SE469875C - Stam av tarmkoloniserande Lactobacillus samt komposition för profylax eller behandling av infektioner i magtarmkanalen - Google Patents

Description

469 875 2 Vad som trots allt i dag synes vara vedertaget är att: - Bakterier av släktet Lactobacillus har en uttalad förmåga att på olika sätt hindra etablering av sjukdomsframkallande bakterier oavsett om det är fråga om ett livsmedel eller en tarm; - Vissa stammar av Lactobacillus är mer effektiva än andra stammar av samma art att förbättra tarmen; - Laktobacillfermenterade livsmedelsprodukter har visat sig ha en kolesterolsänkande effekt, sannolikt på grund av en bromsning av kolesterolbildningen i tarmen, men kanske även genom att bakterierna utnyttjar kolesterol för steroidproduk- tion; - Konsumtion av större mängder laktobaciller förbättrar tarmmotoriken, orsaken till effekten är okänd; - En hög andel laktobaciller i tarmen motverkar cancer, vilket synes kunna bero av flera orsaker. För det första så kan vissa laktobaciller via enzymet nitritreduktas för- hindra bildningen av nitrosaminer i tarmen; nitrosaminer är cancerframkallande. För det andra så kan laktobaciller motverka att vissa bakteriellt bildade enzym i tarmen aktive- rar potentiellt cancerframkallande ämnen. Slutligen finns indicier på att laktobaciller skulle kunna utöva en tillväxt- hämmande effekt på cancertumörer, kanske för att immun- försvarets makrofager aktiveras av laktobacillernas närvaro.

En avgörande svaghet med de laktobaciller som idag används i de flesta etablerade livsmedelsprodukter är deras dåliga över- levnad vid passagen genom magsäck och tolvfingertarm. Detta föranledde tidigt en produktutveckling som resulterade i "acido- filusfil" där mjölk fermenterades med en stam av Lactobacillus acidophilus isolerad direkt från human faeces. L. acidophilus klarar passagen genom den övre delen av matsmältningskanalen bra. För att ha effekt på mikrofloran i tarmen under en längre tid krävs dock även att laktobacillen kan etableras i tarmen.

Lidbeck, A et al visar i Scand J Infect Dis, 4, s 531-537, 1987, att den ökning av antalet laktobaciller i tarmens mikroflora som sker efter konsumtion av ett preparat innehållande Lactobacillus acidophilus minskar gradvis när konsumtionen därav upphör, så att efter 9 dagar utan tillförsel bakteriefloran âterfått den 469 875 ursprungliga sammansättningen.

EP-A2-0 199 535 beskriver en biologiskt ren kultur av Lac- tobacillus acidophilus, ATCC accessionsnr 53 103, isolerad från human faeces, med förmåga att vid test in vitro fästa till mukosaceller. Någon etablering in vivo har dock ej påvisats.

WO 89/05849 beskriver mjölksyrabakterier som isolerats från magtarmkanalen hos gris och som selekterats med hjälp av bland annat vidhäftning till gastrointestinala epitelialceller från gris in vitro och tolerans mot syra och galla. Dessa bakterier kan användas för fermentering av mjölk som sedan kan ges till smågrisar för att förebygga eller behandla bl a E. coli diarré.

De stammar av Lactobacillus som i dag utnyttjas kommersiellt har främst utvalts för att de hjälpligt förmår växa i aktuella produktråvaror som t ex mjölk. Helt klart är att en förutsätt- ning för att en viss stam skall kunna utöva sitt eventuellt positiva inflytande är att den förmår etablera sig i tarmen och där konkurrera med den befintliga mikrofloran. Kunskaper om vilka egenskaper som en viss laktobacill skall besitta för att klara denna konkurrens är till största delen helt okända.

Föreliggande uppfinning avser nya stammar av Lactobacillus med förmåga att kolonisera human tarmslemhinna in vivo, vilka deponerats enligt Budapestöverenskommelsen vid DSM - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH -, Braun- schweig, Tyskland den 2 juli 1991, nämligen Lactobacillus plantarum 299 DSM 6595 Lactobacillus casei ssp rhamnosus 271 DSM 6594 Uppfinningen avser även varianter därav med väsentligen över- ensstämmande REA-mönster. Med REA-mönster avses det mönster som bildas vid elektrofores på agargel av DNA som spjälkats med ett restriktionsenzym enligt den metod som beskrives närmare nedan.

Genom karakterisering av stammarna genom deras REA-mönster kan identiteten av de använda isolaten säkerställas, något som tidigare ej varit möjligt. Närstående stammar av Lactobacillus med skillnader i REA-mönster uppvisar skillnader vad gäller förmåga att fästa till tarmepitel.

Uppfinningen avser även en komposition för profylax eller behandling av infektioner i magtarmkanalen, vilken omfattar en stam av Lactobacillus med förmåga att etableras på human tarm- slemhinna in vivo, vilken erhållits enligt förfarandet enligt 469 875 4 uppfinningen, i kombination med en konventionell bärare.

Speciellt avser uppfinningen en komposition som omfattar någon av stammarna Lactobacillus plantarum 299 DSM 6595 Lactobacillus casei ssp rhamnosus 271 DSM 6594 eller en variant därav med väsentligen överensstämmande REA- mönster.

Konventionella bärare är till exempel fysiologiskt godtagbara substrat som fermenterats av bakterien i fråga, såsom livsmedel av olika slag, speciellt stärkelse- eller mjölkbaser- ade sådana, men också inerta fasta eller flytande substanser, såsom salin eller vatten. Ett lämpligt substrat bör innehålla flytande eller fasta fibrer som ej resorberas i magtarmkanalen och som vid fermentationen med Lactobacillus bildar korta fett- syror. Som exempel på lämpliga, stärkelsehaltiga substrat kan nämnas spannmål såsom havre och vete, majs, rotfrukter såsom potatis, samt vissa frukter som gröna bananer.

Modern vård av patienter i samband med sjukdom och opera- tioner bygger i stor utsträckning på tillföring av näring via blodådrorna, varigenom tarmen ej tillföres material att fermen- tera med åtföljande konsekvenser. Grovtarmen fungerar som krop- pens egen fermentationstank med uppgift att producera nyttiga näringsmedel, bl a för grovtarmens egen funktion, men också att eliminera skadliga substanser, t ex tungmetaller, alltför mycket kolesterol mm. För att grovtarmen skall utöva sin funktion måste det finnas tillgång till nödvändiga bakterier + substrat, främst stärkelsefibrer. Av grovtarmens innehåll är cirka hälften bakte- rier, mestadels av anaerob typ. De viktigaste bakterierna är de som sitter på grovtarmslemhinnan. Bland grovtarmens bakterier finns en minoritet av potentiellt skadlig natur. Så länge de "nyttiga" bakterierna finns närvarande undertryckes den skadliga bakteriefloran. Modern forskning har visat att grovtarmens slemhinna erhåller huvudparten av sin näring från fermentations- produkter, huvudsakligen i form av korta fettsyror. En normal fermentationsprocess förutsätter tillförsel av cirka 30 gram fiber per dag + närvaro av lämpliga bakterier.

Ett föredraget substrat för kompositionen enligt uppfin- ningen, som också ger kompositionen ett utmärkt näringsvärde, är en näringslösning baserad på havremjöl. Det har visat sig att 469 875 5 sädeslaget havre teoretiskt sett är ett bra substrat för fer- mentering på många sätt. Det är rikt på fibrer, också flytande fibrer så kallade ß-glukaner, har en mycket hög halt av ytskyd- dande fosfolipider och har en aminosyrasammansättning som i stor utsträckning svarar mot människokroppens behov. I WO 89/08405 beskrives en näringskomposition lämpad för enteral näringstill- försel, som erhålles genom en kombination av enzymatisk ned- brytning av havremjöl med a-amylas, eventuellt proteas, och ß- glukanas och värmebehandling samt fermentering med en lak- tobacill med förmåga att spontant fästa på tarmen. Den i den refererade patentansökningen beskrivna näringskompositionen utgör i kombination med en Lactobacillus enligt uppfinningen en utmärkt komposition för näringstillförsel till patienter vid den normala behandlingen efter större operationer, för special- behandling av patienter som drabbats av intensivvårdssjukan eller organkollaps, samt för behandling av olika tarmsjukdomar, t.ex. ulcerös kolit.

För att vara användbar i en havrebaserad näringskomposition enligt uppfinningen bör en stam av Lactobacillus uppfylla fö- ljande villkor: - fermentera havre väl; - överleva vid ett pH av 1,0 (vilket motsvarar pH i magsäck- en) i 30 minuter; - överleva och växa i närvaro av gallsalter; - kunna slå sig ner och stanna kvar på tarmslemhinnan.

Det är också väsentligt att pH-värdet vid fermeneringen sjunker snabbt så att tillväxt av andra bakterier hindras.

Det har visat sig att tillförsel av laktobaciller med förmåga att etableras i tarmen kan undertrycka annan bakterieflora i tarmen och därigenom minska risken för sepsis vid bakteriella infektioner som komplikationer till bukkirurgi. Denna behandling synes vara lika effektiv som den etablerade behandling som idag användes i form av antibiotika. Det synes därför vara rimligt att patienter som skall genomgå tarmkirurgi förbehandlas med laktobacilller i stället för med antibiotika. Härigenom skulle uppnås en billigare terapiform med mindre potentiella biverknin- gar då den normala tarmfloran ej skulle slås ut.

Uppfinningen avser således även en komposition omfattande en med en stam av Lactobacillus enligt uppfinningen fermenterad 469 8?5 6 näringskomposition i stället för antibiotika för profylax eller behandling av bakteriella infektioner i samband med kirurgiska ingrepp.

En speciellt lämplig komposition är en med Lactobacillus plantarum 299 fermenterad havrebaserad näringslösning.

Försök med experimentaldjur har visat en statistiskt säker- ställd överlevnad hos djur som behandlats med en komposition omfattande en stam av Lactobacillus som isolerats från tarmslem- hinnan av djur av samma art. Försök på råtta visar god preven- tion och snabbare utläkning av experimentellt inducerad tarm- katarr (colit) och sårbildning (ulcus) i tarmen.

Kompositionen enligt uppfinningen kan administreras på varje lämpligt sätt, speciellt oralt eller rektalt, t.ex. i form av lavemang. Den kan också tillföras enteralt genom en kateter inlagd i tarmen via magen eller direkt i tarmen. Försök har visat att effekten förbättras om fiber i form av t.ex. havreväl- ling eller ß-glukaner tillföres. Behandling bör ske en eller flera gånger dagligen under en period av 1-2 veckor.

På bifogade ritning visar fig. 1-2 REA-mönstret för de nya Lactobacillus stammarna 299 och 271; och fig. 3 koncentrationen av laktobaciller i ileum före, omedelbart efter respektive ett antal dagar efter oral tillförsel av en med Lactobacillus fer- menterad havrevälling.

EXEMPEL Isolering av Lactobacillus stammar från människa För att finna stammar med generell förmåga att etablera sig på human tarmslemhinna har stammar av Lactobacillus isolerats från human tarmslemhinna. Biopsier från kolon togs genom entero- skopi och bitar av slemhinnemembranet från tunntarmen (jejunum och ileum) avlägsnades i samband med kirurgiska ingrepp. Mem- branbitarna placerades omedelbart i transportmedium (0,9 % NaCl, 0,1 % pepton, 0,1 % Tween 80 och 0,02 % cystin, vikt/volym-%).

Proven behandlades i ultraljudbad under 2 minuter och omrördes i 1 minut innan de placerades på Rogosa-agar (Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA). Plattorna inkuberades anaerobt vid 37°C i 2 d (Gas Pak Anaerobic System, BBL). En till tre kolonier plockades godtyckligt från varje platta, renodlades 5 till 9 gånger på Rogosa-agar och förvarades som täta kulturer i fryst 469 875 7 buffert vid -80°C. Totalt isolerades 209 Lactobacillus stammar från ca 61 olika individer. Samtliga isolat karakteriserades med avseende på förmåga att förjäsa 49 olika kolhydrater med hjälp av API 50 CH, en kommersiell testsats från API, Montalieu Verceu, Frankrike. Någon signifikant skillnad i sammansättning mellan laktobacillfloran i tunn- och tjocktarmen kunde ej fast- ställas.

Representativa stammar från de olika grupperna utvärderades med avseende på pH-resistens, förmåga att växa i närvaro av galla, samt förmåga att fermentera havrevälling. pH-resistens testades genom tillsats av 0,1 ml bakteriesu- spension (109 CFU/ml som odlats upp på Rogosa-buljong, centrifu- gerats och resuspenderats i fysiologisk koksaltlösning) till 2 ml fosfatbuffert vid pH 1,0. Efter 30 min gjordes utstryk på Rogosa-agar och om synlig växt kunde påvisas efter inkubering vid 37°C under 3 dygn bedömdes testen som positiv. Endast ett fåtal av de testade stammarna klarade provet.

Tillväxt i närvaro av galla testades genom att isolat av Lactobacillus odlades i närvaro av 0,1 % respektive 0,15 % oxgalla i Rogosa-agar på plattor som inkuberades anaerobt vid 37°C under 3 d. Ca 80 % av stammarna kunde växa i närvaro av 0,1 % galla under det att endast 18 % klarade tillväxt vid 0,15 % galla.

På basis av resultaten av dessa undersökningar utvaldes 20 olika Lactobacillus stammar för fortsatta test.

Tarmkolonisation in vivo på människa Friska försökspersoner fick under en period dagligen äta fermenterad havrevälling som innehöll en blandning av tjugo olika, enligt ovan noggrant utvalda, stammar av Lactobacillus.

Därefter undersöktes vilka av de förtärda stammarna som kunde återfinnas på slemhinna från tunntarm och grovtarm.

Fermenterad havrevälling tillverkades enligt det recept som anges nedan. Detta gjordes för var och en av de i studien in- gående stammarna av Lactobacillus, vilket redovisas i Tabell 1 nedan. De olika preparationerna blandades i sådana proportioner att den slutliga produkten innehöll 8 x 107 CFU per gram frys- torkad produkt.

I studien deltog 12 frivilliga försökspersoner i åldern 31 469 8?5 8 til 56 år, som vardera erhöll tio flaskor innehållande 100 ml flytande havrevälling baserad på 1 g frystorkad produkt per ml vatten. Prov från tarmslemhinnan togs innan förtäringen av havrevälling hade inletts, efter 11 dagar då försökspersonerna förtärt 100 ml havrevälling till frukost varje dag under en tio- dagars period och efter ytterligare 10 dagar, dvs 11 dagar efter det att förtäringen av havrevällingen upphört. Tarmproven togs i form av biopsier från tunntarmen (ileum) med hjälp av en Watson kapsel, och från rektum med ett rektoskop. Biopsierna behandla- des så som angivits ovan och analyserades med avseende på mäng- den Lactobacillus. Från varje prov plockades ca tio kolonier från Rogosa-plattan, vilka renodlades och frysförvarades vid - 80°C tills de identifierades.

Samtliga isolat testades på API 50 CH enligt ovan. De isolat som verkade stämma överens med eller i stort sett stämma överens med någon av teststammarna testades vidare genom plasmidanalys och restriktionsendonukleasanalys enligt nedan beskrivna meto- der.

Som en genomgående trend kunde noteras att halten lak- tobaciller på slemhinnan ökade vid förtäring av den fermenterade havrevällingen och att denna ökning höll i sig 11 dagar efter det att tillförseln hade avbrutits. I fig 3 visas med hjälp av stapeldiagram den logaritmiska koncentrationen av laktobaciller i ileum innan försöket påbörjades, dagen efter det att försöket avslutats samt efter ytterligare 10 dagar. Ökningen var mer markerad i tunntarmen, men å andra sidan var halten laktobacil- ler överhuvudtaget högre i grovtarmen. Vidare kunde konstateras att halten gramnegativa anaeroba bakterier i kolon minskade efter förtäringen.

Följande stammar återfanns i en dominerande ställning på tarmslemhinnan 10 dagar efter det att tillförseln av laktobacil- lerna upphört: Lactobacillus plantarum 299 återfanns hos 11 personer (hos 5 personer enbart på tunntarmen och hos 5 andra enbart på grovtarmen); Lactobacillus casei ssp rhamnosus 271 återfanns hos 4 personer (hos 1 enbart på tunntarmen och hos 2 andra enbart på grovtarmen); Lactobacillus reuteri 108 återfanns hos 4 personer (hos 1 'x 4-69 875 9 enbart på tunntarmen och hos 1 annan enbart på grovtarmen); Lactobacillus murinus/casei ssp tolerans 294 återfanns hos 2 personer.

De stammar som återisolerades 11 d efter avslutad tillförsel fanns på slemhinnan i en ungefärlig koncentration av 3 x 103 till 105 CFU/g slemhinna för tunntarmen och en koncentration av 103 till 3 x 107 CFU/g slemhinna för grovtarmen.

Framställning av havrevälling Fermenterad havrevälling tillverkades i tre steg: (i) 1295 g havremjöl (MP-450, Nord-Mills, Järna; proteinhalt 14,2 % och askhalt 2,1 %), 129,5 g enzymblandning (Nord Malt, Söderhamn) och 5390 g kranvatten blandades och upphettades till 95°C under långsam omröring. Vällingen kyldes till 50°C, för- sattes med 1 % (vikt/volym) ß-glukanas (GV-L; Grindsted Products A/S, Braband, Danmark) och inkuberades därefter i 2 h vid 50°C; (ii) Vällingen fermenterades vid 37°C i 20 h. pH var 3,4 till 3,9. Fermenteringen utfördes med de olika stammarna var för sig och antalet kolonibildande enheter CFU, per ml produkt varierade mellan 6 x 106 och 2 x 108 på Rogosa-agar (anaerobt vid 37°C i 20 h); (iii) Den fermenterade Vällingen frystorkades. De olika produkterna blandades i ett sådant förhållande att samma värde på CFU/g erhölls för samtliga stammar. Blandningen komplettera- des med 20 % (vikt/vikt) sojamjöl (protein 51 %, askhalt 5,5 %, fett 1 %). Den berikade blandningen innehöll 2 x 107 CFU/g och förvarades vid -18°C. Icke-fermenterad havrevälling framställdes på samma sätt som ovan, men utan fermenteríng.

Havrevälling tillverkades med samtliga 20 stammar som utvalts för det ovan beskrivna tarmkolonisationsförsöket och värderades med avseende på koncentration före och efter frystorkning samt smak. Resultaten framgår av följande Tabell 1. 469 875 10 Tabell 1 Utvalda stammar av Lactobacillus för kliniskt försök Stamnr Beteckning CFU/g CFU*/g Smak 138 ~^ "aggregerande" 8,8x108 l,78x108 1 132 L. salivarius 1,1x1o8 6,sx1o6 3 47 L. reuteri 1,2x1o9 3,7x1o7 1 1os L. reuteri 1,sx1o9 1,ssx1o7 1 98 L. casei pseu- doplantarum 1,63x1o9 6,6x1o8 292 L. gasseri l,58x109 5,1xl08 299 L. plantarum 1,92x1o9 6,71x1o8 5 136 L. casei casei 3,sx1o9 1,4sx1o9 2 A1 L. plantarum 2,27x1o9 4,15x1o8 5 271 L. casei rham- nosus 4,3x1o9 6,1ox1o8 4 227 L. buchneri 9,4sx1o 1,s1x1o8 1 140 L. gasseri 1,2x1o8 s,sx1o6 4 294 L. murinus/ casei tolerans 1,63xlO9 1,3xl08 3 233 L. plantarum 7,43x1o8 7,ssx1o7 4 282 cluster 25** 7,sx1o8 6,6sx1o7 2 96 cluster 19** 4,9x1o8 4,3x1o7 3 99 cluster 12** 4,6x1o9 1,39x1o9 4 99' cluster 12** 1,ox1o9 1,6x1o8 2 308 L. acidophilus 5,9x1o8 1,ox1o8 3 280 L. salivarius 3,ox1o8 2,43x1o6 3 * efter frystorkning ** cluster-numreringen hänför sig till ett arbete i numerisk taxonomi över tarmassocierade laktobaciller av Molin G et al (under publicering) Fermentering av havrevälling De fyra stammar som återfanns på tarmslemhinnan i dominerande mängd undersöktes vidare med avseende på förmåga att fermentera havrevälling, förmåga att motstå frystorkning samt med avseende på smakutveckling i havrevälling.

Förmåga att fermentera havrevälling bedömdes med hjälp av förmågan att sänka pH under 4,0 och bilda CFU i en nivå >108 CFU/g våtvikt. 469 875 ll Förmåga att motstå frystorkning i havrevälling var ett annat urvalskriterium. Härvid mättes CFU-koncentrationen efter frys- torkning.

Resultatet av ovan angivna försök med havrevälling anges i Tabell 2 nedan.

Tabell 2 Fermentering av havrevälling med valda stammar av Lactobacillus Stam 299 211 22¿ 1Q§ slut-pH 3,6 3,8 3,4 3,8 syratal 8,0 6,5 8,1 6,5 L-laktat, g/1oo g 0,18 o,4o 0,32 0,25 D-laktat, g/100 g 0,390 0,031 0,24 0,19 laktat tot., g/1oo g 0,57 0,43 13,55 0,44 D-laktat i % 69 7 43 44 acetat, g/100 g 0,0084 0,013 0,13 0,0026 reduktion efter frys- torkning i % 65 86 94 98 slutligt cFU/g 2x1o9 4x1o9 axios 1x1o9 Förmåga att via fermenteringen ge havrevällingen en angenäm smak bedömdes av en "expertpanel" bestående av fyra personer som utvärderade de havrevällingar som olika stammar fermenterat.

Smaken värderades i en fallande skala från 5 till 1 där 5 be- tecknar omdömet "mycket god" och 1 omdömet "osmaklig".

Värdena för de 20 utvalda teststammarna anges i Tabell 1 ovan.

Dessutom utvärderades smaken av de utvalda 4 stammarna i jäm- förelse med dels en kommersiell yogurthkultur (Streptococcus thermophilus och Lactobacillus bulgaricus) och dels en kommersi- ell kultur för acidofilus-fil (Lactobacillus acidophilus) under användning av samma värderingssymboler. Resultaten anges i Tabell 3 nedan.

Tabell 3 Smak av havrevälling fermenterad med stammar av Lactobacillus voqurth acidonhilus-fil 299 271 294 108 3 2 5 4 3 1 På basis av dessa värden bedömdes stammarna 299, 271 och 294 vara av speciellt intresse och beskrives närmare i det följande. 469 875 12 Beskrivning av Lactobacillus stam 299 och 271 Stammarna 299 och 271, vilka samtliga isolerats från frisk human tarmslemhinna, har deponerats vid Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH den 2 juli 1991 och givits deponeringsnumren DSM 6595 (299) och DSM 6594 (271).

Fenotyg beskrivning Stammarna 299 och 271 är grampositiva, katalasnegativa stavar som växer på Rogosa-agar vid pH 5,5.

Stammarnas kapacitet att fermentera olika kolhydrater redovisas i Tabell 4. Testen har urförts med hjälp av API 50 CH enligt tillverkarens instruktioner.

Tabell 4 Förmåga att bilda syra från olika kolhydrater Stam 299 271 1. Glycerol - - 2. Erytritol - - 3. D-arabinos - - 4. L-arabinos + - 5. Ribos + 6. D-xylos - - 7. L-xylos - - 8. Adonitol - - 9. B-metyl-xylosid - - 10. Galaktos + 11. D-glukos + 12. D-fruktos + 13. D-mannos + 14. L-sorbos - ++++++ 15. Ramnos - 16. Dulcitol - 17. Inositol - 18. Mannitol 19. Sorbitol 20. a metyl-D-mannosid 21. a-metyl-D-glukosid 22. N-acetyl-glukosamin 23. Amygdalin 24. Arbutin 25. Eskulin +++ l+++ ++++l +++++ 13 26. Salicin 27. Cellobios 28. Maltos 29. Laktos 30. Melibios 31. Sackaros 32. Trehalos 33. Inulin - - 34. Melezitos + + 35. D-raffinos - - 36. Amidon - - 37. Glykogen - - 38. Xylitol - - 39. ß-gentiobios + + 40. D-turanos + + 41. D-lyxos - + 42. D-tagatos - + 43. D-fukos - - 44. L-fukos - - 45. D-arabitol - - 46. L-arabitol - - 47. Glukonat + + 48. 2-keto-glukonat - - 49. 5-keto-glukonat - - +++++++ ++l++++ Fenotypiskt kan 299 identifieras som Lactobacillus plantarum (endast raffinos avvek från testmönstret för L. plantarum ATCC 14917T; detta är typstammen för arten L. plantarum, dvs den stam som definierar arten). 271 kan identifieras som Lactobacillus casei subsp. rhamnosus (överensstämmer helt med typstammen för arten).

Genotyp beskrivning De tre stammarna har undersökts vad gäller klyvningsmönster av det kromosomala DNA:t vid spjälkning med EcoRI, genom res- triktionsendonukleasanalys - REA - (metod enligt Ståhl M, Molin G, Persson A, Ahrnë S & Ståhl S, International Journal of Syste- matic Bacteriology, 40:189-193, 1990). Schematiskt kan REA beskrivas enligt följande: (1) Kromosomalt DNA prepareras fram för de i studien ingående stammarna; (2) DNA:t klyvs med re- 469 875 14 striktionsenzymer; (3) De spjälkade DNA-fragmenten separeras med avseende på storlek med agarosgelelektrofores; (4) Bandmönstren för de olika stammarna registreras och tolkas med hjälp av en laser-densitometer och tillhörande programvara. Olikheterna mellan stammarna med avseende på REA-mönstret kan uttryckas matematiskt med hjälp av principalkomponent-analys (Ståhl et al, Int J System Bacteriol, 189-193, 1990.

Vidare har gjorts en undersökning med avseende på innehåll av plasmider (metod enligt Ahrnë S, Molin G & Ståhl S, Systematic and Applied Microbiology 11:320-325, 1989).

Stam 299: Denna stam innehåller fyra plasmider som är 4 MDal, 9 HDal, 20 MDal respektive 35 Mbal stora. Stammens klyvnings- mönster av det kromosomala DNA:t visas i Fig 1. Det band som markerats med 299 visar mönstret för stam 299 och de band som markerats med v en geneteisk variant av stam 299 från två olika isolat; denna variant ingick bland de 20 stammar som testades på människa och har i Tabell 1 betecknats som A1; s betecknar standarden, High MWDNA Markers (AEH; BRL, Bethesda Research Laboratories, Life Technologies, Inc.). Varianten av 299 kan med gängse fenotypiska tester inte särskiljas från 299. Även geneti- skt sett står 299 och 299v varandra mycket nära. Varianten har också visat sig ha samma goda förmåga att etablera sig på tarm- slemhinna.

Stam 271: Denna stam innehåller två plasmider, 3 MDal respek- tive 5 MDal. Stammens klyvningsmönster av det kromosomala DNA:t visas i Fig 2, som band A; band v visar en genetisk variant av stam 271, som isolerats från en försöksperson som erhållit stam 271; s betecknar samma standard som i Fig. 1. Varianten av 271 kan med gängse fenotypiska tester inte särskiljas från 271. Även genetiskt sett står 271 och 271v varandra mycket nära. Varianten har också visat sig besitta samma goda förmåga att etablera sig på tarmslemhinna som moderstammen.

Genetiskt sett skiljer sig de två undersökta stammarna i väsentlig grad från varandra. De skiljer sig också signifikant från respektive typstammar. in: 469 875 15 Uppodling av Lactobacillus 299 - En ymp från frys av -80°C sättes till 50 ml Lactobacillus Carrying Medium (LCM, Efthymiou & Hansen, J. Infect. Dis., 110:258-267, 1962) eller Rogosa, - inkuberas cirka 40 timmar vid 37°C, - 50 ml ympas till 500 ml LCM, - inkuberas cirka 40 timmar vid 37°C, - 500 ml ympas till 5 liter, - inkuberas cirka 25-30 timmar vid 37°C, - centrifugeras vid 10 000 varv/min i 10 minuter, - tvättas en gång med fysiologisk koksaltlösning, - pelletten upplöses i cirka 1 liter fysiologisk koksaltlös- ning.

Denna mängd beräknas räcka till cirka 4-500 liter havrevälling.

Odlingsmedier är ej optimerade. Rogosa fungerade bättre än LCM, eventuellt beroende på bättre buffertverkan. Till LCM sattes 2 % glukos. Samma förfarande kan utnyttjas för att producera övriga Lactobacillusstammar.

Biologiskt test på råtta Råttor med en vikt av 250-300 g genomgick en standardoperation för framkallande av en abscess i bukhålan genom att en del av en grovtarmslinga isolerades och punkterades varigenom erhölls ett konstant läckage av tarminnehåll ut i bukhålan med framkallande av en varböld inom 24 timmar, blodförgiftning och därpå följande hög dödlighet. Tre grupper av djur användes om vardera 30 djur.

Grupp 1 var en obehandlad kontrollgrupp, Grupp 2 en grupp som behandlades med antibiotika, genom injektion, och Grupp 3 en grupp som tillfördes lactobaciller i form av en fermenterad havrevälling till magsäcken. Den använda stammen av Lactobacil- lus hade isolerats från tarmslemhinna på råtta och vid försök visat sig kunna återetableras i tarmen.

Utvärdering av testet gjordes genom analys av bakterie- förekomsten i blod vilket är liktydigt med blodförgiftning, samt odlingar från bukhåla och tarm. Resultatet visar att samtliga djur i Grupp 1 uppvisade bakterier i blodet, vilket borde med- föra en mycket hög dödlighet. I Grupp 2 och Grupp 3 erhölls samma resultat med förekomst av bakterier hos 3 av 30 djur, dock i en mängd betydligt mindre än i Grupp 1.

Claims (4)

469 875 16 PATENTKRAV

1. Stam av Lactobacillus med förmåga att kolonisera human tarmslemhinna in vivo, vilken utgöres av Lactobacillus plantarum 299 DSM 6595, eller en variant därav med väsentligen överensstämmande REA- mönster, till användning för profylax eller behandling av stör- ningar i tarmmikrofloran.

2. Komposition för profylax eller behandling av infektioner i magtarmkanalen, kännetecknad av att den omfattar en stam av Lactobacillus med förmåga att etableras på human tarmslemhinna in vivo, nämligen Lactobacillus plantarum 299 DSM 6595 eller en variant därav med väsentligen överensstämmande REA- mönster, i kombination med en konventionell bärare.

3. Komposition enligt krav 2 för oral, enteral eller rektal administration, kännetecknad av att den utgöres av en med någon av de angivna stammarna av Lactobacillus fermenterad havrebaserad näringslösning.

4. Komposition enligt krav 2 eller 3 till användning för profylax eller behandling av bakteriella infektioner i samband med kirurgiska ingrepp i stället för antibiotika.