DE69226668T3

DE69226668T3 - Imfpstoff, enthaltend ein Pneumokokkenpolysaccharid-Konjugat

Info

Publication number: DE69226668T3
Application number: DE69226668T
Authority: DE
Inventors: Peter J. Lansdale Kniskern; Charlotte C. Blue Bell Ip; Arpi Lansdale Hagopian; John P. Dublin Hennessey Jr.; William J. North Wales Miller; Dennis J. Salem Kubek; Pamela D. Landsdale Burke; Stephen Metuchen Marburg; Richard L. Warren Tolman
Original assignee: Merck Sharp and Dohme Ltd; Merck Sharp and Dohme LLC
Current assignee: Merck Sharp and Dohme LLC
Priority date: 1991-01-28
Filing date: 1992-01-27
Publication date: 2010-12-16
Anticipated expiration: 2012-01-28
Also published as: IL100716A0; JPH0565300A; LV12309B; IL100716A; IE920244A1; LV12309A; HU9200252D0; SK280659B6; FI107370B; NZ241367A; EP0497525B2; AU651656B2; NO920350L; ATE169825T1; KR100243958B1; US5623057A; FI920353L; CS19992A3; FI920353A0; DK0497525T4

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die als Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken, Pn) klassifizierten pathogenen Bakterien wurden in 84 antigene Serotypen unterteilt, basierend auf dem Kapselpolysaccharid (Pn-Ps) des Organismus. Krankheitszustände, die diesen Organismen zugeschrieben werden können, umfassen Lungenentzündung, Meningitis, Mittelohrentzündung, Bakteriämie und akute Verschlimmerungen von chronischer Bronchitis, Sinusitis, Arthritis und Konjunktivitis. Der Großteil dieser Erkrankungen wird jedoch von einer begrenzten Untergruppe der 84 bekannten Isolate verursacht Somit kann ein polyvalentes Vakzin, welches die Pn-Ps der am häufigsten vorkommenden und am stärksten pathogenen Isolate des Organismus enthält, Schutz gegen einen sehr hohen Prozentsatz der am häufigsten genannten Pathogene dieser Klasse bieten.
Es wurden polyvalente Vakzine hergestellt, welche zur Induktion schützender Immunantworten gegen die Pneumokokken bei Erwachsenen wirksam sind. „PNEUMOVAX^® 23” (Pneumokokkenvakzin, polyvalentes, MSD; siehe PDR, Ausgabe von 1990, Seite 1431) ist beispielsweise eine flüssige Zusammensetzung, die 50 μg/ml von jedem der 23 verschiedenen unkonjugierten Pneumokokken-Polysaccharide enthält, von denen alle bei der ATCC hinterlegt sind und eine mögliche Quelle von Ausgangsmaterial für diese Erfindung bieten. „PNEUMOVAX^® 23” umfaßt jedes der folgenden freien, d. h. unkonjugierten, Polysaccharide: 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19F, 19A, 20, 22F, 23F und 33F, die etwa 90% der Pneumokokken-Blutisolate ausmachen. Derartige Vakzine sind jedoch am wenigsten wirksam bei dem Teil der Bevölkerung, der das höchste Risiko für Pneumokokken-Infektionen aufweist: Personen mit geschwächter B-Zell-Immunabwehr, ältere Personen und Kleinkinder, die jünger als zwei Jahre sind, welche für den Immunschutz von T-Zell-Antworten abhängig sind. Nachdem unkonjugierte Polysaccharide schlechte Induktoren von T-Zell-Immunantworten sind, ist die Überführung der Pn-Ps in Immunogene, welche zur Induktion von T-Zell-Antworten imstande sind, der Schlüssel, um bei dieser Zielpopulation einen adäquaten Schutz zu erzielen. Die Verwendung ist jedoch nicht auf diese Gruppe von Individuen beschränkt. Beispielsweise induziert die Verabreichung eines Vakzins, das eines oder mehrere der neuen Konjugate umfaßt, an einen weiblichen Säuger vor oder während der Schwangerschaft Antikörper bei der Mutter, welche einen sich entwickelnden Fötus und einen Säugling passiv schützen können, selbst wenn das Vakzin dem Fötus oder Kleinkind nicht direkt verabreicht wird. Solche Konjugat-Vakzine sollten sich auch als geeignet erweisen zur Induktion von Antikörpern für einen maximalen passiven Schutz von Risikogruppen wie Neugeborene oder Geschwister von infizierten Individuen.
Polysaccharide, die allein als wenig immunogen befunden worden waren, zeigten sich als ziemlich gute Immunogene, sobald sie mit einem immunogenen Protein, PRO, konjugiert sind [Marburg et al., US-Patent-Nr. 4,695,624 ; Schneerson et al., New Dev. with Hum. & Vet. Vaccines, 77–94 (1980); Schneerson et al., J. Exptl. Med., 152, 361 (1980); Anderson, Infection and Immunity, 39, 233 (1983)]. Ein Hauptproblem bei der Herstellung solcher Konjugate ist jedoch die viskose und inhomogene Natur des Polysaccharid-Ausgangsmaterials und somit die Schwierigkeit bei der chemischen Definition des Konjugatprodukts. Somit ist ein Verfahren erforderlich, bei dem die Ausgangsmaterialien so gut wie möglich definiert sind und jeder Schritt auf dem Syntheseweg hinsichtlich des gebildeten Zwischenprodukts überprüfbar ist. Das hier beschriebene Verfahren genügt dieser Anforderung, indem hochgradig immunogene Konjugat-Immunogene gegen die zugehörigen Pathogene, von denen das Pn-Ps stammt, bereitgestellt werden. Die Konjugate eignen sich für Kleinkinder, die jünger als zwei Jahre alt sind.
Marburg et al., [J. Am. Chem. Soc., 108, 5282 (1986), und US-Patent 4,695,624 ; 4,830,852 ; 4,882,317 ] offenbarten ein Mittel zur Konjugation von Polysacchariden und immunogenen Proteinen durch bigenerische Abstandhalter. Das PRO wurde derivatisiert, um nukleophile oder elektrophile Seitengruppen zu zeigen (PRO*), während ein Partner-Ps funktionalisiert wurde, um Seitengruppen der entgegengesetzten Reaktivität zu zeigen (Ps*). Nach der Kombination von Ps* mit PRO* wurden bigenerische Abstandshalter gebildet, die Ps kovalent mit PRO verbanden (Ps-PRO). Nach saurer Hydrolyse wird der bigenerische Abstandhalter als ungewöhnliche Aminosäure freigesetzt, durch Aminosäureanalyse quantitativ bestimmt und dadurch ein Mittel zum Nachweis der Kovalenz geboten.
EP-A-097407 offenbart Vakzine gegen pathogene Bakterien mit Kapselpolysacchariden und ein Verfahren zu deren Herstellung.
EP-A-208375 offenbart Glykoprotein-Konjugate mit trivalenter immunogener Aktivität, die als Vakzine eingesetzt wurden.
WO-A-8706267 offenbart Antigene mit immunogenen Determinanten von Gruppe B-Streptococcus-Bakterien und Vakzine gegen solche Bakterien.
Obwohl die drei obigen Referenzen Techniken zur partiellen Hydrolyse und Fraktionierung nach Größe und Reinheit von Streptococcus pneumoniae-Polysaccharid-Antigenen beschreiben, offenbaren oder nahelegen sie nirgends das verbesserte Verfahren, das durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt wird.
Diese Erfindung offenbart ein Verfahren, welches gegenüber dem im US-Patent 4,695,624 ; 4,830,852 ; und 4,882,317 offenbarten verbessert ist. Die Verbesserungen umfassen die Präparation des Pn-Ps-Ausgangsmaterials, welche spezifischere, reproduzierbarere und steuerbarere physikalische Eigenschaften aufweist, als sie von rohen Pn-Ps-Präparationen geboten werden, einschließlich: erhöhte Löslichkeit, erhöhte Filtrierbarkeit, erhöhte Reinheit (Verringerung der Verunreinigung mit gruppenspezifischem C-Polysaccharid (C-Ps)) und verringertes Molekulargewicht, verringerte Polydispersität und Viskosität. Die resultierenden, hier offenbarten Konjugate sind hinsichtlich Steigerungen in der Einheitlichkeit und Bequemlichkeit der Herstellung, besserer Antigenizität und besserer Reinheit des Endprodukts gegenüber denjenigen verbessert, welche durch das Verfahren von 4,695,624 bereitgestellt werden. Besonders signifikant ist die 3–20fache Verringerung von gruppenspezifischem C-Polysaccharid und Peptidoglykan in den Pn-Ps vor der Konjugation gegenüber den Ps-Präparationen des Patents 4,695,624 vor der Konjugation. Obwohl die Anwesenheit der C-Polysaccharid-Verunreinigung die Immunantworten gegen die typenspezifischen Antigene nicht stört, könnte C-Ps an der Konjugationsreaktion teilnehmen und diese für das typenspezische Ps weniger spezifisch und kontrolliert machen. Ferner kann die Produktion von Anti-C-Polysaccharid-Antikörpern mit der Gewebezerstörung korrelieren, die bei einigen ungeklärten Pneumokokken-Infektionen beobachtet wurde.
Diese Erfindung offenbart neben dem neuen Konjugatprodukt ein neues Verfahren zur Herstellung partiell hydrolysierter, hochgereinigter Pneumokokken-Polysaccharid-Zwischenprodukte, neue Zusammensetzungen, die ein bis zehn verschiedene Konjugate umfassen, und Verfahren zum Einsatz der Erfindung. Von besonderem Interesse sind die in „PNEUMO-VAX^® 23” (Pneumokokkenvakzin, polyvalentes, MSD; siehe PDR, Ausgabe von 1990, Seite 1431) eingeschlossenen Kapselpolysaccharide. Eine am meisten bevorzugte Untergruppe sind die Kapselpolysaccharide der Streptococcus pneumoniae-Subtypen 6B, 23F, 19F, 14, 18C, 4 und 9V, da geschätzt wird, daß diese kleine Gruppe von Pneumokokken-Subtypen für zwischen 75–85% der Pneumokokken-Infektionen bei Kleinkindern und Kindern verantwortlich ist. Die hier bereitgestellten Verfahren sind auf ein breites Spektrum von Pneumokokken- und anderen bakteriellen Polysacchariden anwendbar.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Chemisch gut definiertes Pneumokokken-Polysacharid (Pn-Ps) wird hergestellt durch partielle Hydrolyse einer rohen Präparation von Pn-Ps auf einen Endpunkt, der so vorherbestimmt ist, daß die antigene Integrität des Pn-Ps aufrechterhalten wird. Das partiell hydrolysierte Pn-Ps ist im wesentlichen gereinigt und geeignet zur Herstellung von Konjugaten von Pn-Ps und immunogenem Protein (PRO), (Pn-Ps-PRO).
Neue und hochgradig antigene Pn-Ps-PRO-Konjugate der Erfindung, welche den Komplex des Proteins der äußeren Membran (OMPC) von Neisseria meningitidis b oder rekombinante oder gereinigte Untereinheiten davon, z. B. MIEP, oder andere immunogene Trägerproteine in kovalenter Verknüpfung mit partiell hydrolysierten und hochgereinigten Pn-Ps-Zwischenprodukten von den am häufigsten vorkommenden Pneumokokken-Isolaten umfassen, sind geeignet zur Verhinderung von Pneumokokken-Infektionen bei Säugern. Die Konjugate sind von besonderem Nutzen in Vakzin-Zusammensetzungen zur Stimulierung von Anti-Pneumokokken-Immmunantworten bei Säugern, insbesondere bei Individuen mit geschwächter B-Zell-Immunabwehr, älteren Individuen und menschlichen Kleinkindern, die jünger als zwei Jahre alt sind, da die Konjugate T-Zell-Antworten hervorrufen. Pn-Ps-OMPC- und Pn-Ps-MIEP-Konjugate werden hergestellt durch ein Verfahren, welches umfaßt die Schritte der Isolierung von Kapsel-Ps aus Kulturen von Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken, Pn), partiellen Hydrolyse oder physikalischen Scherung der Pn-Ps, Fraktionierung der Pn-Ps, um ein Pn-Ps-Produkt mit verringerter Molekülgröße, Polydispersität, Vskosität zu ergeben, und anschließenden kovalenten Konjugation des Pn-Ps mit OMPC oder MIEF.
AUFGABEN DER ERFINDUNG
Eine Aufgabe dieser Erfindung ist die Bereitstellung neuer, partiell hydrolysierter und hochgereinigter, in antigener Hinsicht typenspezifischer Pneumokokken-Kapselpolysaccharide (Pn-Ps), die als Zwischenprodukte bei der Herstellung von T-Zell-abhängigen Konjugaten der Pn-Ps und immunogenen Proteine geeignet sind. Eine weitere Aufgabe ist die Bereitstellung von T-Zell-abhängigen Konjugaten der Pn-Ps und immunogenen Proteine, geeignet für Vakzin-Zusammensetzungen, um Pneumokokken-Infektionen zu verhindern, insbesondere bei Kleinkindern, die jünger als zwei Jahre alt sind, und bei Personen mit geschwächter B-Zell-Immunabwehr. Eine weitere Aufgabe ist die Bereitstellung eines Verfahrens, welches gegenüber dem im US-Patent Nr. 4,695,624 bereitgestellten Verfahren verbessert ist, zur Herstellung von kovalenten Konjugaten von Pneumokokken-Polysaccharid und immunogenem Protein (Pn-Ps-PRO), worin die Verbesserung in der besseren chemischen Definiertheit und Reinheit der Ausgangs-Pn-Ps, der Zwischenprodukte und des Endprodukts und erhöhten Einheitlichkeit und Leichtigkeit der Durchführung des Verfahrens selbst besteht. Eine noch weitere Aufgabe ist die Bereitstellung von chemisch definierten Pn-Ps-PRO-Konjugaten nach dem verbesserten Verfahren, welche T-Zell-Abhängigkeit zeigen, geeignet zur Induktion von schützendem Serum-Antikörper gegen pathogene Pneumokokken, insbesondere bei Kleinkindern, die jünger als zwei Jahre alt sind, und bei Individuen mit geschwächter Immunabwehr. Eine weitere Aufgabe ist die Bereitstellung eines Behandlungsverfahrens unter Einsatz dieser Konjugate in immunologisch wirksamen Mengen in Vakzin-Formulierungen, um pneumokokken-induzierte Krankheiten wie Mittelohrentzündung, Meningitis, Lungenentzündung, Bakteriämie und die akuten Verschlimmerungen von chronischer Arthritis, Sinusitis, Bronchitis und Konjunktivitis zu verhindern.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
A. Das neue Pn-Ps-PRO-Konjugat und Polysaccharid-Zwischenprodukte:
Das Pn-Ps-PRO-Konjugatprodukt dieser Erfindung weist ein Verhältnis von Pn-Ps zu PRO zwischen 0,05 und 0,5 mg Polysaccharid/mg Protein, ein hohes Maß an Kovalenz, eine minimale Verunreinigung des Konjugats durch freies Pn-Ps und einzigartige pysikalische und chemische Eigenschaften auf, die von den neuen Polysaccharid-Komponenten verliehen werden.
Das Konjugat umfaßt ein immunogenes Protein (PRO), das über einen Abstandhalter kovalent an ein neues, partiell hydrolysiertes und hochgereinigtes Pneumokokken-Kapselpolysaccharid (Pn-Ps) gekoppelt ist. Das immunogene Protein ist vorzugsweise der Komplex des Proteins der äußeren Membran (OMPC), der von einer Kultur von Neisseria meningitidis b stammt. Ein Verfahren zur Präparation von OMPC ist im wesentlichen wie im US-Patent 4,271,147 und in Beispiel 1 angegeben. Als Alternative ist eine Untereinheit von OMPC, z. B. MIEP, die durch Dissoziation des OMPC oder durch ihre rekombinante Expression gebildet wird, ebenfalls bevorzugt. Eine Methode zur Erreichung dieses Ziels wird in der Patentanmeldung USSN 555,978; 555,329 und 555,204 (entsprechend EP-A-0467714 ) und in Beispiel 2, 16–23, angegeben.
Das neue, partiell hydrolysierte und hochgereinigte Pneumokokken-Kapselpolysaccharid (Pn-Ps) ist eine Präparation eines antigenen Polysaccharids, das von einer Kultur eines der Pneumokokken-Subtypen (wie im folgenden in dem Abschnitt, der ein neues Konjugationsverfahren beschreibt, und in den Beispielen 3–10 beschrieben) stammt. Das Pn-Ps besitzt ein mittleres Molekulargewicht zwischen etwa 1 × 10⁵ und 1 × 10⁶ Dalton, im Mittel weniger als etwa 1000 sich wiederholende Einheiten pro Molekül, einen Grad der Verunreinigung durch C-Polysaccharid von weniger als etwa 3% und einen Antigenizitätsindex zwischen 0,4 und 1,1, und vorzugsweise zwischen 0,7 und 1,1. Dieser letzte Parameter ist das relative Ausmaß der typenspezifischen Anti-Pneumokokken-Antikörperbindung, welche pro Masseeinheit des neuen Pn-Ps gezeigt wird, im Vergleich zu rohem Pn-Ps, das bei der ATCC hinterlegt ist. Darüber hinaus ist das neue Pn-Ps einer Konjugation mit immunogenem Protein zugänglich, um das Pn-Ps-PRO-Produkt der Erfindung zu bilden. Einige physikalische und chemische Eigenschaften von zwei verschiedenen Pn6B-Ps- und zwei verschiedenen Pn23F-Ps-Präparationen sind in Tabelle I unten angegeben, während die folgende Beschreibung zeigt, wie diese Eigenschaften gemessen werden. Das im folgenden offenbarte Verfahren stellt ein Verfahren bereit zur Herstellung von Pn-Ps-Zwischenprodukten und Pn-Ps-PRO-Konjugaten mit einer großen Vielfalt von Pneumokokken-Subtypen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, diejenigen, welche aus den Subtypen 1, 2, 3, 4, 5, 68, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 158, 17F, 18C, 19F, 19A, 20, 22F, 23F und 33F ausgewählt sind. Wie oben erwähnt, sind eine bevorzugte Untergruppe von Pneumokokken-Polysacchariden diejenigen, welche von den Pneumokokken-Subtypen 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F und 23F stammen. Für Fachleute auf diesem Gebiet wird offensichtlich sein, daß neben irgendwelchen dieser Polysaccharide oder anstelle irgendwelcher dieser Polysaccharide ersatzweise andere eingesetzt werden können, wenn es in der Riskopopulation erforderlich wird. So können Pn1-Ps und Pn5-Ps wie Pn4-Ps oder Pn9V-Ps behandelt werden, ebenso wie Neisseria Meningitidis B-, C- oder Gruppe B-Streptokokken-Polysaccharide, während Pn7F-Ps wie Pn14-Ps behandelt werden kann, wie im folgenden näher beschrieben, und in ein multivalentes Vakzin eingeschlossen werden. Für Fachleute wird auch ersichtlich sein, daß mit dem Einschluß von Pn6B-Ps durch kreuzreaktive Antikörper Schutz gegen Pn6A geboten wird. Dies gilt auch für eine Reihe anderer Pneumokokken-Subtypen.
Multivalente Vakzine, sind diejenigen, welche Mischungen von verschiedenen Pn-Ps-PRO-Konjugaten umfassen, die jeweils separat mit einem gegebenen Pn-Ps-Subtyp hergestellt wurden. Darüber hinaus sind multivalente Vakzine diejenigen, bei denen mehrere verschiedene Pn-Ps-Subtypen alle gleichzeitig oder nacheinander mit einem gegebenen PRO konjugiert werden.
1. Charakterisierung der neuen Polysaccharid-Zwischenprodukte:
Die physikalischen und chemischen Eigenschaften der partiell hydrolysierten, gereinigten Pneumokokken-Kapselpolysaccharid-Zwischenprodukte hängen von dem Pneumokokken-Subtyp ab, von dem sie stammen, und den Manipulationen, denen sie nach dem hier offenbarten Verfahren unterworfen werden. Im allgemeinen weisen die Pn-Ps Zwischenprodukte im Vergleich zu rohem, von einer Bakterienkultur stammendem Polysaccharid eine 2- bis 10fach geringere Molekülgröße und Polydispersität auf. Die reduzierte Größe erlaubt eine bessere Handhabung des Polysaccharids während der Konjugation und bei der Entfernung von freiem Pn-Ps nach der Konjugation, höhere Pn-Ps-Reinheit/-Homogenität, niedrigere Polydispersität der Molekülgröße des Pn-Ps und im wesentlichen unveränderte Antigenizität. Diese Eigenschaften des neuen Pn-Ps tragen wesentlich zu der entsprechenden Bildung eines gut definierten, hochgradig typenspezifischen antigenen Pn-Ps-PRO-Produkts bei.
i. Pn-Ps-Molekulargewicht und -Polydispersität:
Durch Messung des Gewichtsmittel-Molekulargewichts M_W mittels Diffusion, Sedimentation oder Chromatographie und des Zahlenmittel-Molekulargewichts M_N durch eine kolligative Eigenschaft wie Viskosität, Gefrierpunktserniedrigung oder Siedepunktserhöhung wird die Polydispersität der Pn-Ps-Präparation als das Verhältnis M_W/M_N erhalten. Je näher diese Zahl bei 1 liegt, desto homogener ist die Polysaccharid-Präparation. Die Polydispersität einer Anzahl von Pn-Ps-Präparationen ist hier angegeben und ein bevorzugtes Verfahren zur Erzielung dieser erhöhten Homogenität ist ebenfalls offenbart
Der Verteilungskoeffizient

Vo: = Hohlraumvolumen der Säule
Vi: = Gesamtpermeationsvolumen
Ve: = Elutionsvolumen der Probe
K_d: = Verteilungskoeffizient der Probe

_d

Eine bevorzugte Säulenmatrix für diesen Zweck ist SEPHAROSE CL2B-Gel (Pharmacia Nr. 17-0120-01). Das Hohlraumvolumen der Säule (Vo) wird mit Blue Dextran 2000 (Pharmacia Nr. 17-0360-01) und das Gesamtpermeationsvolumen (Vi) aus einem Natriumchloridsalz-Peak bestimmt. Gemäß einem Verfahren wird die Pn-Ps-Probe mit 2,5 mg/ml in destilliertem Wasser hergestellt und ein Injektionsvolumen von 1 ml eingesetzt Das Verhältnis Vo/Vi sollte im Bereich von 0,32–0,37 liegen. Der K_d für Dextran T500 (Pharmacia Nr. 17-0320-01) sollte zwischen 0,37–0,49 liegen. Ein bevorzugtes HPSEC-System umfaßt eine 7,5 × 600 mm TSK G6000 PW-Säule, die auf 50°C erwärmt ist.
In einem sehr bevorzugten Verfahren wird SEC oder HPSEC mit einem Differentialrefraktometer, welcher die relative Analytenkonzentration als Funktion des Elutionsvolumens überwacht, und einem Differentialviskometer, welcher die spezifische Viskosität des Analyten als Funktion des Elutionsvolumens überwacht, kombiniert. Eine Universalkalibrierungskurve [log (Grenzviskosität mal Molekulargewicht) gegen Retentionsvolumen] wird anhand der Analyse einer Reihe von monodispersen Polyethylenoxid-Standards konstruiert. Die Diagramme der Konzentration und spezifischen Viskosität können verwendet werden, um für die Probe ein Diagramm von Molekulargewicht gegen Elutionsvolumen zu berechnen, welches wiederum eingesetzt wird, um die Werte für M_N und M_W zu berechnen, aus denen der Polydispersitätsindex (M_W/M_N) berechnet wird [Yau, W. W., und Rementer, S. W., J. Lig. Chromatog., 13, 627–675 (1990); Nagy, J. Lig. Chrom., 13, 677–691 (1990); Benoit et al., J. Ch. Phys. Tome., 63, 1507–1514 (1966)]. Bei der vorliegenden Erfindung wurde die Grenzviskosität in 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,2, gemessen.
Nachdem das mittlere Molekulargewicht einer Pn-Ps-Präparation bestimmt wurde, ist die mittlere Anzahl sich wiederholender Einheiten pro Molekül leicht zu bestimmen durch Teilung des Polymer-Molekulargewichts durch das Molekulargewicht der sich wiederholenden Einheit (siehe Tabelle II).
ii. Retention der typenspezifischen Pn-Ps-Antigenizität:
Es ist wichtig, daß für jedes rohe Pn-Ps, das einer physikalischen Scherung oder einer chemischen, thermischen, Beschallungs- oder enzymatischen Hydrolyse unterworfen wird, ein Endpunkt bestimmt wird, an dem sich die antigene Integrität zu verlieren beginnt. Dieser Endpunkt wird bequem bestimmt durch Korrelation der Viskosität mit irgendeinem aus einer Anzahl von immunologischen Tests, die im Stand der Technik bekannt sind. In einem bevorzugten Verfahren wird ein Aliquot der Polysaccharidlösung gemessen durch den Ouchterlony-Doppelimmundiffusions-Assay unter Verwendung von Pneumokokken-Subtyp-spezifischem Antikörper. Das Auftreten einer weißen Präzipitinbande im Agar, welche neben der Präzipitinbande einer Probe von rohem Pn-Ps liegt, die in eine benachbarte Vertiefung eingebracht wurde, nach einer Diffusionsperiode bietet eine qualitative Identifizierung der Reaktanten und einen Hinweis darauf, daß die antigene Integrtät des Polysaccharids intakt bleibt. Ein mehr quantitativer immunologischer Assay wird durch Geschwindigkeitsnephelometrie-Analyse oder einen RIA erreicht.
Geschwindigkeitsnephelometrie mißt die Änderung oder die Geschwindigkeit der Änderung in der Intensität von Streulicht während der Bildung von Antigen-Antikörper-Komplexen. Die Reaktion läuft in einer Reaktionszelle ab, durch die ein Lichtstrahl geleitet wird. Im vorliegenden Fall werden die Komplexe durch eine Immunpräzipitinreaktion gebildet, welche in Lösung stattfindet, wenn ein spezifischer Antikörper (Ab) mit seinem spezifischen Antigen (Ag), d. h., Pn-Ps, reagiert. Da die Bildung eines Ag-Ab-Komplexes von der Anwesenheit von Ag- und Ab-Molekülen in optimalen Verhältnissen abhängt, nimmt der Grad der Komplexbildung für eine konstante Menge von Ab mit der Menge von Ag bis zu einem maximalen Niveau zu; größere Mengen an Ag führen zur Bildung von weniger Komplex. So wird durch Aufrechterhaltung eines konstanten Niveaus an Ab und Messung der Lichtstreuung mit zunehmenden Konzentrationen an Ag eine Standardkurve gebildet. Es ist möglich, die Ag-Konzentration für eine Ps(oder derivatisiertes Ps)-Präparation zu berechnen, wenn Proben mit ihren spezifischen Ab unter den gleichen Bedingungen, die zur Entwicklung der Standardkurve verwendet wurden, umgesetzt werden.
Ein Vergleich der immunologisch durch Geschwindigkeitsnephelometrie berechneten Konzentration mit der Konzentration, die auf chemische oder physikalische Weise (durch Kolorimetrie, Refraktionsindex oder durch Gesamthydrolyse und quantitative Bestimmung von Monosacchariden – siehe unten) erhalten wurde, ergibt einen Index der Antigenizität für die Ps-Proben. Eine Trockengewichtsanalyse von Polysacchariden ist nur angebracht, wenn der Gehalt an flüchtigen Stoffen der Pulverpräparation bekannt ist. Polysaccharide sind notorisch hygroskopisch und können schätzungsweise von 5 bis 30 Gewichtsprozent flüchtige Stoffe enthalten. Somit sind Trockengewichtsmessungen für sich allein nicht besonders verläßlich. Ein Verfahren, das zur Bestimmung der Polysaccharidkonzentration mit vernünftiger Genauigkeit eingesetzt wurde, ist ein kolorimetrischer Assay, wenn der Assay mit einer Standardlösung des Polysaccharids von Interesse geeicht ist. Beispielsweise können Pn6B-Ps, Pn18C-Ps, Pn19F-Ps und Pn23F-Ps alle quantitativ bestimmt werden durch den Methylpentose-Assay von Dische und Shettles (J. Biol. Chem., 175, 595–603 (1948)]. Pn4-Ps, Pn9V-Ps, Pn14-Ps und Pn19F-Ps können durch den Hexosamingehalt quantitativ bestimmt werden und Pn9V kann auch durch den Uronsäuregehalt quantitativ bestimmt werden. Der Phenol-Schwefelsäure-Assay [Dubois et al., Anal. Chem., 28, 350–356 (1956)] ist geeignet zur quantitativen Bestimmung aller dieser Pn-Ps-Präparationen als Teil einer verfahrensbegleitenden Überprüfung während der Konjugatherstellung. Das andere eingesetzte Verfahren ist die Verwendung eines Refraktionsindexsignals als Maß für die Masse des Analyten, ebenfalls geeicht mit einer Standardlösung des interessierenden Polysaccharids. Obwohl der kolorimetrische Assay zur Überprüfung des Polysaccharidgehalts der Proben während der Derivatisierung und des Konjugationsprozesses eingesetzt wird, wird das letztere Verfahren während der physikalischen Charakterisierung der Polysaccharid-Präparation durch HPSEC-Universalkalibrierungsanalyse und zur Berechnung des Antigenizitätsindexes eingesetzt. Dem rohen Ausgangs-Pn-Ps wird ein Antigenizitätsindexwert von 1,0 zugeordnet. Ein Index der relativen Antigenizität wird für Versuchsproben berechnet und ein Wert von 0,4–1,1 wird als zufriedenstellend betrachtet. Es ist möglich, einen Antigenizitätsindex von größer als 1,0 zu bekommen, wenn das Polysaccharid während der Hydrolyse und dem Fraktionierungsschritt erheblich gereinigt wird. Es ist auch theoretisch möglich, daß die Größenreduktion allein den Antigenizitätsindex einer Präparation erhöhen könnte, indem die Flexibilität der Polysaccharidmoleküle erhöht und somit die sterische Hinderung um die antigenen Epitope verringert wird. Diese Bestimmungen erfolgen als verfahrensbegleitende Prüfung auf hydrolysierte, fraktionierte und derivatisierte Ps-Proben. Proben, die relative Antigenizitäten von < 0,4 aufweisen, werden verworfen, d. h. nicht konjugiert. Es stehen Anti-Pn-Ps-Antikörper-Präparationen zur Verfügung, welche zur Charakterisierung von Pneumokokken-Polysacchariden geeignet sind. Bezugsquellen von Anti-Pn-Ps-Antikärpern schließen die Health Research Inc., Albany, N. Y., und das Staten Serum Institute ein. Alternativ können typenspezifische Anti-Pn-Ps-Antikörper für diesen Zweck nach im Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden unter Verwendung von im Handel erhältlichen rohen Pn-Ps als Immunogen [Baker et al., Immunology 20, 469 (1971); Brooke, M. S., J. Immunol., 95, 358 (1966); Kearney, R., und Halladay, W. J., Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci., 48, 227(1970); Schneerson, R., et al., Prag. Allergy, 33, 144 (1983); Robbins, J. B., Infect. Immun., 26, 1116 (1979)].
Ein weiteres Indiz für erhalten gebliebene Antigene Integrität ist die Beibehaltung der korrekten chemischen Zusammensetzung der Pn-Ps-Präparation. Beispielsweise weist Pn6B-Ps eine sich wiederholende Einheit von [α-Gal(1-3)-α-Glu(1-3)-α-L-Rhap(1-4)-D-Ribit-5-(PO₄(2)] auf, so daß das Molverhältnis der Kohlenhydratkomponenten Ribit:Rhamnose:Galactose:Glucose etwa 1:1:1:1 beträgt Dieses Verhältnis kann beispielsweise nach der Hydrolyse des Polysaccharids mit 36%iger Fluorwasserstoffsäure für etwa 2 Stunden bei 45–65°C, gefolgt von 2 M Trifluoressigsäure für 10–20 Stunden bei 100°C und Hochleistungs-Anionenaustauschchromatographie mit gepulstem amperometrischem Nachweis bestimmt werden. Vier Peaks, die etwa gleiche Molmengen der Kohlenhydratkomponenten repräsentieren, sind somit ein Indiz für die erhalten gebliebene Integrität. Im wesentlichen theoretische Verhältnisse der Kohlenhydratkomponenten bleiben für alle neuen Pn-Ps-Verbindungen dieser Erfindung innerhalb von etwa 20% erhalten. Die Abweichungen von den theoretischen Werten sind in erster Linie auf methodische Grenzen zurückzuführen. Somit hat nach einer Gesamthydrolyse Pn23F-Ps ein Verhältnis von etwa Glycerin:Rhamnose:Galactose:Glucose = 1:2:1:1;
Pn14-Ps ein Verhältnis von etwa N-Acetylglucosamin:Galactose:Glucose = 1:2:1;
Pn19F-Ps ein Verhältnis von etwa Rhamnose:N-Acetylmannosamin:Glucose = 1:1:1;
Pn18C-Ps ein Verhältnis von etwa Glucose:Galactose:Rhamnose:Glycerin:Acetat = 3:1:1:1:1;
Pn9V-Ps ein Verhältnis von etwa Glucose:Galactose:N-Acetylmannosamin:Glucuronsäure: Galacturonsäure:Acetat = 2:1:1:1:1:1,7; und
Pn4-Ps ein Verhältnis von etwa N-Acetylmannosamin:N-Acetylfucosamin:Galactosamin: Galactose:Pyruvat = 1:1:1:1:1.
Ferner wurde kürzlich festgestellt, daß Pn4-Ps eine weitere Komponente enthält, identifiziert durch HPLC-Analyse, welche 2-Aminopneumosamin (2-Amino-2,6-didesoxytalose) zu sein scheint, ebenso Pn5-Ps [Barker et al., Carbohydrate Res., 224–233 (1966)]. Pn19F-Ps besitzt ebenfalls eine weitere Komponente, wahrscheinlich ein Hexosamin, das in der Literatur noch nicht erwähnt wurde und wofür eine definitive Identifizierung noch aussteht. Diese und weitere theoretische Zusammensetzungen von Polysaccharid-Repeats werden in den folgenden Referenzen angegeben: J. E. G. van Dam et al., Carbohyd. Res. 187, 267 (1988); H. J. Jennings, Adv. Carbohyd. Chem. 41, 155 (1983) und die dort angegebenen Referenzen; J. C. Richards und M. Perry, Biochem. Cell. Biol. 66, 758 (1988). Neben den Kohlenhydratkomponenten gibt es bei mehreren der interessierenden Pn-Ps Phosphat-, Acetat- und Pyruvat-Seitengruppen, wobei einige davon immunodominante Merkmale sind. Als solche können diese Komponenten auch nachgewiesen werden (siehe Beispiel 30). Die quantitative Bestimmung von Monosacchariden ist auch ein brauchbares Mittel zur quantitativen Bestimmung der Polysaccharidkonzentration einer Probe.
Ein weiteres Element bei der Antigenizität der vorliegenden Polysaccharide ist die Erhaltung dessen, was als ”Konformationsepitop” in dem Polysaccharid bezeichnet worden ist [siehe z. B. Wessels, M. R., und Kasper, D. L., J. Exp. Med., 169, 2121–2131 (1989)]. Dieses Niveau der Antigenizität scheint nur in hochmolekularen Formen des Saccharids Ausdruck zu finden, und die hier beschriebenen Verfahren sind auch auf die Erhaltung dieses Niveaus der Polysaccharid-Immogenizität gerichtet
iii. Minimale Verunreinigung durch C-Polysaccharid:
Ein weiterer kritischer Parameter ist der Grad der Verunreinigung durch C-Polysaccharid. Dieser Wert kann bestimmt werden durch vollständige Säurehydrolyse einer Polysaccharid-Präparation, Chromatographie des Hydrolysats und konduktometrischen Nachweis von Cholin [Hermans et al., Red. Trav. Chim. Pays-Bas, 107, 600 (1988)]. Alternativ kann das unhydrolysierte Polysaccharid mittels NMR hinsichtlich Cholin analysiert werden. Die NMR Technik setzt das Verhältnis des Cholinsignals zum Rhamnosemethylsignal (für Pn-Ps, die eine Rhamnose enthalten; ein anderes Signal für andere Pn-Ps) zur Berechnung des C-Ps-Gehalts ein. Das chromatographische Verfahren setzt entweder das Verhältnis des Cholinsignals zum Polysaccharidgehalt, bestimmt durch konduktometrischen Assay, oder das Verhältnis des Cholinsignals zu einem der Pn-Ps-Komponenten-Peaks ein, um den C-Ps-Gehalt zu berechnen. Bei jedem Verfahren erlauben Standards bekannter Konzentrationen an Cholin die direkte Berechnung des in einer Polysaccharid-Präparation vorhandenen Cholinniveaus, unter Heranziehung der theoretischen Wiederholungsstruktur von C-Ps [Hermans et al., vollst. Referenz siehe oben] wird die Konzentration von C-Ps in einer Polysaccharid-Präparation bestimmt Polysaccharidkonzentrationen von Pn-Ps-Proben werden nach im Stand der Technik bekannten Verfahren gemessen. Beispielsweise kann durch vollständige Hydrolyse des Polysaccharids und Messung der Konzentration eines spezifischen Monosaccharids die Gesamtpolysaccharid-Konzentration bestimmt werden. Durch Vergleich der C-Ps-Konzentration mit der Gesamtpolysaccharid-Konzentration wird der Grad der Verunreinigung durch C-Polysaccharid (Gew./Gew.) bestimmt. C-Polysaccharid-Niveaus von weniger als 3% (Gew./Gew.) des Gesamtpolysaccharids werden als annehmbar betrachtet, jedoch noch bevorzugter sind Niveaus von weniger als 1%.

Die chemischen und physikalischen Eigenschaften von zwei Pn6B-Ps-Chargen und zwei Pn23F-Ps-Chargen sind in Tabelle I unten zusammengefaßt. Diese Daten demonstrieren die Reproduzierbarkeit der Parameter von einer Charge zur anderen, welche aus dem neuen, hier beschriebenen Verfahren resultiert TABELLE I Charakteristische Eigenschaften von hydrolysierten und fraktionierten Pn-Ps

Pn-Ps-Präparation	6B-1	6B-2	23F-1	23F-2
Endviskosität	1,094	1,147	1,350	1,376
Kd (HPSEC)	0,62	0,62	0,49	0,49
Kd (CL-2B)	0,64	0,60	0,41	n. b.
Monosaccharid	S	S	S	S
Antigenizität
Ouchterlony	S	S	S	S
Nephelose	S	S	S	S
(Phenol:Schwefelsäure)	S	S	S	S
S: Zufriedenstellend

In der folgenden Tabelle II sind chemische und physikalische Parameter verschiedener roher Pneumokokken-Polysaccharide und der korrespondierenden neuen hydrolysierten und fraktionierten (hyd. + frak.) Verbindungen dieser Erfindung angegeben. Die angegebenen Zahlen sind Näherungswerte innerhalb des Versuchsfehlers und der Nachweisgrenzen für die hergestellten komplexen Polysaccharidverbindungen.
2. Charakterisierung des neuen Pn-Ps-PRO-Konjugats:
i. Analyse der Identität und Quantität von Pn-Ps:
Es ist sehr nützlich, die Quantität und chemische Integrität von Pn-Ps in einem Endkonjugat durch eine unabhängige Technik zu verifizieren, um die Antigenizität (Integrität) sicherzustellen und das Pn-Ps/PRO-Verhältnis zu berechnen. Ein Verfahren beinhaltet die vollständige Hydrolyse unter Einsatz von 2 M TFA bei 100°C für 5–16 h, je nach der optimalen Hydrolysezeit für jedes spezielle Pn-Ps. Gleiche Mengen von Pn-Ps-PRO-Konjugat und PRO-Hydrolysat (auf der Basis von Lowry-Protein) werden durch Hochleistungs-Anionenaustauschchromatographie mit gepulstem amperometrischem Nachweis analysiert, um Monosaccharid-Profile zu erhalten. Zur Korrektur bezüglich der von PRO beigesteuerten Monosaccharide, z. B. aus in OMPC vorhandenem Lipopolysaccharid (LPS), wird das Profil von PRO von dem Profil des Pn-Ps-PRO-Konjugats unter Einsatz geeigneter Computer-Software wie dem Nelson-Programm „subtrahiert”. Die Menge des Pn-Ps im Konjugat wird dann berechnet durch Vergleich des Profils der bekannten Menge des derivatisierten Pn-Ps-Hydrolysats und der korrigierten Pn-Ps-PRO-Konjugate. Das Pn-Ps/PRO-Verhältnis wird ebenfalls auf diese Weise gemessen.
ii. Analyse hinsichtlich neuer Aminosäuren, welche Konjugation und Versehung mit Endgruppen anzeigen
Nach der Konjugation von Pn-Ps mit PRO werden Proben des Konjugats in 6 N HCl hydrolysiert und einer Aminosäureanalyse unterworfen. Dieses Verfahren weist die Anwesenheit und die Menge einmaliger Aminosäuren wie S-Carboxymethylhomocystein (S-CMHC) und S-Carboxymethylcysteamin (S-CMCA) nach. Die erstere Aminosäure wird als Teil der chemischen Verknüpfung durch die chemische Reaktion zwischen derivatisiertem Pn-Ps und PRO, wie im folgenden Verfahrensabschnitt beschrieben, gebildet und wird als definitiver Beweis der kovalenten Verknüpfung von derivatisiertem Pn-Ps mit PRO betrachtet. Die Bildung einer solchen kovalenten Verknüpfung ist für die T-Zell-Immunogenizität des Konjugat-Vakzins essentiell. Unmittelbar nach Beendigung der Konjugat-Reaktion werden nicht umgesetzte Bromacetamidgruppierungen mit N-Acetylcysteamin-Endgruppen versehen. Die Hydrolyse dieser Verknüpfung resultiert in der Freisetzung von S-Carboxymethylcysteamin (S-CMCA), das auch bei der Aminosäureanalyse nachgewiesen wird. Der Nachweis dieser Aminosäure bestätigt das erfolgreiche Versehen der reaktiven Bromacetamidgruppen mit Endgruppen, was sie somit für etwaige unerwünschte chemische Reaktionen nicht mehr verfügbar macht. Akzeptable Niveaus an Kovalenz und Endgruppen liegen zwischen etwa 1–15% für S-CMHC/Lys und etwa 0–5% für S-CMCA/Lys.
iii. Analyse des aluminiumhydroxid-adsorbierten Vakzins:
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Pn-Ps-PRO-Konjugat an Aluminiumhydroxid (Aluminiumoxid, Al(OH)₃-Gel (siehe Abschnitt C. unten)) adsorbiert, was zu einer Potenzierung der Immunantwort auf das Vakzin führt. Andere mögliche Vakzin-Formulierungen umfassen die Formulierung in physiologisch annehmbaren Verdünnungsmitteln und die Verwendung anderer Adjuvanzien, Immunmodulatoren oder inerter Trägerstoffe als das Aluminiumhydroxidgel. Die Analyse dieses aluminiumoxid-adsorbierten Materials wird wie folgt durchgeführt.
Das aluminiumoxid-adsorbierte Pn-Ps-PRO kann hinsichtlich Zusammensetzung und Stabilität nach der Desorption des Konjugats von Alaun analysiert werden. Dies wird erreicht durch Dialyse des aluminiumoxid-adsorbierten Pn-Ps-PRO gegen eine 3%ige Natriumcitratlösung für 16 h bei Raumtemperatur. Das resultierende lösliche Aluminiumcitratsalz wandert aus der Dialysemembran und läßt das Pn-Ps-PRO zurück. Dieses Verfahren ist von Bedeutung, um zu bestätigen, daß sich die korrekte Menge an Pn-Ps-PRO in der aluminiumoxid-adsorbierten Formulierung befindet. Jedoch enthalten einige Formulierungen wie Pn6B-Ps-OMPC und Pn23F-Ps-OMPC 10, 5, 2 und 1 μg Pn-Ps/ml (siehe Abschnitt C. unten), Konzentrationen deutlich unterhalb chemischer Nachweisverfahren. Um deshalb Analysen der Kohlenhydratzusammensetzung durchzuführen, werden die adsorbierten Pn-Ps-OMPC-Vakzine zuerst pelletiert, um die wäßrige Flüssigkeit zu entfernen, und das Pellet wird vor der Citratlösung in einem Fünftel des ursprünglichen Volumens resuspendiert. Nach der Dialyse liegt das solubilisierte Pn-Ps-OMPC mit 50, 25, 10 und 5 μg Pn-Ps/ml vor. Diese Konzentrationen sind dann sowohl einer Pn-Ps- als auch Proteinanalyse zugänglich, um die Dosierungsniveaus zu bestätigen.
Citrat-desorbierte Proben werden auch hinsichtlich der möglichen Anwesenheit von freiem Pn-Ps analysiert, ein Gesichtspunkt, der für die Immunogenizität und Einheitlichkeit der Produktion bedeutsam ist. Diese Analyse wird durchgeführt mittels Chromatographie auf einer SEPHAROSE CL-2B- oder SEPHACRYL S1000SF-Größenfraktionierungssäule, worin Pn-Ps-OMPC von Pn-Ps abgetrennt werden kann. Die Anwesenheit und Menge des freien Pn-Ps wird als Antigen durch Geschwindigkeitsnephelometrie gemessen. Der Grad der Verunreinigung des Pn-Ps-OMPC durch freies Pn-Ps beträgt weniger als 15% des insgesamt vorhandenen Pn-Ps.
iv. Pyrogen-Test: Abwesenheit von signifikanter Pyrogenizität:
Das Konjugatprodukt dieser Erfindung wird hinsichtlich der Abwesenheit nachteiliger Temperaturerhöhungseffekte getestet. Konjugatprodukte wurden nach dem hier offenbarten Verfahren hergestellt und befunden, annehmbare Niveaus an Pyrogenizität aufzuweisen.
Methode (IV)
Das Pn-Ps-Konjugat-Vakzin wird getestet wie in 21 CFR, Abschnitt 610.13(b) beschrieben.
1) Methode (IM)
Ein zweites Maß für die Pyrogenizität ist der Kaninchen-IM-Test. Dieser Test ahmt den Einsatz des Produkts in der Klinik besser nach und reflektiert unserer Meinung nach genauer die scheinbare Endotoxinbelastung des Produkts.
Jedes Kaninchen erhält 1,0 ml Vakzin durch intramuskuläre Injektion. Der Test wird mit mindestens drei Kaninchen durchgeführt. Die Temperatur wird 5 h lang nach der Injektion überwacht. Andere Testmethoden sind wie in 21 CFR Abschnitt 610.13(b) beschrieben (Die Testdosis basiert auf der Polysaccharidkonzentration).
v. Art der kovalenten Verknüpfung:
Die Pn-Ps-PRO-Konjugate, wie z. B. Pn-Ps-OMPC oder Pn-Ps-MIEP, können durch bigenerische Abstandhalter gekoppelt werden, die eine Thioethergruppe und ein primäres Amin enthalten, welche hydrolytisch labile kovalente Bindungen mit dem Polysaccharid und dem PRO, wie z. B. OMPC oder MIEP, bilden. Bevorzugte Konjugate gemäß dieser Erfindung sind diejenigen, welche durch die Formeln Pn-Ps-A-E-S-B-PRO oder Pn-Ps-A'-S-E'-B'-PRO dargestellt werden können. A-E-S-B und A'-S-E'-B' stellen bigenerische Abstandhalter dar, welche hydrolytisch stabile kovalente Thioetherbindungen enthalten und welche kovalente Bindungen (wie hydrolytisch labile Ester- oder Amidbindungen) mit den Makromolekülen PRO und Pn-Ps bilden. In dem Abstandhalter A-E-S-B ist S Schwefel; E ist das Transformationsprodukt einer thiophilen Gruppe, die mit einer Thiolgruppe umgesetzt wurde, und wird repräsentiert durch
worin R H oder CH₃ darstellt und p 1 bis 3 ist; A ist
worin W O oder NH ist, m 0 bis 4 ist, n 0 bis 3 ist und Y CH₂, O, S, NR' oder CHCO₂H darstellt, wobei R' H oder C₁- oder C₂-Alkyl ist, so daß, falls Y CH₂ ist, m und n nicht beide gleich Null sein können und falls Y O oder S ist, m größer als 1 und n größer als 1 ist; B ist
worin q 0 bis 2 ist, Z NH₂,
COOH oder H darstellt, wobei R' und p wie oben definiert sind und D
oder
ist.
In dem Abstandhalter A'-S-E'-B' ist S Schwefel; A' ist
worin a 1 bis 4 ist und R'' CH₂ oder
darstellt, wobei Y' NH₂ oder NHCOR' ist, und W, p und R' wie oben definiert sind, und E' ist das Transformationsprodukt einer thiophilen Gruppe, die mit einer Thiolgruppe umgesetzt wurde, und wird repräsentiert durch
worin R wie oben definiert ist, und B' ist
oder E' ist
und B' ist
worin p 1 bis 3 ist. Ferner sind von den bigenerischen Abstandhaltern A-E-S-B und A'-S-E'-B' die E-S-B- und A'-S-E'-Komponenten bestimmbar und quantifizierbar, wobei diese Identifizierung die Kovalenz der Konjugatbindung reflektiert, welche die Seite des Thioetherschwefels, welche von dem kovalent modifizierten Polysaccharid stammt, mit der Seite des Abstandshalters, welche von dem funktionalisierten Protein stammt, verknüpft.
Die Konjugate Pn-Ps-A-E-S-B-PRO gemäß dieser Erfindung können Abstandhalter enthalten, deren Komponenten u. a. Derivate einschließen von:
Kohlendioxid, 1,4-Butandiamin und S-Carboxymethyl-N-acetylhomocystein; Kohlendioxid, 1,5-Pentandiamin und S-Carboxymethyl-N-acetylhomocystein; Kohlendioxid, 3-Oxa-1,5-pentandiamin und S-Carboxymethyl-N-acetylhomocystein; Kohlendioxid, 1,4-Butandiamin und S-Carboxymethyl-N-acetycystein; Kohlendioxid, 1,3-Propandiamin und S-Carboxymethyl-N-benzoylhomocystein; Kohlendioxid, 3-Aza-1,5-pentandiamin und S-Carboxymethyl-N-acetylcystein; Kohlendioxid, 1,2-Ethandiamin, Glycin und S-(Succin-2-yl)-N-acetylhomocystein. Die Konjugate Pn-Ps-A'-S-E'-B'-PRO gemäß dieser Erfindung können Abstandhalter enthalten, deren Komponenten u. a. Derivate einschließen von:
Kohlendioxid und S-Carboxymethylcysteamin; Kohlendioxid und S-(α-Carboxyethyl)cysteamin; Kohlendioxid und S-Carboxymethylhomocysteamin; Kohlendioxid, S-(Succin-2-yl)cysteamin und Glycin; Kohlendioxid und S-Carboxymethylcystein.
B. Verfahren zur Herstellung neuer Pn-Ps-Zwischenprodukte und Pn-Ps-PRO-Konjugate:
Bei der Offenbarung dieses Verfahrens werden mehrere Stufen gesondert beschrieben:
I. Polysaccharid-Herstellung:

a) Isolierung von rohem Pneumokokken-Polysaccharid, Pn-Ps;
b) partielle Hydrolyse oder mechanische Scherung des rohen Pn-Ps;
c) Fraktionierung des partiell hydrolysierten Pn-Ps nach Größe und Reinheit;

II. Konjugation:

a) Funktionalisierung des fraktionierten Pn-Ps, um den elektrophilen oder nukleophilen Reaktanten Pn-Ps* zu bilden, vorzugsweise um etwa 21 reaktive Bromacetylgruppen pro 100 sich wiederholender Pn-Ps-Oligosaccharideinheiten aufzuweisen;
b) Isolierung des immunogenen Proteins (PRO), vorzugsweise des Neisseria meningitidis B-OMPC oder einer Untereinheit davon;
c) Funktionalisierung des PRO, um den nukleophilen oder elektrophilen Reaktanten PRO* zu bilden, vorzugsweise OMPC oder eine Untereinheit davon, wie z. B. MIEP, um reaktive Sulfhydrylgruppierungen aufzuweisen;
d) Konjugation des Polysaccharids (Pn-Ps*) von Schritt (a) mit dem Protein (PRO*) von Schritt (c);
e) Versehen des Pn-Ps-PRO-Konjugats mit Endgruppen, um restliche funktionelle Gruppen zu eliminieren;
f) Isolierung des Konjugatprodukts.

I.a.) Isolierung von rohem Pneumokokken-Polysaccharid, Pn-Ps:
Pneumokokken-Kapselpolysaccharide unterscheiden sich in chemischer und antigener Hinsicht aufgrund der Zusammensetzung und der Verknüpfung der sich wiederholenden Oligosaccharideinheit des gegebenen Kapselpolysaccharid-Serotyps. Die Isolierung der Polysaccharide muß je nach den charakteristischen physikalischen Eigenschaften des gegebenen Polysaccharids auf etwas verschiedene Weise ablaufen. Im allgemeinen werden jedoch nach bekannten Verfahren [Beispiel 3 und Williams, C. A., und Chase, M. W., Methods in Immunology and Immunochemistry, Bd. I, Academic Press (1967)] die Bakterien gezüchtet und das Pn-Ps gewonnen, während die Pathogene selbst von der ATCC erhältlich sind. Kurz gesagt, im Anschluß an eine Großkultur der Bakterien in geeigneten Nährmedien, die bekannterweise das Pneumokokken-Wachstum unterstützen, wird ein Bakterizid wie Phenol oder Toluol zur Abtötung der Organismen zugegeben (Beispiel 3).
Anschließend wird eine Alkoholfraktionierung des Polysaccharids in zwei Stufen durchgeführt. In der ersten Stufe wird eine niedrige Alkoholkonzentration eingesetzt, um Zelltrümmer und andere unerwünschte Verunreinigungen auszufällen, während das rohe Pn-Ps in Lösung verbleibt. Eine nachfolgende Zugabe von mit Wasser mischbarem Alkohol auf eine vorherbestimmte Konzentration fällt die Kapselpolysaccharide aus, während weitere Verunreinigungen in der Überstandsflüssigkeit zurückgelassen werden. Einer erneuten Suspension in einem wäßrigen Medium folgt die Entfernung kontaminierender Proteine und Nukleinsäuren nach bekannten Verfahren wie Nukleaseverdauung oder proteolytische Verdauung oder Lösungsmittelextraktion. Das rohe Polysaccharid wird durch Alkoholfällung gewonnen und getrocknet, um ein Pulver des rohen Pn-Ps zu bilden (Beispiel 3).
I.b) Partielle Hydrolyse oder mechanische Scherung des rohen Pn-Ps:
Rohes Polysaccharid, im wesentlichen wie oben beschrieben hergestellt [siehe auch Beispiel 3 unten], wurde in unkonjugiertem Zustand eingesetzt, um Pneumokokken-Vakzine zu formulieren, die zur Verwendung bei Erwachsenen und Kindern im Alter von über zwei Jahren bestimmt sind. Die folgenden Verfahrensschritte ergeben ein neues, partiell hydrolysiertes, gereinigtes Pn-Ps-Produkt mit einmaligen und definierten chemischen und physikalischen Eigenschaften (siehe Tabelle II), das zur Herstellung von Konjugat-Vakzinen geeignet ist. Die Größenreduktion des rohen Pn-Ps trägt zum Erfolg der anschließenden Reinigungsschritte bei, um ein hochgereinigtes Pn-Ps-Produkt zu ergeben. Bei Verwendung zur Herstellung von Konjugaten ist darüber hinaus die Konjugation effizienter, wenn das neue Pn-Ps dieser Erfindung eingesetzt wird. Dies liegt daran, daß wäßrige Lösungen des rohen Polysaccharidmaterials hochviskos und schlecht löslich sind und dessen Konjugate weitgehend unlöslich und unfiltrierbar sind. Der Konjugationsprozeß selbst ist schwierig durchzuführen, was zu einer niedrigen Ausbeute an Konjugat führt Ferner wird die Abtrennung von unkonjugiertem Pn-Ps von dem Endkonjugat erleichtert, wenn das Pn-Ps vor der Konjugation eine verringerte Größe und Viskosität und verbesserte Löslichkeit aufweist. Dies ist insofern erheblich, als es die Anwesenheit von freiem Pn-Ps in Konjugat-Präparationen schwierig macht, die tatsächliche Dosis an verabreichtem Konjugat-Pn-Ps abzuschätzen, und nachdem es das konjugierte Pn-Ps ist, welches die signifikante T-Zell-stimulierende Wirkung besitzt, bedeutet die Anwesenheit von unkonjugiertem Pn-Ps eine Verminderung des immunologisch ”relevanten” Pn-Ps.
Das wie oben hergestellte, trockene, rohe Kapselpolysaccharid kann auch vor oder nach der partiellen Hydrolyse gereinigt werden, z. B. durch Anionenaustauschchromatographie oder ein anderes chromatographisches Verfahren, wie in Beispiel 6 für Pn14-Ps gezeigt. Die chromatographische Adsorption-Desorption kann entweder positiv oder negativ angewandt werden. Im positiven Modus wird das Pn-Ps an das Harz adsorbiert, wobei Verunreinigungen in der Lösung zurückgelassen werden, welche vor der Pn-Ps-Desorption weggewaschen werden. Im negativen Modus werden Verunreinigungen aus der Pn-Ps-Lösung adsorbiert und verworfen, was das Pn-Ps in der Lösung in gereinigtem Zustand zurückläßt. Alternativ kann das Pn-Ps direkt einer partiellen thermischen Hydrolyse, wie in Beispiel 4 für Pn6B-Ps gezeigt, oder einer Beschallungshydrolyse, wie in Beispiel 6 für Pn14-Ps gezeigt, unterworfen werden. Andere Hydrolysemittel, z. B. chemische, enzymatische oder physikalische (z. B. eine Hochdruckzelle), sind ebenfalls bekannt.
Die partielle Hydrolyse erfolgt durch eine limitierte thermische Behandlung in einem wäßrigen Medium, vorzugsweise bei 50 bis 110°C für etwa 1 Stunde bis etwa 48 Stunden. Alternativ wird eine limitierte Schallbehandlung mit hoher Energie von 5 Sekunden bis 5 Minuten so oft wie erforderlich, mit Abkühlperioden, wiederholt, um die gewünschte Viskosität oder den gewünschten K_d-Endpunkt zu erreichen. Das Verfahren der Beschallungshydrolyse ist der thermischen Hydrolyse für Polysaccharide mit komplexen Strukturen (siehe unten) vorzuziehen. Andere im Stand der Technik bekannte geeignete Mittel, um eine partielle Hydrolyse von Polysacchariden zu bewirken, sind ebenfalls anwendbar. Beispielsweise kann eine limitierte chemische Hydrolyse mit Säure, endolytische Enzymbehandlung oder physikalische Scherung in einem Mischer oder einer Mühle ebenfalls zur Verringung der mittleren Kettengröße des Pn-Ps eingesetzt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Pn-Ps mittels Passage durch einen Homogenisator bei einer Temperatur zwischen etwa 0°C und 30°C und Drücken zwischen etwa 13,8 MPa und 103 MPa (2000 psi und 15000 psi) einer physikalischen Scherung unterworfen, so vorherbestimmt, daß sich ein Pn-Ps-Produkt mit den erwünschten Eigenschaften hinsichtlich Größe, Polydispersität und Antigenizität (siehe Beispiel 10) ergibt.
Ein Ziel-Endpunkt der Hydrolyse, günstig durch Lösungsviskosität oder durch Hochleistungs-Größenausschlußchromatographie gemessen, wird für jedes Polysaccharid in einem Pilotmaßstab so vorherbestimmt, daß die Antigenizität des Polysaccharids nicht eliminiert wird. Wie oben erörtert, wird eine nominale Fähigkeit zur Bindung von typenspezifischem Anti-Pneumokokken-Antikörper, die nicht weniger als 70% der gezeigten Bindung für eine gleiche Konzentration des rohen Pn-Ps-Ausgangsmaterials beträgt, als zufriedenstellend betrachtet. Dies bedeutet nicht, daß nicht Pn-Ps mit wesentlich niedrigerem M_N, M_W oder niedrigerer Anzahl sich wiederholender Einheiten pro Molekül (Tabelle II) nach diesem Verfahren hergestellt werden könnten und solche Pn-Ps, welche nicht in der Lage sein mögen, oberhalb der 70%-Ausschlußgrenze zu reagieren, welche oben für den Geschwindigkeitsnephelometrie-Assay festgelegt wurde, nach einer Konjugation in Tieren immunogen sein könnten. Dies bedeutet, daß Pn-Ps mit niedrigem Molekulargewicht trotz der Abwesenheit einer nenneswerten Fähigkeit zur Bindung von typenspezifischem Anti-Pn-Ps-Antikörper in konjugiertem Zustand von dem Immunsystem des Säugers erkannt werden könnten und eine gute typenspezifische Anti-Pneumokokken-Antwort hervorgerufen werden könnte. In diesem Fall sollte der Begriff durch den Begriff ”immunogen” als operatives Kriterium zur Akzeptanz oder Verwerfung einer gegebenen Pn-Ps-Präparation ersetzt werden. In der Praxis ist es jedoch am bequemsten, statt der in vivo-Immunogenitätsparameter die in vitro-Antigenizitätsparameter zur Verfahrenskontrolle zu verwenden.
Im allgemeinen ist dasselbe Größenreduktionsverfahren auf die meisten Polysaccharide anwendbar. Während das Pn6B-Ps jedoch nach längerer thermischer Größenreduktion seine Antigenizität behält, kann Pn23F-Ps seine strukturelle Integrität verlieren (Entfernung der Glycerin-Phosphat-Seitenketten) und erfordert die sanftere Größenreduktion, welche mittels Schall oder physikalischer Scherung erzielt werden kann. Physikalische Scherung, z. B. in einem Gaulin-Homogenisator, ist aus mehreren Gründen ein bevorzugtes Verfahren. Erstens ist das Verfahren einer Anwendung in größerem Maßstab zugänglich. Zweitens erfordern die Verfahren der Beschallungs- und thermischen Hydrolyse im allgemeinen eine nachfolgende Fraktionierung des hydrolysierten Pn-Ps, um Polydispersitäten im Bereich zwischen 1,0 und 1,5 zu erzielen. Das Verfahren der physikalischen Scherung ergibt jedoch im allgemeinen ein Pn-Ps-Produkt mit einer Polydispersität, die ohne weitere Fraktionierung in diesen Bereich fällt, obwohl erforderlichenfalls eine Fraktionierung eingesetzt werden kann, um zusätzliche Reinheitssteigerungen und Verminderungen der C-Ps-Verunreinigung zu erzielen. Drittens kann das Verfahren der physikalischen Scherung im Vergleich zu den Mitteln der thermischen Hydrolyse oder Beschallungshydrolyse den Vorteil einer größeren Reproduzierbarkeit für jedes gegebene Pn-Ps aufweisen. Viertens scheint das Verfahren der physikalischen Scherung einen gewissen Vorteil bei der Herstellung des Pn-Ps-Produkts zu bieten, welches für eine gegebene Größe mehr Antigenizität behält als ein Pn-Ps derselben Größe, welches durch Beschallungshydrolyse oder thermische Hydrolyse erzeugt wurde.
Die Viskosität, die zum mittleren Pn-Ps-Molekulargewicht in Beziehung steht, ist ein bequemer Prozeßparameter zur Überwachung und kann während der Hydrolyse leicht verfolgt werden, um den Grad der Größenreduktion zu limitieren und zu kontrollieren. Chemisch und physikalisch nicht unterscheidbare Chargen von Pn6B-Ps und Pn23F-Ps wurden einfach hergestellt durch Größenreduktion des Polysaccharids auf eine einheitliche Ziel-Endviskosität (siehe Tabelle I oben). Ein solcher Einsatz von verfahrensbegleitenden Vskositätsmessungen ist auf ein breites Spektrum von rohen Polysacchariden anwendbar, was deren hydrolytische Größenreduktion ohne Änderung der antigenen Eigenschaften der resultierenden Pn-Ps erlaubt Wie oben geschildert, wird die Retention der Antigenizität leicht festgestellt, z. B. durch einen Ouchterlony-Doppelimmundiffusions-Assay, Geschwindigkeitsnephelometrie oder andere im Stand der Technik bekannte Verfahren.

Ziel-Endviskositäten für Lösungen von 1 mg/ml verschiedener Pn-Ps-Präparationen in 0,9% Natriumchlorid (Salzlösung) sind in Tabelle III unten angegeben. Ähnliche Werte sind für Pn-Ps, die von anderen Pneumokokken-Subtypen stammen, geeignet TABELLE III Lösungsviskosität für rohe und hydrolysierte Pn-Ps:

Pn-Ps-Subtyp	Viskosität von rohem Pn-Ps	Ziel-Endviskosität
	(Zentistokes)	(Zentistokes)
Pn4-Ps	1,8	1,5–1,00
Pn6-Ps	1,4	1,3–1,00
Pn9V-Ps	1,4	1,3–1,00
Pn14-Ps	1,2	1,1–0,95
Pn18C-Ps	2,0	1,5–1,00
Pn19F-Ps	1,4	1,3–1,00
Pn23F-Ps	1,6	1,5–1,00

Bei einigen Pneumokokken-Polysacchariden ist es vorteilhaft, einen zusätzlichen Reinigungsschritt wie einen Ionenaustauschschritt vor oder nach der partiellen Hydrolyse einzuschließen. Im Falle von Pn14-Ps erfolgt dieser Schritt durch eine diskontinuierliche Adsorption von anionischen Verunreinigungen an Whatman DE52-Harz vor der partiellen Beschallungshydrolyse. Das Polysaccharid, das bei dem leicht sauren ph-Wert der Behandlung neutral ist, wird als Überstandsfraktion bereit zur Hydrolyse gewonnen.
Die Molekulargewichtswerte für Pn6B-Ps-Präparationen betragen etwa 900 Kilodalton (kD) vor und etwa 300 kD nach der Größenreduktion und Fraktionierung. Für Pn23F-Ps betragen die jeweiligen Werte etwa 1000 kD oder mehr davor und etwa 400–500 kD danach. Somit ist eine Reduktion der Pn-Ps-Größe auf etwa 500 plus-minus etwa 300 Kilodalton ein angemessenes Ziel für diese Phase des Verfahrens für jeden Pn-Ps-Subtyp.
Eine erneute Fällung des partiell hydrolysierten Materials mit vorherbestimmten Alkoholkonzentrationen erlaubt die Gewinnung und weitere Reinigung des partiell hydrolysierten Pn-Ps wie im Unterabschnitt (c) unten beschrieben.
I.c) Fraktionierung der partiell hydrolysierten Pn-Ps nach Größe und Reinheit:
Die Polydispersität einer Pn-Ps-Präparation weist nicht nur auf die Varianz der Kettenlänge des subtypenspezifischen Pn-Ps hin, sondern zeigt auch an, daß gruppenspezifisches C-Polysaccharid sowie andere Verunreinigungen in der Pn-Ps-Präparation verbleiben können. Wie oben festgestellt, ist eine Verunreinigung durch restliches C-Polysaccharid nicht nützlich und kann sogar mit negativen Immunantworten in Zusammenhang stehen.
Die Auswahl eines engen Bereichs der mittleren Polysaccharid-Molekülgröße (verringerte Polydispersität) wird günstig erzielt durch differentielle Alkohollöslichkeit, z. B. Ethanol- und vorzugsweise Isopropanol(IPA)-Löslichkeit, nach der Größenreduktion. Die Grundlage dieser Selektion ist, daß für eine gegebene Pn-Ps-Präparation die Alkohollöslichkeit umgekehrt proportional zur Kettenlänge ist, welche wiederum proportional zum Molekulargewicht ist. So wurde das Verfahren erfolgreich angewandt, um quantitativ Molekülpopulationen mit einheitlicher Größe und mit signifikant verbesserter Homogenität gegenüber den größenreduzierten Ausgangs-Pn-Ps zu isolieren. Eine verfahrensbegleitende Kontrolle von IPA-Fraktionierungen wird ermöglicht durch die Durchführung eines Pilotexperiments, um den IPA-Bereich, in dem das Pn-Ps ausfällt, vorauszusagen. Ein antikörper-gesteuerter Nephelose-Assay wird zur Überwachung der Fraktionierung eingesetzt, um eine quantitative Pn-Ps-Gewinnung sicherzustellen. Durch diese Verbesserung wird die Verunreinigung durch C-Polysaccharid, das gruppenspezifische Polysaccharid, welches vielen verschiedenen Pneumokokken-Isolaten gemeinsam ist, gegenüber dem bei rohen Pn-Ps-Präparationen gefundenen Niveau um etwa das 3- bis 20fache verringert. Ferner wird die Polydispersität der Molekülgröße der Pn-Ps-Präparation gleichzeitig auf zwischen etwa 1,0 und 1,4 verringert.
Eine zur IPA-Fraktionierung der größenreduzierten Pn-Ps alternative Vorgehensweise ist die Chromatographie der wäßrigen, größenreduzierten Pn-Ps durch ein geeignetes Größenausschlußharz, z. B. CL-2B-Harz oder irgendein anderes Harz, welches imstande ist, Polysaccharid im Molekulargewichtsbereich von 200–1000 Kilodalton einzuschließen und zu fraktionieren. HPSEC unter Einsatz einer starren Größenausschluß-Matrix ist in dieser Hinsicht günstig, um die Laufzeit zu verringern und die Auflösung zu erhöhen. Die Selektion von Fraktionen, die von der Säule mit einer vorherbestimmten Viskosität oder Retentionszeit eluieren, oder durch On-Line-Nachweis ergibt eine Population von Pn-Ps-Molekülen mit den erwünschten, oben offenbarten Eigenschaften hinsichtlich Größe, Viskosität und Reinheit.
Präparationen von Pn-Ps, die den zusätzlichen Schritten von IPA- oder chromatographischer Fraktionierung unterzogen wurden, verhalten sich während der chemischen Kopplungsschritte einheitlicher und ergeben deshalb Konjugate mit reproduzierbaren Eigenschaften. Es werden auch signifikante gleichzeitige Erhöhungen der Pn-Ps-Reinheit erzielt, insbesondere werden die C-Ps-Niveaus stark verringert.
Als Ergebnis der oben beschriebenen Manipulationen und Messungen sind bevorzugte Eigenschaften für die Pn-Ps-Zwischenprodukte so wie in Tabelle II oben zusammengefaßt.
II.a) Funktionalisierung des fraktionierten Pn-Ps, um den elektrophilen oder nukleophilen Reaktanten Pn-Ps* zu bilden, vorzugsweise um etwa 10–40 reaktive Bromacetylgruppen pro 100 Pn-Ps-Monomer-Einheiten aufzuweisen:
Das Pn-Ps aus Schritt I. (c) oben ist ausreichend homogen und besitzt Eigenschaften wie verbesserte Löslichkeit und verringerte Viskosität, um das Pn-Ps einer Konjugation zugänglich zu machen. Für Fachleute sind viele unterschiedliche Schemata verfügbar, um Konjugate von Polysacchariden und anderen Gruppierungen herzustellen. Das hier offenbarte Verfahren ist nur ein möglicher Weg zur Nutzbarmachung des neuen, partiell hydrolysierten und fraktionierten Pn-Ps-Zwischenprodukts dieser Erfindung, um Konjugate zu bilden, und sollte nicht als der ausschließliche Modus zur Verwendung des Pn-Ps-Zwischenprodukts verstanden werden.
Das von Marburg, S., et al., [ US-Patent 4,695,624 ; J. Am. Chem. Soc. 108, 5282 (1986)] offenbarte Verfahren mit einem bigenerischen Abstandhalter ist ein bevorzugtes Verfahren zur Konjugation des fraktionierten und größenreduzierten Pn-Ps mit einem immunogenen Protein. Das Pn-Ps wird funktionalisiert, um elektrophile oder nukleophile Gruppen zu zeigen. Das resultierende Pn-Ps* ist dann imstande, mit einem umgekehrt funktionalisierten Protein, PRO*, zu reagieren. Das Verfahren dieser Erfindung umfaßt auch die Wahl eines Nukleophils oder Bisnukleophils, welches mit dem aktivierten Polysaccharid reagieren wird, um ein kovalent modifiziertes Polysaccharid mit elektrophilen Seitenpositionen oder Thiolseitengruppen zu bilden, wodurch das Bedürfnis zur weiteren Funktionalisierung des bis-nukleophil modifizierten Polysaccharids vor der Umsetzung des kovalent modifizierten Polysaccharids mit dem kovalent modifizierten Protein entfällt. Die Funktionalisierung des Proteins mit jeder Gruppierungsform kann auch in mehr als einem Schritt durchgeführt werden, je nach der Wahl der Reaktanten in diesen Schritten.
Unabhängig von der erwünschten Funktionalität des Pn-Ps* muß das größenreduzierte fraktionierte Pn-Ps zuerst in einem Lösungsmittel solubilisiert werden, welches den Funktionalisierungsprozeß nicht stören wird. Nachdem es die Hydroxylgruppen des Pn-Ps sind, welche einer Funktionalisierung am ehesten zugänglich sind, ist die Trennung des Pn-Ps von Wasser, um die erste Funktionalisierung zu bewirken, kritisch. Der Ersatz saurer Pn-Ps-Wasserstoffe durch ein hydrophobes Kation wie Tetra- oder Tributylammonium ermöglicht dem Pn-Ps, in nicht-wäßrigen Lösungsmitteln wie DMSO oder DMF löslich zu werden. Natürlich besteht keine Notwendigkeit, diesen Ersatz bei Pn-Ps durchzuführen, welche neutral sind (z. B. Pn14-Ps oder Pn7F-Ps). Sobald sich das Pn-Ps in einer nicht-wäßrigen Lösung befindet, kann es mit einem Biselektrophil wie Carbonyldiimidazol umgesetzt werden, um ein Imidazoyldiurethan zu bilden. Die Anzahl der funktionellen Gruppen pro 100 Pn-Ps-Monomereinheiten wird zu diesem Zeitpunkt kontrolliert durch Zugabe einer limitierten Menge von etwa 1/5 des Carbonyldiimidazol-Reagens im Vergleich zu den gesamten Pn-Ps-Monomeren auf molarer Basis, so daß im Mittel nur etwa 10–40 von 100 Pn-Ps-Monomereinheiten derivatisiert werden. Diese Spezies ist einer nukleophilen Substitution durch Reagenzien wie i) Cystamin-Dihydrochlorid, welche die Bildung von nukleophilen Pn-Ps*-Derivaten erlauben, oder ii) 1,4-Butandiamin, welche die Bildung von elektrophilen Pn-Ps*-Derivaten erlauben, zugänglich, wie offenbart im US-Patent 4,695,624 und Marburg et al., J. Am. Chem. Soc., 108, 5282 (1986).
Es wurde kürzlich festgestellt, daß aufgrund der Tatsache, daß einige saure Pneumokokken-Polysaccharide, wie Pn9V-Ps, Pn4-Ps, Pn1-Ps, Pn5-Ps und Neisseria meningitidis B- oder C-Polysaccharide, freie Carbonsäuregruppen sowie freie Hydroxylgruppen aufweisen, die Konjugationschemie dieser Polysaccharide im Vergleich zu neutralen Polysacchariden oder Polysacchariden, welche aufgrund der Anwesenheit von Phosphodiesterbindungen wie in Polyribosylribitphosphat anionisch sind, in leicht unterschiedlicher Weise vonstatten geht. Im allgemeinen geht die Konjugationschemie von carboxylat-freien Polysacchariden durch Überführung freier Polysaccharidhydroxyle in Urethanverknüpfungen vonstatten, d. h. von
worin R^a den Rest der Atomkette, die das Polysaccharid mit Protein verknüpft, darstellt.
Bei den Carbonsäure enthaltenden Polysacchariden wie Pn-9V-Ps, welches Glucuronat enthält, oder Pn4-Ps, welches Pyruvatgruppen enthält, geht die Chemie jedoch von
worin R^a wiederum den Rest der Atomkette, die das Polysaccharid mit Protein verknüpft, darstellt. Beobachtet wird deshalb, daß die Esterfunktionalität des Urethans bei dem Carbonsäure enthaltenden Polysaccharid entweder nicht gebildet wird oder zusätzlich an diesen Stellen eine einfache Amidbindung gebildet wird. Die Konjugationschemie geht aufgrund der Anwesenheit der Carbonsäurefunktionalitäten mit höherer Geschwindigkeit vonstatten.
Da angenommen wird, daß die Carbonsäurefunktionalitäten einen wichtigen Beitrag zur Antigenizität und Immunogenizität dieser Klasse von anionischen Polysacchariden darstellen, muß die Konjugationschemie für diese Polysaccharide sorgfältig gesteuert werden. Das Bedürfnis nach hohen Verhältnissen von Polysaccharid zu Protein im Endkonjugat muß gegen die Notwendigkeit zur Aufrechterhaltung der antigenen Integrität ausbalanciert werden. Dieses Ziel wird erreicht durch Begrenzung des Ausmaßes der anfänglichen, durch Carbonyldiimidazol vermittelten Aktivierung. Sobald das Amid gebildet ist, kann der nächste Schritt unter Beteiligung von Cystamin-Dihydrochlorid oder 1,4-Butandiamin wie oben angegeben und im folgenden weiter erläutert vonstatten gehen.
Alternativ können die Carboxylgruppen durch Verwendung von Trimethylsilyl oder ähnlichen Schutzgruppen, welche später durch milde alkalische Bedingungen entfernt werden können, oder durch Verwendung von 2,4-Dimethoxybenzylestern, welche säurelabil wären, reversibel geschützt und dann von den Schutzgruppen befreit werden. In diesem Fall kann die Konjugationschemie auf übliche Weise über die Polysaccharid-Hydroxylgruppen vonstatten gehen.
1. Herstellung von nukleophilem Pn-Ps*:
Das oben erhaltene, durch Carbonyldiimidazol aktivierte, größenreduzierte und fraktionierte Ps kann in wäßrigen oder anderen Lösungsmitteln mit Reagenzien, wie z. B. im US-Patent 4,695,624 offenbart, umgesetzt werden. Ein bevorzugtes Reagens ist Cystamin-Dihydrochlorid. Die anschließende Entfernung von überschüssigem Cystamin und die Reduktion mit Dithiothreit oder Dithioerythreit ergibt das nukleophile sulfhydryl-funktionalisierte Pn-Ps. Dieses Pn-Ps*-Derivat ist zur Reaktion mit einem elektrophilen PRO* in der Lage, z. B. dort wo das Protein modifiziert wurde, um Bromacetylseitengruppen aufzuweisen.
2. Herstellung von elektrophilem Pn-Ps*:
Das oben erhaltene, durch Carbonyldiimidazol aktivierte, größenreduzierte und fraktionierte Pn-Ps kann in wäßrigen oder anderen Lösungsmitteln mit Reagenzien wie im Patent 4,695,624 offenbart, vorzugsweise mit 1,4-Butandiamin (BuA₂), umgesetzt werden. Eine nachfolgende Acylierung des Pn-Ps-BuA₂ mit p-Nitrophenylbromacetat oder einem ähnlichen Reagens erzeugt das elektrophile Pn-Ps-BuA₂-BrAc-Derivat, welches zur Reaktion mit einem nukleophilen PRO*, z. B. einem sulfhydryl- modifizierten Protein, in der Lage ist. Der Grad der Derivatisierung wird zu diesem Zeitpunkt durch NMR und Vergleich des 1,4-Butandiamin-Integrals mit einem geeigneten Monosaccharidsignal wie demjenigen des Methyls von Rhamnose gemessen. Bevorzugte Derivatisierungsgrade betragen zwischen 10 bis 40% und am meisten bevorzugt etwa 20%.
II.B.) Isolierung des immunogenen Proteins (PRO), vorzugsweise des Neisseria meningitidis B-OMPC oder einer Untereinheit davon:
Die Proteingruppierung sollte sich als Immunverstärker verhalten. Es ist wünschenswert, bei der Wahl des Proteins diejenigen zu vermeiden, welche zu einer unspezifischen Aktivierung der Immunantwort des Empfängers führen (Reaktogenizität). Im US-Patent 4,695,624 verwendeten Marburg et al. den Komplex des Proteins der äußeren Membran (OMPC), abgeleitet von Neisseria meningitidis, um Polysaccharid-Protein-Konjugate herzustellen. OMPC hat sich für diese Erfindung als geeignet erwiesen, obwohl andere immunogene Proteine wie Tetanus- oder Diphterie-Toxoid oder Pertussinogen eingesetzt werden können.
Es wurden verschiedene Verfahren zur Reinigung von OMPC aus den gramnegativen Bakterien entwickelt [Frasch et al., J. Exp. Med. 140, 87 (1974); Frasch et al., J. Exp. Med. 147, 629 (1978); Zollinger et al., US-Patent 4,707,543 (1987); Helling et al., Acta Path. Microbiol. Scand. Abschn. C 89, 69 (1981); Helting et el., US-Patent 4,271,147 ). Der hier verwendete OMPC wurde präpariert wie im Beispiel 1 beschrieben. Ferner ist eine Proteinuntereinheit, isoliert durch Dissoziation von OMPC oder durch rekombinante Expression von Material, das für ein OMPC-Komponentenprotein kodiert, insbesondere das Hauptmembranprotein (auch als das mitogene Induktionsprotein MIP oder als das hauptsächlich immunverstärkende Protein, MIEP, bezeichnet), ebenfalls bevorzugt. Ein Verfahren zur Gewinnung der Untereinheitsproteine ist offenbart in Beispiel 2, 16–23 und in der US-Patentanmeldung USSN 555,978; 555,329; 555,204; und 639,457 (entsprechend EP-A-0467714 ):
II.c) Funktionalisierung des PRO zur Erzeugung des nukleophilen oder elektrophilen Reaktanten PRO*, vorzugsweise OMPC oder eine Untereinheit davon, um reaktive Sulfhydrylgruppierungen zu zeigen:
Das wie in II.(b) oben isolierte PRO wird anschließend funktionalisiert, um entweder elektrophile oder nukleophile Gruppen zu zeigen. Das resultierende PRO* ist dann imstande, mit einem gegenteilig funktionalisierten Pn-Ps*, wie in II.(a) oben hergestellt, zu reagieren.
1. Bildung von elektrophilen PRO*-Derivaten:
Das isolierte PRO, z. B. der OMPC von Neisseria oder MIEP von OMPC, wird vorzugsweise umgesetzt mit einem Reagens wie N-(Bromacetyl)-6-aminocapronsäure-p-nitrophenylester, das imstande ist, mit den ε-Aminogruppen von Lysin auf PRO zu reagieren. Das resultierende bromacetylierte PRO* ist imstande, mit den nukleophilen Derivaten von Pn-Ps*, wie in II.(a)1. oben hergestellt, zu reagieren.
2. Bildung von nukleophilen PRO*-Derivaten:
Das isolierte PRO, z. B. der OMPC von Neisseria oder MIEP, wird mit einem Reagens wie N-Acetylhomocysteinthiolacton umgesetzt, um das Sulfhydryl-Derivat des Proteins zu erzeugen. Dieses nukleophile Derivat ist zur Reaktion mit einem elektrophilen Pn-Ps*, hergestellt wie in II.(a)2. oben, in der Lage. Typische Ergebnisse dieser Prozeßphase ergeben Sulfhydryl-Titer von zwischen etwa 0,1 und 0,3 μMol/mg Protein.
II.d) Konjugation des Polysaccharids (Pn-Ps*) von Schritt II.(a) mit dem Protein (PRO*) von Schritt II(c):
Nach Bildung der reaktiven Spezies Pn-Ps* und PRO* nach den obigen Schritten II.(a) und II.(c) werden die gegenteilig aktivierten Reaktionspartner miteinander in einem Masseverhältnis von etwa 1:1 in Kontakt gebracht. Die Reaktionsmischung sollte durch Spülen mit Stickstoff von Luft befreit werden, verschlossen und bei Raumtemperatur etwa 4 Tage lang bei zwischen 17° und 40°C reagieren gelassen werden. Beispiele solcher Reaktionen umfassen:
worin ein aktiviertes Polysaccharid, das mit 4-Bromacetamidobutylamin umgesetzt wurde, mit einem Protein, das mit N-Acetylhomocysteinthiolacton umgesetzt wurde, zur Bildung eines Konjugats umgesetzt wird, und:
(worin Y'' ein C₂-C₈-Alkylrest ist), worin ein amino-derivatisiertes Polysaccharid, das mit aktivierter Maleimidosäure umgesetzt wurde, mit einem carboxy-aktivierten Protein, das mit einem Aminothiol aminiert wurde, zur Bildung eines Konjugats umgesetzt wird.
Gleichermaßen können beliebige der kovalent modifizierten Polysaccharide mit Thiolseitengruppen mit dem bakteriellen Protein OMPC oder MIEP, welches elektrophile Zentren als Seitengruppen aufweist, umgesetzt werden, um ein kovalentes Konjugat zu ergeben. Ein Beispiel einer solchen Reaktion ist:
worin ein aktiviertes Polysaccharid, das mit einem Aminothiol umgesetzt wurde, mit einem carboxy-aktivierten Protein, das mit Monohalogenacetyl-Derivaten eines Diamins umgesetzt wurde, zur Bildung eines Konjugats umgesetzt wird. Eine sehr bevorzugte Verknüpfung gemäß dieser Erfindung ist der Abstandhalter der Formel:
für Verknüpfungen über die Polysaccharid-Hydroxylgruppen, oder
im Falle von Polysacchariden, welche Carbonsäuregruppen tragen.
Sollte es erforderlich sein, die elektrophile Aktivität eines Überschusses an Halogenacetylgruppen zu eliminieren, wird die Reaktion des Konjugats mit einem niedermolekularen Thiol wie N-Acetylcysteamin diesen Zweck erfüllen. Die Verwendung dieses Reagenzes, N-Acetylcysteamin, erlaubt auch die Bestätigung hinsichtlich der eingesetzten Halogenacetylgruppierungen, da das gebildete S-Carboxymethylcysteamin eindeutig mit dem Verfahren von Spackman, Moore und Stein nachgewiesen werden kann.
II.e) Versehen des Pn-Ps-PRO-Konjugats mit Endgruppen, um restliche funktionelle Gruppen zu eliminieren:
Restliche elektrophile Gruppen entweder auf dem PRO* oder dem Pn-Ps* werden am Ende der Reaktion gequencht durch Zugabe eines etwa 2–10fachen molaren Überschusses gegenüber restlichen reaktiven Gruppen auf dem Konjugat an einem niedermolekularen Nukleophil, z. B. N-Ethylmaleimid (NEM), um restliche freie Sulfhydryle mit Endgruppen zu versehen, oder einem Elektrophil, z. B. N-Acetylcysteamin, um restliche Bromacetylgruppierungen mit Endgruppen zu versehen.
II.f) Isolierung des Konjugatprodukts:
Das mit Endgruppen versehene Produkt-Konjugat wird von unkonjugiertem PRO, Pn-Ps und anderen Reaktanten durch Ultrazentrifugation oder Diafiltration abgetrennt. Das Konjugat-Pellet wird in einer wäßrigen Pufferwaschlösung resuspendiert, welche eine Detergensbehandlung, z. B. 0,5% Desoxycholin und Salz wie 0,1 M Tris, pH 7–9, und etwa 10 mM EDTA einschließen kann, um restliche Pyrogene zu entfernen, und wird zwischen 1 und 25 h lang bei Raumtemperatur stehengelassen. Das Konjugat wird erneut pelletiert, In wäßrigem Puffer ohne Detergens resuspendiert und dann durch Ultrazentrifugation bei etwa 100.000 × g unter Verwendung eines Festwinkelrotors etwa 2 h lang bei etwa 1° bis 20°C erneut pelletiert oder irgendeinem aus einer Vielfalt von anderen Reinigungsverfahren unterworfen, einschließlich Difiltrations-Gelpermeation, Ionenaustauschchromatographie, Gradientenzentrifugation oder einer anderen Differentialadsorptionschromatographie, um nicht-kovalent gebundene Polysaccharide und Proteine zu eliminieren, unter Verwendung von Ps-, PRO- und Geschwindigkeitsnephelometrie-Assays sowie des Kovalenz-Assays für den bigenerischen Abstandhalter (siehe unten) als in vitro-Verfahren zur Verfolgung der erwünschten biologischen Aktivität.
Die weitere Abtrennung von Reagenzien kann durch Größenausschlußchromatographie in einer Säule erfolgen oder die Abtrennung kann im Falle sehr großer, unlöslicher Proteine durch Ultrazentrifugation erfolgen. Der Resuspension des Konjugats in sterilem Wasser und dem Stehenlassen für etwa einen Tag bei 4°C, um eine vollständige Solubilisierung zu erlauben, folgt eine Zentrifugation bei niedrigerer Geschwindigkeit, um unlösliche Teilchen zu entfernen. Die Überstandslösung enthält das Endprodukt, welches steril filtriert zu Vakzin-Zusammensetzungen in immunologisch wirksamen Dosierungsniveaus formuliert und steril in Flaschen abgefüllt werden kann.
Eine Analyse des Konjugats, um die Kovalenz und somit die Stabilität des Konjugats zu bestätigen, wird durchgeführt mittels Hydrolyse (vorzugsweise mit 6 N HCl bei 100°C für 20 h) des Konjugats und anschließender quantitativer Analyse hinsichtlich der einmaligen Aminosäure des hydrolysestabilen Abstandhalters, welcher die Thioetherbindung enthält, und der Aminosäurebestandteile des Proteins. Der Beitrag der Aminosäuren des Proteins kann erforderlichenfalls eliminiert werden durch Vergleich mit dem entsprechenden Aminosäurestandard für das betreffende Protein, wobei der verbleibende Aminosäurewert die Kovalenz des Konjugats reflektiert, oder die Aminosäure des Abstandhalters kann so ausgesucht werden, daß sie außerhalb des Aminosäurestandards des Proteins in der Analyse erscheint. Der Kovalenz-Assay ist auch geeignet zur Überwachung von Reinigungsverfahren, um die Konzentrationserhöhung der biologisch aktiven Komponenten zu kennzeichnen. In den obigen Beispielen resultiert die Hydrolyse von
in der Freisetzung von S-Carboxymethylhomocystein,
die Hydrolyse von
resultiert in der Freisetzung der Aminodicarbonsäure,
und die Hydrolyse von
resultiert in der Freisetzung von S-Carboxymethylcysteamin, H₂NCH₂CH₂SCH₂CO₂H, durch Spaltung des Ps-A-E-S-B-PRO-Moleküls an Peptidverknüpfungen und anderen hydrolytisch instabilen Bindungen. Chromatographieverfahren, z. B. diejenigen von Spackman, Moore und Stein, können dann günstig angewandt und das Verhältnis der Aminosäurebestandteile bestimmt werden.
Die optimale Produktion von IgG-Antikörper erfordert das Zusammenwirken von B- und T-Lymphozyten mit Spezifität für das Antigen von Interesse. T-Lymphozyten sind nicht imstande, Polysaccharide zu erkennen, können jedoch zu Anti-Polysaccharid-IgG-Antikörper-Antworten beitragen, falls das Polysaccharid kovalent mit einem Protein verknüpft ist, welches die T-Zelle erkennen kann.
C. Vakzin-Formulierungen und Anwendbarkeit:
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Konjugatprodukt an Aluminiumhydroxidgel adsorbiert. Dies erfolgt beispielsweise durch Präparation einer Konjugat-Stammlösung, die einer Konzentration von 20 μg/ml Pn-Ps äquivalent ist. Portionen können 1:1, 1:5 und 1:10 mit sterilem Wasser verdünnt werden. Portionen jeder dieser Proben, einschließlich einer Portion der 20 μg/ml-Stammlösung, werden mit einem Aluminiumhydroxid-Verdünnungsmittel, das 0,85 mg/ml Al⁺³, 1,7% NaCl (Gew./Vol.) und 100 μg/ml Thimerosol enthält, 1:1 verdünnt. Der pH-Wert der Lösung wird mit 1 N NaOH auf etwa 7,5 eingestellt, was Lösungen mit einer Pn-Ps-Konzentration von 10, 5, 2 und 1 μg/ml ergibt Dosen von zwischen etwa 0,1 und 0,75 ml jeder dieser Formulierungen eignen sich zur Verabreichung an Empfänger unterschiedlichen Alters und Gewichtsbereichs. Es wurde festgestellt, daß das wie beschrieben formulierte Vakzin bei 2–3 Monate alten Affenbabys signifikante subtypenspezifische Anti-Pneumokokken-Polysaccharid-Immunantworten auf Pn6B-Ps-OMPC, Pn14-Ps-OMPC, Pn19F-Ps-OMPC und Pn23F-Ps-OMPC induzierte. Das Pn-Ps-OMPC-Konjugat-Vakzin wurde ferner befunden, bei athymischen Mäusen T-Zell-abhängig zu sein.
Aus dieser Offenbarung sollte deutlich geworden sein, daß andere Polysaccharide, welche Eigenschaften wie hier definiert aufweisen, und Verfahren zur Herstellung der Ps mit diesen Eigenschaften zur Herstellung von anderen Konjugaten als solchen, welche partiell hydrolysierte und fraktionierte Pneumokokken-Polysaccharide umfassen, günstig einsetzbar sein werden. Diese Konjugate könnten dann eingesetzt werden zur Verhinderung von Krankheiten, die von anderen pathogenen Organismen verursacht werden. Beispielsweise könnten die Gruppe-B-Streptokokken, eine Ursache von Neugeborenenmeningitis, Neisseria meningitidis B oder C, eine Ursache von Meningitis bei Kleinkindern, oder E. coli, eine wichtige Ursache von Harntraktsinfektionen und anderen opportunistischen Infektionen, als Polysaccharid-Quellen verwendet werden. Diese Polysaccharide sowie die Pn-Ps und deren kovalente Konjugate können auch wichtige Komponenten für Kombinationsvakzin-Formulierungen bereitstellen. Solche Kombinationen können beispielsweise immunologisch wirksame Mengen an Adjuvans, z. B. Freunds oder Ribi, oder immunmodulatorische Verbindungen wie die Interleukine, Interferone (siehe z. B. die Verbindungen, welche aufgelistet sind in: Market Letter, 30. Nov., 1987, S. 26–27; Genetic Engineering News, Jan. 1988, Bd. 8, S. 23) oder weitere Immunogene einschließen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist eine Zusammensetzung, die immunologisch wirksame Mengen des Konjugats dieser Erfindung umfaßt, mit einem oder mehreren der Vakzine gegen Hepatitis B, Hepatitis A, Non-A-Non-B-Hepatitis, AIDS, Diphterie, Keuchhusten, Tetanus, Masern, Mumps, Röteln, Varicella, Polio oder Haemophilus influenzae b eingeschlossen. Bevorzugte weitere Vakzine, ausgewählt aus den soeben genannten, sind aus PevaxHIB^®, Recombivax HB^®, M-M-R^® und einem trivalenten DTP-Vakzin ausgewählt.
Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Offenbarung der Erfindung.
BEISPIEL 1
Herstellung von Neisseria meningitidis B11 Serotyp 2 OMPC
A. Fermentation
1. Neisseria meningitidis Gruppe B11
Ein Röhrchen, enthaltend die lyophilisierte Kultur von Neisseria meningitidis [erhalten von Dr. M. Artenstein, Walter Reed Army Institute of Research (WRAIR), Washington, D. C.], wurde geöffnet und Eugonbouillon (BBL) zugegeben. Die Kultur wurde auf Mueller-Hinton-Agarschrägen ausgestrichen und bei 37°C mit 5% CO₂ 36 h lang inkubiert, wonach das Wachstum in 10%iges Magermilchmedium (Difco) geerntet wurde und Aliquots bei –70°C eingefroren wurden. Die Identität des Organismus wurde bestätigt durch Agglutination mit spezifischem Antiserum, bezogen von WRAIR, und Typisierungsserum, bezogen von Difco.
Ein Gefäß der Kultur aus der zweiten Passage wurde aufgetaut und auf 10 Columbia Sheep Blood-Agarplatten (CBAB-BBL) ausgestrichen. Die Platten wurden bei 37°C mit 5% CO₂ 18 h lang inkubiert, wonach das Wachstum in 100 ml 10%iges Magermilchmedium geerntet wurde, Aliquots in 0,5-ml-Mengen entnommen und bei –70°C eingefroren wurden. Der Organismus wurde durch Agglutination mit spezifischem Antiserum, Zuckerfermentation und Gram-Färbung positiv identifiziert.
Ein Gefäß der Kultur aus dieser Passage wurde aufgetaut, mit Mueller-Hinton-Bouillon verdünnt und auf 40 Mueller-Hinton-Agarplatten ausgestrichen. Die Platten wurden bei 37° C mit 6% CO₂ 18 h lang inkubiert, wonach das Wachstum in 17 ml 10%iges Magermilchmedium geerntet wurde, in Aliquots von 0,3-ml-Mengen aufgeteilt und bei –70°C eingefroren wurde. Der Organismus wurde durch Gram-Färbung, Agglutination mit spezifischem Antiserum und Oxidasetest positiv identifiziert.
2. Fermentation und Gewinnung von Zellpaste

a. Impfgutentwicklung – Das Impfgut wurde gezüchtet aus einem eingefrorenen Gefäß von Neisseria meningitidis Gruppe B, B-11 von oben (Passage 4). 10 Mueller-Hinton-Agarschrägen wurden angeimpft und 6 etwa 18 h später geerntet und als Impfgut für drei 250-ml-Kolben von Gotschlichs Hefedialysatmedium bei pH 6,35 eingesetzt. Die OD₆₆₀ wurde auf 0,18 eingestellt und es wurde inkubiert, bis die OD₆₆₀ zwischen 1 und 1,8 lag. 1 ml dieser Kultur wurde verwendet, um jeden von fünf 2-l-Erlenmeyerkolben (jeweils 1 l Medium enthaltend; siehe unten) anzuimpfen, und bei 37°C in einem Schüttler bei 200 UpM inkubiert. Die OD wurde in stündlichen Intervallen nach der Animpfung überwacht. 4 l Bouillonkultur bei einer OD₆₆₀ von 1,28 waren das Ergebnis.

70-l-Impffermenter – Etwa 4 l Impfkultur wurden dazu verwendet, einen sterilen 70-l-Fermenter anzuimpfen, der etwa 40 l vollständiges Produktionsmedium enthielt (siehe unten). Die Bedingungen für die 70-l-Fermentation umfaßten 37° C, 185 UpM bei 10 l/Mm. Lufteintrag und konstante pH-Kontrolle bei etwa pH 7,0 für etwa 2 h. Für diesen Ansatz betrug die endgültige OD₆₆₀ nach 2 h 0,732.
800-l-Produktionsfermenter – Etwa 40 l Impfkultur wurden verwendet, um einen sterilen 800-l-Fermenter anzuimpfen, der 568,2 l vollständiges Produktionsmedium (siehe unten) enthielt. Der Ansatz wurde bei 37°C, 100 UpM mit 60 l/Min. Lufteintrag und konstanter pH-Kontrolle bei pH 7,0 inkubiert Für diesen Ansatz betrug die endgültige OD 13 h nach der Animpfung 5,58. 3. Vollständiges Medium für Erlenmeyerkolben und 70- und 800-l-Fermenter

Fraktion A

L-Glutaminsäure 1,5 g/l

NaCl 6,0 g/l

Na₂HPO₄·wasserfrei 2,5 g/l

NH₄Cl 1,25 g/l

KCl 0,09 g/l

L-Cystein-HCl 0,02 g/l
Fraktion B (Gutschlichs Hefedialysat):
1280 g Difco-Hefeextrakt wurden in 6,4 l destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wurde in zwei Amicon DC-30-Hohlfaserdialyseeinheiten mit drei H10SM-Kartuschen dialysiert. 384 g MgSO₄·7-H₂O und 3200 g Dextrose wurden in dem Dialysat gelöst und das Gesamtvolumen mit destilliertem Wasser auf 15 l gebracht. Der pH wurde mit NaOH auf 7,4 eingestellt, es erfolgte eine Sterilisierung mittels Passage durch ein 0,22-μm-Filter und die Überführung in den Fermenter, der Fraktion A enthielt.
Für die Erlenmeyerkolben: 1 l Fraktion A und 25 ml Fraktion B wurden zugegeben und der pH mit NaOH auf 7,0–7,2 eingestellt.
Für den 70-l-Fermenter: 41,8 l Fraktion A und 900 ml Fraktion B wurden zugegeben und der pH mit NaOH auf 7,0–7,2 eingestellt.
Für den 800-l-Fermenter. 553 l Fraktion A und 15,0 l Fraktion B wurden zugegeben und der pH mit NaOH auf 7,1–7,2 eingestellt.

b. Ernte und Inaktivierung Nachdem die Fermentation beendet war, wurde Phenol in ein separates Gefäß gegeben, in das anschließend die Zellbouillon überführt wurde, was eine Phenolendkonzentration von etwa 0,5% ergab. Das Material wurde unter leichtem Rühren bei Raumtemperatur gehalten, bis die Kultur nicht mehr lebensfähig war (etwa 24 h).
c. Zentrifugation Nach etwa 24 h bei 4°C wurden die 614,4 l inaktivierter Kulturflüssigkeit durch Sharples-Durchlaufzentrifugen zentrifugiert. Das Gewicht der Zellpaste nach der Phenol behandlung betrug 3,875 kg.

Alternativ wurde die durch Phenol abgetötete Fermentationsbouillon durch Diafiltration wie unten beschrieben geerntet.
B. OMPC-Isolierung
Schritt 1. Konzentration und Diafiltration
Die durch Phenol inaktivierte Kultur wurde auf etwa 30 l konzentriert und in sterilem destilliertem Wasser unter Verwendung von 0,2-μm-Hohlfaserfiltern (ENKA) diafiltriert.
Schritt 2. Extraktion
Ein gleiches Volumen an 2 × TED-Puffer [0,1 M TRIS-, 0,01 M EDTA-Puffer, pH 8,5, mit 0,5% Natriumdesoxycholat] wurde zu den konzentrierten diafiltrierten Zellen zugegeben. Die Suspension wurde in einen temperaturregulierten Tank überführt zur OMPC-Extraktion bei 56°C unter Rühren für 30 Minuten.
Der Extrakt wurde mit etwa 18.000 UpM in einer Sharples-Durchlaufzentrifuge bei einer Durchflußrate von etwa 80 ml/Min. bei etwa 4°C zentrifugiert. Die viskose Überstandsflüssigkeit wurde dann gewonnen und bei 4°C gelagert. Die extrahierten Zellpellets wurden erneut in TED-Puffer extrahiert wie oben beschrieben. Die Überstandsflüssigkeiten wurden vereinigt und bei 4°C gelagert.
Schritt 3. Konzentration durch Ultrafiltration
Der vereinigte Extrakt wurde in ein temperaturreguliertes Gefäß überführt, das mit AG-Tech-0,1-μm-Polysulfonfiltern verbunden war. Die Temperatur des Extrakts wurde in dem Gefäß während des Konzentrationsprozesses bei 25°C gehalten. Die Probe wurde bei einem durchschnittlichen Transmembrandruck von zwischen 75,9 und 165,6 kPa (11 und 24 psi) 10fach konzentriert.
Schritt 4. Gewinnung und Waschen des OMPC
Das Retentat aus Schritt 3 wurde bei etwa 160.000 × g (35.000 UpM) bei etwa 70°C in einer Durchlaufzentrifuge mit einer Durchflußrate zwischen 300 bis 500 ml/Min. zentrifugiert und die Überstandsflüssigkeit verworfen.
Das OMPC-Pellet wurde in TED-Puffer (190 ml Puffer; 20 ml/g Pellet) suspendiert. Schritt 2 und Schritt 4 wurden zweimal wiederholt (unter Auslassung von Schritt 3).
Schritt 5. Gewinnung des OMPC-Produkts
Die gewaschenen Pellets von Schritt 4 wurden in 100 ml destilliertem Wasser mit einem Glasstab und einem Dounce-Homogenisator suspendiert, um eine vollständige Suspension sicherzustellen. Die wäßrige OMPC-Suspension wurde dann mittels Passage durch ein 0,22-μm-Filter filtersterilisiert und der TED-Puffer durch Wasser ersetzt mittels Diafiltration gegen steriles destilliertes Wasser unter Verwendung eines 0,1-μm-Hohlfaserfilters.
BEISPIEL 2
Reinigung einer Untereinheit von OMPC:
Präparation von gereinigtem MIEP aus OMPC oder aus rekombinanten Zellen durch Polyacrylamidgelelektrophorese
Acrylamid/BIS(37,5:1)-Gele, 18 × 14 cm, 3 mm dick, wurden verwendet. Das Stützgel war 4%iges Polyacrylamid und das Trennungsgel war 12%iges Polyacrylamid. Etwa 5 μg OMPC-Protein oder rekombinantes Wirtszellprotein wurden pro Gel eingesetzt. Zu 1 ml OMPC wurden 0,5 ml Probenpuffer (4% Glycerin, 300 mM DTT, 100 mM TRIS, 0,001% Bromphenolblau, pH 7,0) zugegeben. Die Mischung wurde 20 Minuten lang auf 105°C erwärmt und ihr gestattet, auf Raumtemperatur abzukühlen, bevor sie auf das Gel aufgetragen wurde. Das Gel wurde bei 200–400 mA unter Kühlen laufengelassen, bis das Bromphenolblau den unteren Rand des Gels erreichte. Ein vertikaler Streifen des Gels wurde ausgeschnitten (etwa 1–2 cm breit) und mit Coomassie/Kupfer(II)-acetat (0,1%) angefärbt. Der Streifen wurde entfärbt, bis die MIEP-Bande (etwa 38 KD) sichtbar wurde. Der Streifen wurde dann an seine ursprüngliche Gelposition gebracht und die MIEP-Fläche aus dem verbleibenden Gel mit Hilfe eines Skalpells ausgeschnitten.
Die ausgeschnittene Fläche wurde in Würfel geschnitten (etwa 5 mm) und mit 0,01 M TRIS-Puffer, pH 8,1, eluiert. Nach zwei Elutionszyklen wurde das Eluat hinsichtlich der Reinheit mittels SDS-PAGE bewertet. Das Eluat wurde mit einem gemeinsamen Pool von Eluaten kombiniert und 48 h lang gegen 60 mM Ammoniak-Ameisensäure, pH 10, dialysiert Alternativ kann das eluierte Protein gegen 50%ige Essigsäure in Wasser dialysiert werden. Nach der Dialyse wurde das eluierte Protein bis zur Trockne eingedampft Das Material wurde weiter gereinigt mittels Passage durch eine PD10-Größenfraktionierungssäule (Pharmacia, Piscataway, NJ), und bei Raumtemperatur gelagert.
BEISPIEL 3
Kultivierung von Streptococcus pneumoniae-Subtypen und Isolierung von rohem Pn-Ps:
I. Kultivierung von Pneumokokken:
Verfahren zur Kultivierung von Pneumokokken sind im Stand der Technik wohlbekannt [Chase, M. W., Methods of Immunology and Immunochemistry 1, 52 (1967)]. Isolate von Pneumokokken-Subtypen sind von der ATCC erhältlich. Die Bakterien sind identifiziert als verkapselte, unbewegliche, grampositive, lanzettenförmige Diplokokken, welche auf Blutagar alpha-hämolytisch sind. Die Subtypen werden auf der Basis der Quelling-Reaktion unter Verwendung spezifischer Antiseren differenziert. Haupt- und Stamm-Impfkulturen werden vorzugsweise lyophilisiert oder unterhalb von 8°C gehalten. In einem bevorzugten Kulturverfahren werden Stammkulturen mit Heart Infusion Broth rekonstituiert, auf Heart Infusion Agar, enthaltend 10% fibrinfreies Kaninchenblut, ausplattiert und etwa 18 Stunden lang bei 37°C ± 2°C inkubiert.
Das Wachstum auf der Platte wird in Heart Infusion Broth resuspendiert und ein Aliquot des resuspendierten Wachstums wird zur Animpfung von 100 ml Heart Infusion Broth, enthaltend 10% fibrinfreies Kaninchenblut, verwendet, welche als stationäre Kultur etwa 18 Stunden lang bei 37°C ± 2°C inkubiert wird. Diese 100 ml flüssiger Kultur (Arbeitsimpfgut) werden durch mikroskopische Überprüfung eines gramgefärbten Ausstrichs und durch Wachstum auf Heart Infusion-Blutagarplatten auf Reinheit überprüft. Das Arbeitsimpfgut kann bis zu 14 Tage bei 2–8°C gelagert oder sofort eingesetzt werden. Zwei-Liter-Erlenmeyerkolben oder andere geeignete Gefäße, die Pneumococcus Inoculum Medium (YUF) mit Dextrose (25 g/l) enthalten, werden mit Arbeitsimpfgut angeimpft und etwa 8–24 Stunden lang bei 37°C ± 2°C stationär inkubiert. Der Inkubationszeitraum variiert je nach dem gezüchteten Streptococcus pneumoniae-Typ wie angegeben. Der pH-Wert der Fermentation wird durch die periodische Zugabe von 12%iger Natriumbicarbonatlösung so eingestellt, daß ein Ziel-pH-Bereich von 6,0 bis 7,2 aufrechterhalten wird, bis eine optische Dichte von 1,5 bis 4,0 erreicht ist. Die optische Dichte wird bei 660 Nanometer überprüft. Eine Probe des Wachstums wird mikroskopisch untersucht und eine serologische Agglutinationsreaktion durchgeführt, um die Reinheit zu überprüfen. Das Wachstum dieser Stufe wird in einen Impffermenter überführt, der 40 l Pneumococcus Fermenter Medium, zusammengesetzt aus destilliertem Wasser, einer trockenen Charge der Komponenten für Pneumococcus-Impfmedium (YUF), Yeast Extract Ultrafiltrate, UCON und Dextrose (etwa 25 g/l) enthält. Die Kultur wird bei 37°C ± 2°C unter leichtem Rühren etwa 2–12 Stunden lang inkubiert. Der pH wird durch die periodische Zugabe von Natriumhydroxidlösung auf 6,0 bis 7,2 eingestellt. Ein Fermenter, der 525 l Pneumococcus Fermenter Medium, zusammengesetzt aus destilliertem Wasser, einer trockenen Charge der Komponenten für Pneumococcus Production Medium (YUF), Yeast Extract Ultrafiltrate, UCON, und Dextrose (etwa 25 g/l) enthält, wird mit etwa 50 l einer 2–12stündigen Impfkultur angeimpft. Die Kultur wird bei 37°C ± 2°C unter leichtem Rühren 6–30 Stunden lang inkubiert, je nachdem Typ, der gezüchtet wird. Der pH-Wert wird durch periodische Zugaben von Natriumhydroxidlösung auf 6,0 bis 7,2 eingestellt. Der Fermentation folgt eine Bestimmung der optischen Dichte, und die Fermentation wird beendet, wenn die Dextrose vollständig verbraucht ist, wie durch keine weiteren pH-Veränderungen angezeigt.
Die pathogenen Organismen werden unmittelbar nach Beendigung der Fermentation abgetötet. Dies wird erreicht, indem Phenol bis zu einer Konzentration von etwa 1% zugegeben und die Fortsetzung der Abtötung für 2–12 Stunden bei Umgebungstemperatur gestattet wird.
II) Isolierung von rohem Pn-Ps:
Denaturierter Alkohol wird der abgetöteten Kultur in einer ausreichenden Menge zugegeben, um Zelltrümmer und Nukleinsäuren auszufällen, welche durch Zentrifugation entfernt werden. Das rohe Polysaccharid wird dann aus der Überstandsflüssigkeit durch Zugabe von weiterem denaturiertem Ethanol gefällt. Die Feststoffe werden durch Zentrifugation gewonnen und die Überstandsflüssigkeit verworfen.
Die Nukleinsäureverunreinigung wird verringert durch Solubilisierung des Polysaccharids in einer neutralen wäßrigen Lösung wie 1–5%igem Natriumacetat oder 0,05 M Phosphatpuffer, zu der Nuklease und etwa 0,01 M Magnesiumchlorid zugegeben wird. Nach etwa 60–120 Minuten bei etwa 36°C wird der pH-Wert auf etwa 8,0 eingestellt und eine Protease wie Trypsin zugegeben, um proteinhaltige Verunreinigungen zu verdauen.
Weitere Verunreinigungen können durch erneute Fällung des Polysaccharids in Natriumacetat mit denaturiertem Alkohol oder Isopropanol, gefolgt von erneuter Solubilisierung in destilliertem Wasser, eliminiert werden. Die Zugabe von Cetrimoniumbromid bei etwa 8°C fällt Verunreinigungen aus, welche durch Zentrifugation entfernt werden. Die Zugabe von Natriumacetat und eines Aliquots an denaturiertem Alkohol oder Isopropanol erlaubt die Entfernung weiterer Verunreinigungen. Das Polysaccharid wird durch Zugabe von weiterem Alkohol und Zentrifugation gewonnen. Der Niederschlag wird mit absolutem Ethanol gewaschen, bis ein weißes Pulver erhalten wird. Das Polysaccharid wird durch Filtration gewonnen, mit absolutem Ethanol und Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet, um das rohe Pn-Ps als Pulver zu ergeben.
BEISPIEL 4
Herstellung von partiell hydrolysiertem, gereinigtem Pn6B-Ps:

(1) Thermische Hydrolyse: Eine 3,0-g-Portion von rohem Pn6B-Ps-Pulverwurde in 1200 ml Salzlösung (0,9% NaCl) unter Rühren bei Raumtemperatur für etwa 4 Stunden solubilisiert und über Nacht bei 4°C gelagert. Die Lösung wurde dann in einer Kältefinger-Rückflußkühler-Apparatur 24 Stunden lang bei 100°C hydrolysiert und auf Raumtemperatur abgekühlt. Natriumacetat-Reagens (59,7 g) wurde bis zu einer Endkonzentration von 3% (Gew./Vol.) zugegeben.
(2) Serologische Untersuchung: Eine Isopropanol(IPA)-Fraktionierungspilotstudie und ein antikörpergesteuerter Endpunkt-Nephelose-Assay, durchgeführt mit einer 10-ml-Portion der Probe, zeigten, daß das Pn6B-Ps bei 40–50% IPA ausfallen wurde.
(3) Erste IPA-Zugabe: Die hydrolysierte Probe (Volumen – 1210 ml, aus Schritt 1 oben) wurde durch die Zugabe von 932 ml IPA (tropfenweise unter Rühren bei Raumtemperaturzugegeben) auf 43,5% IPA gebracht. Die Probe wurde 15–30 Minuten lang rühren gelassen und dann 30 Minuten lang bei 11.000 × g zentrifugiert (Beckman JA-10-Rotor, 8.000 UpM; 20°C). Das Abfallpellet wurde mit absolutem EtOH in einem 250-ml-Omnimix-Gefäß trituriert, dann auf einem 60-ml-Sinterglastrichter gesammelt. Der Niederschlag wurde direkt auf dem Trichter mit absolutem EtOH, dann Aceton gewaschen und im Vakuum über CaCl₂ bei Raumtemperatur in Vorbereitung auf die Analyse getrocknet.
(4) Zweite IPA-Zugabe und Produktgewinnung: Die Überstandsflüssigkeit von 43,5% IPA (Volumen 2020 ml, aus Schritt 3 oben] wurde durch tropfenweise Zugabe von 93,5 ml IPA unter Rühren bei Raumtemperatur auf 46,0% IPA gebracht. Die Probe wurde stehengelassen und zentrifugiert wie in Schritt 3 oben. Das Pellet wurde trituriert, gesammelt, gewaschen und getrocknet wie in Schritt 3 oben. Das Pn6B-Ps-Produkt wog 1650 mg und besaß einen K_d von 0,62 und einen Phosphorgehalt von 3,3%.

BEISPIEL 5
S. pneumoniae 6B-OMPC-Konjugat Pn6B-Ps-OMPC:
A. Herstellung von Dowex 50 × 2 Tetrabutylammoniumharz [Dowex 50 (Bu₄N⁺)]:
Dowex 50 × 2 (200–400 Mesh), H⁺-Form (72 g), wurde in Wasser aufgeschlämmt, auf eine Säule aufgetragen und nacheinander mit Wasser, 6 N HCl und dann Wasser gewaschen, bis der Ausfluß beim Test mit pH-Papier neutral war. Eine 10%ige wäßrige Lösung von Tetrabutylammoniumhydroxid wurde dann durch die Säule laufengelassen, bis der Ausfluß beim Test stark alkalisch war. Schließlich wurde Wasser durch die Säule laufengelassen, bis der Ausfluß beim Test wieder neutral war.
B. Pn6B(Bu₄N⁺):
Pn68-Ps (600 mg), größenreduziert und fraktioniert (hinsichtlich der physikalischen Eigenschaften siehe Tabelle I, Pn6B-Ps-Charge 1), wurde in sterilem destilliertem Wasser (60 ml) gelöst und die Lösung magnetisch gerührt, bis alle Feststoffe in Lösung gingen (1,5 h). Die Polysaccharidlösung wurde auf das gespülte Harz aufgetragen und ihr gestattet, durch Schwerkraft das Bett zu passieren (4,5 h). Die Säule wurde mit Wasser (10–12 ml) gewaschen und die vereinigten Ausflüsse lyophilisiert, was 640 mg trockenes Pn6B-Ps-Tetra-n-butylammoniumsalz, Pn6B(n-Bu₄N⁺), ergab.
C. Pn6B-BuA₂:
Pn6B(n-Bu₄N⁺) (640 mg) wurde in Dimethylsulfoxid (DMSO) (24 ml) gelöst und 30 Minutenlang magnetisch gerührt, nach welcher Zeit alle Feststoffe in Lösung zu sein schienen. Zu dieser Mischung wurde 1,1'-Carbonyldiimidazol (44,2 mg) zugegeben und die Reaktion bei Raumtemperatur (60 Min.) gerührt. In einem separaten Kolben wurde eine Lösung von Butandiamin-Dihydrochlorid (BuA₂·2HCl, 1,022 g) in Wasser (16 ml) durch die Zugabe von 10 N NaOH basisch gemacht (pH 10,2). Die Lösung wurde durch ein steriles 0,2-μm-Filter filtriert und in einem Eisbad gekühlt. Die gealterte DMSO-Mischung, enthaltend das aktivierte Polysaccharid, wurde zu der kalten BuA₂·2HCl-Lösung in einem langsamen, stetigen Strom zugegeben und die resultierende Lösung bei 0°C gerührt (15 Min.). Die Reaktionsmischung wurde auf Raumtemperatur aufwärmen gelassen und 1 weitere Stunde gerührt, wonach sie in einen Dialyseschlauch überführt und gegen folgendes dialysiert wurde (4°C): 1] 15 l 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, für 6 h; 2] 15 l 0,01 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, 12 h; 3] 15 l 0,01 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, 9 h; 4] 15 l destilliertes H₂O, 17,5 h. Der Inhalt des Dialyseschlauchs wurde lyophilisiert, was 222 mg Pn6B-1,4-Butandiamin (Pn6B-BuA₂) ergab. Das NMR (300 MHz, D₂O) von etwa 5 mg dieses Materials zeigte durch Vergleich der Integrale der Resonanzen der Butandiamin- Methylene und der Rhamnose-Methylprotonen von Pn6B-Ps eine Beladung von 22 Diaminresten pro 100 sich wiederholender Pn6B-Ps-Monomereinheiten.
Pn6BuA₂-BrAc:
Pn6B-BuA₂ (210 mg) wurde in 0,1 M Kolthoff-Borat-Phosphat-Puffer, pH 9,04, (21 ml) gelöst und die Mischung 30 Minuten lang magnetisch gerührt, um die Lösung zu bewirken. Zu dieser wäßrigen Lösung wurde eine Mischung zugegeben, die aus p-Nitrophenylbromacetat (210 mg) in Acetonitril (2,6 ml) bestand und die Reaktion über Nacht gerührt (20 h, 4°C). Die Lösung wurde in einen Dialyseschlauch überführt und gegen folgendes dialysiert (4°C):

1] 15 l steriles destilliertes H₂O, 12,3 h; 2] 15 l steriles destilliertes H₂O, 8,25 h; 3] 15 l steriles destilliertes Wasser, 5,5 h. Von dem Inhalt des Beutels wurden 1,7 ml für Assays entnommen (NMR und HPSEC-Universalkalibrierung oder Molekülgrößenanalyse) und dann 0,449 g getrocknetes Salz von Phosphatpuffer, pH 8, (hergestellt durch Lyophilisierung einer 0,1 M Natriumphosphatlösung von pH 8), zugegeben. Nach vollständiger Lösung (30 Min.) wurde die Lösung durch ein steriles 0,2-μm-Filter filtriert, was eine Lösung von Pn6B-BuA₂-BrAe bei pH 8 ergab.

Pn6B-OMPC:
Steriler OMPC (40 ml, 4,5 mg/ml) wurde durch Ultrazentrifugation (4°C, 43 K UpM, 2 h) in vier 10-ml-Zentrifugenrhrchen pelletiert. Jedes Pellet wurde in 3 ml einer steril filtrierten (0,22 μm) Thiolierungsmischung resuspendiert, welche aus dem folgenden bestand:
N-Acetylhomocysteinthiolacton-Hydrochlorid (164 mg), Ethylendiamintetraessigsäure-Dinatriumsalz (255 mg) und Dithiothreit (53 mg) in Na₂B₄O₇-Puffer, pH 11,09 (30 ml). Die resuspendierten Pellets wurden homogenisiert (Dounce), vereinigt, das Gefäß entgast und mit Stickstoff als Schutzgas versehen und über Nacht (19 h) bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Lösung wurde auf drei Ultrazentrifugenröhrchen aufgeteilt, mit 1 M KH₂PO₄ überschichtet und das Protein pelletiert (4°C, 43 K UpM, 2 h). Die Pellets wurden in 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 8, (30 ml) resuspendiert, homogenisiert (Dounce) und erneut pelletiert (4°C, 43 K UpM, 2 h). Das sterile Proteinpellet wurde in der filtrierten Pn6B-BuA₂-BrAc-Lösung resuspendiert verwendet. Ein Ellman's-Test wurde sofort durchgeführt und zeigte einen SH-Titer von 34 μMol. Die Reaktionsmischung wurde entgast, mit Stickstoff als Schutzgas versehen und 91 h lang bei Raumtemperatur stehengelassen.
Das Protein wurde durch Zugabe von 1 ml einer (steriles 0,22 μm-Filter) Lösung, bestehend aus dem folgenden: N-Ethylmaleimid (75 mg) in 5 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 8,0, mit Endgruppen versehen. Diese Mischung wurde 4 h lang bei Raumtemperatur stehengelassen, wonach 300 μl N-Acetylcysteamin (bei 0,22 μm steril filtriert) zugegeben und die Lösung weitere 19,5 h lang stehengelassen wurde.
Das sterile, mit Endgruppen versehene Konjugat wurde auf vier Zentrifugenröhrchen aufgeteilt, mit 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7, überschichtet und durch Ultrazentrifugation (4°C, 43 K UpM, 2 h) pelletiert, dann in sterilem 0,1 M NaPO₄-Puffer, pH 7, (42 ml) resuspendiert und homogenisiert (Dounce). Nach erneuter Zentrifugation wie zuvor wurden die Pellets in einem Dounce-Homogenisator in einer Gesamtmenge von 50 ml sterilem destilliertem Wasser resuspendiert Nach Stehenlassen für 17 h bei 4°C wurde die Konjugat-Präparation 3,5 Minuten lang bei 1000 UpM in einem TH-4-Rotor in einer TJ-6-Zentrifuge zentrifugiert und eine kleine Menge Sediment entfernt Die endgültige Konjugatprodukt-Suspension wurde auf Protein (Lowry), Pn6B-Polysaccharid (Phenol/Schwefelsäure), unkonjugiertes Polysaccharid (Größenausschlußchromatographie-Geschwindigkeitsnephelometrie) und Aminosäuren (Aminosäureanalyse) untersucht. Die Ergebnisse waren wie folgt:

Pn6B-Polysaccharid 0,33 mg/ml

Protein 2,2 mg/ml

Pn6B-Ps/OMPC 0,15

freies Pn6B-Ps < 5 Flächen-%

S-Carboxymethylhomocystein/Lysin 7,7%

S-Carboxymethylcysteamin/Lysin 1,6%
BEISPIEL 6
Herstellung von partiell hydrolysiertem, gereinigtem Pn14-Ps:

(1) Behandlung mit Anionenaustauscherharz: Eine Portion von 2,81 g Pn14-Ps-Pulverwurde in 1124 ml destilliertem H₂O unter Rühren bei Raumtemperatur etwa 4 Stunden lang solubilisiert und dann bei 4°C über Nacht gelagert. Die Lösung wurde zu 60 g DE52 (Whatman, Diethylaminoethylcellulose) zugegeben, die etwa 15 h lang in destilliertem H₂O bei einem pH von etwa 5–6 vorgequollen worden war. Die Aufschlämmung wurde auf einer Schüttelplattform bei Raumtemperatur etwa 15 h lang sanft geschüttelt, wonach sie in einem Beckman JA-10-Rotor 15 Minuten lang bei 5000 UpM und 20°C zentrifugiert wurde. Die Überstandsflüssigkeit wurde durch einen Sinterglastrichter (150 ml, mittlere Porosität) weiter geklärt und in einem 2-Liter-Seitenhalskolben gesammelt.
(2) Beschallungshydrolyse: Das DE52-behandelte Pn14-Ps (Volumen – 1100 ml, aus Schritt 1 oben) wurde in einem Kunststoffbecherglas auf einem Eisbad mit einem Branson Sonifier (Halbzoll-Sonde, Einstellung 8) 2 Minuten lang beschallt. Die Probe wurde etwa 15 Minuten lang abkühlen gelassen, während die Viskosität bestimmt wurde, und dann für weitere einminütige Intervalle beschallt. Eine Endviskosität von 1,096 Zentistokes wurde nach der letzten Schallbehandlung erzielt. Die hydrolysierte Probe wurde auf Raumtemperatur gebracht und Natriumacetat-Reagens (18,0 g) wurde bis zu einer Endkonzentration von 1% (Gew./Vol.) zugegeben.
(3) Serologische Untersuchung: Eine Isopropanol(IPA)-Fraktionierungspilotstudie und ein antikörpergesteuerter Endpunkt-Nephelose-Assay, durchgeführt mit einer 10-ml-Portion der Probe, zeigten, daß das Pn14-Ps zwischen 35–45% IPA ausfallen würde.
(4) Erste IPA-Zugabe: Die hydrolysierte Probe [Volumen – 1090 ml, aus Schritt 2 oben] wurde durch die Zugabe von 706 ml IPA (tropfenweise unter Rühren bei Raumtemperatur zugegeben) auf 39,3% IPA gebracht. Die Probe wurde 15–30 Minuten lang rühren gelassen und dann 30 Minuten lang bei 11.000 × g zentrifugiert (Beckman JA-10-Rotor; 8.000 UpM; 20°C) und die Überstandsflüssigkeit dekantiert. Das Abfallpellet wurde mit absolutem EtOH in einem 250-ml-Omnimix-Gefäß trituriert, dann auf einem 60-ml-Sinterglastrichter gesammelt. Der Niederschlag wurde direkt auf dem Trichter mit absolutem EtOH, dann Aceton gewaschen und im Vakuum über CaCl₂ bei Raumtemperatur getrocknet in Vorbereitung auf die Analyse.
(5) Zweite IPA-Zugabe und Produktgewinnung: Die Überstandsflüssigkeit von 39,3% IPA [Volumen – 1712 ml, aus Schritt 4 oben] wurde durch tropfenweise Zugabe von 73,5 ml IPA unter Rühren bei Raumtemperatur auf 41,8% IPA gebracht. Die Probe wurde stehengelassen und zentrifugiert wie in Schritt 4 oben. Das Pellet wurde trituriert, gesammelt, gewaschen und getrocknet wie in Schritt 4 oben. Das Pn14-Ps-Produkt wog 1399 mg.
(6) Dialyse und Lyophilisierung: Eine Portion (1385,6 mg) der Probe aus Schritt 5 oben wurde in 554 ml destilliertem H₂O bei Raumtemperatur 2–3 Stunden lang solubilisiert. Die Lösung (2,5 mg/ml) wurde in einen Dialyseschlauch (MW-Ausschluß 12.000; 45 mm) überführt und unter 2 weiteren Austauschen von destilliertem H₂O 27 Stunden lang gegen destilliertes H₂O dialysiert. Dann wurde die dialysierte Probe in Lyophilisierungskolben überführt, in einem Trockeneis:Methanol-Bad rollschichtgefroren und mit einem Virtis(Freezemobile)-Lyophilisator 2–1/2 Tage bis zur Trockne lyophilisiert. Die Ausbeute an Pn14-Ps-Endprodukt, welches einen K_d von 0,56 besaß, betrug 1326,8 mg.

Für Fachleute sollte aus dieser Offenbarung offensichtlich sein, daß andere neutrale Pn-Ps-Subtypen wie Pn7F-Ps nach dem hier offenbarten Verfahren hergestellt werden und wie Pn14-Ps, das ebenfalls ein neutrales Polysaccharid ist, konjugiert werden könnten.
BEISPIEL 7
Konjugation des Komplexes des Proteins der äußeren Membran mit Pneumokokken-14-Polysaccharid, Pn14-Ps-OMPC:
a. Herstellung des 1,4-Butandiamin-Derivats von Pn14-Ps (Pn14-BuA₂):
Eine 410-mg-Portion von Pn14-Ps nach einer 3-ständigen Lagerung im Vakuum über P205 wurde mit 26 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) bedeckt und zur Lösung 0,75 h lang gerührt Dazu wurden 62 mg Carbonyldiimidazol zugegeben und die resultierende Lösung 80 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) gerührt.
Eine Lösung, enthaltend 1,067 g 1,4-Butandiamin-Dihydrochlorid (BuA₂·2HCl) in 38,5 ml H₂O wurde hergestellt und deren pH mit 2,5 N NaOH auf 10,20 eingestellt. Diese Lösung wurde durch ein 0,2-μm-GV-Filter von Millex filtriert und in einem Eisbad gekühlt.
Die gealterte DMSO-Lösung wurde zu der kalten BuA₂-Lösung zugegeben und weitere 10 Minuten lang in dem Eisbad gerührt. Sie wurde dann 50 Minuten lang bei RT stehengelassen, wonach die Lösung in zwei 12-Inch-Längen von Spectrapor-2-Dialyseschlauch eingebracht wurde, 1 cm vom oberen Rand der Flüssigkeit abgeklemmt und dialysiert wurde gegen: 1) 15 l 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, für 16,5 h; 2) 15 l 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, für 8 h; 3) 15 l 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, für 8 h; 4) 15 l H₂O für 17,5 h. Sie wurde dann lyophilisiert, um 210 mg des 1,4-Butandiamin-Derivats von Pn14-Ps(Pn14-BuA₂) zu ergeben.
Ein NMR-Spektrum einer Probe von etwa 5 mg zeigte eine ”Beladung” von etwa 31 Butandiaminresten pro 100 sich wiederholender Polysaccharideinheiten, festgestellt durch Vergleich der Integrale der Butandiamin-Methylene und der N-Acetylmethyl(von Pn14-Ps)-Resonanzen.
b. Herstellung des bromacetylierten Butandiamin-Derivats von Pn14-Ps(Pn14-BuA₂-BrAc):
Pn14-BuA₂ (210 mg) wurde mit 36 ml eines 0,1 M Borat-Phosphat-Puffers, pH 9,0, bedeckt und 2,5 h lang gerührt, um die Lösung zu bewirken. Dann wurden 195 mg p-Nitrophenylbromacetat, gelöst in 4 ml Acetonitril, zugegeben. Die resultierende Mischung wurde 21 h bei 4°C gerührt Sie wurde dann in einem Spectrapor-2-Schlauch dialysiertgegen: 1) 15 l destilliertes H₂O für 6 h, 2) 15 l destilliertes H₂O für 14,5 h und 3) 15 l destilliertes H₂O für 6 h. Von dem dialysierten Inhalt des Beutels wurden 2,0 ml für Assays entnommen und dann 492 mg getrocknetes Salz von Phosphatpuffer, pH 8,0, (hergestellt durch Lyophilisierung einer 0,1 M Natriumphosphatlösung, pH 8,0) zugegeben. Die Lösung wurde durch zwei 0,2-μm-Corning-Filter filtriert, was in einer wäßrigen Lösung, pH 8,0, von Pn14-BuA₂-BrAc (43 ml) resultierte.
c. Konjugation von OMPC mit Pn14-BuA₂-BrAc-Ps:
50 ml OPMC (Konzentration 3,2 mg/ml) wurden in fünf 10-ml-Zentrifugenröhrchen eingebracht und in einem Beckman 80-Ti-Rotor mit 43.000 UpM (43 K) 2 h lang bei 4°C zentrifugiert. Eine Thiolierungsmischung wurde hergestellt durch Lösen von 350 mg EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure-Dinatriumsalz) und 64 mg Dithiothreit (DTT) in 30 ml Na₂6₄O₇-Puffer, pH 11,0. 346 mg N-Acetylhomocysteinthiolacton wurden zugegeben und die Lösung durch ein 0,2-μm-Corning-Filter (Bechertyp) filtriert.
Die Pellets aus der obigen Zentrifugation wurden jeweils mit 3 ml der filtrierten Thiolierungsmischung (insgesamt 15 ml) disloziert, in einen Dounce-Homogenisator überführt und resuspendiert. Die Röhrchen wurden durch reihenweises Umfüllen von weiteren 5 ml der Thiolierungslösung gespült Der Spülprozeß wurde mit weiteren 5 ml Thiolierungslösung wiederholt. Die kombinierten Spüllösungen wurden im Dounce homogenisiert und das gesamte resuspendierte Material (25 ml) in einen 100-ml-Rundkolben überführt.
Nach Verschließen mit einem Septum und Ersetzen der Luft durch N₂ unter Verwendung eines Firestone-Ventils wurde die Reaktionsmischung 21 h lang stehengelassen. Die 25-ml-Reaktionsmischung wurde dann auf drei Zentrifugenröhrchen aufgeteilt, wovon jedes mit 1 M KH₂PO₄ (wäßrig) aufgefüllt und dann 2 h lang bei 43 K UpM und 4°C zentrifugiert wurde. Die Überstandsflüssigkeiten wurden entfernt und die Pellets in 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 8,0, resuspendiert (eine Gesamtmenge von 30 ml war das endgültige Resuspensionsvolumen).
Anschließend wurde eine zweite Ultrazentrifugation (2 h, 4°C, 43 K UpM) durchgeführt. Nach Entfernung der Überstandsflüssigkeit wurden die Pellets mit Hilfe des Dounce-Verfahrens in der oben hergestellten, filtrierten Pn14-BiA₂-BrAc-Lösung resuspendiert. Ein Ellman-Assay zu diesem Zeitpunkt zeigte eine Gesamtmenge von etwa 23 μMol Thiol an.
Es sollte beachtet werden, daß die Filtration der Pn14-BuA₂-BrAc-Lösung gerade vor der Resuspension des thiolierten Proteins geschieht. Die resultierende Reaktion (d. h. Pn14-BuA₂-BrAc mit thioliertem OMPC) wurde unter Stickstoff (unter Entgasen) in einer N₂-Box bei RT 114 h lang stehengelassen.
Die Reaktion wurde dann mit Endgruppen versehen (d. h., die reaktiven Gruppierungen auf dem Pn14-Ps und OMPC werden deaktiviert) wie folgt: Eine Lösung, enthaltend 75 mg N-Ethylmaleimid (NEM) in 5 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 8,0, wurde zugegeben und die Mischung weitere 22,5 h lang stehengelassen.

Die mit Endgruppen versehene Reaktionsmischung (35 ml) wurde auf 4 Zentrifugenröhrchen aufgeteilt und zentrifugiert (43 K, 2 h, 4°C). Die Pellets wurden in 40 ml TED-Puffer (0,1 M Tris, 0,01 M EDTA, 0,5% 000, pH 8,5) resuspendiert und 19 h lang bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Lösung wurde dann zentrifugiert (43 K, 2 h, 4°C). Die Pellets wurden in 40 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 8, resuspendiert und dann erneut zentrifugiert (43 K, 2 h, 4°C). Diese Pellets wurden in 44 ml destilliertem H₂O resuspendiert und 17 h lang bei 4°C stehengelassen. Eine Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit (1000 UpM, 3,5 Min.) ergab ein kleines Pellet, welches verworfen wurde. Die Überstandsflüssigkeit wurde entnommen, was 43 ml rohes Konjugat mit den folgenden analytischen Eigenschaften ergab:

Test	Ergebnisse
a. Ps-Gehalt	387 μg/ml
b. Protein	1300 μg/ml
Ps/Protein-Verhältnis (berechnet)	0,30
c. Freies Ps	< 5 Flächen-%
d. Aminosäureanalyse
SCMHC/Lysin	9,8%
SCMC/Lysin	3,5%

BEISPIEL 8
Herstellung des Pn23F-Ps-Zwischenprodukts:

(1) Beschallungshydrolyse: Eine 3,0-g-Portion von Pn23F-Ps-Pulver wurde in 1200 ml Salzlösung (0,9% NaCl) unter Rühren bei Raumtemperatur für etwa 4 h solubilisiert. Die Lösung wurde dann in einem Kunststoffbecherglas in einem Eisbad mit einem Branson Sonifier (Halbzoll-Sonde, Einstellung 8) für Intervalle von 3 Minuten bis zu insgesamt 15 Minuten beschallt. Die Viskosität wurde nach jedem Intervall überprüft. Nach 15 Minuten wurde eine weitere Beschallung von 5 Minuten durchgeführt, um eine Endviskosität von 1,206 Zentistokes zu erhalten. Die hydrolysierte Probe wurde auf Raumtemperatur gebracht und Natriumacetat-Reagens (58,4 g) bis zu einer Endkonzentration von 3% (Gew./Vol.) zugegeben.
(2) Serologische Untersuchung: Eine Isopropanol(IPA)-Fraktionierungspilotstudie und ein antikörpergesteuerter Endpunkt-Nephelose-Assay, durchgeführt mit einer 10-ml-Portion der Probe, zeigten, daß das Pn23F-Ps zwischen 35–45% IPA ausfallen würde.
(3) Erste IPA-Zugabe: Die hydrolysierte Probe [Volumen = 1165 ml, aus Schritt 1 oben] wurde durch die Zugabe von 810 ml IPA (tropfenweise unter Rühren bei Raumtemperaturzugegeben) auf 41,0% IPA gebracht. Die Probe wurde 15–30 Minuten lang röhrengelassen und dann 30 Minuten lang bei 11.000 × g zentrifugiert (Beckman JA-10-Rotor, 8.000 UpM; 20°C). Das Abfallpellet wurde mit absolutem EtOH in einem 250-ml-Omnimix-Gefäß trituriert, dann auf einem 60-ml-Sinterglastrichter gesammelt. Der Niederschlag wurde direkt auf dem Trichter mit absolutem EtOH, dann Aceton gewaschen und im Vakuum über CaCl₂ bei Raumtemperatur in Vorbereitung auf die Analyse getrocknet.
(4) Zweite IPA-Zugabe und Produktgewinnung: Die Überstandsflüssigkeit von 41,0% IPA [Volumen = 1925 ml, aus Schritt 3 oben] wurde durch die tropfenweise Zugabe von 85,0 ml IPA unter Rühren bei Raumtemperatur auf 43,5% IPA gebracht. Die Probe wurde stehengelassen und zentrifugiert wie in Schritt 3 oben. Das Pellet wurde trituriert, gesammelt, gewaschen und getrocknet wie in Schritt 3 oben. Das Pn23F-Ps-Produkt wog 1795 mg.
(5) Dialyse und Lyophilisierung: Eine Portion (1779 mg) der Pn-Ps-Probe aus Schritt 4 oben wurde in 712 ml destilliertem H₂O bei Raumtemperatur 3–4 h lang solubilisiert. Die Lösung (2,5 mg/ml) wurde in einen Dialyseschlauch überführt (MG-Ausschluß 12.000; 45 mm) und unter zwei weiteren Austauschen von destilliertem H₂O 27 h lang bei 4°C gegen destilliertes Wasser dialysiert. Dann wurde die Probe in Lyophilisierungskolben überführt, in einem Trockeneis:Methanol-Bad rollschichtgefroren und mit einem Virtis(Freezemobile)-Lyophilisator 2–3 Tage lang lyophilisiert. Die Ausbeute des Ps-Endprodukts betrug 1703 mg. Das Endprodukt besaß einen K_d = 0,60.

BEISPIEL 9
Konjugation des Komplexes des Proteins der äußeren Membran mit dem Pn23F-Ps-Zwischenprodukt:
a. Herstellung von Dowex 50 × 2 (200–400 Mesh) Tetrabutylammoniumform-Harz [Dowex 50 (Bu₄N⁺)]
Dowex 50 × 2 (200–400 Mesh), H⁺-Form (72 g), wurde in H₂O aufgeschlämmt (das bei diesen Verfahren verwendete Wasser war pyrogenfreies, steriles, destilliertes Wasser), auf eine Säule aufgetragen und nacheinander gewaschen mit 1] 800 ml H₂O; 2] 400 ml 6 N HCl; 3] 300 ml H₂O, bis der Ausfluß für pH-Papier neutral ist; 4] 250 g einer 10%igen wäßrigen Tetrabutylammoniumhydroxidlösung, bis der Ausfluß für pH-Papier stark alkalisch ist; 5] 750 ml H₂O.
b. Herstellung von Pn23F-Ps Tetrabutylammoniumform [Pn23F(Bu₄N⁺)]:
Eine 34-ml-Säule von Dowex 50 × 2 (Bu₄N⁺) wurde mit 70 ml H₂O gewaschen. Eine 450-mg-Portion von größensortiertem Pn23F-Ps wurde mit 50 ml H₂O bedeckt und 0,5 h lang gerührt. Diese Lösung wurde auf die Säule aufgetragen und durch Schwerkraft perkolieren gelassen (ca. 2 h). Zu diesem Zeitpunkt wurde an das untere Ende der Säule Vakuum angelegt und die Elution (unter Vakuum) für eine weitere Stunde fortgesetzt. Die Säule wurde mit 25 ml H₂O gewaschen und die vereinigten Ausflüsse lyophilisiert, was 0,5 g des Pn23F(Bu₄N⁺)-Salzes ergab. Dieses wurde in einem Vakuumexsikkator über P₂O₅ für etwa 17 h gelagert.
c. Herstellung des 1,4-Butandiamin-Derivats von Pn23F-Ps (Pn23F-BuA₂):
Die 0,5 g des Pn23F (Bu₄N⁺) von Schritt b oben wurden mit 25 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) bedeckt und zur Lösung 15 Minuten lang gerührt. Dazu wurden 22 mg Carbonyldiimidazol (CDI) zugegeben und die resultierende Lösung bei Raumtemperatur (RT) 0,5 h lang gerührt.
Eine Lösung, enthaltend 507 mg 1,4-Butandiamin-Dihydrochlorid (BuA₂·2HCl) in 32 ml H₂O, wurde hergestellt und deren pH mit 2,5 N NaOH auf 10,23 eingestellt. Diese Lösung wurde durch ein 0,2-μm-GV-Filter von Millex filtriert und in einem Eisbad gekühlt.
Die gealterte DMSO-Lösung wurde zu der kalten BuA₂-Lösung zugegeben und eine weitere Stunde in dem Eisbad gerührt. Sie wurde dann 1 h lang bei RT stehengelassen, wonach die Lösung in 2 × 12 Inch eines Spectrapor-Dialyseschlauchs eingebracht wurde, 1 cm vom oberen Rand der Flüssigkeit abgeklemmt und dialysiert wurde gegen: 1) 15 l 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, für 16 h; 2) 15 l 0,01 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, für 10,5 h; 3) 15 l 0,01 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, für 12,5 h; 4) 15 l H₂O für 10,5 h. Sie wurde dann lyophi-lisiert, um 220 mg des 1,4-Butandiamin-Derivats von Pn23F-Ps (Pn23F-BuA₂) zu ergeben.
Ein NMR-Spektrum von etwa 6,9 mg zeigte eine ”Beladung” von etwa 23,5 Butandiaminresten pro 100 sich wiederholender Polysaccharitdeinheiten, festgestellt durch Vergleich der Integrale der Butandiamin-Methylene und der Rhamnosemethyl(von Pn23F)-Resonanzen.
d. Herstellung des bromacetylierten Butandiamin-Derivats von Pn23F-Ps (Pn23F-BuA-BrAc):
Pn23F-BuA₂ (214 mg) wurde mit 23 ml eines 0,1 M Borat-Phosphat-Puffers, pH 9,0, bedeckt und 30 Minuten lang gerührt, um die Lösung zu bewirken. Dann wurden 230 mg p-Nitrophenylbromacetat in 6 ml Acetonitril zugegeben. Die resultierende Mischung wurde 23 h lang bei 4°C gerührt. Sie wurde dann in einem Spectrapor 2-Schlauch dialysiert gegen: 1) 15 l H₂O für 8 h, 2) 15 l H₂O für 12 h und 3) 15 l H₂O für 6 h. Von dem dialysierten Inhalt des Beutels wurden 1,5 ml für Assays entnommen und dann 490 mg getrocknetes Salz von Phosphatpuffer, pH 8,0, (hergestellt durch Lyophilisierung einer 0,1 M Natriumphosphatlösung, pH 8,0) zugegeben. Das Lösen erfordert ungefähr 15 Minuten, nach welcher Zeit durch ein 0,2-μm-Corning-Filter filtriert wird, was eine wäßrige Lösung, pH 8,0, von Pn23F-BuA₂-BrAc ergibt.
e. Konjugation von OMPC mit Pn23F-BuA₂-BrAc-Ps:
60 ml OMPC (3,1 mg/ml) wurden in 6 10-ml-Zentrifugenrährchen eingebracht und in einem Beckman 80-Ti-Rotor bei 43.000 UpM (43 K) 2 h lang bei 4°C zentrifugiert. Eine Thiolierungsmischung wurde hergestellt durch Lösen von 260 mg EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure-Dinatriumsalz) und 52 mg Dithiothreit (DTT) in 30 ml Na₂B₄O₇. Thiolacton wurde zugegeben und die Lösung durch ein 0,2-μm-Corning-Filter (Bechertyp) filtriert.
Die Pellets aus der obigen Zentrifugation wurden jeweils mit 3 ml der filtrierten Thiolierungsmischung (insgesamt 20 ml) disloziert und in einen Dounce-Homogenisator überführt und resuspendiert Die Röhrchen wurden durch reihenweises Umfüllen von weiteren 6 ml der Thiolisierungslösung gespült. Das Spülverfahren wurde mit weiteren 4 ml Thiolisierungslösung wiederholt. Die vereinigten Spüllösungen wurden in dem Dounce homogenisiert und das gesamte resuspendierte Material (28 ml) in einen 100-ml-Rundkolben überführt. Nach Verschließen mit einem Septum und Ersetzen der Luft durch N₂ unter Verwendung eines Firestone-Ventils wurde die Reaktionsmischung 19 h lang stehengelassen. Die 28-ml-Reaktionsmischung wurde dann auf drei Zentrifugenröhrchen aufgeteilt, von denen jedes mit 1 M Kaliumphosphat (wäßrig) aufgefüllt und dann 2 h lang bei 43 K UpM und 4°C in einem Beckmann 80 Ti-Rotor zentrifugiert wurde. Die Überstandsflüssigkeiten wurden entfernt und die Pellets in 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 8,0, resuspendiert (eine Gesamtmenge von 30 ml war das endgültige Resuspensionsvolumen).
Anschließend wurde eine zweite Ultrazentrifugation (2 h, 4°C, 43 K UpM) durchgeführt Nach Entfernung der Überstandsflüssigkeit wurden die Pellets nach dem Dounce-Verfahren in der filtrierten Pn23F-BuA₂-BrAc-Lösung resuspendiert, die in Abschnitt 7.I.C.3d hergestellt worden war. Ein Ellman-Assay zu diesem Zeitpunkt zeigte eine Gesamtmenge von etwa 28 μMol Thiol in der resultierenden Lösung an.
Es sollte beachtet werden, daß die Filtration der Pn23F-BuA₂-BrAc-Lösung gerade vor der Resuspension des thiolierten Proteins geschieht. Die resultierende Reaktion (d. h. Pn23F-BuA₂-BrAc mit thioliertem OMPC) wurde unter N₂ (unter Entgasen) in einer N₂-Box bei RT 117 h lang stehengelassen.
Die Reaktion wurde dann mit Endgruppen versehen (d. h. die reaktiven Gruppierungen auf dem Pn23F-Ps und OMPC werden deaktiviert) wie folgt Eine Lösung, enthaltend 75 mg N-Ethylmaleimid (NEM) in 5 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 8,0, wurde durch ein 0,22-μm-Filter filtriert, der Reaktion zugegeben und 18 h lang stehengelassen.
Das Gesamtvolumen der mit Endgruppen versehenen Konjugationsmischung betrug 38,5 ml und 1,5 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 8,0, wurden zugegeben, um das Gesamtvolumen auf 40 ml zu bringen. Mit 35 ml dieser Lösung wurden zu gleichen Teilen vier 10-ml-Zentrifugenröhrchen beschickt und jedes davon mit 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 8,0, aufgefüllt Diese wurden bei 43 K UpM, 2 h, 4°C, zentrifugiert. Die Überstandsflüssigkeiten wurden entfernt und jedes der Pellets mit 8 ml TED-Puffer (0,1 M Tris, pH 8,5, 0,01 M EDTA, 0,5% Na-Desoxycholat) disloziert und in einen Dounce-Homogenisator überführt. Die Zentrifugenröhrchen wurden der Reihe nach mit weiteren 8 ml TED-Puffer gespült und die Pellets resuspendiert (insgesamt 40 ml) und bei Raumtemperatur 20 h lang stehengelassen. Das gealterte Material wurde zentrifugiert (wie oben beschrieben) in vier 10-ml-Röhrchen bei 43 K, 2 h, 4°C. Jedes der Pellets wurde mit 8 ml TED-Puffer disloziert, die Röhrchen der Reihe nach mit 8 ml TED-Puffer gespült, resuspendiert und zentrifugiert wie oben beschrieben. Diese Pellets wurden dann in insgesamt 40 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7, resuspendiert und wie oben beschrieben erneut zentrifugiert. Die Pellets wurden in insgesamt 44 ml Wasser resuspendiert und 17 h lang bei 4°C stehengelassen. Eine kleine Menge unlöslicher Stoffe wurde durch eine Zentrifugation bei geringer Geschwindigkeit (1000 UpM, 3,5 Min.) entfernt, was das Produkt in der Überstandsflüssigkeit ergab.

Die resultierende Überstandsflüssigkeit ist die Wirkstoffsubstanz, rohes Konjugat-Vakzin. Das Konjugat besaß die folgenden analytischen Eigenschaften:

Test	Ergebnisse
a. Ps-Gehalt	284 μg/ml
b. Protein	2025 μg/ml
Ps/Protein-Verhältnis (berechn.)	0,14
c. Freies PS	< 5 Flächen-%
d. Aminosäureanalyse
SCMHC/Lysin	6,7%
SCMC/Lysin	1,6%

BEISPIEL 10
Herstellung von Pn-Ps durch Gaulin-Homogenisierung:
Rohes Pneumokokken-Pulver wurde in einer Konzentration von 1,5 mg/ml in Wasser durch Mischen über Nacht bei 4°C solubilisiert. Es wurde auch eine stärker konzentrierte Lösung von Pn-Ps mit 10 mg/ml hergestellt Die Zugabe von 50 mM CaCl₂ war erfolgreich bei der Verringerung der Viskosität der 10 mg/ml-Lösung auf die Viskosität der 1,5 mg/ml-Lösung. Das solubilisierte Pn-Ps wurde dann durch einen Gaulin-Homogenisator geleitet, der auf eine von vier Druckeinstellungen eingestellt war: 13,8, 34,5, 69,0 oder 103 MPa (2000, 5000, 10000 oder 15000 psi). Das gescherte Pn-Ps wurde dann durch Zugabe von 60%igem Isopropanol, der mit einer 2 M Stammlösung auf 50 mM CaCl₂ gebracht worden war, gewonnen. Das Pellet wurde mit 100%igem Ethanol in einem Omnimixer gewaschen und filtriert, um das gefällte Pn-Ps zu gewinnen. Das Pn-Ps wird auf dem Filter mit Aceton gewaschen und dann über CaSO₄ (Drierit) getrocknet und bis zur Analyse bei –70°C gelagert Aliquots des gescherten Pn-Ps werden mit etwa 1 mg/ml resuspendiert und hinsichtlich der Molekulargröße und Polydispersität durch HPSEC-Universalkalibrierung und hinsichtlich des Antigenizitätsindexes durch Geschwindigkeitsnephelometrie analysiert.

Pn-Ps-Subtyp MG, bei dem die Antigenizität abzunehmen beginnt Polydispersität

68 500.000 1,19

14 300.000 1,15

19 F 250.000 1,09

23 F 250.000 1,15
BEISPIEL 11
Maus-T-Zell-Stimulierung:
Dieser Test wird durchgeführt, um die T-Zell-Abhängigkeit/Immunogenizität von Pn-Ps-Konjugat-Vakzinen in Mäusen festzustellen. Dieses Modell wurde verwendet, da Kinder im Alter von weniger als zwei Jahren normalerweise gut auf T-abhängige Antigene ansprechen. Athymische Mäuse besitzen ein abnormes Thymusepithel und deshalb ist ihre Antwort auf T-abhängige Antigene signifikant geringer als bei ihren normalen kongenen Wurfgenossen.
Eine Einzelverdünnung von Vakzin, um eine Dosierung von 0,5 μg Polysaccharid zu ergeben, wurde intraperitoneal erwachsenen athymischen Mäusen (nu/nu) und deren kongenen Kontroll-Wurfgenossen (nu/+) am Tag 0,7 und 28 injiziert. Den Mäusen wurde eine Woche später Blut entnommen und deren individuelle Seren auf Antikörperantwort mittels Radioimmunoassay (RIA) getestet.
Bei dem RIA wurde jedes Mausserum mit C¹⁴-markiertem Pn-Ps kombiniert Ein etwaiger gebildeter Antigen-Antikörper-Komplex wurde dann durch Zugabe von gesättigtem Ammoniumsulfat gefällt Jede behandelte Probe wurde in einem Betazähler 1 Minute lang gezählt. Die Pn6B-Ps-OqMPC-, Pn14-Ps-OMPC-, Pn19F-Ps-OMPC-, Pn23F-Ps-OMPC-, Pn18C-Ps- und Pn4-Ps-Konjugate dieser Erfindung wurden auf diese Weise getestet und befunden, bei den Nu/+-Mäusen eine gute T-Zell-Stimulierung hervorzurufen.
BEISPIEL 12
Immunogenizität von Pn-Ps-Konjugaten bei Rhesusaffenbabys:
Dieser Test wird durchgeführt, um die Immunogenizität von entweder rohem Konjugat oder gefüllten Behältern von Pn-Ps-OMPC- oder Pn-Ps-MIEP-Konjugat-Vakzin bei Affenbabys festzustellen. Das Affenbaby-Modell hat sich als ausgezeichneter klinischer Indikator für das PedvaxHIB^TM-Konjugat-Vakzin erwiesen [Vella et al., Pediatrics, 5. April, Erg., S. 668–675 (1990)] und wurde deshalb als Modell für die Pn-Ps-Konjugat-Vakzin-Beurteilung ausgewählt.
Eine Dosis Vakzin wird intramuskulär (0,25 ml in jede von zwei Stellen) zwei bis drei Monate alten Affenbabys am Tag 0 und 28 injiziert. Den Affen wird am Tag 0, 28 und 42 Blut entnommen und die individuellen Seren auf Antikörperantwort mittels Radioimmunoassay (RIA) getestet.
Bei dem RIA wird jedes Affenserum mit C¹⁴-markiertem Pn-Ps kombiniert. Etwaiger gebildeter Antigen-Antikörper-Komplex wird dann durch die Zugabe von gesättigtem Ammoniumsulfat gefällt. Jede behandelte Probe wird 1 Minute lang in einem Betazähler gezählt. Die immunogene Antwort auf das Vakzin ist zufriedenstellend, wenn mindestens 50% der Versuchstiere eine Antikörperantwort von mindestens 1 μg nach Erhalt von zwei Dosen Vakzin aufweisen.
Pn6B-Ps-OMPC, Pn23F-Ps-OMPC, Pn19F-Ps-OMPC, Pn18C-Ps-OMPC, Pn4-Ps-OMPC und Pn14-Ps-OMPC zeigten, daß sie starke anti-typenspezifische Antikörperantworten hervorrufen. Ferner zeigte eine tetravalente Zusammensetzung, umfassend Pn6B-Ps-OMPC, Pn23F-Ps-OMPC, Pn19F-Ps-OMPC und Pn14-Ps-OMPC, gute Anti-Pn-Ps-Antikörperantworten auf alle vier Serotypen.
BEISPIEL 13
Schutzwirkung von Pneumokokken-Konjugaten bei Chinchillas:
Jedem Chinchilla wurde subkutan oder intramuskulär 0, 0,25, 1,0 oder 4,0 μg Pn6B-Ps-OMPC, adsorbiert an Al(OH)₃, injiziert. Den Chinchillas wurde nach 0, 2, 4, 6 und 8 Wochen Blut entnommen.
Die Tiere wurden mit Streptococcus pneumoniae 6B 8 Wochen nach der Injektion herausgefordert und alle 1–3 Tage durch Otoskopie und Tympanometrie überwacht. Flüssigkeitsansammlungen im Mittelohr wurden für die Kultur abgesaugt und die Tiere zwei Wochen nach der Herausforderung getötet Die getöteten Tiere wurden hinsichtlich einer Mittelohr-Histopathologie analysiert. Es gab eine 60%ige Sterblichkeit bei Tieren, die kein Konjugat erhielten, während sogar die niedrigste Dosis zu 0% Sterblichkeit führte. Es gab keinen Schutz gegen eitrige Mittelohrentzündung bei den Tieren, welche kein Konjugat erhielten, während diejenigen, welche Konjugat enthielten, auf Niveaus zwischen 60 und 100% über alle Dosierungsbereiche hinweg geschützt waren.
BEISPIEL 14
Anti-Pneumokokken-Immunantworten bei 2–5 Jahre alten Kindern:
2–5 Jahre alte Kinder, die zwei Dosen von jeweils 0,5 oder 5 μg Pn6B-Ps enthielten, wurden auf die Produktion von Anti-Pn6B-Ps-Antikörpern durch RIA und ELISA untersucht. Es wurden signifikante Erhöhungen der Anti-Pn6B-Ps-Antikörper beobachtet.
BEISPIEL 15
Geschwindigkeitsnephelometrie von Pneumokokken-Polysacchariden:
Der Zweck dieses Assays ist die Bestimmung des Polysaccharidgehalts und Antigenizitätsindexes von freiem Pn-Ps und Konjugat-Präparationen unter Anwendung von Geschwindigkeitsnephelometrie.
Der Bereich der Standardkurve für die Geschwindigkeitsnephelometrie differiert für die verschiedenen Pn-Ps wie die Antwort pro Pn-Ps-Masseeinheit und der lineare Abschnitt des Antwort-gegen-Pn-Ps-Antigenkonzentration-Diagramms differiert für jedes Pn-Ps. Das hier angegebene Verfahrensbeispiel ist spezifisch für Pn6B-Konjugat und trifft nicht notwendigerweise auf Konjugate anderer Pn-Ps-Typen zu. Ferner werden alaun-adsorbierte Proben und deren jeweilige Standards in 3% Natriumcitrat statt 0,9% NaCl verdünnt, wie im folgenden beschrieben. Wäßrige Konjugat-Proben und -Standards (d. h. diejenigen, welche nicht auf Alaun vorliegen) werden in 0,9% NaCl verdünnt und wiederum auf Nominalkonzentrationen verdünnt, von denen angenommen wird, daß sie innerhalb der Grenzen der Standardkurve liegen.
a) Reagenzien

Salzlösung: 0,9% wäßriges NaCl
Anti-Pn-Ps-Seren: Antiseren (Health Research, Inc., Albany, NY) werden 30fach mit Salzlösung verdünnt
Standards: Herstellung von Standards von 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0 und 4,0 μg/ml Pn-Ps-Konjugat aus einer Stammlösung von 387 μg/ml, deren Konzentration durch den Phenol-Schwefelsäure-Assay für Polysaccharid bestimmt wurde.
Testproben: Vorbereitung in Natriumcitrat-Stammlösung, um eine Endkonzentration von 3% Natriumcitrat zu haben, und Reihenverdünnungen der Testproben auf theoretische Konzentrationen von 1,0, 2,0 und 3,0 μg Pn-Ps/ml.

b) Verfahren
Assay aller Proben und Standards unter Verwendung des Beckman ICS-Geschwindigkeitsnephelometers und Anwendung von Doppelbestimmungen. Bestimmung der Konzentration in den Proben aus der Standardkurve. Multiplikation der Probenkonzentration mit dem Ver-dünnungsfaktor und Mittelung der Werte für jede Testprobe.
Wie zuvor erwähnt, werden die Proben, die bei diesem Verfahren befunden werden, Antigenizitätsindizes unterhalb von 70% aufzuweisen, für die Konjugation verworfen, um sicherzustellen, daß das verwendete Pn-Ps die gewünschten immunologischen Eigenschaften besitzt.
BEISPIEL 16
Klonierung von genomischer DNA, die für MIEP kodiert:
Etwa 0,1 g der durch Phenol inaktivierten N. meningitidis-Zellen (siehe Beispiel 1) wurden in ein frisches Röhrchen eingebracht. Die durch Phenol inaktivierten Zellen wurden in 567 μl TE-Puffer [10 mM TRIS-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0] resuspendiert. Zu den resuspendierten Zellen wurden 30 μl 10%iges SDS und 3 μl 20 mg/ml Proteinase K (Sigma) zugegeben. Die Zellen wurden gemischt und etwa 1 h lang bei 37°C inkubiert, wonach 100 μl 5 M NaCl zugegeben und sorgfältig gemischt wurde. 80 μl 1%iges Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) in 0,7 M NaCl wurden dann zugegeben, es wurde sorgfältig gemischt, und 10 Minuten lang bei 65°C inkubiert. Ein gleiches Volumen (etwa 0,7 bis 0,8 ml) Chloroform/Isoamylalkohol (bei einem Verhältnis von 24:1) wurde zugegeben, sorgfältig gemischt und etwa 5 Minuten lang bei etwa 10.000 × g zentrifugiert. Die wäßrige (obere) Phase wurde in ein neues Röhrchen überführt und die organische Phase verworfen. Ein gleiches Volumen an Phenol/Chloroform/-Isoamylalkohol (bei einem Verhältnis von 25:24:1) wurde der wäßrigen Phase zugegeben, sorgfältig gemischt und etwa 5 Minuten lang bei 10.000 × g zentrifugiert. Die wäßrige Phase (oben) wurde in ein neues Röhrchen überführt und 0,6 Volumina (etwa 420 μl) Isopropylalkohol zugegeben, sorgfältig gemischt und die ausgefällte DNA 10 Minuten lang bei 10.000 × g zentrifugiert Die Überstandsflüssigkeit wurde verworfen und das Pellet mit 70%igem Ethanol gewaschen. Das DNA-Pellet wurde getrocknet und in 100 μl TE-Puffer resuspendiert und repräsentiert genomische N. meningitidis-DNA.
Es wurden zwei DNA-Oligonukleotide synthetisiert, welche dem 5'-Ende des MIEP-Gens und dem 3'-Ende des MIEP-Gens entsprechen (Murakami, E. C., et al., (1989), Infection and Immunity, 57, S. 2318–23]. Die Sequenz des für das 5'-Ende des MIEP-Gens spezifischen DNA-Oligonukleotids war: 5' ACTAGTTGCAATGAAAAAATCCCTG-3'; und die für das 3'-Ende des MIEP-Gens war: 5'-GAATTCAGATTAGGAATTTGTT-3'. Diese DNA-Oligonukleotide wurden als Primer für eine Polymerasekettenreaktions(PCR)-Amplifizierung des MIEP-Gens unter Verwendung von 10 ng genomischer N. meningitidis-DNA eingesetzt. Der PCR-Amphfizierungsschritt erfolgte nach den vom Hersteller (Perkin Elmer) angegebenen Verfahren.
Die amplifizierte MIEP-DNA wurde dann mit den Restriktionsendonukleasen SpeI und EcoRI verdaut. Das 1,3-Kilobasen(kb)-DNA-Fragment, enthaltend den vollständigen kodierenden Bereich von MIEP, wurde durch Elektrophorese auf einem 1,5%igen Agarosegel isoliert und aus dem Gel durch Elektroelution gewonnen [Current Protocols in Molecular Biology, (1987), Ausubel, R. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Smith, J. A., Seidman, J. G., und Struhl, K., Hrsg., Greene Publishing Assoc.].
Der Plasmidvektor pUC-19 wurde mit SpeI und EcoRI verdaut. Die gelgereinigte SpeI-EcoRI-MIEP-DNA wurde in den SpeI-EcoRI-pUC-19-Vektor ligiert und zur Transformation des E. coli-Stammes DH5 eingesetzt. Transformanten, welche den pUC-19-Vektor mit der 1,3-kbp-MIEP-DNA enthielten, wurden durch Restriktionsendonukleasekartierung identifiziert und die MIEP-DNA sequenziert, um deren Identität sicherzustellen.
BEISPIEL 17
Konstruktion des pC1/1.Gal10p(B)ADH1_t-Vektors:
Der Gal10-Promotor wurde aus dem Plasmid YEp52 [Broach et al., (1983) in Experimental Manipulation of Gene Expression, Inouye, M. (Hrsg.), Academic Press, S. 83–117] isoliert durch Gelreinigung des 0,5-Kilobasenpaar(kbp)-Fragments, das nach Spaltung mit Sau3A und HindIII erhalten worden war. Der ADH1-Terminator wurde aus dem Vektor pGAP.tADH2 [Kniskern et el., (1986), Gene, 46, S. 135–141] isoliert durch Gelreinigung des 0,35-kbp-Fragments, das durch Spaltung mit HindIII und SpeI erhalten worden war. Die beiden Fragmente wurden mit T4-DNA-Ligase mit dem gelgereinigten pUC18ΔHindIII-Vektor ligiert (die HindIII-Stelle wurde eliminiert durch Verdauung von pUC18 mit HindIII, Erzeugung stumpfer Enden mit dem Klenow-Fragment von E. coli-DNA-Polymerase I und Ligierung mit T4-DNA-Ligase), welcher mit BamHI und SphI verdaut worden war; um den Stammvektor pGal10.tADH1 zu bilden. Dieser besitzt eine nur einmal vorkommende HindIII-Klonierungsstelle an der Gal10p.ADH1,-Verbindungsstelle.
Die nur einmal vorkommende HindIII-Klonierungsstelle von pGal10.tADH1 wurde zu einer nur einmal vorkommenden BamHI-Klonierungsstelle verändert durch Verdauung von pGal10.tADH1 mit HindIII, Gelreinigung der geschnittenen DNA und Ligierung unter Verwendung von T4-DNA-Ligase mit dem folgenden HindIII-BamHl-Linker:
Bei dem resultierenden Plasmid, pGal10(B)tADH1, ist die HindIII-Stelle deletiert und eine nur einmal vorkommende BamHI-Klonierungsstelle geschaffen worden.
Das Gal10p.tADH1-Fragment wurde aus pGal10(B)tADH1 durch Verdauung mit SmaI und SphI isoliert, mit T4-DNA-Polymerase stumpfendig gemacht und gelgereinigt Der Hefe-Shuttle-Vektor pC1/1 (Brake et al., (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, S. 4642–4646] wurde mit SphI verdaut, mit T4-DNA-Polymerase stumpfendig gemacht und gereinigt Dieses Fragment wurde mittels T4-DNA-Ligase in den Vektor ligiert. Die Ligierungsreaktionsmischung wurde dann verwendet, um E. coli-HB101-Zellen zu Ampicillinresistenz zu transformieren und Transformanten wurden gescreent durch Hybridisierung mit einem Einzelstrang des ³²P-markierten HindIII-BamHI-Linkers. Die neue Vektorkonstruktion pC1/1.Gal10p(B)ADH1_t wurde durch Verdauung mit HindIII und BamHI bestätigt.
BEISPIEL 18
Konstruktion eines Hefe-MIEP-Expressionsvektors mit MIEP- + Leader-DNA-Sequenzen Ein DNA-Fragment, enthaltend den vollständigen kodierenden Bereich von MIEP, wurde durch Verdauung von pUC19.MIEP#7 mit SpeI und EcoRI, Gelreinigung der MIEP-DNA erzeugt und mit T4-DNA-Polymerase stumpfendig gemacht.
Der interne Hefe-Expressionsvektor pC1/1.Gal10p(B)ADH1_t wurde mit BamHI verdaut, mit alkalischer Kalbsdarmphosphatase dephosphoryliert und mit T4-DNA-Polymerase stumpfendig gemacht. Die DNA wurde gelgereinigt, um ungeschnittenen Vektor zu entfernen.
Das stumpfendige 1,1-kbp-Fragment von MIEP wurde mit dem stumpfendigen pC1/1.Gal10p(B)ADH1_t-Vektor ligiert und die Ligierungsreaktionsmischung eingesetzt, um kompetente E. coli-DH5-Zellen zu Ampicillinresistenz zu transformieren. Transformanten wurden gescreent durch Hybridisierung mit einem ³²P-markierten DNA-Oligonukleotid: 5'... AAGCTCGGATCCTAGTTGCAATG...3', welches konstruiert wurde, um Homologie zu Sequenzen aufzuweisen, welche die MIEP-Vektor-Verbindungsstelle überlappen. DNA-Präparationen wurden aus hybridisierungspositiven Transformanten hergestellt und mit KpnI und SelI verdaut, um zu verifizieren, daß das MIEP-Fragment in der korrekten Orientierung zur Expression durch den Gal10-Promotor vorlag. Eine weitere Bestätigung der DNA-Konstruktion wurde erhalten durch Didesoxysequenzierung vom Gal10-Promotor in den für MIEP kodierenden Bereich.
Expression von MIEP durch die Transformanten wurde durch Western-Blot-Analyse nachgewiesen. Rekombinantes MIEP, das in den Transformanten produziert worden war, wanderte auf Polyacrylamidgelen zusammen mit MIEP, das aus OMPC-Vesikeln gereinigt worden war, und konnte immunologisch mit MIEP-spezifischen Antikärpern reagieren.
BEISPIEL 19
Konstruktion des Hefe-MIEP-Expressionsvektors mit einer 5'-modifizierten MIEP-DNA-Sequenz
Ein DNA-Oligonukleotid, enthaltend eine HindIII-Stelle, einen konservierten nicht-translatierten 5'-Hefe-Leader (NTL), ein Methionin-Startcodon (ATG), die ersten 89 Codons des reifen MIEP (beginnend mit Asp an Position +20) und eine KpnI-Stelle (an Position +89), wurde unter Einsatz der Polymerasekettenreaktionstechnik (PCR) erzeugt. Die PCR wurde durchgeführt wie vom Hersteller angegeben (Perkin Elmer Cetus) unter Verwendung des Piasmids pUC19MIEP42#7 als Matrize und der folgenden DNA-Oligomeren als Primer:
Zur Entfernung des 5'-Bereichs des MIEP-Klons wurde das Plasmid pUC19MIEP42#7 mit KpnI und HindIII verdaut und das 3,4-kbp-Vektorfragment agarosegelgereinigt. Das 280-bp-PCR-Fragment wurde mit KpnI und HindIII verdaut, agarosegelgereinigt und mit dem 3,4-kbp-Vektorfragment ligiert Transformanten von E. coli HB101 (BRL) wurden durch DNA-Oligonukleotid-Hybridisierung gescreent und die DNA aus positiven Transformanten durch Restriktionsenzymverdauung analysiert Um sicherzustellen, daß keine Mutationen während des PCR-Schritts eingeführt wurden, wurde die 280 bp lange, durch PCR erzeugte DNA der positiven Transformanten sequenziert. Das resultierende Plasmid enthält ein HindIII-EcoRI-Insert, das aus einem Hefe-NTL, ATG-Codon und dem gesamten offenen Leserahmen (ORF) von MIEP, beginnend am Asp-Codon (Aminosäure +20), besteht.
Die Hefe-MIEP-Expressionsvektoren wurden wie folgt konstruiert. Die Vektoren pGal10/pC1/1 und pGAP/pC1/1 [Vlasuk, G. P., et al., (1989) J. B. C., 264, S. 12, 106–12, 112] wurden mit BamHI verdaut, mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I glattendig gemacht und mit alkalischer Kalbsdarmphosphatase dephosphoryliert. Diese linearen Vektoren wurden mit dem oben beschriebenen, mit Klenow behandelten und gelgereinigten HindIII-EcoRI-Fragment, welches den Hefe-NTL, das ATG und den ORF von MIEP enthält, ligiert unter Bildung von pGal10/pC1/1-MIEP und pGAP/pC1/1-MIEP.
Der Saccharomyces cerevisiae-Stamm U9 (gal10pgal4-) wurde mit dem Plasmid pGal10/pC1/1-MIEP transformiert. Rekombinante Klone wurden isoliert und auf Expression von MIEP überprüft. Die Klone wurden bei 37°C unter Schütteln in synthetischem Medium (leu-), das 2% Glucose (Gew./Vol.) enthielt, bis zu einer OD₆₆₀ von etwa 6,0 gezüchtet. Anschließend wurde Galactose bis 2% (Gew./Vol.) zugegeben, um Expression von MIEP durch den Gal10-Promotor zu induzieren. Die Zellen wurden nach der Galactose-Induktion weitere 45 h lang auf eine OD₆₆₀ von etwa 9,0 gezüchtet. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugation geerntet. Das Zellpellet wurde mit destilliertem Wasser gewaschen und eingefroren.
Western-Blot für rekombinantes MIEP:
Zur Feststellung, ob die Hefe MIEP exprimierte, wurde eine Western-Blot-Analyse durch-geführt. 12%ige Novex-Laemmli-Gele, 1 mm, 10 bis 15 Vertiefungen, wurden eingesetzt Die Hefezellen wurden in H₂O mit Hilfe von Glasperlen aufgebrochen (Natriumdodecylsulfat (SDS) kann während des Aufbruchprozesses mit 2% eingesetzt werden). Die Zelltrümmer wurden durch einminütige Zentrifugation bei 10.000 × g entfernt.
Der Überstand wurde mit Probenlaufpuffer gemischt, wie für die Polyacrylamidgelreinigung von MIEP beschrieben. Die Proben wurden bei 35 mA laufengelassen, unter Verwendung von OMPC als Referenzkontrolle, bis der Bromphenolblau-Farbstoffmarker aus dem Gel läuft.
Die Proteine wurden unter Verwendung einer NOVEX-Transferapparatur auf Nitrocellulosepapier mit 0,45 μm Porengröße überführt Nach dem Transfer wurde das Nitrocellulosepapier mit 5%igem Rinderserumalbumin in phosphatgepufferter Salzlösung 1 h lang blockiert, wonach 15 ml einer 1:1000-Verdünnung von Anti-MIEP-Kaninchen-Antiserum (erzeugt durch Immunisierung mit gelgereinigtem MIEP nach Standardverfahren) zugegeben wurden. Nach einer Übernachtinkubation bei Raumtemperatur wurden 15 ml einer 1:1000-Verdünnung von mit alkalischer Phosphatase konjugiertem Anti-Kaninchen-Ziegen-IgG zugegeben. Nach 2 h Inkubation wurde der Blot unter Verwendung von FAST RED TR SALT (Sigma) und Naphthol-AS-MX-Phosphat (Sigma) entwickelt.
BEISPIEL 20
bakterielle Expression von rekombinantem MIEP
Das Plasmid pUC19-MIEP, enthaltend das 1,3-Kilobasenpaar-MIEP-Gen-Insert, wurde mit den Restriktionsendonukleasen SpeI und EcoRI verdaut Das 1,1-kbp-Fragment wurde isoliert und auf einem Agarosegel nach im Stand der Technik bekannten Standardverfahren gereinigt. Das Plasmid pTACSD, enthaltend den Zwei-Cistron-TAC-Promotor und eine nur einmal vorkommende EcoRI-Stelle, wurde mit EcoRI verdaut. Stumpfe Enden wurden sowohl bei der 1,3-kbp-MIEP-DNA als auch dem pTACSD-Vektor unter Verwendung von T4-DNA-Polymerase (Boehringer Mannheim) nach den Anweisungen des Herstellers erzeugt. Die stumpfendige 1,3-kbp-MIEP-DNA wurde in den stumpfendigen Vektor unter Verwendung von T4-DNA-Ligase (Boehringer Mannheim) nach den Anweisungen des Herstellers ligiert. Die ligierte DNA wurde eingesetzt, um den E. coli-Stamm DH5alQMAX (BRL) nach den Anweisungen des Herstellers zu transformieren. Die transformierten Zellen wurden auf Agarplatten ausplattiert, die 25 μg Kanamycin/ml und 50 μg Penicillin/ml enthielten, und etwa 15 h lang bei 37°C inkubiert. Ein DNA-Oligonukleotid mit einer zu MIEP homologen Sequenz wurde mit ³²P markiert und zum Screenen von Nitrocellulosefiltern, die lysierte denaturierte Kolonien von den Platten von Transformanten enthielten, unter Anwendung von Standard-DNA-Hybridisierungstechniken eingesetzt. Kolonien, die sich bei der Hybridisierung als positiv erwiesen, wurden mit Hilfe von Restriktionsendonukleasen kartiert, um die Orientierung des MIEP-Gens zu bestimmen.
Die Expression des MIEP durch die Transformanten wurde durch Western-Blot-Analyse nachgewiesen. Rekombinantes MIEP, das in den Transformanten produziert worden war, wanderte auf Polyacrylamidgelen zusammen mit MIEP, das aus OMPC-Vesikeln gereinigt worden war, und konnte immunologisch mit MIEP-spezifischen Antikörpern reagieren.
BEISPIEL 21
Konjugation von Pn-Ps an N. meningitidis-MIEP:
Die chemischen Konjugationen wurden nach dem im US-Patent Nummer 4,882,317 offenbarten Verfahren durchgeführt.
10 mg MIEP in 3 ml 0,1 M Boratpuffer, pH 11,5, wurden mit 10 mg Ethylendiamintetraessigsäure-Dinatriumsalz (EDTA, Sigma Chemicals) und 4 mg Dithiothreit (Sigma Chemicals) gemischt. Die Proteinlösung wird gründlich mit N₂ gespült. 125 mg N-Acetylhomocysteinthiolacton (Aldrich Chemicals) werden der MIEP-Lösung zugegeben und die Mischung 16 h lang bei Raumtemperatur inkubiert. Sie wird dann zweimal unter N₂ gegen 2 l 0,1 M Boratpuffer, pH 9,5, der 4 mM EDTA enthält, 24 h lang bei Raumtemperatur dialysiert. Das thiolierte Protein wird dann hinsichtlich des Thiolgehalts durch Ellmans Reagens (Sigma Chemicals) untersucht und die Proteinkonzentration durch Bradford-Reagens (Pierce Chemicals) bestimmt Für die Konjugation von MIEP an Pn-Ps wird ein 1,5facher Überschuß (Gew./Gew.) von bromacetyliertem Pn-Ps der MIEP-Lösung zugegeben und der pH mit 1 N NaOH auf 9–9,5 eingestellt. Die Mischung wird unter N₂ 6–8 h lang bei Raumtemperatur inkubieren gelassen. Am Ende der Reaktionszeit werden 25 μl N-Acetylcysteamin (Chemical Dynamics) der Mischung zugegeben und 18 h lang unter N₂ bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Konjugat-Lösung wird mit 1 N HCl auf zwischen pH 3 bis 4 angesäuert und eine Zentrifugation 10 Minuten lang bei 10.000 × g durchgeführt. 1 ml der Überstandsflüssigkeit wird direkt auf eine Säule von FPLC-Superose 6B (1,6 × 50 cm, Pharmacia) aufgebracht und das Konjugat mit PBS eluiert. Der Peak des Hohlraumvolumens, welcher das Polysaccharid-Protein-Konjugat (Pn-Ps-MIEP) enthält, wird gepoolt. Die Konjugat-Lösung wird dann zur Sterilisation durch ein 0,22-μm-Filter filtriert.
BEISPIEL 22
Demonstration der Immunogenizität von Pn-Ps-MIEP-Konjugaten:
Immunisierungen: Männliche Balb/c-Mäuse (Charles River, Wilmington, MA) werden mit kovalent an MIEP konjugiertem Pn-Ps unter Einsatz von 2,5 μg Pn-Ps in 0,5 ml vorgebildeten Alauns IP immunisiert. Kontrollmäuse werden mit äquivalenten Mengen an Pn-Ps immunisiert, die als Pn-Ps-CRM (Anderson, M. E., et al., (1985), J. Pediatrics, 107, S. 346–351] (2,5 μg Pn-Ps/6,25 μg CRM; 1/4 der Human-Dosis), Pn-Ps-DT (2,5 μg Pn-Ps/1,8 μg DT; 1/10 der Human-Dosis, so daß konstante Mengen von Pn-Ps eingesetzt werden) und Pn-Ps-OMPC (2,5 μg Pn-Ps/35 μg OMPC; 1/4 der Human-Dosis) gegeben werden.
6–13,5 Wochen alte Rhesusaffenbabys werden mit Pn-Ps-MIEP-Konjugaten, adsorbiert an Alaun, immunisiert. Jeder Affe enthält 0,25 ml Konjugat an zwei verschiedenen Injektionsstellen für eine Gesamtdosis von 0,5 ml. Die Affen werden am Tag 0,28 und 56 immunisiert und es werden alle 2 bis 4 Wochen Blutproben entnommen.
Die Antikörperantworten werden durch den ELISA gemessen, welcher die Klasse und Subklasse der Immunglobulinantwort unterscheidet. Ein RIA, welcher die Gesamtmenge an Anti-Pn-Ps-Antikörper quantitativ bestimmt, wird ebenfalls eingesetzt, um die Affen-Antwort zu bewerten.
Pn-Ps-MIEP-Konjugate sind imstande, bei Mäusen eine Immunantwort hervorzurufen, bestehend aus Anti-Pn-Ps-IgG-Antikörper und einer Erinnerungsantwort. Dies steht im Gegensatz zu den Pn-Ps-CRM und Pn-Ps-DT, welche keinen meßbaren Anti-Pn-Ps-Antikörper hervorrufen. Somit wirkt MIEP als immunologisches Trägerprotein für Pn-Ps und ist imstande, bei kovalenter Konjugation mit dem Pn-Ps-Antigen eine Anti-Pn-Ps-Antikörperantwort zu veranlassen. Gereinigtes MIEP ist deshalb ein effektives immunologisches Trägerprotein, welches das heterogene OMPC bei der Konstruktion bakterieller Polysaccharid-Konjugat-Vakzine ersetzt.
BEISPIEL 23
Quantitative Bestimmung des C-Polysaccharid-Gehalts in Pn-Ps-Präparationen:
Es wurden Systeme zur quantitativen Bestimmung von C-Polysaccharid entwickelt, die auf NMR, enzymatischen oder chromatographischen Methoden beruhen. Im vorliegenden Fall wurde die chromatographische Abtrennung von Cholin (eine Komponente von C-Ps) aus Proben von hydrolysierten Pn-Ps angewandt und mit diesen anderen Methoden verglichen. Das Cholin wurde abgetrennt auf einer Kationenaustauschersäule, gekoppelt mit einem Nachweis unterdrückter Leitfähigkeit.
Proben von Pn-Ps wurden durch Behandlung mit 36%iger Fluorwasserstoffsäure für 2 h bei 45–65°C, gefolgt von 2 M Trifluoressigsäure für 16 h bei 100°C, vollständig hydrolysiert Nach der Hydrolyse wurden 200–300 μg der Probe injiziert in ein Dionex BioLC-Chromatographiesystem mit einer Omnipac PCX-500-Analyse- und Überwachungssäule, einer Ion Pac CTC-1-Kationeneinfangsäule, einem CMMS-2-Micromembransuppressor, regeneriert mit 50 mM Tetrabutylammoniumhydroxid (10 ml/Mmn.), und einer Leitfähigkeitsdetektoreinstellung auf eine Empfindlichkeit von 1 μSiemens. Die Probe wurde unter Verwendung von 5% 200 mM HCl, 5% 20%iges Acetonitril, 85% MilliQ-Wasser, 5% 20 mM Diaminopropionsäure isokratisch eluiert. Cholin eluierte als scharfer Peak nach etwa 10 Minuten.
Gereinigtes C-Ps (erhalten vom Statens Serum Institut) wurde mit diesem Verfahren hinsichtlich des Cholingehalts analysiert und ein Wert von 5,4 Gew.-% Cholin erhalten. Dieser Wert stimmt mit veröffentlichten Angaben des Cholingehalts von C-Ps überein.
Dieser Faktor wurde zur Berechnung der C-Ps-Konzentration in verschiedenen Proben von Pn-Ps-Präparationen verwendet, indem die Nanomolmengen des durch HPLC erhaltenen Cholins in Massenwerte umgerechnet wurden. Durch Vornahme der Umrechnung von 5,4 Gew.-% Cholin wurde die C-Ps-Menge nach Gewicht berechnet. Proben mit C-Ps-Konzentrationen über 3% wurden als für die Konjugation unakzeptabel verworfen. Die folgende Tabelle zeigt die Korrelation dieser Methode mit den NMR- und enzymatischen Methoden und zeigt typische C-Ps-Verunreinigungsniveaus in Präparationen von Pn-Ps verschiedener Reinheitsgrade:

Probe NMR Enzymatisch HPLC

Pn6B-Ps 20% n. b. 18,4%

Pn6B-Ps 1,6% 0,3–1,0% 1,2%

Pn23F-Ps n. b. 2,8% 3,7%

Pn14-PS 2,9% 2,4% 3,2%

Pn19F-Ps 2,7% 2,6% 2,6%
BEISPIEL 24
Herstellung von partiell hydrolysiertem, gereinigtem Pn18C-Ps:

(1) Beschallungshydrolyse: Eine 3,0-g-Portion von Pn18C-Ps-Pulver wurde in 1200 ml Salzlösung (0,9% NaCl) unter Rühren bei Raumtemperatur für etwa 3–4 h solubilisiert, dann bedeckt und bei 4°C über Nacht gelagert Die Lösung wurde dann in einem Kunststoffbecherglas im Eisbad mit einem Branson Sonifier (Halbzoll-Sonde, Einstellung 8) für Intervalle von 20 Minuten (in 5-minütigen Aktivitätsintervallen) bis insgesamt 40 Minuten beschallt. Die Viskosität wurde nach jedem Intervall überprüft.
Nach 40 Minuten wurde eine weitere 10-minütige Beschallung durchgeführt, um eine Endviskosität von 1,218 Zentistokes zu erhalten. Die hydrolysierte Probe (Volumen – 1188 ml) wurde auf Raumtemperatur gebracht und Natriumacetat-Reagens (59,2 g) wurde bis zu einer Endkonzentration von 3% (Gew./Vol.) zugegeben.
(2) Serologische Untersuchung: Eine Isopropanol(IPA)-Fraktionierungsuntersuchung und ein antikörper-gesteuerter Endpunkt-Nephelose-Assay, durchgeführt mit einer 10-ml-Portion der Probe, zeigten, daß das Pn18C-Ps zwischen 40–50% IPA ausfallen würde.
(3) Erste IPA-Zugabe: Die hydrolysierte Probe [Volumen = 1200 ml, aus Schritt 1 oben] wurde durch die Zugabe von 894 ml IPA (tropfenweise unter Rühren bei Raumtemperatur zugegeben) auf 42,7% IPA gebracht Die Probe wurde 15–30 Minuten rühren gelassen und dann 30 Minuten lang bei 11.000 × g zentrifugiert (Beckman JA-10-Rotor, 8.000 UpM; 20°C). Das Abfallpellet wurde mit absolutem EtOH in einem 250-ml-Omnimix-Gefäß trituriert, dann auf einem 60-ml-Sinterglastrichter gesammelt Der Niederschlag wurde direkt auf dem Trichter mit absolutem EtOH, dann Aceton gewaschen und im Vakuum über CaSO₄ (Drierit) bei Raumtemperatur in Vorbereitung auf die Analyse getrocknet.
(4) Zweite IPA-Zugabe und Gewinnung des Zwischenprodukts: Die Überstandsflüssigkeit von 42,7% IPA [Volumen = 2016 ml, aus Schritt 3 oben] wurde durch tropfenweise Zugabe von 92,0 ml IPA unter Rühren bei Raumtemperatur auf 45,2% IPA gebracht Die Probe wurde stehengelassen und zentrifugiert wie in Schritt 3 oben. Das Pellet wurde trituriert, gesammelt, gewaschen und getrocknet wie in Schritt 3 oben. Das Pn18C-Ps-Zwischenprodukt wog 1609 mg.
(5) Dialyse und Lyophilisierung: Eine Portion (1612,5 mg) der Probe aus Schritt 4 oben wurde in 645 ml destilliertem H₂O bei Raumtemperatur etwa 2 h lang solubilisiert. Die Lösung (2,5 mg/ml) wurde in einen Dialyseschlauch überführt (MG-Ausschluß 12.000; 45 mm) und unter zwei weiteren Austauschen von destilliertem H₂O 30 h lang gegen destilliertes H₂O bei 4°C dialysiert. Dann wurde die Probe in Lyophilisierungskolben überführt, in einem Trockeneis:Methanol-Bad rollschichtgefroren und mit einem Virtis(Freezemobile)-Lyophilisator 2–3 Tage lang lyophilisiert Die Ausbeute des Ps-Endprodukts betrug 1487 mg.

BEISPIEL 25
S. Pneumoniae 18C-OMPC-Konjugat, Pn18C-Ps-OMPC:

A. Herstellung von Dowex 50 × 2 (200–400 Mesh) Tetrabutylammoniumform-Harz [Dowex 50 (Bu₄N⁺)]: Dowex 50 × 2 (200–400 Mesh), H⁺-Form, (500 g) wurde in H₂O aufgeschlämmt, auf eine Säule aufgebracht und nacheinander gewaschen mit 1] 600 ml H₂O; 2] 1000 ml 6 N HCl; 3] 400 ml H₂O, bis der Ausfluß für pH-Papier neutral war; 4] 72 g einer 10%igen wäßrigen Tetrabutylammoniumhydroxidlösung, bis der Ausfluß für pH-Papier stark alkalisch war; 5] 1000 ml H₂O bis zur Neutralität.
B. Herstellung von S. Pneumoniae Typ 18C-Polysaccharid, Tetrabutylammonium-form [Pn18C(Bu₄N⁺)]: Eine 60-ml-Säule von Dowex 50 × 2 (Bu₄N⁺) wurde mit 250 ml H₂O gewaschen. Pn18C-Polysaccharid (MG-reduziert (650 mg)) wurde mit 65 ml H₂O bedeckt und 1 h lang gerührt, wonach alles in Lösung zu sein schien. Diese Lösung wurde auf die Säule aufgetragen und durch Schwerkraft perkolieren gelassen (2 h lang und dann 1 h lang unter Vakuum). Die Säule wurde mit 150 ml H₂O gewaschen und die vereinigten Ausflüsse lyophilisiert, was 655 mg des 18C(Bu₄N⁺)-Salzes ergab. 25 mg wurden für eine NMR-Analyse entnommen und Material zurückbehalten.
C. Herstellung des 1,4-Butandiamin-Derivats von 18C(18C-BuA₂): 18C(Bu₄N⁺) (630 mg) wurde mit 143 ml DMSO (Dimethylsulfoxid) bedeckt und 3,25 h lang gerührt. Nach dieser Zeit war der gesamte Feststoff gelöst und 1 ml wurde für eine Karl-Fischer-Titration hinsichtlich des Wassergehalts entnommen. Es wurde ein Wert von 28,2 μMol H₂O/ml festgestellt (insgesamt 4 mMol). Zu dieser Lösung wurden 165,1 mg Carbonyldiimidazol (CDI) zugegeben und die resultierende Lösung 2,0 h lang bei Raumtemperatur (RT) gerührt. Eine Lösung, enthaltend 1,260 g 1,4-Butandiamin-Dihydrochlorid (BuA₂·2HCl) in 40 ml H₂O, wurde hergestellt und deren pH mit 2,5 N NaOH auf 10,20 eingestellt. Diese Lösung wurde in einem Eisbad gekühlt. Die gealterte DMSO-Lösung wurde langsam der kalten BuA₂-Lösung zugegeben und weitere 10 Minuten im Eisbad gerührt. Sie wurde dann 50 Minuten lang bei RT gerührt, wonach die Lösung in einen SPECTRAPOR 2-Dialyseschlauch eingebracht wurde, 1,27 cm (1/2 Inch) vom oberen Rand der Flüssigkeit abgeklemmt und wie folgt dialysiert wurde gegen: 1] 15 l 0,1 M NaPO₄-Puffer, pH 7,0, für 13,0 h; 2] 15 l 0,01 M NaPO₄-Puffer, pH 7,0, für 11 h; 3] 15 l 0,01 M NaPO₄-Puffer, pH 7,0, für 10,8 h; 4] 15 l H₂O für 9,5 h. Das Volumen betrug zu diesem Zeitpunkt 190 ml. Ein 7,5-ml-Aliquot wurde entnommen und separat für einen NMR-Assay lyophilisiert. Die verbleibenden 182,5 ml wurden auf 416 mg des 1,4-Butandiamin-Derivats von 18C(Pn18C-BuA₂) lyophilisiert. Ein NMR-Spektrum von etwa 5 mg zeigte eine ”Beladung” von 10 Butandiaminresten pro 100 Polysaccharidmonomereinheiten, festgestellt durch Vergleich der Integrale der Resonanzen der internen Butandiamin-Methylene und der Rhamnose-Methyle (von 18C).
D. Herstellung des bromacetylierten Butandiamin-Derivats von 18C(Pn18C-BuA₂-BrAc): 18C-BuA₂ (416 mg) wurde mit 36 ml eines 0,1 M Puffers (Kolthoff-Borat-Phosphat), pH 9,04, bedeckt und gerührt, um die Lösung zu bewirken. Dann wurden 256 mg p-Nitrophenylbromacetat in 4,48 ml Acetonitril zugegeben. Die resultierende Mischung wurde 20 h lang bei 4°C gerührt. Sie wurde dann in einem SPECTRAPOR 2-Schlauch wie folgt dialysiert 1] gegen 15 l H₂O für 6 h; 2] gegen 15 l H₂O für 6 h; 3] gegen 15 l H₂O für 6 h. Zu diesem Zeitpunkt lag ein Volumen von 60 ml vor, von dem 1,7 ml für Assays (NMR, Ouchterlony und Viscotek) entnommen und dann 2,42 g getrocknetes Salz von Phosphatpuffer, pH 8 (hergestellt durch Lyophilisierung einer 0,1 M NaPO₄-Lösung von pH 8) zugegeben wurden. Nach der Lösung wurde durch ein 0,2-Micron-CORNING-Filter filtriert, was eine wäßrige Lösung, pH 8, von 18C-BuA₂-BrAc ergab. Die Filtration war langsam und erforderte vier Becherfilter.
E. Konjugation von OMPC (N. meningitidis) mit Pn18C-BuA₂-BrAc: Der Komplex des Proteins der äußeren Membran (N. meningitidis), OMPC, 3,2 mg/ml, 80 ml, wurde in vier 25-ml-Zentrifugenröhrchen eingebracht und in einem 60 Ti-Rotor bei 43.000 UpM (43 K) 2 h lang bei 4°C zentrifugiert. Eine Thiolierungsmischung wurde hergestellt durch Lösen von 680 mg EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure-Dinatriumsalz) und 120 mg Dithiothreit (DTT) in 40 ml eines Na₂B₄O₇-Puffers, pH 11,09. 320 mg N-Acetylhomocysteinthiolacton wurden hinzugegeben und dann die Lösung durch ein 0,2-μm-Corning-Filter (Bechertyp) filtriert. Die Pellets aus der obigen Zentrifugation wurden mit 5 ml der filtrierten Thiolierungsmischung (insgesamt 20 ml) disloziert und in einen DOUNCE-Homogenisator überführt und resuspendiert. Die Röhrchen wurden durch reihenweises Umfüllen von weiteren 2/10 ml der Thiolierungslösung gespült Die vereinigten Lösungen wurden im DOUNCE homogenisiert und das gesamte resuspendierte Material (40 ml) in einen 100-ml-Rundkolben überführt Die Glasgeräte wurde mit weiteren 20 ml der Thiolisierungslösung gespült und diese dem Reaktionskolben zugegeben. Nach dem Verschließen des Kolbens mit einem Septum und Ersetzen der Luft durch N₂ unter Verwendung eines FIRESTONE-Ventils wurde die Reaktionsmischung 18,5 h lang stehengelassen. Die 60 ml wurden dann auf vier Zentrifugenröhrchen aufgeteilt, von denen jedes mit 1 M KH₂PO₄ (wäßrig) aufgefüllt und dann 2 h lang bei 43 K und 4°C zentrifugiert wurde. Die Überstände wurden entfernt und die Pellets in 0,1 M NaPO₄-Puffer, pH 8, resuspendiert (eine Gesamtmenge von 40 ml war das endgültige Resuspensionsvolumen). Diese Lösung wurde zu gleichen Teilen in zwei 25-ml-Zentrifugenröhrchen (Polycarbonat) überführt und die Glasgeräte (DOUNCE etc.) wurden mit etwa 10 ml Phosphatpuffer, pH 8, gespült und diese zum Auffüllen der Zentrifugenröhrchen verwendet Dann wurde eine zweite Ultrazentrifugation (2 h, 4°C, 43 K) durchgeführt. Die Pellets wurden in 30 ml 0,1 M PO₄-Puffer, pH 8, resuspendiert Ein Ellman-Assay zeigte eine Gesamtmenge von 24 μMol SH oder etwa 100 nMol/mg OMPC an. Das thiolierte Protein wurde in einen 100-ml-Rundkolben überführt und die filtrierte 18C-BuA₂-BrAc-Lösung zugegeben. Die resultierende Reaktion (d. h. 18C-BuA₂-BrAc mit thioliertem OMPC) wurde unter N₂ (unter Entgasen) in der N₂-Box 89 h lang bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Reaktion wurde dann wie folgt mit Endgruppen versehen: Eine Lösung, enthaltend 75 mg N-Ethylmaleimid (NEM) in 5 ml 0,1 M NaPO₄-Puffer, pH 8, wurde durch ein 0,22-μm-Filterfiltriert und 2 ml der obigen Reaktionsmischung zugegeben und 4 h lang stehengelassen. Dann wurden 0,5 ml N-Acetylcysteamin in 2,5 ml 0,1 M PO₄-Puffer, pH 8, durch ein 0,22-μm-Filter filtriert und 1,0 ml dieser Lösung der Reaktion zugegeben und 22,5 h lang stehengelassen. Das mit Endgruppen versehene Produkt wurde dann zu gleichen Teilen in vier 25-ml-Zentrifugenröhrchen eingebracht und mit insgesamt 8 ml 0,1 M PO₄-Puffer, pH 8, überschichtet und bei 43 K, 2 h, 4°C zentrifugiert. Nach Entfernung der Überstände wurden die Pellets in einem DOUNCE-Homogenisator in einer Gesamtmenge von 40 ml TED-Puffer resuspendiert, die Glasgeräte mit weiteren 10 ml TED-Puffer gespült und die Lösung in zwei 25-ml-Röhrchen überführt. Diese Röhrchen wurden 15,25 h lang bei Raumtemperatur gelagert und dann 2 h lang bei 43 K UpM und 24°C zentrifugiert Die resultierenden Pellets wurden in einem DOUNCE-Homogenisator in einer Gesamtmenge von 30 ml TED-Puffer resuspendiert, in zwei 25-ml-Zentrifugenröhrchen überführt, die Glasgeräte mit weiteren 20 ml TED-Puffer gespült und 2 h lang bei 43 K und 4°C erneut zentrifugiert. Die Pellets wurden in 50 ml Phosphatpuffer, pH 7, resuspendiert und einer dritten Zentrifugation bei 43 K für 2 h bei 4°C unterworfen. Die Pellets wurden in 82 ml Wasser resuspendiert und in 20,5-ml-Portionen in zwei sterile 50-ml-Kunststoffzentrifugenröhrchen (FALCON) überführt. Nach dem Stehenlassen bei 4°C für 18 h wurde die Konjugat-Präparation 3,5 Minuten lang bei 1000 UpM in einem TH-Rotor in einer TJ-6-Zentrifuge zentrifugiert. Die endgültige Konjugatprodukt-Suspension wurde auf Protein (Lowry), 18C-Polysaccharid (Phenol/Schwefelsäure), unkonjugiertes Polysaccharid (Größenausschlußchromatographie-Geschwindigkeitsnephelometrie) und Aminosäuren (SPINCO) untersucht: Polysaccharid = 339 μg/ml; Protein = 2,57 mg/ml; freies Polysaccharid: < 5% (Grenze des Versuchsfehlers); S-Carboxymethylhomocystein/Lysin = 0,025; S-Carboxymethylcysteamin/Lysin = 0,005.

BEISPIEL 26
Herstellung des Pn4-Ps-Zwischenprodukts:

(1) Beschallungshydrolyse: Eine 1,0-g-Portion von Pn4-Ps-Pulver wurde in 400 ml Salzlösung (0,9% NaCl) unter Rühren bei Raumtemperatur etwa 4 h lang solubilisiert Die Lösung wurde dann in einem Kunststoffbecherglas in einem Eisbad mit einem Branson Sonifier (Halbzoll-Sonde, Einsteilung 8) für Intervalle von 10 Minuten bis zu insgesamt 20 Minuten beschallt Die Viskosität wurde nach jedem Intervall überprüft. Nach 20 Minuten wurde eine Endviskosität von 1267 Zentistokes erhalten. Die hydrolysierte Probe wurde auf Raumtemperatur gebracht und Natriumacetat-Reagens (18,7 g) wurde bis zu einer Endkonzentration von 3% (Gew./Vol.) zugegeben.
(2) Serologische Untersuchung: Eine Isopropanol(IPA)-Fraktionierungspilotstudie und ein antikörpergesteuerter Endpunkt-Nephelose-Assay, durchgeführt mit einer 10-ml-Portion der Probe, zeigten, daß das Pn4-Ps zwischen 45–55% IPA ausfallen würde.
(3) Erste IPA-Zugabe: Die hydrolysierte Probe [Volumen = 385 ml, aus Schritt 1 oben] wurde durch die Zugabe von 379 ml IPA (tropfenweise unter Rühren bei Raumtemperatur zugegeben) auf 49,7% IPA gebracht. Die Probe wurde 15–30 Minuten lang röhrengelassen und dann 30 Minuten lang bei 11.000 × g (Beckman JA-10-Rotor; 8.000 UpM; 20°C) zentrifugiert. Das Abfallpellet wurde mit absolutem EtOH in einem 250-ml-Omnimix-Gefäß trituriert, dann auf einem 60-ml-Sinterglastrichter gesammelt. Der Niederschlag wurde direkt auf dem Trichter mit absolutem EtOH, dann Aceton gewaschen und im Vakuum über CaCl₂ bei Raumtemperatur in Vorbereitung auf die Analyse getrocknet.
(4) Zweite IPA-Zugabe und Produktgewinnung: Die Überstandsflüssigkeit von 49,7% IPA [Volumen 727 ml, aus Schritt 3 oben] wurde durch tropfenweise Zugabe von 38 ml IPA unter Rühren bei Raumtemperatur auf 52,2% IPA gebracht. Die Probe wurde stehengelassen und zentrifugiert wie in Schritt 3 oben. Das Pellet wurde trituriert, gesammelt, gewaschen und getrocknet wie in Schritt 3 oben. Das Pn4-Ps-Produkt wog 516 mg.
(5) Dialyse und Lyophilisierung: Eine Portion (500 mg) der Pn-Ps-Probe aus Schritt 4 oben wurde in 200 ml destilliertem H₂O bei Raumtemperatur 2–3 h lang solubilisiert. Die Lösung (2,5 mg/ml) wurde in einen Dialyseschlauch (MG-Ausschluß 12.000; 45 mm) überführt und unter zwei weiteren Austauschen von destilliertem H₂O C 27 h lang bei 4°C gegen destilliertes H₂O dialysiert. Dann wurde die Probe in Lyophilisierungskolben überführt, in einem Trockeneis:-Methanol-Bad rollschichtgefroren und mit einem Virtis(Freezemobile)-Lyophilisator 2–3 Tage lang lyophilisiert. Die Ausbeute des Ps-Endprodukts betrug 491 mg. Das Endprodukt besaß einen K_d = 0,69.

Für Fachleute sollte aus dieser Offenbarung ersichtlich sein, daß andere carboxyl-enthaltende Pn-Ps-Subtypen wie Pn1-Ps oder Pn5-Ps nach dem hier offenbarten Verfahren hergestellt werden könnten und wie Pn4-Ps oder Pn9V-Ps, die ebenfalls saure Polysaccharide sind, konjugiert werden könnten.
BEISPIEL 27
S. Pneumoniae Typ 4-OMPC-Konjugat, Pn4-Ps-OMPC:

A. Herstellung von Dowex 50 × 2 (200–400 Mesh) Tetrabutylammoniumform-Harz [Dowex 50 (Bu₄N⁺)]: Dowex 50 × 2 (200–400 Mesh), H⁺-Form, (500 g) wurde in H₂O aufgeschlämmt (CM-66), auf eine Säule aufgebracht und nacheinander gewaschen mit 1) 600 ml H₂O; 2] 1000 ml 6 N HCl; 3] 400 ml H₂O, bis der Ausfluß für pH-Papier neutral war; 4] 72 g einer 10%igen wäßrigen Tetrabutylammoniumhydroxidlösung, bis der Ausfluß für pH-Papier stark alkalisch war; 5] 1000 ml H₂O bis zur Neutralität.
B. Herstellung von S. Pneumoniae Typ 4-Polysaccharid, Tetrabutylammoniumform [Pn4(Bu₄N⁺)]: Eine 65-ml-Säule von Dowex 50 × 2 (Bu₄N⁺) wurde mit 520 ml H₂O gewaschen. Pn4-Polysaccharid (MG-reduziert) (400 mg) wurde mit 35 ml H₂O bedeckt und 20 Minuten lang gerührt, wonach alles in Lösung zu sein schien (das Rühren wurde über Nacht fortgesetzt). Diese Lösung wurde auf die Säule aufgetragen und durch Schwerkraft perkolieren gelassen und die Säule wurde mit 150 ml H₂O gewaschen und die vereinigten Ausflüsse lyophilisiert, was 504 mg des Pn4(Bu₄N⁺)-Salzes ergab.
C. Herstellung des 1,4-Butandiamin-Derivats von Pn4(Pn4-BuA₂): Pn4(Bu₄N⁺) (97 mg) wurde mit 16 ml DMSO (Dimethylsulfoxid) bedeckt und im Verlauf eines Zeitraums von 15 Minuten bei 52°C in die Lösung gerührt. Nach dieser Zeit war der gesamte Feststoff gelöst und die Lösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt. Zu dieser Lösung wurden 2 mg Carbonyldiimidazol (CDI), gelöst in 160 μl DMSO, zugegeben und die resultierende Lösung 1,0 h lang bei Raumtemperatur (RT) gerührt. Eine Lösung, enthaltend 0,500 g 1,4-Butandiamin-Dihydrochlorid (BuA₂·2HCl) in 5 ml H₂O, wurde hergestellt und deren pH mit 5,0 N NaOH auf 10,20 eingestellt. Diese Lösung wurde in einem Eisbad gekühlt. Die gealterte DMSO-Lösung wurde langsam der kalten BuA₂-Lösung zugegeben und weitere 5 Minuten in dem Eisbad gerührt. Sie wurde dann 1 h lang bei RT gerührt, wonach die Lösung in einen SPECTRAPOR-2-Dialyseschlauch eingebracht wurde, 1,27 cm (1/2 Inch) vom oberen Rand der Flüssigkeit abgeklemmt und wie folgt dialysiert wurde gegen: 1] 4 l 10,1 M NaPO₄-Puffer, pH 7,0, für 15,0 h; 2] 4 l 0,01 M NaPO₄-Puffer, pH 7,0, für 9 h; 3] 4 l 0,01 M NaPO₄-Puffer, pH 7,0, für 21 h; 4] 4 l H₂O für 20 h. Die Lösung wurde auf 70 mg des 1,4-Butandiamin-Derivats von Pn4 (Pn4-BuA₂) lyophilisiert. Ein NMR-Spektrum von etwa 5 mg zeigte eine ”Beladung” von 22 Butandiaminresten pro 100 Polysaccharidmonomereinheiten, festgestellt durch Vergleich der Integrale der Resonanzen der internen Butandiamin-Methylene und der N-Acetylmethyle (von Pn4).
D. Herstellung des bromacetylierten Butandiamin-Derivats von Pn4 (Pn4-BuA₂-BrAc): Pn4-BuA₂ (54 mg) wurde mit 5,5 ml eines 0,1 M Puffers (Kolthoff-Borat-Phosphat), pH 9,04, bedeckt und gerührt, um die Lösung zu bewirken. Dann wurden 55 mg p-Nitrophenylbromacetat in 1,0 ml Acetonitril zugegeben. Die resultierende Mischung wurde 17 h lang bei 4°C gerührt. Sie wurde dann in einem SPECTRAPOR-2-Schlauch wie folgt dialysiert: 1] gegen 16 l H₂O für 24 h; 2] gegen 16 l H₂O für 8 h; 3] gegen 16 l H₂O für 23 h. Zu diesem Zeitpunkt lag ein Volumen von 12,5 ml vor, von dem 1,0 ml für Assays (NMR, Ouchterlony und Viscotek) entnommen wurde und dann 275 mg eines getrockneten Salzes von Phosphatpuffer, pH 8 (hergestellt durch Lyophilisierung einer 0,1 M NaPO₄-Lösung, pH 8), zugegeben wurde. Nach der Lösung wurde durch ein 0,2-Mikron-CORNING-Filter filtriert, was eine wäßrige Lösung, pH 8, von Pn4-BuA₂-BrAc ergab.
E. Konjugation von OMPC (N. meningitidis) mit Pn4-BuA₂-BrAc: Der Komplex des Proteins der äußeren Membran (N. meningitidis, OMPC, 4,34 mg/ml) (5 ml) wurde in einem 80-Ti-Rotor bei 43.000 UpM (43 K) 2 h lang bei 4°C zentrifugiert. Eine Thiolierungsmischung wurde hergestellt durch Lösen von 85 mg EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure-Dinatriumsalz) und 15 mg Dithiothreit (DTT) in 10 ml eines Na₂B₄O₇-Puffers, pH 11,09. 50 mg N-Acetylhomocysteinthiolacton wurden zugegeben und dann die Lösung durch ein 0,2-pm-Filter filtriert Die Pellets aus der obigen Zentrifugation wurden mit 5 ml der filtrierten Thiolierungsmischung disloziert und in einen DOUNCE-Homogenisator überführt und resuspendiert Die resuspendierte Lösung wurde in ein Zentrifugenröhrchen überführt, mit einem Septum verschlossen und die Luft durch N₂ unter Verwendung eines FIRESTONE-Ventils ersetzt. Die Reaktionsmischung wurde 19 h lang stehengelassen und dann in ein Zentrifugenröhrchen überführt, das mit 1 M KH₂PO₄ (wäßrig) aufgefüllt und dann 2 h lang bei 43 K und 4°C zentrifugiert wurde. Die Überstände wurden entfernt und die Pellets in 10 ml 0,1 M NaPO₄-Puffer, pH 8, resuspendiert. Diese Lösung wurde in ein Zentrifugenröhrchen überführt und dann eine zweite Ultrazentrifugation (2 h, 4°C, 43 K) durchgeführt. Die Pellets wurden in 11,5 ml der in Abschnitt D hergestellten Pn4-BuA₂-BrAc-Lösung resuspendiert. Ein Ellman-Assay zeigte eine Gesamtmenge von 3,44 μMol SH oder etwa 158 nMol SH/mg OMPC an. Die resultierende Reaktion (d. h. Pn4-BuA₂-BrAc mit thioliertem OMPC) wurde unter N₂ (unter Entgasen) in der N₂-Box 66 h lang bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Reaktion wurde dann wie folgt mit Endgruppen versehen: Eine Lösung, enthaltend 5 mg N-Ethylmaleimid (NEM) in 1 ml 0,1 M NaPO₄-Puffer, pH 8, wurde durch ein 0,22-μm-Filter filtriert und der obigen Reaktionsmischung zugegeben und die Lösung 5 h lang stehengelassen. Dann wurden 0,1 ml N-Acetylcysteamin in 0,4 ml 0,1 M PO₄-Puffer, pH 8, durch ein 0,22-μm-Filter filtriert und diese Lösung der Reaktion zugegeben und 14,5 h lang stehengelassen. Die Reaktionsmischung wurde dann 2 h lang bei 43 K, 4°C zentrifugiert und das Pellet in 8 ml 1 × TED-Puffer resuspendiert. Diese Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen und dann 2 h lang bei 43 K, 4°C zentrifugiert. Das Pellet wurde in 8 ml TED-Puffer resuspendiert und sofort 2 h lang bei 43 Kund 4°C erneut zentrifugiert. Das Pellet wurde dann in 10 ml 0,1 M PO₄-Puffer, pH 7,0, resuspendiert und 2 h lang bei 43 K und 4°C rezentrifugiert. Dieses endgültige Pellet wurde in 7,5 ml H₂O resuspendiert. Nach dem Stehenlassen über Nacht bei 4°C wurde die Suspension 3 Minuten lang bei 1000 UpM zentrifugiert und der Überstand als des endgültige Konjugat entnommen.

Assays:	Lowry-Protein: 0,920 mg/ml;
	Phenol-Schwefelsäure-Assay: 0,212 mg/ml;
	Ps/PRO = 0,23;
	SCMHC/Lys = 0,031;
	SCMC/Lys = 0,022.

Nach Verabreichung dieses Konjugats an Mäuse oder afrikanische Meerkatzen wurden hohe Titer von Anti-Pn4-Ps-Antikörper induziert, wie gemessen durch einen Pn4-Ps-spezifischen ELISA-Assay.
BEISPIEL 28
Herstellung des Pn9V-Ps-Zwischenprodukts:

(1) Beschallungshydrolyse: Eine 1,0-g-Portion Pn9V-Ps-Pulverwunde in 400 ml Satzlösung (0,9% NaCl) unter Rühren bei Raumtemperatur etwa 4 h lang solubilisiert. Die Lösung wurde dann in einem Kunststoffbecherglas in einem Eisbad mit einem Branson Sonifier (Halbzoll-Sonde, Einstellung 8) für ein Intervall von 3 Minuten beschallt. Die Viskosität wurde nach diesem Intervall überprüft. Nach 13 Minuten wurde eine weitere einminütige Beschallung durchgeführt, um eine Endviskosität von 1,117 Zentistokes zu erhalten. Die hydrolysierte Probe wurde auf Raumtemperatur gebracht und Natriumacetat-Reagens (19,5 g) bis zu einer Endkonzentration von 3% (Gew./Vol.) zugegeben.
(2) Serologische Untersuchung: Eine Isopropanol(IPA)-Fraktionierungspilotstudie und ein antikörpergesteuerter Endpunkt-Nephelose-Assay, durchgeführt mit einer 10-ml-Portion der Probe, zeigten, daß das Pn9V-Ps zwischen 40–45% IPA ausfallen würde.
(3) Erste IPA-Zugabe: Die hydrolysierte Probe [Volumen = 391 ml, aus Schritt 1 oben] wurde durch die Zugabe von 281 ml IPA (tropfenweise unter Rühren bei Raumtemperatur zugegeben) auf 41,8% IPA gebracht. Die Probe wurde 15–30 Minuten lang röhrengelassen und dann 30 Minuten lang bei 11.000 × g (Beckman JA-10-Rotor; 8.000 UpM; 20°C) zentrifugiert. Das Abfallpellet wurde mit absolutem EtOH in einem 250-ml-Omnimix-Gefäß trituriert, dann auf einem 60-ml-Sinterglastrichter gesammelt. Der Niederschlag wurde direkt auf dem Trichter mit absolutem EtOH, dann Aceton gewaschen und im Vakuum über CaCl₂ bei Raumtemperatur in Vorbereitung auf die Analyse getrocknet.
(4) Zweite IPA-Zugabe und Produktgewinnung: Die Überstandsflüssigkeit von 41,8% IPA (Volumen = 637 ml, aus Schritt 3 oben] wurde durch tropfenweise Zugabe von 28,6 ml IPA unter Rühren bei Raumtemperatur auf 44,3% IPA gebracht. Die Probe wurde stehengelassen und zentrifugiert wie in Schritt 3 oben. Das Pellet wurde trituriert, gesammelt, gewaschen und getrocknet wie in Schritt 3 oben. Das Pn9V-Ps-Produkt wog 342,2 mg.
(5) Dialyse und Lyophilisierung: Eine Portion (347 mg) der Pn-Ps-Probe aus Schritt 4 oben wurde in 139 ml destilliertem H₂O bei Raumtemperatur 4–5 h lang solubilisiert. Die Lösung (2,5 mg/ml) wurde in einen Dialyseschlauch (MG-Ausschluß 12.000; 45 mm) überführt und unter zwei weiteren Austauschen von destilliertem H₂O 25 h lang bei 4°C gegen destilliertes Wasser dialysiert. Dann wurde die Probe in Lyophilisierungskolben überführt, in einem Trockeneis:Methanol-Bad rollschichtgefroren und mit einem Virtis(Freezemobile)-Lyophilisator 2–3 Tage lang lyophilisiert. Die Ausbeute des Ps-Endprodukts betrug 303,5 mg. Das Endprodukt besaß einen K_d = 0,60.
(6) Dritte IPA-Zugabe und Produktgewinnung: Die Überstandsflüssigkeit von 44,3% IPA [Volumen = 655 ml, aus Schritt 4 oben] wurde durch tropfenweise Zugabe von 30,8 ml IPA unter Rühren bei Raumtemperatur auf 46,8% IPA gebracht. Die Probe wurde stehengelassen und zentrifugiert wie in Schritt 3 oben. Das Pellet wurde trituriert, gesammelt, gewaschen und getrocknet wie in Schritt 3 oben. Das Pn9V-Ps-Produkt wog 410,8 mg.
(7) Dialyse und Lyophilisierung: Eine Portion (420,4 mg) der Pn-Ps-Probe aus Schritt 6 oben wurde in 168 ml destilliertem H₂O bei Raumtemperatur 4–5 h lang solubilisiert. Die Lösung (2,5 mg/ml) wurde in einen Dialyseschlauch (MG-Ausschluß 12.000; 45 mm) überführt und unter zwei weiteren Austauschen von destilliertem H₂O 25 h lang bei 4°C gegen destilliertes H₂O dialysiert. Dann wurde die Probe in Lyophilisierungskolben überführt, in einem Trockeneis:Methanol-Bad rollschichtgefroren und mit einem Virtis(Freezemobile)-Lyophilisator 2–3 Tage lang lyophilisiert. Die Ausbeute des Ps-Endprodukts betrug 342,5 mg. Das Endprodukt besaß einen K_d = 0,65.
(8) Für Fachleute ist offensichtlich, daß die Produkte in den Schritten 4 und 6 mit einer größeren Zugabe von IPA hätten gemeinsam gewonnen werden können, dann dialysiert und lyophilisiert als ein einziges Produkt mit den analytischen Eigenschaften des gewichteten Mittels der Eigenschaften der individuellen Subfraktionen. Für Fachleute sollte auch offensichtlich sein, daß Pn1-Ps oder Pn5-Ps auf dieselbe Weise wie Pn9V-Ps oder Pn4-Ps, wie hier offenbart, behandelt werden könnten.

BEISPIEL 29
Konjugation von Pn9V-Ps mit OMPC:
Pn9V-Ps, hergestellt nach Beispiel 28, wird auf dieselbe Weise konjugiert wie Pn4-Ps, wie in Beispiel 27 gezeigt.
BEISPIEL 30
Quantitative Bestimmung von Acetat in Pn9V/18C-Ps und Pyruvat in Pn4-Ps:
Es wurde ein Verfahren entwickelt, um die Retention von O-Pyruvatgruppen in Pn4-Ps und O-Acetatgruppen in Pn9V-Ps und Pn18C-Ps während der Behandlung der Pneumokokken(Pn)-Kapselpolysaccharide (Ps) quantitativ zu bestimmen. Die O-Acetyl- oder O-Pyruvatgruppen werden zuerst durch Hydrolyse freigesetzt, dann wird das Acetat und Pyruvat in dem PnPs-Hydrolysat identifiziert und unter Verwendung von Hochleistungs-Anionenaustauschchromatographie, gekoppelt mit unterdrückter Leitfähigkeit, quantitativ bestimmt.
Nach diesem Verfahren wurden Proben von behandelten und unbehandelten Pn4, Pn9V und Pn18C analysiert. Die vorläufigen Ergebnisse zeigten ein Molverhältnis von etwa 1:1 und 0,8:1 von Pyruvat zu jeder sich wiederholenden Ps-Einheit für unbehandeltes bzw. größensortiertes Pn4. Die Molverhältnisse von Acetat zu jeder sich wiederholenden Ps-Einheit in Pn18C-Ps wurden als 1:1 und 0,8:1 für unbehandelte bzw. größensortierte Proben; und 1,7:1 und 1,5:1 für unbehandeltes bzw. größensortiertes Pn9V befunden. Eine Probe des wäßrigen rohen Pn18C-Ps-OMPC-Konjugats wurde ebenfalls hinsichtlich des Molverhältnisses von O-Acetat zu jeder sich wiederholenden Ps-Einheit analysiert und dieses als etwa 0,5:1 befunden.
In der Literatur wurde berichtet, daß die Pyruvatgruppe eine wirkungsvolle Immundeterminante bei Kapselpolysacchariden vom Typ 4 ist und daß deren Entfernung zu deutlichen Änderungen der immunologischen Spezifität führt [Heidelberger, M., Dudman, W. F., und Nimmich, W., 'Immunochemical relationships of certain capsular polysaccharides of Klebsiella, pneumococci, and Rhizobia. 'J. Immunol., 104: 1321–1328, (1970); Higginbotham, J. D., Heidelberger, M., und Gutschlich, E., 'Degradation of a pneumococcal type-specific polysaccharide with exposure of group-specificity. 'Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 67: 138–142, (1970)). Gleichermaßen eliminierte die Entfernung der O-Acetatgruppe bei dem Typ Pn18C-Ps-Polysaccharid dessen immunologische Spezifität. [Estrada-Parra, S., und Heidelberger, M., 'The specific polysaccharide of type XVIII pneumococcus. 'Biochemistry, 2: 1288–1294, (1963)). Es war deshalb essentiell, eine quantitative Methode zur Bestimmung des Acetats und Pyruvats in Pn18C-Ps und Pn4 zu entwickeln. O-Acetylgruppen in Pn9V könnten auch eine wichtige Rolle bei der immunologischen Struktur von Pn9V spielen, da de-O-acetyliertes Pn9V keine antigene Reaktivität aufwies, wie bestimmt durch Geschwindigkeitsnephelometriemessung.
Wir fanden heraus, daß O-Acetat aus Pn9V- und Pn18C-Ps unter alkalischen Bedingungen (pH 11) bei 4°C leicht freigesetzt wird und O-Pyruvat aus Pn4 nach Erwärmung auf 65°C leicht freigesetzt wird. Wir stellten fest, daß Acetat und Pyruvat aus einer hydrolysierten PnPs-Probe unter Verwendung einer OmniPac PAX500-Säule bei einer Durchflußrate von 1 mVMin. mit 0,98 mM NaOH und 2% MeOH als mobiler Phase abgetrennt werden können. Der Nach-weis erfolgte durch Nachweis unterdrückter Leitfähigkeit unter Verwendung von 25 mM H₂SO₄ als Regenerationsmittel bei einer Durchflußrate von 10 ml/Min. Optimale Hydrolysebedingungen für die quantitative HPLC-Analyse von O-Acetat und O-Pyruvat aus Pn18C-Ps, 9V bzw. Pn4 werden in diesem Beispiel offenbart.
Meßausrüstung
Ein Dionex BioLC war mit einer OmniPac PAX-500-Überwachungs- und Analysesäule (4,6 × 250 mm) ausgerüstet. Der Nachweis unterdrückter Leitfähigkeit erfolgte unter Verwendung von 25 mN Schwefelsäure als Regenerationsmittel. Die Durchflußrate wurde mit einer Dionex-Autoregenerationseinheit auf 10 ml/Min. eingestellt. Die mobile Phase und das Gradientenprogramm für die Abtrennung von Acetat und Pyruvat aus einer Probe von hydrolysiertem PnPs sind in der folgenden Tabelle aufgelistet:

Puffer 1 – 1 mM Natriumhydroxid
Puffer 2 – 100% Methanal
Puffer 3 – 200 mM Natriumhydroxid
Puffer 4 – Wasser

Zeit	% Puffer 1	% Puffer 2	% Puffer 3	% Puffer 4	Durchfluß (ml/Min.)
0	98	2	0	0	1
12,5	98	2	0	0	1
12,6	58	2	0	40	1,5
20,0	58	2	0	40	1,5
20,1	98	2	0	0	1,5
30,0	98	2	0	0	1,5
30,1	98	2	0	0	1
50,0	98	2	0	0	1

Unter Einsatz dieser Bedingungen und einer Detektorempfindlichkeit von 3 μSiemens können jeweils 4 nMol Acetat und Pyruvat, die bei Retentionszeiten von etwa 5,2 bzw. 9,5 Minuten eluieren, ohne weiteres nachgewiesen werden.
Probenvorbereitung
Gereinigte PnPs-Proben von Merck Manufacturing Division wurden einer Karl-Fisher-Titration unter Verwendung eines volumetrischen Aquastar V3000-Feuchtigkeitstitrators unterworfen, um den Restgehalt an H₂O zu bestimmen, und dann in Milli-Q-H₂O in einer Konzentration von 1,0 mg Trockengewicht pro ml gelöst. Proben (100 μg/ml) wurden in 2 mM NaOH 16 h lang bei Raumtemperatur behandelt, um O-Acetat aus Pn9V-Ps- und Pn18C-Ps-Proben zu entfernen. Die Pn4-Ps-Proben wurden in 1 mM HCl bei 65°C 16 h lang zur Entfernung von O-Pyruvat aus Pn4 hydrolysiert. Die Proben von größensortiertem Pn9V- und Pn18C-Ps und des wäßrigen rohen Pn18C-Ps-OMPC-Konjugats wurden ebenfalls Analysen hinsichtlich der Monosaccharidzusammensetzung unterworfen durch Hoch-pH-Anionaustauschchromatographie und gepulsten amperometrischen Nachweis. Die Analyse der Monosaccharidzusammensetzung erfolgte, um die korrekte Konzentration von PnPs in den größensortierten Proben und den Proben des wäßrigen rohen Konjugats zu erhalten. Acetat-, Pyruvat- und N-Acetylmannosamin-Standards wurden in Milli-Q-H₂O in der Konzentration von 200 nMol/ml gelöst.
Hydrolyse von Proben und Standards
Die De-O-acetylierung von Pn18C-Ps wurde durch Behandlung von Pn18C-Ps bei vier NaOH-Konzentrationen (1, 2, 5 und 50 mM) bei verschiedenen Temperaturen (4, 25, 45 und 65°C) und verschiedenen Zeiten (3, 5 und 16 h) untersucht. Standardlösungen von Acetat, Pyruvat und N-Acetylmannosamin waren ebenfalls in der Studie eingeschlossen, um festzustellen, ob die für die De-O-acetylierung erforderlichen Bedingungen auch in einem Abbau von Acetat/Pyruvat oder dem Verlust von N-Acetylgruppen resultieren würden.
Die Entfernung von Pyruvat aus Pn4 wurde nach der Behandlung mit entweder Natriumhydroxid (50 mM/100°C/16 h) oder Salzsäure bei verschiedenen Konzentrationen (1, 10, 100 mM), Zeiten (3, 5 und 16 h) und Temperaturen (65, 85 und 100°C) untersucht.
Geschwindigkeitsnephelometrie
Die geschwindigkeitsnephelometrische Aktivität von Pn9V-Ps, Pn18C-Ps und Pn4-Ps vor und nach der De-O-acetylierung oder De-O-pyruvylierung wurde gemessen. Die Proben wurden auf 1, 1,5, 2 und 2,5 μg/ml verdünnt.
Hochleistungs-Größenausschlußchromatographie (HPSEC)
Die HPSEC von Pn9V-Ps, Pn18C-Ps und Pn4 vor und nach De-O-acetylierung oder De-O-pyruvylierung wurde gemessen. Eine 7,5 × 600 mm TSK G6000PW-Säule, ausgerüstet mit einem Durchflußbegrenzer, wurde auf 50°C bei 5,5 MPa–6,9 MPa (800–1000 psi) erwärmt und mit 0,2 M Natriumacetat mit 0,3 ml/Min. äquilibriert. Eine 60-μg-Probe (1 mg/ml) wurde in die Säule injiziert und mit der mobilen Phase mit 0,3 ml/Min. eluiert. Das Säuleneluat wurde mit einer nach der Säule erfolgenden Zugabe von 0,5 M NaOH bei einer Flußrate von 0,5 ml/Min. gemischt und mit einem gepulsten amperometrischen Dionex-Monitor überwacht und der Kd gemessen.
Assay-Empfindlichkeit und Linearität
Die Linearität und Empfindlichkeit des Detektors wurden bei 3 μSiemens sowohl für Pyruvat als auch für Acetat bestimmt. Pyruvat und Acetat waren bei einer unteren Grenze von 0,125 nMol nachweisbar. Die Detektorantwort für beide Komponenten war bis 2 nMol linear mit Korrelationskoeffizienten von 0,9999 und 0,9992 für Pyruvat bzw. Acetat.
Optimierung der Entfernung von O-Acetat aus Pn18C-Ps
Vorstudien des Zeitverlaufs der Hydrolyse von Pn18C-Ps zeigten die Labilität der O-Acetylgruppe gegenüber alkalischer Hydrolyse bei niedrigen Temperaturen. 2 mM Natriumhydroxid war ausreichend, um Pn18C-Ps nach einer 16-ständigen Inkubation bei 4°C vollständig zu de-O-acetylieren. Behandlungen bei höheren Temperaturen (> 25°C) wurden befunden, N-Acetat aus N-Acetylmannosamin freizusetzen, was die Messung des Pn9V-O-Acetats stören würde. Die optimale Hydrolysebedingung zur Entfernung von O-Acetat aus PnPs wurde als 16 h bei 4°C befunden. Es wurde festgestellt, daß weniger als 1% Acetat aus einem Standard von N-Acetylmannosamin entfernt wurden, der 16 h lang bei Raumtemperatur mit 2 mM NaOH behandelt worden war.
Optimierung der Entfernung von O-Pyruvat aus Pn4
Hydrolysestudien von Pn4 wurden anfangs unter Anwendung von Natriumhydroxid-Hydrolyse unternommen. Es wurde schnell festgestellt, daß bei Verwendung von Natriumhydroxid sehr wenig Pyruvat gewonnen wurde. Anfängliche Kontrollstudien demonstrierten, daß Pyruvat von Pn4 in H₂O bei 100°C abgespalten wurde. Mit dieser Information wurde beschlossen, die Optimierungsstudien für die O-Pyruvatfreisetzung aus Pn4 unter Anwendung von HCl-Hydrolyse bei erhöhten Temperaturen durchzuführen. Es fand ein gewisser Abbau des Pyruvats bei höheren Temperaturen statt. Dies kann mit einer Probe eines Pyruvatstandards demonstriert werden, der unter denselben Bedingungen wie Pn4 hydrolysiert wurde. Eine maximale Gewinnung von Pyruvat fand statt, wenn die Hydrolyse in 1 mM HCl für 16 h bei 65°C durchgeführt wurde.
Analyse von O-Acetat und O-Pyruvat in PnPs-Proben

Verschiedene Proben, die Ausgangs-PnPs, größensortierte PnPs und ein Pn18C-Ps-OMPC-Konjugat repräsentierten, wurden auf O-Acetat/Pyruvat analysiert durch das oben beschriebene HPLC-Verfahren nach einer Hydrolyse in 2 mM NaOH bei Raumtemperatur zur Freisetzung von O-Acetat in Pn9V-Ps/18C oder in 1 mM HCl bei 65°C zur Freisetzung von O-Pyruvat in Pn4-Ps. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind im folgenden dargestellt:

Probe	Verhältnis von Pyruvat/Acetat zu jeder sich wiederholenden Ps-Einheit
Pn4, Probe 1	1,0
Pn4, Probe 2	0,8
Pn9V Probe 1	1,7
Pn9V, Probe 2	1,5
Pn18C-Ps, Probe 1	1,0
Pn18C-Ps, Probe 2	0,8
Pn18C-Ps-OMPC, wäßriges Rohmaterial	0,5

Die Ergebnisse zeigen, daß die Retention der Seitengruppen in den größensortierten PnPs etwa 90% für Pn9V-Ps und 80% für Pn4 und 18C betrug. Die Retention von O-Acetat im wäßrigen rohen Pn18C-Ps-OMPC-Konjugat wurde als etwa 50% befunden. Die theoretischen Werte für Pn18C-Ps und Pn4 sind 1 Mol Acetat oder Pyruvat pro Mol sich wiederholender Ps-Einheit und für Pn9V beträgt das Verhältnis 2:1. [Jansson, P.-E., Lindberg, B., und Lindquist, U. 'Structural studies of the capsular polysaccharides from Streptococcus pneumoniae Type 4. 'Carbohyd. Res., 95: 73–80, (1981). Lugrowski, C., und Jennings, H. J. 'Structural determination of the capsular polysaccharide of Streptococcus pneumoniae Type 18C. 'Carbohyd. Res. 131: 119–129, (1984). Perry, M. B., Daoust, V., und Carlos, D. J. 'The specific capsular polysaccharide of Streptococcus pneumoniae Type 9V. 'Can. J. Biochem. 59: 524–533, (1981)]. Die geringere Retention von O-Acetat, die bei dem Pn18C-Ps-OMPC-Konjugat festgestellt wurde, ist aufgrund der Hydrolyseempfindlichkeit von O-Acetylgruppen unter alkalischen Bedingungen bei niedrigen Temperaturen zu erwarten.
Die geschwindigkeitsnephelometrische Aktivität von Proben von Pn4-, Pn9V- und Pn18C-Ps und de-O-pyruvylierter und de-O-acetylierter Proben wurde gemessen. Die Ergebnisse zeigten, daß die Nephelose-Aktivität nach der Entfernung dieser Seitengruppen vollständig verlorenging, trotz des Kd der unbehandelten Proben. Die Kd-Werte wurden durch das oben beschriebene HPSEC-Verfahren erhalten. Der Kd von Pn4 nach De-O-pyruvylierung durch milde Säurehydrolyse wurde jedoch von 0,60 auf 0,68 erhöht und das Erscheinen in der Nähe des Salzvolumens. Die Antigenizltätsdaten für Pn4- und Pn18C-Ps stützen die Arbeit anderer Forscher bezüglich der Bedeutung dieser Seitengruppen bei der immunologischen Reaktivität von Pneumokokken-Polysaccharid. Die Ergebnisse für Pn9V legen nahe, daß neben Glucuronsäure die O-Acetylgruppen dieses Moleküls ebenfalls wichtige immunologische Determinanten sind.
So wurde nach dieser Methode ein schnelles, empfindliches Verfahren zur quantitativen Analyse von O-Pyruvylketal in Pn4 und O-Acetat in Pn9V- und Pn18C-Ps entwickelt. Dieses Verfahren ist wertvoll bei der Festlegung des richtigen Verfahrens zur Größensortierung und Konjugation von Pn4-, Pn9V- und Pn18C-Ps, um die antigene Struktur dieser Polysaccharide aufrechtzuerhalten.
BEISPIEL 31
Isolierung von Pn6B-Ps-MIEP-Konjugat:

1. Zwei Konjugat-Reaktionsmischungsproben (wobei eine eine gegen H₂O dialysierte Probe der anderen darstellt) wurden bis zur Verwendung bei 3–8°C gelagert.
2. 0,2 M MOPS-Puffer, pH 7,2, wurde den Proben zugegeben, um eine Endkonzentration von etwa 7 mM zu erhalten. Festes GuHCl wurde der Probe zugegeben, um eine Endkonzentration von 4,2 M zu erreichen (Anmerkung: 1,42 g GuHCl/ml Probe sollten zugegeben werden, um die Volumenerhöhung aufgrund der Zugabe des festen GuHCl zu kompensieren. Gleichermaßen sollte die Pufferzugabe eingestellt werden, um die Volumenerhöhung auszugleichen, so daß die Probenzusammensetzung der Zusammensetzung des Säulenelutionsmittels näher kommt. Alternativ könnte die Probe vor der Chromatographie gegen das Säulenelutionsmittel dialysiert werden.)
3. 2,8 ml Probe (enthaltend etwa 1 mg Protein auf der Basis eines Lowry-Protein-Assays) wurden in eine 2,6 × 96 cm-Säule von Sephacryl S-1000, äquilibriert in 10 mM MOPS, pH 7,2, 6 M GuHCl, bei einer Durchflußrate von 0,6 ml/Min. injiziert. Der Säulenausfluß wunde kontinuierlich bei 280 nm (Perkin Elmer LC 235-Diodenanordnungsdetektor) überwacht und 3-ml-Fraktionen gesammelt.
4. Die Proteinverteilung basierte auf A280 (sowie Spektren) und die Pn6B-Ps-Verteilung auf einem für Pn6B-Ps spezifischen RIA-Assay. Auf der Basis der Elutionspositionen von Pn6B-Ps-BrAc allein und in physikalischen Mischungen mit unaktiviertem MIEP wurden Pools von Fraktionen, die sowohl Ps als auch Protein enthielten, hergestellt und diejenigen, welche abweichend von den Positionen eluierten, die für das Pn6B-Ps-BrAc beobachtet wurden, wurden als mutmaßliches Pn6B-Ps-MIEP-Konjugat bezeichnet
5. Pools wurden durch Ultrafiltration unter Verwendung einer YM-30-Membran konzentriert und unter Verwendung von Milli-Q-H₂O diafiltriert. Protein- und Pn6B-Ps-Gehalt wurden aus quantitativen Untersuchungen der Zusammensetzung bestimmt Die Anwesenheit von SCMHC wurde durch Aminosäureanalyse nachgewiesen.

BEISPIEL 32
Direkter RIA-Assay auf Pneumokokken-Polysaccharid Pn18C-Ps
Dieser Assay wird zur quantitativen Bestimmung des Pneumokokken-Polysaccharids vom Typ 18C eingesetzt. Es ist ein Mehrschichten-Sandwich-RIA-Assay. Polystyrolperlen werden mit Kaninchen-Anti-Pn18C-Ps beschichtet Die Perlen werden in einer Probenlösung, die Pn18C-Ps enthält, inkubiert. Nach der Inkubation werden die Perlen gewaschen und in einer zweiten Lösung erneut inkubiert, die einen Maus-Antikörper gegen Pn18C-OMPC enthält. Nach dieser Inkubation werden die Perlen gewaschen und ein drittes Mal in einer Lösung inkubiert, die ein ¹²⁵I-Anti-Maus-Ziegen-IgG enthält Die Platten werden einmal mehr gewaschen, wonach die Perlen zur Zählung in Kunststoffröhrchen überführt werden. Unbekannte Proben von Pn18C-Ps werden zur quantitativen Bestimmung mit einer Standardkurve verglichen.
Ausrüstung

1. RIA-Kit: Abbott Labs, Diagnostic Div., Katalog-Nr. 6171-10.
2. Qwik Wash System, Abbott Labs, Diagnostic Div.
3. Einstellbare Pipetten und Einmal-Pipettenspitzen (Ausführung Eppendorf digital)
4. Gamma-Zähler (Ausführung Abbott Autologic).
5. 1/4-Inch-Polystyrolperlen mit spiegelnder Oberfläche: Precision Plastic Ball Co., 3000 N. Cicero Ave., Chicago, Illinois 60641.

Reagenzien

1. New York State Health Services Anti-Pn18C-Ps-Antikörper, Los R18-44 oder ein Äquivalent.
2. Anti-Pn18C-Ps-OMPC-Mausantiseren (Pool 11260-235 oder ein Äquivalent).
3. ¹²⁵I-markierte Anti-Maus-Ziegen-IgG-Antiseren: NEX 159, New England Nuclear, 549 Albany Street, Boston, MA 02118.
4. Inkubationspuffer: RCM8 enthaltend

1,0% BSA Sigma A2153

0,1% Azid Sigma S2002

5. Verdünnungsmittel

8 Teile fötales Kalbsserum	Sigma F3885
1 Teil Ziegenserum	Sigma G6767
1 Teil Kaninchenserum	Sigma R4505
0,05% TWEEN 20	Sigma P1379
0,1% Azid	Sigma S2002

3. Zugabe einer mit Anti-Pn18C-Ps beschichteten Perle zu jeder Vertiefung der Platte, die eine Probe oder einen Standard enthält, und sanftes Bewegen der Platte, um sicherzustellen, daß alle Perlen vollständig mit Puffer bedeckt sind.
4. Bedeckung der Platte mit einer haftenden Schutzfolie, die mit dem RIA-Kit geliefert wurde, und Inkubation der Platte für 6 h bei Raumtemperatur.
5. Waschen der Platte unter Verwendung der Qwik Wash-Apparatur und entionisierten Wassers.
6. Verdünnung des Anti-18C-Mausantikörpers 1:1000 in Verdünnungsmittel.
7. Zugabe von 200 μl dieser Lösung zu jeder Vertiefung, die eine Perle enthält.
8. Bedeckung der Platte und Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur.
9. Waschen der Platte unter Verwendung der Qwik Wash-Apparatur und entionisierten Wassers.
10. Verdünnung von ¹²⁵I-markiertem Anti-Maus-Ziegenantikörper auf 15000 CpM/10 μl in Verdünnungsmittel (≈ 1:160-Verdünnung).
11. Zugabe von 20 μl dieser Lösung zu jeder Vertiefung, die eine Perle enthält.
12. Bedeckung der Platte und Inkubation für 2 h bei 37°C.
13. Waschen der Platten unter Verwendung der Qwik Wash-Apparatur und entionisierten Wassers.
14. Überführung der Perlen in die Kunststoffröhrchen, die mit dem RIA-Kit geliefert wurden, und Zählung unter Verwendung eines geeigneten Gamma-Zählers.

Berechnungen

1. Kombination der Doppelmessungen, um ein Mittel für jede Probe, jeden Standard und die Inkubationspufferkontrolle zu erhalten. Subtraktion der Inkubationspufferkontrolle von alten Standards und Proben.
2. Verwendung eines für statistische Berechnungen ausgerüsteten Rechners, Eingabe der Daten für die Standardkurve und Berechnung des Korrelationskoeffizienten und der Steigung der Linie.
3. Verwendung der geeigneten Standardkurve (frei für frei, Konjugat für Konjugat), Berechnung der Antwort der Proben und Korrektur hinsichtlich der Verdünnungen.

Dasselbe oben beschriebene Verfahren ist durch Ersatz der typenspezifischen Reagenzien auf jede der anderen Pn-Ps-Spezies anwendbar.

Claims

Ein Konjugat aus Pneumokokken-Polysaccharid und immunogenem Protein, hergestellt durch das Verfahren: (a) der Kultivierung einer Pneumokokke und Isolierung von rohem Pneumokokken-Polysaccharid oder Solubilisierung von Pneumokokken-Polysaccharid-Pulver; (b) der Reinigung und partiellen Hydrolyse des Polysaccharids von Schritt (a) bis zu einem Endpunkt, der so vorherbestimmt ist, dass ein Polysaccharid gebildet wird, das einer Konjugation zugänglich ist und nicht mehr als eine 30%ige Verminderung der typenspezifischen Antigenizität des Polysaccharids im Vergleich zu dem rohen Polysaccharid von Schritt (a) aufweist; und (c) der Konjugation des Produkts von Schritt (b) mit einem immunogenen Protein, wobei die in Schritt (a) kultivierte Pneumokokke aus einem oder mehreren der Subtypen 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F und 23F ausgewählt ist, wobei das Pn-Ps seine antigene Integrität behält, wie gemessen durch Ouchterlony-Doppelimmundiffusion oder Geschwindigkeitsnephelometrie-Assay unter Verwendung eines typenspezifischen Anti-Pn-Ps-Antikörpers, und das Pn-Ps vor der Konjugation in einer Gaulin-Presse bei einem Druck zwischen etwa 13,8 MPa und 103 MPa (2000 und 15 000 psi) einer physikalischen Scherung unterworfen wird oder durch 24-ständige Erwärmung auf 100°C hydrolysiert wird.