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DE69228269T2 - Polyäthylenglycolprotein Konjugate - Google Patents

Polyäthylenglycolprotein Konjugate

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DE69228269T2
DE69228269T2 DE69228269T DE69228269T DE69228269T2 DE 69228269 T2 DE69228269 T2 DE 69228269T2 DE 69228269 T DE69228269 T DE 69228269T DE 69228269 T DE69228269 T DE 69228269T DE 69228269 T2 DE69228269 T2 DE 69228269T2
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DE
Germany
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protein
oxy
ethanediyl
peg
sru
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DE69228269T
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DE69228269D1 (de
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John Hakimi
Patricia Kilian
Perry Rosen
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HOFFMANN LA ROCHE
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
HOFFMANN LA ROCHE
F Hoffmann La Roche AG
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Publication date
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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft neue Polyethylenglycol (PEG)-Konjugate von Proteinen.
  • Zahlreiche natürliche und rekombinante Proteine weisen medizinische und pharmazeutische Anwendbarkeit auf. Wenn sie einmal gereinigt, getrennt und formuliert sind, können sie für verschiedene therapeutische Indikationen parenteral verabreicht werden. Jedoch können parenteral verabreichte Proteine immunogen sein, relativ wasserunlöslich sein und können eine kurze pharmakologische Halbwertszeit aufweisen. Folglich kann es schwierig sein, bei den Patienten therapeutisch brauchbare Blutspiegel der Proteine zu erzielen.
  • Diese Probleme können durch Konjugieren der Proteine an solche Polymere, wie Polyethylenglycol, gelöst werden. Davis et al., US-A-4 179 337 offenbaren Konjugieren von Polyethylenglycol (PEG) an Proteine, wie Enzyme und Insulin, zu Konjugaten, in denen das Protein weniger immunogen sein würde und einen wesentlichen Teil seiner physiologischen Aktivität beibehalten würde. Nakagawa et al., US-A-4 791 192 offenbaren Konjugieren von PEG an Insel-aktivierendes Protein zur Verminderung seiner Nebenwirkungen und Immunogenizität. Veronese et al., Applied Biochem. and Biotech, 11: 141-152 (1985) offenbaren Aktivierung von Polyethylenglycolen mit Chlorameisensäurephenylestern zur Modifizierung einer Ribonuclease und einer Superperoxiddismutase. Katre et al., US-A-4 766 106 und 4 917 888 offenbaren ebenfalls das Solubilisieren von Proteinen durch Polymerkonjugation. PEG und andere Polymere werden an rekombinante Proteine konjugiert, um die Immunogenizität zu vermindern und die Halbwertszeit zu erhöhen, siehe Nitecki, et al., US-A-4 902 502, Enzon, Inc., Internationale Anmeldung Nr. PCT/US90/02133, Nishimura et al., Europäische Patentanmeldung 154 316 und Tomasi, Internationale Anmeldung Nr. PCT/US85/02572. King et al., Int. Archs. Allergy appl. Immun. 66, 439-446 (1981) beschreiben ein Verfahren zum Binden von Proteinen an PEG durch Anwendung von O-(RO-PEG)-S- Carboxamidomethyldithiocarbonat-Zwischenprodukten.
  • Frühere Verfahren zur Bildung von PEG-Protein-Konjugaten und die Konjugate aus diesen Verfahren werfen verschiedene Probleme auf. Unter diesen Problemen ist auch jenes, daß bestimmte Verfahren zur Bildung dieser Protein-PEG- Konjugate das Protein inaktivieren können, so daß die erhaltenen Konjugate mangelhafte biologische Aktivität aufweisen können. Außerdem können bestimmte, zur Bildung dieser PEG- Protein-Konjugate verwendete verbindende Gruppen (Linker) der hydrolytischen in-vivo-Spaltung unterliegen. Wenn solche Spaltung nach der Verabreichung auftritt, verlieren diese Konjugate die vorteilhaften Eigenschaften, die durch PEG bereitgestellt werden.
  • Die vorliegende Erfindung stellt neue PEG-Protein- Konjugate durch die Verwendung von einzigartigen Linkem bereit, die die verschieden freien Aminogruppen in einem Protein an PEG binden, wodurch man die mit der Bildung von Konjugaten von einem Protein mit PEG verbundenen Probleme umgeht.
  • Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein physiologisch aktives Konjugat eines Proteins der Formel bereit
  • worin R¹ Niederalkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen darstellt; R² -O- oder -NH- darstellt; R³ =N-R&sup4;, =S oder =O darstellt; R&sup4; Nieder-C&sub1;-C&sub6;-alkyl oder Cycloalkyl darstellt; m und n derart aus ganzen Zahlen ≥ 1 ausgewählt sind, daß das Konjugat mindestens einen Teil der biologischen Aktivität des nichtkonjugierten Proteins aufweist, und worin das Protein Interleukin-1, Interleukin-1ra, Interferon-α oder Interleukin-2 darstellt; mit der Maßgabe, daß, wenn R² -O- darstellt, R³ nicht =N-R&sup4; darstellt, und daß, wenn R² -O- dar stellt und R³ =O darstellt, das Protein nicht Interleukin-2 ist.
  • Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung Protein-Konjugate der Formeln:
  • bereit,
  • wobei R¹, R&sup4;, m, n und das Protein wie vorstehend definiert sind.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung haben wir ebenfalls das erste Mal das an PEG konjugierte Protein Interleukin-1- Rezeptorantagonist (IL-1ra) und Interleukin-1 (IL-1) bereitgestellt.
  • Gemäß dieser Erfindung wird das Konjugat eines Proteins nach Formel I durch Kondensieren von aktiviertem PEG, d. h. PEG, worin eine Hydroxygruppe durch einen aktivierten Linker ersetzt wurde, mit einer oder mehreren der freien Aminogruppen in dem Protein hergestellt. Die zur Herstellung des Konjugats verwendeten aktivierten PEG-Verbindungen weisen die nachstehenden Formeln auf:
  • II-A R¹O(CH&sub2;CH&sub2;O)n-CH&sub2;CH&sub2;-N=C=n-R&sup4;
  • II-D R¹O(CH&sub2;CH&sub2;O)n-CH&sub2;-CH&sub2;-N=C=S
  • worin R¹ Niederalkyl darstellt, R&sup4; Niederalkyl oder Cycloalkyl darstellt, R&sup5; Niederalkyl oder H darstellt und n eine ganze Zahl von 1 bis 1000 ist.
  • Gemäß der Erfindung wird durch Verwendung der aktivierten PEG-Verbindung der Formel II-A, II-B, II-C, II-D, II- E, II-F oder II-G zur Herstellung der Konjugate eine verbindende Bindung zwischen den freien Aminogruppen in dem Protein und dem PEG gebildet, so daß das erhaltene Konjugat mindestens einen Teil der biologischen Aktivität des Proteins unter Verminderung seiner Immunogenizität beibehält. Außerdem erzeugen die in dem Konjugat der Erfindung durch die Verwendung einer der aktivierten Polyethylenglycole der Formeln II-A bis II-G gebildeten Bindungsgruppen ein Protein-Konjugat, das für eine hydrolytische in-vivo-Spaltung nicht sehr anfällig ist und keinen der vielen bei bekannten PEG-Protein- Konjugaten vorliegenden Nachteile aufweist.
  • Gemäß dieser Erfindung können R¹ und R&sup5; Niederalkyl, vorzugsweise Methyl, sein. Der Ausdruck Niederalkyl bezeichnet Niederalkylgruppen, die 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthalten, wie Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, usw.. Im allgemeinen ist die bevorzugte Alkylgruppe eine Niederalkylgruppe, die 1 bis 4 Kohlenstoffatome enthält, wobei Methyl besonders bevorzugt ist.
  • Gemäß dieser Erfindung können m und n aus einer beliebigen ganzen Zahl ≥ 1 in einer solchen Weise ausgewählt werden, daß das erhaltene Konjugat eines Proteins mindestens einen Teil der biologischen Aktivität des das Konjugat bildenden Proteins aufweist. Es wird deutlich, daß die Summe von n und m umgekehrt proportional zum Grad der biologischen Aktivität des Proteins ist, die von dem Konjugat beibehalten wird. Der Zahlenwert von n bezüglich der Zahl an Ethylenglycoleinheiten in dem Polyethylenglycol, das das Konjugat bildet, liegt zwischen 1 und 1000. Der Ausdruck m bezieht sich auf die Zahl der freien, in dem Protein enthaltenen Aminogruppen, die mit dem aktivierten PEG umgesetzt werden. Vorzugsweise liegt der Wert von m im Bereich von 1 bis 5, wobei 1 der besonders bevorzugt ist. Je höher der Wert von m + n, um so höher ist das Molekulargewicht des Konjugats. Die Molekulargewichte der Polyethylenglycolpolymere der Formeln II- A bis II-G und der Protein-Konjugate der Formeln I und I-A bis I-E können leicht durch den Fachmann bestimmt werden. Aus den bestimmten Molekulargewichten können die Werte von m und n geschlußfolgert werden. Der Ausdruck Protein umfaßt einerseits Polypeptide und andererseits physiologisch verträgliche Additionssalze.
  • Wenn die Verbindung von einer der Formeln II-A bis II-G mit dem Protein umgesetzt wird und das Protein mehr als eine freie Aminogruppe enthält, kann das Konjugat als Gemisch verschiedener Protein-PEG-Konjugate hergestellt werden. Wenn das Protein zwei freie Aminogruppen enthält, kann das aktivierte PEG sowohl mit einer der freien Aminogruppen, als auch mit beiden freien Aminogruppen umgesetzt werden. In dieser Situation enthält das Gemisch ein Konjugat, gebildet, wenn zwei freie Aminogruppen mit PEG umgesetzt werden und ein zweites Konjugat, gebildet, wenn nur eine freie Aminogruppe mit dem PEG umgesetzt wird. Da die verschiedenen Konjugate in diesem Gemisch unterschiedliche Molekulargewichte aufweisen, können diese Konjugate durch übliche Verfahren, wie Chromatographie, getrennt werden. Um zu bestimmen, ob m und n geeignet ausgewählt sind, können die getrennten Konjugate durch die gleichen zum Absuchen des Stammproteins verwendeten Mittel, die zur Bestimmung, ob das Konjugat noch einen Teil der biologischen Aktivität des Proteins, das zur Bildung des Konjugats verwendet wurde, beibehält, auf biologische Aktivität abgesucht werden. Auf diese Weise können die Zahlen m und n in beliebig gewünschter Weise eingestellt werden, um die gewünschte Aktivität bereitzustellen.
  • Gemäß der bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung sind m und n eine beliebige ganze Zahl, so daß das Molekulargewicht des Konjugats, ausschließlich des Gewichts des Proteins, zwischen ungefähr 300 bis ungefähr 30 000 Dalton liegt. Gemäß der bevorzugten Ausführungsform ist m 1. Wenn m 1 ist, kann dieses Konjugat erhalten werden, auch wenn zwei oder mehrere freie Aminogruppen vorliegen. Die aktivierte PEG-Verbindung wird zunächst mit einer der freien Aminogruppen, die in den Proteingruppen enthalten sind, reagieren. Durch Einstellen der Konzentration der Reagenzien, wie dem Protein, und der Reaktionsbedingungen, gemäß den Standardverfahren der Aminkondensation, kann man den Pegylierungsgrad der in dem Protein enthaltenen freien Aminogruppen steuern. In Proteinen, die eine oder mehrere freie Aminogruppen enthalten, worin eine der freien Aminogruppen reaktiver ist als die anderen Aminogruppen, können die Bedingungen so ausge wählt sein, daß das Protein mit der aktivierten PEG-Verbindung unter Bildung der Verbindung der Formel I, worin m 1 ist, umgesetzt wird. Andere freie Aminogruppen, die in den Aminosäuren enthalten sind, die das Protein bilden, können anschließend mit dem PEG umgesetzt werden, indem man die Kondensationsreaktion länger ausführt oder durch Anwenden anderer stärkerer Bedingungen. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist n, wenn m 1 ist, eine beliebige ganze Zahl, so daß das das Konjugat bildende Polyethylenglycol ein Molekulargewicht von 300 bis 30 000 Dalton aufweist, was einem Wert für n von ungefähr 6 bis 680 entspricht. Insbesondere ist n etwa 28, 112 und 225 entsprechend den Molekulargewichten von 1325, 5000 bzw. 10 000, und wobei n im Bereich von 112 besonders bevorzugt ist. Das Charakterisieren des Polyethylenglycolpolymers durch das Molekulargewicht ist bevorzugt gegenüber der Nennung der sich wiederholenden Einheiten in dem PEG-Polymer mit der ganzen Zahl n, aufgrund der potentiellen Inhomogenität der PEG-Ausgangsverbindungen, die gewöhnlich durch ihr mittleres Molekulargewicht und nicht durch ihre sich wiederholenden Einheiten definiert werden. Die PEG- Ausgangsverbindungen der verschiedenen Molekulargewichte können durch im Stand der Technik bekannte Verfahren hergestellt werden oder können von kommerziellen Anbietern erhalten werden.
  • Wenn die durch Bestimmung der Molekulargewichte erhaltenen Werte von m und n keine ganzen Zahlen sind (wie es im allgemeinen der Fall ist); müssen ihre Werte in üblicher Weise auf- oder abgerundet werden.
  • Wenn R&sup4; Niederalkyl darstellt, kann R&sup4; eine beliebige, wie vorstehend definierte Niederalkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen sein. Wenn R&sup5; Cycloalkyl darstellt, ist R&sup5; vorzugsweise eine Cycloalkylgruppe, die 3 bis 7 Kohlenstoffatome enthält, wie Cyclopropyl, Cyclopentyl, Cyclobutyl und Cyclohexyl. Die bevorzugte Cycloalkylgruppe ist Cyclohexyl.
  • Die Titelverbindungen von jedem der nachstehenden Beispiele werden gemäß der IUPAC-Nomenklatur benannt. Diese Verbindungen können jedoch ebenfalls wie nachstehend benannt werden:
    • Beispiele 1, 2, 3 und 4:
  • α-[2-[[Cyclohexylcarbonimidoyl)-amino]ethyl]-ω-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl) wird alternativ α-[2-[[(Cyclohexylamino)methylen]amino]ethyl]-ω-methoxypoly-(oxy-1,2-ethandiyl) genannt.
    • Beispiele 1A, 1a und 1d:
  • α-(2-Chlorethyl)-ω-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl) wird alternativ α-Methoxy-ω-(2-chlorethyl)poly(oxy-1,2-ethandiyl) genannt.
    • Beispiele 1B, 1b und 1e:
  • α-(2-Azidoethyl)-ω-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl) wird alternativ α-Methoxy-ω-(2-azidoethyl)poly(oxy-1,2-ethandiyl) genannt.
    • Beispiele 1C, 1c und 1f:
  • α-(2-Aminoethyl)-ω-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl) wird alternativ α-Methoxy-ω-(2-aminoethyl)poly(oxy-1,2-ethandiyl) genannt.
  • Beispiele 11, 11a, 11b, 12, 12A und 13-17: α-Methyl- ω-[2-[[(2-Pyridinyloxy)carbonyl]amino]ethoxy]poly(oxy-1,2- ethandiyl) wird alternativ α-[2-[[(2-Pyridinyloxy)carbonyl]- amino]ethyl]-ω-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl) genannt.
    • Beispiele 18, 18a, 19, 19A, 20, 20A, 21 und 22:
  • α-[(2-Pyridinyloxy)carbonyl]-ω-methoxypoly(oxy-1,2- ethandiyl) wird alternativ α-Methyl-ω-[2-[[(2-pyridinyloxy)- carbonyl]oxy]-ethoxy]poly-(oxy-1,2-ethandiyl) genannt.
    • Beispiele 23-27:
  • α-[2-(Isothiocyanato)ethyl]-ω-methoxypoly(oxy-1,2- ethandiyl) wird alternativ α-[Methoxy-ω-[2-(isothiocyanato)- ethyl]poly(oxy-1,2-ethandiyl) genannt.
    • Beispiel 28:
  • α-[(2-Pyridinyloxy)thiocarbonyl]-ω-methoxypoly(oxy- 1,2-ethandiyl) wird alternativ α-Methyl-ω-[2-[[(2-pyridinyloxy)thiocarbonyl]oxy]ethoxy]-poly(oxy-1,2-ethandiyl) genannt.
  • Die vorliegende Erfindung umfaßt ebenfalls das Verfahren zur Herstellung von PEG-Protein-Konjugaten der allgemeinen Formel I oder Formeln I-A bis I-E, wobei das Verfahren Umsetzen von einer der aktivierten Verbindungen der allgemeinen Formeln
  • II-A R¹O(CH&sub2;CH&sub2;O)n-CH&sub2;CH&sub2;-N=C=N-R&sup4;
  • II-D R¹O(CH&sub2;CH&sub2;O)n-CH&sub2;-CH&sub2;-N=C=S
  • worin R¹, R&sup5; und n wie vorstehend definiert sind, mit einer freien Aminogruppe von einem Protein oder einem Salz davon und Isolieren des Protein-Konjugats aus dem Reaktionsgemisch umfaßt.
  • Insbesondere kann die Synthese der einzelnen PEG-Derivate, die mit einem Protein gekuppelt werden, sowie deren Reaktion mit dem Protein, wie in den nachstehenden Abschnitten und in den Beispielen beschrieben, ausgeführt werden.
  • Um das Protein-Konjugat, worin R² -NH- darstellt und R³ =N-R&sup4; darstellt (die Verbindung der Formel I-A), herzustellen, kann das nachstehende Reaktionsschema angewendet werden:
  • worin R¹, R&sup4;, n, m und das Protein wie vorstehend definiert sind.
  • In dem Reaktionsschema wird die Hydroxylgruppe am Ende des PEG-Moleküls zu einer Halogengruppe durch übliche Mittel, wie durch Behandlung mit einem Thionylhalogenid, umgewandelt. Das erhaltene PEG-Halogenid wird zu einem Azid durch übliche Mittel, wie durch Behandlung mit Natriumazid, umgewandelt. Das PEG-Azid kann dann zu einem Amin durch übliche Mittel, wie Hydrierung, umgewandelt werden. Das PEG-Amin wird dann mit einem Alkyl- oder Cycloalkylisothiocyanat, wie Cyclohexylisothiocyanat, unter Bildung des Thioharnstoffs der Formel III umgesetzt, der dann durch übliche Mittel unter Bildung der Verbindung der Formel II-A entschwefelt wird, die die funktionelle Carbodiimidgruppe enthält. Beim Umwandeln des Thioharnstoffs der Formel III in das PEG-Carbodiimid der Formel II-A ist das bevorzugte Entschwefelungsmittel Triphenylphosphin.
  • Das PEG-Carbodiimid der Formel II-A kann dann mit einem Protein unter beliebigen üblichen Bedingungen zum Kondensieren von Carbodiimiden mit Aminen kondensiert werden. Im allgemeinen wird diese Reaktion in einer wässerigen Standard- Pufferlösung mit einem pH-Wert zwischen 7 und 9 unter Herstellung des Konjugats der Formel I-A ausgeführt. Die erhaltene Kondensationsreaktion kann, in Abhängigkeit von der Anzahl der freien Aminogruppen in dem Protein und der Reaktionszeit, ein Gemisch von PEG-Protein-Konjugaten von verschiedenen Molekulargewichten erzeugen. Die PEG-Protein-Konjugate können dann in ihre einzelnen Komponenten durch übliche Verfahren, wie Hochleistungs-Flüssig-Chromatographie oder Gelelektrophorese, aufgetrennt werden.
  • Zur Herstellung des Protein-Konjugats, worin R² -O- darstellt und R³ =S darstellt (die Verbindung der Formel I- B), kann das nachstehende Reaktionsschema angewendet werden.
  • worin R¹, m, n und das Protein wie vorstehend definiert sind.
  • In dieser Reaktion wird ein PEG mit 1,1-Carbonothioylbis-2(1H)-pyridinon in einem hochsiedenden Kohlenwasserstofflösungsmittel unter Herstellung der Verbindung der Formel II-B unter Rückfluß erhitzt. Die Verbindung der Formel II-B kann mit einer oder mehreren der freien Aminogruppen des Proteins unter Herstellung des Konjugats der Formel I-B in der gleichen Weise, wie im Zusammenhang mit der Kondensation der Verbindung der Formel II-A mit einem Protein zur Herstellung des Konjugatgemisches der Formel I-A beschrieben, kondensiert werden. Die Trennung dieses Gemisches kann gemäß den Molekulargewichten der wie vorstehend beschriebenen, gebildeten Produkte ausgeführt werden.
  • Alternativ kann das Proteinkonjugat der vorliegenden Erfindung, worin R² -O- darstellt und R³ =S darstellt (die Verbindung der Formel I-B), durch das nachstehende Reaktionsschema hergestellt werden:
  • worin R¹, m, n und das Protein wie vorstehend definiert sind.
  • Gemäß diesem Schema wird PEG mit dem Thiocarbonat der Formel VI in einem organischen Lösungsmittel zur Bildung des PEG-Thiocarbonats der Formel II-F umgesetzt. Ein übliches Verfahren zum Kondensieren eines Thiocarbonats mit einer Hydroxygruppe kann zur Ausführung dieser Reaktion verwendet werden.
  • Die Verbindung der Formel II-F wird zu dem Konjugat der Formel I-B durch Kondensieren der Verbindung der Formel II-F mit mindestens einer freien Aminogruppe des Proteins umgewandelt. Diese Reaktion wird in der für die Umwandlung der Verbindung der Formel II-A zu dem Konjugat der Formel I-A beschriebenen Weise ausgeführt. Das durch diese Reaktion hergestellte Produkt kann, in Abhängigkeit von der Menge der freien Aminogruppen in dem verwendeten Protein, ein Gemisch von Konjugaten mit unterschiedlichen Molekulargewichten sein.
  • Diese Konjugate können durch das Molekulargewicht gemäß dem hierin vorstehend beschriebenen Verfahren getrennt werden.
  • Zur Herstellung des Protein-Konjugats, worin R² -NH- darstellt und R³ =O darstellt (die Verbindung der Formel I- C), kann das nachstehende Reaktionsschema angewendet werden:
  • worin R¹, R&sup5;, m, n und das Protein wie vorstehend definiert sind.
  • Die Verbindung der Formel IV wird durch Kondensieren von Phosgen mit 2-Hydroxypyridin (substituiert, wenn R&sup5; = Niederalkyl), unter Verwendung eines üblichen Verfahrens zum Kondensieren eines Säurehalogenids mit einem Alkohol, hergestellt.
  • Die Kondensation eines PEG-Amins mit der Verbindung der Formel IV wird durch Erhitzen unter Rückfluß in einem halogenierten Kohlenwasserstofflösungsmittel unter Herstellung der Verbindung der Formel II-C bewirkt. Die Verbindung der Formel II-C wird mit dem Protein durch eine oder mehrere freie Aminogruppen unter Herstellung der Verbindung der Formel I-C an das Protein kondensiert. Diese Reaktion wird in der für die Kondensation der Verbindung der Formel II-A zur Herstellung des Konjugats der Formel I-A beschriebenen Weise ausgeführt. In Abhängigkeit von der Anzahl der freien Aminogruppen, die in dem Protein enthalten sind, die mit der Verbindung der Formel II-C reagieren, kann das Konjugat der Formel I-C als ein Gemisch von Konjugaten mit unterschiedlichen Molekulargewichten gebildet werden. Dieses Konjugatgemisch kann in der vorstehend beschriebenen Weise getrennt werden.
  • Zur Herstellung des Protein-Konjugats der vorliegenden Erfindung, worin R² -NH- darstellt und R³ =S darstellt (die Verbindung der Formel I-D), kann das nachstehende Reaktionsschema verwendet werden.
  • worin R¹, m, n und das Protein wie vorstehend definiert sind.
  • In diesem Reaktionsschema wird PEG mit Di-2-pyridylthionocarbonat unter Herstellung der Verbindung der Formel II-D umgesetzt. In diesem Verfahren kann ein beliebiges übliches Verfahren zum Kondensieren eines Amins mit einem Thiocarbonat zur Herstellung eines Isothiocyanats verwendet werden. Die Verbindung der Formel II-D wird mit dem Protein unter Bildung des Konjugats der Formel I-D in der vorstehend für die Umwandlung der Verbindung der Formel II-A zu der Verbindung der Formel I-A beschriebenen Weise umgesetzt. In Abhängigkeit von der Menge der freien Aminogruppen, die in dem Protein enthalten sind, erzeugt die Kondensation der Verbindung der Formel II-D mit dem Protein ein Gemisch von Konjugaten, das in seine einzelnen Komponenten in der vorstehend für die Trennung des Konjugats der Formel I beschriebenen Weise aufgetrennt werden kann.
  • Alternativ kann die Verbindung der Formel I-D unter Verwendung des nachstehenden Reaktionsschemas hergestellt werden:
  • Die Verbindung der Formel V wird durch Kondensieren von Thiophosgen mit 2-Hydroxypyridin (substituiert, worin R&sup5; Niederalkyl darstellt) unter Verwendung eines beliebigen üblichen Verfahrens zum Kondensieren eines Säurehalogenids mit einem Alkohol hergestellt. V wird dann mit einem PEG-Amin in der zur Herstellung der Verbindung von II-C beschriebenen Weise umgesetzt. Die erhaltene Verbindung ist II-E. Die Verbindung der Formel II-E wird mit einer oder mehreren freien Aminogruppen an einem Protein zur Herstellung des Konjugats der Formel I-D kondensiert. Diese Reaktion wird in der für die Bildung von Konjugat I-A beschriebenen Weise ausgeführt.
  • Um eine Proteinzusammensetzung der vorliegenden Erfindung, worin R² -O- darstellt und R³ O darstellt (die Verbindung der Formel I-E), herzustellen, kann das nachstehende Reaktionsschema verwendet werden.
  • worin R¹, m, n und das Protein wie vorstehend definiert sind.
  • In dem vorstehenden Reaktionsschema wird Di-2-pyridylcarbonat mit PEG zur Herstellung der Verbindung der Formel II-G umgesetzt. Diese Reaktion wird durch Bedingungen, die beim Kondensieren eines Alkohols mit einem Carbonat üblich sind, ausgeführt. Die Verbindung der Formel II-G wird durch Kondensieren der Verbindung der Formel II-G mit einer oder mehreren freien Aminogruppen in dem Protein zu der Verbindung der Formel I-E umgewandelt. Diese Reaktion wird in der gleichen Weise, wie im Zusammenhang mit der Umwandlung der Verbindung der Formel II-A zu der Verbindung der Formel I-A beschrieben, ausgeführt. Das so hergestellte Reaktionsgemisch kann ein Gemisch Konjugate der Formel I-E, in Abhängigkeit von den freien Aminogruppen, die in dem Protein enthalten sind, enthalten. Dieses Gemisch besteht aus einem Gemisch von verschiedenen Konjugaten mit unterschiedlichen Molekulargewichten. Die verschiedenen Konjugate können aus dem Gemisch gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren abgetrennt werden.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung kann ein Konjugat von einem Interferon-α mit PEG durch das nachstehende Reaktionsschema hergestellt werden:
  • worin R¹ Methyl darstellt, n etwa 112 ist. Diese Reaktion ist von besonderem Interesse für Interferon-α von dem Subtyp Interferon-α A (ebenfalls Interferon-α 2 genannt).
  • Die Synthese der aktivierten PEG-Verbindung II-C wird vorstehend im Zusammenhang mit der Synthese eines Proteinkonjugats, worin R² -NH- darstellt und R³ =O darstellt, beschrieben. Das Endkonjugat von Interferon-α kann in analoger Weise, wie vorstehend oder in den Beispielen für die Synthese des Proteinkonjugats I-C beschrieben, erhalten werden.
  • Ein beliebiges Protein mit einer physiologischen Aktivität oder ein Salz davon kann zur Herstellung eines Konjugats mit PEG verwendet werden, vorausgesetzt, daß dieses Protein mindestens eine Aminogruppe zur Kondensation enthält.
  • Bevorzugte Proteine, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind Interleukin-1 (IL-1), Interleukin-1 Rezeptor-Antagonist (IL-1ra), Interleukin-2 (IL- 2) und Interferone, wie IFN-α (Leukozyt-Interferone), IFN-β (Fibroblast-Interferon) und IFN-γ (Immun-Interferon), deren natürlich vorkommende Formen sowie Analogen, Homologen oder Rumpf-Formen davon.
  • Der Interleukin-1 Rezeptor-Antagonist (IL-1ra) hierin kann aus Gewebskulturen oder durch rekombinante Techniken erhalten werden. Ein Verfahren zum Gewinnen von IL-1ra ist die Behandlung von U937 myelomonozyten Humanzellen (ATCC CRL 1593) mit dem differenzierenden Mittel Phorbolmyristatacetat (PMA) und anschließend ihre Stimulierung mit Granulozyten Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor (GM-CSF, erhältlich von Amgen) und Isolieren und Reinigen des IL-1ra aus der Kulturüberstandsflüssigkeit, wie von Carter et al., Nature 344, 633-637 (1990), beschrieben.
  • Rekombinantes IL-1ra bezieht sich auf IL-1ra mit vergleichbarer biologischer Aktivität zu nativem IL-1ra, jedoch durch rekombinante Techniken, wie von Carter et al., siehe vorstehend, oder von Eisenberg et al., Nature 343, 341-346 (1990), beschrieben, hergestellt.
  • Interferon schließt alle Arten von Interferonen, wie α-, β-, γ oder ω-Interferone, und beliebige Untertypen von beliebigen Typen ein. Interferone können aus Geweben oder Gewebskulturen erhalten werden oder können unter Verwendung von in der Literatur, beispielsweise EP-A-0 043 980, beschriebenen rekombinanten Techniken, hergestellt werden. Andere Verfahren zur Erzeugung und Isolierung natürlicher oder rekombinanter Interferone sind ebenfalls im Stand der Technik gut bekannt.
  • Gemäß dieser Erfindung wurde gefunden, daß die Proteinkonjugate dieser Erfindung die gleiche Anwendbarkeit aufweisen wie das zur Bildung des Konjugats verwendete Protein. Deshalb sind diese Konjugate in der gleichen Weise wie das Protein, aus dem sie gebildet werden, therapeutisch aktiv und können in der gleichen Weise wie das Protein selbst, ohne Erzeugen von unerwünschten Immunreaktionen, die mit der Verabreichung an die Patienten von den Proteinen selbst verbunden sein können, verwendet werden. Deshalb umfaßt die vorliegende Erfindung auch die pharmazeutischen Zusammensetzungen auf der Basis der Verbindungen der Formel I oder deren Salze und Verfahren zur Herstellung derselben.
  • Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen, die zur Bekämpfung oder Verhinderung von Krankheiten verwendet werden, umfassen ein Proteinkonjugat der allgemeinen Formel I und ein therapeutisch inertes, nicht toxisches und therapeutisch verträgliches Trägermaterial. Die zu verwendenden pharmazeutischen Zusammensetzungen können formuliert und in Übereinstimmung mit der gängigen medizinischen Praxis, unter Berücksichtigung der zu behandelnden Erkrankung, des Zustands des einzelnen Patienten, der Art der Freisetzung des Proteinkonjugats, des Verabreichungsverfahrens und anderer, dem Arzt bekannter Faktoren dosiert werden.
  • Die nachstehenden Beispiele geben erläuternde Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, ohne Begrenzen derselben, wieder.
    • Beispiel 1 Herstellung von α-[2-[[(Cyclohexylcarbonimidoyl)amino]ethyl]-ω-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 111.7. A. Herstellung von α-(2-Chlorethyl)-ω-methoxypoly- (oxy-1,2-ethandiyl) SRU 111.7 (wie hierin verwendet bedeutet SRU die Zahl der sich selbst wiederholenden Einheiten, die in dem PEG-Polymer vorliegen).
  • Aus einer Aufschlämmung von 50 g MPEG (Methoxypolyethylenglycol, Molekulargewicht 5000) in 700 ml Toluol wurden 200 ml Lösungsmittel destilliert. Zu der Lösung unter Rückfluß wurden tropfenweise 0,8 ml trockenes Pyridin und 2,2 ml Thionylchlorid gegeben. Nach Erhitzen unter Rückfluß für vier Stunden wurde das Reaktionsgemisch über Nacht rühren lassen. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und 500 ml CH&sub2;Cl&sub2; zu dem Rückstand gegeben. Die erhaltene Lösung wurde dann mit wasserfreiem K&sub2;CO&sub3; getrocknet und durch 50 g basisches Aluminiumoxid (Wolem Super I) geleitet. Das meiste des CH&sub2;Cl&sub2; wurde dann unter vermindertem Druck entfernt und ein Liter Diethylether zu dem sich ergebenden Sirup gegeben. Der Ether wurde durch Destillation entfernt und weiterer Diethylether zur Ausfällung zugesetzt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur zwei Stunden gerührt und dann filtriert zu 45 g α-(2-Chlorethyl)-ω-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 111.7.
  • Analyse berechnet für C&sub3;H&sub7;ClO(CH&sub2;CH&sub2;O)111.7: C, 53,97; H, 9,12; Cl, 0,71. Gefunden: C, 54,21; H,8,70; Cl, 0,71.
    • B. Herstellung von α-(2-Azidoethyl)-ω-methoxypoly- (oxy-1,2-ethandiyl) SRU 111.7
  • Ein Gemisch von 20 g Natriumazid und 50 g α-(2- Chlorethyl)-ω-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 111.7 wurde bei 120-125ºC in 375 ml trockenem DMF erhitzt. Nach 7 Stunden wurde das Lösungsmittel unter Hochvakuum entfernt. Der Rückstand wurde in 500 ml CH&sub2;Cl&sub2; gelöst und durch Diatomeenerde filtriert. Das meiste des CH&sub2;Cl&sub2; wurde dann abdestilliert und Diethylether zur Ausfällung zugesetzt. Das Gemisch wurde über Nacht gerührt und dann filtriert. Der Rückstand wurde dann in einem Minimum von Glym bei 50ºC gelöst, die Lösung abgekühlt und das ausgefällte Produkt filtriert zu α-(2-Azidoethyl)-ω- methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 111.7.
  • Analyse berechnet für C&sub3;H&sub3;N&sub3;O(CH&sub2;CH&sub2;O)111.7: C, 53,77; H, 9,09; N, 0,84. Gefunden: C, 53,61; H, 9,08; N, 0,89.
    • C. Herstellung von α-(2-Aminoethyl)-ω-methoxypoly- (oxy-1,2-ethandiyl) SRU 111.7
  • Zu einem Gemisch von 25 g α-(2-Azidoethyl)-ω-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 111.7 in 250 ml trockenem Glym wurden 3,5 g 10% Pd/C gegeben. Das Gemisch wurde dann unter eine Atmosphäre von 50 p.s.i. H&sub2; gesetzt und bei 50ºC 18 Stunden geschüttelt. Das Gemisch wurde dann filtriert, die Feststoffe mit CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen und die vereinigten organischen Lösungen unter verminderten Druck gesetzt, um das Lösungsmittel zu entfernen. Der Rückstand wurde dann in 100 ml warmem Glym gelöst und das Produkt aus der abgekühlten Lösung ausfallen lassen. Der Niederschlag wurde filtriert und durch Erwärmen unter vermindertem Druck getrocknet zu 23 g α-(2- Aminoethyl)-ω-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 111.7.
  • Analyse berechnet für C&sub3;H&sub9;NO(CH&sub2;CH&sub2;O)111.7: C, 54,43;
  • H, 9,20; N, 0,28. Gefunden: C, 54,43; H, 9,18; N, 0,36.
  • Alternativ wurde eine Lösung von 40 g α-(2-Azidoethyl)-ω-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 111.7 und 6,7 g (25,6 mMol) Triphenylphosphin, gelöst in 200 ml trockenem CH&sub2;Cl&sub2;, über Nacht unter Argonatmosphäre gerührt. Wasser (2 ml) wurde zugegeben und das Gemisch weitere 12 Stunden gerührt. Das meiste des Methylenchlorids wurde unter Vakuum entfernt und 400 ml Diethylether zugesetzt. Der Niederschlag wurde filtriert, mit Ether gewaschen und in 300 ml warmem (50ºC) Glym gelöst. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur über Nacht belassen und der erhaltene Niederschlag filtriert, mit 2 · 100 ml Glym, 2 · 100 ml Diethylether gewaschen und in einem Vakuumofen unter einem Stickstoffstrom getrocknet zu 35 g α-(2-Aminoethyl)-ω-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 111.7.
    • D. Herstellung von α-[2-[[(Cyclohexylamino)thiocarbonyl]amino]ethyl]-ω-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 111.7
  • Zu einer Lösung von 4 g α-(2-Aminoethyl)-ω-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 111.7 in 60 ml trockenem Glym bei 40ºC wurden 0,1 ml Cyclohexylisothiocyanat gegeben. Die Lösung wurde bei 40ºC 18 Stunden- rühren lassen. Das Gemisch wurde dann filtriert und das Lösungsmittel unter Hochvakuum entfernt. Der Rückstand wurde dann in 100 ml warmem Glym gelöst, die Lösung abgekühlt und der erhaltene Niederschlag filtriert und unter Hochvakuum getrocknet zu 3,5 g α-[2- [[(Cyclohexylamino)thiocarbonyl]-amino]ethyl]-ω-methoxypoly- (oxy-1,2-ethandiyl) SRU 111.7.
  • Analyse berechnet für C&sub1;&sub0;H&sub2;&sub0;N&sub2;OS(CH&sub2;CH&sub2;O)111.7:
  • C, 54,25; H, 9,13; N, 0,54; S, 0,62. Gefunden: C, 54,39; H, 8,87; N, 0,55; S, 0,59.
    • E. Herstellung von α-[2-[[(Cyclohexylcarbonimidoyl)- amino]ethyl]-ω-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 111.7.
  • Eine Lösung von 1 g α-[2-[[(Cyclohexylamino)-thiocarbonyl]amino]ethyl]-ω-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 111.7, 120 mg Triphenylphosphin, 90 ul CCl&sub4; und 84 ul Triethylamin in 5 ml trockenem CH&sub2;Cl&sub2; wurden 72 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Das Lösungsmittel wurde dann unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand in einem Minimum trockenem Glym gelöst. Nach Abkühlen fiel das Produkt aus und wurde filtriert und unter Vakuum getrocknet zu α-[2-[[(Cyclohexylcarbonimidoyl)amino]ethyl]-ω-methoxypoly(oxy-1,2- ethandlyl) SRU 111.7.
  • Analyse berechnet für C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub8;N&sub2;O(CH&sub2;CH&sub2;O)111.7:
  • C, 54,61; H, 9,15; N, 0,55. Gefunden: C, 54,95; H, 9,27; N, 0,50.
    • Beispiel 1a Herstellung von α-(2-Chloroethyl)-ω-methoxypoly(oxy- 1,2-ethandiyl) SRU 225
  • Durch das in Beispiel 1A beschriebene Verfahren wurde MPEG, Molekulargewicht 10 000, zu α-(2-Chlorethyl)-ω-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 225 umgewandelt.
  • Analyse berechnet für C&sub3;H&sub7;ClO(CH&sub2;CH&sub2;O)&sub2;&sub2;&sub5;: C, 54,37;
  • H, 9,14; Cl, 0,35. Gefunden: C, 54,30; H, 9,15; Cl, 0,41.
    • Beispiel 1b Herstellung von α-(2-Azidoethyl)-ω-methoxmoly(oxy- 1,2-ethandiyl) SRU 225
  • Durch das in Beispiel 1B beschriebene Verfahren wurde α-(2-Chlorethyl)-ω-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 225 zu α-(2-Azidoethyl)-ω-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 225 umgewandelt.
  • Analyse berechnet für C&sub3;H&sub7;N&sub3;O(CH&sub2;CH&sub2;O)&sub2;&sub2;&sub5;: C, 54,34;
  • H, 9,13; N, 0,42. Gefunden: C, 54,32; H, 9,28; N, 0,50.
    • Beispiel 1c Herstellung von α-(2-Aminoethyl)-ω-methoxypoly(oxy- 1,2-ethandiyl) SRU 225
  • Durch das in Beispiel 1C beschriebene Verfahren wurde α-(2-Azidoethyl)-ω-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 225 zu α-(2-Aminoethyl)-ω-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 225 umgewandelt.
  • Analyse berechnet für C&sub3;H&sub9;NO(CH&sub2;CH&sub2;O)&sub2;&sub2;&sub5;: C, 54,48;
  • H, 9,17; N, 0,14. Gefunden: C, 54,80; H, 9,21; N, 0,12.
    • Beispiel 1d Herstellung von α-(2-Chlorethyl)-ω-methoxypoly(oxy- 1,2-ethandiyl) SRU 28.3
  • Zu einer Lösung von frisch destilliertem Oxalylchlorid (0,5 ml) in 40 ml trockenem CH&sub2;Cl&sub2; bei 0ºC wurden tropfenweise 0,5 ml trockenes DMF in 10 ml CH&sub2;Cl&sub2; gegeben. Die erhaltene Lösung wurde auf Raumtemperatur erwärmt, 15 Minuten gerührt und dann erneut auf 0ºC abgekühlt. MPEG, Molekulargewicht 1325, (5,6 g), wurde dann zugegeben und die erhaltene Lösung 5 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Das Gemisch wurde anschließend in Wasser gegossen und das Gemisch mit CH&sub2;Cl&sub2; extrahiert. Die CH&sub2;Cl&sub2;-Lösung wurde getrocknet (MgSO&sub4;) und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt zu 1,7 g α-(2-Chlorethyl)-ω-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 28.3 als weißes Pulver.
  • Analyse berechnet für C&sub3;H&sub7;ClO(CH&sub2;CH&sub2;O)28.3: C, 53,38;
  • H, 9,03; Cl, 2,64. Gefunden: C, 53,48; H, 9,10; Cl,2,41.
    • Beispiel 1e Herstellung von α-(2-Azidoethyl)-ω-methoxypoly(oxy- 1,2-ethandiyl) SRU 28.3
  • Durch das in Beispiel 1B beschriebene Verfahren wurde α-(2-Chlorethyl)-ω-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 28.3 zu α-(2-Azidoethyl)-ω-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 28.3 umgewandelt.
  • Analyse berechnet für C&sub3;H&sub7;N&sub3;O(CH&sub2;CH&sub2;O)28.3: C, 53,12;
  • H, 8,99; N, 3,11. Gefunden: C, 53,21; H, 9,07; N, 2,98.
    • Beispiel 1f Herstellung von α-(2-Aminoethyl)-ω-methoxypoly(oxy- 1,2-ethandiyl) SRU 28.3
  • Durch das in Beispiel 1C beschriebene Verfahren wurde α-(2-Azidoethyl)-ω-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 28.3 zu α-(2-Aminoethyl)-ω-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 28.3 umgewandelt.
  • Analyse berechnet für C&sub3;H&sub9;NO(CH&sub2;CH&sub2;O)28.3: C, 54,47;
  • H, 9,17; N, 0,14. Gefunden: C, 54,44; H, 9,19; N, 0,15.
    • Beispiel 2 Herstellung von rekombinantem Interferon-α (IFN-α), konjugiert an PEG mit Hilfe des Reagenz α-[2-[[(Cyclohexylcarbonimidoyl)amino]ethyl]-ω-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 111.7.
  • α-[2-[[(Cyclohexylcarbonimidoyl)amino]ethyl]-ω-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 111.7, hergestellt gemäß Beispiel 1, wurde zu 1 mg homogenem IFN-α in 200 ul Puffer (0,1 M Natriumborat, pH 9,0) in einem Molverhältnis von 10 Mol Reagenz pro ein Mol IFN-α gegeben. Die Lösungen wurden sorgfältig vermischt und die Pegylierungsreaktion bei Raumtemperatur für 60 Minuten ablaufen lassen.
  • Der Grad der Derivatisierung (oder Pegylierung) von IFN-α wurde durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS- PAGE) (TABELLE I) abgeschätzt. Proteine wurden durch Coomassie-Blue-Färbung visualisiert. Die Analyse der Produkte der 60 Minuten-Reaktion setzte neue Proteinspezies mit höherem Molekulargewicht, entsprechend PEG-konjugiertem IFN-α, frei. IFN-α hat ein scheinbares Molekulargewicht von 15 kD nach SDS-PAGE. Unmodifiziertes IFN-α; dessen scheinbares Molekulargewicht unverändert verblieb, ist deshalb nicht mit PEG konjugiert. Das PEG-modifizierte IFN-α-Produkt weist ein scheinbares Molekulargewicht von 28 kD auf.
    • TABELLE I: Modifizierung von IFN-α mit dem in Beispiel 1 beschriebenen Reagenz Scheinbares Molekulargewicht von IFN Protein (kD) % Gesamt-Protein aus Reaktion
  • 15 (unmodifiziert) 80
  • 28 20
    • Beispiel 3 Herstellung von rekombinantem Interleukin-2 (rIL-2), konjugiert an PEG mit Hilfe des Reagenz α-[2-[[(Cyclohexylcarbonimidoyl)amino]ethyl]-ω-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 111.7.
  • α-[2-[[(Cyclohexylcarbonimidoyl]amino]ethyl]-ω-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 111.7, hergestellt gemäß Bei spiel 1, wurde zu 2 mg rIL-2 in 200 ul Puffer (0,1 M Natriumborat, pH 9,0) in einem Molverhältnis von 10 Mol Reagenz pro ein Mol rIL-2 gegeben. Die Lösungen wurden sorgfältig vermischt und die Pegylierungsreaktion wurde bei Raumtemperatur 60 Minuten ablaufen lassen.
  • Der Grad der Derivatisierung (oder Pegylierung) des Proteins wurde mit SDS-PAGE (TABELLE II) abgeschätzt. Die Proteine wurden durch Coomassie-Blue-Färbung visualisiert. Die Analyse der Produkte der 60 Minuten-Reaktion setzte neue Proteinspezies mit höherem Molekulargewicht, entsprechend PEG-konjugiertem rIL-2, frei. rIL-2 weist ein scheinbares Molekulargewicht von 15 kD durch SDS-PAGE auf. Unmodifiziertes rIL-2 ist das Protein, das von dem Reaktionsgemisch abgetrennt wurde, dessen Molekulargewicht unverändert verbleibt und ist deshalb nicht mit PEG konjugiert. Das vorherrschende PEG-modifizierte rIL-2-Produkt hat ein scheinbares Molekulargewicht von 28 kD.
    • TABELLE II. Modifizierung von rIL-2 mit dem in Beispiel 1 beschriebenen Reagenz Scheinbares Molekulargewicht von rIL-2 Protein (kD) % Gesamt-Protein aus Reaktion
  • 15 (unmodifiziert) 20
  • 28 50
  • 33 20
  • 43 10
  • Pegyliertes rIL-2 wurde aus dem Reaktionsgemisch, wie von Katre et al. [Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 84: 1483-1491, (1987)] beschrieben, unter Verwendung von hydrophober Austausch-Chromatographie (Bio-Rad; Biogel-Phenyl 5-PW) gereinigt. Ein linearer Gradient mit sinkender Salzkonzentration von 1,53 auf 0,0 M (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; in 50 mN Natriumphosphat, pH 7,0, in 30 Minuten wurde zum Abtrennen von PEG-modifiziertem und unmodifiziertem rIL-2 verwendet. Aliquote Mengen der Fraktionen wurden durch SDS-PAGE bewertet und zusammengegebene Fraktionen wurden zur Bestimmung ihrer spezifischen Aktivität in einem CTLL Zell-Proliferationsassay durch das von Gillis et al. [J. Immunology 120: 2027-2032, (1978)] beschriebene Verfahren bewertet. Die Proteinkonzentrationen wurden spektrofotometrisch bei 280 nm unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten von 0,667 für rIL-2 bestimmt. Die spezifische Aktivität der rIL-2-isolierten Proteine wird als Einheiten/mg Protein ausgedrückt und die Ergebnisse werden in Tabelle III zusammengefaßt. Es wird deutlich, daß die spezifische Aktivität von rIL-2 sich durch die Konjugation mit PEG nicht signifikant veränderte.
    • TABELLE III. Bioaktivität von rIL-2, konjugiert an PEG mit dem in Beispiel 1 beschriebenen Reagenz Scheinbares Molekulargewicht von rIL-2 Protein (kD) Spezifische Aktivität (Einheiten/mg)
  • 15 (unmodifiziertes IL2) 2,0 · 10&sup7;
  • 28 2,4 · 10&sup7;
    • Beispiel 4 Herstellung von rekombinantem Interleukin 1-α (rIL-1 α), konjugiert an PEG mit Hilfe des Reagenz α-[2-[[(Cyclohexylcarbonimidoyl]amino]ethyl]-ω-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 111.7.
  • Das in Beispiel 1 beschriebene Reagenz wurde zu 2,0 mg homogenem rIL-1a in 1,0 ml 0,1 M Natriumborat, pH 9,0, in einem Molverhältnis von 10 Mol Reagenz pro ein Mol rIL-1a gegeben. Die Lösung wurde sorgfältig vermischt und die Pegylierungsreaktion wurde bei Raumtemperatur 60 Minuten ablaufen lassen.
  • Der Grad der Derivatisierung (oder Pegylierung) von dem Protein wurde durch SDS-PAGE (Tabelle IV) geschätzt. Die Proteine wurden durch Coomassie-Blue-Färbung visualisiert. Die Analyse der Produkte aus der 60-Minuten-Reaktion setzte neue Proteinspezies mit höherem Molekulargewicht, entsprechend PEG-konjugiertem rIL-1 α-Protein, frei. rIL-1 α hat ein scheinbares Molekulargewicht von 17 kD durch SDS-PAGE. Unmodifiziertes rIL-1 α ist Protein aus dem Reaktionsgemisch, dessen scheinbares Molekulargewicht unverändert bleibt und wird deshalb nicht mit PEG konjugiert. Das PEG-modifizierte rIL-1 α-Produkt weist ein scheinbares Molekulargewicht von 30 kD auf.
    • TABELLE IV. Modifizierung von rIL-1a mit dem in Beispiel 1 beschriebenen Reagenz Scheinbares Molekulargewicht von rIL-1 α Protein (kD) % Gesamt-Protein aus Reaktion
  • 17 (unmodifiziert) 85
  • 30 15
    • Beispiel 5 Herstellungt von α-[(1,2-Dihydro-2-oxo-1-pyridinyl)- thiocarbonyl]-ω-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 111.7
  • Aus einer Lösung von 1 g (0,2 mMol) MPEG (Methoxypolyethylenglycol), Molekulargewicht 5000, in 15 ml trockenem Toluol, wurden 5 ml Lösungsmittel destilliert. Die erhaltene Lösung wurde abgekühlt und 46,5 mg (0,2 mMol) 1,1-Carbonothioylbis-2(1H)-pyridinon wurden zugegeben. Das Gemisch wurde dann unter Argonatmosphäre 4 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Das Lösungsmittel wurde anschließend unter Vakuum entfernt und der Rückstand in 5 ml trockenem Glym gelöst und über Nacht belassen. Der erhaltene Niederschlag wurde dann filtriert und mit 2 · 5 ml trockenem Glym und 5 ml Diethylether gewaschen. Das Produkt wurde dann in einem Vakuumofen unter einem langsamen Stickstoffstrom getrocknet zu 0,96 g α-[(1,2- Dihydro-2-oxo-1-pyridinyl)thiocarbonyl]-ω-methoxypoly(oxy- 1,2-ethandiyl) SRU 111.7.
  • Analyse berechnet für C&sub9;H&sub1;&sub1;NO&sub3;S(CH&sub2;CH&sub2;O)111.7:
  • C, 54,37; H, 8,99; N, 0,27; 5, 0,62; gefunden: C, 54,03; H, 8,98; N, 0,18; 5, 0,59.
    • Beispiel 5a Herstellung von α-[(1,2-Dihydro-2-oxo-1-pyridinyl)- thiocarbonyl]-ω-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 225
  • Durch das in Beispiel 5 beschriebene Verfahren wurde MPEG (Methoxypolyethylenglycol) Molekulargewicht 10 000 zu α- [(1,2-Dihydro-2-oxo-1-pyridinyl)thiocarbonyl]-ω-methoxypoly- (oxy-1,2-ethandiyl) SRU 225 umgewandelt.
  • Analyse berechnet für C&sub9;H&sub1;&sub1;N&sub3;S(CH&sub2;CH&sub2;O)&sub2;&sub2;&sub5;: C, 54,54; H, 9,08; N, 0,14; S, 0,32; gefunden: C, 54,38; H, 9,16; N, 0,15; S, 0,31.
    • Beispiel 6 Herstellung von Interleukin-1 Rezeptor-Antagonist (IL-1ra), konjugiert an PEG mit Hilfe des Reagenz α-[(1,2-Dihydro-2-oxo-1-pyridinyl)thiocarbonyl]-ω-methoxypoly-(oxy-1,2- ethandiyl) SRU 111.7.
  • α-[(1,2-Dihydro-2-oxo-1-pyridinyl)thiocarbonyl]-ω- methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 111.7, hergestellt gemäß Beispiel 5, wurde zu 10 mg homogenem IL-1ra in 1,0 ml Puffer (0,1 M Natriumborat, pH 9,0) in einem Molverhältnis von 5 Mol Reagenz pro ein Mol IL-1ra gegeben. Die Lösung wurde sorgfältig vermischt und die Pegylierungsreaktion wurde bei Raumtemperatur 60 Minuten ablaufen lassen.
  • Der Grad der Derivatisierung (oder Pegylierung) des Proteins wurde durch SDS-PAGE (Tabelle V) abgeschätzt. Die Proteine wurden durch Coomassie-Blue-Färbung visualisiert. Die Analyse der Produkte aus der 60 Minuten-Reaktion setzten neue Proteinspezies mit höherem Molekulargewicht, entsprechend PEG-konjugiertem IL-1ra-Protein, frei. IL-1ra weist ein scheinbares Molekulargewicht von 19 kD durch SDS-PAGE auf. Unmodifiziertes IL-1ra ist das Protein aus dem Reaktionsgemisch, dessen scheinbares Molekulargewicht unverändert verbleibt und ist deshalb mit PEG nicht konjugiert.
  • Die vorherrschenden PEG-modifizierten IL-1ra-Proteine weisen scheinbare Molekulargewichte von 26 und 33 kD auf.
    • TABELLE V. Modifizierung von IL-1ra mit dem in Beispiel 5 beschriebenen Reagenz Scheinbares Molekulargewicht von IL-1ra Protein (kD) % Gesamt-Protein aus der Reaktion
  • 19 (unmodifiziert) 36
  • 26 33
  • 33 21
  • > 33 10
  • Pegyliertes IL-1ra wurde aus dem Reaktionsgemisch unter Verwendung von hydrophober Austausch-Chromatographie (Bio-Rad; HRLC MP7 HIC) gereinigt. Ein linearer Gradient mit absinkenden Salzkonzentrationen von 0,43 bis 0,0 M (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; in 50 mM Natriumphosphat, pH 7,0, in 20 Minuten wurde zum Abtrennen von pegyliertem IL-1ra und unmodifiziertem IL-1ra verwendet. Aliquote Mengen der Fraktionen wurden durch SDS- PAGE bewertet und zusammengegebene Fraktionen wurden in einem IL-1 Radioreceptorverdrängungs-Bindungsassay bewertet. [Kilian et al. J. Immunol., 136, 4509-4514, (1986)]. Kurz, es wurden IL-1ra und PEG-IL-1ra bei variierenden Konzentrationen mit EL-4-Membranen 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Das [¹²&sup5;I]IL-1a wurde dann zugegeben und die Inkubation 30 Minuten fortgesetzt. Das Assay wurde durch Vakuumfiltration beendet und die Ansammlung an Zellen band [¹²&sup5;I] IL-1 an Filterplatten. Die Konzentration an IL-1ra oder PEG-IL-1ra, die die Bindung von [¹²&sup5;I]IL-1 durch 50% (IC&sub5;&sub0;) inhibiert, wurde graphisch bestimmt. Die Ergebnisse werden in TABELLE VI gezeigt. Das IC&sub5;&sub0; von IL-1ra in diesem Assay ist 1-2,0 ng/ml. Das pegylierte IL-1ra-Gemisch behielt seine Fähigkeit, an den IL- 1-Rezeptor an EL-4-Membranen mit einem Faktor vom 2- bis 3- fachen, bezogen auf das unmodifizierte IL-1ra, zu binden.
    • TABELLE VI. Inhibierung von [¹²&sup5;I] IL-1-Bindung durch IL-1ra, konjugiert mit dem in Beispiel 5 beschriebenen Reagenz Scheinbares Molekulargewicht von IL-1ra-Protein (kD) IC&sub5;&sub0; (ng/ml)
  • 19K (unmodifiziert) 2,0
  • 26K, 33K (Gemisch) 5,0
  • Die Pharmakodynamik des IL-1ra-Proteins wurde in vivo durch die Fähigkeit von dem IL-1ra, die rIL-1-α-Einführung von Interleukin-6 zu inhibieren, bewertet. Serum von mit rIL- 1-α behandelten Mäusen enthält hohe Spiegel von IL-6 [McIntosh et al., Immunol. 143: 162-167, (1989)]. Die Verabreichung von unmodifiziertem IL-1ra, zusammen mit IL-1α (0 Stunden Zeitpunkt) inhibiert die Einführung von IL-6. Dieses Testsystem wurde verwendet, um die pharmakodynamischen Eigen schaften von unmodifiziertem und PEG-IL-1ra zu vergleichen. Gruppen von drei weiblichen C57B1/6-Mäusen wurden subkutan mit 200 ug unmodifiziertem IL-1ra oder PEG-IL-1ra 48 Stunden, 24 Stunden oder 6 Stunden vor oder gleichzeitig (0 Stunden) mit 0,2 ug rIL-1α injiziert. Drei Stunden später wurden Serumproben gesammelt. IL-6-Spiegel (Einheiten) wurden unter Verwendung einer Modifizierung eines IL-6-Assays, das vorstehend beschrieben wurde [Van Snick et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 9679-9683, (1986)], bewertet. In dem IL-6-Assay wurden B9 Hybridomazellen mit zweifachen seriellen Verdünnungen der Testseren in Mikrotiter-Platten mit 96-Vertiefungen behandelt. Nach einer 3-tägigen Inkubation bei 37ºC in einer Feuchtigkeitsatmosphäre, die 5% CO&sub2; und 95% Luft umfaßte, wurden die Vertiefungen mit 0,5 uCi tritiiertem Thymidin pulsiert und für weitere 18 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden dann auf Glasfaserfiltern geerntet und der Spiegel der tritiierten Thymidin-Einarbeitung wurde durch Szintillationszählen bestimmt. IL-6-Aktivität wird als U/ml ausgedrückt. IL-6-Einheiten werden als das Umgekehrte der Serumverdünnung definiert, die, verglichen mit einem Bezugsstandard, halbmaximal tritiierten Thymidin-Einbau erzeugt.
  • Die pharmakodynamischen Daten werden in Tabelle D1 zusammengefaßt. Nur mit IL-1 behandelte Mäuse zeigten 28852 U/ml IL-6. Sowohl unmodifiziertes, als auch modifiziertes IL- 1ra inhibierte IL-6-Einführung bei 0 Stunden. Jedoch, das pegylierte IL-1ra zeigte eine längere IL-6-Inhibitorwirkung, verglichen mit unmodifiziertem IL-1ra bei 8 und 24 Stunden nach Verabreichung. TABELLE D1. Pharmakodynamisches Profil von IL-1ra, konjugiert mit dem in Beispiel 5 beschriebenen Reagenz
    • Beispiel 6A Herstellung von Interleukin 1 Rezeptorantagonist (IL- 1ra), konjugiert an PEG mit Hilfe des Reagenz α-[(1,2-Dihydro-2-oxo-1-pyridinyl)thiocarbonyl]-ω-methoxypoly(oxv-1,2-ethandiyl) SRU 225.
  • IL-1ra wurde gemäß dem in Beispiel 6, unter Verwendung des in Beispiel 5a beschriebenen Reagenz, erläuterten Verfahrens konjugiert und gereinigt.
  • Die vorherrschenden, PEG-modifizierten IL-1ra-Proteine weisen scheinbare Molekulargewichte von 33 kD und 48 kD auf. Das 33 kD- und das 48 kD-Protein zählten 46 bzw. 27% des Gesamtproteins in dem Reaktionsgemisch.
  • Die Fähigkeit dieser Proteine, IL-1-Binden zu inhibieren, wie in Beispiel 6 beschrieben, wird in Tabelle VII zusammengefaßt. Das PEG-modifizierte 33 kD-Protein behält die Fähigkeit, IL-1-Bindung innerhalb des 6-fachen, bezogen auf IL-1ra, zu inhibieren, und bei stärkerer Modifizierung des Proteins mit PEG, als mit diesem 48 kD-Protein beobachtet, führt zu einem wesentlichen Verlust an dessen Bindung an den IL-1-Rezeptor.
    • TABELLE VII. Inhibierung von [¹²&sup5;I] IL-1-Bindung von IL-1ra- Proteinen, die mit dem in Beispiel 5a beschriebenen Reagenz konjugiert sind Scheinbares Molekulargewicht von IL-1ra Protein (kD) IC&sub5;&sub0;(ng/ml)
  • 19 (unmodifiziert) 1,6
  • 33 9,0
  • 48 50,0
  • Um das pharmakokinetische Profil von PEG-IL-1ra-Arten zu bestimmen, wurde C57BF/6-Mäusen 100 ug modifiziertes oder pegyliertes IL-1ra-Arten subkutan verabreicht. Serumproben wurden nach 1, 2, 3, 4 und 6 Stunden von Mäusen gesammelt, die unmodifiziertes IL-1ra erhalten hatten und nach 2, 4, 8, 10 und 24 Stunden von Mäusen, die PEG-IL-1ra erhalten hatten. Die Serumspiegel wurden in dem EL4-Membran-Bindungsassay, wie in Beispiel 6 beschrieben, bestimmt. Die Daten werden in Ta belle D2 zusammengefaßt. Das PEG-IL-1ra war in Serumproben bei höheren Konzentrationen detektierbar und für längere Zeit, verglichen mit IL-1ra, das einen längeren Serum-Zeitverlauf zeigte. TABELLE D2. Pharmakokinetisches Profil von IL-1ra, pegyliert wie in Beispiel 6a
    • Beispiel 7 Herstellung von rIL-1 α, konjugiert an PEG mit Hilfe von dem Reagenz α-[(1,2-Dihydro-2-oxo-1-pyridinyl)thiocarbonyl]-ω-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 111.7.
  • Rekombinantes IL-1 α wurde mit dem in Beispiel 5 beschriebenen Reagenz durch das in Beispiel 4 beschriebene Verfahren pegyliert. Drei vorherrschende Molekulargewichtsarten aus dem Reaktionsgemisch wurden durch SDS-PAGE mit scheinbaren Molekulargewichten, entsprechend 17 (unmodifiziert), 26 und 33 kD, identifiziert. Die letzteren zwei pegylierten Proteine betrugen 25 bzw. 55% des Gesamtproteins.
  • Pegyliertes rIL-1 α wurde aus dem Reaktionsgemisch nach 60 Minuten unter Verwendung von hydrophober Austausch- Chromatographie (Bio-Rad; HRLC MP7 HIC) gereinigt. Ein linearer Gradient mit sinkender Salzkonzentration von 0,43 bis 0,0 M (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; in 50 mN Natriumphosphat, pH 7,0, innerhalb 20 Minuten, wurde zum Abtrennen von pegyliertem rIL-1 α und unmodifiziertem rIL-1 α verwendet. Aliquote Mengen der Fraktionen wurden durch SDS-PAGE bewertet und zusammengegebene Fraktionen wurden auf spezifische Aktivität in einem D10 Zell-Proliferation-Assay durch das von Kaye et al. [J. Exp. Med. 158: 836-854 (1983)] beschriebene Verfahren bewertet. Proteinkonzentrationen wurden spektrofotometrisch bei 280 nM unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten von 1,0 für rIL-1 α bestimmt. Die spezifische Aktivität des rIL-1 α ist ungefähr 1,0 · 10&sup8; Einheiten/mg. Die spezifischen Aktivitätsergebnisse werden in Tabelle VIII zusammengefaßt. Das 26 kD- pegylierte IL-1 α-Konjugat verbleibt bioaktiv innerhalb des 2- bis 3-fachen, bezogen auf IL-1 α. Weitere Modifizierung, die sich aus 33 kD-Protein ergibt, ergibt einen wesentlichen Verlust an Bioaktivität.
    • TABELLE VIII. Bioaktivität von rIL-1α, konjugiert mit dem in Beispiel 5 beschriebenen Reagenz Scheinbares Molekulargewicht von rIL-1 α Protein (kD) Spezifische Aktivität (Einheiten/mg)
  • 17 (unmodifiziert) 4,6 · 10&sup7;
  • 26 1,9 · 10&sup7;
  • 33 4,5 · 10&sup6;
    • Beispiel 8 Herstellung von IFN-α, konjugiert an PEG, mit Hilfe von α-[(1,2-Dihydro-2-oxo-1-pyridinyl)thiocarbonyl]-ω-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 111.7
  • α-[(1,2-Dihydro-2-oxo-1-pyridinyl)thiocarbonyl]-ω- methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 111.7, hergestellt gemäß Beispiel 5, wurde zu 1 mg gereinigtem IFN-α in 100 ul Puffer (0,1 M Natriumborat, pH 9,0) in einem Molverhältnis von 8 Mol des PEG-Reagenz pro ein Mol IFN-α gegeben. Die Lösungen wurden sorgfältig vermischt und die Pegylierungsreaktion wurde bei Raumtemperatur 60 Minuten ablaufen lassen.
  • Die vorherrschenden Molekulargewichtsarten aus dem Reaktionsgemisch wurden durch SDS-PAGE mit scheinbaren Molekulargewichten von 15 (unmodifiziert) und 28 kD identifiziert. Das 28 kD-pegylierte Protein betrug 40% des Gesamtproteins. Das pegylierte IFN-α wurde aus dem 60-Minuten- Reaktionsgemisch gereinigt und unter Verwendung von hydropho ber Austausch-Chromatographie (Bio-Rad; Biogel-Phenyl-S-PW) charakterisiert. Ein linearer Gradient mit sinkenden Salzkonzentrationen von 0,42 M bis 0,0 M (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; in 50 mM Natriumphosphat, pH 7,0, in 20 Minuten, wurde zum Abtrennen von pegyliertem IFN-α und unmodifiziertem IFN-α verwendet. Aliquote Mengen der Fraktionen wurden durch SDS-PAGE bewertet und zusammengegebene Fraktionen wurden auf antivirale Aktivität (spezifische Aktivität) in einem MDBK-Assay durch das von Familletti, et al. [Methods Enzym. 78, 387-394 (1987)] beschriebenen Verfahren bewertet.
  • Die Proteinkonzentrationen wurden spektrofotometrisch bei 280 nM unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten von 1,0 für eine 1 mg/ml IFN-α-gepufferte Lösung bestimmt. Die spezifische Aktivität der isolierten Proteine wird als Einheiten pro mg Protein ausgedrückt und die Ergebnisse werden in Tabelle IX zusammengefaßt.
  • Die Ergebnisse zeigen, daß die spezifische Aktivität des 28 kD-pegylierten IFN-α, bezogen auf IFN-α, sich nicht signifikant änderte.
    • TABELLE IX. Bioaktivität von IFN-α, konjugiert mit dem Reagenz von Beispiel 5 Scheinbares Molekulargewicht von IFN-α Protein (kD) Spezifische Aktivität (Einheiten/mg)
  • 15 (unmodifiziert) 1,1 · 10&sup8;
  • 28 1,4 · 10&sup8;
    • Beispiel 8A Herstellung von IFN-α, konjugiert an PEG, mit Hilfe des Reagenz α-[(1,2-Dihydro-2-oxo-1-pyridinyl)thiocarbonyl]- ω-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 225.
  • IFN-α wurde wie in Beispiel 8 mit dem in Beispiel 5a beschriebenen Reagenz pegyliert. Drei vorherrschende Molekulargewichtsarten aus dem Reaktionsgemisch bei 60 Minuten wurden durch SDS-PAGE mit scheinbaren Molekulargewichten, entsprechend 15 (unmodifiziert), 35 und 43 kD, identifiziert. Die letzteren zwei pegylierten Proteine betrugen 35 bzw. 33 Prozent der Gesamtproteine in dem Reaktionsgemisch.
  • Die durch in Beispiel 8 der pegylierten Arten von IFN-α beschriebenen Verfahren bestimmten Aktivitäten werden in Tabelle X zusammengefaßt. Die Ergebnisse zeigen, daß das 35 kD-pegylierte IFN-α-Produkt biologische Aktivität innerhalb des 2- bis 3-fachen von IFN-α zurückbehielt. Das 43 kD- Konjugat verlor im wesentlichen Aktivität.
    • TABELLE X. Bioaktivität von IFN-α, konjugiert mit dem Reagenz von Beispiel 5a Scheinbares Molekulargewicht von IFN-α Protein (kD) Spezifische Aktivität (Einheiten/mg)
  • 15 (unmodifiziert) 3,3 · 10&sup8;
  • 35 1,2 · 10&sup8;
  • 43 1,5 · 10&sup7;
    • Beispiel 8B Herstellung von rIL-2, konjugiert an PEG, mit Hilfe des Reagenz α-[(1,2-Dihydro-2-oxo-1-pyridinyl)thiocarbonyl]- ω-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 111.7
  • rIL-2 wurde mit dem in Beispiel 5 beschriebenen Reagenz pegyliert und unter Verwendung des in Beispiel 3 beschriebenen Verfahrens gereinigt.
  • Die vorherrschenden Molekulargewichtsarten aus dem Reaktionsgemisch nach 60 Minuten wurden mit scheinbaren Molekulargewichten von 15 (unmodifiziert) und 25 kD durch SDS- PAGE identifiziert. Das 25 kD-pegylierte Protein zählte für 60% des Gesamtproteins in der Reaktion.
  • Die spezifische Aktivität der rIL-2-isolierten Proteine wurde wie in Beispiel 3 beschrieben gemessen und wird als Einheiten/mg Protein ausgedrückt und die Ergebnisse werden in Tabelle XI zusammengefaßt.
  • Wie aus Tabelle XI ersichtlich sein kann, wurde die biologische Aktivität von IL-2 nach Konjugieren mit PEG nicht verändert.
    • TABELLE XI. Bioaktivität von rIL-2, konjugiert an PEG, mit dem in Beispiel 5 beschriebenen Reagenz Scheinbares Molekulargewicht von rIL-2 Protein (kD) Spezifische Aktivität (Einheiten/mg)
  • 15 (unmodifiziert) 2,0 · 10&sup7;
  • 25 2,0 · 10&sup7;
    • Beispiel 8C Herstellung von rIL-2, konjugiert an PEG, mit Hilfe des Reagenz α-[(1,2-Dihydro-2-oxo-1-pyridinyl)thiocarbonyl]- ω-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 225
  • rIL-2 wurde unter Verwendung des in Beispiel 3 beschriebenen Verfahrens mit dem in Beispiel 5a beschriebenen Reagenz pegyliert.
  • Die vorherrschenden Molekulargewichtsarten aus dem Reaktionsgemisch nach 60 Minuten wurden mit scheinbaren Molekulargewichten von 15 kD (unmodifiziert), 33 kD und 43 kD durch SDS-PAGE identifiziert. Die 33- und 43 kD-pegylierten Proteine betrugen 60 bzw. 20 Prozent des Gesamtproteins in der Reaktion.
    • Beispiel 9 Herstellung von IFN-α, konjugiert an PEG, mit Hilfe des Reagenz α-[(1,2-Dihydro-2-oxo-1-pyridinyl)thiocarbonyl]- ω-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 111.7.
  • Ein alternatives Verfahren zum Konjugieren von IFN-α an PEG wurde wie nachstehend ausgeführt:
  • IFN-α (5 mg in 1 ml) wurde gegen einen Puffer, der 5 mM Natriumacetat, pH 5,0, 120 mM NaCl, enthielt, dialysiert. Zu der dialysierten Proteinlösung wurde festes Kaliumthiocyanat zu einer Endkonzentration von 0,5 M Salz gegeben und der pH-Wert durch die Zugabe von einem Zehntel Volumen 1 M Tricin-Natriumhydroxid, pH 11,9, zu einem End-pH-Wert von 10,0 der Lösung eingestellt. α-[(1,2-Dihydro-2-oxo-1-pyridinyl)thiocarbonyl]-ω-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl) wurde tropfenweise zu der Probe in einem Molverhältnis von 3 Mol Reagenz zu 1 Mol Protein gegeben. Die Modifizierungsreaktion wurde bei Raumtemperatur 30 Minuten ablaufen lassen und durch die Zugabe von 1 M Glycin gestoppt, wobei der pH-Wert 6,3 zu einer Endkonzentration von 20 mM war. Das PEG-modifizierte Protein wurde aus der Lösung durch Zugabe eines Puffers, der 3,5 M Ammoniumsulfat, 50 mM Natriumphosphat, pH 7,0, zu einer Endkonzentration von 1,1 M Ammoniumsulfat enthielt, gefällt und der Niederschlag durch Zentrifugation (10 000 · g für 12 Minuten) gesammelt. Nach Spülen des Pellets mit einem Puffer, der 1,1 M Ammoniumsulfat, 50 mM Natriumphosphat, pH 7,0, enthält, wurde das Pellet in einem Puffer, der 25 mM Ammoniumacetat, pH 5,0, enthält, erneut gelöst. Das PEG-modifizierte Protein wurde gereinigt und wie in Beispiel 2 beschrieben charakterisiert. Eine einzeln pegylierte IFN-Art wurde mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 28 kD erhalten. Die antivirale Aktivität (spezifische Aktivität) des modifizierten Proteins wurde durch das in Beispiel 8 beschriebene Verfahren bestimmt. Die spezifische Aktivität des Ausgangs-IFN-α betrug 2,6 · 10&sup8; U/mg und die spezifische Aktivität des IFN- α, das an PEG konjugiert ist, betrug 1,0 · 10&sup8; U/mg, was zeigt, daß das PEG konjugierte IFN-α die biologische Aktivität innerhalb des 3-fachen, bezogen auf IFN-α, beibehalten hatte.
    • Beispiel 10 Herstellung von IFN-α, konjugiert an PEG, mit Hilfe des Reagenz α-[(1,2-Dihydro-2-oxo-1-pyridinyl)thiocarbonyl]- ω-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 225.
  • IFN-α wurde an PEG gemäß dem in Beispiel 9 beschriebenen Verfahren konjugiert. Die Proteine wurden gereinigt und wie in Beispielen 2 und 9 beschrieben charakterisiert. Das Ausgangs-IFN-α hatte eine spezifische Aktivität von 2,6 · 10&sup8; U/mg, unter Verwendung an PEG konjugiertes IFN-α, das ein scheinbares Molekulargewicht von 31 kD hatte und eine spezifische Aktivität von 1,0 · 10&sup8; U/mg, wie in Beispiel 8 beschrieben, aufwies. Die Bioaktivität des konjugierten IFN-α betrug das 3-fache von IFN-α.
    • Beispiel 11 Herstellung von α-Methyl-ω-[2-[[(2-pyridinyloxy)carbonyl]amino]ethoxy]poly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 111.7.
  • Aus einer Lösung von 1 g (0,2 mMol) von α-(2-Aminoethyl)-ω-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 111.7 (wie in Beispiel 1C hergestellt), in 40 ml trockenem CH&sub2;Cl&sub2;, wurden 15 ml des Lösungsmittels abdestilliert. Zu der erhaltenen Lösung wurden dann bei 0ºC 65 mg (0,3 mMol) Di-2-pyridylcarbonat gegeben und das Gemisch weitere 4 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde dann unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand mit Diethylether verrieben. Der Niederschlag wurde dann filtriert und mit 50 ml Ether, gefolgt von 50 ml Hexan, gewaschen. Das Produkt wurde dann in einem Vakuumofen unter einem langsamen Stickstoffstrom getrocknet zu 1 g α-Methyl-ω-[2-[[(2-pyridinyloxy)carbonyl]amino]ethoxy]poly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 111.7 als weißes Pulver.
  • Analyse berechnet für C&sub9;H&sub1;&sub2;N&sub2;O&sub3;(CH&sub2;CH&sub2;O)111.7:
  • C, 54,56; H, 9,04; N, 0,55; gefunden: C, 54,26; H, 9,00; N, 0,53.
    • Beispiel 11a Herstellung von α-Methyl-ω-[2-[[(2-pyridinyloxy)carbonyl]amino]ethoxy]poly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 225
  • Durch das in Beispiel 11 beschriebene Verfahren wurde α-(2-Aminoethyl)-ω-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 225 (wie in Beispiel 1c hergestellt) zu α-Methyl-ω-[2-[[(2-pyridinyloxy)carbonyl]amino]ethoxy]poly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 225 umgewandelt.
  • Analyse berechnet für C&sub9;H&sub1;&sub2;N&sub2;O&sub3;(CH&sub2;CH&sub2;O)&sub2;&sub2;&sub5;: C, 54,54; H, 9,10; N, 0,28. Gefunden: C, 54,49; H, 9,27; N, 0,31.
    • Beispiel 11b Herstellung von α-Methyl-ω-[2-[[(2-pyridinyloxy)carbonyl]amino]ethoxy]poly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 28.3
  • Durch das in Beispiel 11 beschriebene Verfahren wurde α-(2-Aminoethyl)-ω-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 28.3 (wie in Beispiel 1f hergestellt) zu α-Methyl-ω-[2-[[(2-pyri dinyloxy)carbonyl]-amino]ethoxy]poly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 28.3 umgewandelt.
  • Analyse berechnet für C&sub9;H&sub1;&sub2;N&sub2;O&sub3;(CH&sub2;CH&sub2;O)28.3: C, 54,61; H, 8,75; N, 1,94. Gefunden: C, 54,67; H, 8,96; N, 1,63.
    • Beispiel 12 Herstellung von IL-1ra, konjugiert an PEG, mit Hilfe des Reagenz α-Methyl-ω-2-[[(2-pyridinyloxy)carbonyl]amino]- ethoxy]poly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 111.7
  • α-Methyl-ω-[2-[[(2-pyridinyloxy)carbonyl]amino]ethoxy]poly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 111.7 wurde zu 25 mg gereinigtem IL-1ra in 2,5 ml Puffer (0,1 M Natriumborat, pH 9,0) in einem Molverhältnis von 1 Mol Reagenz pro ein Mol IL-1ra gegeben. Die Lösungen wurden sorgfältig vermischt und die Pegylierungsreaktion wurde bei Raumtemperatur 60 Minuten ablaufen lassen. PEG-modifiziertes ILra wurde dann gemäß dem in Beispiel 6 ausgewiesenen Verfahren gereinigt.
  • Die vorherrschenden pegylierten Produkte von der 60- Minuten-Reaktion hatten scheinbare Molekulargewichte von 28 kD und 38 kD und zählten ungefähr 42 bzw. 29% des Gesamtproteins von dem Reaktionsgemisch.
  • Die Fähigkeit der gereinigten IL-1ra-Proteine aus dem Reaktionsgemisch, IL-1-Binden zu inhibieren, wurde wie in Beispiel 6 beschrieben bestimmt und in Tabelle XII zusammengefaßt. Die Bindungseigenschaften des 28 kD-Produkts waren nicht signifikant verändert und die Bindungsfähigkeit des 38 kD-Proteins behielt die Aktivität innerhalb des 5-fachen von IL-1ra bei.
    • TABELLE XII. Inhibierung von [¹²&sup5;I]-IL-1-Binden durch IL-1ra- Protein, pegyliert mit dem in Beispiel 11 beschriebenen Reagenz Scheinbares Molekulargewicht von IL-1ra Protein IC&sub5;&sub0; (kD) ng/ml
  • 19 (unmodifiziert) 2,0
  • 28 3,0
  • 38 10,0
  • Das pharmakodynamische Profil von PEG-IL-1ra wurde wie in Beispiel 6 beschrieben bestimmt. Die Daten werden in Tabelle D3 zusammengefaßt. IL-1 allein induziert 27283 U/ml IL-6. Unmodifiziertes IL-1ra inhibierte weniger als 50% der IL-I-Reaktion innerhalb 6 Stunden nach Verabreichung. Im Gegensatz, war PEG-IL-1ra, obwohl weniger aktiv, zu früheren Zeitpunkten viel aktiver nach 24 und 48 Stunden nach Injektion. Somit zeigte das PEG-IL-1ra ein längeres pharmakodynamisches Profil. TABELLE D3. Pharmakodynamisches Profil von IL-1ra, konjugiert mit dem in Beispiel 11 beschriebenen Reagenz
    • Beispiel 12A Herstellung von IL-1ra, konjugiert an PEG, mit Hilfe des Reagenz α-Methyl-ω-[2-[[(2-pyridinyloxy)carbonyl]amino]- ethoxy]poly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 225
  • α-Methyl-ω-[2-[[(2-pyridinyloxy)carbonyl]amino]ethoxy]poly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 225 (vorher wie in Beispiel 11a beschrieben) wurde zu 25 mg gereinigtem IL-1ra in 2,5 ml Puffer (0,1 M Natriumborat, pH 9,0) in einem Molverhältnis von 4 Mol Reagenz pro ein Mol IL-1ra gegeben. Die Lösungen wurden sorgfältig vermischt und die Pegylierungsreaktion wurde bei Raumtemperatur 60 Minuten ablaufen lassen. PEG-modifiziertes IL-1ra wurde dann gemäß dem in Beispiel 6 ausgewiesenen Verfahren gereinigt.
  • Die vorherrschenden, pegylierten Produkte von der 60- Minuten-Reaktion hatten scheinbare Molekulargewichte von 33 kD und 48 kD und betrugen ungefähr 76 bzw. 15% des Gesamtproteins von dem Reaktionsgemisch. Die Fähigkeit der gereinigten IL-1ra-Proteine, aus dem Reaktionsgemisch, das IL-1- Binden zu inhibieren, wird in Tabelle XIII zusammengefaßt. Das 33 kD-PEG-modifizierte Protein behielt seine Fähigkeit, IL-1-Binden zu inhibieren, mit dem 8-fachen, bezogen auf IL- 1ra, bei. Das 48 kD-Produkt verlor im wesentlichen Bindungskapazität.
    • TABELLE XIII. Inhibierung von [¹²&sup5;I]IL-1-Binden durch IL-1ra- Proteine, die mit dem in Beispiel 11a beschriebenen Reagenz pegyliert sind Scheinbares Molekulargewicht von IL-1ra Protein (kD) IC&sub5;&sub0;(ng/ml)
  • 19 (unmodifiziert) 0,8
  • 33 6,0
  • 48 18,0
  • Das pharmakokinetische Profil von PEG-IL-1ra wurde wie in Beispiel 6A beschrieben bestimmt. Die Daten werden in Tabelle D4 zusammengefaßt. Das PEG-IL-1ra war in Serumproben bei höheren Konzentrationen und für einen längeren Zeitraum, verglichen mit dem unmodifizierten IL-1ra, detektierbar. TABELLE D4. Pharmakokinetisches Profil von IL-1ra konjugiert an das in Beispiel 11a beschriebenen Reagenz
    • Beispiel 13 Herstellung von rIL-2, konjugiert an PEG, mit Hilfe des Reagenz α-Methyl-ω-[2-[[(2-pyridinyloxy)carbonyl]amino]- ethoxy]poly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 111.7
  • rIL-2 wurde mit α-Methyl-ω-[2-[[(2-pyridinyloxy)carbonyl]amino]ethoxy]poly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 111.7 gemäß den in Beispielen 3 und 8b beschrieben Verfahren pegyliert. Die spezifische Aktivität des IL-2-Proteins wurde wie in Beispiel 8 beschrieben bestimmt. Die spezifische Aktivität des 15 kD, unmodifizierten rIL-2 betrug 2 · 10&sup7; Einheiten/mg und das 29 kD-pegylierte IL-2 betrug 2,4 · 10&sup7; Einheiten/mg IL-2, was keinen wesentlichen Verlust an biologischer Aktivität als Ergebnis der Pegylierung ausweist.
    • Beispiel 14 Herstellung von PEG-modifiziertem rIL-1 α, konjugiert an PEG, mit Hilfe des Reagenz α-Methyl-ω-2-[[(2-pyridinyloxy)carbonyl]amino]ethoxy]poly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 111.7
  • rIL-1 α wurde mit dem in Beispiel 11 beschriebenen Reagenz α-Methyl-ω-[2-[[(2-pyridinyloxy)carbonyl]amino]ethoxy]poly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 111.7 gemäß dem in Beispielen 4 und 7 angeführten Verfahren pegyliert. Zwei pegylierte rIL- 1 α-Proteine mit scheinbaren Molekulargewichten von 28 kD und 38 kD wurden gereinigt und betrugen 50 bzw. 25 Prozent der Gesamtproteine aus dem Reaktionsgemisch bei 60 Minuten.
    • Beispiel 15 Herstellung von IFN-α, konjugiert an PEG mit Hilfe des Reagenz α-Methyl-ω-[2-[[(2-pyridinyloxy)carbonyl]amino]- ethoxy]poly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 111.7
  • IFN-α wurde mit dem in Beispiel 11 beschriebenen Reagenz α-Methyl-ω-[2-[[(2-pyridinyloxy)carbonyl]amino]ethoxy]- poly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 111.7 gemäß dem in Beispiel 8 angegebenen Verfahren pegyliert. Vierzig Prozent Protein wurden nach 60 Minuten derivatisiert und das Produkt hatte ein scheinbares Molekulargewicht von 26 kD.
    • Beispiel 16 Herstellung von IFN-α, konjugiert an PEG, mit Hilfe des Reagenz α-Methyl-ω-[2-[[(2-pyridinyloxy)carbonyl]amino]- ethoxy]poly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 111.7 - Alternatives Verfahren zum Pegylieren von IFN-α
  • Unter Verwendung des in Beispiel 9 erläuterten Verfahrens wurde IFN-α an PEG durch α-Methyl-ω-[2-[[(2-pyridinyloxy)carbonyl]amino]ethoxy]poly(oxy-1,2-ethandiyl), SRU 111.7, konjugiert. Die spezifische Aktivität von IFN-α wurde wie in Beispiel 8 beschrieben bestimmt. Die spezifische Aktivität des Ausgangs-IFN-α betrug 1,7 · 10&sup8; U/mg und die spezifische Aktivität des an PEG durch α-Methyl-ω-[2-[[(2-pyridinyloxy)carbonyl]amino]ethoxy]poly(oxy-1,2-ethandiyl) konjugierten IFN-α betrug 0,8 · 10&sup8; U/mg, was innerhalb des 2- bis 3-fachen von IFN-α lag.
    • Beispiel 17 Herstellung von IFN-α, konjugiert an PEG, mit Hilfe des Reagenz α-Methyl-ω-[2-[[(2-pyridinyloxy)carbonyl]amino]- ethoxy]poly(oxy-1,2-ethandyl) SRU 225
  • Unter Verwendung des in Beispiel 9 erläuterten Verfahrens wurde IFN-α mit Hilfe des in Beispiel 11a beschriebenen Reagenz pegyliert. Die spezifische Aktivität, bestimmt durch das in Beispiel 8 beschriebene Verfahren von IFN-α, konjugiert an PEG, betrug 0,4 · 10&sup8; U/mg, was keinen signifikanten Verlust an Bioaktivität anzeigt.
    • Beispiel 18 Herstellung von α-[(2-Pyridinyloxy)carbonyl]-ω-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 111.7
  • Aus einer Lösung von 1 g MPEG, Molekulargewicht 5000, gelöst in 30 ml trockenem CH&sub2;Cl&sub2;, wurden 10 ml Lösungsmittel abdestilliert. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur gekühlt und 132 mg (0,6 mM) Di-2-pyridylcarbonat und 4 mg DMAP wurden zugegeben. Die erhaltene Lösung wurde dann 14 Stunden gerührt und das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde mit Diethylether verrieben und der erhaltene Niederschlag filtriert. Das Produkt wurde dann in 7 ml trockenem Glym gelöst, zur Auflösung erwärmt und die erhaltene Lösung abkühlen lassen und bei Raumtemperatur einige Stunden belassen. Der erhaltene Niederschlag wurde dann filtriert und mit 2 · 5 ml trockenem Glym gewaschen. Der Feststoff wurde dann in einem Vakuumofen und unter einem Stickstoffstrom getrocknet zu 0,7 g α-[(2-Pyridinyloxy)carbonyl]-ω-methoxypoly(oxy-1,2- ethandiyl) SRU 111.7.
  • Analyse berechnet für C&sub9;H&sub1;&sub1;NO&sub4;(CH&sub2;CH&sub2;O)111.7: C, 54,57; H, 9,02; N, 0,28. Gefunden: C, 54,51; H, 9,19; N, 0,28.
    • Beispiel 18a Herstellung von α-[(2-Pyridinyloxy)carbonyl]-ω-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 225
  • Durch das in Beispiel 18 beschriebene Verfahren wurde MPEG (Methoxypolyethylenglycol), Molekulargewicht 10 000, zu α-[(2-Pyridinyloxy)carbonyl]-ω-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl), SRU 225 umgewandelt.
  • Analyse berechnet für C&sub9;H&sub1;&sub1;NO&sub4;(CH&sub2;CH&sub2;O)&sub2;&sub2;&sub5;: C, 54,54;
  • H, 9,08; N, 0,14. Gefunden: C, 54,54; H, 9,12; N, 0,11.
    • Beispiel 19 Herstellung von IL-1ra, konjugiert an PEG mit Hilfe des Reagenz α-[(2-Pyridinyloxy)carbonyl]-ω-methoxypoly(oxy- 1,2-ethandiyl) SRU 111.7
  • IL-1ra wurde mit α-[(2-Pyridinyloxy)carbonyl]-ω-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 111.7 durch das vorstehend in Beispielen 6 und 12 beschriebene Verfahren pegyliert. Die vorherrschenden, pegylierten Produkte hatten scheinbare Molekulargewichte von 26 kD und 33 kD und betrugen ungefähr 31 bzw. 57 Prozent des Gesamtproteins aus dem 60-Minuten-Reaktionsgemisch. Die Fähigkeit der gereinigten IL-1ra-Proteine aus dem Reaktionsgemisch, IL-1-Bindung zu inhibieren, wurde wie in Beispiel 6 beschrieben bestimmt und in Tabelle XIV zusammengefaßt. Das 26 kD pegylierte IL-1ra-Konjugat behielt dessen Bindungskapazität innerhalb des 4-fachen von IL-1ra bei. Das 33 kD-Konjugat verlor signifikant Bindungsaktivität, wie durch die 15-fache Abnahme der konkurrierenden Bindungsaktivität ausgewiesen.
    • TABELLE XIV. Inhibierung von [¹²&sup5;I]IL-1-Bindung durch IL-1ra- Proteine, die mit dem in Beispiel 18 beschriebenen Reagenz pegyliert sind Scheinbares Molekulargewicht von IL-1ra Protein (kD) IC&sub5;&sub0; (ng/ml)
  • 19 (unmodifiziert) 2,0
  • 26 8,0
  • 33 30,0
    • Beispiel 19A Herstellung von IL-1ra, konjugiert an PEG mit Hilfe des Reagenz α-[(2-Pyridinyloxy)carbonyl]-ω-methoxypoly(oxy- 1,2-ethandiyl) SRU 225
  • IL-ra wurde mit α-[(2-Pyridinyloxy)carbonyl]-ω-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 225 gemäß dem in Beispiel 19 angeführten Verfahren pegyliert. Die vorherrschenden, pegylierten Produkte aus dem 60-Minuten-Reaktionsgemisch hatten scheinbare Molekulargewichte von 33 kD und 48 kD und betrugen ungefähr 47 bzw. 25 Prozent des Gesamtproteins aus dem Reaktionsgemisch.
  • Die Fähigkeit der gereinigten IL-1ra-Proteine aus dem Reaktionsgemisch, das IL-1-Binden zu inhibieren, wurde wie in Beispielen 6 und 12 beschrieben bestimmt und in Tabelle XV zusammengefaßt. Das 33 kD-Protein behielt die Aktivität innerhalb des 6-fachen von IL-1ra bei. Das Konjugat mit höherem Molekulargewicht verlor signifikant Aktivität.
    • TABELLE XV. Inhibierung von [¹²&sup5;I] IL-1-Binden durch IL-1ra- Proteine, die mit dem in Beispiel 18a beschriebenen Reagenz pegyliert sind Scheinbares Molekulargewicht von IL-1ra Protein (kD) IC&sub5;&sub0; (ng/ml)
  • 19 (unmodifiziert) 1,5
  • 33 9,0
  • 48 40,0
  • Das pharmakokinetische Profil von PEG-IL-1ra wurde wie im Beispiel 6A beschrieben bestimmt. Die Daten werden in Tabelle D5 zusammengefaßt. Das PEG-IL-1ra war in den Serumproben für einen längeren Zeitraum, verglichen mit dem unmodifizierten IL-1ra, detektierbar, was eine längere Serum- Halbwertszeit anzeigt. Das pharmakodynamische Profil von PEG- IL-1ra wurde wie in Beispiel 6 beschrieben bestimmt, mit der Ausnahme, daß 0,05 ug rIL-1a verabreicht wurden. Die Daten werden in Tabelle D6 zusammengefaßt. Die Reaktion auf IL-1 allein war 9203 Einheiten/ml IL-6. Eine längere Inhibitorwirkung, verglichen mit unmodifiziertem IL-1ra, kann bis 72 Stunden nach Verabreichung von PEG-IL-1ra beobachtet werden, was verbesserte pharmakodynamische Eigenschaften zeigt. Zusammgefaßt erläutern diese Daten, daß, auch wenn ein pegyliertes Protein in vitro verminderte Aktivität aufweist, es verbesserte pharmakodynamische Eigenschaften in vivo aufweisen könnte. TABELLE D5. Pharmakokinetisches Profil von IL-1ra, konjugiert mit dem in Beispiel 18a beschriebenen Reagenz TABELLE D6. Pharmakodynamisches Profil von IL-1ra, konjugiert mit dem in Beispiel 18 beschriebenen Reagenz
    • Beispiel 20 Herstellung von IFN-α, konjugiert an PEG mit Hilfe des Reagenz α-[(2-Pyridinyloxy)carbonyl]-ω-methoxypoly(oxy- 1,2-ethandiyl) SRU 111.7
  • Das Reagenz α-[(2-Pyridinyloxy)carbonyl]-ω-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl), SRU 111.7, wurde zu 1 mg gereinigtem IFN-α in 200 ul Puffer (0,1 Natriumborat, pH 9,0) in einem Molverhältnis von 10 Mol Reagenz pro Mol IFN-α gegeben. Die Lösungen wurden sorgfältig vermischt und die Pegylierungsreaktion wurde bei Raumtemperatur 60 Minuten ablaufen lassen. Gereinigtes, PEG-modifiziertes IFN-α wurde dann gemäß dem in Beispiel 8 angeführten Verfahren erhalten. Sechsunddreißig Prozent Protein wurden derivatisiert und das Produkt hatte ein scheinbares Molekulargewicht von 28 kD.
  • Die spezifische Aktivität der gereinigten IFN-Proteine aus dem Reaktionsgemisch wurde wie in Beispiel 8 beschrieben bestimmt und die Werte werden in Tabelle XVI zusammengefaßt. Das modifizierte IFN wies eine 5- bis 6-fache Verringerung der biologischen in vitro-Aktivität auf.
    • TABELLE XVI. Bioaktivität von IFN-α, konjugiert mit dem in Beispiel 18 beschriebenen Reagenz Scheinbares Molekulargewicht von IFN-α Protein (kD) Spezifische Aktivität (Einheiten/mg)
  • 15 (unmodifiziert) 1,88 · 10&sup8;
  • 28 8,0 · 10&sup7;
    • Beispiel 20A Herstellung von rIL-2, konjugiert an PEG mit Hilfe des Reagenz α-[(2-Pyridinyloxy)carbonyl]-ω-methoxypoly(oxy- 1,2-ethandiyl) SRU 111.7
  • Das Reagenz α-[(2-Pyridinyloxy)carbonyl]-ω-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl), SRU 111.7, vorstehend in Beispiel 18 beschrieben, wurde zu 1 mg rIL-2 in 200 ul Puffer (0,1 Natriumborat, pH 9,0) in einem Molverhältnis von 5 Mol des Reagenz pro ein Mol rIL-2 gegeben. Die Lösungen wurden sorgfältig vermischt und die Pegylierungsreaktion wurde bei Raumtemperatur 60 Minuten ablaufen lassen.
  • Die vorherrschenden Molekulargewichtsarten aus dem 60-Minuten-Reaktionsgemisch wurden durch SDS-PAGE mit scheinbaren Molekulargewichten von 15 kD (unmodifiziert) und 25 kD identifiziert. Das 25 kD-pegylierte Protein betrug 60% Gesamtprotein.
    • Beispiel 21 Herstellung von IFN-α, konjugiert an PEG mit Hilfe des Reagenz α-[(2-Pyridinyloxy)carbonyl]-ω-methoxypoly(oxy- 1,2-ethandiyl) SRU 111.7
  • IFN-α wurde mit dem in Beispiel 18 beschriebenen Reagenz gemäß dem in Beispiel 9 beschriebenen Verfahren pegyliert.
  • Die spezifische Aktivität, bestimmt durch die in Beispiel 8 beschriebene Verfahren, des unmodifizierten Ausgangs- IFN-α betrug 1,0 · 10&sup8; U/mg und die spezifische Aktivität von dem IFN-α, konjugiert an PEG, betrug 0,4 · 10&sup8; U/mg, was keinen signifikanten Verlust an Bioaktivität anzeigt.
    • Beispiel 22 Herstellung von IFN-α, konjugiert an PEG mit Hilfe des Reagenz α-[(2-Pyridinyloxy)carbonyl]-ω-methoxypoly(oxy- 1,2-ethandiyl) SRU 225.
  • PEG wurde unter Verwendung des in Beispiel 18a beschriebenen Reagenz mit den Verfahren von Beispiel 9 an IFN-α konjugiert. Die spezifische Aktivität, bestimmt durch die in Beispiel 8 beschriebenen Verfahren, von IFN-α, konjugiert an PEG, betrug 0,3 · 10&sup8; U/mg.
    • Beispiel 23 Herstellung von α-[2-(Isothiocyanato)ethyl]-ω-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 111.7
  • Zu 2 g α-(2-Aminoethyl)-ω-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl), SRU 111.7, in 100 ml CH&sub2;Cl&sub2;, wurden 94,2 mg Di-2-pyridylthiocarbonat gegeben. Die Lösung wurde 18 Stunden gerührt und dann mit einer kleinen Menge kaltem Wasser extrahiert. Das meiste des CH&sub2;Cl&sub2; wurde unter vermindertem Druck entfernt und Ether zur Ausfällung zugesetzt. Das Produkt wurde filtriert und unter Hochvakuum getrocknet zu α-[2-(Isothiocyanato)ethyl]-ω-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 111.7.
  • Analyse berechnet für C&sub4;H&sub7;NOS (CH&sub2;CH&sub2;O)111.7: C, 53,88; H, 9,07; N, 0,28; S, 0,64. Gefunden: C, 54,45; H, 8,93; N, 0,28; S, 0,53.
    • Beispiel 24 Herstellung von IFN-α, konjugiert an PEG mit Hilfe des Reagenz α-[2-(Isothiocyanato)ethyl]-ω-methoxypoly(oxy- 1,2-ethandiyl), SRU 111.7
  • Das Reagenz α-[2-(Isothiocyanato)ethyl]-ω-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl), SRU 111.7, vorstehend in Beispiel 23 beschrieben, wurde zu 1 mg gereinigtem IFN-α in 200 ul Puffer (0,1 M Natriumborat, pH 9,0) in einem Molverhältnis von 10 Mol Reagenz pro ein Mol IFN-α gegeben. Die Lösungen wurden sorgfältig vermischt und die Pegylierungsreaktion wurde bei Raumtemperatur 60 Minuten ablaufen lassen. Dreißig Prozent des Produkts wurden derivatisiert und hatten ein scheinbares Molekulargewicht von 26 kD.
    • Beispiel 25 Herstellung von rIL-2, konjugiert an PEG mit Hilfe des Reagenz α-[2-(Isothiocyanato)ethyl]-ω-methoxypoly(oxy- 1,2-ethandiyl), SRU 111.7
  • Das Reagenz α-[2-(Isothiocyanato)ethyl]-ω-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl), SRU 111.7, vorstehend in Beispiel 23 beschrieben, wurde zu 1,0 mg rekombinantem IL-2 (rIL-2) in 100 ul Puffer (0,1 M Natriumborat, pH 9,0) in einem Molverhältnis von 10 Mol Reagenz PEG pro Mol rIL-2 gegeben. Die Lösungen wurden sorgfältig vermischt und die Pegylierungsreaktion wurde bei Raumtemperatur 60 Minuten ablaufen lassen. Gereinigtes, PEG-modifiziertes rIL-2 wurde dann gemäß dem in Beispiel 3 angegebenen Verfahren erhalten. Die Derivatisierungsergebnisse werden in Tabelle XVII zusammengefaßt.
    • TABELLE XVIT. Modifizierung von rIL-2 mit dem in Beispiel 23 beschriebenen Reagenz Scheinbares Molekulargewicht von rIL-2 Protein (kD) % Gesamt-Protein aus der Reaktion
  • 15 (unmodifiziert) 70
  • 26 20
  • 30 10
    • Beispiel 26 Herstellung von IL-ira, konjugiert an PEG mit Hilfe des Reagenz α-[2-(Isothiocyanato)ethyl]-ω-methoxypoly(oxy- 1,2-ethandiyl), SRU 111.7
  • IL-1ra wurde mit α-[2-(Isothiocyanato)ethyl]-ω-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl), SRU 111.7, gemäß dem in Beispiel 6 beschriebenen Verfahren pegyliert. Die vorherrschenden pegylierten Produkte hatten Molekulargewichte von 26, 31, 38 und 48 kD und betrugen ungefähr 17, 44, 15 und 10 Prozent des Gesamtproteins.
  • Die Fähigkeit von gereinigtem 26 kD IL-1ra-Protein aus dem 60-Minuten-Reaktionsgemisch, IL-1-Binden zu inhibieren, wurde durch in Beispiel 6 beschriebene Verfahren bestimmt und in Tabelle XVIII zusammengefaßt. Das pegylierte Protein behielt seine Bindungskapazität innerhalb des 2- bis 3-fachen von IL-1ra bei.
    • TABELLE XVIII. Inhibierung von [¹²&sup5;I] IL-1-Binden von IL-1ra- Protein, pegyliert mit dem in Beispiel 23 beschriebenen Reagenz Scheinbares Molekulargewicht von IL-1ra Protein (kD) IC50 (ng/ml)
  • 19 2,0
  • 26 5,0
    • Beispiel 27 Herstellung von rIL-1α, konjugiert an PEG mit Hilfe des Reagenz α-[2-(Isothiocyanato)ethyl]-ω-methoxypoly(oxy- 1,2-ethandiyl), SRU 111.7
  • Rekombinantes IL-1 α wurde mit α-[2-(Isothiocyanato)ethyl]-ω-methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl), SRU 111.7, wie in Beispiel 4 beschrieben pegyliert. Zwei vorherrschende, pegylierte Molekulargewichtsarten aus dem 60-Minuten-Reaktionsgemisch wurden durch SDS-PAGE mit scheinbaren Molekulargewichten von 26 und 38 kD identifiziert. Die letzteren zwei pegylierten Proteine betrugen 46 bzw. 48 Prozent des Gesamtproteins. Das pegylierte rIL-1 α wurde aus dem Reaktionsgemisch gereinigt und wie in Beispiel 4 beschrieben charakterisiert.
  • Die Bioaktivität der zusammengegebenen, gereinigten Fraktionen wurde in dem wie in Beispiel 7 beschriebenen D10- Zell-Proliferation-Assay bewertet und die Ergebnisse in Tabelle XIX zusammengefaßt. Die in der Tabelle als Gemische angeführten Proben enthielten mehr als eine Proteinart, die nicht weiter gereinigt wurde. Das 26 kD-pegylierte Protein hatte eine spezifische Aktivität, die von IL-1 im wesentlichen nicht unterscheidbar war.
    • TABELLE XIX. Bioaktivität von rIL-1 α, konjugiert an PEG mit dem in Beispiel 23 beschriebenen Reagenz Scheinbares Molekulargewicht von rIL-1 α Protein (kD) Spezifische Aktivität (Einheiten/mg)
  • 17 1,1 · 10&sup8;
  • 26 1,7 · 10&sup8;
  • 26, 38 (Gemisch) 2,0 · 10&sup8;
  • > 38 (Gemisch) 6,0 · 10&sup6;
    • Beispiel 28 Herstellung von α-[(2-Pyridinyloxy)thiocarbonyl]-ω- methoxypoly(oxy-1,2-ethandiyl), SRU 225
  • Aus einer Lösung von 1 g (0,1 mMol) MPEG (Methoxypolyethylenglycol, Molekulargewicht 10 000) in 30 ml CH&sub2;Cl&sub2; wurden 10 ml Lösungsmittel abdestilliert. Die erhaltene Lösung wurde abgekühlt und 69,7 mg (0,3 mM) Di-2-pyridylthionocarbonat und 2 mg DMAP zugegeben. Das Gemisch wurde dann unter Argonatmosphäre 18 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt und der Rückstand in einem Minimum von CH&sub2;Cl&sub2; erneut gelöst. Ether wurde dann zugesetzt und der erhaltene Niederschlag filtriert und mit Ether gewaschen. Das Produkt wurde dann in 5 ml warmem Glym gelöst und die erhaltene Lösung über Nacht belassen. Der erhaltene Niederschlag wurde dann filtriert und mit 2 · 5 ml Glym und 5 ml Diethylether gewaschen. Das Produkt wurde dann in einem Vakuumofen unter einem langsamen Stickstoffstrom getrocknet zu 0,9 g α-[(2-Pyridinyloxy)thiocarbonyl]-ω-methoxypoly(oxy-1,2- ethandiyl) SRU 225.
  • Analyse berechnet für C&sub9;H&sub1;&sub1;NO&sub3;S(CH&sub3;CH&sub2;O)225.3: C, 54,46; H, 9,04. Gefunden: C, 54,67; H, 9,30.
    • Beispiel 29 Herstellung von IL-1ra, konjugiert an PEG mit Hilfe des Reagenz α-[(2-Pyridinyloxy)thiocarbonyl]-ω-methoxypoly- (oxy-1,2-ethandiyl) SRU 225
  • α-[(2-Pyridinyloxy)thiocarbonyl]-ω-methoxypoly(oxy- 1,2-ethandiyl), SRU 225, hergestellt wie in Beispiel 28 beschrieben, wurde zu 2,0 mg IL-1ra in 1,0 ml Puffer (0,1 M Na triumborat, pH 9,0) in einem Molverhältnis von 2 Mol des Reagenz pro ein Mol IL-1ra gegeben. Die Lösungen wurden sorgfältig vermischt und die Pegylierungsreaktion bei Raumtemperatur für 60 Minuten ablaufen lassen. PEG-modifiziertes IL-1ra wurde dann gemäß dem in Beispiel 6 ausgewiesenen Verfahren gereinigt.
  • Das vorherrschende, pegylierte Produkt hatte ein scheinbares Molekulargewicht von 33 kD und zählte für ungefähr 17% des Gesamtproteins aus dem 60-Minuten-Reaktionsgemisch. Die Fähigkeit der gereinigten IL-1ra-Proteine aus dem Reaktionsgemisch, IL-1-Binden zu inhibieren, wurde wie in Beispiel 6 beschrieben bestimmt und in Tabelle XX zusammengefaßt. Die Bindungskapazität des 33 kD-Proteins war innerhalb des 3- bis 4-fachen von IL-1ra.
    • TABELLE XX. Inhibierung von [¹²&sup5;I]IL-1-Binden durch IL-1ra- Proteine, pegyliert mit dem in Beispiel 28 beschriebenen Reagenz Molekulargewicht von IL-1ra Protein (kD) IC&sub5;&sub0; ng/ml
  • 19 (unmodifiziert) 1,4
  • 33 5,0
    • Beispiel 30 Carbonothiosäure-o,o-di-(6-methyl-2-pyridinyl)ester
  • Zu einer Lösung von 10 g (0,09 Mol) 6-Methyl-2-hydroxypyridin in 250 ml trockenem CH&sub2;Cl&sub2; wurden 12,7 ml Triethylamin gegeben. Die Lösung wurde auf 0ºC abgekühlt und unter Argonatmosphäre wurden tropfenweise 4,1 ml (0,046 Mol) einer Lösung von Thiophosgen in CCl&sub4; (85%) gegeben. Das Gemisch wurde dann bei Raumtemperatur 5 Stunden rühren lassen, filtriert und die CH&sub2;Cl&sub2;-Lösung zweimal mit 100 ml gesättigter NaHCO&sub3;-Lösung gewaschen. Die organische Schicht wurde getrocknet und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Hexan (100 ml) wurde dann zu dem Rückstand gegeben und das erhaltene Gemisch wurde über Nacht verarbeiten lassen. Der erhaltene Niederschlag wurde abfiltriert, mit Hexan gewaschen und in einem Vakuumofen unter einem langsamen Stick stoffstrom getrocknet zu 5,7 g Carbonothionsäure-o,o-di-(6- methyl-2-pyridinyl)ester, Fp. 155-156ºC.
  • Analyse berechnet für C&sub1;&sub3;H&sub1;&sub2;N&sub2;O&sub2;S: C, 59,98; H, 4,65; N, 10,76; S, 12,32. Gefunden: C, 59,65; H, 4,59; H, 10,75; S, 12,06.
    • Beispiel 31 α-Methyl-ω-[2-[[(6-methyl-2-pyridinyloxy)thiocarbonyl]amino]ethoxy]poly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 225
  • Eine Lösung von 1 g α-Methoxy-ω-(2-aminoethyl)poly- (oxy-1,2-ethandiyl) SRU 225 (wie in Beispiel 1c hergestellt) und 52,7 mg Carbonothionsäure-o,o-di(6-methyl-2-pyridinyl)- ester (Beispiel 30), gelöst in 15 ml trockenem CH&sub2;Cl&sub2;, wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand mit Diethylether verrieben. Der Niederschlag wurde filtriert und mit Ether gewaschen. Das Produkt wurde dann in 5 ml warmem Glym gelöst und durch ein 0,75 um-Millipore-Filter filtriert. Die Lösung wurde dann bei Raumtemperatur 48 Stunden belassen und der erhaltene Niederschlag filtriert. Das Produkt wurde dann in einem Vakuumofen unter N&sub2;-Atmosphäre 18 Stunden getrocknet zu 0,9 g α-Methyl-ω-[2-[[(6-methyl-2-pyridinyloxy)- thiocarbonyl]amino]ethoxy]poly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 225.
  • Analyse berechnet für C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub4;N&sub2;O&sub2;S (CH&sub2;CH&sub2;O)&sub2;&sub2;&sub5;: C, 54,50; H, 9,09; N, 0,27; S, 0,32. Gefunden: C, 54,38; H, 9,20; N, 0,21; S, 0,37.
    • Beispiel 32 Herstellung von rIL-1ra, konjugiert an PEG mit Hilfe des Reagenz α-Methyl-ω-[2-[[(6-methyl-2-pyridinyloxy)thiocarbonyl]amino]ethoxy]poly(oxy-1,2-ethandiyl), SRU 225
  • Das wie vorstehend in Beispiel 31 beschrieben hergestellte Reagenz wurde zu 5,0 mg gereinigtem rIL-1ra in 1,0 ml 0,1 M Natriumborat, pH 9,0, in einem Molverhältnis von 2,0 Mol Reagenz pro Mol rIL-1ra gegeben. Die Lösung wurde sorgfältig vermischt und das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 60 Minuten reagieren lassen.
  • Die rIL-1ra-Produkte wurden unter Verwendung des in Beispiel 6 beschriebenen Verfahrens bewertet. Tabelle XXI zeigt die Prozent Modifizierung der primären Molekulargewichtsart aus dem Reaktionsgemisch.
    • TABELLE XXI. Modifizierung von rIL-1ra mit dem in Beispiel 31 beschriebenen Reagenz Scheinbares Molekulargewicht von rIL-1ra Protein (kD) % Gesamt-Protein aus der Reaktion
  • 19 (unmodifiziert) 30,0
  • 35 65,0
  • 48 5,0
  • rIL-1ra-Produkte aus dem Reaktionsgemisch wurden unter Verwendung des in Beispiel 6 beschriebenen Verfahrens gereinigt.
  • Gereinigte Fraktionen aus dem Reaktionsgemisch wurden in einem rIL-1-Radiorezeptor-Konkurrierenzbindungsassay, wie vorstehend in Beispiel 6 beschrieben, bewertet. Die Ergebnisse werden in Tabelle XXII gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen, daß das 35 kD-Protein 6-fach weniger aktiv war als unmodifiziertes IL-1ra zum Inhibieren von IL-1-Binden, während das 48 kD-Protein 20-fach weniger aktiv war.
    • TABELLE XXII. Inhibierung von [¹²&sup5;I] IL-1-Binden durch IL- 1ra, konjugiert mit dem in Beispiel 31 beschriebenen Reagenz Scheinbares Molekulargewicht von rIL-1ra Protein (kD) IC&sub5;&sub0; (ng/ml)
  • 19 (unmodifiziert) 1,5
  • 35 9,0
  • 48 30,0
    • Beispiel 33 α-[2-[[(2-Pyridinyloxy)carbonyl]amino]ethyl]-ω-[2- [[(2-pyridinyloxy)carbonyl]amino]ethoxy]poly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 180 A. Herstellung von α-(2-Chlorethyl)-ω-(2-chlorethoxy)poly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 180
  • Aus einer Aufschlämmung von 80 g MPEG (Polyethylenglycol, Molekulargewicht 8000) in 750 ml Toluol wurden 200 ml Lösungsmittel abdestilliert. Zu der Lösung unter Rückfluß wurden tropfenweise 1,7 ml trockenes Pyridin und 4,7 ml Thionylchlorid gegeben. Nach Erhitzen unter Rückfluß für zwölf Stunden wurde das Reaktionsgemisch über Nacht gerührt. Methylenchlorid (50 ml) wurden dann zugegeben und die erhaltene Lösung durch 60 g basisches Aluminiumoxid (Wolem Super 1) filtriert. Die Säule wurde dann mit 500 ml CH&sub2;Cl&sub2; eluiert, die organischen Schichten vereinigt und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde dann in 300 ml CH&sub2;Cl&sub2; gelöst und langsam Ether zugegeben, während die Lösungsmittel auf einem Dampfbad entfernt wurden. Dieses Verfahren wurde fortgesetzt, bis sich eine trübe Suspension entwickelte. Das erhaltene Gemisch wird dann bei Raumtemperatur für einige Stunden gerührt und das Produkt dann filtriert zu 73 g α-(2-Chlorethyl)-ω-(2-chlorethoxy)poly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 180.
  • Analyse berechnet für C&sub2;H&sub4;Cl&sub2; (CH&sub2;CH&sub2;O)&sub1;&sub8;&sub0;: C, 54,16; H, 9,09; Cl, 0,88. Gefunden: C, 53,40; H, 8,81; Cl, 0,93.
    • B. Herstellung von α-(2-Azidoethyl)-ω-(2-azidoethoxy)poly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 180
  • Ein Gemisch von 72 g α-(2-Chlorethyl)-ω-(2-chlorethoxy)poly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 180, 25 g Natriumazid und 700 ml trockenem DMF wurde gerührt und 12 Stunden auf 125ºC erhitzt. Das Lösungsmittel wurde dann unter Hochvakuum entfernt und der Rückstand in einem Liter CH&sub2;Cl&sub2; gelöst und durch Celite filtriert. Das CH&sub2;Cl&sub2; wurde dann auf einem Dampfbad entfernt, während Diethylether zum Ausfällen zugesetzt wurde. Das Gemisch wurde über Nacht gerührt und dann filtriert. Der Niederschlag wurde anschließend in einem Minimum an Glym bei 50ºC gelöst und langsam abgekühlt und filtriert. Das Produkt trocknete anschließend in einem Vakuumofen unter N&sub2;-Strom zu 69 g α-(2-Azidoethyl)-ω-(2-azidoethoxy)poly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 180.
  • Analyse berechnet für C&sub2;H&sub4;N&sub6; (CH&sub2;CH&sub2;O)&sub1;&sub8;&sub0;: C, 54,07; H, 9,08; N, 1,044. Gefunden: C, 53,76; H, 9,28; N, 0,96.
    • C. Herstellung von α-(2-Aminoethyl)-ω-(2-aminoethoxy)poly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 180
  • Eine Lösung von 69 g α-(2-Azidoethyl)-ω-(2-azidoethoxy)poly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 180 und 6,7 g (25,6 mMol) Triphenylphosphin, das in 200 ml trockenem CH&sub2;Cl&sub2; gelöst war, wurde über Nacht unter Argonatmosphäre gerührt. Wasser (2 ml) wurde zugegeben und das Gemisch weitere 12 Stunden gerührt. Das meiste des Methylenchlorids wurde unter Vakuum entfernt und 400 ml Diethylether zugesetzt. Der Niederschlag wurde filtriert, mit Ether gewaschen und in 300 ml warmem (50ºC) Glym gelöst. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur über Nacht belassen und der erhaltene Niederschlag filtriert, mit 2 · 100 ml Glym, 2 · 300 ml Diethylether gewaschen und in einem Vakuumofen unter einem N&sub2;-Strom getrocknet zu 66 g α-(2-Aminoethyl)-ω-(2-aminoethoxy)poly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 180.
  • Analyse berechnet für C&sub2;H&sub8;N&sub2;(CH&sub2;CH&sub2;O)&sub1;&sub8;&sub0;: C, 54,42; H, 9,18; N, 0,35. Gefunden: C, 53,85; H, 9,20; N, 0,43.
    • D. α-[2-[[(2-Pyridinyloxy)carbonyl]amino]ethyl]-ω-[2- [[(2-pyridinyloxy)carbonyl]amino]ethoxy]poly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 180
  • Aus einer Lösung von 1 g α-(2-Aminoethyl)-ω-(2-aminoethoxy)poly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 180, gelöst in 40 ml trockenem CH&sub2;Cl&sub2;, wurden 15 ml Lösungsmittel abdestilliert. Die Lösung wurde auf 0ºC gekühlt und 85 mg (6,39 mMol) Di-2-pyridylcarbonat wurden zugegeben. Das Gemisch wurde dann bei 0ºC 4 Stunden gerührt und das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde mit Diethylether verrieben und das Produkt filtriert und mit Ether (2 · 75 ml) gewaschen. Das Produkt wurde dann unter Vakuum getrocknet und in 8 ml trockenem Glym (50ºC) gelöst. Die Lösung wurde abkühlen lassen und bei Raumtemperatur 12 Stunden belassen. Das ausgefallene Produkt wurde filtriert, mit 2 · 5 ml Glym gewaschen und in einem Vakuumofen unter einem N&sub2;-Strom getrocknet zu 1 g α-[2-[[(2-Py ridinyloxy)carbonyl]amino]ethyl]-ω-[2-[[(2-pyridinyloxy)carbonyl]amino]ethoxy]poly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 180.
  • Analyse berechnet für C&sub1;&sub4;H&sub1;&sub4;N&sub4;O&sub4;(CH&sub2;CH&sub2;O)&sub1;&sub8;&sub0;: C, 54,57; H, 8,99; N, 0,68. Gefunden: C, 54,32; H, 8,79; N, 0,77.
    • Beispiel 34 α-[2-[[(2-Pyridinyloxy)carbonyl]amino]ethyl]-ω-[2- [[(2-pyridinyloxy)carbonyl]amino]ethoxy]poly(oxy-1,2-ethandiyl)SRU 452 A. Herstellung von α-(2-Chlorethyl)-ω-(2-chlorethoxy)poly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 452
  • Durch das in Beispiel 33A beschriebene Verfahren wurde Polyethylenglycol, Molekulargewicht 20 000, zu α-(2- Chlorethyl)-ω-(2-chlorethoxy)poly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 452 umgewandelt.
  • Analyse berechnet für C&sub2;H&sub4;Cl&sub2; (CH&sub2;CH&sub2;O)&sub4;&sub5;&sub2;: C, 54,38; H, 9,13; Cl, 0,35. Gefunden: C, 54,36; H, 9,23; Cl, 0,40.
    • B. Herstellung von α-(2-Azidoethyl)-ω-(2-azidoethoxy)poly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 452
  • Durch das in Beispiel 33B beschriebene Verfahren wurde α-(2-Chlorethyl)-ω-(2-chlorethoxy)poly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 452 zu α-(2-Azidoethyl)-ω-(2-azidoethoxy)poly(oxy- 1,2-ethandiyl) SRU 452 umgewandelt.
  • Analyse berechnet für C&sub2;H&sub4;N&sub6; (CH&sub2;CH&sub2;O)452: C, 54,35; H, 9,12; N, 0,42. Gefunden: C, 54,38; H, 9,30; N, 0,47.
    • C. Herstellung von α-(2-Aminoethyl)-ω-(2-aminoethoxy)poly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 452
  • Durch das in Beispiel 33C beschriebene Verfahren wurde α-(2-Azidoethyl)-ω-(2-azidoethoxy)poly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 452 zu α-(2-Aminoethyl)-ω-(2-aminoethoxy)poly(oxy-1,2- ethandiyl) SRU 452 umgewandelt.
  • Analyse berechnet für C&sub2;H&sub8;N&sub2; (CH&sub2;CH&sub2;O)&sub4;&sub5;&sub2;: C, 54,49; H, 9,17; N, 0,14. Gefunden: C, 54,44; H, 9,19; N, 0,15.
    • D. α-[2-[[(2-Pyridinyloxy)carbonyl]amino]ethyl]-ω-[2- [[(2-pyridinyloxy)carbonyl]amino]ethoxy]poly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 452
  • Durch das in Beispiel 33D beschriebene Verfahren wurde α-(2-Aminoethyl)-ω-(2-aminoethoxy)poly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 452 zu α-[2-[[(2-Pyridinyloxy)carbonyl]amino]- ethyl]-ω-[2-[[(2-pyridinyloxy)carbonyl]amino]ethoxy]poly(oxy- 1,2-ethandiyl) SRU 452 umgewandelt.
  • Analyse berechnet für C&sub1;&sub4;H&sub1;&sub4;N&sub4;O&sub4; (CH&sub2;CH&sub2;O)452: C, 54,56; H, 9,08; N, 0,28. Gefunden: C, 54,33; H, 9,13; N, 0,33.
    • Beispiel 35 Herstellung von rIL-1ra, konjugiert an PEG mit Hilfe des Reagenz α-[2-[[(2-Pyridinyloxy)carbonyl]amino]ethyl]-ω- [2-[[(2-pyridinyloxy)carbonyl]amino]ethoxylpoly(oxy-1,2- ethandiyl) SRU 452
  • Das wie vorstehend in Beispiel 34 beschrieben hergestellte Reagenz wurde zu 5,0 mg gereinigtem rIL-1ra in 1,0 ml 0,1 M Natriumborat, pH 9,0, in einem Molverhältnis von 1,0 Mol Reagenz pro 4,0 Mol rIL-1ra gegeben. Die Lösung wurde sorgfältig 60 Minuten bei Raumtemperatur vermischt.
  • Die rIL-1ra-Produkte wurden unter Verwendung des vorstehend in Beispiel 6 beschriebenen Verfahrens bewertet. Tabelle XXIII zeigt die prozentuale Modifizierung der primären Molekulargewichtsarten von dem Reaktionsgemisch.
    • TABELLE XXIII. Modifizierung von rIL-1ra mit dem in Beispiel 33 beschriebenen Reagenz Scheinbares Molekulargewicht von rIL-1ra Protein (kD) % Gesamt-Protein aus der Reaktion
  • 19 (unmodifiziert) 50,0
  • 55 35,0
  • 75 15,0
    • Beispiel 36 Bis-(3-methyl-2-pyridyl)carbonat
  • Eine Lösung von 4,6 g (42 mMol) 3-Methyl-2-hydroxypyridin und 6 ml Triethylamin, gelöst in 20 ml CH&sub2;Cl&sub2;, wurde bei 0ºC tropfenweise zu einer Lösung von 50 ml CH&sub2;Cl&sub2; und 11 ml Phosgen in Toluol (1,93 molar) gegeben. Das Gemisch wurde bei 0ºC 2 Stunden und dann bei Raumtemperatur 2 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann mit einer gesättigten NaHCO&sub3;-Lösung, gefolgt von gesättigter NaCl-Lösung gewaschen und dann getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;). Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand aus EtOAc/Hexan kristallisiert zu 3 g Bis-(3-methyl-2-pyridyl)carbonat, Fp. 110-112ºC.
  • Analyse berechnet für C&sub1;&sub3;H&sub1;&sub2;N&sub2;O&sub3;: C, 63,93; H, 4,95; N, 11,47. Gefunden: C, 63,78; H, 4,86; N, 11,23.
    • Beispiel 37 α-Methyl-ω-[2-[[(3-methyl-2-pyridinyloxy)carbonyl]- amino]ethoxy]poly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 225
  • Aus einer Lösung von 1 g α-Methoxy-ω-(2-aminoethyl)- poly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 225, gelöst in 25 ml CH&sub2;Cl&sub2;, wurden 10 ml Lösungsmittel abdestilliert. Zu der Lösung wurden anschließend 49,2 mg (0,2 mMol) Bis-(3-methyl-2-pyridyl)- carbonat gegeben und das erhaltene Gemisch unter Argonatmosphäre über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel wurde dann unter vermindertem Druck entfernt und 80 ml Diethylether zu dem Rückstand gegeben. Der Feststoff wurde filtriert, mit Ether gewaschen und dann in 10 ml CH&sub2;Cl&sub2; gelöst. Ether wurde dann langsam unter Abdestillieren von Lösungsmittel, bis die Lösung trübe wurde, zugegeben. Das Gemisch wurde dann 18 Stunden bei Raumtemperatur belassen und der erhaltene Niederschlag filtriert. Der Feststoff wurde dann in 8 ml warmem Glym gelöst und bei Raumtemperatur weitere 18 Stunden absetzen lassen. Das Produkt wurde dann filtriert und in einem Vakuumofen unter Stickstoffatmosphäre getrocknet zu 0,6 g α- Methyl-ω-[2-[[(3-methyl-2-pyridinyloxy)carbonyl]amino]ethoxy]poly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 225.
  • Analyse berechnet für C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub4;N&sub2;O&sub3; (CH&sub2;CH&sub2;O)&sub2;&sub2;&sub5;: C, 54,59; H, 9,09; N, 0,28. Gefunden: C, 55,64; H, 9,14; N, 0,22.
    • Beispiel 38 Herstellung von rIL-1ra, konjugiert an PEG mit Hilfe des Reagenz α-Methyl-ω-[2-[[(3-methyl-2-pyridinyloxy)carbonyl]amino]ethoxy]poly(oxy-1,2-ethandiyl) SRU 225
  • Das wie vorstehend in Beispiel 37 beschrieben hergestellte Reagenz wurde zu 5,0 mg gereinigtem rIL-1ra in 1,0 ml 0,1 M Natriumborat, pH 9,0, in einem Molverhältnis von 2,0 Mol Reagenz pro Mol rIL-1ra gegeben. Die Lösung wurde sorgfältig vermischt und das Reaktionsgemisch 60 Minuten bei Raumtemperatur belassen.
  • Die rIL-1ra-Produkte wurden unter Verwendung des in Beispiel 6 beschriebenen Verfahrens bewertet. Tabelle XXIV zeigt die Prozent Modifizierung der primären Molekulargewichtsarten aus dem Reaktionsgemisch.
    • TABELLE XXIV. Modifizierung von rIL-1ra mit dem in Beispiel 37 beschriebenen Reagenz Scheinbares Molekulargewicht von rIL-1ra Protein (kD) % Gesamt-Protein aus der Reaktion
  • 19 (unmodifiziert) 45,0
  • 35 43,0
  • 45 12,0
  • rIL-1ra-Produkte aus dem Reaktionsgemisch wurden wie in Beispiel 6 beschrieben gereinigt. Gereinigte Fraktionen aus dem Reaktionsgemisch wurden in einem rIL-1-Radiorezeptor- Konkurrenzbindungsassay, wie in Beispiel 6 beschrieben, bewertet. Die Ergebnisse werden in Tabelle XXV gezeigt. Das 35 kD-Protein war 4-mal weniger aktiv als unmodifiziertes IL-1ra zum Inhibieren von IL-1-Binden. Das 45 kD-Protein war 30-mal weniger aktiv.
    • TABELLE XXV. Inhibierung von [¹²&sup5;I] IL-1-Binden durch rIL-1ra, konjugiert mit dem in Beispiel 35 beschriebenen Reagenz Scheinbares Molekulargewicht von rIL-1ra Protein (kD) IC&sub5;&sub0; (ng/ml)
  • 19 (unmodifiziert) 1,0
  • 35 4,0
  • 45 30,0

Claims (23)

1. Physiologisch aktives Konjugat eines Proteins der Formel
worin R¹ Niederalkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen darstellt; R² -O- oder -NH- darstellt; R³ =N-R&sup4;, =S oder =O darstellt; R&sup4; Nieder-C&sub1;-C&sub6;-alkyl oder Cycloalkyl darstellt; m und n derart aus ganzen Zahlen ≥ 1 ausgewählt sind, daß das Konjugat mindestens einen Teil der biologischen Aktivität des nichtkonjugierten Proteins aufweist, und worin das Protein Interleukin-1, Interleukin-1ra, Interferon-α oder Interleukin-2 darstellt; mit der Maßgabe, daß, wenn R² -O- darstellt, R³ nicht =N-R&sup4; darstellt, und daß, wenn R² -O- darstellt und R³ =O darstellt, das Protein nicht Interleukin-2 ist.
2. Proteinkonjugat nach Anspruch 1, wobei m und n derart ausgewählt sind, daß das Molekulargewicht des/der Polyethylenglycolierungs-, Pegylierungsrestes(e), pro Proteinmolekül 300 bis 30 000 Dalton ist.
3. Proteinkonjugat nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin m 1 oder 2 ist.
4. Proteinkonjugat nach einem der Ansprüche 1-3 der Formel
worin R¹, R&sup4;, m, n und das Protein wie in Anspruch 1 sind.
5. Proteinkonjugat nach einem der Ansprüche 1-3 der Formel
worin R¹, m, n und das Protein wie in Anspruch 1 sind.
6. Proteinkonjugat nach einem der Ansprüche 1-3 der Formel
worin R¹, m, n und das Protein wie in Anspruch 1 sind.
7. Proteinkonjugat nach einem der Ansprüche 1-3 der Formel
worin R¹, m, n und das Protein wie in Anspruch 1 sind.
8. Proteinkonjugat nach einem der Ansprüche 1-3 der Formel
worin R¹, m, n und das Protein wie in Anspruch 1 sind.
9. Proteinkonjugat nach einem der Ansprüche 1-8, worin R¹ CH&sub3; darstellt.
10. Proteinkonjugat nach Anspruch 1 der Formel
worin n etwa 112 ist.
11. Proteinkonjugat nach Anspruch 1 der Formel
worin n etwa 112 ist.
12. Proteinkonjugat nach Anspruch 10 oder Anspruch 11, wobei das Interferon-α Interferon-α A darstellt.
13. Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus
II-A R¹O(CH&sub2;CH&sub2;O)n-CH&sub2;CH&sub2;-N=C=N-R&sup4;
II-D R¹O(CH&sub2;CH&sub2;O)n-CH&sub2;-CH&sub2;-N=C=S
worin R¹ Niederalkyl darstellt, R&sup4; Nieder-C&sub1;-C&sub6;-alkyl oder Cycloalkyl darstellt, R&sup5; Nieder-C&sub1;-C&sub6;-alkyl oder H darstellt und n eine ganze Zahl von 1 bis 1000 ist.
14. Verbindung nach Anspruch 13, worin R&sup4; Cyclohexyl darstellt.
15. Verbindung nach Anspruch 13, worin R&sup5; H darstellt.
16. Verbindung nach Anspruch 13, worin R&sup5; CH&sub3; darstellt.
17. Verbindung nach einem der Ansprüche 13-16, worin R¹ CH&sub3; darstellt.
18. Verbindung der Formel
worin R¹ CH&sub3; darstellt und n etwa 112 ist.
19. Proteinkonjugate nach einem der Ansprüche 1-12, zur Verwendung als therapeutisch wirksame Verbindungen bei der Behandlung oder Prophylaxe von Krankheiten.
20. Verfahren zur Herstellung eines Proteinkonjugats nach einem der Ansprüche 1-12, wobei das Verfahren Umsetzen einer Verbindung nach Anspruch 13 mit einer freien Aminogruppe eines Proteins nach Anspruch 1 oder eines Salzes davon und Isolieren des Proteinkonjugats aus dem Reaktionsgemisch umfaßt.
21. Pharmazeutische Zusammensetzungen, umfassend ein Proteinkonjugat nach einem der Ansprüche 1-12 und einen therapeutisch inerten Träger.
22. Pharmazeutische Zusammensetzungen für die Behandlung oder Prophylaxe von immunomodulatorischen Erkrankungen, wie neoplastischen Erkrankungen oder infektiösen Erkrankungen, umfassend ein Proteinkonjugat nach einem der Ansprüche 1-12 und einen therapeutisch inerten Träger.
23. Verwendung der Proteinkonjugate nach einem der Ansprüche 1-12, zur Herstellung von Arzneimitteln zur Verwendung bei der Behandlung oder Prophylaxe von Krankheiten.
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