descritos aquí se pueden utilizar terapéuticamente. En algunos ejemplos, el anticuerpo anti-receptor Nogo 1 es un anticuerpo humano. En algunos ejemplos, el mamífero es un paciente humano. En algunos ejemplos, el anticuerpo o el fragmento de unión de su antígeno se administra a un mamífero no humano que expresa un receptor Nogo 1 con el que el anticuerpo pueda tener una reacción cruzada (p. ej,. un primate, un mono cynomologous o Rhesus) son fines veterinarios o como modelo animal para enfermedades humanas. Tales modelos animales pueden ser de utilidad para evaluar la eficacia terapéutica de los anticuerpos de esta descripción, que incluyen los anticuerpos de esta invención.

En algunos ejemplos, la administración del anticuerpo anti-receptor Nogo 1 o el fragmento de unión de su antígeno, o el polipéptido soluble del receptor Nogo 1 o la proteína de fusión se utilizan para tratar una lesión de la médula espinal para facilitar el crecimiento axonal por todo el sitio lesionado.

Los anticuerpos anti-receptor Nogo 1 o los fragmentos de unión de su antígeno, o el polipéptido soluble del receptor Nogo 1 o la proteína de fusión de la presente descripción, que incluyen los de la presente invención, se pueden suministrar solos, o en combinación, o en combinación secuencial con otros agentes que modulan un proceso patológico en especial. Por ejemplo, los agentes antiinflamatorios se pueden coadministrar después de un ictus como medio para bloquear el daño neuronal ulterior y la inhibición de la regeneración axonal. Según se utilizan aquí, se dice que los anticuerpos anti-receptor Nogo 1 o los fragmentos de unión de su antígeno, o el polipéptido soluble del receptor Nogo 1 o la proteína de fusión se administran en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales si los dos se suministran simultáneamente, consecutivamente o independientemente.

Los anticuerpos anti-receptor Nogo 1 o los fragmentos de unión de su antígeno, o el polipéptido soluble del receptor Nogo 1 o la proteína de fusión de la presente descripción, que incluyen los de la presente invención, se pueden administrar por vía parenteral, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, transdérmica, por inhalación o por vía bucal. Por ejemplo, aun agente se puede administrar localmente al sitio de la lesión por microinfusión. Los lugares habituales incluyen, pero no se limitan a, áreas dañadas de la médula espinal como resultado de la lesión. La dosis administrada dependerá de la edad, salud, y peso del receptor, del tipo de tratamiento simultáneo, si lo hubiese, de la frecuencia del tratamiento, y de la naturaleza del efecto deseado.

Los compuestos de esta descripción, que incluyen los de la presente invención, se pueden utilizar in vivo, generalmente en mamíferos, como los humanos, ovejas, caballos, ganado, cerdos, perros, gatos, ratas, ratones, o in vitro.

Los métodos y usos de acuerdo con la presente invención se establecen en las reivindicaciones adjuntas.

Vectores de la invención

La presente descripción, que incluye la invención, proporciona moléculas de ADN recombinantes (ADNr) que contiene, una secuencia codificante. En el sentido aquí utilizado, una molécula de ADNr es una molécula de ADN que ha sido sometida a manipulación molecular. Los métodos para generar moléculas de ADNr son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, véase Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press. En algunas moléculas de ADNr, un secuencia de ADN codificante esta unida operativamente a las secuencias de control de expresión y a las secuencias de los vectores.

Se proporcionan también vectores que comprenden los ácidos nucléicos que codifican los polipéptidos de la presente descripción, p. ej. los polipéptidos de la invención. Los vectores que forman parte de la presente invención se establecen en las reivindicaciones adjuntas. La elección del vector y de las secuencias de control de expresión a las cuales los ácidos nucléicos de esta descripción p. ej. los ácidos nucléicos de esta invención, se unen operativamente, depende directamente, como es bien conocido en la técnica, de las propiedades funcionales deseadas (p. ej., expresión de proteínas, y la célula hospedadora que va a ser transformada). Un vector de la presente descripción, p. ej., un vector de la presente invención, podría ser capaz, por lo menos, de dirigir la replicación o inserción en el cromosoma del hospedadora, y preferiblemente también la expresión, de los genes estructurales que se incluyen en la molécula de ADNr.

Los elementos de control de la expresión que se usan para regular la expresión de una secuencia codificante de una proteína unida operativamente son conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, promotores inducibles, promotores constitutivos, señales de secreción, y otros elementos reguladores. Preferiblemente, el promotor inducible está fácilmente controlado, por ejemplo siendo sensible a un nutriente del medio de la célula hospedadora.

En un ejemplo, p. ej. en una realización, el vector que contiene una molécula de ácido nucléico codificante incluirá un replicón procariota, es decir, una secuencia de ADN que tenga la habilidad de dirigir la replicación autónoma y el mantenimiento de la molécula de ADN recombinante extra-cromosómicamente en una célula hospedadora procariota, tal como una célula hospedadora bacteriana, transformada con ella. Tales replicones se conocen bien en la técnica. Además. Los vectores que incluyen un replicón procariota pueden también incluir un gen cuya expresión confiera un marcador detectable o seleccionable tal como una resistencia a fármacos. Genes bacterianos típicos de resistencia a fármacos con aquellos que confieren resistencia a ampicilina o tetraciclina.

Los vectores que incluyen un replicón procariota pueden además incluir un promotor procariota o un bacteriófago capaz de dirigir la expresión (transcripción o traducción) de las secuencias de los genes codificantes en una célula hospedadora bacteriana, como E. coli. Un promotor es un elemento de control de la expresión formado por una secuencia de ADN que permite la unión de la ARN polimerasa y que la trascripción tenga lugar. Las secuencias de promotores compatibles con los hospedadores bacterianos se proporcionan normalmente en vectores plasmídicos que contienen los sitios de restricción convenientes para la inserción del segmento de ADN de la presente invención. Algunos ejemplos de tales vectores plasmídicos son pUC8, pUC9, pBR322, pBR329 (Laboratorios Bio-Rad®), pPL y pKK223 (Pharmacia). Cualquier hospedadora procariota adecuado se puede utilizar para expresar la molécula de ADN recombinante que codifica una proteína de la presente descripción p. ej. una proteína de la presente invención.

Los vectores de expresión compatibles con las células eucariotas, preferiblemente aquellos compatibles con las células de vertebrados, pueden también utilizarse para formar moléculas de ADNr que contengan las secuencias codificantes. Los vectores de expresión de las células eucariotas son bien conocidos en la técnica y están disponibles de varias fuentes comerciales. Normalmente, estos vectores se proporcionan conteniendo los sitios de restricción convenientes para la inserción del segmento de ADN deseado. Ejemplos de tales vectores son pSVL y pKSV-10 (Pharmacia). pBPV-1, pML2d (International Biotechnologies), pTDT1 (ATCC® 31255) y otros vectores de expresión bacterianos.

Los vectores de expresión de las células eucariotas que se utilizan para construir las moléculas de ADNr de la presente descripción, que incluyen las moléculas de ADNr de la presente invención, pueden además incluir un marcador de selección que sea eficaz en una célula eucariota, preferiblemente un marcador de selección de resistencia a fármacos. Un marcador de resistencia a fármacos preferido es el gen cuya expresión tiene como resultado la resistencia a neomicina, es decir, el gen (neo) de la fosfotransferasa de neomicina). (Southern et. al., (1982) J. Mol. Anal. Genet. 1, 327-342). Alternativamente, el marcador de selección puede estar presente en un plásmido separado, en los dos vectores introducidos por co-transfección de la célula hospedadora, y en los transfectantes seleccionados por cultivo en un fármaco adecuado para el marcador seleccionable.

Para expresar los anticuerpos, o las partes de anticuerpos de la presente descripción, p.ej. los anticuerpos, o las partes de anticuerpos de la presente invención, los ADN que codifican las cadenas ligeras o pesadas parciales o en toda su longitud se insertan en los vectores de expresión de manera que los genes estén unidos operativamente a las secuencias control de transcripción y de traducción. Los vectores de expresión incluyen plásmidos, retrovirus, cósmidos, YAC, episomas derivados de EBV, y similares. El gen del anticuerpo está ligado al vector de modo las secuencias control de la transcripción y de la traducción del vector sirvan para la función pretendida de regular la transcripción y la traducción del gen del anticuerpo. El vector de expresión y las secuencias de control de la expresión se eligen para que sean compatibles con la célula hospedadora utilizada para la expresión. El gen de la cadena ligera del anticuerpo y el gen de la cadena pesada del anticuerpo se pueden insertar en vectores separados. Ambos genes pueden, sin embargo, insertarse en el mismo vector de expresión. Los genes del anticuerpo se insertan en el vector de expresión por métodos estándar (p. ej., ligadura de los sitios de restricción complementarios en el fragmento del gen del anticuerpo y vector, o unión de extremos romos si no hay sitios de restricción presentes).

Un vector adecuado es el que codifica una secuencia funcionalmente completa de inmunoglobulina C_{H} o C_{L} humana con los sitios de restricción adecuados transformados de manera que cualquiera de las secuencias V_{H} o V_{L} se puedan insertar y expresar fácilmente, como se describe anteriormente. En estos vectores, el corte y empalme tiene lugar normalmente entre el sitio donador del empalme en la región de inserción J y el sitio aceptor del empalme que precede la región C humana, y también en las regiones de empalme que se encuentran en los exones de C_{H} humana. La poliadenilación y la terminación de la transcripción tienen lugar los sitios cromosómicos originales aguas abajo de las regiones codificantes. El vector de expresión recombinante puede también codificar un péptido señal que facilite la secreción de una cadena de anticuerpo de la célula hospedadora. El gen de la cadena de anticuerpo se puede clonar en el vector de manera que el péptido señal esta ligado dentro del marco al amino terminal del gen de la cadena de anticuerpo. El péptido señal puede ser un péptido señal de inmunoglobulina o un péptido señal heterólogo (es decir, un péptido señal de una proteína no inmunoglobulina).

Además para codificar los polipéptidos inmunogénicos, los anticuerpos del receptor Nogo-1, los fragmentos de unión de su antígeno, los polipéptidos del receptor Nogo 1 soluble y las proteínas de fusión del receptor Nogo 1 soluble de la presente descripción, p. ej. de la presente invención, los vectores de expresión recombinantes que se describen aquí llevan secuencias reguladoras que controlan su expresión en la célula hospedadora. Los expertos en la técnica comprenderán que el diseño de un vector de expresión que incluye la selección de secuencias reguladoras puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedadora que se va a transformar, el nivel de expresión de la proteína deseada, etc. Las secuencias reguladoras preferidas para expresión de célula hospedadora de mamífero incluyen elementos virales que dirigen altos niveles de expresión de proteínas en células de mamíferos, tales como promotores y/o potenciadores derivados de LTR retroviral, citomegalovirus (CMV) (como el promotor/potenciador de CMV), Virus 40 de los Simios (SV40) (como el promotor/potenciador de SV40), adenovirus, (p. ej., el promotor tardío principal de adenovirus (AdMLP)), polioma, y promotores fuertes de mamíferos como inmunoglobulinas nativas y promotores de actina. Para una mejor descripción de los elementos reguladores, y sus secuencias, véase p. ej. Patente EE.UU. Nº 5.168.062 de Stinski, Patente EE.UU. Nº 4.510.245 de Bell et al. y Patente EE.UU. Nº 4.968.615 de Schaffner et al.

Además de los genes heterólogos y las secuencias regulatorias, los vectores de expresión de la presente descripción, que incluyen los de la presente invención, pueden llevar secuencias adicionales, tales como las secuencias que regulan la replicación del vector en las células hospedadora (p. ej. orígenes de replicación) y genes marcadores seleccionables. El gen marcador seleccionable facilita la selección de las células hospedadoras en las que el vector ha sido introducido (véase p ej., las patentes americanas EE.UU. 4.399.216, 4.634.665 y 5.179.017, todas de Axel et al.). Por ejemplo, generalmente un gen marcador seleccionable confiere resistencia a fármacos, como a G418, higromicina o metotrexato, en una célula hospedadora en la que vector ha sido introducido. Los genes marcadores seleccionables preferidos incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) (para uso en células hospedadora dhfr^{-} con selección/amplificación de metotrexato) y el gen de neo (para selección de G418).

Células hospedadoras y métodos para producir por recombinación la proteína de la invención

Las moléculas de ácido nucléico que codifican anticuerpos anti-receptor Nogo 1, péptidos inmunogénicos, polipéptidos del receptor Nogo 1 soluble, proteínas de fusión de receptor Nogo 1 soluble de esta descripción, p.ej. de esta invención, y los vectores que comprenden estas moléculas de ácidos nucléicos, pueden utilizarse para la transformación de célula hospedadora adecuada. La transformación puede efectuarse de cualquier método conocido para introducir polinucleótidos en una célula hospedadora. Los métodos para introducir polinucleótidos heterólogos en células de mamífero son bien conocidos en la técnica e incluyen transfección por medio de dextrano, precipitación con cloruro de calcio, transfección en presencia de polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulado del polinucleótido(s) en liposomas, y microinyección directa de ADN en los núcleos. Además, las moléculas de ácido nucléico se pueden introducir en células de mamífero por vectores virales.

La transformación de las células hospedadora adecuadas con una molécula de ADNr de la presente descripción, p. ej. una molécula de ADNr de la presente invención, se lleva a cabo por métodos conocidos y depende normalmente del tipo de vector utilizado y del sistema hospedadora empleado. En relación con la transformación de las células hospedadora de procariotas, se puede emplear la electroporación y los métodos de tratamiento con sales (véase, por ejemplo Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratoty Press; Cohen et al. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 69, 2110-2114). En relación con la transformación de células de vertebrados con vectores que contiene ADNr, se puede emplear electroporación, métodos de tratamiento con sal o lípidos catiónicos (véase, por ejemplo, Graham et al., (1973) Virology 52, 456-467; Wigler et al. 1979) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 76, 1373-1376).

Las células transformadas satisfactoriamente, es decir, las células que contienen la molécula de ADNr de la presente descripción, p. ej. una molécula de ADNr de la presente invención, se pueden identificar por técnicas bien conocidas que incluyen la selección para un marcador seleccionable. Por ejemplo, las células resultantes de la introducción de un ADNr de la presente invención, p. ej. una molécula de ADNr de la presente invención, se puede clonar para producir colonias individuales. Las células de estas colonias se pueden recoger, lisar y examinar su contenido de ADN para ver la presencia de ADNr utilizando un método tal como el descrito por Southern, (1975) J. Mol. Biol. 98, 503-517 o se pueden comprobar las proteínas producidas por la célula mediante un método inmunológico.

Las líneas celulares de mamífero disponibles como hospedadores para la expresión son técnicas bien conocidas en la técnica e incluyen líneas celulares inmortalizadas disponible en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC®). Estas incluyen, entre otras, células de ovario de Hámster Chino (CHO), NSO, células SP2, células HeLa, células de hígado de cría de Hámster (BHK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (p. ej. Hep G2), células A549 y varias otras líneas celulares. Las líneas celulares de especial preferencia se seleccionan por determinación de que líneas celulares tienen niveles altos de expresión. Otras líneas celulares que se pueden utilizar son las líneas celulares de insectos tales como las células Sf9. Cuando los vectores de expresión recombinantes que codifican polipéptidos inmunogénicos, anticuerpos anti-receptor Nogo 1 o fragmentos de unión de su antígeno, polipéptidos del receptor Nogo 1 soluble y proteínas de fusión de receptor Nogo 1 soluble de la presente descripción, p.ej. de la presente invención, se introducen en las células hospedadora de mamífero, se producen por el cultivo de las células hospedadoras durante un período de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo, polipéptido o polipéptido de fusión en las células hospedadora, o más preferiblemente, por la secreción de los polipéptidos inmunogénicos, anticuerpos anti-receptor Nogo 1 o fragmentos de unión de su antígeno, polipéptidos del receptor Nogo 1 soluble y proteínas de fusión de receptor Nogo 1 soluble en el medio de cultivo en el que crecen las células hospedadora. Los polipéptidos inmunogénicos, anticuerpos anti-receptor Nogo 1 o fragmentos de unión de su antígeno, polipéptidos del receptor Nogo 1 soluble, proteínas de fusión de receptor Nogo 1 soluble de la presente descripción, p.ej. de la presente invención, se pueden recuperar del medio de cultivo utilizando métodos de purificación de proteínas estándar.

Además, la expresión de los polipéptidos inmunogénicos, anticuerpos del receptor Nogo 1 o fragmentos de unión de su antígeno, polipéptidos del receptor Nogo 1 soluble, proteínas de fusión de receptor Nogo 1 soluble de la presente descripción, p.ej. de la presente invención (u otras partes de los mismos) a partir de líneas celulares de producción se puede aumentar utilizando varias técnicas conocidas. Por ejemplo, el sistema de expresión del gen de la glutamina sintetasa (el sistema GS) es un método corriente para aumentar la expresión en determinadas condiciones. El sistema GS se analiza totalmente o en parte en relación con las Patentes Europeas EP 0 216 846, 0 256 055, y 0 323 997 y la Solicitud de Patente Europea 89303964.4.

Células Hospedadoras

Se proporcionan también células hospedadora transformadas con una molécula de ácido nucléico que codifica un anticuerpo del receptor Nogo 1 o un fragmento de unión de su antígeno, un polipéptido del receptor Nogo 1 soluble y/o proteínas de fusión de receptor Nogo 1 soluble de la presente descripción, p.ej. una proteína de fusión de la invención. Determinadas células hospedadora de la presente descripción proporcionan otros aspectos de la presente invención como se establece en las reivindicaciones adjuntas. Las células hospedadora pueden ser eucariotas o procariotas. Las células eucariotas de utilidad para la expresión de una proteína de la presente descripción, p. ej. una proteína de la presente invención, no están limitadas, mientras que la línea celular sea compatible con los métodos de cultivo celulares y compatible con la propagación del vector de expresión y la expresión del producto génico. Las células hospedadora eucariotas preferidas incluyen, pero no se limitan a levaduras, insectos y células de mamíferos preferiblemente células de vertebrados como las células de ratón, rata, mono o humanas. Ejemplos de células hospedadora eucariotas de utilidad incluyen las células de ovario de Hámster Chino (CHO) disponible en ATCC® como CCL61, las células NIH de embrión de ratón Suizo NIH-3T3 disponibles en ATTC® como CRL1658, células de riñón de cría de hámster (BHK), y las líneas celulares de tejidos eucariotas similares.

Producción de proteínas recombinantes utilizando una molécula de ADNr

También se proporcionan métodos para producir un anticuerpo anti-receptor Nogo 1 o un fragmento de unión de su antígeno, un polipéptido del receptor Nogo 1 soluble y/o proteínas de fusión de receptor Nogo 1 soluble de la presente descripción, p.ej. de la invención, utilizando las moléculas de ácido nucléico aquí descritas. En términos generales, la producción de una forma recombinante de una proteína implica normalmente las siguientes etapas.

Primero, se obtiene una molécula de ácido nucléico que codifica una proteína de la presente descripción, p. ej. una proteína de la invención. Si la secuencia codificante esta interrumpida por intrones, es adecuada directamente para la expresión en cualquier hospedadora.

Entonces la molécula de ácido nucléico se dispone opcionalmente en un unión operativa con las secuencias de control adecuadas, como se describe anteriormente, para formar una unidad de expresión que contiene el marco de lectura abierto de la proteína. La unidad de expresión se utiliza para transformar un hospedadora adecuado y el hospedadora transformado se cultiva en condiciones que permitan la producción de la proteína recombinante. Opcionalmente la proteína recombinante se aísla del medio o de las células; la recuperación y purificación de la proteína puede no ser necesaria en algunos casos donde se pueden tolerar algunas impurezas.

Cada una de las siguientes etapas se puede realizar de varias formas. Por ejemplo, se pueden obtener las secuencias codificantes deseadas a partir de fragmentos genómicos y utilizarlas directamente en los hospedadores adecuados. La construcción de los vectores de expresión que son operativos en diversos hospedadores se lleva a cabo utilizando los replicones adecuados y las secuencias de control, como se estableció anteriormente. Las secuencias de control, los vectores de expresión y los métodos de transformación dependen del tipo de célula hospedadora utilizada para expresar el gen y fueron analizados en detalle anteriormente. Se puedes añadir sitios de restricción adecuados, si no están normalmente disponibles, en los extremos de la secuencia codificante para proporcionar un gen escindible para insertar en estos vectores. Un experto en la técnica puede adaptar fácilmente cualquier sistema conocido en la técnica hospedadora/expresión para uso con moléculas de ácido nucléico de la presente descripción p. ej. con moléculas de ácido nucléico de la presente invención, para producir la proteína recombinante. Algunos métodos para producir proteínas de la presente invención proporcionan aún otros aspectos de la presente invención como se establece en las reivindicaciones adjuntas.

Para que esta invención se comprenda mejor, se explican los siguientes ejemplos. Estos ejemplos tienen fines únicamente ilustrativos y no se pueden interpretar para limitar el ámbito de la invención en ningún modo.

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Ejemplo 1

Producción de anticuerpos monoclonales anti-receptor Nogo 1 murinos

Se prepararon anticuerpos anti-receptor Nogo 1 que se unen específicamente a un polipéptido del receptor Nogo 1 inmunogénico de la invención utilizando los siguientes métodos y procedimientos.

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Inmunizaciones

Se utilizaron dos enfoques de inmunización:

1. Células o membranas celulares COS-7 que contienen el receptor Nogo 1 (NogoR-1) como inmunógeno

Se subclonó el gen del receptor Nogo 1 de rata (GenBank^{TM} Nº AF 462390) en un vector de expresión de mamífero pEAG1256 (Biogen®) que contenía el promotor CMV y el gen de resistencia a la geniticina para selección de fármacos. El plásmido recombinante fue transfectado en células COS-7 utilizando Superfect (Qiagen®). Los transfectantes se seleccionaron utilizando geneticina (Gibco^{TM}, 2 mg/ml), se clonaron y se verificó la expresión en superficie de la proteína del receptor Nogo 1 por FACS. Se prepararon las membranas COS-7 a partir de estas células según procedimientos como el descrito en [Wang et al., J. Neurochem., 75: 1155-1161 (2000) con dos lavados, y se mantuvo en 1 mg/ml [concentración de proteína] en glicerol al 10% a -70ºC.

Se inmunizaron ratones hembra RBF de dieciocho semanas de edad (Jackson Labs, Bar Harbor, ME) intraperitonealmente bien con una emulsión que contiene 50 g de membranas COS-7-receptor Nogo 1 de rata o células completas COS-7 que expresan el receptor Nogo 1 en la superficie y 50 \mug de adyuvante RIBI MPL+TDM+CWS (Sigma® Chemical Co., St. Louis, MO) una vez cada dos semanas (Lipman et al., 1992). Se recogieron los sueros de los ratones inmunizados antes de la primera inmunización, 7 días después de la segunda y tercera inmunización, y 38 días después de la tercera inmunización y se midió la titulación de los anticuerpos anti-receptor Nogo 1 con ELISA como se describe más adelante.

2. Péptidos específicos del receptor Nogo 1 como inmunógeno

La secuencia del gen del receptor Nogo 1 de rata se sometió a un análisis de antigenicidad utilizando el programa Vector NTi^{TM} (Fig. 2). Los péptidos antigénicos, identificados en el análisis se conjugaron con Hemocianina de Lapa Californiana (Keyhole Limpet Hemocyanin (KHL)) utilizando procedimientos estándar con glutaldehído.

Ratones hembra RBF de ocho semanas de edad (Jackson Labs, Bar Harbor, ME) se inmunizaron intraperitonealmente con una emulsión que contiene 50 \mug de péptidos conjugados-KLH y 50 \mul de adyuvante completo de Freunds (Sigma® Chemical Co., St. Louis, MO) una vez cada dos semanas. Se recogió suero de los ratones inmunizados antes de la primera inmunización y 1 semana después de la segunda y tercera inmunización y se midieron las titulaciones de los anticuerpos anti-receptor de Nogo 1. Se dio una dosis de refuerzo después de la tercera inmunización. Tres días después de esta dosis de refuerzo de inmunización, se iniciaron los experimentos de fusión.

Producción del hibridoma y escrutinio

Se seleccionaron con ELISA los sueros de ratones inmunizados con péptidos antigénicos del receptor Nogo 1 mientras que los sueros de ratones inmunizados con células COS-7 que expresan el receptor Nogo 1 se seleccionaron por citometría de flujo. Los ratones que resultaron positivos para los anticuerpos que se unían específicamente a las células COS-7-receptor Nogo 1 se identificaron por citometría de flujo y fueron sacrificados. Se aislaron esplenocitos de los ratones y se fusionaron con el mieloma FL653 (un APRT derivado de un mieloma de ratón IG-/HGPRT-Balb/c, conservado en DMEM que contiene FBS al 10%, 4500 mg/L de glucosa, de L-glutamina 4 mM, y 20 mg/ml de 8-azaguanina) como se describe en (Kennett et al., 1993. Anticuerpos Monoclonales: Una nueva dimensión en el análisis biológico. Plenum Press, Nueva York). Las células fusionadas se sembraron en placas de 24 o 48 pocillos (Corning Glass Works, Corning, Nueva York) y se alimentaron con medio de cultivo que contenía adenina, aminopterina y timidina. Los cultivos AAT resistentes se seleccionaron por ELISA o citometría de flujo para la unión bien a células COS-7-receptor Nogo 1 o para péptidos antigénicos del receptor Nogo 1 como se describió anteriormente. Las células de los pocillos positivos de subclonaron además por dilución limitante.

Para seleccionar un anticuerpo que se una al péptido antigénico del receptor Nogo 1, los péptidos que se utilizaron como inmunógenos se conjugaron con BSA. Se añadieron 0,5 \mug del péptido conjugado en 50 \mul de un tampón 0,1 M de bicarbonato de sodio, pH 9,0 a cada pocillo de una placa MaxiSorp de 96 pocillos (Nunc^{TM}). Depués se incubó la placa a 37ºC durante 1 hora o a 4ºC durante 16 horas y se bloquearon los sitios de unión no específicos utilizando HEPES 25 mM, pH 7,4 que contiene BSAal 1%, de ovoalbúmina al 0,1%, blotto al 0,1% y azida al 0,001%. Se añadió el hibridoma sobrenadante y se incubó a 25ºC durante 1 hora. Después de lavarlo tres veces con PBS, se añadieron 50 \mul de una dilución 1:10.000 de anticuerpo secundario de cabra anti-ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (Jackson InmunoResearch Inc.) a cada pocillo y se incubaron durante una hora. Después de tres lavados, se reveló el color con TMB (Pierce) y se detuvo con ácido sulfúrico 2 M. Se monitorizó la intensidad del color con un espectrófotometro a 450 nm.

Se seleccionaron los anticuerpos por su unión al receptor Nogo 1 en toda su longitud de siguiente modo. Se marcaron las células COS-7 con 0,1 uM de verde CMFDA^{I} CellTracker^{TM} (Molecular Probes, Eugene, OR) como describe el proveedor. Se mezclaron volúmenes iguales de células del control marcado con CellTracker^{TM} con células COS-7-receptor Nogo 1 lavadas antes de la incubación con suero de ensayo del anti-receptor Nogo 1. Se dispensaron cincuenta microlitros de la mezcla de células en cada pocillo de placas de poliestireno de fondo V de 96 pocillos (Costar® 3877, Corning, NY) y se añadieron 100 \mul de sobrenadante de hibridoma o un anticuerpo control anti-receptor Nogo 1. Después de incubación a 4ºC durante 30 minutos, las células se lavaron e incubaron con 50 \mul de anticuerpos secundarios conjugados específicos conjugados con picoeritrina-R, de un fragmento de F(ab')2 de cabra puro de afinidad anti Fc gamma de IgG de ratón (1:200, Jackson InmunoResearch Laboratory, West Grove, PA) en PBS. Al final de la incubación, se lavaron las células dos veces con PBS y se suspendieron en 200 \mul de PBS que contiene FBS al 1%, y se sometieron a análisis FACS. Como alternativa, las células COS-7-receptor Nogo 1 se mezclaron con el sobrenadante del hibridoma y posteriormente se trataron con anticuerpo secundario de cabra anti-ratón conjugado con picoeritrina-R y se sometieron directamente a análisis estándar FACS.

Generamos 25 anticuerpos anti-receptor Nogo 1 utilizando varios inmunógenos. Generamos dos anticuerpos, 7E11 y 5B10, utilizando un secuencia de péptidos que corresponde a los restos 110-125 del receptor Nogo 1 de rata como inmunógeno. Generamos tres anticuerpos, 1H2, 3G5 y 2F7, utilizando membranas preparadas de células COS7 transfectadas con el receptor Nogo 1 en toda su longitud como inmunógeno. Generamos 13 anticuerpos utilizando sNogoR310-Fc como inmunógeno (1D9.3, 1E4.7, 1B4.3, 2C4.3, 1F10.3, 2H1.4, 1H3.3, 1G4.1, 1E4.1, 2G7.1, 2C4.1, 2F11.1, y 1H4.1) y 7 anticuerpos utilizando un secuencia de péptidos que se corresponde con los restos 423-434 del receptor Nogo 1 de rata como inmunógeno (2E8.1, 2G11.2, y 1B5.1).

Análisis de la secuencia de los anticuerpos monoclonales 7E11 y 5B10

Extrajimos el ARN total utilizando un mini kit RNAeasy® de Quiagen®, y generamos el ADNc del ARN aislado. Amplificamos la secuencia de la cadena ligera por PCR utilizando los cebadores 5'-TGAGGAGACGGTGACCGTG
GTCCCTTGGCCCCAG-3' (SEQ ID NO: 12) y 5'-AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3' (SEQ ID NO: 25). Amplificamos las secuencia de la cadena pesada por PCR utilizando los cebadores 5'-GGGGATATCCACCATGAAGTT
GCCTGTTAGGCTGTTG-3' (SEQ ID NO: 13) y 5'-GGGGATATCCACCATGAGGKCC-CCWGCTCAGYTYCTK
GGA-3' (SEQ ID NO: 14). Estos cebadores comprenden los nucleótidos degenerados siguientes: S representa G o C; M representa A o C; R representa G o A; W representa A o T; K representa G o T; e Y representa T o C. Clonamos los fragmentos de PCR en un vector de secuenciación y determinamos la secuencia de ADN de los CDR por la terminación de cadena didexosi utilizando cebadores específicos para el vector de secuenciación. Traducimos conceptualmente las secuencias de ADN y las secuencias parciales de aminoácidos de las regiones CDR de las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos monoclonales 7E11 y 5B10 se muestran en la Tabla 2. La identidad de secuencia de las cadenas ligeras de 7E11 y 5B10 es del 95% de los aminoácidos y la identidad de secuencia de las cadenas pesadas es del 91%. Los mAb 7E11, 5B10, y 1H2 son del isotipo IgG1 y los mAb 3G5 y 2F7 son del isotipo IgG2a. Cada uno de estos cinco mAb tiene una cadena ligera del isotipo kappa. Analizamos la secuencia de los otros anticuerpos monoclonales con este enfoque.

TABLA 2 Secuencia de aminoácidos de mAbs 7E11 y 5B10

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Inhibición de la unión del ligando al receptor Nogo 1 soluble por el anticuerpo monoclonal anti receptor Nogo 1

Analizamos los anticuemos monoclonales anti receptor Nogo 1 producidos con se describió anteriormente para determinar si inhibían la unión del ligando al receptor Nogo 1.

Se inmovilizaron 0,5 \mug de una proteína de fusión del receptor Nogo 1 soluble que comprende los restos aminoácidos 26-344 del receptor Nogo 1 de rata y las regiones bisagra y Fc de la molécula IgG1 de la rata (sNogoR344-Fc) producido como se describe anteriormente, en 250 \mug de proteína A o perlas SPA conjugadas con aglutinina de germen de trigo (Amersham Pharmacia Biotech) durante 2 horas a 25ºC. Se añadieron las perlas SPA acopladas a Fc-SNogoR-1
[QUE sNOGO ES ESTE?], mAb anti receptor Nogo 1 y 1 \mul ^{125}I-Nogo66 (Amersham, 2000 Ci/mmol, 1 nM) en
50 \mul del medio de incubación tampón HEPES (HEPES 10 mM, pH 7.4, albumina de suero bovino al 0,1%, ovoalbúmina al 0,1%, MgCl_{2} 2 mM, CaCl_{2} 2 mM e inhibidores de proteasa) a cada pocillo muestra. Después de 16 horas, se midió la radiactividad en muestras cuadruplicadas utilizando TopCount® (Packard). Los valores de IC_{50} se calcularon por un análisis de ajuste de curva (Fig. 3) (PRISM, GraphPad Software, NJ). En algunos experimentos, utilizamos también conjugados ligando-AP (p.ej. AP-Nogo66) y detectamos la unión por monitorización de la actividad de la fosfatasa alcalina. También probamos la habilidad de los mAb para bloquear la unión de los ligandos MAG-Fc y AP-OM-gp al receptor Nogo 1.

Todos los anticuerpos monoclonales 7E11, 5B10, 1H2, 3G5 y 2F7 inhibieron la unión de Nogo66, MAG y OM-gp a sNogoR344-Fc. Las IC_{50} para Nogo66 por 7E11 y 1H2 fueron 400 nM y 60 nM, respectivamente. En la Tabla 3 se resumen los datos de la inhibición por medio de mAb de la monitorización ELISA de la unión de los tres ligandos al receptor Nogo 1.

TABLA 3 mAbs que inhiben la unión de Nogo66, MAG y OM-gp al receptor Nogo-1

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El desplazamiento porcentual se muestra para los anticuerpos a 30 nM y la EC_{50} para determinados mAb se determinó por análisis de ajuste de curva como se describió anteriormente. "-" indica actividad no detectable y "ND" indica no determinada.

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Ejemplo 2

Producción de anticuerpos fago-Fab anti-receptor Nogo 1

Los anticuerpos fago-Fab anti receptor Nogo 1 que se unen específicamente a un polipéptido inmunogénico del receptor Nogo 1 de la invención se prepararon también por escrutinio de una biblioteca de fagos Fab de la forma siguiente.

La biblioteca de fagos Fab MorphoSys de HuCal® GOLD se cribó frente a una proteína recombinante Fc -sNogoR310 soluble de rata y las células COS7 que expresan el receptor Nogo 1 de rata. Se purificaron y caracterizaron los fagos-Fab que se unen específicamente al receptor Nogo 1. La cadena pesada de 14D6 se derivó del gen V_{H}2 y la cadena ligera se derivó del gen V_{K}1. Las secuencias de aminoácidos de los CDR de la cadena pesada y de la cadena ligera de uno de estos fagos-Fab, 14D5, se muestran en la Tabla 4.

TABLA 4 Secuencia de aminoácidos de CDRs de 14D5

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14D5 se une al receptor Nogo 1 tanto en forma monovalente como bivalente. Además, 14D5 se une al receptor Nogo 1 de ratón y humano y al receptor Nogo 2 humano pero no al receptor Nogo 3 de ratón.

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Ejemplo 3

Inmuno precipitación del receptor Nogo 1 por los anticuerpos monoclonales anti receptor Nogo 1

Para llevar a cabo la inmuno precipitación, se lisaron 100 \mul de células lisadas o 50 \mul de células PiPLC tratadas se mezclaron con 400 o 450 \mul de tampón de extracción [Tris-HCl10 mM, pH 7,2, Tween-20^{TM} al 0,5%, PSMF 0,2 mM] o de tampón RIFA, respectivamente en presencia de 30 \mul de Proteína A o G y 1-2 \mug de anticuerpos. La mezcla se incubó en un agitador a 4ºC durante 16 horas.

Las muestras se centrifugaron suavemente para granular las perlas agrupadas de las proteínas A o G. La perlas se lavaron tres veces con 1 ml de tampón de lavado (Tris-HCl 10 mM, pH 7,2, de Tween-20^{TM} al 0,1%). Se llevó a cabo el lavado final utilizando tampón de lavado original al 10%.

Las perlas se volvieron a suspender en 100 \mul de 2X SDS con mercaptoetanol beta al 10%. Se incubaron las muestras a temperatura ambiente antes de hacerse pasar por un gel de Tris-Glicina al 4-20% para SDS-PAGE. Como se determinó por análisis en gel SDS-PAGE, los anticuerpos monoclonales, 3G5 y 2F7, inmuno precipitaron el receptor Nogo 1.

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Ejemplo 4

Determinación de la especificidad del anticuerpo por ELISA

Para determinar la especificidad de los anticuerpos monoclonales y del fago-Fab producido en los Ejemplo 1 y 2, se llevó a cabo un ELISA utilizando un panel de polipéptidos del receptor Nogo 1. El panel consistía en sNogoR310-Fc (una proteína de fusión que comprende los aminoácidos 26-310 del receptor Nogo 1 de rata y un fragmento de Fc de rata), sNogoR344-Fc (véase anteriormente), el polipéptido p-617 (SEQ ID NO: 1), el polipéptido p-618 (un polipéptido de 19 aminoácidos de la región LRR7 del receptor Nogo 1,Fig 2; SEQ ID NO: 11) y, los polipéptidos p-4 y p-5 (polipéptidos de las regiones LRR5 y LRRCT del receptor Nogo 1 respectivamente). Se utilizaron como controles ovoalbúmina y BSA. Como se muestra en la Fig. 4, los mAb 1H2, 3G5 y 2F7 se unen todos específicamente a sNogoR344-Fc. En experimentos similares, estos anticuerpos se unieron también específicamente a un polipéptido que consiste en los aminoácidos 310-344 del receptor Nogo 1 (SEQ ID NO: 3) y los mAb 7E11 y 5B10 se unieron específicamente al polipéptido p-617 (SEQ ID NO: 1).

Diez de los anticuerpos (1D9.3, 1E4.7, 1B4.3, 2C4.3, 1F10.3, 2H1.4, 1H3.3, 1G4.1, 1E4.1, y 2G7.1) de la inmunización de sNogoR310-Fc se desplazaron unos a otros para unirse, indicando que reconocen epítopos similares o solapados de sNogoR310-Fc. Los otros tres anticuerpos de la inmunización de sNogoR310-Fc (2C4-1, 2F11.1, y 1H4.1) reconocen epítopos diferentes localizados en los restos aminoácidos 26-310.

También se llevaron a cabo ensayos de unión ELISA utilizando el Fab-fago 14D5. Donde se permitió a los ligandos AP-Nogo66, AP-OM-gp y MAG-Fc unirse al sNogoR344-Fc inmovilizado, 1 \mug de 14D5 inhibió completamente la unión a Nogo y a MAG. Se requirieron 10 \mug de 14D5 para inhibir completamente la unión de OM-gp a sNogoR344-Fc.

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Ejemplo 5

Ensayo de crecimiento de neuritas

Para probar las habilidad de los anticuerpos monoclonales fago-Fab producidos anteriormente para disminuir el efecto inhibitorio de la mielina de las neuronas del SNC, los portaobjetos del cultivo Lab-Tek® (4 pocillos) se recubrieron con 0,1 mg/ml de poli-D-lisina (Sigma®). Mielina de SNC o PBS se sembraron como gotas de 3 \mug. Se añadieron microesferas fluorescentes (Polysciences) a mielina/PBS para permitir la identificación posterior de las gotas (Grandpre et al. Nature 403, 2000). Posteriormente los portaobjetos Lab -Tek® se aclararon y se recubrieron con 10 \mug/ml de laminina (Gibco®). Los ganglios de la raíz dorsal (DGR) de crías de rata Sprague Dawley P3-4 se disociaron con 1 mg/ml de colagenasa tipo 1 (Worthington), se trituraron con pipetas Pasteur afinadas al fuego pre-cubiertas para enriquecerlas en células neuronales y finalmente recubiertas con 23.000 células /pocillo en el portaobjetos de cultivo Lab-Tek® pre-recubierto. El medio de cultivo era F12 que contiene suero de caballo donante al 5% inactivado con calor, suero bovino fetal al 5% inactivado con calor y 50 ng/ml de mNGF y se incubaron a 37ºC y CO_{2} al 5% durante 6 horas. Se añadieron quince \mug/ml de mAb 7E11 inmediatamente después del recubrimiento.

Los portaobjetos se fijaron durante 20 minutos con paraformaldehido al 4% que contiene azúcar al 20% y se tiñeron para el marcador neuronal anti beta-III-tubulina (Covance TUJ1) diluído 1:500. Como anticuerpo secundario Alexa Fluo® 594 anti-ratón (Molecular Probes) se diluyó 1:300 y los portaobjetos se cubrieron con el cubreobjetos con Gel/Mount® (Biømeda®). Se tomaron imágenes digitales 5x con el programa OpenLab^{TM} y se analizaron utilizando el programa MetaMorph® para cuantificar el crecimiento de neuritas.

Los mAb 7E11 protegieron las neuronas DGR de la inhibición por medio de mielina del crecimiento de neuritas. (Fig. 5). Se observaron resultados similares con mAbs 1H2 Y 3G5.

En un ensayo de protección del crecimiento de neuritas donde neuronas de rata P7 DRG se cultivaron en un substrato de mielina CNS, 14D5 bivalente también estimuló eficazmente el crecimiento de neuritas.

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Ejemplo 6

Inmuno histoquímica con 7E11 en células transfectadas con el receptor Nogo 1

Para una mayor caracterización de las propiedades de unión del mAb anti-receptor Nogo 1 producido como se describe en el Ejemplo 1, comparamos la unión a COS-7 fijadas y vivas o a células 293 que expresan el receptor Nogo 1 de rata o humano.

Células fijadas

Células transfectadas con el receptor Nogo 1 y no transfectadas se crecieron en portaobjetos de cultivo Lab-Tek® de 8 pocillos, fijadas con formaldehido al 4% durante 15 minutos, bloqueadas con suero normal de cabra al 10%, tritón X-100 al 0,1% en PBS durante 1 hora. Se añadieron 15 \mug/ml y 1,5 \mug/ml de mAb 7E11 a una disolución bloqueante y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. Se incubaron anticuerpos anti-ratón conjugados AI-exa® (Molecular Probes) a una dilución 1:300 en una disolución bloqueante durante 1 hora: se añadieron 5 \mug/ml de DAPI al anticuerpo secundario para marcar todos los núcleos.

Células vivas

Células transfectadas y no transfectadas se sembraron en los portaobjetos de cultivo de ocho pocillos, se bloquearon con un tampón FACS (que contiene suero donante de caballo al 4%) durante 30 minutos a 4ºC, incubados con 15 \mug/ml y 1,5 \mug/ml de 7E11 en un tampón FACS durante 1 hora a 4ºC, se aclararon y se incubaron con un anticuerpo secundario anti-ratón Alexa® (1:300 en tampón FACS) durante 30 minutos a 4ºC.

Los experimentos de tinción inmuno histoquímica demostraron que todos los mAb se unían a células que expresaban el receptor Nogo 1 de rata. Los mAb 7E11, 2G7.1 y 2C4.1 se unían tanto a células fijadas como a células vivas que expresan receptor Nogo 1 humano.

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Ejemplo 7

Modelo de ratón de lesión por contusión de la médula espinal

Para valorar el efecto de los mAb anti-receptor Nogo 1 producidos según el Ejemplo 1 en las neuronas en vivo, utilizamos un modelo en ratón de lesión por contusión de la médula espinal.

Se trataron ratones hembra (18-22 g) profilácticamente con agentes analgésicos y antibióticos. Los ratones se anestesiaron y se colocaron en un dispositivo estereotáxico con fijación de columna vertebral bajo un estereomicroscópio. El trauma de la médula espinal se produjo con por una versión modificada del método "weight-drop" (caída de peso) (M. Li et al., Functional role and therapeutic implications of neuronal caspase-1 and -3 in a mouse model of traumatic spinal cord injury. Neuroscience Vol. 99, pp. 333-342, 2000).

En resumen, se realiza una laminectomía de T9 y T10 y la columna vertebral se estabiliza utilizando un par de grapas transversales de ratón soportando los procesos transversos T9-T10 bilateralmente. Una barra de impacto de acero inoxidable con un diámetro de 1,4 mm y un peso de 2 g. se levanta 2,5 cm por encima de la duramadre y se deja caer sobre la médula espinal al nivel de la T10. Durante la cirugía, los ratones se mantienen en una manta de calentamiento a 37ºC y se le administra a cada ratón 1 ml de disolución salina estéril caliente subcutáneamente después de la cirugía para evitar la deshidratación. La vejiga se exprime manualmente una vez al día hasta que se recupera el control reflejo de la vejiga.

Todos los animales reciben analgesia post operatoria cada 8-12 horas y tratamiento antibiótico dos veces al día durante 7 días a partir de entonces. Los animales tienen acceso libre a comida y a agua mientras dura el estudio. Los anticuerpos anti-receptor Nogo 1 se administran al lugar de la lesión por medio de una inyección intratecal durante 28 días como se describe más abajo en el modelo de ratón de transección de la médula espinal.

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Ejemplo 8

Caracterización de las proteínas de fusión del receptor Nogo 1 soluble

Para caracterizar los polipéptidos del receptor Nogo 1 soluble (sNogo 1) y las proteínas de fusión (Fc-sNogoR-1) llevamos a cabo el siguiente experimento.

Se inmovilizaron tres \mug de receptores Nogo solubles (sNogoR310-Fc y sNogoR344-Fc) en 250 \mug de perlas WGA-SPA y recibieron 0,5 \mul de ligando radiactivo (concentración final 0,5 nM) en un volumen final de 100 \mul de tampón de unión (HEPES 20 mM, pH 7.4, Ca 2 mM, Mg, 2 mM BSA al 0,1%, ovoalbúmina al 0,1% e inhibidores de proteasa). Los ligandos incluyen Nogo6610 \muM, ^{125}I-Nogo40 10 \muM (aminoácidos 1-40 de NogoA) y 10 \mul de sobrenadante del anticuerpo anti receptor Nogo 1 por cada grupo de ligando. Las tres tirosinas de Nogo40 se yodaron separadamente y se designaron Nogo40-A,-B y -C respectivamente.

Los valores promedio de los triplicados se presentan como el % normalizado de radiactividad unida (Figs. 6, 7 y 8). Las barras de error indican SEM. Se tomó como el 100% la radiactividad unida en ausencia de inhibidores y la radiactividad unida inferior en presencia de 10 \muM de Nogo40 se tomó como el 0% para la normalización de los datos.

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Ejemplo 9

Inhibición de ligando unido a proteína de fusión del receptor Nogo 1

Se utilizó un ensayo similar al ensayo de unión del Ejemplo 8 para probar la habilidad de dos mAb producidos en el Ejemplo 1 para inhibir la unión de ^{125}I-Nogo66 a sNogoR344-Fc. Los mAb 2F7 y 3G5 inhibieron la unión de ^{125}I-Nogo66 a sNogoR344-Fc.

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Ejemplo 10

Ensayo del crecimiento de neuritas

Los portaobjetos de cultivo (4 pocillos) Lab-Tek® se recubrieron con 0,1 mg/ml de poli-D-lisina (Sigma®). La mielina del SNC sola o mezclada con sNogoR310, la proteína de fusión sNogoR310-Fc, el mAb 5B10 o el PBS control se sembraron separadamente como gotas de 3 \mul. Se añadieron microesferas fluorescentes (Polysciences) a mielina/PBS para permitir la identificación posterior de las gotas (Grandpre et al. Nature 403, 2000). Después, los portaobjetos de Lab -Tek® se aclararon y se recubrieron con 10 \mug/ml de laminina (Gibco®). Los ganglios de raíz dorsal (DGR) de crías de rata Sprague Dawley p3-4 se disociaron con 1 mg/ml de colagenasa tipo 1 (Worthington), se trituraron con pipetas Pasteur afinadas al fuego pre-cubiertas para enriquecerlas en células neuronales y finalmente se recubren con 23.000 células/pocillo en el portaobjetos de cultivo Lab-Tek® pre-recubierto. El medio de cultivo era F12 que contiene suero de caballo donante al 5% inactivado con calor, suero bovino fetal al 5% inactivado con calor y 50 ng/ml de mNGF y se incubaron a 37ºC y CO_{2} al 5% durante 6 horas.

Los portaobjetos se fijaron durante 20 minutos de paraformaldehido al 4% que contiene azúcar al 20% y se tiñeron para el marcador neuronal anti beta-III-tubulina (Covance TUJ1) diluido 1:500. Como anticuerpo secundario anti-ratón Alexa Fluo® 594 (Molecular Probes) se diluyó 1:300 y los portaobjetos se cubrieron con el cubreobjetos con Gel/Mount® (Biømeda^{TM}). Se tomaron imágenes digitales 5x con el programa OpenLab^{TM} y se analizaron utilizando el programa MetaMorph® para la cuantificación del crecimiento de neuritas.

SNogoR310, sNogoR310-Fc and mAb 5B10 protegieron las neuronas DGR de la inhibición en presencia de mielina o del crecimiento de neuritas (Figs. 9-11). Se utilizó sNogoR310 en un ensayo similar utilizando neuronas de pollito y resultó ser protectora.

También se evalúo el efecto neuroprotector de los receptores Nogo solubles realizando experimentos con células que crecen en presencia o ausencia de laminina. El crecimiento de las células neuronales en un medio sin laminina es pobre y simula condiciones de estrés neuronal.

Se diseccionaron DGR de crías de rata 6-7 días después del nacimiento (P6-7), se disociaron en células individuales y se sembraron en placas de 96 pocillos recubiertas previamente con poli-D-lisina como se describió anteriormente. En algunos pocillos se añadieron 2 \mug/ml de laminina durante 2-3 horas y se aclararon antes de sembrar las células. Después de 18-20 horas de incubación se fijaron la placas con paraformaldehido al 4%, se tiñeron con anticuerpo anti-Beta-III-tubulina de conejo diluido 1:500 (Covance®) y anti-HuC/D diluido 1:100 (Molecular Probes), y se añadieron los anticuerpos secundarios fluorescentes (Molecular Probes), a una dilución de 1:200. Se utilizó el ArrayScan® II (Cellomics®) para capturar imágenes digitales 5x y para cuantificar el crecimiento de neuritas como el promedio del crecimiento de neurita/neurona por pocillo, utilizando la aplicación de crecimiento de neuritas. Se analizaron nueve imágenes 5x de 3 pocillos/clase.

En algunos experimentos, se utilizó un subclon de células PC12 (Neuroscreen^{TM}) (Cellomics®). Las células
Neuroscreen^{TM} se pre diferenciaron durante 7 días con 200 ng/ml de NGF, se separaron y se volvieron a sembrar en placas de 96 pocillos recubiertas previamente con poli-D-lisina. En algunos pocillos se agregaron 5 \mug/ml de laminina durante 2-3 horas y se aclararon antes de que se sembraran las células. Después de dos días de incubación las placas se fijaron con paraformaldehido al 4%, se tiñeron con anticuerpo anti-Beta-III-tubulina de conejo diluido 1:500 (Covance®) y Hoechst (tinción nuclear). Se utilizó el ArrayScan® II para cuantificar el crecimiento de neuritas con en las células DRG.

Se añadió sNogoR344-Fc o IgG de rata en disolución a neuronas P6-7 de DRG y a células diferenciadas
Neuroscreen^{TM} en el momento de sembrarlas.

El efecto neuroprotector de sNogoR344-Fc se observó a 1 \muM y 10 \muM cuando las neuronas P6 de DGR crecieron en ausencia de laminina. La cuantificación del crecimiento de neuritas manifestó que se incrementaba dependiendo de la dosis con la adición de sNogoR344-Fc. La adición de sNogoR344-Fc en las mismas concentraciones a las neuronas DRG que crecen en un substrato con laminina no produjo ningún efecto inusual, indicando que sNogoR344-Fc es activa solamente en las células con estrés. El efecto neuroprotector de sNogoR344-Fc a las mismas concentraciones en ausencia de laminina también se apreció con las células Neuroscreen.

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Ejemplo 11

Producción y purificación de la proteína de fusión Fc-sNogoR-1

Se fusionó una construcción de ADNc que codifica los aminoácidos 1-310 del receptor Nogo 1 de rata con IgG1 Fc de rata contenida en un vector de expresión de mamífero y este vector se electroporó en células (DG44) de ovario de hámster Chino (CHO). La células se mantuvieron en MEM-alfa, suplementado con suero bovino fetal dializado al 10%, glutamina 2 mM y reactivos antibióticos y antimicóticos. Dos días después de la transfección, se recogió y analizó el medio condicionado por Inmuno transferencia en condiciones reductoras. Se detectó una banda de proteínas de 60 kDa aproximadamente utilizando un anticuerpo policlonal de conejo anti receptor Nogo 1. Las células se expandieron y clasificaron utilizando anticuerpos R-PE conjugados de cabra anti Ig de rata. Después de la segunda clasificación las células se sembraron a una densidad de una célula/pocillo en placas de 96 pocillos. Los niveles de proteína de receptor Nogo 1 soluble secretados en cada pocillo en particular se analizaron y se compararon utilizando un Sandwich ELISA. La placa ELISA se recubrió con anticuerpo específico de cabra anti IgG Fc\kappa de rata. Se aplicó el medio acondicionado. Se detectó la proteína del receptor Nogo 1 soluble unida con Fab de burro conjugado con HRP anti IgG de rata, anticuerpo especifico Fc. El clon 4C12 presentó el nivel de secreción mayor. 4C12 se expandió y creció en un medio CHO-M7 en un matraz de agitación. El nivel de secreción fue de aproximadamente 10 mg/ml a 37ºC.

Las células CHO que expresan la proteína de fusión sNogoR310-Fc se cultivaron a gran escala. Se obtuvieron 1,7 l de medio acondicionado concentrado de la ejecución de un reactor de 10 l. El pH se incremento añadiendo una décima parte del volumen de Tris-HCl 1,0 M, pH 8,9. Se añadieron cloruro de sodio sólido y glicina 3,0 M y 1,5 M respectivamente. Se preparó una columna de 60 mL de proteína A-Sepharosa^{TM} equilibrada con Tris-HCl 10 mM, cloruro de sodio 3M, glicina 1,5 M y pH 8,9. El medio condicionado concentrado se aplicó a la columna a 1,5 ml/min utilizando una bomba peristáltica. La columna se lavó con 300 ml de Tris-HCl 10 mM, cloruro de sodio 3M, glicina 1,5 M, pH 8,9 seguido de 120 ml de Tris-HCl 5 mM, cloruro de sodio 3M, glicina 1,5 M y pH 8,9. La proteína se eluyó con fosfato de sodio 25 mM, cloruro de sodio 100 mM, pH 2,8. Se recogieron fracciones de 10 ml en tubos que contienen 1,0 ml de HEPES 1,0 M, pH 8,5. Las fracciones de proteína se agruparon y se dializaron contra 3 x 2 l de fosfato de sodio 5 mM, NaCl 300 mM, pH 7,4.

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Ejemplo 12

Ensayo de transección de la médula espinal

Para evaluar su habilidad para estimular la recuperación funcional in vivo, una proteína de fusión sNogoR-1 se examinó en un ensayó de transección de médula espinal de rata.

Se cargaron las bombas osmóticas Alzet® con la disolución problema (sNogoR310-Fc en PBS) preparada recientemente el día de su utilización. Se calculó que la concentración de carga fuese de 5 a 50 \muM. La bombas se cebaron durante >40 horas a 37ºC antes de la implantación en los animales. Se suministró a las ratas hembras Long Evans una analgesia preoperatoria y un tranquilizante y se les anestesió utilizando isofluorano (al 3% en O_{2}).

Las ratas se situaron en un marco estereostático y se puso al descubierto la corteza motora para la infusión del agente de rastreo BDA (10.000 MW) de forma bilateral. Las ratas se sometieron a una hemisección dorsal de la médula espinal en T5-T6 seguido de una implantación del catéter intratecal y del sistema de bombeo para suministrar el compuesto problema (n= 11 por grupo).

Se permitió que las ratas se recuperaran y sobrevivieran hasta 28 días después de la cirugía. Se registró la puntuación del comportamiento utilizando la puntuación BBB hasta 28 días después de la inducción de la lesión, justo antes de que terminase la fase en vida del estudio. A continuación de la perfusión y la fijación, las médulas espinales se extirparon, se protegieron con frío, seccionaron, tiñeron y se realizaron los contajes axonales.

La escala de puntuación locomotora Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) (Basso et al., 1996, Neurotrauma 13, 343-359), el test del plano inclinado y el test del recorrido por la rejilla inclinada (Li and Strittmatter, 2003, J Neurosci. 2003, 23, 4219-27) se monitorizaron para ratas y ratones después de la lesión. Para el test en plano inclinado, se midió el ángulo máximo al que se podía inclinar una tabla de 50 cm x 60 cm durante 5 segundos sin que el ratón se resbalase. Para la prueba de recorrido por la rejilla inclinada, se entrenó a los ratones para que escalaran una rejilla de cable (35 cm de largo con cuadrados de 2,54 cm) a una inclinación de 45 grados. Se anotó el número de veces que las patas traseras caían por debajo del plano de la rejilla para cada excursión de abajo a arriba. Para evaluar el comportamiento de la rata, se llevó a cabo la escala locomotora BBB, el recorrido por la rejilla y el análisis de huellas. Para la prueba del recorrido por la rejilla se entrenó a las ratas para que caminaran por una rejilla de cable (70 cm de largo con cuadrados de 2,54 cm), y se contabilizó el número de veces que las patas traseras caían por debajo del plano de la rejilla. Para el análisis de la huella plantar, se registraron con tinta los patrones de las patas traseras de las ratas al caminar durante una locomoción continua a través de una pista de 90 cm y se calculó la longitud del paso a cada lado y la amplitud del paso (Metz et al. 2000, Brain Res., 883, 165-177). Todos estos test de comportamiento se efectuaron con dos individuos por lo menos. Durante la cirugía, la prueba de comportamiento y el análisis histológico, los investigadores no podían ver la identificación del compuesto de la minibomba.

SNogoR310-Fc estimuló la recuperación funcional (Fig. 12).

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Ejemplo 13

Ensayo de contusión de la médula espinal de rata

Se evaluó el efecto de los polipéptidos del receptor Nogo 1 soluble y las proteínas de fusión en las neuronas in vivo en un ensayo de contusión de la médula espinal de una rata.

Ratas hembra Long Evans (170-190 g) encapuchadas se trataron profilácticamente con agentes analgésicos y antibióticos. Diez minutos antes de la cirugía, los animales fueron tranquilizados con 2,5 mg/kg de Midalozam i.p. (intraperitoneal) y se anestesiaron con isoflurano al 2-3% en O_{2}. Posteriormente las ratas se afeitaron, se limpiaron con alcohol y betadine, y se les aplicó un lubricante ocular en los ojos. A continuación se realizó una incisión por debajo de la línea media y se pusieron al descubierto las vertebras de la T7 a la T12.

Se llevó a cabo una laminectomia dorsal en T9 ½ y T10 para poner al descubierto la médula. La rata se montó en el Impactor. En primer lugar se sujetan los segmentos T7 y T8 y después los segmentos T11 y T12 se sujetan a la grapa caudal. Se colocó un material suave debajo de la barbilla de la rata. La barra del Impactor se colocó en la posición cero y el clip de conexión eléctrica a tierra se sujetó al borde de la herida. Después la barra del Impactor se subió a 25,0 mm y se ajusto adecuadamente a la posición directamente por encima de la médula espinal al descubierto. A continuación, la barra del Impactor se soltó para que golpease la médula espinal al descubierto y el Impactor se levantó inmediatamente.

Posteriormente la rata se desmontó, y se colocó Gelfoam® en la herida. Se suturó el musculo sobre la herida, y se grapó la incisión quirúrgicamente. Los animales se colocaron en una incubadora hasta que se recuperaron de la anestesia. A las ratas se les dieron los antibióticos, analgésicos y suero salino necesarios. Se exprimieron las vejigas cada mañana y cada tarde a partir de entonces hasta que recuperaron la función.

Las proteínas de fusión del receptor Nogo 1 (p. ej., sNogoR310-Fc) se administraron de modo intratecal como se describió anteriormente en el modelo de transección de médula espinal de rata. La puntuación BBB se efectúo un día después de la cirugía, después cada semana de ahí en adelante hasta entre 4 o 6 semanas.

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Ejemplo 14

Expresión de SNogoR310 en ratones transgénicos

Produjimos ratones transgénicos que expresan la proteína del receptor Nogo 1 soluble para evaluar el efecto cuando se expresaba in vivo.

El cADN de sNogoR310 de ratón se clonó (que corresponden a los aminoácidos 1-310 del receptor Nogo 1) en el sitio Notl del vector C-3123. En este vector, la expresión de sNogoR310 está bajo el control de los elementos reguladores del gen (gfap) de la proteína fibrilar acídica de la glía que permite alto nivel de expresión con secreción aumentada de los astrocitos reactivos en el sitio de la lesión. Digerimos el vector resultante secuencialmente con AatII y SfiI y aislamos la construcción gafp::sNogoR310 en un fragmento de 3,4 kb. Microinyectamos este fragmento en embriones para generar ratones transgénicos. Verificamos por PCR que el transgen se había integrado e identificamos cuatro líneas fundadoras. Cruzamos los machos heterocigotos de las dos líneas fundadoras con los niveles de expresión más altos con hembras de ratones C57BL/6J. Confirmamos que las células GFAP positivas expresan y secretan sNogR310 en ratones transgénicos heterocigotos por análisis de Inmuno transferencia utilizando un anticuerpo desarrollado frente al receptor Nogo 1.

Homogeneizamos la corteza y la médula espinal en un tampón Tris salino suplementado con inhibidores de proteasa (Roche) y centrifugamos el homogeneizado a 40.000 rpm durante 20 minutos a 4ºC. Tratamos el sobrenadante con paraformaldehido al 4% durante 20 minutos para aumentar la especificidad del anticuerpo y dializamos antes de la inmuno transferencia. Homogeneizamos la fracción particulada por sonicación en tampón RIPA (Triton® X-100 al 1%, desoxicolato de sodio al 0,5%, SDS al 0,1% en PBS), centrifugamos el homogeneizado resultante y tratamos este sobrenadante (fracción particulada soluble-detergente) como anteriormente. Analizamos 20 \mug de proteína de cerebro y de médula espinal por inmuno transferencia utilizando antisuero de conejo desarrollado frente al receptor Nogo 1 a una dilución de 1:2000. Visualizamos la inmuno reactividad por incubación con Ig conjugada con AP anti conejo y substratos AP NBT/BCIP.

Detectamos sNogoR310 secretada a 37kDA en extractos solubles sin detergente de corteza y médula espinal de dos líneas transgénicas Tg08 y Tg09, pero poca o ninguna proteína del receptor Nogo 1 soluble a 37 a 81 kDa está presente en las crías silvestres (WT) de la misma camada. El examen de las fracciones particuladas demostró que había niveles comparables de receptor Nogo 1 endógenos en ambos ratones, WT y transgénicos.

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Ejemplo 15

Expresión de sNogoR310 en ratones transgénicos después de la lesión

Evaluamos el efecto de la lesión en SNC en la expresión de sNogoR310 en ratones transgénicos realizando una lesión de hemisección tranversal (over-hemisection) dorsal.

Obtuvimos animales transgénicos sNogoR310 y animales control no transgénicos por apareamiento de machos heterocigotos con hembras C57/BL6 como se describe en el Ejemplo 14.

Anestesiamos profundamente a hembras adultas heterocigotas transgénicas o a los ratones silvestres de la misma camada (de 10-16 semanas de edad) y llevamos a cabo una laminectomia completa, poniendo al descubierto totalmente la parte dorsal de la médula espinal a los niveles de T6 y T7. Realizamos una hemisección tranversal (over-hemisection) dorsal en T6 con una aguja de calibre 30 y una par de microtijeras para cortar completamente los tractos corticoespinales lateral y dorsolateral (CST). Pasamos una aguja marcada a través de parte dorsal de la médula espinal varias veces para asegurar que la lesión tuviese lugar a una profundidad de 1, 0 mm. Suturamos las capas musculares por encima de las laminectomias y cerramos la piel del lomo con grapas quirúrgicas. Para localizar el tracto corticoespinal, realizamos un orificio por encima de la corteza cerebral en la parte derecha dentro del cerebro 14 días después de la lesión de la médula espinal. Aplicamos un marcador BDA (MW 10.000, al 10% en PBS) (Molecular Probes, Eugene, OR) en 4 sitios de inyección a una profundidad de 0,7 mm desde la superficie cortical. Cuatro semanas después de la lesión, se realizo a los ratones una perfusión transcardíaca con PBS, seguida de paraformaldehido al 4%. Los ratones utilizados para los experimentos de expresión de sNogoR310 no recibieron ninguna inyección del
marcador.

Se recogió la médula espinal a nivel entre T3 y L3 de los ratones utilizados para el análisis de inmuno transferencia sin perfusión 14 días después de la lesión. Los ratones utilizados para el marcaje inmuno histoquímico del receptor Nogo 1 se perfundieron con paraformaldehido al 4% 10 días después de la hemisección, y la médula espinal lesionada se retiró para seccionarla. Para examinar la expresión de sNogoR310 en el cerebro dañado de los ratones transgénicos y silvestres, se realizó una lesión cortical con una hoja de bisturí del número 11 sujeta en un aparato estereotáxico (David Kopf, Tujunga, CA). Se realizó un corte parasagital de 4 mm, 0,5 mm posterior a Bregma, 1,5 mm lateralmente a la línea media y 3, 5 de profundidad.

Detectamos niveles incrementados de sNogoR310 en los extractos solubles de las médulas espinales diez días después de la lesión en los ratones transgénicos pero no en los ratones WT, consecuentes con la regulación al alza después de la lesión de GFAP alrededor de la lesión. Para confirmar que esto no se debía a la regulación al alza compensatoria de Nogo-A, se examinó su expresión y se encontró que era similar tanto en corteza y en médula espinal bien intacta o lesionada tanto de ratones WT como transgénicos.

Examinamos la expresión celular de sNogoR310 en SNC dañado por marcaje inmunológico de cerebros y médula espinal lesionados que contiene una zona de lesión con anticuerpos contra el receptor Nogo 1 y GFAP. La morfología general de la glía astrocítica reactiva no difiere entre ratones WT y silvestres, pero la densidad marcada para el receptor Nogo 1 in ambos espacios intra y extracelular es marcadamente superior en ratones transgénicos gafp::sNogoR310 que en ratones silvestres, indicando una expresión de sNogoR310 incrementada alrededor de la lesión en los ratones transgénicos. La proteína del receptor Nogo 1 se co-localizó con el marcador GFAP de astrocitos solamente en los ratones transgénicos. Hay también un gran incremento del marcaje no celular difuso en las muestras transgénicas, consecuente con sNogoR310 en el espacio extracelular. El marcaje del receptor Nogo 1 del cuerpo de las células neuronales se detectó tanto en ratones WT como en transgénicos.

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Ejemplo 16

sNogoR310 secretado induce el desarrollo de CST en ratones transgénicos

Se evaluó si la expresión incrementada de sNogoR310 alrededor de la zona lesionada en los ratones transgénicos tenía como resultado la regeneración de los axones lesionados.

Investigamos la integridad de los tractos corticoespinales descendientes (CST) por inyección del trazador anterógrado amina deldextrano de biotina (BDA) en la corteza derecha motora como se describe en Li y Strittmatter, 2003, J. Neurosci. 23, 4219-27. En camadas de ratones WT, el CST dorsal prominente (dCST) está estrechamente empaquetado rostral a la lesión, y unas pocas fibras de CST dorsolaterales son visibles de forma ipsilateral. Un pequeño número de brotes colaterales cortos marcados de BDA se proyectan dentro de la materia gris, en especial en el cordón ventral, pero el desarrollo queda confinado en gran parte al lado del cordón contralateral a la inyección de marcaje. Sin embargo, las secciones rostrales a la hemisección dorsal de los ratones transgénicos sNogoR310 lesionados indican un patrón de marcaje de BDA bastante diferente. Se observa una densidad elevada de fibras marcadas con BDA en el exterior del dCST prominente en todos los ratones transgénicos de la línea Tg08 o de la línea Tg01. Las fibras ectópicas se extienden a través del área de materia gris, y algunas fibras alcanzan la materia blanca lateral y dorsolateral. Se aprecian varias fibras (4-12 brotes por sección transversal) en la parte opuesta de la médula espinal (ipsilateral al sitio de inyección del marcador). La medida micro densitométrica de los brotes colaterales indica aproximadamente un aumento de diez veces en la densidad de brotes en los ratones transgénicos sNogoR310. El examen de las secciones longitudinales parasagitales de 1 a 4 mm rostrales a la lesión revelan que las fibras de CST se extienden un gran número de ramificaciones de brotes dentro de la zona de materia gris ventral en los ratones transgénicos sNogoR310, a diferencia de los animales de la camada WT. En general, el patrón y la extensión del desarrollo rostral a la lesión en los ratones transgénicos son similares a aquellos que se observan en los ratones tratados sistémicamente con péptido NEP1-40 antagonista del receptor Nogo 1 (Li y Strittmatter, 2003).

Estos resultados demuestran que sNogoR310 secretado induce el desarrollo de CST en los ratones transgénicos.

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Ejemplo 17

La regeneración de los axones CST circunvala la zona de lesión dentro del cordón espinal distal en los ratones transgénicos sNogoR310

Aislamos la médula espinal 4 mm rostral y 4 mm caudal al sitio de la lesión (de 8 mm de longitud en total) de ratones transgénicos y la incorporamos en una matriz de albumina polimerizada-glutaraldehido y cortamos parasagitalmente con un vibratomo (30 \mum de grosor). Recogimos las secciones transversas (50 \mum) de la médula espinal 5-7 mm rostrales y a 5-7 mm caudales del sitio de la lesión. Para los experimentos de inyección de sNogoR310-Fc en ratas, la médula espinal que se extiende desde 10 mm rostral a 10 mm caudal del sitio de la lesión se corto parasagitalmente (50 \mum) en un micrótomo de vibración. Se recogieron las secciones transversas de la médula espinal 11-16 mm rostrales y 11-16 mm caudales del sitio de la lesión. Se incubaron las secciones con un complejo avidina-biotina-peroxidasa y se visualizo el marcador BDA por reacción HRP diaminobencidina intensificada-níquel (Grandpre, 2002, Nature, 417, 574-551). Procesamos algunas secciones para inmuno histoquímica de serotonina (anticuerpo anti-5-HT) por inmuno fluorescencia indirecta. Para visualizar la zona de la lesión, se marcaron doblemente algunas secciones con anticuerpos dirigidos contra GFAP (Sigma®, St. Louis, MO). Montamos, deshidratamos y cubrimos las secciones con un medio de montaje.

Evaluamos si las fibras inducidas por sNogoR310 expresadas en ratones transgénicos después de la lesión (véase Ejemplo 169) cruzaban la zona de la lesión hacia la médula espinal caudal para proporcionar una recuperación funcional.

Las secciones parasagitales consecutivas a través de la zona de la lesión trazaron en un visualizador de cámara lúcida el patrón de distribución total de las fibras regeneradoras de CST a pocos milímetros de la lesión. Las secciones de los ratones WT no mostraron fibras de CST que se extendieran más allá del lugar de la lesión. Secciones similares de ratones transgénicos sNogoR310 mostraron numerosas fibras de CST que cruzaban la zona de transección y se proyectaban dentro de las zonas de materia gris distal y de materia blanca en un patrón altamente ramificado. Inmediatamente rostral a la hemisección, se proyecto dentro de la zona de la lesión un desarrollo de CST de alta densidad marcadas con BDA originadas a partir de sCST prominente, pero la mayoría de los brotes de CST no consiguieron pasar la zona de transección donde la formación de la cicatriz y la cavitación tisular son prominentes. Una fracción pequeña pero significativa de los axones regenerados rodeo la zona de la lesión a través de los puentes tisulares restantes de la materia gris y blanca ventral y ventrolateral. Además, unas pocas fibras de CST parece que cruzaban la propia zona de transección vía la médula espinal dorsal y dorsolateral lesionada hacia las regiones distales. En los alrededores de la lesión, el recorrido de las fibras regeneradoras era típicamente tortuoso y bastante diferente de las fibras rectas normales del CST rostral. Las fibras colaterales y arborizadas son las que se ven más frecuentemente en la zona de materia gris de la médula espinal distal. Las reconstrucciones demuestran el recorrido de 5-15 fibras regeneradoras marcadas con BDA en el eje rostral-caudal a cualquier nivel 1-4 mm caudales a la lesión en todos los ratones transgénicos. Para secciones transversales a 5-7 mm caudales a la hemisección dorsal, los axones de CST marcados con BDA se ven en ambas zonas de materia gris y de materia blanca en cada ratone transgénico. El recuento de las fibras de los ratones transgénicos indica aproximadamente un número similar de fibras de CST marcadas con BDA para los niveles proximales en las secciones sagitales.

Además de las fibras de CST, los otros tractos descendentes, como las fibras rafespinales, contribuyen también a la función locomotora de los ratones. En este modelo de ratón con over-hemisection dorsal, la transección lesiona una mayoría de las fibras serotonérgicas, disminuyendo la densidad de estas fibras en un 80% aproximadamente en el cuerno ventral. El análisis de la longitud total de las fibras de serotonina del cuerno ventral de la médula espinal caudal indica un número mucho mayor de estas fibras en los ratones transgénicos que en el grupo WT, indicando que los efectos estimulación-crecimiento de sNogoR310 en los ratones transgénicos no están limitados a una ruta descendente del axón.

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Ejemplo 18

La expresión transgénica de sNogoR310 mejora la recuperación locomotora

El rastreo del axón de CST y el análisis de fibras serotonérgicas indica que sNogoR310 liberado de los astrositos en los ratones transgénicos estimula la regeneración anatómica extensiva de los axones lesionados descendentes en la médula espinal. Llevamos a cabo varios test de comportamiento como se describe en el Ejemplo 12 para determinar si estas fibras regeneradas benefician la recuperación funcional.

Como se valoró por el test BBB, los ratones WT recuperan parcialmente la función locomotora durante un periodo de 4 semanas de supervivencia. A las 4 semanas de la lesión, la mayoría de los ratones lesionados recuperan un nivel caracterizado por un paso plantar consecuente con un apoyo del peso, pero exhiben solo una coordinación de los miembros delanteros y trasero de ocasional a frecuente, con una rotación de la posición de la pata predominante cuando realiza el contacto inicial con la superficie. Por el contrario, las puntuaciones BBB de los ratones transgénicos sNogoR310 de ambas líneas Tg08 y Tg01 son significativamente mas altas que las del grupo de control a lo largo de los 7-28 días del período de observación (Figs. 13A y 13B). A los 28 días de la lesión, la mayoría de los ratones transgénicos muestran una coordinación de los miembros traseros y delanteros consecuente, y la posición predominante de la pata es paralela al cuerpo.

Empleamos otros dos test mas de comportamiento para caracterizar mejor la actuación de los ratones transgénicos sNogoR310. Primero, medimos el ángulo máximo al que se inclinaría una tabla sin que un ratón perdiera el agarre durante 5 segundos. Antes de la lesión por hemisección dorsal, ambos ratones transgénicos y WT pueden mantener su postura en una tabla con un ángulo de 55 grados. En los días del 7-28 después de la lesión, el ángulo de sostenibilidad se reduce en todos los ratones, pero los ángulos de sostenibilidad para los ratones transgénicos son significativamente mayores que los del grupo de control (Fig. 13C). En otro test de comportamiento, los ratones escalaron por una rejilla colocada a un ángulo de 45º de la vertical y se contabilizaron las salidas de las patas traseras por debajo de la rejilla. (Metz et al., 2000). Ningún ratón cometió errores en este test durante el entrenamiento antes de la lesión. Hay numerosos errores por fallos de las patas con solo una mínima mejoría en los ratones WT durante el período de 2-6 semanas después de la lesión. Por el contrario, los ratones transgénicos sNogoR310 exhibieron una mejoría progresiva en la escalada de la rejilla durante este período, teniendo lugar la mayor mejoría entre las semanas 1 y 3 después de la lesión (Fig. 13D). Por lo tanto, los ratones transgénicos que secretan sNogoR310 de los astrocitos exhiben una regeneración de CST, un desarrollo rafespinal y una función motora mejorada después de la hemisección espinal torácica.

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Ejemplo 19

La administración intratecal de la proteína sNogoR310-Fc induce el desarrollo de CST

Como segundo test del beneficio del receptor Nogo 1 soluble en la estimulación del crecimiento después de un trauma espinal, administramos la proteína purificada intratecalmente.

Fusionamos el dominio de unión del ligando (27-310) del receptor Nogo 1 de rata al dominio Fc de IgG1 de rata para estimular la estabilidad y la purificación. Purificamos la proteína a partir de las células CHO transfectadas estables. Esta proteína bloquea Nogo-66, MAG y la acción de la mielina in vitro, como se mostró previamente para His sNogoR310-Myc de ratón (Fournier et al 2002. J. Neurosci., 22, 8876-8883; Liu et al., 2002, Science, 297, 1190-1193). Administramos la proteína sNogoR310-Fc intratecal a las ratas con una lesión por hemisección dorsal en mitad del tórax con una minibomba osmótica. Durante un periodo de supervivencia después de cuatro semanas de la lesión, se administraron localmente 1,2 mg de proteína sNogoR310-Fc a cada rata. El las ratas que reciben el tratamiento vehiculo (1,2 mg de IgG de rata) las secciones rostrales a la hemisección muestran el CST dorsal prominente fuertemente empaquetado y muy pocas fibras de CST ectópicas marcadas con BDA por encima del lugar de la lesión. Las secciones rostrales a la lesión del las ratas lesionadas que reciben proteína sNogoR310-Fc exhiben un patrón de marcaje bastante diferente. Se observan numerosas de fibras ectópicas que se desarrollan a partir de CST marcado con BDA desde las secciones transversales y parasagitales. En algunos casos, las proyecciones cruzan desde la zona dCST cerca de la línea media a la periferia de la médula llegando a entremezclarse con el CST dorsolateral. Los axones desarrollados se extienden por la materia gris en mayor medida que en la materia blanca. Una medida de las fibras desarrolladas ectópicas (\geq 100 \mum en secciones transversales, \geq 200 \mum en secciones sagitales) adyacentes al dCST revela un incremento mayor en las ratas tratadas con sNogoR310-Fc.

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Ejemplo 20

Axones de CST regenerados en la médula espinal distal de las ratas tratadas con sNogoR310-Fc

Anestesiamos profundamente a ratas Dprague-Dawley hembras (190-250 g) y dirigimos las laminectomias a los niveles espinales de T6-7, poniendo al descubierto la médula espinal. Cortamos la mitad dorsal de la médula espinal con una aguja de calibre 30 y un par de micro tijeras para cortar las partes dorsales del tracto CSGT, y aseguramos la profundidad de la lesión (1,8 mm) pasando la parte afilada de una hoja del número 11 a través de la mitad dorsal de la médula (Grandpre et al., 2002, Nature, 417, 547-551). Una mini bomba osmótica (Alzet® 2ML4, 2 ml de volumen, 2.5 \mul/h, 28 días de administración), que se lleno con 1,2 mg de IgG de rata en PBS o 1,2 mg de proteína de fusión sNogoR310-Fc en PBS, se sutura a los músculos de debajo de la piel en el lomo de los animales. Se insertó un catéter conectado a la salida de la mini bomba dentro del espacio intratecal de la médula espinal a nivel de T7-8 a través de un pequeño orificio en la duramadre.

La infusión de la proteína agonista del receptor Nogo 1 indujo un desarrollo extensivo rostral a una hemisección de rata, pero una cuestión mas crítica es si el desarrollo de las fibras de CST se proyecta en la médula espinal distal y contribuyen a la recuperación locomotora. Las secciones longitudinales a través del sitio de la lesión de ratas tratadas con el vehículo no muestran ninguna o un número muy pequeño de fibras de CST ventrales marcadas con BDA por debajo del nivel de la lesión (GrandPre et al., 2002; Weidner et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 98, 3513-3518). Las secciones similares de las ratas tratadas con sNogoR310-Fc muestran muchas fibras marcadas con BDA circunvalando el sitio de la transección y que se proyectan hacia la médula espinal caudal en gran parte a través de los tejidos puente de la médula espinal ventral y ventrolateral. El marcaje inmunológico para el marcador de astrositos GFAP muestra que la extensión de la transección alcanza más allá del área del canal central. A diferencia del perfil lineal de las fibras rostrales en el CST dorsal prominente, las fibras de CST regeneradas normalmente siguen una trayectoria ramificada en la médula espinal distal, especialmente en la zona de la materia gris. Estas fibras se detectan en muchas regiones de la médula espinal, pero se aprecian más fácilmente en la parte central y en la mitad dorsal de la médula espinal por toda la médula espinal. El recuento de las fibras de CST de las secciones sagitales indica aproximadamente 20 axones marcados con BDA 1-2 mm caudales a la lesión y trazas de 15 axones 7-8 mm distales a la lesión de cada rata tratada con sNogoR310-Fc. Generalmente, el patrón de ramificación de estas fibras es similar al que se observó en los animales tratados con 1-40 péptidos NEP, pero se aprecian mas ramificaciones colaterales en cada brote de las secciones tratadas con la proteína sNogoR310-Fc. Una medida de los brotes de la médula espinal distal muestra que la longitud colateral de cada brote en ratas tratadas con sNogoR310-Fc es el doble que la de los animales tratados con NEP 1-40. El número de brotes (\geq 200 \mum de longitud) 1-10 mm caudales a la espina dorsal en ambos grupos tratados con el receptor Nog 1 y con el antagonista es aproximadamente 20-40 veces mayor que los grupos de control. Se aprecian mas brotes en las ratas tratadas con sNogoR310-Fc que en el tratamiento con NEP 1-40 locales (~ 50 vs 25 brotes/rata), pero esta diferencia no es significativa estadísticamente (p=0,1713, t-test).

Se observan axones CST regeneradores en las secciones transversales de la médula espinal 11-15 mm caudales a la hemisección en las ratas que reciben tratamiento sNogR310. Estas fibras se detectan tanto en la materia gris como en la materia blanca de la médula espinal. Las fibras detectadas en la materia gris ofrecen a menudo más ramificaciones colaterales que las de la materia blanca. Por el contrario en las secciones transversales del grupo tratado con el vehiculo, solamente se aprecia marcaje con BDA ocasionalmente en la zona ventral de la materia blanca, con los axones de CST ventrales no lesionados. A este nivel de la médula espinal distal, el número promedio de fibras de CST marcadas con BDA de ambos grupos tratados con antagonistas del receptor Nogo 1 [sNogoR310-Fc y NEP 1-40] es aproximadamente 20 veces mayor que el de las ratas tratadas con el vehiculo. En conjunto, los antagonistas del receptor Nogo, la proteína sNogoR310-Fc y el péptido NEP 1-40, tienen como resultado una espectacular regeneración de los axones de CST en la médula espinal distal, pero el desarrollo inducido por el primero presenta un patrón mucho mas ramificado.

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Ejemplo 21

sNogoR310-Fc local induce el desarrollo de axones rubroespinales y serotonérgicos en la médula espinal lesionada de ratas

Catorce días después de la hemisección, se realizo un orificio a cada lado del cráneo que recubre la corteza sensitiva motora de los miembros inferiores para localizar las fibras de CST. Se aplicó el marcador anterógrado neuronal BDA (al 10% en PBS, 3,5 \mul por corteza) en siete sitios de inyección a una profundidad de 1,5 mm de la duramadre a cada lado (Granpre, 2002). Para localizar el tracto rubroespinal en las ratas, el marcador BDA (1 \mul; MW 10,000; al 10% en PBS) se inyectó en dos núcleos rojos al lado izquierdo (5,8 mm posterior a bregma, 0,7 mm lateral, 7,0 mm ventral a la superficie del cráneo). Dos semanas después de la inyección de BDA, estos animales se prefundieron con PBS, seguido de paraformaldehido al 4%, y se recogió el tejido para histología.

La reparación de las fibras del tracto rubroespinal lesionado (RST) contribuyen a las mejorías funcionales después de la lesión de la médula espinal (Liu et al., 1999, J. Neurosci., 19, 4370-4387). La distribución generalizada del receptor Nogo 1 en las neuronas del SNC (Wang et al., 2002, J. Neurosci., 22, 5505-5515) hace posible que la inhibición del receptor Nogo 1 con los antagonistas pueda dar como resultado el nuevo crecimiento de los axones de RST después de la lesión. Para valorar los efectos de sNogoR310-Fc en RST lesionado, se marco íntegramente esta ruta inyectando BDA en los núcleos rojos. Al nivel de la médula espinal, las fibras RST están normalmente localizadas en el área de la materia blanca de la espina dorsal, y son transectadas por las hemisecciones dorsales de este estudio. En las secciones transversales 11-15 cm rostrales a la lesión de las ratas control, se aprecia un número pequeño de fibras cortas marcadas con BDA entre el RST prominente y el cuerno dorsal de materia gris. Las secciones al mismo nivel tratadas con sNogoR310-Fc exhiben muchas fibras de unión entre la RST principal y la materia del cuerno gris dorsal. Las secciones transversas 11-15 mm distales de SCI, no mostraron fibras de RST marcadas con BDA en las ratas tratadas con el vehículo. Por el contrario, las secciones al mismo nivel que reciben el tratamiento con sNogoR310-Fc muestran muchas fibras de RST marcadas con BDA tanto en la materia gris y como en la blanca contralateral a la inyección de marcaje. Se observan algunos brotes con un patrón ramificado en la materia gris ipsilateral a la inyección de BDA.

Las fibras medulares rufespinales también se examinaron en las ratas tratadas con sNogR310-Fc. El marcaje inmunológico demuestra la intensidad de las fibras serotonérgicas 11-15 mm rostrales a la lesión que es similar entre los grupos tratados con el vehiculo y con sNogR310-Fc. En las secciones situadas 11-15 mm por debajo de la lesión, las fibras serotonérgicas de las ratas tratadas con sNogR310-Fc son el doble de numerosas que las del grupo de control. Estos resultados demuestran que la sensibilidad a la inhibición del receptor Nogo 1 por la proteína con sNogR310-Fc no se limita a las fibras de CST, y que los otros tractos descendentes, tales como los axones rubroespinales y serotonérgicos, también son sensibles al antagonismo del receptor Nogo 1.

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Ejemplo 22

El tratamiento local con sNogR310-Fc mejora la recuperación funcional de las ratas

La administración intratecal de la proteína sNogR310-Fc estimula las regeneración de los axones en varias rutas descendentes después de la lesión traumática de la médula espina. Se valoró si la proteína mejoraba también la recuperación funcional en la médula espinal lesionada.

A las 2 semanas de la hemisección, la puntuación BBB locomotora en las ratas tratadas con el vehículo alcanzan un nivel de 12 (Fig. 14A). A las 4 semanas de la lesión, la mayoría de los controles (6 de 7) dan pasos frecuentes-consecuentes con soporte del peso y tienen una coordinación frecuente-consecuente de los miembros delanteros y traseros, pero presentan una rotación de la posición de la pata predominante cuando realizan el contacto inicial con la superficie. Por el contrario, en las ratas que reciben el tratamiento con proteína sNogR310-Fc, la puntuación locomotora continúa mejorando entre las semanas 2 y 4 posteriores al trauma. A las 4 semanas de la lesión, los 9 animales tratados con sNogR310-Fc tenían una coordinación de los miembros anteriores y posteriores consecuente y una posición de la pata paralela en el contacto inicial con la superficie del ensayo.

El recorrido por la rejilla se ha utilizado para evaluar los déficits del control motor fino en el descenso después de la lesión de la médula espinal (Metz et al., 2000). Este comportamiento requiere una coordinación del miembro superior e inferior y un control del movimiento voluntario por mediación de las fibras ventrolaterales, corticoespinales y rubroespinales. Durante el entrenamiento previo a la lesión, todas las ratas colocan con precisión sus patas traseras en las barras de la rejilla. A las 2-4 semanas de la lesión, las ratas control cometen de 8-9 errores por sesión con solo una mínima mejoría en el tiempo. Por el contrario, las ratas tratadas con sNogR310-Fc presentan una mejoría progresiva en el recorrido por la rejilla y realizan significativamente menos errores (promedio 4-7/ por sesión). La mejoría mayor tiene lugar 2-3 semanas después de la lesión. El análisis de las huellas de las patas traseras del grupo control muestran que la longitud del paso disminuye significativamente y la posición a lo ancho se incrementa a las 4 semanas de la hemisección, en comparación con las ratas no lesionadas o los animales lesionados que reciben tratamiento con sNogR310-Fc (Fig. 14C). Por lo tanto, estos múltiples test de comportamiento demuestran que el bloqueo de la función del receptor Nogo 1 con una inyección local de proteína antagonista mejora la recuperación locomotora después de la lesión.

Depósitos biológicos

Los hibridomas HB 7E11 (ATCC® Nº de acceso PTA-4587), HB 1H2 (ATCC® Nº de acceso PTA-4584), HB 3G5 (ATCC® Nº de acceso PTA-4586), HB 5B10 (ATCC® Nº de acceso PTA-4588) and HB 2F7 (ATCC® Nº de acceso PTA-4585) se depositaron en la Colección Americana de Cultivos Tipo (American Type Culture Collection) ("ATCC®"), 10801 University Boulevard, Manassas,VA 20110-2209, EE-UU el 9 de Agosto de 2002.

<110> Universidad de Yale, et al

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<120> ANTAGONISTAS DEL RECEPTOR NOGO

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<130> P29268EP-PCT

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<140> EP03785123.5

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<141> 2003-08-07

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<150> 60/402,866

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<151> 2002-08-10

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<160> 25

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 16

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<212> PRT

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<213> Rattus sp.

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<400> 1

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\hskip1cm

5

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<210> 2

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<211> 16

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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\hskip1cm

6

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<210> 3

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<211> 35

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<212> PRT

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<213> Rattus sp.

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<400> 3

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\hskip1cm

7

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<210> 4

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<211> 35

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

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\hskip1cm

8

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<210> 5

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 5

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\hskip1cm

9

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<210> 6

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<211> 344

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 6

\hskip1cm

10

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<210> 7

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<211> 310

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\hskip1cm

12

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 344

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus sp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\hskip1cm

13

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 310

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus sp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

15

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Ligando sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus sp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgaggagacg gtgaccgtgg tcccttggcc ccag

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggggatatcc accatgaagt tgcctgttag gctgttg

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador degenerado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggggatatcc accatgaggk ccccwgctca gytyctkgga

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 144

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia del péptido sintético de cadena ligera

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 144

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\hskip1cm

19

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 116

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia del péptido sintético de cadena pesada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\hskip1cm

20

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 114

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\hskip1cm

21

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\hskip1cm

22

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\hskip1cm

23

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\hskip1cm

24

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\hskip1cm

25

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\hskip1cm

26

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\hskip1cm

27

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador degenerado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggtsmarct gcagsagtcw gg

\hfill

22

Claims

1. Un polipéptido seleccionado entre el grupo constituido por SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, y SEQ ID NO: 5.

2. Una molécula de ácido nucléico que codifica un polipéptido según la reivindicación 1.

3. La molécula de ácido nucléico según la reivindicación 2 unida operativamente a una secuencia de control de la expresión.

4. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico según las reivindicaciones 2 o 3.

5. Una célula hospedadora que comprende la molécula de ácido nucleico según las reivindicaciones 2 o 3 o que comprende el vector según la reivindicación 4.

6. Método de producción del polipéptido según la reivindicación 1 que comprende las etapas que consisten en:

(a): cultivar la célula hospedadora según la reivindicación 5; y

(b): recuperar el polipéptido a partir de la célula hospedadora o del medio de cultivo.

7. Método de producción de un anticuerpo que comprende las etapas que consisten en:

(a): inmunizar un hospedadora con un polipéptido según la reivindicación 1 o una célula hospedadora según la reivindicación 5; y

(b): recuperar el anticuerpo.

8. El anticuerpo o fragmento de unión de su antígeno que se unen específicamente a un polipéptido según la reivindicación 1, o producido por el procedimiento según la reivindicación 7, donde dicho anticuerpo o fragmento de unión del antígeno:

(a): inhibe el colapso del cono de crecimiento de una neurona

(b): disminuye la inhibición del crecimiento de las neuritas y de su desarrollo en una neurona; o

(c): inhibe la unión del receptor Nogo 1 a un ligando.

9. El anticuerpo o fragmento de unión de su antígeno según la reivindicación 8, donde el crecimiento de las neuritas y el desarrollo es crecimiento axonal.

10. El anticuerpo o fragmento de unión de su antígeno según la reivindicación 8 o 9, donde la neurona es una neurona del sistema nervioso central.

11. Anticuerpo o fragmento de unión del antígeno según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, donde:

(a): el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal

(b): el anticuerpo es un anticuerpo murino; o

(c): el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, y un anticuerpo de cadena sencilla.

12. Una línea celular de hibridoma seleccionada entre el grupo que consiste en: HB 7E11 depositada en ATCC con el nº de acceso PTA-4587, HB 1H2 depositada en ATCC con el nº de acceso PTA-4584, HB 3G5 depositada en ATCC con el nº de acceso No. PTA-4586, HB 5B10 depositada en ATCC con el nº de acceso No. PTA-4588, y HB 2F7 depositada en ATCC con el nº de acceso PTA-4585.

13. Un anticuerpo o fragmento de unión de su antígeno producido por la línea celular del hibridoma según la reivindicación 12.

14. Un anticuerpo o fragmento de unión de su antígeno que inhibe de forma competitiva la unión de un anticuerpo según la reivindicación 13 al polipéptido según la reivindicación 1 o a un receptor Nogo 1, donde dicho anticuerpo o fragmento de unión del antígeno:

(a): inhibe el colapso del cono de crecimiento de una neurona

(b): disminuye inhibición del crecimiento de las neuritas y del desarrollo en una neurona; o

(c): inhibe la unión del receptor Nogo 1 a un ligando.

15. Un anticuerpo o fragmento de unión de su antígeno que se une específicamente al receptor Nogo 1, donde dicho anticuerpo o fragmento comprende una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionados de un grupo constituido por:

(i): la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15

(ii): la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; y

(iii): una secuencia de aminoácidos que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 22, 23 y 24 de los CDR1, CDR2 y CDR3; y donde dicho anticuerpo o fragmento de unión del antígeno:

(a): inhibe el colapso del cono de crecimiento de una neurona

(c): inhibe la unión del receptor Nogo 1 a un ligando.

16. El anticuerpo o fragmento de unión del antígeno según la reivindicación 15, que comprende además una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en

(i): la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17

(ii): la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; y

(iii): una secuencia de aminoácidos que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 19, 20 y 21 de los CDR1, CDR2 y CDR3.

17. Un anticuerpo o fragmento de unión de su antígeno que se une específicamente al receptor Nogo 1, donde dicho anticuerpo o fragmento comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos elegidos de un grupo constituido por:

(i): la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17

(ii): la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; y

(iii): una secuencia de aminoácidos que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 19, 20 y 21 de los CDR1, CDR2 y CDR3; y donde dicho anticuerpos o fragmento de unión del antígeno:

(a): inhibe el colapso del cono de crecimiento de una neurona

(c): inhibe la unión del receptor Nogo 1 a un ligando.

18. El anticuerpo o fragmento de unión del antígeno según la reivindicación 17, que comprende además una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en

(i): la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15

(ii): la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:16; y

(iii): la secuencia de aminoácidos que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 22, 23 y 24 de los CDR1, CDR2 y CDR3.

19. Un polipéptido del receptor Nogo 1 soluble seleccionado entre el grupo constituido por: los restos aminoácidos 26-344 de SEQ ID NO: 6; los restos aminoácidos 26-310 de SEQ ID NO: 7; los restos aminoácidos 26-344 de SEQ ID NO: 8; los restos aminoácidos 26-310 de SEQ ID NO: 9; los restos aminoácidos 27-344 de SEQ ID NO: 8; y los restos aminoácidos 27-310 de SEQ ID NO: 9.

20. El polipéptido del receptor Nogo 1 soluble según la reivindicación 19 unido a una secuencia señal.

21. Una molécula de ácido nucléico que codifica el polipéptido del receptor Nogo 1 soluble según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 20.

22. La molécula de ácido nucléico según la reivindicación 21 unida operativamente a una secuencia de control de la expresión.

23. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 21 o 22.

24. Célula hospedadora que comprende la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 21 o 22 o que comprende el vector según la reivindicación 23.

25. Método de producción del polipéptido del receptor Nogo 1 soluble según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 20, que comprende las etapas que consisten en:

(a): cultivar la célula hospedadora según la reivindicación 24; y

26. Una proteína de fusión del receptor Nogo 1 que comprende:

(a): los restos aminoácidos 26-344 de SEQ ID NO: 6; los restos aminoácidos 26-310 de SEQ ID NO: 7; los restos aminoácidos 26-344 de SEQ ID NO: 8; los restos aminoácidos 26-310 de SEQ ID NO: 9; los restos aminoácidos 27-344 de SEQ ID NO: 8; y los restos aminoácidos 27-310 SEQ ID NO: 9; y

(b): un polipéptido heterólogo que comprende:

(i): una región constante de inmunoglobulina; o

(ii): una región Fc.

27. La proteína de fusión del receptor Nogo 1 según la reivindicación 26, que es un dímero.

28. La proteína de fusión del receptor Nogo 1 según la reivindicación 26 o 27, en la que la región constante de la inmunoglobulina es una región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina.

29. La proteína de fusión del receptor Nogo 1 según la reivindicación 28, en la que la región constante de la inmunoglobulina es una región constante de la cadena pesada de una IgG.

30. La proteína de fusión del receptor Nogo 1 según cualquiera de las reivindicaciones 26 a 29, que comprende además una secuencia señal.

31. Una molécula de ácido nucléico que codifica la proteína de fusión del receptor Nogo 1 según una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 30.

32. La molécula de ácido nucléico según la reivindicación 31 unida operativamente a una secuencia de control de la expresión.

33. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 31 o 32.

34. Una célula hospedadora que comprende la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 31 o 32 o que comprende el vector según la reivindicación 33.

35. Método de producción de la proteína de fusión del receptor Nogo 1 según una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 30, que comprende la etapas que consisten en:

(a): cultivar la célula hospedadora según la reivindicación 34; y

(b): recuperar la proteína de fusión del receptor Nogo 1 a partir de la célula hospedadora o del medio de cultivo.

36. Método de producción de un anticuerpo específico del receptor Nogo 1 que comprende las etapas que consisten en:

(a): inmunizar un hospedadora con un polipéptido del receptor Nogo 1 soluble según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 20, una proteína de fusión del receptor Nogo 1 según una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 30 o una célula hospedadora según la reivindicación 24 o 34; y

(b): recuperar el anticuerpo.

37. Un anticuerpo o fragmento de unión de su antígeno que se une específicamente a un polipéptido del receptor Nogo 1 soluble según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 20, o producido por el método según la reivindicación 36, donde dicho anticuerpo o fragmento de unión del antígeno:

(a): inhibe el colapso del cono de crecimiento de una neurona

(b): disminuye la inhibición del crecimiento de las neuritas y del desarrollo en una neurona; o

(c): inhibe la unión del receptor Nogo 1 a un ligando.

38. Método in vitro de inhibición de la unión del receptor Nogo 1 a un ligando, que comprende la etapa que consiste en:

(a): poner en contacto el receptor Nogo 1 con un anticuerpo o un fragmento de unión del antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 y 13 a 18; o

(b): poner en contacto el ligando con el polipéptido del receptor Nogo 1 soluble según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 20 o la proteína de fusión del receptor Nogo 1 según una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 30.

39. Utilización de un anticuerpo o de un fragmento de unión del antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 y 13 a 18 o del polipéptido del receptor Nogo 1 soluble según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 20, o de la proteína de fusión del receptor Nogo 1 según una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 30, para la preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento de un mamífero que presenta señales o síntomas de esclerosis múltiple, ELA, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, neuropatía diabética, ictus, traumatismos craneoencefálicos o lesiones de la médula espinal.

40. Método in vitro de modulación de una actividad de un ligando del receptor Nogo 1, que comprende la etapa que consiste en poner en contacto el ligando del receptor Nogo 1 con un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 20 o la proteína de fusión del receptor Nogo 1 según una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 30.

41.Utilización del polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 20, o de la proteína de fusión del receptor Nogo 1 según una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 30, para la preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento de un mamífero que presenta señales o síntomas de esclerosis múltiple, ELA, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, neuropatía diabética, ictus, traumatismos craneoencefálicos o lesiones de la médula espinal.

42. Método in vitro de inhibición del colapso del cono de crecimiento en una neurona, que comprende la etapa que consiste en:

(a): poner en contacto la neurona con el anticuerpo o el fragmento de unión de su antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 y 13 a 18; o

(b): poner en contacto un ligando del receptor Nogo 1 con el polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 20 o la proteína de fusión del receptor Nogo 1 según una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 30.

43. Método in vitro de disminución del crecimiento de neuritas o de desarrollo en una neurona que comprende la etapa que consiste en:

44. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 38, 40, 42 y 43, en el que el ligando se elige entre el grupo formado por NogoA, NogoB, NogoC, MAG y OM-gp.

45. Método según la reivindicación 43, en el cual el crecimiento de las neuritas y el desarrollo es crecimiento axonal.

46. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 42, 43 y 45, en el cual la neurona es una neurona del SNC.

47. Una composición que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y un componente elegido entre:

(a): el anticuerpo o un fragmento de unión del antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, 13 a 18 y 37;

(b): el polipéptido del receptor Nogo 1 soluble según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 20; y

(c): la proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 30.

48. La composición según la reivindicación 47, que comprende uno o varios agentes terapéuticos adicionales.

49. Método in vitro que permite favorecer la supervivencia de una neurona en peligro de muerte, que comprende poner en contacto la neurona con una cantidad eficaz de:

(a): un anticuerpo anti-receptor Nogo 1 o de un fragmento de unión del antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 y 13 a 18; o

(b): un polipéptido del receptor Nogo 1 soluble según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 20; o

(c): una proteína de fusión del receptor Nogo 1 según una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 30.

50. Método según la reivindicación 49 o utilización según la reivindicación 39 o 41, donde la proteína de fusión es una proteína de fusión de Fc.

51. Método de utilización según la reivindicación 50, donde la proteína de fusión de Fc se compone de los restos aminoácidos 26 a 344 de SEQ ID NO: 8 y de la región bisagra y Fc de la molécula de IgG1 de rata (Ig-sNogoR344).

52. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 49 a 51, en el que la neurona proviene de un mamífero.

53. Método según la reivindicación 52, en el que el mamífero presenta señales o síntomas de esclerosis múltiple, ELA, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, neuropatía diabética, ictus, traumatismos craneoencefálicos o lesiones de la médula espinal.

54. Utilización de una célula hospedadora cultivada que expresa:

(a): un anticuerpo anti-receptor Nogo 1 o un fragmento de unión de su antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 y 13 a 18; o

(c): una proteína de fusión del receptor Nogo 1 según una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 30;

para la preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento de un mamífero que presenta señales o síntomas de esclerosis múltiple, ELA, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, neuropatía diabética, ictus, traumatismos craneoencefálicos o lesiones de la médula espinal.

55. Utilización de un vector viral que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica:

para la preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento de un mamífero que presenta señales o síntomas de esclerosis múltiple, ELA, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, neuropatía diabética, ictus, traumatismos craneoencefálicos o lesiones de la médula espinal, donde el anticuerpo anti receptor Nogo 1, el fragmento de unión del antígeno, la proteína de fusión del receptor Nogo 1 o el polipéptido del receptor Nogo 1 soluble deben expresarse a partir de la secuencia nucleotídica del mamífero en una cantidad suficiente para favorecer la supervivencia de una neurona en peligro de muerte.