DE69227329T3

DE69227329T3 - Milchbakterien

Info

Publication number: DE69227329T3
Application number: DE69227329T
Authority: DE
Inventors: Dominique Brassart; Anne Donnet; Harriet Link; Olivier Mignot; Jean-Richard Neeser; Florence Rochat; Eduardo Schiffrin; Alain Servin
Original assignee: Societe des Produits Nestle SA; Nestle SA
Current assignee: Societe des Produits Nestle SA; Nestle SA
Priority date: 1992-07-06
Filing date: 1992-07-06
Publication date: 2003-01-23
Anticipated expiration: 2012-07-07
Also published as: DK0768375T3; ATE153063T1; CZ134393A3; PL175639B1; EP0577904B1; ATE172245T1; NO308617B1; EP0768375B2; SK71293A3; EP0577904A1; JP2916350B2; FI111650B; CA2099856C; ES2102485T3; AU4158793A; UA42092C2; UA26430C2; ES2124060T5; DK0577904T3; HU219262B

Description

Die Erfindung betrifft eine biologisch reine Kultur eines Milchsäurebakterienstamms und eine Verwendung dieses Stamms.
EP 199535 (Gorbach und Goldin) schlägt einen Bakterienstamm vor (zunächst als Lactobacillus (L.) acidophilus identifiziert und dann als ein Lactobacillus, der dem L. casei subs. ramnosus am nächsten kommt (vgl. M. Silva et al. in Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 31, Nr. 8, 1231-1233, 1987)), der eine gute Haftung an den Zellen der Dünndarmschleimhaut besitzt und für therapeutische Verwendungen geeignet ist. Dieser Stamm, der Stamm GG genannt wird und in der ATCC (American Type Culture Collection) unter der Nummer 53103 hinterlegt ist, kann in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger insbesondere in Nahrungsmittelprodukten, vor allem beispielsweise in angesäuerten Milchprodukten vom Typ Joghurt, verwendet werden.
Andere Stämme vom selben Typ werden seit langem schon in Produkten zu einem ähnlichen Zweck verwendet. Es besteht jedoch der Bedarf an besonders leistungsfähigen Stämmen dieses Typs, die klar identifiziert sind, unbestreitbare Eigenschaften besitzen und die Palette der verfügbaren Stämme bereichern.
Ziel der Erfindung ist es, diese Anforderung zu erfüllen.
Zu diesem Zweck schlägt man erfindungsgemäß eine biologisch reine Kultur eines Milchsäurebakterienstamms vor, der wegen seiner Fähigkeiten der Implantierung in eine Darmflora, der Haftung an Darmzellen, der kompetitiven Hemmung von pathogenen Bakterien an Darmzellen, der Immunomodulation und/oder der Reduzierung der Fäkalenzymaktivität selektiert wird, und der ausgewählt ist aus Bifidobacterium breve (CNCM I-1226), Bifidobacterium infantis (CNCM I-1227) und Bifidobacterium longum (CNCM I-1228).
Ein solcher Stamm ist insbesondere dazu bestimmt, Menschen oder Tieren zu einem therapeutischen oder prophylaktischen Ziel im Magen-Darm-System, insbesondere zur Behandlung von Durchfall, verabreicht zu werden.
Der Stamm kann in Form einer biologisch reinen Kultur beispielsweise so, wie er ist, oder nach Eingefrierung und/oder Lyophilisierung verabreicht werden. Eine solche Kultur kann beispielsweise 108-101º lebensfähige Keime (cfu, vom engl. Ausdruck "colony forming units") pro g bei der flüssigen oder gefrorenen Form und 109-1011 cfu/g bei der lyophilisierten Form aufweisen.
Der Stamm kann auch in Form einer Zusammensetzung verabreicht werden, die eine solche Kultur und einen einnehmbaren Träger umfaßt, insbesondere einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder ein Nahrungsmittelprodukt wie eine angesäuerte Milch, insbesondere beispielsweise Joghurt oder eine Pulvermilchformulierung.
In einer ersten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung schlägt man eine Kultur eines Milchsäurebakterienstammes vor, der wegen seiner Fähigkeit selektiert wurde, in den Verdauungskanal von Mäusen oder Ratten mit menschlicher Darmflora implantiert werden zu können.
In einer zweiten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung schlägt man eine Kultur eines Milchsäurebakterienstammes vor, der wegen seiner Fähigkeit selektiert wurde, an Darmzellen pathogene Bakterien, die für Durchfall verantwortlich sind, kompetitiv zu hemmen.
Die Bakterienstämme, die auf diese Weise insbesondere beispielsweise ausgehend von angesäuerten Milchsorten, insbesondere handelsüblichen Joghurts, oder ausgehend von handelsüblichen Kulturen, die zur Herstellung solcher Milchsorten bestimmt sind, oder ausgehend von Kinderstuhl selektiert wurden, wurden dem Budapester Abkommen am 30.06.92 be der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, 28 rue du Dr Roux, 75724 Paris Cedex 15, Frankreich, hinterlegt, wo ihnen die jeweils in Klammern angegebene CNCM-Nr. zugeteilt wurde, und zwar ein Stamm von Bifidobacterium breve (CNCM I-1226), Bifidobacterium infantis (CNCM I-1227) und Bifidobacterium longum (CNCM I-1228).
Es folgen Einzelheiten der Morphologie und der allgemeinen Eigenschaften dieser Stämme:

L.acidophilus CNCM I-1225

Morphologie:

- Gram-positiver, unbeweglicher, nicht-sporenbildender Mikroorganismus.
- Einzelne, ziemlich kurze und gedrungene Stäbchen

Metabolismus:

- Mikroaerophiler Mikroorganismus mit homofermentativem Metabolismus, der zur Erzeugung von L(+)- und D(-)- Milchsäure führt.
- Weitere Merkmale: Katalase (-), Erzeugung von CO&sub2;(-), Hydrolyse von Arginin(-).

Gärung der Zucker:

Amygdalin (+), Arabinose (-), Cellobiose (+), Esculin (+), Fructose (+), Galactose (-), Glucose (+), Lactose (+), Maltose (+/-), Mannitol (-), Mannose (+), Melibiose (-), Raffinose (+), Ribose (-), Salicin (+), Sucrose (+), Trehalose (+).

B. Breve CNCM I-1226, B.infantis CNCM I-1227 und B.longum I-1228

Morphologie:

- Gram-positive, unbewegliche, nicht-sporenbildende Mikroorganismen.
- Kurze, an den Enden abgerundete Stäbchen mit V- oder Y-förmigen Zweigen.

Metabolismus

- Anaerobe Mikroorganismen mit heterofermentativem Metabolismus, der hauptsächlich zur Erzeugung von Milch- und Essigsäure führt.
- Weitere Merkmale: Catalase (-), Erzeugung von CO&sub2; (-), Hydrolyse von Arginin (-).

Gärung der Zucker

Das Profil der Gärung der Zucker dieser Arten ist sehr unstabil und nicht reproduzierbar; nur einige Zucker haben immer fermentiert, und zwar insbesondere D-Ribose, Lactose und Raffinose.
Einzelheiten hinsichtlich der besonderen Eigenschaften, auf deren Grundlage dieser Stamm selektiert werden kann, werden im nachstehenden angeführt:

Implantation in eine Darmflora

Gnotoxenische Mäuse

Zwei Gruppen von axenischen Mäusen (Mäuse ohne Darmflora) werden jeweils mit der menschlichen Flora eines anderen Spenders versehen (gnotoxenische Mäuse). Nach mehreren Tagen der Ansiedlung sind die Darmfloren der Mäuse in funktioneller, qualitativer und quantitativer Hinsicht mit denen der menschlichen Spender vollkommen vergleichbar.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurden zahlreiche Stämme auf ihre Fähigkeit getestet, den Verdauungskanal dieser Mäuse mit menschlicher Flora zu besiedeln, mit anderen Worten auf ihre Fähigkeit der Implantation in diese Darmflora.
Man stellt fest, daß die meisten Stämme selbst nach mehreren aufeinanderfolgenden Beimpfungen nicht in der Lage sind, diese Tiere zu besiedeln, daß jedoch beispielsweise der Stamm L.acidophilus CNCM I-1225 in der Lage ist, sich im Verdauungskanal, mit anderen Worten in der Darmflora der Mäuse der beiden Gruppen, zu vermehren und anzusiedeln, und zwar selbst nach einer einzigen Beimpfung.
Diese Besiedlung oder Implantation macht es möglich, daß der Stamm im Kot in einer Menge von mehr als 106 cfu/g auftritt. Dieser Gehalt des Kots an lebensfähigen Keimen des Stamms kann als erforderlich und/oder ausreichend dafür betrachtet werden, daß der Metabolismus des Stamms den des Gastes ändern kann.
Man stellt außerdem fest, daß diese Besiedlung bestehen bleibt, solange die Umgebung der Tiere nicht gestört wird.

Gnotoxenische Ratten

Axenische Ratten werden mit einem Stamm (Thetajotaomikron-- Bakteroide FI 1, Collection particuliere du Centre de Recherche Nestec SA, CH-1000 Lausanne, Suisse) ausgestattet (gnotoxenische Ratten), der von einer menschlichen Darmflora eines gesunden Spenders isoliert wurde und dazu bestimmt ist (siehe unten), die Produktion von Enzymen einer vollständigen Fäkalflora zu simulieren. Diese Eingabe bringt eine reiche Besiedelung des Darms dieser Ratten mit sich und gestattet dieser Bakterie, im Kot in einer Menge von etwa 10&sup8; cfu/g aufzutreten.
Ein Versuch der Implantation beispielsweise des Stamms L.acidophilus CNCM I-1225 in diese Flora ergibt eine gute Ko-Kolonisierung, aufgrund welcher dieser Stamm ebenfalls im Kot in einer Menge von etwa 10&sup8; cfu/g auftreten kann.

Menschliche Versuchspersonen

Zum Vergleich bestimmt man, wieviel lebensfähige Keime von L.bulgaricus sich im Kot von gesunden menschlichen Versuchspersonen wiederfinden, die herkömmlichen Joghurt verzehren, der durch Gärung von Kuhmilch mit einer handelsüblichen Kultur von L.bulgaricus und S.thermophilus hergestellt wurde.
Diese Versuchspersonen verzehren in drei aufeinanderfolgen Zeiträumen von jeweils drei Wochen kein vergorenes Milchprodukt, mit Ausnahme des Joghurts, den sie im zweiten Zeitraum von drei Monaten verzehren.
In den drei Wochen, in denen sie Joghurt essen, nehmen sie ihn so zu sich, daß sie etwa 10¹&sup0; L.bulgaricus pro Tag einnehmen, was etwa drei Joghurts von 120 g täglich entspricht. In dem Zeitraum, in dem sie Joghurts zu sich nehmen, treten etwa 10&sup5; cfu L.bulgaricus pro g Kot der Versuchspersonen auf.
Im Rahmen der Erfindung nimmt man einen Versuch mit demselben Szenario wie oben vor, jedoch mit Joghurt, der durch Gärung von Milch mit einer handelsüblichen Kultur von S.thermophilus und B.bifidus zubereitet wurde, die beispielsweise mit dem Stamm L.acidophilus CNCM I-1225 in einer Konzentration derselben Größenordnung ergänzt wurde.
Man bestimmt die Gesamtzahl lebensfähiger Keime von Lacto-bacillen im Kot der Versuchspersonen, während und nach dem Zeitraum der Aufnahme von Joghurt. Man findet Werte von 10&sup5;-10&sup6; cfu/g vor, mehr als 10&sup7; cfu/g während und 10&sup6; cfu/g nach diesem Zeitraum.
Man stellt also eine Zunahme der Gesamtzahl von Lactobacillen fest, die im Kot während der Zeit des Verzehrs von Joghurt gefunden wurden. Der Stamm CNCM I-1225 wurde in großer Menge und in lebensfähiger Form bei den Versuchspersonen gefunden. Dagegen ist er einige Tage nach Abbruch des Verzehrs von Joghurt verschwunden.

Reduzierung der Fäkalenzymaktivität

Gnotoxenische Ratten

Im Rahmen von Tests, die an den oben genannten gnotobiotischen Ratten vorgenommen wurden, bestimmt man die Aktivität der Fäkalazoreductase und -nitroreductase. Die Enzyme Azoreductase und Nitroreductase sind nämlich an der Erzeugung von karzinogenen Substanzen beteiligt. Eine hohe Konzentration dieser Enzyme ist mit einer Erhöhung des Krebsrisikos des Grimmdarms verbunden.
Man stellt fest, daß die Fäkalenzymaktivität von gnotobiotischen Ratten mit Bakteroiden sich auf 2,5 ug/h/mg Protein bei der Azoreductase und auf 4,2 ug/h/mg Protein bei der Nitroreductase beläuft, während sich diese Enzymaktivität bei gnotobiotischen Ratten mit Bakteroiden, in deren Flora beispielsweise der Stamm CNCM I-1225 implantiert wurde, auf 1,8 ug/h/mg Protein bei der Azoreductase und auf 3,5 ug/h/mg Protein bei der Nitroreductase beläuft.
Man stellt außerdem fest, daß gnotobiotische Ratten mit Darmflora, die nur aus dem Stamm CNCM I-1225 gebildet ist, keine Aktivität der Fäkalazoreductase und -nitroreductase zeigen.
Mit anderen Worten, man stellt fest, daß die Anwesenheit des Stamms CNCM I-1225 in der Flora von gnotobiotischen Ratten eine Verminderung mancher unerwünschter Enzymproduktionen bei diesen Tieren bewirkt, d. h. günstige Änderungen im Metabolismus des Gastes.

Menschliche Versuchspersonen

Im Rahmen der an menschlichen Versuchspersonen vorgenommenen Versuche bestimmt man die Enzymaktivität der Fäkalnitroreductase. Man bestimmt diese Aktivität während der letzten Tage, die dem Zeitraum der Einnahme von beispielsweise mit CNCM I-1225 zubereitetem Joghurt vorhergehen, während dieses Zeitraums und in den darauffolgenden ersten Tagen.
Man stellt dabei fest, daß diese Aktivität während des Zeitraums der Einnahme von Joghurt von 8,2 auf 4,9 ug/h/mg Protein übergeht, daß sie während etwa einer Woche nach diesem Zeitraum auf dieser Höhe bleibt und anschließend allmählich wieder ansteigt.

Immunomodulation

Menschliche Versuchspersonen (Befähigung der Leukozyten zur Phagozytose)

Menschliche Versuchspersonen enthalten sich jedes Verzehrs von vergorenen Milchprodukten, und zwar mit Ausnahme der nach dem folgenden Programm eingenommenen Produkte: Milch während drei Wochen, Joghurt, der durch Gärung von Milch mit einer gemischten Kultur von handelsüblichem S. thermophilus und beispielsweise L.acidophilus CNCM I-1225 hergestellt wurde, während der folgenden drei Wochen und dann Milch während sechs Wochen.
Man bestimmt die Befähigung der Leukozyten zur Phagozytose im peripherem Blut der Versuchspersonen zu Beginn und am Ende jedes dieser Zeiträume.
Diese Bestimmung besteht darin, daß die Leukozyten aus dem Blut extrahiert werden und mit fluoreszierenden Bakterien in Kontakt gebracht werden. Man mißt das fluoreszierende Licht, das von den Leukozyten ausgestrahlt wird, die fluoreszierende Bakterien phagozytiert haben, durch Zytofluormetrie (mit einem Gerät, das unter dem Namen Fac-scan im Handel ist). Davon leitet man den Prozentsatz der Leukozyten ab, die eine phagozytische Aktivität haben, und dieser Prozentsatz stellt das phagozytische Vermögen dar.
Man beobachtet ein phagozytiches Vermögen der Leukozyten des peripheren Bluts von 36,5% am Anfang des ersten Zeitraums der Milcheinnahme, von 32,7% am Ende dieses Zeitraums und damit am Anfang des Zeitraums der Einnahme von Joghurt, von 51,8% am Ende dieses Zeitraums der Joghurteinnahme und von 51,4% sechs Wochen später, d. h. am Ende des zweiten und letzten Zeitraums der Milcheinnahme. Die Wahrscheinlichkeit, daß man einen Fehler begeht (Wert p), indem man diese Zunahme des phagozytischen Vermögens der Leukozyten als signifikant einschätzt, ist kleiner als 0,1%.

Menschliche Versuchspersonen (Reaktion auf einen Impfstoff)

16 gesunde menschliche Versuchspersonen (Testgruppe) ernähren sich nach folgendem Programm: während zwei Wochen (Wochen 1 und 2) normale Diät, aus der jedes fermentierte Produkt ausgeschlossen ist, während der drei folgenden Wochen (Wochen 3, 4 und 5) eine Diät, die die Einnahme von drei Joghurts von 125 ml täglich vorsieht, die durch Gärung von Milch mit einer handelsüblichen Kultur von S. thermophilus und Bifidobacterium bifidus hergestellt wurden, der beispielsweise der Stamm L.acidophilus CNCM I-1225 beigegeben wurde, der in diesem Joghurt in einer Menge von 10&sup7;-10&sup8; cfu/ml vorhanden ist, und während weiterer zwei Wochen (Wochen 6 und 7) normale Diät, aus der jedes fermentierte Produkt ausgeschlossen ist.
14 gesunde menschliche Versuchspersonen (Vergleichsgruppe) ernähren sich gleichzeitig nach einem Programm, das aus einer normalen Diät besteht, aus der jedes fermentierte Produkt ausgeschlossen ist.
Ein oraler attenuierter Impfstoff (Salmonella Typhi Ty21a), der von der Firma Berna SA vertrieben wird, wird den Versuchspersonen der beiden Gruppen entsprechend den Anweisungen des Herstellers an den Tagen 1, 3 und 5 der Woche 4 verabreicht.
Drei Tage vor dem Anfang der Woche 3 sowie einen Tag und 10 Tage nach Ende der Woche 5 wird allen Versuchspersonen Blut entnommen.
Eine Bestimmung der Konzentration der spezifischen IgA der Immunantwort auf die antigenen Lipopolysaccharide (LPS) von Salmonella typhi wird nach der Methode ELISA vorgenommen.
Man stellt fest, daß die 14 Tage nach der Impfung beobachtete Zunahme der Konzentration an spezifischen IGA im Vergleich zu der neun Tage vor der Impfung beobachteten Konzentration in beiden Gruppen signifikant ist (Wert p < 0,001).
Betrachtet man jedoch Zunahmefaktorenbereiche < 2; > 2 und < 3; > 3 und < 4; > 4, so stellt man fest, daß auf diese Bereiche 1, 6, 3 und 6 Versuchspersonen in der Testgruppe gegenüber 8, 3, 0 und 3 Versuchspersonen in der Vergleichsgruppe fallen. Mit anderen Worten, die Zunahmefaktoren sind in der Testgruppe signifikant höher als in der Vergleichsgruppe (Wert p = 0,04).

Anhaftung an Darmzellen

Im Rahmen der Erfindung untersucht man die Anhaftung von verschiedenen Milchsäurebakterienstämmen an Darmzellen, insbesondere an menschlichen Darmepithelzellen Caco-2 (M. Pinto et al., Biol. Cell. 47, 323, 1983) und an menschlichen schleimsekretierenden Darmzellen HT29-MTX (Lesuffleur et al., Cancer Res. 50, 6334-6343) in Monoschichtkultur in vitro.
Zu diesem Zweck kultiviert man die Zellen in Plastikbehältern von 25 cm² (Corning) für den Unterhalt der Zellennachkommen und auf Glasplatten (22 · 22 mm), die entfettet, sterilisiert und für die Anhaftungstests in Behälter mit sechs Schächten gesetzt werden (Corning).
Zur Kultur der Zellen Caco-2 und HT29-MTX ist das Medium vom zweiten Tag nach der Wiederbeimpfung an täglich zu wechseln. Das Kulturmedium wird aus essentiellem Minimalmedium Eagle, modifiziert durch Dulbecco (DMEM), in Pulverform hergestellt.
Die Milchsäurebakterien werden unter Anaerobiose auf MRS-Medium aus einem gefrorenen Vorrat kultiviert. Die Bakterien werden von der zweiten Umsetzung an verwendet.
Ein gemischtes Medium zur Inkubation an den Zellen wird hergestellt, indem 50% eines DMEM-Mediums ohne Antibiotikum und 50% des MRS-Mediums gemischt werden, in welchem die Bakterien gewachsen sind, wobei dieses Medium 108 Lactobazillen oder Bifidobakterien enthält (vgl. Chauvière G. et al., FEMS Microbiol.Lett.91, 213-218, 1992).
Um die Anhaftung vorzunehmen, gibt man das gemischte Medium, das die Bakterien enthält, auf die Darmzellen und inkubiert eine Stunde unter Aerobiose. Man nimmt fünf Waschungen durch 20 kreisförmige Rührbewegungen der Schachtbehälter vor, so daß eine gute Entfernung der nicht anhaftenden Bakterien stattfindet. Die Zellenteppiche werden anschließend in aufeinanderfolgenden Methanolbädern fixiert, und zwar 10 Minuten 70%ig, zehn Minuten 95%ig und 15 Minuten 100%ig, und durch Gram- oder Giemsafärbung gefärbt. Der Anhaftungsgrad wird durch mikroskopische Zählung der anhaftenden Bakterien bestimmt.
Von den zahlreichen getesteten Stämmen besitzen die vier Stämme, die im Rahmen der Erfindung als Beispiel hinterlegt wurden, einen guten Anhaftungsgrad an Darmzellen, wie mit Hilfe dieser Haftungstests an der Nachkommenschaft von Caco-2-Zellen bestimmt wurde.
So haftet der Stamm L.acidophilus CNCM I-1225 an den Caco-2-Zellen in einer Menge von etwa 150+23 Bakterienzellen auf 100 Caco-2-Zellen. Bewertet man dieses Ergebnis mit +++++, so erhält man eine Haften von ++++++ bei B. Breve CNCM I-1226, ++++ bei B.infantis CNCM I-1227 und ++++ bei B.longum CNCM I-1228.
Haftungstests beispielsweise des Stamms L.acidophilus CNCM I-1225 an den Zellen HT29-MTX ergeben sogar noch eindrucksvollere Ergebnisse.
Man stellt ferner überraschenderweise fest, daß die Haftung dieser Stämme oder zumindest einiger von ihnen auf einen Faktor zurückzuführen ist, den sie in ihrem eigenen Kulturmedium (beispielsweise MRS oder Milch) abscheiden. Wenn nämlich der oben beschriebene einstündige Inkubationsvorgang an Caco-2 mit den Stämmen L.acidophilus CNCM I-1225, B.breve CNCM I-1226 oder B.longum CNCM I-1228 ohne ihr Bakterienkulturmedium vorgenommen wird, beobachtet man eine starke Abnahme der Anhaftung.
Wenn man diesen Inkubationsvorgang an Caco-2 mit diesen Stämmen und ihrem Kulturmedium, das zuvor einer Behandlung mit Trypsin unterzogen wurde, vornimmt, stellt man außerdem ebenfalls eine starke Abnahme der Haftung fest. Dies scheint zu belegen, daß der von diesen Stämmen in ihr Kulturmedium abgeschiedene Haftungsfaktor ein Protein ist.

Kompetitive Hemmung von pathogenen Bakterien

Im Rahmen der Erfindung untersucht man die Fähigkeiten von verschiedenen-Milchsäurebakterien zur kompetitiven Hemmung von pathogenen Bakterien, insbesondere von für Diarrhoen verantwortlichen pathogenen Bakterien an Darmzellen.
Man untersucht insbesondere die Hemmung von manchen Stämmen von E.coli, Saprophyten des Verdauungskanals beim Menschen und Tier, die Virulenzmerkmale erlangen und pathogen werden können, und zwar von enterotoxiogenen E.coli (ETEC), enteroadhäsiven E.coli (DAEC) und enteropathogenen C.coli (EPEC), sowie die Hemmung eines Stamms von Salmonella typhi-murium. Bei dieser Untersuchung werden die folgenden Stämme verwendet:
- ETEC: der Stamm H10407, der CFA/1 exprimiert (Collection du professeur Joly, Laboratoire de microbiologie, Faculte de médecin et de pharmacie, Université de Clermont-Ferrand 1, 63003 Clermont-Ferrand, Frankreich)
- DAEC: der Stamm C1845 (Collection of Dr S. Bilge, Department of Microbiologiy, School of Medicine, G 3111 Health Sciences Building, University of Washington, Seattle, Washington 98195, USA)
- EPEC: der Stamm JPN15 pMAR7, der EAF und eae exprimiert (Collection of Prof. J. Kaper, Center for Vaccine Development, University of Maryland, School of Medicine, 10 South Pine Street, Baltimore, Maryland 21201, USA)
- Salmonella typhi-murium: der Stamm SL 1344 (Dr B. Stocker, Stanford University, School of Medicine, Department of Microbiology and Immunology. Sherman Sairchild Science Building, D 333 Stanford, California 94305-5402, USA)
Zur Bestimmung der Haftung der Bakterien an den Caco-2-Zellen geht man auf die im nachstehenden beschriebene Weise vor:
Man wäscht, kurz gesagt, die Monoschichten bildenden Caco-2-Zellen mit einer phosphatgepufferten Salzlösung (PBS). Die mit ¹&sup4;C markierten E.coli oder die mit ³&sup5;S markierten Salmonella werden in einer Menge von 10&sup8; cfu/ml in dem Kulturmedium in Suspension gebracht, und 2 ml Suspension werden jedem Schacht beigegeben, der eine die Zellenkultur tragende Platte enthält.
Bei E.coli werden alle Inkubationen unter Anwesenheit von 1%iger D-Mannose durchgeführt. Zur Bestimmung eines Hemmungssfaktors oder -grads, mit anderen Worten zur Bestimmung, welcher Anteil an pathogenen Bakterien durch Milchsäurebakterien gehindert werden, an den Caco-2 Zellen zu haften, wobei diese Milchsäurebakterien den Platz der pathogenen Bakterien einnehmen, gibt man jedem Schacht, der eine die Zellenkultur tragende Platte enthält, 1 ml Suspension, die 10&sup8; cfu/ml des markierten pathogenen Stamm enthält, und 1 ml einer Suspension bei, die entweder 10&sup8; oder 10&sup9; cfu/ml des getesteten Milchsäurebakterienstamms enthält.
Man inkubiert die Platten bei 37ºC eine Stunde lang unter einer Atmosphäre, die 10% CO&sub2; und 90% Luft enthält. Man wäscht die Zellenmonoschichten 5 mal mit steriler PBS. Die anhaftenden Bakterien und die Darmzellen werden in einer 0,2 N Lösung von NaOH gelöst. Man ermittelt die Anzahl markierter haftender Bakterien durch Zählung durch Flüssigkeitsszintillation.
Von den verschiedenen Milchsäurebakterienstämmen, die auf diese Weise auf ihre Befähigung oder auf ihr Vermögen der kompetitiven Hemmung von pathogenen Bakterien untersucht wurden, haben die im Rahmen der Erfindung selektierten und als Beispiel hinterlegten Stämme tatsächlich bemerkenswerte Fähigkeiten gezeigt, die in der nachstehenden Tabelle aufgeführt sind, die die Hemmungsgrade, die von den getesteten Stämmen gegenüber den verschiedenen in diesen Tests verwendeten pathogenen Stämmen erbracht wurden, in Prozent angibt.

Claims

1. Bifidobacterium, ausgewählt aus Bifidobacterium breve CNCM I-1226, Bifidobacterium infantis CNCM I-1227 und Bifidobacterium longum CNCM I-1228.

2. Verwendung eines Stammes von Bifidobacterium-Milchsäurebakterien, ausgewählt aus Bifidobacterium breve CNCM I-1226, Bifidobacterium infantis CNCM I-1227 und Bifidobacterium longum CNCM I-1228, zur Herstellung eines an Menschen oder Tiere zu verabreichenden Trägers für einen therapeutischen oder prophylaktischen Zweck im Bereich des Gastrointestinal-Systems.