CZ283284B6 - Pneumokoková polysacharidová konjugátová vakcína - Google Patents

Abstract

Novým postupem se vyrábí nová konjugátová vakcína, obsahující částečně hydrolyzovaný, vysoce purifikovaný, kapsulární polysacharid (Ps) z bakterií Streptococcus pneumoniae (pneumokoky, Pn) vázaný s imunogenním nosičovým proteinem. Tento konjugát je užitečný pro prevenci pneumokokových infekcí. Vakcína obsahující směs jednoho až deseti konjugátů (Pn-Ps-PRO) pneumokokového polysacharidu s imunogenním proteinem (PRO) vyvolává širokou ochrannou imunitní odpověď recipienta proti pathogenům příbuzným pneumokokům, z nichž byly polysacharidy odvozeny. Malé děti, včetně dětí do dvou let věku, které normálně nevykazují protektivní imunitní odpověď na samotný Pn-Ps, vykazují po vakcinaci těmito Pn-Ps-PRO konjugáty protektivní imunitní odpověď.ŕ

Description

Vynález se týká konjugátu, obsahujícího imunogenní protein, způsobu jeho výroby, jeho použití a vakcínového přípravku.

Dosavadní stav techniky

Patogenní bakterie, určené jako Streptococcus pneumoniae (pneumokoky, Pn), se dělí do 84 antigenních sérotypů podle kapsulámích polysacharidů (Pn-Ps) tohoto mikroorganismu. Do skupiny chorob, které jsou způsobeny těmito mikroorganismy, patří pneumonia, meningitis, otitis media, bacteriaemia a akutní exacerbace chronické bronchitis, sinusitis, arthritis a conjunctivitis, Převážná část těchto nemocí je však způsobena omezeným souborem z 84 známých izolátů. Proto může polyvalentní vakcína, obsahující Pn-Ps z nejrozšířenějších patogenních izolátů tohoto mikroorganismu, poskytnout ochranu proti velmi vysokému podílu nej častěji uváděných patogenů této třídy.

Vyráběné polyvalentní vakcíny způsobují zesílení ochranné imunitní odpovědi proti pneumokokům u dospělých. Například PNEUMOVAX^(R) (Pneumococcal Vaccine Polyvalent, MSD; viz PDR, vydání 1990, str. 1431) je kapalný přípravek, obsahující 50 pg/ml každého z 23 různých nekonjugovaných pneumokokových polysacharidů, z nichž všechny jsou uloženy ve sbírce ATCC a poskytují jeden možný zdroj výchozího materiálu pro tento vynález. PNEUMOVAX^(R) 23 obsahuje všechny následující volné, tj. nekonjugované polysacharidy: 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19F, 19A, 20, 22F, 23F a33F, které tvoří asi 90 % pneumokokových krevních izolátů. Avšak tyto vakcíny jsou nejméně účinné u té části populace, která je nejvíce vystavena riziku pneumokokových infekcí: u jedinců s narušením imunity způsobeným poškozením B-buněk, u lidí pokročilejšího věku a dětí mladších dvou let, u nichž imunitní ochranu zabezpečují T-buňky. Protože nekonjugované polysacharidy jsou slabými induktory imunitní odpovědi T-buněk, je konverze Pn-Ps na imunogeny schopné indukovat imunitní odpověď T-buněk klíčovým problémem při zajišťování vhodné ochrany této části populace. Avšak použití těchto imunogenů není omezeno jen na tuto skupinu jedinců. Například podávání vakcíny, která obsahuje jeden nebo více nových konjugátů, savčí samici před nebo během gravidity zvyšuje množství protilátek v jejím těle, které mohou pasivně chránit vyvíjející se plod a kojence, aniž by se vakcína přímo podávala plodu nebo kojenci. Tyto konjugované vakcíny by také měly být užitečné pro vyvolání tvorby protilátek a tím pro pasivní ochranu ohrožených částí populace, jako jsou novorozenci nebo sourozenci infikovaných jedinců.

Polysacharidy, které samy o sobě jsou slabě imunogenní, se ukázaly jako dobré imunogeny po konjugaci s imunogenním proteinem PRO /Marburg a další, US patent č. 4 695 624; Schneerson a další, New Dev. with Hum. and Vet. Vaccines, 77 až 94 (1980); Schneerson a další, J. Exptl. Med., 152, 361 (1980); Anderson, Infection and Immunity, 39, 233 (1983)/. Avšak hlavním problémem při produkci takových konjugátů je viskózní a nehomogenní povaha polysacharidového výchozího materiálu, kvůli níž je obtížné chemicky definovat konjugovaný produkt. Proto se vyžaduje takový způsob výroby, při němž je výchozí materiál co nejlépe definovaný a každý krok syntetické dráhy je analyzovatelný, pokud jde o vytvořený meziprodukt. Způsob výroby popsaný zde uspokojuje tyto požadavky tím, že poskytuje vysoce imunogenní konjugátové imunogeny proti patogenům, které jsou příbuzné patogenním mikroorganismům, od nichž byl daný Pn-Ps odvozen. Konjugáty jsou užitečné pro děti mladší dvou let.

- 1 CZ 283284 B6

Marburg a další /viz J. Am. Chem. Soc., 108, 5282 (1986) a US patenty č. 4 695 624; 4 830 852 a 4 882 317/ objevili způsob konjugace polysacharidů a imunogenních proteinů pomocí dvoj vazných mezemíků (bigenerických spacerů). PRO (protein) se derivatizuje takovým způsobem, aby měl vyčnívající nukleofilní nebo elektrofilní skupiny (PRO ), zatímco Ps (polysacharid) se funkcionalizuje tak, aby obsahoval vyčnívající skupiny s opačnou reaktivitou (Ps ). Při sloučení Ps* s PRO* se utvoří dvojvazné mezemíky, které kovalentně vážou Ps s PRO (Ps-PRO). Při kyselé hydrolýze se dvojvazný mezemík uvolní jako neobvyklá aminokyselina, která se stanoví při analýze aminokyselin a tím lze dokázat kovalentnost vazby.

Tento vynález představuje zlepšení způsobů popsaných v amerických patentech č. 4 695 624, 4 830 852 a 4 882 317. Toto zlepšení zahrnuje přípravu výchozího materiálu Pn-Ps, který má specifičtější, reprodukovatelnější a z hlediska zpracování vhodnější fyzikální vlastnosti než surové Pn-Ps přípravky. Tyto fyzikální vlastnosti zahrnují zvýšenou rozpustnost, zvýšenou fíltrovatelnost, zvýšenou čistotu /snížení kontaminace skupinově specifickým C-polysacharidem (C-Ps)/, sníženou molekulovou hmotnost, polydisperzitu a viskozitu. Výsledné konjugáty popsané zde, mají lepší vlastnosti než konjugáty připravené podle postupu z amerického patentu č. 4 695 624, s ohledem na svou vyšší konzistentnost, snazší přípravu, zlepšenou antigenicitu a vyšší čistotu finálního produktu. Zvláště významné je troj- až dvacetinásobné snížení kontaminace skupinově specifickým C-polysacharidem a peptidoglykanem v pre-konjugaci Pn-Ps vzhledem k pre-konjugaci Ps preparátů, popsané v americkém patentu č. 4 695 624. Ačkoliv přítomnost C-polysacharidového kontaminantu neinterferuje s imunitní odpovědí proti druhově specifickým antigenům, mohl by se C-PS účastnit vkonjugační reakci a tím ji učinit méně specifickou a řízenou pro druhově specifický Ps. Kromě toho může produkce anti-C-polysacharidových protilátek souviset s poškozením tkáně pozorovaným při některých nevyjasněných pneumokokových infekcích.

Kromě nového konjugátového produktu popisuje tento vynález také nový způsob přípravy částečně hydrolyzovaných, vysoce purifikovaných pneumokokových polysacharidových meziproduktů, nové přípravky obsahující jeden až deset různých konjugátu a způsoby použití tohoto vynálezu. Zvláště významné jsou kapsulámí polysacharidy obsažené v PNEUMOVAX^<R) 23 (Pneumococcal Vaccine Polyvalent, MSD; viz PDR, vydání 1990, str. 1431). Podskupinu, které se dává největší přednost, tvoří kapsulámí polysacharidy z Streptococcus pneumoniae, poddruhy 6B, 23F, 19F, 14, 18C, 4 a 9V, protože se odhaduje, že tato malá skupina pneumokokových poddruhů je odpovědná za 75 až 85 % pneumokokových infekcí u malých i větších dětí. Zde uvedené způsoby přípravy jsou aplikovatelné na široké spektrum pneumokokových a jiných bakteriálních polysacharidů.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je konjugát, obsahující imunogenní protein, kterým je proteinový komplex vnější membrány (OMPC) Neisseria meningitidis b, nebo jeho podjednotka MIEP, kde MIEP znamená hlavní protein zvyšující imunitu, přičemž tento protein je kovalentně vázaný spolysacharidem, odvozeným od jednoho nebo více poddruhů Streptococcus pneumoniae, přičemž uvedený polysacharid obsahuje v průměru méně než 1200 opakujících se jednotek na molekulu, jeho molekulová hmotnost leží mezi 1 x 10⁵ a 1 x 10⁶, polydisperzita mezi 1,0 a 3,0 a hladina kontaminace pneumokokovým skupinově specifickým C-polysacharidem je nižší než 3 % tohoto druhově specifického polysacharidů.

Dále je předmětem vynálezu způsob výroby výše uvedeného konjugátu, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje

a) izolaci surového pneumokokového polysacharidů Pn-Ps;

-2CZ 283284 B6

b) částečnou hydrolýzu nebo mechanické smykové zpracování surového Pn-Ps;

c) derivatizaci frakcionováného Pn-Ps odvozeného od jednoho nebo více pneumokokových poddruhů, získaného podle kroků a) až b) za účelem zavedení vyčnívajících bočních nukleofilních nebo elektrofilních skupin;

d) izolaci OMPC nebo jeho podjednotky z Neisseria meningitidis;

e) funkcionalizaci OMPC nebo jeho podjednotky za účelem zavedení reaktivních elektrofilních nebo nukleofilních skupin;

f) konjugaci polysacharidu z kroku c) s proteinem z kroku e);

g) blokování konjugátu pro odstranění zbytkových funkčních skupin;

h) izolaci konjugátového produktu, kde OMPC a Pn-Ps mají shora uvedený význam.

Dále je předmětem vynálezu způsob výroby výše uvedeného konjugátu, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje

a) kultivaci pneumokoků a izolaci surového pneumokokového polysacharidu nebo solubilizaci práškového pneumokokového polysacharidu;

b) purifikaci a částečnou hydrolýzu polysacharidu z kroku a) až po předem stanovenou hranici, za vzniku polysacharidu schopného konjugace, kteiý neztratil více než 30 % polysacharidové druhově specifické antigenicity ve srovnání se surovým polysacharidem z kroku a); a

c) konjugaci produktu z kroku b) s imunogenním proteinem;

přičemž pneumokoky kultivované v kroku a) zahrnují alespoň jeden poddruh zvolený ze skupiny obsahující poddruhy 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F a 23F; Pn-Ps si zachovává svou antigenní integritu, podle měření Ouchterlonyho dvojitou imunodifúzní zkouškou nebo rychlostní nefelometrií s použitím anti-Pn-Ps druhově specifické protilátky; a Pn-Ps se před konjugací fyzikálně zpracovává smykem v Gaulinově lisu při tlaku mezi 13,74 a 103,05 MPa nebo se hydrolyzuje zahříváním při 100 °C po dobu 24 hodin nebo působením ultrazvuku, až se dosáhne při koncentraci Pn-Ps 1 mg/ml v roztoku chloridu sodného o koncentraci 0,9M konečné hodnoty viskozity nebo IQ, pík, které pro každý Pn-Ps poddruh uvádí následující seznam

Pn-Ps poddruh	Cílová konečná hodnota viskozity. 106 (m2.s’’)	Cílová konečná hodnota IQ, pík
Pn-4-Ps	1,5 až 1,00	0,65 ± 0,05
Pn6B-Ps	1,3 až 1,00	0,60 ± 0,05
Pn9V-Ps	1,3 až 1,00	0,65 ± 0,05
Pnl4-Ps	1,1 až 0,95	0,60 ± 0,05
Pnl8C-Ps	1,5 až 1,00	0,65 + 0,05
Pnl9F-Ps	1,3 až 1,00	0,65 ± 0,05
Pn23F-Ps	1,5 až 1,00	0,54 ± 0,05.

Předmětem vynálezu je i vakcínový přípravek, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje výše uvedený konjugát a inertní nosič, kterým je hydroxid hlinitý, fosforečnan hlinitý nebo oxid

-3 CZ 283284 B6 hlinitý, přičemž konjugát obsahuje jeden až všechny konjugáty vybrané ze skupiny obsahující

Pn4-Ps-OMPC, Pn6B-Ps-OMPC, Pn9V-Ps-OMPC, Pnl4-Ps-OMPC, Pnl8C-Ps-OMPC, Pnl9FPs-OMPC, Pn23F-Ps-OMPC, Pnl-Ps-OMPC, Pn5-Ps-OMPC, Pn7F-Ps-OMPC.

Konečně je předmětem vynálezu také použití výše defonovaného konjugátu, přičemž konjugát obsahuje jeden až všechny konjugáty vybrané ze skupiny obsahující Pn4-Ps-OMPC, Pn6B-PsOMPC, Pn9V-Ps-OMPC, Pnl4-Ps-OMPC, Pn 18C-Ps-OMPC, Pnl9F-Ps-OMPC, Pn23F-PsOMPC, Pnl-Ps-OMPC, Pn5-Ps-OMPC, Pn7F-Ps-OMPC, pro výrobu kombinovaného vakcínového přípravku proti Pneumococcus a jedné až všem dalším chorobám zvoleným ze souboru zahrnujícího hepatitis B, hepatitis A, hepatitits non-A non-B, AIDS, záškrt-čemý kašeltetanus, spalničky, příušnice, zarděnky, plané neštovice, dětskou obrnu a Haemophilus influenzae b.

Vysoce chemicky definovaný pneumokokový polysacharid (Pn-Ps) se připraví částečnou hydrolýzou surového Pn-Ps preparátu. Hydrolýza probíhá až k předem stanovenému konečnému produktu, který si udržuje antigenní integritu Pn-Ps. Částečně hydrolyzovaný Pn-Ps se vydatně čistí a používá se pro přípravu konjugátu Pn-Ps-imunogenní protein (PRO), Pn-Ps-PRO.

Nové vysoce antigenní Pn-Ps-PRO konjugáty podle tohoto vynálezu, obsahující proteinový komplex z vnější membrány (OMPC) Neisseria meningitidis b nebo jeho rekombinantní nebo purifikované podjednotky, jako je MIEP, nebo jiné imunogenní nosičové proteiny kovalentně vázané k částečně hydrolyzovaným a vysoce purifikovaným Pn-Ps meziproduktům z převládajících pneumokokových izolátů, jsou užitečné pro prevenci pneumokokových infekcí u savců. Tyto konjugáty jsou zvláště užitečné ve vakcínových přípravcích pro stimulaci anti-pneumokokových imunitních odpovědí u savců, zejména u jedinců s narušením imunity v důsledku poškození B-buněk, u starších osob a u dětí do dvou let, protože konjugáty vyvolávají odpověď T-buněk. Pn-Ps-OMPC a Pn-Ps-MIEP konjugáty se vyrábějí podle postupu, který obsahuje následující kroky: izolaci kapsulámího Ps z kultur Streptococcus pneumoniae (pneumokoky Pn), částečnou hydrolýzu nebo fyzikální rozštěpení Pn-Ps, frakcionaci vzniklých Pn-Ps za vzniku PnPs produktu se sníženou velikostí molekuly, polydisperzitou a viskozitou a potom kovalentní konjugaci Pn-Ps s OMPC nebo MIEP.

Způsob přípravy kovalentních konjugátů pneumokokový polysacharid - imunogenní protein (PnPs-PRO) je zlepšen oproti způsobu popsanému v americkém patentu č. 4 695 524. Toto zlepšení spočívá ve větší chemické definovatelnosti a čistotě výchozího Pn-Ps, meziproduktů a finálního produktu a ve větší konsistentnosti a snazším provedení celého postupu. Chemicky definované konjugáty Pn-Ps-PRO vykazují závislosti na T-buňkách a jsou využitelné při vyvolávání tvorby sérových protilátek proti patogenním pneumokokům, zejména u dětí do dvou let a u jedinců se sníženou imunitou. Konjugátů podle vynálezu se může použít k terapeutickým účelům v podobě očkovacích látek pro prevenci nemocí vyvolaných pneumokoky jako je otitis media, meningitis, pneumonia, bacteriaemia a akutní exacerbace chronické arthritis, sinusitis, bronchitis a conjunctivitis.

Následuje podrobný popis tohoto vynálezu.

A. Nový Pn-Ps-PRO konjugát a póly sacharidové meziprodukty

V konjugovaném produktu Pn-Ps-PRO podle tohoto vynálezu se poměr Pn-Ps ku PRO pohybuje mezi hodnotami 0,05 až 0,5 mg polysacharidu na miligram proteinu. Produkt vykazuje vysoký stupeň kovalentnosti, minimální kontaminaci volným Pn-Ps a jedinečné fyzikální a chemické charakteristiky, což je způsobeno novou polysacharidovou složkou produktu.

-4CZ 283284 B6

Konjugát obsahuje imunogenní protein (PRO) kovalentně vázaný pomocí mezemíku na nový, částečně hydrolyzovaný a vysoce purifikovaný, pneumokokový kapsulámí polysacharid (Pn-Ps). Imunogenním proteinem je přednostně proteinový komplex vnější membrány (OMPC) získaný z kultury Neisseria meningitidis b. Jeden způsob přípravy OMPC je popsán v americkém patentu č. 4 271 147, konkrétně v příkladu 1. Alternativně se může také s výhodou použít podjednotka OMPC, jako je MIEP, získaná disociací OMPC nebo jeho rekombinantní expresí. Jeden způsob přípravy této podjednotky je popsán v patentových přihláškách USA č. 555 978, 555 329 a 555 204, které byly podány 19. července 1990 a v příkladu 2.

Nový částečně hydrolyzovaný a vysoce purifikovaný pneumokokový kapsulámí polysacharid (Pn-Ps) je preparát antigenního polysacharidu, získaný z kultury jednoho z pneumokokových poddruhů (jak je to popsáno dále, v části popisující nový způsob konjugace a v příkladech 3 až 10). Průměrná molekulová hmotnost Pn-Ps se pohybuje od asi 1 x 10⁵ do 1 x 10⁶ daltonů. Molekula Pn-Ps obsahuje v průměru méně než 1000 opakujících se jednotek. Kontaminace Cpolysacharidem je nižší než asi 3 % a index antigenicity se pohybuje mezi hodnotami 0,4 a 1,1, přednostně mezi 0,7 a 1,1. Tento parametr vyjadřuje relativní množství vazeb anti-pneumokokově specifické protilátky na jednotku hmotnosti nového Pn-Ps ve srovnání se surovým Pn-Ps uloženým ve sbírce ATCC. Kromě toho je nový Pn-Ps schopný konjugace s imunogenním proteinem, čímž se vytvoří Pn-Ps-PRO produkt podle vynálezu. Některé fyzikální a chemické charakteristiky dvou různých Pn6B-Ps a dvou různých Pn24F-Ps preparátů jsou udány v tabulce I dále. Následující popis vysvětluje jak se tyto charakteristiky měří. Dále uvedený postup představuje způsob tvorby Pn-Ps meziproduktů a Pn-Ps-PRO konjugátů s širokou skupinou pneumokokových poddruhů. Tato skupina zahrnuje poddruhy 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19F, 19A,20, 22F, 23Fa33F, ale neomezuje se na ně. Jak je uvedeno výše, přednostně užívanou podskupinu pneumokokových polysacharidů tvoří polysacharidy odvozené od pneumokokových poddruhů 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F a 23F. Odborníkům v daném oboru je zřejmé, že kromě těchto polysacharidů nebo místo nich se mohou použít jiné tak, jak to vyžaduje ohrožená populace. Pnl-Ps a Pn5-Ps se tedy mohou zpracovávat jako Pn4-Ps nebo Pn9V-Ps, podobně jako polysacharidy z Neisseria meningitidis B, C nebo polysacharidy ze streptokoků skupiny B, zatímco Pn7F-Ps se může zpracovávat jako Pnl4-Ps a potom se mohou vzniklé konjugáty včlenit do polyvalentní vakcíny, jak je to blíže popsáno dále. Odborníkům v tomto oboru je také zřejmé, že začleněním Pn6B-Ps by bylo možno dosáhnout ochrany proti Pn6a prostřednictvím křížově reaktivních protilátek. To také platí pro řadu jiných poddruhů pneumokoků.

Polyvalentní vakcíny jsou vakcíny obsahující směsi různých Pn-Ps-PRO konjugátů, přičemž každý konjugát je připraven odděleně s Pn-Ps daného poddruhu. Kromě toho jsou polyvalentní vakcíny vakcínami, v nichž je najednou nebo postupně konjugováno několik Pn-Ps různých poddruhů s daným PRO.

1. Charakterizace nových polysacharidových meziproduktů

Fyzikální a chemické charakteristiky částečně hydrolyzovaných, purifikovaných pneumokokových kapsulámích polysacharidových meziproduktů závisí na poddruhu pneumokoku, od kterého je polysacharid odvozen a na úpravách, které se sním provádějí při postupu podle tohoto vynálezu. Obecně mají Pn-Ps meziprodukty dva- až desetkrát nižší velikost molekuly apolydisperzitu ve srovnání se surovými polysacharidy, získanými z bakteriální kultury. Menší velikost molekuly umožňuje lepší manipulaci s polysacharidem během konjugace, snazší odstranění volných Pn-Ps po konjugaci, dosažení vyšší čistoty a homogenity Pn-Ps, nižší polydisperzity Pn-Ps, pokud se týče velikosti molekul při v podstatě nezměněné antigenicitě. Tyto charakteristiky nových Pn-Ps podporují významně konzistentní tvorbu dobře definovaného, vysoce druhově specifického, antigenního Pn-Ps-PRO produktu.

-5CZ 283284 B6

i. Molekulová hmotnost a polydisperzita Pn-Ps

Měřením hmotnostní střední molekulové hmotnosti M_w pomocí difúze, sedimentace nebo chromatografickým způsobem a měřením číselné střední molekulové hmotnosti Mn pomocí koligativní vlastnosti, jako je viskozita, snížení teploty tuhnutí nebo zvýšení teploty varu, se získá polydisperzita Pn-Ps preparátu jako poměr M_w/Mn- Čím více se tato hodnota blíží jedničce, tím má polysacharidový preparát větší homogenitu. V tomto popisu je uvedena polydisperzita řady Pn-Ps preparátů a také se zde popisuje přednostní způsob dosažení této zvýšené homogenity.

Rozdělovači koeficient vzorku (Kd) je definován takto:

V_e-V₀ K_d =--------------- ,

Vi-V₀ kde

V_o představuje mrtvý objem kolony,

V; představuje celkový permeační objem kolony a

V_e představuje eluční objem vzorku.

Kj každého surového a částečně hydrolyzovaného Pn-Ps preparátu se měří pomocí normální nebo vysokoúčinné chromatografie, založené na principu rozlišení velikosti molekuly /sizeexclusion chromatography (SEC) nebo high-performance size-exclusion chromatography (HPSEC)/. Měření se provádí s alikvótním podílem vzorku polysacharidu postupem známým v tomto oboru. Takto získaná hodnota Kd je měřítkem průměrného hydrodynamického objemu polysacharidového konjugátu. Při snižování velikosti molekul Pn-Ps fyzikálním štěpením molekul nebo tepelnou nebo ultrazvukovou hydrolýzou způsobem podle vynálezu se zvyšuje eluční objem vzorku Pn-Ps a také roste hodnota Kd.

Přednostně užívanou náplní kolony pro tento účel je gel SEPHAROSE CL2B Pharmacia č. 170120-01). Mrtvý objem kolony se stanoví pomocí modři Blue Dextran 2000 (Pharmacia č. 170360-01) a celkový permeační objem kolony (V,) se stanoví pomocí píku chloridu sodného. Podle jednoho způsobu se vzorek Pn-Ps připraví jako roztok o koncentraci 2,5 mg Pn-Ps na 1 ml destilované vody. Objem nástřiku je 1 ml. Poměr V/V; by se měl pohybovat v rozmezí 0,32 až 0,37. K<j pro Dextran T500 (Pharmacia č. 17-0320-01) by měl být v rozmezí 0,37 až 0,49. Přednostně užívaný HPSEC systém obsahuje kolonu o velikosti 7,5 x 600 mm TSK G6000 PW vyhřívanou na 50 °C.

V optimálním uspořádání je systém SEC nebo HPSEC kombinovaný s diferenčním refraktometrem, který monitoruje relativní koncentraci analytu jako funkci elučního objemu a s diferenčním viskozimetrem, který monitoruje specifickou viskozitu analytu, jako funkci elučního objemu. Univerzální kalibrační křivka [log(vnitřní viskozita krát molekulová hmotnost)proti retenčnímu objemu] se sestrojí na základě analýzy série monodisperzních standardů polyethylenoxidu. Koncentračního profilu a profilu specifické viskozity se může použít pro výpočet profilu závislosti molekulové hmotnosti na elučním objemu pro daný vzorek a z těchto hodnot se dále vypočtou hodnoty M_N a M_w. Z hodnot M_N a M_w se vypočte index polydisperzity (M_N/M_W) /Yau, W. W. a Rementer, S. W., J. Liq. Chromatog., 13, 627 až 675 (1990); Nagy, J. Liq. Chromatog., 13, 677 až 691 (1990); Benoit a další, J. Ch. Phys. Tome., 63, 1507 až 1514 (1966)/. Podle tohoto vynálezu se vnitřní viskozita maří v pufru o koncentraci 0,lM fosforečnanu sodného při pH 7,2.

-6CZ 283284 B6

Po stanovení průměrné molekulové hmotnosti Pn-Ps preparátu se může průměrný počet opakujících se jednotek v molekule snadno zjistit vydělením molekulové hmotnosti polymeru molekulovou hmotností opakující se jednotky (viz tabulka II).

ii. Retence druhově specifické angigenicity Pn-Ps

Pro každý surový Pn-Ps, podrobený fyzikálnímu štěpení nebo hydrolýze chemickými prostředky, teplotou, ultrazvukem nebo enzymy, je důležité stanovit konečný produkt, za nímž se již antigenní integrita začíná ztrácet. Tento konečný produkt se dá snadno zjistit pomocí korelace mezi viskozitou vzorku a kterýmkoliv z řady imunologických testů, známých v tomto oboru. Přednostním způsobem je měření alikvotního podílu polysacharidového roztoku pomocí Ouchterlonyho dvojitého imunodifusního stanovení s použitím pneumokokové podddruhově specifické protilátky. Vznik bílého precipitačního pásu v agaru, který se připojuje k precipitačnímu pásu vzorku surového Pn-Ps, umístěného v sousední jamce, po uplynutí doby pro difúzi, umožňuje kvalitativní indentifikaci reaktantů a poskytuje důkaz, že póly sacharidová antigenní integrita vzorku zůstala neporušená. Kvantitativnější imunologické stanovení se provádí metodou rychlostní nefelometrie nebo pomoci RIA testu.

Při rychlostní nefelometrii se měří změna nebo rychlost změny intenzity rozptýleného světla během tvorby komplexu antigen-protilátka. Reakce probíhá v reakční cele, kterou prochází světelný paprsek. V tomto případě se tvoří komplexy při imunoprecipitační reakci, která probíhá v roztoku, když specifická protilátka (Ab) reaguje se svým specifickým antigenem (Ag), tj. Pn-Ps. Jelikož tvorba Ag-Ab komplexu závisí na přítomnosti molekul Ag a Ab v optimálních množstvích, roste míra tvorby komplexu při konstantním množství Ab s rostoucím množstvím Ag až po maximální hranici; větší množství Ag způsobují nižší tvorbu komplexu. Kalibrační křivka se vytvoří tak, že se udržuje konstantní množství Ab a měří se rozptyl světla při zvyšujících se koncentracích Ab. Pro Ps (nebo derivatizovaný Ps) preparát je možné vypočítat koncentraci Ag, jestliže se vzorky nechají reagovat se svými specifickými Ab za stejných podmínek, za jakých byla sestrojena kalibrační křivka.

Srovnání koncentrace, vypočtené imunologicky pomocí rychlostní nefelometrie, s koncentrací, získanou chemicky nebo fyzikálně (pomocí kalorimetrie, měření indexu lomu nebo totální hydrolýzy a stanovení nomosacharidů - viz dále) se udává index antigenicity pro Ps vzorky. Stanovení sušiny polysacharidů je vhodné pouze v případě, že je známý obsah těkavého podílu v práškovém vzorku. Je obecně známo, že póly sacharidy jsou hygroskopické a mohou obsahovat jakékoliv množství od 5 do 30 % hmotnostních těkavých látek. Proto není stanovení sušiny v nich nebo u nich příliš spolehlivé. Pro stanovení koncentrace polysacharidů s rozumnou přesností se používá kolorimetrického stanovení. Kalibrace se provede pomocí standardního roztoku polysacharidů, který se sleduje. Například Pn6B-Ps, Pnl8C-Ps, Pnl9F-Ps a PN23F-Ps se mohou kvantifikovat pomocí stanovení methylpentosy podle Dische a Shettles /J. Biol. Chem., 175, 595 až 603 (1948)/. Pn4-Ps, Pn9V-Ps, Pnl4-Ps aPnl9 F se mohou kvantifikovat stanovením obsahu hexosaminu a Pn9V se může také kvantitativně určit na základě obsahu kyseliny uronové. Stanovení pomocí fenolu a kyseliny sírové /Dubois a další. Anal. Chem., 28, 350 až 356 (1956)/ je užitečné pro zjištění celkového množství všech Pn-Ps preparátů při testování během přípravy konjugátu. Dalším používaným způsobem je měření signálu indexu lomu jako míry hmotnosti analytu. Při tomto způsobu se také provádí kalibrace pomocí standardního roztoku polysacharidů, který se sleduje. Kolorimetrické stanovení se sice používá pro sledování obsahu polysacharidů ve vzorcích během derivatizace a konjugace, ale refraktometrického měření se používá při fyzikální charakterizaci polysacharidového preperátu pomocí HPSEC univerzální kalibrační analýzy a při výpočtu indexu antigenicity. Výchozímu surovému Pn-Ps se přidělí hodnota indexu antigenicity 1,0. Pro experimentální vzorky se vypočítá index relativní antigenicity; je-li jeho hodnota v rozmezí od 4,0 do 1,1, považuje se to za uspokojivé. Indexu

-7CZ 283284 B6 antigenicity většího než 1,0 se může dosáhnout, jestliže se polysacharid značně vyčistí během hydrolýzy a frakcionace. Teoreticky by také mohlo samotné zmenšení velikosti molekul zvýšit index antigenicity preparátu zvětšením flexibility polysacharidových molekul a tím snížením sterické interference kolem antigenních epitopů. Tato stanovení se provádějí jako kontrolní stanovení během procesu hydrolýzy frakcionace a derivatizace Ps vzorků. Vzorky, které mají hodnoty relativní antigenicity menší než 0,4 se vyřadí, tj. nekonjugují se. Anti-Pn-Ps protilátky jsou dostupné a používají se pro charakterizaci pneumokokových polysacharidů. Anti-Pn-Ps protilátky jsou dostupné například v the Health Research. Inc., Albany. NY a the Staten Serun Institute. Alternativně se druhově specifické nati-Pn-Ps protilátky mohou pro tento účel připravit podle postupů známých v tomto oboru, přičemž jako imunogenu se použije komerčně dostupného surového Pn-Ps /Baker a další. Immunology 20, 469 (1971); Brooke, M. S., J. Immunol., 95, 358 (1966); Keamey, R. a Halladay, W. J., Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci., 48, 227 (1970); Schneerson, R. a další, Prog. Allergy, 33, 144 (1983); Robbins, J. B., Infect. Immun., 26 1 116(1979)/.

Dalším ukazatelem zachované antigenní integrity je udržování správného chemického složení Pn-Ps preparátu. Například Pn6B-Ps má opakující se jednotku /a-Gal(l-3)-a-Glu(l-3)-a-LRhapíl-Aj-D-Ribitol-S-POJ?)/, takže molámí poměr cukerných složek ribitol: rhamnosa: : galaktosa: glukosa je přibližně 1:1:1:1. Tento poměr se může stanovit například po hydrolýze polysacharidů. Hydrolýza se provádí dvě hodiny, při teplotě 45 až 65 °C, 36% kyselinou fluorovodíkovou, dále 10 až 20 hodin, při teplotě 100 °C kyselinou trifluoroctovou o koncentraci 2 M. Po hydrolýze se provede stanovení pomocí vysokoúčinné chromatografie na anexu s pulsní amperometrickou detekcí. Ukazatelem zachované integrity jsou čtyři píky, které reprezentují přibližně ekvimolámí množství cukerných složek. Zhruba teoretické poměry cukerných složek se zachovávají u všech nových Pn-Ps sloučenin podle tohoto vynálezu, s rozptylem asi 20 %. Odchylky od teoretických hodnot jsou způsobené hlavně omezeními danými povahou zvolené metody. Takže po celkové hydrolýze má

Pn23F-Ps molámí poměr glycerol: rhamnosa: galaktosa: glukosa 1:2:1:1;

Pn 14-Ps má molámí poměr N-acetylglukosamin: galaktosa: glukosa 1:2:1;

Pnl9F-PS má molámí poměr rhamnosa: N-acetylmanosamin: glukosa asi 1:1:1;

Pn 18C-PS má molámí poměr glukosa: galaktosa: rhamnosa: glycerol: acetát asi 3:1:1:1:1;

Pn9V-Ps má molámí poměr glukosa: galaktosa: N-acetylmanosamin: glukuronová kyselina: galakturonová kyselina: acetát asi 2:1:1:1:1:1:7; a

Pn4-Ps má molámí poměr N-acetylmanosamin: N-acetylfukosamin: galaktosamin: galaktosa: pyruvát asi 1:1:1:1:1.

Kromě toho se nedávno zjistilo, že Pn-4Ps obsahuje přídavnou složku, identifikovanou pomocí HPLC analýzy jako 2-aminopneumosamin (2-amino-2,6-dideoxytalosa), stejně jako Pn5-Ps /Barker a další, Carbohydrate Tes., 224 až 233 (1966)/. Pnl9F-PS obsahuje také přídavnou složku, pravděpodobně hexosamin, což se v literatuře neuvádí. Definitivní identifikace této složky není dosud vyřešena. Tyto a přídavné teoreticky možné polysacharidové opakující se složky se uvádějí v následujících odkazech: J. E. G. van Dam a další, Carbohyd. Res. 187, 267 (1988); H. J. Jennings, Adv. Carbohyd. Chem. 41, 155 (1983) a odkazy v této publikaci; J. C. Richards aM. Perry, Biochem. Cell. Biol. 66, 758 (1988)/. Kromě cukerných složek obsahují některé sledované Pn-Ps fosfátové, acetátové a pyruvátové boční skupiny, přičemž některé z těchto skupin mají imunodominentní rysy. Proto se může obsah těchto složek také sledovat (viz

-8CZ 283284 B6 příklad 30). Kvantitativní stanovení monosacharidů je také užitečným prostředkem pro určení koncentrace polysacharidu ve vzorku.

Dalším prvkem antigenicity sledovaných polysacharidů je zachování toho, čemu se říká konformační epitop v polysacharidu /viz např. Wessels, M. R. a Kasper, D. L., J. Exp. Med., 169, 2121 až 2131 (1989)/. Tato úroveň antigenity se vyjadřuje pouze u sacharidů s vysokou molekulovou hmotností. Zde popsané metody jsou řízeny tak, aby se tato úroveň antigenicity také zachovala.

iii. Minimální kontaminace C-polysacharidem

Dalším kritickým parametrem je hladina kontaminace C-polysacharidem. Tato hodnota se může získat po totální kyselé hydrolýze polysacharidového preparátu pomocí chromatografické analýzy hydrolyzátu a konduktometrické detekce cholinu /Hermans a další, Reci. Trav. Chim. Pays-Bas, 107, 600 (1988)/. Alternativně se může stanovit cholin v nehydrolyzovaném polysacharidu pomocí NMR. Při použití NMR techniky se pro výpočet obsahu C-Ps používá poměr signálu cholinu ku signálu methylskupiny rhamnosy (pro Pn-Ps obsahující rhamnosu; pro Pn-Ps neobsahující rhamnosu se používá jiný signál). Při použití chromatografického způsobu analýzy se pro výpočet obsahu C-Ps využívá poměr signálu cholinu buď k obsahu polysacharidu, určenému konduktometricky, nebo k píku jedné ze složek Pn-Ps. V obou případech dovolují standardy o známých koncentracích cholinu přímý výpočet množství cholinu přítomného v polysacharidovém vzorku za použití teoretické opakující se struktury C-Ps (Herman a další, citace uvedená výše); stanoví se tak koncentrace C-Ps v polysacharidovém vzorku. Koncentrace polysacharidu v Pn-PS vzorcích se měří způsoby, které jsou v tomto oboru známé. Například celková koncentrace polysacharidu se může stanovit po celkové hydrolýze polysacharidu měřením koncentrace specifického monosacharidů. Porovnáním koncentrace C-Ps ku celkové koncentraci polysacharidu se stanoví stupeň kontaminace C-polysacharidem v hmotnostních procentech. Stupeň kontaminace nižší než 3 % hmotnostní se považuje za přijatelný, ale vhodnější je stupeň kontaminace nižší než 1 %.

Chemické a fyzikální vlastnosti dvou šarží Pn6B-Ps a dvou šarží Pn23F-Ps jsou shrnuty v tabulce I dále v textu. Tyto údaje ukazují reprodukovatelnost u parametrů od šarže k šarží, která je výsledkem nového, zde popsaného procesu.

Tabulka I

Vlastnosti hydro lyžovaných a fřakcionovaných Pn-Ps

Pn-Ps preparát	6b-1	6B-2	23F-1	23F-2
Viskozita konečného produktu	1,094	1,147	1,350	1,376
Kd (HPSEC)	0,62	0,62	0,49	0,49
Kd (CL-28)	0,64	0,60	0,41	nestanoveno
Monosacharid	S	S	S	S
Antigenicita: stanovení podle Ouchterlonyho	S	S	s	S
Nefelometrické stanovení	S	S	s	S
Stanovení postupem s fenolem a kyselinou sírovou	S	S	s	S

-9CZ 283284 B6

S: nalezená hodnota je uspokojivá

Tabulka II, uvedená dále, ukazuje chemické a fyzikální parametry několika surových pneumokokových polysacharidů a odpovídajících nových hydrolyzovaných a frakcionovaných (hyd+frak) sloučenin podle vynálezu. Uvedené hodnoty jsou přibližné, v mezích experimentální chyby a hranic detekce připravených komplexních polysacharidových sloučenin.

Tabu lkali

Fyzikální a chemické vlastnosti surových a nových hydrolyzovaných a frakcionovaných Pn-Ps sloučenin

Pn-Ps	Pík Ka	Vnitřní	Hmotnostní	Číselná středová	Poly-	Počet	C-Ps
poddruh		viskozita	středová	molekulová	disperzita	opakujících	%
			molekulová	hmotnost (Mn)	(Mw/Mn)	se jednotek
			hmotnost (Mw)			na molekulu

4-surový	0,55 ± 0,05	4,34 ± 10%	4,2 x 103 ± 20 %	3,3 x 103 ± 20 %	1,2 až 1,6	>600	>3
4-hyd+frak	0,69 ± 0,05	1,0 až 3,0	1 x 105-5 x 105	2x 103-4x 103	1,0 až 1,4	<600	<3
6B-surový	0,40 ± 0,05	2,67 ± 10 %	1,4 x 106±20%	9 x 10^20%	1,5 až 2,5	>1000	>3
6B-hyd+frak :	0,60 ± 0,05	1,0 až 2,0	3 x 10^-7 x 103	3x 103-6x 103	1,0 až 1,4	<1000	<3
9V-surový	0,53 ± 0,05	2,29 ± 10%	1,1 x 106±20%	9x 103±20%	1,2 až 2,5	>800	>3
9V-hyd+frak :	0,65 ± 0,05	1,0 až 2,0	3x 103-7x 103	3 x 10s-6 x 10’	1,0 až 1,4	<800	<3
14-surový	0,50 ± 0,05	1,69 ± 10%	l,lxl06±20%	7xl05±20%	1,3 až 2,5	>1200	>3
14-hyd+frak	0,60 ± 0,05	0,6 až 1,6	4x 103-l x 106	3x105-8x105	1,0 až 1,4	<1200	<3
18C-surový	0,50 ± 0,05	5,20 ± 10%	8,7 x 105±20%	6x 105 ± 20 %	1,4 až 2,5	>700	>3
18C-hyd+frak :	0,65 ± 0,05	1,5 až 3,0	2x 103-6x 103	2x 103-6 x 105	1,0 až 1,4	<700	<3
19F-surový	0,44 ± 0,05	2,95 ± 10%	1,0 x 106±20%	6x 103±20%	1,8 až 2,5	>1000	>3
19F-hyd+frak :	0,65 ± 0,05	1,0 až 2,0	2x 105-6x 105	2 x 103-6 x 103	1,0 až 1,4	<1000	<3
23F-surový	0,36 ± 0,05	4,15 ±10%	2,2 x 106 ± 20 %	1 x 106 ± 20 %	2,0 až 3,0	>1000	>3
23F-hyd+frak :	0,54 ±0,10	1,5 až 3,0	4 x 105-8 x 105	2x 103-6x 103	1,0 až 1,4	<1000	<3

2. Charakterizace nového Pn-Ps-PRO konjugátu

i. Identifikace a kvantitativní stanovení Pn-Ps

Je velmi užitečné ověřit si množství a chemickou integritu Pn-Ps v konečném konjugátu nezávislou technikou, aby se ověřila antigenicita (integrita) a vypočítal se Pn-Ps/PRO poměr. Jeden způsob zahrnuje totální hydrolýzu pomocí TFA, o koncentraci 2M, při teplotě 100 °C, po dobu 5 až 16 hodin, přičemž optimální doba hydrolýzy závisí na každém jednotlivém Pn-Ps. Stejná množství Pn-PS-PRO konjugátu a PRO hydrolyzátu (na podkladě výsledku stanovení proteinů podle Lowryho) se analyzují pomocí vysokoůčinné chromatografie na anexu s pulzní amperometrickou detekcí. Získají se monosacharidové profily. Profil PRO se odečte od profilu Pn-Ps-PRO konjugátu za použití vhodného počítačového software, jako je Nelsonův program, za účelem korekce na monosacharidy, které pocházejí z PRO, například lipopolysacharidu (LPS), přítomného v OMPC. Množství Pn-Ps v konjugátu se tedy vypočte porovnáním profilu známého

- 10CZ 283284 B6 množství derivatizovaného Pn-Ps hydrolyzátu a korigovaného Pn-Ps-PRO konjugátu. Poměr PnPs/PRO se také měří tímto způsobem.

ii. Stanovení nových aminokyselin jako indikátoru konjugace a blokování

Po konjugaci Pn-Ps s PRO se vzorky konjugátu hydrolyzují v HC1, o koncentraci 6N a provede se analýza aminokyselin. Tento způsob deteguje přítomnost a množství výjimečných aminokyselin jako je S-karboxymethylhomocystein (S-CMHC) a S-karboxymethylcysteamin (SCMCA). S-CMHC se tvoří jako součást chemické vazby při chemické reakci mezi derivatizovaným Pn-Ps a PRO, jak je to popsáno v části zabývající se postupem, uvedené dále. Přítomnost této aminokyseliny se bere jako definitivní důkaz kovalentní vazby mezi derivatizovaným Pn-Ps a PRO. Tvorba takové kovalentní vazby je nezbytná pro imunogenicitu konjugátové vakcíny vzhledem k T-buňkám. Ihned po dokončení konjugační reakce se nezreagované bromacetamidové skupiny blokují N-acetylcysteaminem. Výsledkem hydrolýzy této vazby je uvolnění (SCMCA), což se také deteguje analýzou aminokyselin. Detekce této aminokyseliny (S-CMCA) potvrzuje úspěšné blokování reaktivních bromacetamidových skupin. Tím jsou tyto skupiny nedostupné pro jakékoliv nechtěné chemické reakce. Přijatelné hodnoty kovalentnosti a blokování se pohybují v rozmezí asi 1 až 15 % pro S-CMHC/Lys a asi 0 až 5 % pro S-CMCA/ /Lys.

iii. Analýza vakcíny adsorbované na hydroxid hlinitý

Přednostně se Pn-Ps-PRO konjugát adsorbuje na hydroxid hlinitý /A1(OH)₃ gel/ (viz oddíl C, dále) a tím se zesílí imunitní odpověď na vakcínu. Jiné možné vytvoření vakcíny zahrnuje použití fyziologicky přijatelných ředidel, jiných adjuvans, imunomodulátorů nebo inertních excipientů jiných než je gel hydroxidu hlinitého. Analýza materiálu adsorbosaného na gel hydroxidu hlinitého se provádí následujícím způsobem.

Pn-Ps-PRO adsorbovaný na hydroxidu hlinitém se může analyzovat pokud jde o jeho složení a stabilitu po desorbci konjugátů z hydroxidu hlinitého. Tento způsob se doplní dialýzou Pn-PsPRO adsorbovaného na A1(OH)₃ proti roztoku citrátu sodného, o koncentraci 3 %, po dobu 16 hodin při laboratorní teplotě. Vzniklá rozpustná sůl, citrát hlinitý, migruje pryč přes dialyzační membránu a zbývá Pn-Ps-PRO. Tento způsob je důležitý, aby se potvrdilo, že v přípravku adsorbovaném na hydroxid hlinitý je správné množství Pn-Ps-PRO.

Avšak některé přípravky jako Pn6B-PS-OMPC a Pn23F-PsOMPC obsahují 10, 5, 2 a 1 pg Pn-Ps/ml (viz oddíl C, dále), což jsou koncentrace nedetegovatelné chemickými metodami. Aby se daly provést analýzy složení cukrů i v tomto případě, vakcíny s adsorbovaným Pn-PsOMPC se nejprve peletují, aby se odstranila voda. Pelety se resuspendují v jedné pětině původního objemu vody před rozpouštěním v roztoku citrátu. Po dialýze je solubilizovaný Pn-PsOMPC přítomen v koncentracích 50, 25, 10 a 5 pg Pn-Ps/ml. Při těchto koncentracích je možné stanovit jak Pn-Ps, tak protein a potvrdit tak úroveň dávky.

Vzorky desorbované pomocí citrátu se také analyzují na možnou přítomnost volných Pn-Ps. To je důležité pro kontrolu imunogenicity a pro konzistentnost výroby. Tato analýza se provádí chromatograficky v koloně s náplní SEPHAROSE CL-2B nebo SEPHACRYL S1000SF. Kolona pracuje na principu molekulového síta aje na ní možné oddělit Pn-Ps-OMPC od Pn-Ps, Přítomnost a množství volných Pn-Ps se měří nefelometricky. Úroveň kontaminace Pn-Ps-OMPC volnými Pn-Ps je nižší než 15 % z celkového obsahu Pn-Ps.

- 11 CZ 283284 B6 iv. Test na pyrogenitu: důkaz nepřítomnosti pyrogenity ve významném rozsahu

Konjugační produkt podle tohoto vynálezu se testuje, aby se vyloučila možnost nežádoucích efektů zvyšujících teplotu. Zjistilo se, že konjugační produkty, vyrobené podle zde popsaného postupu, mají přijatelnou pyrogenitu.

Způsob (I. V.)

Vakcína s konjugovaným Pn-Ps se testuje podle postupu, popsaného v 21 CFR, oddíl 610.13 (b).

1) Způsob (I. M.)

Druhým způsobem měření pyrogenity je králičí IM test. Tento test lépe simuluje klinické použití produktu a považuje se za přesnější odraz zjevného znečištění produktu endotoxinem.

Každý králík dostane 1,0 ml vakcíny v podobě nitrosvalové injekce. Test se provádí alespoň na třech králících. Teplota se sleduje po dobu pěti hodin po aplikaci injekce. Jiné testovací způsoby se popisují v 21 CFR, oddíl 610.13 (b). (Testovaná dávka udává koncentrace polysacharidů.)

v. Povaha kovalentní vazby

Pn-PS-PRO, jako Pn-Ps-OMPC nebo Pn-Ps-MIEP konjugáty se mohou připravovat kondenzací pomocí dvojvazných mezemíků, které obsahují thioetherovou skupinu a primární aminoskupinu. Tyto mezemíky tvoří hydrolyticky labilní kovalentní vazby s polysacharidem a PRO, jako je OMPC nebo MIEP. Přednostní konjugáty podle tohoto vynálezu jsou konjugáty, které se mohou vyjádřit vzorci Pn-Ps-A-E-S-B-PRO nebo Pn-Ps-A'-S-E'-B'-PRO, A-E-S-B a A'-S-E'-B' tvoří dvojvazné mezemíky, které obsahují hydrolyticky stabilní kovalentní thioetherové vazby a které tvoří kovalentní thioetherové vazby (například hydrolyticky labilní esterové nebo amidové vazby) s makromolekulami PRO a Pn-Ps. V mezemíků A-E-S-B, symbol S znamená atom síry; symbol E je transformační produkt thiofilní skupiny, která zreagovala s thiolovou skupinou a dá se vyjádřit vzorcem

O

II —C(CH₂)p

nebo

v němž

R představuje atom vodíku nebo methylovou skupinu a p představuje číslo od 1 do 3;

A představuje skupinu obecného vzorce

WH

III

-CN(CH₂)_mY(CH₂)_n-NH-, kde

W představuje kyslík nebo skupinu NH, m představuje číslo 0 až 4,

- 12CZ 283284 B6 n představuje číslo 0 až 3 a

Y představuje methylenskupinu, kyslík, síru, skupinu NR' nebo CHCO2H, kde R' představuje vodík nebo alkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku, přičemž když Y představuje methylenskupinu, potom ani m ani n neznamená číslo 0 a když Y představuje kyslík nebo síru, potom m je větší než 1 a n je větší než 1,

B představuje skupinu obecného vzorce

-(CH₂)_pCH(CH₂)_qD-, kde q představuje číslo 0 až 2,

Z představuje aminoskupinu, skupinu vzorce CH-C(=O)OR', karboxyskupinu nebo atom vodíku,

R'ap mají shora uvedený význam a

D představuje oxoskupinu, skupinu NR' nebo skupinu vzorce

HO O

N-C(CH₂)₂C .

V mezemíku A'-S-E'-B'

S představuje atom síry,

A' představuje skupinu obecného vzorce

W

-CNH(CH₂)_aR- , kde a znamená číslo 1 až 4 a

R představuje methylenskupinu nebo skupinu obecného vzorce

HOY'

I III

NCCH(CH₂)_P, kde Y' představuje aminoskupinu nebo skupinu obecného vzorce NHCOR' a W, p a R' mají shora uvedený význam a buď E' představuje transformační produkt thiofilní skupiny, která byla zreagována s thiolovou skupinou a lze jej vyjádřit obecným vzorcem

R

-CH- , kde R má shora uvedený význam a

- 13CZ 283284 B6

B' představuje oxoskupinu;

nebo E' představuje skupinu vzorce

O

a

B' představuje skupinu obecného vzorce

O II -(CH₂)_pC-, kde p znamená číslo 1 až 3.

Z dvojvazných mezemíků vzorce A-E-S-B a A'-S-E'-B' je možno kvalitativně a kvantitativně stanovit složky E-S-B a A-S-E' , přičemž tato identifikace odráží kovalentnost vazby konjugátu, která spojuje místo s thioetherovou sírou, pocházející z kovalentně modifikovaného polysacharidu s místem mezemíků, které pochází z funkcionalizovaného proteinu.

Konjugáty Pn-Ps-A-E-S-B-PRO podle tohoto vynálezu mohou obsahovat mezemíky, jejichž složkami jsou mimo jiné tyto deriváty: oxid uhličitý, 1,4—butandiamin a S-karboxymethyl-Nacetylhomocystein; oxid uhličitý, 1,5-pentadiamin a S-karboxymethyl-N-acetylhomocystein; oxid uhličitý, 3-oxa-1,5-pentandiamin a S-karbomethyl-N-acetylhomocystein; oxid uhličitý, 1,4-butandiamin a S-karboxymethyl-N-acetylcystein; oxid uhličitý, 1,3-propandiamin a S-karboxymethyl-N-benzoylhomocystein; oxid uhličitý, 3-aza-l,5-pentandiamin a S-karboxymethyl-N-acetylcystein; oxid uhličitý, 1,2-ethandiamin, glycin a S-(sukcin-2-yl) -N-acetylhomocystein. Konjugáty Pn-Ps-A'-S-E'-B'-PRO podle tohoto vynálezu mohou obsahovat mezemíky, jejichž složkami jsou tyto deriváty: oxid uhličitý a S-karboxymethylcysteamin; oxid uhličitý a S-(a-karboxyethyl)cysteamin; oxid uhličitý a S-karboxymethylhomocysteamin; oxid uhličitý, S-(sukcin-2-yl)cysteamin a glycin; oxid uhličitý a S-karboxymethylcystein.

B. Způsob výroby nových Pn-Ps meziproduktů a Pn-Ps-PRO konjugátů

Při popisu se rozlišuje několik stupňů:

I. Příprava polysacharidů

a) izolace surového pneumokokového polysacharidů Pn-Ps

b) částečná hydrolýza nebo mechanické rozštěpení surového Pn-Ps střižnými silami

c) frakcionace částečně hydrolyzovaných Pn-Ps podle velikosti a čistoty

- 14CZ 283284 B6

II. Konjugace

a) funkcionalizace frakcionovaného Pn-Ps za účelem vytvoření elektrofilně nebo nukleofilně reaktivního Pn-Ps*, přednostně takového, který má 21 reaktivních bromacetylových skupin na

100 Pn-Ps oligosacharidových opakujících se jednotek;

b) izolace imunogenního proteinu PRO, přednostně OMPC nebo jeho podjednotky z Neisseria meningitidis B ;

io c) funkcionalizace PRO za účelem vytvoření nuklefilně nebo elektrofilně reaktivního PRO*, přednostně OMPC nebo jeho podjednotky, jako je MIEP s reaktivními sulfhydíylovými skupinami;

d) konjugace polysacharidu (Pn-Ps*), připraveného podle kroku a) s proteinem (PRO*), připraveným podle bodu c);

e) blokování Pn-Ps-PRO konjugátu, aby se odstranily zbytkové funkční skupiny ;

f) izolace konjugovaného produktu.

I. a) Izolace surového pneumokokového polysacharidu Pn-Ps

Pneumokokové kapsulámí polysacharidy se liší chemicky a antigenní reakcí, podle složení 25 a vazby oligosacharidové opakující se jednotky daného kapsulámího polysacharidového sérotypu. Izolace polysacharidů musí probíhat poněkud odlišnými cestami, které závisí na fyzikálních charakteristikách daného polysacharidu. Avšak obecně se bakterie kultivují a Pn-Ps se získává známými způsoby /příklad 3 a Williams, C. A., a Chase, M. W., Metody v imunologii a imunochemii, sv. I, Academie Press (1967)/, zatímco samotné patogeny jsou dostupné od 30 ATCC. Stručně řečeno, po kultivaci bakterií ve velkém měřítku ve vhodném živném médiu, které podporuje růst pneumokoků a je v oboru známé, se do média přidá baktericidní látka, například fenol nebo toluen, aby se mikroorganismy usmrtily (příklad 3).

Dále se provádí frakcionace polysacharidu alkoholem ve dvou stupních. V prvním stupni se 35 použije alkoholu o nízké koncentraci, aby se vysrážely buněčné zbytky a jiné nežádoucí nečistoty, zatímco surový Pn-Ps zůstává v roztoku. Následující přídavek alkoholu mísitelného s vodou na předem stanovenou koncentraci způsobí vysrážení kapsulámích polysacharidů, zatímco přídavné nečistoty zůstanou v supematantu. Po resuspendování polysacharidů ve vodném médiu se odstraní kontaminující proteiny a nukleové kyseliny známým způsobem, jako 40 je například štěpení nukleasami, proteolytické štěpení nebo extrakce rozpouštědlem. Surový polysacharid se získá srážením alkoholem. Po vysušení vznikne prášek surového Pn-Ps (příklad 3).

I. b) Částečná hydrolýza nebo mechanické rozštěpení surového Pn-Ps

Surový polysacharid připravený v podstatě podle postupu popsaného výše v textu (viz také příklad 3, dále) se použije v nekonjugovaném stavu pro vytvoření pneumokokových vakcín. Tyto vakcíny jsou určeny pro dospělé a děti starší dvou let. V následujících stupních postupu se 50 získává nový, částečně hydrolyzovaný, purifíkovaný Pn-Ps produkt, který má jedinečné a definované chemické a fyzikální vlastnosti (viz tabulka II), které jsou užitečné pro přípravu konjugátových vakcín. Zmenšení velikosti surového Pn-Ps přispívá k úspěšnosti následných purifikačních kroků, kterými se získá vysoce vyčištěný Pn-Ps produkt. Kromě toho, při přípravě konjugátů je konjugace účinnější, když se použijí nové Pn-Ps podle tohoto vynálezu. To je

- 15 CZ 283284 B6 způsobeno tím, že vodné roztoky surového polysacharidového materiálu jsou vysoce viskózní, špatně rozpustné akonjugáty zněj vytvořené jsou z velké části nerozpustné a nefiltrovatelné. Provést samotný konjugační proces je obtížné a výsledkem toho je nízký výtěžek konjugátu. Kromě toho se nekonjugovaný Pn-Ps z výsledného konjugátu snáze odstraní, když má Pn-Ps před konjugací menší velikost a viskozitu a lepší rozpustnost. Tento fakt je důležitý, protože přítomnost volných Pn-Ps v konjugátových přípravcích ztěžuje odhad skutečné dávky konjugátu Pn-Ps, který se podává. Protože významný stimulační efekt na T-buňky má právě konjugovaný Pn-Ps, přítomnost nekonjugováného Pn-Ps znamená snížení imunologicky relevantních Pn-Ps.

Vysušený surový kapsulámí polysacharid připravený podle popisu uvedeného výše v textu se může také čistit, například za použití chromatografie na anexech nebo jiné chromatografické techniky, před nebo po částečné hydrolýze, což ukazuje příklad 6 pro Pnl4-Ps. Chromatografický adsorbční-desorbční proces se může použít buď pozitivně, nebo negativně. Při pozitivním způsobu se Pn-Ps adsorbuje na pryskyřici a nečistoty se odstraní v roztoku, kterým se vymývá kolona, před desorbcí Pn-Ps. Při negativním způsobu se nečistoty sorbují na náplň kolony z Pn-Ps roztoku a odstraní se, přičemž Pn-Ps v roztoku odcházejícím z kolony je vyčištěný. Alternativně se Pn-Ps mohou přímo částečně hydrolyzovat tepelně, jak je to ukázáno v příkladu 4 pro Pn6B-Ps, nebo ultrazvukem, což ukazuje příklad 6 pro Pnl4-Ps. Také je možná hydrolýza jinými prostředky, například chemická, enzymatická nebo fyzikální (například ve vysokotlaké cele).

Částečná hydrolýza se doplňuje omezeným zahřátím ve vodném médiu, přednostně na teplotu 50 až 110°C po dobu asi 1 až asi 48 hodin. Alternativním způsobem je omezené působení ultrazvuku o vysoké energii, po dobu 5s až 5 minut, které se opakuje s obdobími chlazení. To se provádí tolikrát, kolikrát je to nutné pro dosažení požadované viskozity nebo konečné hodnoty Kj. Pro polysacharidy s komplexní strukturou (viz dále) je přednostním způsobem hydrolýza ultrazvukem před termální hydrolýzou. Jiné vhodné způsoby s účinkem částečné hydrolýzy polysacharidů známé v tomto oboru se také mohou použít. Tedy také omezené chemické hydrolýzy působením kyseliny, působením endolytického enzymu nebo fyzikálního štěpení v mixeru nebo mlýnku se může použít pro zmenšení průměrné velikosti Pn-Ps řetězce.

Přednostně se na Pn-Ps působí fyzikálním smykem při průchodu homogenizerem při teplotě v rozmezí 0 až 30 °C a tlaku v rozmezí od 13,75 do 103 MPa. Hodnoty teploty a tlaku se předem stanoví tak, aby se získal Pn-Ps produkt s žádanou velikostí molekuly, polydisperzitou a antigenicitou (viz příklad 10).

Cílová konečná hranice hydrolýzy se výhodně zjistí měřením viskozity roztoku nebo vysokoúčinnou chromatografií s rozlišením velikosti molekul (SEC) a předem se stanoví pro každý polysacharid ve zkušebním měřítku tak, aby se antigenicita polysacharidů neztratila. Jak je diskutováno výše v textu, za uspokojivý výsledek se považuje, když nominální vyjádřená schopnost vázat anti-pneumokokovou druhově specifickou protilátku není menší než 70 % hodnoty této schopnosti, kterou vykazuje výchozí surový Pn-Ps materiál při stejné koncentraci. To neznamená, že Pn-Ps s podstatně nižšími hodnotami M_N, Mw nebo počtem opakujících se jednotek na molekulu (tabulka II) se nemohou tímto způsobem vytvořit a že tyto Pn-Ps, které mohou být při nefelometrickém stanovení (viz výše v textu) určeny jako neuspokojivé s ohledem na výše uvedených 70 % hodnoty schopnosti vázat specifickou protilátku, nemohou po konjugaci působit imunogenním způsobem u zvířat. Platí tedy, že navzdory nedostatku žádané schopnosti vázat druhově specifickou anti-Pn-Ps protilátku mohou být Pn-Ps o nízké molekulové hmotnosti v konjugovaném stavu rozpoznány savčím imunitním systémem a může na ně vzniknout dobrá druhově specifická anti-pneumokoková odpověď. V tomto případě by se termín antigenní měl nahradit termínem imunogenní a ten brát jako operativní kriterium pro přijetí nebo odmítnutí daného Pn-Ps preparátu. V praxi je však mnohem výhodnější využívat raději in vitro stanovený parametr antigenicity než in vivo stanovený parametr imunogenicity pro kontrolu procesu.

- 16CZ 283284 B6

Obecně se na většinu polysacharidů dá aplikovat stejný postup pro snížení jejich velikosti. Avšak zatímco Pn6B-Ps si zachovává svou antigenicitu po rozsáhlém snížení velikosti působení tepla. Pn23F-Ps může po tomto zásahu ztratit svou strukturní integritu (odstranění glycerol-fosfátových postranních řetězců). Proto Pn23F-Ps vyžaduje snížení velikosti molekuly za mírnějších podmínek, dosažitelné ultrazvukem nebo štěpením fyzikálními střižnými silami. Použití vlivu fyzikálních střižných sil, například v Gaulinově homogenizátoru, je přednostním způsobem z několika důvodů. Za prvé se tento způsob může převést do většího měřítka. Za druhé způsoby hydrolýzy pomocí ultrazvuku nebo tepla obecně vyžadují následnou frakcionaci hydrolyzovaných Pn-Ps, aby se dosáhlo rozmezí polydisperzity 1,0 až 1,5. Při způsobu s použitím fyzikálních střižných sil se však obecně získá Pn-Ps produkt, jehož polydisperzita spadá do tohoto rozmezí bez další frakcionace, i když frakcionace se může použít, aby se dosáhlo zvýšení čistoty a snížení C-Ps kontaminace, je-li to nutné. Za třetí, způsob využívající fyzikální střižné síly je reprodukovatelnější pro jakýkoliv daný Pn-Ps ve srovnání s termální a ultrazvukovou hydrolýzou. Za čtvrté, způsob využívající fyzikální střižné síly má výhodu vtom, že se jím získávají Pn-Ps produkty, které mají větší antigenicitu než Pn-Ps o stejné velikosti molekuly získané termální nebo ultrazvukovou hydrolýzou.

Viskozita, která je závislá na průměrné molekulové hmotnosti Pn-Ps je vhodným parametrem pro sledování průběhu procesu. Dá se snadno stanovit během hydrolýzy, a tak se může omezit a řídit proces zmenšování velikosti Pn-Ps. Chemicky a fyzikální nerozlišitelné šarže Pn6B-Ps a Pn23FPs se mohou jednoduše připravit zmenšováním velikosti molekul polysacharidů až do dosažení konzistentní cílové konečné viskozity (viz tabulka I, výše v textu). Měření viskozity během procesu se může použít pro širokou skupinu surových polysacharidů, což dovoluje hydrolytické zmenšení jejich velikosti bez změny antigenních vlastností výsledných Pn-Ps. Jak je popsáno výše v textu, zachování antigenních vlastností se snadno stanoví například Ouchterlonyho dvojitou difúzní zkouškou, rychlostní nefelometrií nebo jiným v tomto oboru známým způsobem.

Cílové, konečné hodnoty viskozity pro několik roztokových Pn-Ps preparátů, o koncentraci 1 mg/ml, v 0,9% roztoku chloridu sodného (fyziologický roztok), udává tabulka III, níže v textu. Tyto hodnoty viskozity se mohou obdobně použít pro Pn-Ps, odvozené od jiných pneumokokových poddruhů.

Tabulka III

Viskozita roztoku surového a hydrolyzováného Pn-Ps

Pn-Ps poddruh	Viskozita surového Pn-Ps.l06(m2.s·')	Cílová,konečná viskozita. 106 (m2.s'*)
Pn4-Ps	1,8	1,5 až 1,00
Pn6B-Ps	1,4	1,3 až 1,00
Pn9V-Ps	1,4	1,3 až 1,00
Pnl4-Ps	1,2	1,1 až 0,95
Pnl8C-Ps	2,0	1,5 až 1,00
Pnl9F-Ps	1,4	1,3 až 1,00
Pn24F-Ps	1,6	1,5 až 1,00

V případě některých pneumokokových polysacharidů je výhodné zařadit přídavný purifikační krok, jako je iontová výměna, před nebo po částečné hydrolýze. V případě Pnl4-Ps se tento stupeň provádí adsorpcí nečistot se záporným nábojem na pryskyřici Whatman DE52 před částečnou ultrazvukovou hydrolýzou. Pryskyřice se přidá ve formě vsádky do roztoku. Toto

- 17CZ 283284 B6 čištění se děje při slabě kyselém pH, kdy polysacharid je neutrální. Polysacharid připravený pro hydrolýzu se získá jako supematant.

Hodnota molekulové hmotnosti pro Pn-6B-Ps preparáty je asi 900 kilodaltonů (kD) před a asi 5 300 kD po snížení velikosti a frakcionaci. Pro Pn23F-Ps je to asi 1000 kD nebo více před a asi

400 až 500 kD po této úpravě. Tedy snížení velikosti Pn-Ps na asi 500 ± asi 300 kD je vhodné v této fázi procesu pro všechny Pn-Ps poddruhy.

Opakované vysrážení částečně hydrolyzovaného materiálu alkoholem o předem stanovených io koncentracích umožňuje získat a dále vyčistit částečně hydrolyzovaný Pn-Ps. Tento postup je popsán v pododdíle (c) dále.

I. c) Frakcionace částečně hydrolyzovaného Pn-Ps podle velikosti a čistoty

Polydisperzita Pn-Ps preparátu je nejen ukazatelem neshody v délce řetězce poddruhově specifického Pn-Ps, ale i toho, že v Pn-Ps preparátu mohl zůstat skupinově specifický C-polysacharid nebo jiné kontaminanty. Jak je uvedeno výše v textu, zbytková kontaminace Pn-Ps není užitečná a může dokonce souviset s nepříznivou imunitní odpovědí.

Selekce polysacharidů o úzkém rozpětí velikosti molekul (snížené polydisperzitě) se vhodně provede tak, že se využije rozdílné rozpustnosti různě velkých polysacharidů, po zmenšení velikosti, v alkoholu, přednostně v isopropylalkoholu (IPA). Principem této selekce je skutečnost, že pro daný Pn-Ps preparát je rozpustnost v alkoholu nepřímo úměrná molekulové 25 hmotnosti. Proto se tento způsob může úspěšně použít pro kvantitativní izolaci populací molekul o stejné velikosti, čímž se podstatně zvýší homogenita přípravku ve srovnání s homogenitou výchozího Pn-Ps po snížení velikosti molekuly. Řízení IPA frakcionaci během procesu se provádí na základě předběžného pokusu, při němž se určí koncentrace IPA, nad nimiž se Pn-Ps vysráží. Pro zajištění kvantitativního získání Pn-Ps se frakcionace monitoruje nefelometrickou 30 zkouškou zaměřenou na stanovení protilátky. Pomocí tohoto zlepšeného způsobu se kontaminace

C-polysacharidem, skupinově specifickým polysacharidem, který je společný pro mnoho různých pneumokokových izolátů, sníží troj- až dvacetinásobně ve srovnání s hladinou kontaminace, nalezenou u surových Pn-Ps preparátů. Kromě toho se polydisperzita molekulové hmotnosti PnPs preparátů zároveň sníží na rozsah 1,0 až 1,4.

Místo IPA frakcionace Pn-Ps o snížené velikosti se může použití SEC chromatografie vodného roztoku Pn-Ps o snížené velikosti na vhodné pryskyřici, například na CL-2B pryskyřici nebo jiné pryskyřici, která umožňuje frakcionovat polysacharidy o molekulové hmotnosti ležící v rozmezí 200 až 1000 kD. HPSEC s použitím rigidní matrice se schopností rozlišit molekuly podle 40 velikosti je vhodná s ohledem na snížení doby zdržení a zvýšení rozlišení. Výběrem frakcí eluovaných z kolony podle předem určené viskozity, retenčního času nebo podle on-line detekce, se získá populace Pn-Ps molekul s požadovanou velikostí, viskozitou a čistotou, jak je uvedeno výše v textu.

Pn-Ps preparáty podrobené těmto přídavným krokům (IPA frakcionaci nebo chromatografické frakcionaci) se chovají konzistentněji během chemického blokování, a proto se s jejich použitím vyrobí konjugáty s reprodukovatelnými parametry. Také se dosáhne významného zvýšení čistoty Pn-Ps, zejména koncentrace C-polysacharidu se výrazně sníží.

Výše uvedené manipulace a měření se projeví vtom, že získané Pn-Ps meziprodukty mají přednostní parametry, které jsou souhrnně uvedeny v tabulce II shora v textu.

- 18CZ 283284 B6

II. a) Funkcionalizace frakcionovaných Pn-Ps za účelem vytvoření elektrofilně nebo nukleofílně reaktivních Pn-Ps , přednostně takových, které mají 10 až 40 reaktivních bromacetylových skupin na 100 Pn-Ps monomemích jednotek

Pn-Ps, připravený podle postupu z oddílu lc, je dostatečně homogenní a má takové vlastnosti, jako je zvýšená rozpustnost a snížená viskozita, které způsobují, že je vhodný pro konjugaci. Odborníci v tomto oboru mohou použít mnoho různých postupů pro přípravu konjugátů polysacharidů s jinými zbytky. Zde popsaný způsob je pouze jednou možnou cestou jak použít nových částečně hydrolyzovaných a frakcionovaných Pn-Ps meziproduktů podle vynálezu pro vytvoření konjugátů. Tento způsob by se neměl považovat za jediný způsob použití Pn-Ps meziproduktů.

Metoda, využívající dvoj vazného mezemíku, kterou popsal Marburg, S. a další /americký patent č. 4 695 624; J. Am. Chem. Soc. 108, 5282 (1986)/, je přednostní metodou konjugace frakcionovaných Pn-Ps o snížené velikosti molekuly s imunogenním proteinem. Pn-Ps se funkcionalizuje, aby měl elektrofilní nebo nukleofilní skupiny. Vzniklý Pn-Ps je potom schopen reakce s opačně fiinkcionalizovaným proteinem PRO . Postup podle tohoto vynálezu také zahrnuje výběr nukleofilu nebo binukleofilu, který reaguje s aktivovaným polysacharidem za vzniku kovalentně modifikovaného polysacharidů s vyčnívajícími elektrofilními skupinami nebo vyčnívajícími thiolovými skupinami. Tím se odstraní potřeba dále funkcionalizovat polysacharid, modifikovaný binukleofilem, před reakcí kovalentně modifikovaného polysacharidů s kovalentně modifikovaným proteinem. Také funkcionalizace proteinu za účelem vytvoření obou druhů PRO (s elektrofilními i nukleofilními skupinami) se může provádět ve více než jednom kroku podle výběru reaktantů v těchto krocích.

Ať je požadovaný Pn-Ps* jakkoliv funkcionalizován, frakcionovaný Pn-Ps o zmenšené velikosti molekuly se musí nejprve rozpustit v rozpouštědle, které neinterferuje s íunkcionalizačním procesem. Protože pro funkcionalizaci jsou nejvhodnější hydroxylové skupiny Pn-Ps, je kritickým místem funkcionalizace vyjmutí Pn-Ps z vody pro zahájení funkcionalizace. Náhradou kyselých vodíkových atomů Pn-Ps za hydrofobní kationty, jako jsou ionty tetra- nebo tributylammonia se Pn-Ps stane rozpustným v nevodných rozpouštědlech, jako je DMSO nebo DMF. Přirozeně není potřeba provádět tuto náhradu u Pn-Ps, které jsou neutrální (například Pnl4-Ps nebo Pn7F-Ps). V nevodném roztoku může Pn-Ps reagovat s bielektrofilem jako je karbonyldiimidazol a vytvořit tak imidazoyldiuretan. Počet funkčních skupin na 100 Pn-Ps monomemích jednotek se řídí v tomto okamžiku přídavkem omezeného množství reakčního činidla, karbonyldiimidazolu. Ve srovnání s celkovým množstvím Pn-Ps monomerů se přidá asi pětina molámího množství tohoto činidla, takže v průměru jenom asi 10 až 40 ze 100 Pn-Ps monomemích jednotek se derivatizuje. Vzniklý produkt je vhodný pro nukleofilní substituci buď reagentem, jako je

1) cystamindihydrochlorid, čímž vzniknou nukleofilní Pn-Ps* deriváty nebo

2) 1,4-butandiamin, čímž vzniknou elektrofilní Pn-Ps* deriváty, jak je popsáno v americkém patentu č. 4 695 624 a jak popisuje Marburg a další, J. Am. Chem. Soc, 108, 5282(1986).

Nedávno se zjistilo, že některé kyselé pneumokokové polysacharidy, jako jsou Pn9V-Ps, Pn4Ps, Pnl-Ps, Pn5-Ps aNeisseria meningitidis B nebo C-polysacharidy obsahují volné kyselé karboxylové skupiny, stejně jako volné hydroxylové skupiny. Konjugační chemie těchto polysacharidů je trochu jiná ve srovnání s neutrálními polysacharidy nebo s polysacharidy, které mají záporný náboj vzhledem k přítomnosti fosfodiesterových vazeb, jako v polyribosylribitolfosfátu. Obecně konjugační chemie polysacharidů neobsahujících karboxylátové skupiny spočívá v konverzi volných hydroxylových skupin polysacharidů na urethanové vazby, tj. z Pn

- 19CZ 283284 B6

Ps-OH na Pn-Ps-O-C(=O) -N(H) -R^a, kde symbol R^a představuje zbytek řetězce vážícího polysacharid s proteinem. Avšak v případě, polysacharidů obsahujících karboxyskuipny, jako je Pn9V-Ps, který obsahuje glukoronátové skupiny nebo Pn4-Ps, který obsahuje pyruvátové skupiny, probíhá konverze z Pn-Ps-C(=O) -OH na Pn-Ps-C(=O) -N(H) -R^a, přičemž symbol R^a opět představuje zbytek řetězce vážícího polysacharid s proteinem. Proto se ukazuje, že esterová skupina urethanu se buď v polysacharidů, obsahujícím karboxylovou skupinu, neutvoří, nebo se kromě ní vytvoří na místech s karboxylovými skupinami jednoduché amidové vazby. Konjugace probíhá rychleji v přítomnosti karboxylových skupin.

Protože karboxylové skupiny pravděpodobně významně přispívají kantigenním aimunogenním vlastnostem této třídy aniontových polysacharidů, musí se konjugace těchto polysacharidů opatrně řídit. Požadavek vysokého poměru polysacharidových molekul ku proteinovým molekulám ve výsledném konjugátu musí být v rovnováze s požadavkem na zachování antigenní integrity. Toho se dosáhne omezením počáteční aktivace zprostředkované karbonyldiimidazolem. Když již vznikne amid, může v dalším kroku reagovat cystamindihydrochlorid nebo 1,4-butandiamin, jak je popsáno výše v textu a rozebráno dále.

Alternativně se karboxylové skupiny mohou reverzibilně chránit a potom zbavit ochranných skupin. Jako chránící skupiny se používají trimethylsilylskupiny nebo podobné chránící skupiny, které se mohou odstranit v mírně alkalickém prostředí, nebo 2,4-dimethoxybenzylesterové skupiny, které jsou nestabilní v kyselém prostředí. V tomto případě probíhá konjugace obvyklým způsobem přes hydroxylové skupiny polysacharidů.

1. Příprava nukleofilního Pn-Ps*

Frakcionovaný Pn-Ps o snížené velikosti molekuly a aktivovaný karbonylidimidazolem, získaný jak je popsáno výše, se může nechat reagovat ve vodných nebo jiných rozpouštědlech s reagenty popsanými v americkém patentu č. 4 695 624. Přednostním reagentem je cystamindihydrochlorid. Následným odstraněním přebytku cystaminu a redukcí pomocí dithiothreitolu nebo dithioerythreitolu se získá nukleofilní Pn-Ps funkcionalizovaný sulfhydrylovými skupinami. Tento Pn-Ps* derivát je schopný reagovat s elektrofilním PRO*, například proteinem modifikovaným tak, že má vyčnívající bromacetylové skupiny.

2. Příprava elektrofilního Pn-Ps

Frakcionovaný Pn-Ps o snížené velikosti molekuly a aktivovaný karbonylidimidazolem, získaný jak je popsáno výše, se může nechat reagovat ve vodných nebo jiných rozpouštědlech s reagenty popsanými v americkém patentu č. 4 695 624. Přednostním reagentem je 1,4-butandiamin (BuA₂). Následnou acylací Pn-Ps-BuA₂ p-nitrofenylbromacetátem nebo podobným reagentem se vytvoří elektrofilní Pn-Ps-BuA₂-BrAc derivát schopný reagovat s nuklefilním PRO , jako je protein modifikovaný sulfhydrylovými skupinami. Stupeň derivatizace se měří pomocí NMR srovnáním integrálního signálu 1,4-butandiaminu s vhodným signálem z monosacharidu, například se signálem methylskupiny z rhamnosy. Přednostní stupeň derivatizace leží mezi 10 a 40 %, nejlépe okolo 20 %.

II. b) Izolace imunogenního proteinu (PRO), přednostně OMPC nebo jeho podjednotky z Neisseria meningitidis B

Protein by měl zesilovat imunitní odpověď. Je žádoucí se při výběru proteinu vyhnout proteinům, které způsobují nespecifickou aktivaci imunitní odpovědi příjemce (reaktogenicitu). Použití proteinového komplexu z vnější stěny (OMPC) Neisseria meningitidis pro přípravu konjugátů polysacharid-protein je popsáno v americkém patentu č. 4 695 624 (Marburg a další).

-20CZ 283284 B6

Pro tento vynález se ukázalo použití OMPC jako vhodné, ale mohou se použít i jiné imunogenní proteiny, jako je tetanový nebo záškrtový toxoid nebo pertussinogen.

Byly již navrženy různé způsoby purifikace OMPC z gram-negativních bakterií /Frasch a další, J. Exp. Med. 140, 87 (1974); Frasch a další, J. Exp. Med. 147, 629 (1978); Zollinger a další, americký patent č. 4 707 543 (1978); Helting a další, Acta Path. Microbiol. Scand, oddíl C 89, 69 (1981); Helting a další, americký patent č. 4 271 147/. Přípravu zde použitého OMPC popisuje příklad 1 Přednostní je také použití proteinové podjednotky, izolované s použitím disociace OMPC nebo rekombinantní expresí materiálu, který kóduje OMPC konstitutivní protein, zvláště hlavní membránový protein (také uváděný jako mitózu indukující protein MIP nebo jako hlavní imunitní odpověď zvyšující protein MIEP). Způsob získávání podjednotkových proteinů se popisuje v příkladu 2 a v amerických patentových přihláškách pořadových čísel 555 978, 555 329, 555 204 podaných 19. ledna 1990 a 639 457 podané 10. ledna 1991.

II. c) Funkcionalizace PRO za účelem vytvoření nukleofilně nebo elektrofilně reaktivních PRO*, přednostně funkcionalizace OMPC nebo jeho podjednotky zavedením reaktivních sulfhydrylových skupin

PRO, izolovaný jak je popsáno v oddílu lib) výše v textu, se funkcionalizuje tak, aby měl buď elektrofilní, nebo nukleofílní skupiny. Výsledný PRO je potom schopen reagovat s opačně funkcionalizovaným Pn-Ps*, jehož příprava je popsána v oddílu Ha) výše v textu.

1. Tvorba elektrofilních PRO* derivátů

Izolovaný PRO, například OMPC z Neisseria nebo MIEP z OMPC se přednostně nechá reagovat s reagentem, jako je p-nitrofenylester kyseliny N-(bromacetyl)-6-aminokapronové, který je schopný reagovat s ε-aminoskupinami lysinu v PRO. Výsledný bromacetylovaný PRO je schopen reagovat s nukleofilními deriváty Pn-Ps , připravenými podle odstavce Ha) 1. výše.

2. Tvorba nukleofilních PRO* derivátů

Izolovaný PRO, například OMPC z Neisseria nebo MIEP se nechá* reagovat s reagentem, jako je N-acetylhomocysteinthiolakton, čímž vznikne sulfhydrylový derivát proteinu. Tento nukleofilní derivát je schopen reagovat s elektrofilním Pn-Ps připraveným podle odstavce Ha) 2. výše. Typickým výsledkem pro tuto fázi procesuje koncentrace sulfhydrylových skupin pohybující se v rozmezí 0,1 až 0,3 pmol/mg proteinu.

II. d) Konjugace polysacharidů (Pn-Ps*) podle bodu Ha) s proteinem (PRO*) podle bodu líc)

Po utvoření reaktivních látek Pn-Ps* a PRO* podle bodu Ha) a líc) výše, se opačně aktivovaní reakční partneři přivedou do kontaktu v hmotnostním poměru přibližně 1:1. Reakční směs se může odvzdušnit dusíkem, uzavřít a nechat reagovat čtyři dny při teplotě 17 °C až 40 °C. Jako příklady probíhajících reakcí, při nichž vznikne konjugát, je možno uvést reakci

OH O NHCOCH3

III II I

Pn-Ps-CNCH₂CH₂CH₂CH₂NHCCH₂Br + HSCH₂CH₂CHCO-PRO

OH O NHCOCH3

II I II I

Pn-PsCNCH₂CH₂CH₂CH₂NHCCH₂SCH₂CH₂CHCOPRO,

-21 CZ 283284 B6 při níž se aktivovaný polysacharid, který byl předem zreagován s 4-bromacetamidobutylaminem, nechá reagovat s proteinem, který byl předem zreagován s N-acetylhomocysteinthiolaktonem a reakci

O

OH HO

III III Pn-Ps-CNY’_NCCH₂N

O

OO

IIII ⁺ HSCH₂CH₂NHCCH₂CH₂C-PRO

oo

IIII ch₂ch₂nhcch₂ch₂c- pro (kde symbol Y označuje alkylový zbytek se dvěma až osmi atomy uhlíku), při níž se aminoderivatizovaný polysacharid, který byl zreagován s aktivovanou maleinimidovou kyselinou, nechá reagovat s karboxy-aktivovaným proteinem, do kterého byla zavedena aminoskupina pomocí aminothiolu.

Podobně jakýkoliv zkovalentně modifikovaných polysacharidů s vyčnívajícími thiolovými skupinami se může nechat zreagovat s bakteriálním proteinem OMPC nebo MIEP, který má vyčnívající elektrofilní skupiny, za vzniku kovalentního konjugátu. Příkladem takové reakce je

O O O H

II II II I

Pn-Ps-CNHCH₂CH₂SH + PRO-CCH₂CH₂C-N(CH₂)₄NHCOCH₂Br

Pn- PsCNCH₂CH₂SCH₂CN(CH₂)₄ NHCCH₂CH₂C- P RO, při níž se aktivovaný polysacharid, který je modifikován aminothiolem, nechá reagovat s karboxy-aktivovaným proteinem, který byl modifikován monohalogenacetylovými deriváty diaminu. Přednostním vazebným seskupením podle tohoto vynálezu je mezemík, jehož složení je zřejmé ze vzorce

PRO-N-COCHCH₂CH₂SCH₂CONH(CH₂)₄ NHC-O- PnPs

H NHCOCH3 O v případě vazeb zprostředkovaných hydroxylovými skupinami polysacharidu, nebo

-22CZ 283284 B6

PRO-N-COCHCH2CH2SCH₂CONH(CH₂)4 NHC-PnPs,

H NHCOCH3 O v případě polysacharidů s karboxylovými skupinami.

Je-li potřeba eliminovat elektrofilní aktivitu přebytku halogenacetylových skupin, nechá re konjugát reagovat s thiolem o nízké molekulové hmotnosti, jako je N-acetylcysteamin. Použití N-acetylcysteaminu také umožňuje potvrzení počtu využitých halogenacetylových skupin, protože vytvořený S-karboxymethylcysteamin se může jednoznačně detegovat způsobem podle Spackmana. Moora a Steina.

II. e) Blokování Pn-Ps-PRO konjugátu za účelem odstranění zbytkových funkčních skupin

Zbytkové elektrofilní skupiny konjugátu, buď na PRO* nebo na Pn-Ps* se na konci reakce nechají zreagovat s nukleofilem o nízké molekulové hmotnosti, který se přidá ve dvoj- až desetinásobném molámím přebytku. Jako nukleofilu je například možno použít N-ethylmaleinimidu (NEM) pro blokování zbytkových volných sulfhydrylových skupin. Pro blokování zbytkových bromacetylových skupin se může použít elektrofilu, například N-acetylcysteaminu.

II. f) Izolace konjugátového produktu

Blokovaný konjugátový produkt se oddělí od nekonjugováného PRO, Pn-Ps ajiných reaktantů ultracentrifugací nebo diafiltrací. Konjugátová peleta se resuspenduje ve vodné pufrovací lázni, která může obsahovat detergent, jako je 0,5% roztok deoxychinolinu a sůl, jako je 0,1 M Tris o pH 7 až 9 a asi 10 nM EDTA. Takto se odstraní zbytkové pyrogeny. Směs se nechá stát 1 až 25 hodin při laboratorní teplotě. Konjugát se opět nechá utvořit peletu, resuspenduje se ve vodném pufru bez detergentu a potom se z něj opět vytvoří peleta ultracentrifugací při 100 000 g s použitím odstředivky s rotorem nastaveným v pevném úhlu. Odstřeďuje se 2 hodiny při teplotě 1 až 20 °C. Konjugát se také alternativně může čistit jakýmkoliv jiným purifikačním postupem, například gelovou filtrací, iontově výměnnou chromatografií, gradientovou centrifurací nebo jinou diferenčně adsorpční chromatografií, aby se odstranily nekovalentně vázané proteiny a polysacharidy. Přitom se pro sledování požadované biologické aktivity použijí in vitro metody, jako je stanovení Ps, PRO a rychlostní nefelometrické stanovení a také zkouška kovalentnosti pro dvojvazný mezemík (viz dále).

Další separace reakčních složek se může provádět pomocí chromatografie s rozlišením velikosti molekul v koloně, nebo v případě velmi velkých, nerozpustných proteinů se může separace provádět pomocí ultracentrifugace. Resuspendování konjugátu ve sterilní vodě a stárnutí po dobu 1 dne při teplotě 4 °C umožní kompletní solubilizaci. Následuje centrifugace při nízké rychlosti pro odstranění nerozpustných částic. Supematant obsahuje konečný produkt, který se může sterilně přefiltrovat a dále se z něj mohou vytvořit vakcínové přípravky s imunologicky účinnou úrovní dávky. Vakcíny se sterilně plní do lahví.

Analýza konjugátu pro potvrzení kovaletnosti a tudíž stability konjugátu se provádí hydrolýzou konjugátu (přednostně pomocí HC1 o koncentraci 6 M, při 110°C, 20 hodin) a kvantitativním stanovením jedinečné aminokyseliny hydrolyticky stabilního mezerníku, obsahujícího thioetherovou vazbu a stanovením stavebních aminokyselin proteinu. Je-li to nutné, může se příspěvek aminokyselin pocházejících z proteinu odečíst od celkového množství aminokyselin srovnáním s vhodným aminokyselinovým standardem pro daný protein. Počet zbývajících aminokyselin odráží kovalentnost konjugátu. Alternativně se může aminokyselina v mezerníku navrhnout tak, aby její stanovení probíhalo mimo analýzu aminokyselin proteinového standardu.

-23 CZ 283284 B6

Stanovení kovalentnosti je také užitečné pro sledování purifikačních postupů a pro zjištění zvýšení koncentrace biologicky aktivních složek. V předchozích příkladech vede hydrolýza produktu vzorce

OH O NHCOCH3

111 II I

PsCNCH₂CH₂CH₂CH₂NHCCH₂SCH₂CH₂CHCOPRO k uvolnění S-karboxymethylhomocesteinu vzorce

HO2CCH₂SCH₂CH₂CHCO₂H

Hydrolýza produktu vzorce

O O

II II ch₂ch₂nhcch₂ch₂c- pro vede k uvolnění aminodikarboxylové kyseliny vzorce

HO2CCH2CHSCH2CH2NH2

HO₂C

Hydrolýza produktu vzorce

OH OH O O

III III II II

PsCHCH₂CH₂SCH₂CN(CH₂)₄NHCCH₂CH₂CPR0 vede k uvolnění S-karboxymethylcysteaminu vzorce

H2NCH2CH₂SCH₂CO₂H.

Přitom dochází ke štěpení Ps-A-E-S-B-PRO molekuly vpeptidových vazbách a v jiných hydrolyticky nestabilních vazbách. Poměr aminokyselinových stavebních složek se může výhodně stanovit chromatograficky, například metodou podle Spackmana. Moora a Steina.

Optimální produkce IgG protilátky vyžaduje spolupráci B aT lymfocytů se specifitou pro daný antigen. T lymfocyty jsou neschopné rozpoznat polysacharidy, ale mohou pomoci pro odpovědi anti-polysacharidové IgG protilátky, jestliže je polysacharid kovalentně vázán na protein, který je T buňka schopna rozpoznat.

-24CZ 283284 B6

C. Tvorba vakcín ajejich použití

Přednostně se konjugační produkt adsorbuje na gel hydroxidu hlinitého. To se provede například tak, že se připraví zásobní roztok konjugátu o koncentraci Pn-Ps 20 pg/ml. Z tohoto roztoku se připraví podíly, zředěné sterilní vodou v poměru 1 : 1, 1 : 5 a 1 : 10. Část těchto vzorků a část zásobního roztoku o koncentraci 20 pg/ml se zředí v poměru 1 : 1 ředidlem, tj. hydroxidem hlinitým, který obsahuje 0,85 mg/ml Al³⁺, 17 g/1 NaCl a 100 pg/ml thimerosolu. Hodnota pH roztoku se upraví na asi 7,5 roztokem NaOH o koncentraci 1 mol/1. Tím se získají roztoky o koncentracích Pn-Ps 10, 5, 2 a 1 pg/ml. Dávky o objemu 0,1 až 0,75 ml každého z těchto přípravků jsou vhodné pro podávání příjemcům různého věku a hmotnosti. Zjistilo se, že takto vytvořené vakcíny významně zvyšují imunitní odpověď poddruhově specifického antipneumokokového polysacharidu u mláďat opic starých dva až tři měsíce pro Pn6B-Ps-OMPC, Pnl4-PsOMPC, Pnl9F-Ps-OMPC a Pn23F-Ps-OMPC. Pn-Ps-OMPC konjugátová vakcína je, jak bylo zjištěno, kromě toho také závislá na T-buňkách athymických myší.

Z tohoto popisu by mělo být zřejmé, že jiné polysacharidy s vlastnostmi zde definovanými a způsoby výroby těchto Ps s těmito vlastnostmi, se mohou úspěšně použít pro přípravu jiných konjugátů, které neobsahují částečně hydrolyzované a frakcionované pneumokokové polysacharidy. Tyto konjugáty mohou sloužit pro prevenci nemocí, způsobených jinými patogenními mikroorganismy. Jako zdroj polysacharidů se například může použít skupina B streptokoků, která způsobuje neonatální meningitis, Neisseria meningitidis B nebo C, příčina infantilní meningitis nebo E. coli, důležitá příčina infekcí močových cest nebo jiných podobných infekcí. Tyto polysacharidy, stejně jako zmíněné Pn-Ps ajejich kovalentní konjugáty mohou také poskytnout důležité složky pro kombinované vakcínové přípravky. Takové kombinované přípravky mohou například obsahovat imunologicky účinné množství adjuvans, jako je Freundsovo nebo Ribiho adjuvans nebo imunomodulačních sloučenin, jako jsou interleukiny, interferony (viz například seznam sloučenin v Markét Letter, 30.1istp. 1987, str. 26 až 27; Genetic Engineering News, leden 1988, sv. 8, str. 23) nebo přídavných imunogenů. Přednostně přípravek obsahující imunologicky účinné množství konjugátu podle vynálezu obsahuje také jednu nebo více vakcín proti hepatitis B, hepatitis A, non-A non-B hepatitis. AIDS, záškrtu, pertussis, tetanu, spalničkám, příušnicím, rubella, varicella, dětské obrně nebo Haemophilus influenzae b. Přednostní přídavné vakcíny právě uvedeného typu jsou vakcíny PevaxHIB^(R) , Recombivax HB^(R), M-M-R^<R) a trivalentní DTP vakcína.

Následující příklady jsou uvedeny pro další objasnění vynálezu a nejsou míněny jako omezení tohoto vynálezu. Procentické údaje jsou hmotnostní, u plynů se jedná o procenta objemová.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příprava OMPC z Neisseria meningitidis B11 serotyp 2

A. Fermentace

1. Neisseria meningitidis skupina Β11

Zkumavka s lyofilizovanou kulturou Neisseria meningitidis (získanou od Dr. M. Artensteina, Walter Reed Army Instituce of Research (WRAIR), Washington. D. C.) se otevře a přidá se do

-25CZ 283284 B6 ní Eugonbronthovo (BBL) médium. Kultura se čárkováním naočkuje na šikmé agary s Mueller

Hinton médiem. Inkubace probíhá 36 hodin při 37 °C v atmosféře s 5 % CO₂. Po této době se nárůst sklidí do 10% roztoku média z odstředěného mléka (Difco). Alikvotní podíly se zmrazí při teplotě -70 °C. Identita mikroorganismu se potvrdí aglutinací se specifickým antisérem (dodavatel WRAIR) a typovacím sérem (Difco).

Nádobka s kulturou z tohoto druhého pasážování se rozmrazí a čárkováním naočkuje na 10 misek s ovčím krevním agarem (CBAB-BBL). Misky se inkubují 18 hodin při 37 °C v atmosféře s 5 % CO₂. Po této době se nárůst sklidí do 100 ml 10% roztoku mléčného média. Odeberou se alikvotní podíly o objemu 0,5 ml a zmrazí se při -70 °C. Mikroorganismus se pozitivně identifikuje aglutinací se specifickým antisérem, fermentací cukrů a Gramovým barvením.

Nádobka s kulturou z tohoto pasážování se rozmrazí, zředí médiem Mueller-Hinton a čárkováním naočkuje na 40 misek s Mueller-Hintonovým agarem. Misky se inkubují 18 hodin při 37 °C v atmosféře s 6 % CO₂. Po této době se nárůst sklidí do 17 ml 10% roztoku mléčného média. Alikvotní podíly o objemu 0,3 ml se zmrazí při -70 °C. Mikroorganismus se pozitivně identifikuje barvením podle Grama, aglutinací se specifickým antisérem a oxidasovým textem.

2. Fermentace a vytvoření buněčné pasty

a) Vývoj inokula

Inokulum se napěstuje z obsahu jedné ze zmrazených nádobek s kulturou Neisseria meningitidis skupina B, B-ll (4. pasážováním, viz výše). Zaočkuje se 10 šikmých agarů s půdou podle Muellera-Hintona. Šest z těchto agarů se přibližně o 18 hodin později sklidí a použijí se jako inokulum pro 3 baňky o objemu 250 ml s kvasničným dialyzovaným médiem podle Gotschlicha o pH 6,35. Optická hustota při vlnové délce 660 nm (OD₆₆o) se upraví na hodnotu 0,18. Baňky se inkubují, dokud hodnota OD₆6o není mezi 1,0 až 1,8. Jeden ml této kultury se použije jako inokulum pro každou z pěti Erlenmeyerových baněk o objemu 2 1 (každá baňka obsahuje 1 litr média, viz dále). Tyto baňky se inkubují na třepačce při otáčkách 200 min’¹ při 37 °C. Hodnota OD se stanovuje v hodinových intervalech od očkování. Získají se 4 litry kultivačního média o OD₆₆₀ 1,28.

Seed fermentor o objemu 70 litrů

Pro inkubaci sterilního sedmdesátilitrového fermentoru obsahujícího asi 40 litrů kompletního produkčního média (viz dále) se použijí přibližně 4 litry seed kultury. Kultivační podmínky v tomto fermentoru jsou: teplota 37 °C, otáčky 185 min’¹, průtok vzduchu 10 litrů/min a udržování pH na hodnotě 7,0 po dobu dvou hodin. Za dvě hodiny je konečná hodnota optické hustoty vsádky OD₆6o = 0,732.

Produkční fermentor o objemu 800 litrů

Pro inokulaci sterilního fermentoru o objemu 800 litrů obsahujícího 568,2 litru kompletního produkčního média (viz dále) se použije přibližně 40 litrů seed kultury. Vsádka se inkubuje při teplotě 37 °C, otáčkách 100 min'¹, průtoku vzduchu 60 litrů/min a při regulaci hodnoty pH na 7,0. Pro tuto vsádku je výsledná hodnota OD660 po 13 hodinách od inokulace 5,58.

-26CZ 283284 B6

3. Kompletní médium pro Erlenmeyerovy baňky a fermentory o objemu 70 a 800 litrů

Frakce A:

L-glutamová kyselina

NaCl

Na₂HPO₄.bezvodý

NH4CI

KC1

L-cystein HC1 (g/D

1.5

6,0

2.5

1,25

0,09

0,02

Frakce B (kvasničný dialyzát podle Gotschlicha)

1280 g kvasničného extraktu Difco se rozpustí v 6,4 litru destilované vody. Roztok se dialyzuje ve dvou dialyzačních jednotkách s dutými vlákny Amicon DC-30 se třemi zásobníky H10SM. 384 g MgSO₄, 7-H₂O a 3200 g dextrosy se rozpustí v dialyzátu a doplní destilovanou vodou na objem 15 litrů. Hodnota pH se upraví pomocí roztoku NaOH na 7,4 a médium se sterilizuje filtrací přes filtr o průměru otvorů 0,22 mikrometrů se médium převede do fermentoru obsahujícího frakci A.

Pro Erlenmeyerovy baňky: 1 litr frakce A a 25 ml frakce B, pH se upraví roztokem NaOH na 7,0 až 7,2.

Pro fermentor o objemu 70 litrů: 41,8 litru frakce A a 900 ml frakce B, pH se upraví roztokem NaOH na 7,0 až 7,2.

Pro fermentor o objemu 800 litrů: 553 litrů frakce A a 15 litrů frakce B, pH se upraví roztokem NaOH na 7,1 až 7,2.

b) Sklizení buněk a inaktivace

Po skončení fermentace se buňky převedou do zvláštní nádoby s fenolem. Výsledná koncentrace fenolu je 0,5 %. Nádoba se nechá při mírném míchání při laboratorní teplotě dokud se kultura neusmrtí (asi 24 hodin).

c) Centrifugace

Po 24 hodinách při teplotě 4 °C se 614,4 litru inaktivované kultivační kapaliny odstředí na kontinuálních průtokových odstředivkách Sharples. Hmotnost konečné pasty po působení fenolu činí 3,875 kg. Alternativně se fenolem usmrcené buňky z fermentačního média získají diafiltrací, jak je to popsáno dále.

B. Izolace OMPC

Krok 1. Koncentrace a diafiltrace

Fenolem inaktivovaná kultura se zkoncentruje na asi 30 litrů a diafiltruje ve sterilní destilované vodě s použitím filtrů ve tvaru dutých vláken o průměru 0,2 pm (ENKA).

-27CZ 283284 B6

Krok 2. Extrakce

Ke zkoncentrovaným diafiltrovaným buňkám se přidá stejný objem 2X TED pufru /0,1 TRIS 0,01 M EDTA pufr, pH 8,5 s 0,5% roztokem deoxycholátu sodného/. Suspenze se převede do nádrže s regulovanou teplotou pro extrakci OMPC při teplotě 56 °C, za míchání, 30 minut.

Extrakt se odstředí v odstředivce s kontinuálním průtokem Sharples při otáčkách 18 000 min'¹, rychlosti průtoku 80 ml/min, při teplotě 4 °C. Potom se shromáždí viskózní supematant a skladuje se při 4 °C. Extrahované buněčné pelety se znovu extrahují v TED pufru, jak je to popsáno výše. Kapalina supematantů se spojí a skladuje při 4 °C.

Krok 3. Koncentrace ultrafiltrací

Spojený extrakt se převede do nádoby s regulovanou teplotou, připojenou k polysulfonovým filtrům o průměrů pórů 0,1 pm, AG-Tech. Teplota extraktu během koncentračního procesu se udržuje na 25 °C. Vzorek se desetkrát zkoncentruje při průměrném tlaku na membránu 75, 57 až 165 kPa.

Krok 4. Shromáždění a promytí OMPC

Retentát z kroku 3 se odstředí v kontinuální průtokové odstředivce při 160 000 g (otáčky 35 000 min'¹), teplotě 37 °C, rychlosti průtoku 300 až 500 ml/min. Supematant se zahodí.

OMPC peleta se suspenduje v TED pufru (190 ml pufru, 20 ml/g pelety) a kroky 2 a 4 se dvakrát opakují (krok 3 se přeskočí).

Krok 5. Získání OMPC produktu

Promyté pelety z kroku 4 se suspendují ve 100 ml destilované vody skleněnou tyčinkou a homogenizerem Dounce, čímž se zajistí úplné suspendování. Vodná suspenze OMPC se potom sterilizuje filtrací přes filtr o průměru pórů 0,22/μιη. TED pufr se nahradí vodou při diafiltraci proti sterilní destilované vodě s použitím filtru s dutými vlákny o průměru pórů 0,l/pm.

Příklad 2

Purifíkace podjednotky OMPC

Příprava purifikované MIEP z OMPC nebo z rekombinantních buněk pomocí elektroforézy na svislém polyakrylamidovém gelu

Použijí se gely o složení akrylamid/BIS (37,5 : 1), o rozměrech 18 x 14 cm, 3 mm tlusté. Koncentrace polyakrylamidu ve svislém gelu je 4 %, v separačním gelu 12 %. Na gel se nanese přibližně 5 pg OMPC proteinu nebo proteinu z rekombinantní hostitelské buňky. K 1 ml OMPC se přidá 0,5 ml pufru pro vzorek (pufr obsahuje 4 % glycerolu, 300 mM DTT, 100 mM TRIS, 0,001 % bromfenolové modři, pH 7,0). Před nanesením na gel se směs zahřívá 20 minut při teplotě 105 °C a nechá se ochladit na laboratorní teplotu. Elektroforéza probíhá při 200 až 400 mA, za chlazení, dokud se bromfenolová modř nedostane na spodek gelu. Z gelu se vyřízne vertikální proužek (asi 1 až 2 cm široký) a obarví se roztokem Coomassie o koncentraci 0,1 % v acetátu měďnatém. Proužek se odbarvuje dokud se pás MIEP (okolo 38 kDa) nestane viditelným. Proužek se potom umístí na své původní místo do gelu a oblast s MIEP se ze zbývajícího gelu vyřízne skalpelem.

-28CZ 283284 B6

Vyříznutá část se nakrájí na kostky (délka hrany 5 mm) a eluuje se 0,01 M Tris-pufrem o pH 8,1. Po dvou elučních cyklech se hodnotí čistota eluátu pomocí SDS-PAGE. Eluáty se spojí a dialyzují 48 hodin proti roztoku amoniaku v kyselině mravenčí o koncentraci 60 mM, o pH 10. Alternativně se eluovaný protein může dialyzovat proti roztoku kyseliny octové ve vodě o koncentraci 50 %. Po dialýze se eluovaný protein odpaří do sucha. Tento materiál se dále čistí průchodem kolonou PD10 (Pharmacia. Piscataway. NJ) schopnou rozlišit velikosti molekul a skladuje se při laboratorní teplotě.

Příklad 3

Kultivace poddruhů Streptococcus pneumoniae a izolace surových Pn-Ps

I. Kultivace pneumokoků

Způsoby kultivace pneumokoků jsou v tomto oboru dobře známé /Chase, M. W., Methods of Immunology and Immunochemistry 1, 52 (1967)/. Izoláty poddruhů pneumokoků jsou dostupné od ATCC. Bakterie jsou identifikovány jako opouzdřené, nepohyblivé, gram-pozitivní, diplokoky tvaru lancety, které jsou alfa-hemolytické na krevním agaru. Poddruhy se diferencují na základě Quellingovy reakce s použitím specifického antiséra. Produkční a zásobní seed kultury se uchovávají přednostně lyofilizované nebo při teplotě nižší než 8 °C. Při přednostních způsobech kultivace se zásobní kultury oživují v srdečním infusním médiu (Heart Infusion Broth), na miskách se srdečním infusním agarem (Heart Infusion Agar), který obsahuje 10% defibrinované králičí krve a inkubují se při teplotě 37 °C ± 2 °C, přibližně 18 hodin.

Nárůst na misce se resuspenduje v srdečním infusním médiu a alikvotní podíl této suspenze se použije na inokulaci 100 ml srdečního infusního média, obsahujícího 10 % defibrinované králičí krve. Inkubuje se stacionárně, přibližně 18 hodin při teplotě 37 °C ± 2 °C. 100 ml kapalné kultury (pracovní seed) se kontroluje na čistotu mikroskopickým sledováním skvrn po Gramové barvení a pomocí růstu na miskách se srdečním infusním krevním agarem. Pracovní seed se může skladovat maximálně 14 dní při teplotě 2 až 8 °C nebo se může použít okamžitě. Pracovním seedem se zaočkují Erlenmeyerovy baňky o objemu 2 litry nebo jiné vhodné nádoby, obsahující pneumokokové inokulační médium (YUF) s dextrosou (25 g/litr). Inkubuje se stacionárně přibližně 8 až 24 hodin, při teplotě 37 °C ± 2 °C. Doba inkubace se mění v závislosti na druhu pěstovaného Streptococcus pneumoniae. Hodnota pH při fermentaci se upraví tak, aby se výsledné pH dalo udržovat v rozmezí 6,0 až 7,2 periodickými přídavky roztoku hydrogenuhličitanu sodného o koncentraci 12 % dokud se nedosáhne optické hustoty 1,5 až 4,0. Optická hustota se stanovuje při vlnové délce 660 nm. Vzorek nárůstu se mikroskopicky zkoumá a zkoušení čistoty se provede serologickou aglutinační reakcí. Nárůst z tohoto stupně se převede do seed fermentoru obsahujícího 40 litrů pneumokokového fermentačního média. Toto médium se skládá z destilované vody, suché dávky složek pro pneumokokové seed médium (YUF), ultrafiltrátu kvasničného extraktu, UCON a dextrosy (přibližně 25 g/litr). Kultura se inkubuje při teplotě 37 °C ± 2 °C, za mírného míchání, přibližně 2 až 12 hodin. Hodnota pH se udržuje mezi 6,0 až 7,2 pomocí periodických přídavků roztoku hydroxidu sodného. Fermentor, obsahující 525 litrů pneumokokového fermentačního média, které je složené z destilované vody, suché dávky složek pneumokokového produkčního média (YUF), ultrafiltrátu kvasničného extraktu, UCON a dextrosy (přibližně 25 g/litr), se zaočkuje přibližně 50 litry jedné ze seed kultur, napěstované za 2 až 12 hodin. Kultura se inkubuje při teplotě 37 °C ± 2 °C, za mírného míchání, 6 až 30 hodin, v závislosti na pěstovaném druhu. Hodnota pH se udržuje mezi 6,0 až 7,2 periodickými přídavky hydroxidu sodného. Fermentace se sleduje stanovením optické hustoty a ukončí se, když je dextrosa kompletně utilizovaná, což se projeví tím, že se dále nemění pH.

-29CZ 283284 B6

Patogenní mikroorganismy se usmrtí ihned po skončení fermentace. Usmrcení se provede přídavkem fenolu do koncentrace 1 % a fenol se nechá 2 až 12 hodin působit při teplotě okolí.

II. Izolace surového Pn-Ps

K usmrcené kultuře se přidá denaturovaný alkohol v dostatečném množství, aby se vysrážely zbytky buněk a nukleové kyseliny. Ty se odstraní odstředěním. Surový polysacharid se potom vysráží ze supematantu přídavkem dalšího množství denaturovaného alkoholu. Pevné části se shromáždí odstředěním a supematant se vyhodí.

Kontaminace nukleovými kyselinami se sníží solubilizací polysacharidu v neutrálním vodném roztoku, jako je 1 až 5% roztok octanu sodného nebo fosfátový pufr o koncentraci 0,05 M, ke kterému se přidá nukleasa a asi 0,01 M chloridu hořečnatého. Po 60 až 120 minutách při teplotě asi 36 °C se upraví pH na 8,0 a přidá se proteasa, jako je trypsin, pro štěpení proteinových kontaminantů.

Přídavné nečistoty se mohou odstranit novým vysrážením polysacharidu v roztoku octanu sodného denaturovaným alkoholem nebo isopropylalkoholem a následnou solubilizací v destilované vodě. Přídavek cetrimoniumbromidu při teplotě 8 °C vysráží nečistoty, které se odstraní odstředěním. Přídavek octanu sodného aalikvotního podílu denaturovaného alkoholu nebo isopropylalkoholu umožní odstranění přídavných nečistot. Polysacharid se izoluje přidáním dalšího alkoholu a odstředěním. Sraženina se promývá absolutním alkoholem, dokud se nezíská bílý prášek. Polysacharid se shromáždí filtrací, promyje absolutním ethanolem a acetonem a vakuově se vysuší. Získá se surový Pn-Ps v podobě prášku.

Příklad 4

Příprava částečně hydrolyzovaného, purifíkovaného Pn6B-Ps

1) Termální hydrolýza

3,0 g surového Pn6B-Ps v podobě prášku se rozpustí v 1200 ml fyziologického roztoku (0,9% roztok NaCl), 4 hodiny se míchá při laboratorní teplotě a nechá přes noc stát při teplotě 4 °C. Potom se roztok hydrolyzuje v zařízení se zpětným chladičem typu chlazeného prstu při 100 °C, 24 hodin a ochladí se na laboratorní teplotu. Přidá se 59,7 g octanu sodného, takže jeho výsledná koncentrace v roztoku je 30 g/litr.

2) Serologická zkouška

Pokusná frakcionace isopropylalkoholem (IPA) a nefelometrické stanovení konečného bodu zaměřené na protilátku, které se provádí s 10 ml vzorku, ukazuje, že Pn6B-Ps se sráží při koncentraci IPA 40 až 50 %.

3) První přídavek IPA

K hydrolyzovanému vzorku o objemu 1200 ml, připravenému podle kroku 1, se přidá 932 ml IPA, takže koncentrace IPA v roztoku je 43,5 %. IPA se přidává po kapkách, za míchání, při laboratorní teplotě. Vzorek se nechá 15 až 30 minut míchat a potom se 30 minut odstřeďuje při 11 000 g (odstředivka Beckman s rotorem JA-10, otáčky 8 000 min'¹, 20 °C). Odpadní peleta se

-30CZ 283284 B6 rozmělní v absolutním ethanolu v nádobě Omnimix o objemu 250 ml. Tuhé části směsi se shromáždí na skleněné sintrové fritě o objemu 60 ml. Sraženina se promyje přímo na fritě absolutním ethanolem, potom acetonem a vysuší se ve vakuu nad CaCl₂ při laboratorní teplotě v průběhu přípravy na stanovení.

4) Druhý přídavek IPA a získání produktu

K supematantu o koncentraci IPA 43,5 % (objem 2020 ml, získanému podle kroku 3, výše v textu) se přidá po kapkách při laboratorní teplotě, za míchání 93,5 ml IPA až do výsledné koncentrace IPA 46 %. Vzorek se nechá stárnout a pak se odstředí stejně jako v kroku 3. Peleta se rozmělní, shromáždí, promyje a vysuší jako v kroku 3. Produkt PnóB-Ps váží 1650 mg, jeho Kj má hodnotu 0,62, obsah fosforu činí 3,3 %.

Příklad 5

S. pneumoniae 6B-OMPC konjugát, Pn6B-Ps-OMCP

A. Převedení pryskyřice Dowex 50x2 na tetrabutylamoniovou formu /Dowex 50 (Bu₄N±)l

Dowex 50x2 (200 až 400 mesh) H⁺ forma (72 g) se suspenduje ve vodě, naplní se do kolony a promývá se postupně vodou, roztokem HC1 o koncentraci 6 M a opět vodou, dokud není reakce roztoku na pH papírek na výtoku u kolony neutrální. Potom se kolona promývá 10% vodným roztokem tetrabutylamoniumhydroxidu, dokud není reakce roztoku na výtoku z kolony silně alkalická. Nakonec se kolona promývá vodou, dokud není reakce roztoku na výtoku z kolony opět neutrální.

B. Pn6B(Bu4N+)

Pn6B-Ps (600 mg) o snížené velikosti molekuly a frakcíonovaný (fyzikální vlastnosti viz tabulka I Pn6B-Ps šarže I) se rozpustí v 60 ml sterilní destilované vody. Roztok se míchá magnetickým míchadlem, dokud se všechny tuhé části nerozpustí (1,5 hodiny). Roztok polysacharidu se nastříkne na kondicionovanou pryskyřici a nechá se protékat jejím ložem působením gravitace (4,5 hodiny). Kolona se promyje 10 až 12 ml vody a spojené eluáty se lyofilizují. Tím se získá 640 mg suché Pn6B-Ps ve formě tetra-n-butylamoniové soli Pn6B(n-Bu4N+).

C. Pn6B-BuA₂

Pn6B(N-Bu₄N⁺) (640 mg) se rozpustí ve 24 ml dimethylsulfoxidu (DMSO) a 30 minut se míchá magnetickým míchadlem. Za tuto dobu se všechny tuhé části rozpustí. K tomuto roztoku se přidá 44,2 mg Ι,Γ-karbonyldiimidazolu a reakční směs se 60 minut míchá při laboratorní teplotě. V oddělené baňce se připraví pomocí přídavku roztok NaOH o koncentraci 10 M bázický roztok (pH 10,2) butandiamindihydrochloridu (BuA₂.2HCl, 1,022 g) v 16 ml vody. Roztok se přefiltruje přes sterilní filtr o průměru pórů 0,2/μιη a ochladí se v ledové lázni. Ke studenému roztoku BuA₂.2HCl se pomalým ustáleným přítokem přidá stařená směs DMSO, obsahující aktivovaný polysacharid. Výsledný roztok se 15 minut míchá při teplotě 0 °C. Reakční směs se nechá ohřát na laboratorní teplotu a dále se jednu hodinu míchá. Potom se převede do dialyzační trubice a při teplotě 4 °C se dialyzuje proti následujícím roztokům: 1) proti 15 1 pufru fosforečnanu sodného o koncentraci 0,1 M a pH 7,0 6 hodin; 2) proti 15 litrům pufru fosforečnanu sodného

-31 CZ 283284 B6 o koncentraci 0,01 M apH 7,0, 12 hodin; 3) proti 15 litrům pufru fosforečnanu sodného o koncentraci 0,01 M a pH 7,0, 9 hodin; 4) proti 15 litrům destilované vody, 17,5 hodiny. Obsah dialyzační trubice se lyofilizuje. Získá se 222 mg Pn6B—1,4—butandiaminu (Pn6B-BuA₂) . NMR analýza (300 MHz, D₂O) asi 5 mg tohoto materiálu odhalila, že na 100 Pn6B-Ps opakujících se monomemích jednotek připadá 22 diaminových zbytků. To se zjistí srovnáním integrálu rezonančních signálů methylenu z butandiaminu s integrálem signálů protonů methylu z rhamnosy z Pn6B-Ps.

Pn6B-BuA₂-BrAc

Pn6B-BuA₂ (210 mg) se rozpustí v 21 ml Kolthoffova borátofosfátového pufru o koncentraci 0,1 M a pH 9,04. Směs se 30 minut míchá magnetickým míchadlem, aby vznikl roztok. K tomuto vodnému roztoku se přidá směs obsahující 210 mg p-nitrofenylbromacetátu v 2,6 ml acetonitrilu a reakční směs se přes noc míchá (20 hodin při teplotě 4 °C). Roztok se převede do dialyzační trubice adialyzuje se při teplotě 4 °C proti následujícím roztokům: 1) proti 15 litrům sterilní destilované vody, 12,3 hodiny; 2) proti 15 litrům sterilní destilované vody, 8, 25 hodiny; 3) proti 15 litrům sterilní destilované vody, 5,5 hodiny. Z obsahu se odebere 1,7 ml pro stanovení (NMR a HPSEC univerzální kalibraci nebo stanovení velikosti molekuly). K obsahu se potom přidá 0,449 g suché soli fosfátového pufru o pH 8,0 (tato suchá sůl se připraví lyofilizací roztoku fosforečnanu sodného o koncentraci 0,1 M a pH 8,0). Po úplném rozpuštění (30 minut) se roztok přefiltruje přes sterilní filtr o průměru pórů 0,2 pm. Získá se roztok Pn6B-BuA₂-BrAc o pH 8.

Pn6B-OMPC

Ze 40 ml sterilního OMPC o koncentraci 4,5 mg/ml se vytvoří pelety ultracentrifugací při teplotě 4 °C, 43 000 otáček/min, po dobu 2 hodin, ve čtyřech centrifugačních zkumavkách o objemu 10 ml. Každá peleta se resuspenduje ve 3 ml sterilně přefiltrované (přes filtr spory 0,22 pm) thiolační směsi, která obsahuje následující složky: N-acetylhomocysteinthiolaktonhydrochlorid (164 mg), dvojsodnou sůl ethylendiamintetraoctové kyseliny (255 mg) a dithiothreitol (53 mg) ve 30 ml Na₂B₄O₇ pufru o pH 11,09. Resuspendované pelety se homogenizují (homogenizátor Dounce) a spojí. Nádoba se suspenzí se odplyní a nasytí dusíkem a nechá se přes noc stárnout (19 hodin při laboratorní teplotě). Roztok se rozdělí mezi tři ultracentrifugační zkumavky, převrství roztokem KH₂PO₄ o koncentraci 1 M a z proteinu se ultracentrifugací (při 4 °C, 43 000 otáček/min, po 2 hodinách) vytvoří pelety. Pelety se resuspendují ve 30 ml pufru o koncentraci fosforečnanu sodného 0,1 M apH 8, homogenizují se (homogenizátor Dounce) a znovu se z nich vytvoří pelety ultracentrifugací za stejných podmínek. Sterilní proteinová peleta se používá resuspendovaná v přefiltrovaném roztoku Pn6B-BuA₂-BrAc. Ihned se provede Ellmanův test a zjistí se, že titr SH skupin činí 34 pmol. Reakční směs se odplyní, nasytí dusíkem a nechá 91 hodin stárnout při laboratorní teplotě.

Protein se blokuje přidáním 1 ml roztoku filtrovaného přes sterilní filtr s 0,22/pm póry, který obsahuje 75 mg N-ethylmaleinimidu v 5 ml pufru o koncentraci fosforečnanu sodného 0,1 M a pH 8,0. Tato směs se nechá stárnout 4 hodiny při laboratorní teplotě a potom se k ní přidá 300 μΐ roztoku N-acetylcysteaminu, filtrovaného přes filtr s 0,22 pm póry. Roztok se nechá dále 19,5 hodiny stárnout.

Sterilní blokovaný konjugát se rozdělí mezi čtyři centrifugační zkumavky a převrství pufrem o koncentraci fosforečnanu sodného 0,1 M apH 7,0. Ultracentrifugací při 4 °C, 43 000 otáček/min. po dobu 2 hodin se vytvoří pelety. Pelety se resuspendují ve 42 ml sterilního pufru o koncentraci Na₂PO₄ 0,1 M apH 7,0 ahomogenizují se (homogenizátor Dounce). Dále se provede za stejných podmínek ultracentrifugace. Vzniklé pelety se resuspendují v 50 ml sterilní destilované vody v homogenizátoru Dounce. Po staření, probíhajícím 17 hodin při 4 °C, se konjugovaný preparát odstřeďuje v TJ-6 odstředivce s rotorem TH 4 při otáčkách 1000 min'¹, po

-32CZ 283284 B6 dobu 3,5 minuty. Malé množství sedimentu se odstraní. Konečný produkt, suspenze konjugátu, se testuje na obsah proteinů (podle Lowryho), Pn6B-polysacharidu (pomocí fenolu/kyseliny sírové), nekonjugovaného polysacharidu (chromatografie SEC s rozpoznáním velikosti molekul, rychlostní nefelometrie) a aminokyselin (stanovení aminokyselin). Výsledky jsou následující:

Pn6B-polysacharid protein

Pn6B-Ps/OMPC volný Pn6B-Ps

S-karboxymethylhomocystein/lysin S-karboxymethylcysteamin/lysin

0,33 mg/ml

2,2 mg/ml

0,15 pod 5 % objemu

7,7 %

1,6%

Příklad 6

Příprava částečně hydrolyzovaného, purifikovaného Pnl4-Ps

1) Čištění pomocí anexové pryskyřice

2,81 g prášku Pnl4-Ps se rozpustí v 1124 ml destilované vody za míchání při laboratorní teplotě během asi 4 hodin a potom se přes noc skladuje při 4 °C. Roztok se přidá k 60 g DE52 (Whatman, diethylaminoethylcelulosa), která se předem nechá asi 15 hodin botnat v destilované vodě o pH 5 až 6. Vzniklá kaše se jemně třese na deskové třepačce při laboratorní teplotě asi 15 hodin. Potom se směs odstřeďuje v odstředivce Beckman s rotorem JA-10 při otáčkách 5000 min'¹ při teplotě 20 °C. Supematant se dále vyčeří filtrací přes skleněnou sintrovou fritu o objemu 150 ml a střední porozitě. Filtrát se sbírá v odsávačce o objemu 2 litry.

2) Ultrazvuková hydrolýza

Na Pnl4-Ps vyčištěný pomocí DE52 podle kroku 1 o objemu 1100 ml se působí ultrazvukem v kádince z umělé hmoty, která je v ledové lázni, v sonifikátoru Branson (12,7 mm sonda, nastavení na hodnotu 8) po dobu 2 minut. Vzorek se nechá během 15 minut zchladnout a mezitím se stanoví jeho viskozita. Potom se pokračuje v sonifikaci v jednominutových intervalech. Po poslední sonifikaci se získá vzorek o konečné hodnotě viskozity 1,096, 10^-6 m².s‘'. Hydrolyzovaný vzorek se ohřeje na laboratorní teplotu a přidá se k němu 18,0 g octanu sodného, takže konečná koncentrace acetátu je 10 g/litr.

3) Šero logická zkouška

Pokusná frakcionace isopropylalkoholem (IPA) a nefelometrické stanovení konečného bodu, zaměřené na protilátku, které se provádí slOml vzorku, ukazuje, že Pnl4-Ps se sráží při koncentraci IPA 35 až 45 %.

4) První přídavek IPA

K hydro lyžovanému vzorku o objemu 1090 ml připravenému podle kroku 2) se přidá 706 ml IPA, takže koncentrace IPA v roztoku je 39,3 %. IPA se přidává po kapkách, za míchání, při laboratorní teplotě. Vzorek se nechá 15 až 30 minut míchat a potom se 30 minut odstřeďuje při 11 000 g (odstředivka Beckman s rotorem JA-10, otáčky 8 000 min'¹, 20 °C). Odpadní peleta se rozmělní v absolutním ethanolu v nádobě Omnimix o objemu 250 ml. Tuhé části se shromáždí

-33CZ 283284 B6 na skleněné sintrové fritě o objemu 60 ml. Sraženina se promyje přímo na fritě absolutním ethanolem, potom acetonem a vysuší se ve vakuu nad CaCl₂ při laboratorní teplotě v průběhu přípravy na stanovení.

5) Druhý přídavek IP A a izolace produktu

K supematantu o koncentraci IPA 39,3 %, objem 1712 ml, získanému podle kroku 4, se přidá po kapkách při laboratorní teplotě za míchání 73,5 ml IPA, takže výsledná koncentrace IPA je 41,8 %. Vzorek se nechá stárnout a pak se odstředí stejně jako v kroku 4. Peleta se rozmělní, shromáždí, promyje a vysuší jako v kroku 4. Produkt Pnl4-Ps váží 1,399 mg.

6) Dialýza a lyofilizace

1385,6 mg vzorku získaného podle kroku 5 se rozpouští 2 až 3 hodiny v destilované vodě (554 ml) při laboratorní teplotě. Roztok o koncentraci 2,5 mg/ml se převede do dialyzační trubice (o průměru 45 mm, propustnost do molekulové hmotnosti 12 000). Dialyzuje se 27 hodin proti destilované vodě se dvěma výměnami destilované vody. Potom se dialyzovaný vzorek převede do lyofilizačních baněk. Zmrazí se na slupku v lázni ze suchého ledu a methanolu a lyofilizuje se v lyofilizátoru Virtis (Freezemobile) 2,5 dne až do sucha. Získá se 1326,8 mg produktu Pnl4-Ps oKj 0,56.

Z tohoto popisu by odborníkům v oboru mělo být zřejmé, že i jiné neutrální Pn-Ps jiných podtypů, jako například Pn7F-Ps, se mohou připravit podle tohoto způsobu a potom konjugovat stejně jako Pnl4-Ps, který je také neutrálním polysacharidem.

Příklad 7

Konjugace proteinového komplexu z vnější membrány s pneumokokovým 14 polysacharidem. Pnl4-Ps-OMPC

a) Příprava 1,4—butandiaminového derivátu Pnl4-Ps (14-BuA₂)

410 mg Pnl4-Ps po skladování ve vakuu nad P₂O₅ po 3 hodiny se přelije 26 ml dimethylsulfoxidu (DMSO). Směs se rozpouští za míchání 0,75 hodiny. Potom se k roztoku přidá 62 mg karbonyldiimidazolu a výsledný roztok se míchá 80 minut při laboratorní teplotě.

Připraví se roztok obsahující 1,067 g 1,4-butandiamindihydrochloridu (BuA₂.2HC1) ve 38,5 ml H₂O. Jeho pH se upraví na hodnotu 10,20 roztokem NaOH o koncentraci 2,5 M. Vzniklý roztok se přefiltruje přes filtr Millex 0,2 pm GV a ochladí v ledové lázni.

Ke studenému BuA₂ roztoku se přidá stařený roztok v DMSO a směs se dále v ledové lázni 10 minut míchá. Potom se roztok nechá stát 50 minut při laboratorní teplotě, načež se naplní do dialyzační trubice Spectrapor 2 (2 x 312 mm). Trubice se zasvorkuje 1 cm pod hladinou kapaliny. Dialyzuje se proti

1.15 litrům pufru o koncentraci 0,1 M fosforečnanu sodného při pH 7,0, 16,5 hodiny;

2. 15 litrům stejného pufru, 8 hodin;

3. dalším 15 litrům stejného pufru, 8 hodin;

-34CZ 283284 B6

4. 15 litrům vody, 17,5 hodiny.

Potom se roztok lyofilizuje. Získá se 210 mg 1,4-butandiaminového derivátu Pnl4-Ps (Pnl4BuA₂). Změřením NMR spektra asi 5 mg vzorku a srovnáním integrálů rezonančních píků methylenu z butandiaminu s píky N-acetylmethylskupiny z Pnl4-Ps se zjistí, že na 100 opakujících se jednotek polysacharidů připadá přibližně 31 butandiaminových zbytků.

b) Příprava bromacetylovaných butandiaminových derivátů Pnl4-Ps (Pnl4-BuA₂-BrAc)

210 mg Pnl4-BuA₂ se přelije 36 ml boráto-fosfátového pufru o koncentraci 0,1 M apH 9,0. Směs se 2,5 hodiny míchá, až vznikne roztok. Potom se přidá 195 mg p-nitrofenylbromacetátu rozpuštěného ve 4 ml acetonitrilu. Vzniklá směs se 21 hodin míchá při teplotě 4 °C. Potom se roztok dialyzuje v trubicích Spectrapor 2 proti: 1.15 litrům destilované vody, 6 hodin; 2) dalším 15 litrům destilované vody, 14,5 hodiny a 3) dalším 15 litrům destilované vody, 6 hodin. Z prostoru trubice s dialyzovanou látkou se odeberou 2 ml pro stanovení a potom se přidá 492 mg suché soli fosfátového pufru o pH 8,0 (tato suchá sůl se připraví lyofilizací roztoku fosforečnanu sodného o pH 8,0 a koncentraci 0,1 M). Roztok se přefiltruje přes dva filtry Coming s 0,2 pm póry. Získá se 43 ml vodného roztoku Pnl4-BuA₂-BrAc o pH 8,0.

c) Konjugace OMPC s Pnl4-BuA₂-BrAc-Ps ml OMPC (o koncentraci 3,2 mg/ml) se naplní do 5 centrifugačních zkumavek o objemu 10 ml. Odstřeďuje se v odstředivce Beckman s rotorem 80Ti při otáčkách 43 000 min’¹, teplotě 4 °C 2 hodiny. Připraví se thiolační směs rozpuštěním 350 mg EDTA (disodná sůl ethylendiamintetraoctové kyseliny) a 64 mg dithiothreitolu (DTT) ve 30 ml Na₂B₄O₇ pufru o pH 11,0. Ke směsi se přidá N-acetylhomocysteinthiolakton (346 mg) a potom se směs přefiltruje přes Coming filtr s póry velikosti 0,2 pm (pohárkový typ).

Materiál se uvolní z pelet, získaných centrifugací podle postupu uvedeného výše v textu, pomocí 3 ml přefiltrované thiolační směsi. Celkový objem jedné zkumavky, 15 ml, se převede do homogenizeru Dounce, kde dojde k resuspendování. Zkumavky se propláchnou dalšími 5 ml thiolačního roztoku (dvakrát po sobě). Spojené proplachy se homogenizují v homogenizeru Dounce. Celý objem resuspendovaného materiálu, 25 ml, se převede do baňky s kulatým dnem o objemu 100 ml. Po uzavření šeptem a nahrazení vzduchu dusíkem pomocí ventilu Firestone se reakční směs nechá 21 hodin stát. 25 ml reakční směsi se potom rozdělí do třech centrifugačních zkumavek. Každá zkumavka se přelije vodným roztokem KH₂PO₄ o koncentraci 1 M. Odstřeďuje se 2 hodiny při otáčkách 43 000 min’¹ a teplotě 4 °C. Supematant se odstraní a pelety se resuspendují v pufru o koncentraci fosforečnanu sodného 0,1 M a pH 8,0 (celkový objem pro resuspendování je 30 ml).

Provede se druhá ultracentrifugace za stejných podmínek pro odstřeďování. Po odstranění supematantu se pelety resuspendují v homogenizeru Dounce v přefiltrovaném roztoku Pni 4BuA₂-BrAc, připraveným podle postupu uvedeného výše. Ellmanovým stanovením se zjistí v tomto okamžiku celkové množství asi 23 pmol thiolových skupin.

Je třeba poznamenat, že filtrace roztoku Pnl4-BuA₂-BrAc se provede těsně před resuspendováním thiolovaného proteinu. Vzniklá reakční směs (tj. Pnl4-BuA₂-BrAc s thiolovaným OMPC) se staří v atmosféře dusíku (s odplyněním) v dusíkovém boxu, při laboratorní teplotě 114 hodin.

Reakční směs se potom blokuje (tj. reaktivní skupiny Pnl4-Ps a OMPC se deaktivují) následujícím způsobem. Přidá se roztok obsahující 75 mg N-ethylmaleinimidu (NEM) v 5 ml pufru, o koncentraci fosforečnanu sodného 0,1 M apH 8,0. Směs se nechá 22,5 hodiny stát. 35 ml blokované reakční směsi se rozdělí do čtyř centrifugačních zkumavek a odstřeďuje se 2

-35CZ 283284 B6 hodiny při otáčkách 43 000 min'^{* 1} při 4 °C. Pelety se resuspendují v 40 ml TED pufru (o složení O,1M Tris, 0,01M EDTA, 0,5% DOC, pH 8,5) a roztok se 19 hodin staří při laboratorní teplotě. Potom se za stejných podmínek jako v předchozím případě odstředí. Pelety se resuspendují ve 40 ml pufru o koncentraci fosforečnanu sodného 0,1 M apH 8,0 a roztok se opět stejným způsobem odstředí. Vytvořené pelety se resuspendují ve 44 ml vody a 17 hodin se staří při teplotě 4 °C. Provede se centrifugace při nízkých otáčkách, 1000 min’^{1 3 * *}, 3,5 min. Při ní vznikne malá peleta, která se vyhodí. Supematant se odstraní a získá se 43 ml konjugátu s následujícími analytickými parametry:

Test

a) obsah Ps

b) protein

Ps/protein poměr (vypočtený)

c) volný Ps

d) analýza aminokyselin SCMHC/lysin SCMC/lysin

Výsledky

387 pg/ml

300 pg/ml

0,30 pod 5 % plochy

9,8 %

3,5 %

Příklad 8

Příprava Pn23F-Ps

Příprava meziproduktu Pn23F-Ps

1) Ultrazvuková hydrolýza g prášku Pn23F-Ps se rozpouští v 1200 ml fyziologického roztoku (0,9 % roztok NaCl) za míchání asi 4 hodiny při laboratorní teplotě. Na roztok se potom působí ultrazvukem v kádince z umělé hmoty, která je v ledové lázni, sonifíkátorem Branson (sonda 12,7 mm, nastavená hodnota 8) ve tříminutových intervalech celkem 15 minut. Po každém intervalu se sonifikuje dalších 5 minut, aby se získala konečná hodnota viskozity 1,206 . 10“⁶ mís’¹. Hydrolyzovaný vzorek se ohřeje na laboratorní teplotu a přidá se k němu 58,4 g octanu sodného, takže konečná koncentrace je 30 g/litr.

2) Šero logická zkouška

Pokusná frakcionace isopropylalkoholem (IPA) a nefelometrické stanovení konečného bodu, zaměřené na protilátku, které se provádí s lOml vzorku, ukazuje, že Pn23F-Ps se sráží při koncentraci IPA 35 až 45 %.

3) První přídavek IPA

K hydrolyzovanému vzorku o objemu 1165 ml připravenému podle kroku 1 se přidá 810 ml IPA, takže koncentrace IPA v roztoku je 41,0% IPA se přidává po kapkách, za míchání, při laboratorní teplotě. Vzorek se nechá 15 až 20 minut míchat a potom se 30 minut odstřeďuje při 11 000 g (odstředivka Beckman s rotorem JA-10, otáčky 8 000 min'¹, 20 °C). Odpadní peleta se rozmělní v absolutním ethanolu v nádobě Omnimix o objemu 250 ml. Tuhé části se shromáždí na skleněné sintrové fritě o objemu 60 ml. Sraženina se promyje přímo na filtru absolutním

-36CZ 283284 B6 ethanolem a potom acetonem a vysuší ve vakuu nad CaCl? při laboratorní teplotě v průběhu přípravy na stanovení.

4) Druhý přídavek IPA a izolace produktu

K supematantu o koncentraci IPA 41,0 % o objemu 1925 ml získanému podle kroku 3 se přidá po kapkách při laboratorní teplotě za míchání 85 ml IPA, takže výsledná koncentrace IPA je 43,5 %. Vzorek se nechá stárnout a pak se odstředí stejně jako v kroku 3. Peleta se trituruje, shromáždí, promyje a vysuší jako v kroku 3. Produkt Pn23F-Ps váží 1795 mg.

5) Dialýza a lyofilizace

1779 mg Pn-PS vzorku získaného podle kroku 4 se rozpouští 3 až 4 hodiny v 712 ml destilované vody, při laboratorní teplotě. Roztok o koncentraci 2,5 mg/ml se převede do dialyzační trubice (o průměru 45 mm, propustnost do molekulové hmotnosti 12 000). Dialyzuje se 27 hodin proti destilované vodě se dvěma výměnami destilované vody. Potom se dialyzovaný vzorek převede do lyofilizačních baněk. Zmrazí se na slupku v lázni ze suchého ledu a methanolu a lyofilizuje se v lyofilizátoru Virtis (Freezemobile) 2,5 dne až do sucha. Získá se 1703 Ps produktu o IQ 0,60.

Příklad 9

Konjugace proteinového komplexu z vnější membrány s meziproduktem P23F-Ps

a) Převedení pryskyřice Dowex 50X2 (200 až 400 mesh) na tetrabutylamoniovou formu /Dowex 50 (Bu₄N⁺) / Dowex 50X2 (200 až 400 mesh) v FT formě (72 g) se suspenduje ve vodě (voda použitá v tomto procesu je apyrogenní, sterilní a destilovaná), naplní se do kolony a promývá se postupně 800 ml vody, 400 ml roztoku HC1 o koncentraci 6 M, 300 ml vody, dokud není reakce roztoku na pH papírek na výtoku z kolony neutrální. Dále se náplň promývá 250 g 10% vodného roztoku tetrabutylamoniumhydroxidu, dokud není reakce roztoku na výtoku z kolony silně alkalická. Nakonec se náplň promyje 750 ml vody.

b) Příprava Pn23F-PS tetrabutylamoniové formy /Pn23F(Bu₄N+) /

Sloupec pryskyřice Dowex 50X2 (Bu₄N⁺) o objemu 34 ml se promyje 70 ml vody. 450 mg Pn23F-Ps o snížené velikosti molekuly se přelije 50 ml vody a 0,5 hodiny se míchá. Tento roztok se nastříkne na kolonu a nechá se protékat její náplní za pomoci gravitace (2 hodiny). Potom se na dno kolony připojí zdroj vakua a eluce (vakuová) pokračuje další hodinu. Kolona se promyje 25 ml vody a spojené eluáty se lyofilizují. Získá se 0,5 g Pn23F (Bu₄N⁺) soli, která se skladuje 17 hodin ve vakuovém exsikátoru nad P2O5.

c) Příprava 1,4-butandiaminového derivátu Pn23F-Ps (Pn23F-BuA2)

0,5 g Pn23F (Bu₄N⁺) podle kroku b) výše se přelije 25 ml dimethylsulfoxidu (DMSO) a 15 hodin se míchá, až se rozpustí. K roztoku se přidá 22 mg karbonyldiimidazolu (CEI) a výsledný roztok se 0,5 hodiny míchá při laboratorní teplotě.

Připraví se roztok obsahující 507 mg 1,4-butandiamindihydrochloridu (BuA2-2HC1) ve 32 ml H2O a jeho pH se upraví na 10,23 roztokem NaOH o koncentraci 2,5 M. Roztok se přefiltruje přes filtr Millex 0,2 pm GV a ochladí se v ledové lázni.

-37CZ 283284 B6

Ke studenému BuA? roztoku se přidá stařený DMSO roztok a směs se míchá další hodinu v ledové lázni. Dále se směs nechá stát 1 hodinu při laboratorní teplotě a naplní se do dialyzační trubice Spectrapor (2 x 312 mm). Trubice se zasvorkuje 1 cm pod hladinou kapaliny adialyzuje se proti: 1.15 litrům pufru o koncentraci fosforečnanu sodného 0,1 M a pH 7,0, 16 hodin; 2) 15 litrům pufru o koncentraci fosforečnanu sodného 0,01 M apH 7,0, 10,5 hodiny; 3) dalším 15 litrům stejného pufru jako v případě a), 12,5 hodiny; 4) 15 litrům vody, 10,5 hodiny. Potom se roztok lyofílizuje a získá se 220 mg 1,4-butandiaminového derivátu Pn23F-Ps (Pn23F-BuA₂).

Změřením NMR spektra asi 6,9 mg vzorku a srovnáním integrálů rezonančních píků methylenových skupin butandiaminu s integrály píků methylskupin z rhamnosy (z Pn23F) se zjistí, že na 100 opakujících se jednotek polysacharidu připadá přibližně 23,5 zbytku butandiaminu.

d) Příprava bromacetylovaného butandiaminového derivátu Pn23F-Ps (Pn23F-BuA₂-BrAc)

214mg Pn23F-BuA₂ se přelije 23 ml boráto-fosfátového pufru o koncentraci 0,1 M apH 9,0. Směs se 30 minut míchá, aby vznikl roztok. Potom se přidá 230 mg p-nitrofenylbromacetátu v 6 ml acetonitrilu. Výsledná směs se 23 hodin míchá při teplotě 4 °C. Roztok se potom dialyzuje v trubici Spectapor 2 proti třikrát 15 litrům vody v intervalech 8 hodin, 12 hodin a 6 hodin. Z prostoru obsahujícího dialyzovaný produkt se odebere 1,5 ml na stanovení. Přidá se 490 mg suché soli fosfátového pufru o pH 8,0 (sůl se připraví lyofilizací roztoku fosforečnanu sodného o koncentraci 0,1 M a pH 8,0). Rozpouštění trvá 15 minut a potom se roztok přefiltruje přes filtr Coming s póry o velikosti 0,2 pm. Získá se vodný roztok Pn23F-BuA₂-BrAc o pH 8,0.

e) Konjugace OMPC s Pn23F-BuA₂-BrAc-Ps ml OMPC o koncentraci 3,1 mg/ml se naplní do 6 centrifugačních zkumavek o objemu 10 ml a odstřeďuje se v odstředivce Beckman s rotorem 80Ti při otáčkách 43 000 min'¹ při 4 °C 2 hodiny. Thiolační směs se připraví rozpuštěním 260 mg EDTA (disodná sůl ethylendiamintetraoctové kyseliny) a 52 mg dithiothreitolu (DTT) ve 30 ml Na₂B₄O7 thiolaktonu. Směs se přefiltruje přes filtr Coming s póry 0,2 pm (pohárkového typu). Materiál se uvolní z pelet získaných centrifugací podle postupu uvedeného výše v textu pomocí 3 ml přefiltrované thiolační směsi. Celkový objem jedné zkumavky, 20 ml, se převede do homogenizátoru Dounce, kde dojde k resuspendování. Zkumavky se propláchnou dalšími 6 ml thiolačního roztoku. Proplachování se opakuje s dalšími 4 ml thiolačního roztoku. Spojené proplachy se homogenizují v homogenizátoru Dounce. Celkový objem resuspendovaného materiálu, 28 ml, se převede do baňky s kulatým dnem o objemu 100 ml. Po uzavření šeptem a nahrazení vzduchu dusíkem pomocí ventilu Firestone se reakční směs nechá 19 hodin stát. 28 ml reakční směsi se potom rozdělí do třech centrifugačních zkumavek. Každá zkumavka se přelije vodným roztokem KH₂PO₄ o koncentraci 1 M. Odstřeďuje se 2 hodiny při otáčkách 43 000 min¹ a teplotě 4 ^PC. Supematant se odstraní a pelety se resuspendují v pufru o koncentraci fosforečnanu sodného 0,1 M a pH 8,0 (celkový objem po resuspendování je 30 ml).

Provede se druhá ultracentrifugace za stejných podmínek pro odstřeďování. Po odstranění supematantu se pelety resuspendují v homogenizeru Dounce s přefiltrovaným roztokem Pn23FBuA₂-BrAc připraveným podle postupu uvedeného v oddílu 7.1. C. 3d). Ellmanovým stanovením se zjistí, že celkové množství thiolových skupin ve výsledném roztoku je 28 pmol.

Filtrace roztoku Pn23F-BuA₂-BrAc uvedeného shora se provede těsně před resuspendováním thiolového proteinu. Vzniklá reakční směs (tj. Pn23F-BuA₂-BrAc s thiolovaným OMPC) se staří v atmosféře dusíku (s odplyněním) v dusíkovém boxu při laboratorní teplotě 117 hodin.

Reakční směs se potom blokuje (tj. reaktivní skupiny Pn23F-Ps a OMPC se deaktivují) přidáním roztoku obsahujícího 75 mg N-ethylmaleinimidu (NEM) v 5 ml pufru o koncentraci fosforečnanu

-38CZ 283284 B6 sodného 0,1 M a pH 8,0. (Tento roztok je přefiltrován přes filtr s póry o velikosti 0,22 pm.) Směs se nechá 18 hodin stát. Celkový objem blokované konjugační směsi je 38,5 ml. Směs se doplní na objem 40 ml přídavkem 1,5 ml pufru o koncentraci fosforečnanu sodného 0,1 M apH 8,0.

ml tohoto roztoku se naplní rovnoměrně do čtyř centrifugačních zkumavek o objemu 10 ml.

Každá zkumavka se přelije pufrem fosforečnanu sodného o koncentraci 0,1 M apH 8,0. Odstřeďuje se 2 hodiny při otáčkách 43 000 min¹ při teplotě 4 °C. Supematant se odstraní a každá peleta se uvolní 8 ml TED pufru (o složení 1M Tris, pH 8,5; 0,01M EDTA; 0,5% deoxycholátu sodného) a převede se do homogenizeru Dounce. Centrifugační zkumavky se sériově promyjí přídavkem dalších 8 ml TED pufru. Pelety se resuspendují a staří 20 hodin při ío laboratorní teplotě. Celkový objem suspenze je 40 ml. Stařený materiál se odstřeďuje (jak je popsáno výše) ve čtyřech zkumavkách o objemu 10 ml při otáčkách 43 000 min'¹ 2 hodiny při 4 °C. Každá peleta se uvolní 8 ml TED pufru, zkumavky se sériově promyjí 8 ml TED pufru. Pelety se resuspendují a vzniklá suspenze se odstřeďuje za stejných podmínek jako v předchozím případě. Vzniklé pelety se resuspendují v celkovém objemu 40 ml pufru fosforečnanu sodného 15 o koncentraci 0,1 M apH 7,0. Suspenze se opět za stejných podmínek odstředí. Pelety se resuspendují ve 44 ml vody a suspenze se nechá stát 17 hodin při teplotě 4 °C. Malé množství nerozpustných látek se odstraní odstředěním při nízkých otáčkách 1000 min'¹ po dobu 3,5 minuty. Získá se produkt v supematantu.

Výsledný produkt se léčivá látka, konjugátová vakcína. Konjugát má následující analytické parametry:

Test

Výsledky

a) obsah Ps

b) protein

Ps/protein poměr (vypočtený)

c) volný Ps

d) analýza aminokyselin

SCMHC/lysin

SCMC/lysin

284 pg/ml

025 pg/ml

0,14 pod 5 % plochy

6,7 %

1,6%

Příklad 10

Příprava Pn-Ps homogenizací podle Gaulina

Surový Pn-Ps v podobě prášku se rozpustí ve vodě za míchání přes noc při teplotě 4 °C. Připraví se roztoky Pn-Ps ve vodě o koncentracích 1,5 mg/ml a 10 mg/ml. Přídavkem 50 mM CaCI₂ se 40 úspěšně sníží viskozita Pn-Ps roztoku o koncentraci 10 mg/ml na stejnou hodnotu jakou má roztok Pn-Ps o koncentraci 1,5 mg/ml. Rozpuštěný Pn-Ps se homogenizuje vGaulinově homogenizátoru při jednom ze čtyř tlaků: 13,74 MPa; 34,35 MPa; 67,7 MPa a 103,05 MPa. Střižnými silami hydrolyzovaný Pn-Ps se shromáždí přídavkem 60% roztoku isopropylalkoholu. Peleta se promyje 100% ethanolem v mixeru, směs se přefiltruje a získá se vysrážený Pn-Ps. Pn-Ps se na 45 filtru promyje acetonem a potom se suší nad CaSO₄ (drierit) a před analýzou se skladuje při teplotě -70 °C. Alikvotní podíly tohoto Pn-Ps se resuspendují na koncentraci 1 mg/ml a stanoví se u nich velikost molekuly a polydisperzita pomocí HPSEC universální kalibrace a index antigenicity rychlostní nefelometrií.

-39CZ 283284 B6

Pn-Ps poddruh	Molekulová hmotnost, při níž se začíná snižovat antigenicita	Polydisperzita
6B	500 000	1,19
14	300 000	1,15
19F	250 000	1,09
23F	250 000	1,15

Příklad 11

Stimulace T buněk u myší

Účelem této zkoušky je zjistit závislost na T-buňkách imunogenitu Pn-Ps konjugované vakcíny u myší. Tento model byl přijat, protože děti mladší dvou let normálně dobře odpovídají na T-dependentní antigeny. Athymické myši mají abnormální thymický epithel a jejich odpověď na T-dependentní antigeny je proto podstatně nižší než odpověď jejich normálních sourozenců z jednoho hnízda. Jednou zředěná vakcína tak, aby dávka polysacharidu byla 0,5 pg, se intraperitoneálně vstříkne dospělým athymickým myším (nu/nu) a zároveň kontrolní skupině myší, v níž jsou sourozenci z jednoho hnízda (nu/+). To se provede 0., 7. a 28. den. O týden později se myším odebere krev a z jejich krve se získají jednotlivá séra, která se testují na odpověď protilátky pomocí radioimunozkoušky (RLA).

Při provádění RLA se každé myší sérum spojí s Pn-Ps značeným radionuklidem C¹⁴. Jakýkoliv vytvořený komplex antigen-protilátka se potom vysráží přídavkem nasyceného roztoku síranu amonného. Každý takový vzorek se počítá v beta počítači 1 minutu. Pn6B-Ps-OMPC, Pnl4-PsOMPC, Pnl9F-Ps-OMPC, Pn23F-Ps-OMPC, Pnl8C-Ps aPn4-Ps konjugáty podle tohoto vynálezu se testují tímto způsobem a zjistí se, že tyto konjugáty dobře stimulují T-buňky Nu/+ myší.

Příklad 12

Imunogenicita Pn-Ps konjugátů u mláďat opic druhu rhesus

Tento test se provádí, aby se zjistila imunogenicita buď samotného konjugátu, nebo konjugovaných vakcín obsahujících Pn-Ps-OMPC nebo Pn-Ps-MIEP u mláďat opic. Ukázalo se, že mláďata opic jsou výborným modelem pro klinickou předpověď chování PedvaxHIB^(R) (konjugátová vakcína) /Vella a další, Pediatrics, doplněk z5.dubna, str. 668 až 675 (1990)/, a proto byla vybrána jako model pro hodnocení Pn-Ps konjugovaných vakcín.

Dávka vakcíny se nitrosvalově injekčně aplikuje mláďatům opic (2 až 3 měsíce starým) 0. a 28. den. Injekce se podává v množství 0,25 ml do každého ze dvou míst. Opicím se 0., 28 a 42. den odebere krev ajednotlivá séra se testují na odpověď protilátky pomocí radioimunostanovení (RIA).

Při provádění RIA se každé opičí sérum spojí s Pn-Ps značeným radionuklidem C¹⁴. Jakýkoliv vytvořený komplex antigen-protilátka se potom vysráží přídavkem nasyceného roztoku síranu amonného. Každý takový vzorek se počítá 1 minutu v beta počítači. Imunitní odpověď na vakcínu je uspokojivá, jestliže u alespoň 50 % testovaných zvířat je odpověď protilátky alespoň 1 pg po aplikaci dvou dávek vakcíny.

-40CZ 283284 B6

Pn6B-Ps-OMPC, Pn23F-Ps-OMPC, Pnl9F-Ps-OMPC, Pnl8C-Ps-OMPC, Pn4-PsOMPC a Pni4PsOMPC vykazují silné anti-druhově specifické odpovědi protilátky. Kromě toho tetravalentní přípravek obsahující Pn6B-Ps-OMPC, Pn23F-Ps-OMPC, Pnl9F-Ps-OMPC a Pnl4-Ps-OMPC vykazuje dobré anti-Pn-Ps odpovědi protilátky pro všechny čtyři serotypy.

Příklad 13

Účinnost ochrany pomocí pneumokokových konjugátů u činčil

Každé činčile se injekcí podkožně nebo nitrosvalově aplikuje dávka 0, 0,25, 1,0 nebo 4,0 pg Pn6B-Ps-OMPC adsorbovaného na A1(OH)₃. Po 0, 2, 4, 6 a 8 týdnech se činčilám odebere krev. Osm týdnů po injekční aplikaci konjugátu se u zvířat provede imunologický test s Streptococcus pneumoniae 6B. V intervalech 1 až 3 dny se zvířata sledují pomocí otoskopie a tympanometrie. Výtok ze středního ucha se odsaje pro kultivaci a za dva týdny po zahájení imunologického testu se zvířata usmrtí. U usmrcených zvířat se histopatologicky analyzuje střední ucho. U zvířat, která nedostala žádný konjugát, je 60% úmrtnost, zatímco nejnižší dávka konjugátu způsobí nulovou úmrtnost. Zvířata, která nedostanou konjugát, nemají žádnou ochranu proti purulentní otitis media, zatímco ta, která konjugát dostala, jsou chráněna v 60 až 100 % případů při všech velikostech dávky.

Příklad 14

Antipneumokokové imunitní odpovědi u dětí starých 2 až 5 let

U dětí starých 2 až 5 let, které dostaly dvě dávky, každou v množství 0,5 nebo 5 pg Pn6B-Ps, se sleduje produkce anti-Pn6B-Ps protilátek pomocí testu RIA a ELISA. Zjistí se významné zvýšení anti-Pn6B-Ps protilátek.

Příklad 15

Rychlostní nefelometrie pneumokokových polysacharidů

Účelem tohoto stanovení je určit obsah polysacharidů a index antigenicity volných Pn-Ps a konjugovaných preparátů pomocí rychlostní nefelometrie.

Rozsah standardní křivky pro rychlostní nefelometrii se liší pro různé Pn-Ps, jako se liší odpověď na jednotku hmotnosti Pn-Ps a lineární část křivky závislosti odpovědi na koncentraci Pn-Ps antigenu pro každý Pn-Ps. Zde uvedený příklad je specifický pro Pn6B konjugát a nemusí být aplikovatelný pro Pn-Ps jiných druhů. Kromě toho, vzorky adsorbované na A1(OH)₃ a jejich příslušné standardy se ředí roztokem citrátu sodného o koncentraci 3 % a nikoliv 0,9% roztokem NaCl, jak je uvedeno dále. Vodné roztoky konjugovaných vzorků ajejich standardů (tj. neadsorbované na A1(OH)₃) se ředí 0,9% roztokem NaCl a dále se ředí tak, aby jejich nominální očekávaná koncentrace spadala do rozsahu standardní křivky.

a) Reakční činidla

Fyziologický roztok: 0,9% roztok NaCl

Anti-Pn-Ps sera: Antisera (Health Research. Inc., Albany. NY) se 30x zředí fyziologickým roztokem

-41 CZ 283284 B6

Standardy: připraví se Pn-Ps konjugátové standardy o koncentracích 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0 a 4,0 pg/ml ze zásobního roztoku o koncentraci 387 pg/ml, jehož koncentrace se určí stanovením polysacharidů pomocí fenolu a kyseliny sírové.

Testované vzorky: připraví se v zásobním roztoku citrátu sodného o koncentraci 3 %. Sériovým zředěním se připraví zkoušené vzorky o teoretické koncentraci 1,0, 2,0 a 3,0 pg Pn-Ps/ml.

b) Postup

Provádí se zkouška všech vzorků a standardů ve dvou provedeních s použitím rychlostního nefelometru Beckman ICS. Ze standardní křivky se určí koncentrace vzorků. Koncentrace vzorku se vynásobí zřeďovacím faktorem a vypočte se průměrná hodnota pro každý testovaný vzorek.

Jak je uvedeno již dříve v textu, vzorky, jejich indexy antigenicity jsou nižší než 70%, se nenechají konjugovat. Tím se zajistí, že použité Pn-Ps mají žádané imunologické parametry.

Příklad 16

Klonování genomové DNA, kódující MIEP

Asi 0,1 g fenolem inaktivovaných buněk N. meningitidis (viz příklad 1) se umístí do nové zkumavky. Fenolem inaktivované buňky se resuspendují v 567 μΐ TE pufru (o složení 10 mM TRIS-HC1, 1 mM EDTA, pH 8,0). K resuspendovaným buňkám se přidá 30 μΐ 10% roztoku SDS a 3 μΐ proteinasy K (Sigma) o koncentraci 20 mg/ml. Buňky se promísí a inkubují 1 hodinu při 37 °C. Potom se přidá 100 μΐ roztoku NaCI o koncentraci 5 M a směs se důkladně promísí. Potom se přidá 80 μΐ 1% roztoku cetyltrimethylamoniumbromidu (CTAB) v roztoku NaCI o koncentraci 0,7 M. Směs se důkladně promísí a inkubuje 10 minut při 60 °C. Přidá se stejný objem (asi 0,7 až 0,8 ml) směsi chloroformu a isoamylalkoholu v poměru 24 : 1, směs se důkladně promísí a 5 minut se odstřeďuje při 10 000 g. Vodná (vrchní) fáze se převede do nové zkumavky a organická fáze se odstraní. K vodné fázi se přidá stejný objem směsi fenol : chloro form : isoamylalkohol (25 : 24 : 1). Směs se důkladně promísí a 5 minut se odstřeďuje při 10 000 g. Vodná (vrchní) fáze se převede do nové zkumavky a přidá se kní 0,6 objemu (asi 420 μΐ) isopropylalkoholu. Směs se důkladně promísí a vysrážená DNA se odstředí při 10 000 g 10 minut. Supematant se odstraní a peleta se promyje 70% roztokem ethanolu. DNA peleta se vysuší a resuspenduje ve 100 μΐ TE pufru. Takto se získá genomová DNA zN. meningitidis.

Syntetizují se dva oligonukleotidy DNA, které odpovídají 5'konci MIEP genu a3'konci MIEP genu /Murakami, E. C. a další (1989), Infection and Immunity, 57, str. 2 318 až 2 323/. Specifická sekvence DNA oligonukleotidu pro 5' konec MIEP genu je 5'ACTAGTTGCAATGAAAAAATCCCTG-3'; a pro 3’ konec MIEP genu 5'GAATTCAGATTAGGAATTTGTT-3’ . Tyto DNA oligonukleotidy se použijí jako primery pro amplifikaci MIEP genu pomocí řetězové polymerační reakce (PCR), při níž se použije 10 ng genomové DNA zN. meningitidis, PCR amplifikace se provede podle postupu dodaného výrobcem (Perkin Elmer).

Amplifikovaná MIEP DNA se štěpí restričními endonukleasami Spěl a EcoRI. Fragment DNA o velikosti 1,3 kilobase (kb) obsahující celou oblast kódující MIEP se izoluje elektroforézou na agarovém gelu o koncentraci 1,5%. Z gelu se tento fragment získá elektroelucí /Současné postupy v molekulární biologii, (1987), Ausubel, R. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Smith, J. A., Seidman, J. G. a Struhl, K., vyd. Greene Publishing Assoc./. Plasmidový vektor pUC-19 se štěpí pomocí Spěl a EcoRI.

-42CZ 283284 B6

Fragment DNA Spěl -EcoRI kódující MIEP, elektroforeticky vyčištěný, se ligací vsune do Spěl EcoRI pUC-19 vektoru. Tento vektor se použije pro transformaci E. coli kmene DH5.

Transformanty obsahující pUC-19 vektor sMIEP o velikosti 1,3 kbp se identifikují mapováním restrikčními endonukleasami. MIEP DNA se sekvenuje a tím se potvrdí její identita.

Příklad 17

Konstrukce vektoru pCl/1. Gall0p(B)ADHl_t

Gal 10 promotor se izoluje zplasmidu YEp52 /Broach a další, (1983) v Experimental Manipulation of Gene Expression, Inouye, M(Ed) Academie Press, str. 83 až 117/ purifikací fragmentu o velikosti 0,5 tisíce bázových párů (kbp) na gelu. Fragment se získá po štěpení pomocí Sau 3A a Hind III. ADH1 terminátor se izoluje z vektoru pGAP. tADH2 /Kniskem a další, (1986), Gene, 46, str. 135 až 141/ purifikací fragmentu o velikosti 0,35 kbp na gelu; fragment se získá štěpením pomocí Hind III a Spe I. Tyto dva fragmenty se ligací za působení T4 DNA ligasy spojí s vektorem pUC18AHindIII, vyčištěným na gelu (Hind III místo se eliminuje štěpením PUC18 pomocí Hind III, ukončením natupo pomocí Klenowova fragmentu E. coli DNA polymerasy I a ligací za působení T4 DNA ligasy. Vektor byl štěpen působením BamHI a SpHI, čímž se vytvořil parentální vektor pGallo-tADHl. Vektor má jednoduché Hind III klonovací místo na Gal lOp. ADH1, spojení.

Jednoduché Hind III klonovací místo na pGallO.tADHl se změní na jednoduché BamHI klonovací místo štěpením pGallO.tADHl pomocí Hind III gelovou purifikací štěpu DNA a ligací za působení T4 DNA ligasy s následujícím Hind ΙΠ-BamHI linkerem:

5'-AGCTCGGATCCG-3' 3'-GCCTAGGCTCGA-5'.

Výsledný plasmid pGallO (B) tADHl má vyštěpené Hind III místo a vytvořené jednoduché BamHI klonovací místo.

Gal lOp.tADHl fragment se izoluje z pGal 10 (B) tADHl štěpením pomocí Smál a Sphl natupo zakončením pomocí T4 DNA polymerasy a na gelu se purifikuje. Kvasinkový shuttle vektor pCl/1 /Brake a další, (1984), Proč. Naťl. Acad. Sci. USA, 81, str. 4 642 až 4 646/ se štěpí pomocí SpHI, natupo zakončí pomocí T4DNA polymerasy a purifikuje se. Tento fragment se ligací spojí s vektorem za působení T4 DNA ligasy. Ligační reakční směs se použije pro transformaci buněk E. coli HB 101, čímž se způsobí rezistence kampicilinu. Transformanty se testují pomocí hybridizace s jednoduchým vláknem Hind ΙΠ-BamHI linkeru, značeného radionuklidem ³²P. Konstrukce nového vektoru pCl/l.Gal 10p(B)ADHl, se potvrdí štěpením pomocí HindlII a BamHI.

Příklad 18

Konstrukce kvasinkového vektoru pro expresi MIEP s použitím MIEP DNA sekvence a vedoucí sekvence DNA

DNA fragment obsahující kompletní oblast kódující MIEP se vytvoří štěpením pUC19.MIEP č. 7 pomocí Spěl a EcoRI, gelovou purifikací MIEP DNA a zakončením natupo pomocí T4 DNA polymerasy.

-43 CZ 283284 B6

Kvasinkový vnitřní vektor pro expresi pCI/l.Gal 10p(B)ADHl_t se štěpí pomocí Bam HI, defosforyluje se působením telecí střevní alkalické fosfatasy a zakončí se natupo působením T4

DNA polymerasy. DNA se čistí na gelu, aby se odstranil neštěpený vektor.

Natupo zakončený fragment kódující MIEP o velikosti 1,1 kbp se ligací spojí s natupo zakončeným vektorem pCI/l.Gal 10p(B)ADHl_t. Ligační reakční směs se použije pro transformaci kompetentních buněk E. coli DH5, čímž se způsobí rezistence k ampicilinu. Transformanty se testují pomocí hybridizace s DNA oligonukleotidem, značeným radionuklidem ³²P:

5'... AAGCTCGGATCCTAGTTGCAATG ... 3’.

Tento oligonukleotid je homologní se sekvencemi překrývajícími spojení MIEP DNA-vektor. Z transformantů, pozitivních při hybridizaci se utvoří preparáty DNA. Ty se štěpí pomocí KpnI aSalI, aby se ověřilo, že MIEP fragment je ve správné orientaci pro expresi pomocí Gal 10 promotoru. Další potvrzení konstrukce DNA se získá sekvenováním dideoxy metodou od Gal 10 promotoru přes oblast kódující MIEP.

Exprese MIEP transformanty se deteguje analýzou Western blot. Rekombinantní MIEP produkovaný v transformantech migruje na polyarkylamidových gelech společně s MIEP purifikovaným z OMPC vesikul a je imunologicky reaktivní s protilátkami specifickými vůči MIEP.

Příklad 19

Konstrukce kvasinkového expresního vektoru pro MIEP s 5'-modifikovanou MIEP DNA sekvencí

DNA oligonukleotid obsahující Hind ΠΙ místo, konzervovanou kvasinkovou 5' nepřeloženou vedoucí sekvenci (NTL), start kodón pro methionin (ATC), prvních 89 kodónů pro zralý MIEP (počínaje od Asp na pozici + 20) a KpnI místo (na pozici +89) se vytvoří řetězovou polymerační reakcí (PCR). PCR se provede podle pokynů výrobce (Perkin Elmer Cetus) s použitím plazmidu pUC19MIEP42 č. 7 jako templátu a následujících DNA oligomerů jako primerů:

5’CTAAGCTTAACAAAATGGACGTTACCTTGTACGGTACAATT³a

5'ACGGTACCGAAGCCGCCTTTCAAG³' .

Aby se odstranila 5' oblast MIEP klonu, plazmid pUC19MIEP42 č.7 se štěpí pomocí KpnI a HindlII a fragment vektoru o velikosti 3,4 kbp se čistí na agarosovém gelu.

PCR fragment o velikosti 280 bp se štěpí pomocí KpnI a Hind III, čistí se na agarosovém gelu a ligací se spojí s fragmentem vektoru o velikosti 3,4 kbp. Transformanty E. coli HB101 (BRL) se testují pomocí hybridizace s DNA oligonukleotidem. DNA pozitivní transformanty se analyzují štěpením restrikčním enzymem. Pro potvrzení skutečnosti, že během PCR reakce nedošlo k žádným mutacím ve vytvořeném PCR fragmentu o velikosti 280 bp, se pozitivní transformanty sekvenují. Výsledný plazmid obsahuje Hind ΠΙ-EcoRI insert obsahující kvasinkový NTL, ATG kodón a celý otevřený čtecí rámec (ORF) pro MIEP začínající od Asp kodónu (aminokyselina +20).

Kvasinkové MIEP expresní vektory se konstruují následujícím způsobem. pGAL10/pCl/l a pGAP/pCl/1 vektory /Vlasuk, G. P. a další, (1989) J. B. C., 264, str. 12, 106-12, 112/ se štěpí pomocí BamHl, zarovnají se (flush-ended) Klenowovým fragmentem DNA polymerasy I

-44CZ 283284 B6 a defosforylují se telecí střevní alkalickou fosfatasou. Tyto lineární vektory se ligací spojí

HindlII-EcoRI fragmentem popsaným výše, upraveným pomocí Klenowova fragmentu a vyčištěným na gelu. Tento fragment obsahuje kvasinkový NTL, ATG a ORF pro MIEP. Ligací se vytvoří pGal 10/pCl/l-MIEP a pGAP/pCl/1-MIEP.

Saccharomyces cerevisiae kmen U9 (gal 10pgal4-) se transformuje plazmidem pGal 10/pCl/lMIEP. Rekombinantní klony se izolují atestují na expresi MIEP. Klony se pěstují při teplotě 37 °C za třepání v syntetickém médiu (leu-) obsahujícím glukosu v koncentraci 2 g/1, až se dosáhne hodnoty OD₆₆₀ okolo 6,0. Potom se přidá galaktosa tak, aby její koncentrace v roztoku byla 20 g/1 a tím se indukuje exprese MIEP od Gal 10 promotoru. Buňky se po indukci galaktosou pěstují dalších 45 hodin, až se dosáhne hodnota OD₆₆o asi 9,0. Buňky se potom sklidí centrifugací. Buněčná peleta se promyje destilovanou vodou a zmrazí.

Test Western Blot pro rekombinantní MIEP

Western Blot analýza se provede, aby se určilo, zda v kvasinkách opravdu došlo k expresi MIEP. Použije se gel Novex Laemmli o koncentraci 12% , tloušťce 1 mm, s 10 až 15 jamkami. Kvasinkové buňky se rozbijí ve vodě s použitím skleněných kuliček (během rozbíjení se může přidat 2% roztok dodecylsulfátu sodného /SDS/). Buněčné zbytky se odstraní odstředěním při 10 000 g, 1 minuta.

Supematant se smíchá s elektroforetickým pufrem pro vzorek; pufr je popsán v části popisující čištění MIEP na polyakrylamidovém gelu. Elektroforéza se provádí při 35 mA, s použitím OMPC jako srovnávací kontroly. Ukončí se, když barvící značka (bromfenolová modř) přeběhne okraj gelu. Proteiny se přenesou na nitrocelulosový papír o velikosti pórů 0,45 pm s použitím přenosového přístroje NOVEX. Po přenosu se nitrocelulosový papír jednu hodinu blokuje pomocí 5% roztoku hovězího sérového albuminu ve fyziologickém roztoku, pufrovaném fosfátovým pufrem. Potom se přidá 15 ml králičího anti-MIEP antiséra, zředěného 1 : 1000; sérum se vytvoří imunizací a purifikací MIEP na gelu s použitím standardních postupů. Inkubuje se přes noc při laboratorní teplotě a přidá se 15 ml kozího anti-králičího IgG konjugovaného alkalickou fosfatasou a zředěného 1 : 1000. Po dvou hodinách inkubace se blot vyvíjí pomocí FAST RED TR SALT (Sigma) a Naftol-AS-MX fosfátu (Sigma).

Příklad 20

Bakteriální exprese rekombinantní MIEP

Plazmid pUC19-MIEP obsahující MIEP genový insert o velikosti 1,3 kbp se štěpí restrikčními endonukleasami Spěl a EcoRI. Fragment o velikosti 1,1 kbp se izoluje apurifikuje na agarosovém gelu s použitím standardních technik známých v oboru. Plazmid pTACSD obsahující TAC promotor se dvěma cistrony a jednoduché EcoRI místo se štěpí pomocí EcoRI. Na obou koncích fragmentu MIEP DNA o velikosti 1,3 kbp a pTACSD vektoru se vytvoří tupé konce pomocí T4 DNA polymerasy (Boehringer Mannheim) podle pokynů výrobce. Natupo zakončený fragment MIEP DNA o velikosti 1,3 kbp se ligací spojí s natupo zakončeným vektorem s použitím T4 DNA ligasy podle pokynů výrobce. Ligovaná DNA se použije pro transformaci buněk E. coli kmen DH5aIQMAX (BRL) podle pokynů výrobce. Transformované buňky se naočkují na agarové misky obsahující 25 pg kanamycinu/ml a 50 pg penicilinu/ml. Inkubace probíhá 15 hodin při teplotě 37 °C. DNA oligonukleotid se sekvencí homologní s MIEP se označí radionuklidem ³²P. Tento oligonukleotid se použije při standardní DNA hybridizační technice, kdy se s ním hybridizují lyžované denaturované kolonie transformovaných

-45 CZ 283284 B6 buněk na nitrocelulosovém filtru. Kolonie pozitivní při hybridizaci se mapují s použitím restrikčních endonukleas, aby se určila orientace MIEP genu.

Exprese MIEp v transformantech se zjistí analýzou Western blot. Rekombinantní MIEP produkovaný v transformantech má stejnou pohyblivost v polyakrylamidových gelech jako MIEP purifikovaný Z OMPC vezikul aje imunologicky reaktivní s protilátkami specifickými pro MIEP.

Příklad 21

Konjugace Pn-Ps s MIEP z N. meningitidis

Chemické konjugace se provedou způsobem popsaným v americkém patentu č. 4 882 317.

mg MIEP ve 3 ml borátového pufru o koncentraci 0,1 M a pH 11,5 se smísí s 10 mg disodné soli kyseliny ethylendiamintetraoctové (EDTA, Sigma Chemicals) a 4 mg dithiothreitolu (Sigma Chemicals). Roztok proteinu se důkladně probublá dusíkem. 125 g N-acetylhomocysteinthiolaktonu (Aldrich Chemicals) se přidá kMIEP roztoku a směs 16 hodin inkubuje při laboratorní teplotě. Potom se roztok v dusíkové atmosféře dvakrát dialyzuje proti 2 litrům borátového pufru o koncentraci 0,1 M a pH 9,5, který obsahuje 4 mM EDTA. Dialýza probíhá za laboratorní teploty, vždy 24 hodin. Obsah thiolových skupin v thiolovaném proteinu se stanoví Ellmanovým reakčním činidlem (Sigma Chemicals) a koncentrace proteinu Bradfordovým činidlem (Pierce Chemicals). Pro konjugaci MIEP s Pn-Ps se přidá l,5násobný přebytek (hmotnostní) bromacetylovaného Pn-Ps k MIEP roztoku a pH se upraví roztokem 1M NaOH na hodnotu 9 až 9,5. Směs se nechá inkubovat v atmosféře dusíku 6 až 8 hodin při laboratorní teplotě. Roztok konjugátu se okyselí roztokem HC1 o koncentraci 1 M na pH 3 až 4. Deset minut se odstřeďuje při 10 000 g. Jeden mililitr kapalného supematantu se nastříkne přímo na kolonu FPLC Superose 6B (rozměry 1,6 x 50 cm, Pharmacia) a konjugát se eluuje pomocí PBS. Pík mrtvého objemu, který obsahuje konjugát polysacharid-protein (Pn-Ps-MIEP) se shromáždí. Roztok konjugátu se potom filtruje přes filtr s póry o velikosti 0,22 pm za účelem sterilizace.

Příklad 22

Demonstrace imunogenicity Pn-Ps-MIEP konjugátů

Imunizace: Samci Balb/c myší (Charles River, Wilmington, MA) se imunizují IP s Pn.-Ps kovalentně konjugovaným s MIEP za použití 2,5 pg Pn-Ps v 0,5 ml předem vytvořeného hydroxidu hlinitého. Kontrolní myší se imunizují stejným množstvím Pn-Ps podaného jako Pn-Ps CRM /Anderson, Μ. E. a další, (1985), J. Pediatrics, 107, str. 346 až 351/ (2,5 pg Pn-Ps/6,25 pg CRM; 1/4 dávky pro lidi), Pn-Ps-DT (2,5 pg Pn-Ps/l,8pg DT; 1/10 dávky pro lidi, takže se použije konstantní množství Pn-Ps) aPn-Ps-OMPC (2,5 pg Pn-Ps/35 pg OMPC; 1/4 dávky pro lidi).

Mláďata opic RJhesus, 6 až 13,5 týdnu stará, se imunizují Pn-Ps-MIEP konjugáty adsorbovanými na hydroxidu hlinitém. Každá opice dostane 0,25 ml konjugátu injekčně do dvou různých míst, takže celková dávka je 0,5 ml. Opice se imunizují 0., 28. a 56. den a vzorky krve se odebírají každý druhý až čtvrtý týden.

-46CZ 283284 B6

Protilátkové odpovědi se měří pomocí ELISA testu, který rozlišuje třídu a podtřídu imunoglobulinové odpovědi. Pro hodnocení opičí odpovědi se také používá RIA test, při němž se stanoví celkové množství anti-Pn-Ps protilátky.

Pn-Ps-MIEP konjugáty jsou schopné vyvolat imunitní odpověď u myší, což spočívá v tvorbě IgG anti-Pn-Ps protilátky a zapamatování si odpovědi. To je rozdíl oproti Pn-Ps-CRM a Pn-Ps-DT, při jejichž aplikaci se nedá zjistit žádná anti-Pn-Ps protilátka. Takže MIEP, fungující jako imunologický nosičový protein pro Pn-Ps, je schopný vyvolat anti-Pn-Ps protilátkovou odpověď, je-li kovalentně konjugovaný s Pn-Ps antigenem. Purifikovaný MIEP je proto účinným imunologickým nosičovým proteinem, který nahrazuje heterogenní OMPC při konstrukci bakteriálních polysacharidových konjugovaných vakcín.

Příklad 23

Kvantitativní stanovení obsahu C-polysacharidu v Pn-Ps preparátech

Systémy vyvinuté pro kvantifikaci C-polysacharidu spočívají v NMR, enzymových nebo chromatografických způsobech. V tomto případě se používá chromatografická separace cholinu (složky C-Ps) ze vzorků hydrolyzovaných Pn-Ps a použitý způsob se srovnává s ostatními metodami. Cholin se separuje na koloně s katexem, přičemž detekce se provádí na základě snížení vodivosti.

Vzorky Pn-Ps se úplně hydrolyzují působením 36% kyseliny fluorovodíkové po dobu 2 hodin při teplotě 45 až 65 °C a dále působením kyseliny trifluoroctové o koncentraci 2 M po dobu 16 hodin při 100 °C. Po hydrolýze se 200 až 300 pg vzorku nastříkne do Dionex BioLC chromatografického systému s Omnipac PCX-500 analytickou kolonou apředkolonou slon Pac CTC-1katexovou zachycovací kolonou, s CMMS-2 mikromembránovým supresorem. Regenerace se provádí roztokem tetrabutylamoniumhydroxidu o koncentraci 50 mM při průtoku 10 ml/min. Systém má vodivostní detektor s citlivostí 1 pS. Vzorek se eluuje isokratickým způsobem roztokem obsahujícím 200 mM roztok HC1, 20% roztok acetonitrilu, roztok MilliQ vody, 20 mM roztok kyseliny diaminopropionové; složky jsou v poměru 5 : 5 : 85 : 5. Cholin se eluuje v podobě ostrého píku asi po 10 min.

Purifikovaný C-Ps (získaný ze Statens Sérum Institutu) se shora uvedeným způsobem analyzuje na obsah cholinu. Naměřený výsledek 5,4 % hmotnostního cholinu souhlasí s publikovanými hodnotami obsahu cholinu v C-Ps.

Tento faktor se použije pro výpočet koncentrace C-Ps v různých vzorcích Pn-Ps preparátu, přepočtením nanomolových množství cholinu zjištěného HPLC stanovením na jednotky hmotnosti. S použitím hodnoty 5,4 % hmotnostního cholinu v C-Ps se vypočte obsah C-Ps v hmotnostních procentech. Vzorky, které mají koncentrace C-Ps větší než 3 % se odmítnou jako nepřijatelné pro konjugaci. Tabulka uvedená dále ukazuje korelaci této metody sNMR a enzymovými metodami a ukazuje typická množství kontaminace C-Ps v preparátech Pn-Ps o různých stupních čistoty.

-47CZ 283284 B6

Vzorek NMR Enzymová metoda HPLC (% hmotn.) (% hmotn.) (% hmotn.)

Pn6B-Ps	20	nestanoveno	18,4
Pn6B-Ps	1,6	0,3 až 1,0	1,2
Pn23F-Ps	nestanoveno	2,8	3,7
Pnl4-Ps	2,9	2,4	3,2
Pnl9F-Ps	2,7	2,6	2,6

Příklad 24

Příprava částečně hydrolyzovaného, purifikovaného Pnl8C-Ps

1) Ultrazvuková hydrolýza g prášku Pnl8C-Ps se rozpouští v 1200 ml fyziologického roztoku (0,9% roztok NaCl) za míchání 3 až 4 hodiny při laboratorní teplotě, potom se roztok přikryje a přes noc uloží při 4 °C.

Na roztok se potom působí ultrazvukem v kádince z umělé hmoty umístěné v ledové lázni v sonifikátoru Bronson (kyveta 1,27 cm, nastavená hodnota 8) ve 20min intervalech (5 min působení) celkem 40 minut. Po každém intervalu se kontroluje viskozita. Po 40 minutách sonifikace se sonifikuje dalších 10 minut, aby se získala konečná hodnota viskozity vzorku 1,218.10^-6 m².s''. Hydrolyzovaný vzorek (1188 ml) se ohřeje na laboratorní teplotu a přidá se k němu 59,2 g octanu sodného, takže konečná koncentrace je 30 g/litr.

2) Serologická zkouška

Pokusná frakcionace isopropylalkoholem (IPA) a nefelometrické stanovení konečného bodu zaměřené na protilátku, které se provádí s lOml vzorku, ukazuje, že Pnl8C-Ps se sráží při koncentraci IPA 40 až 50 %.

3) První přídavek IPA

K. hydrolyzovanému vzorku o objemu 1200 ml připravenému podle kroku 1 se přidá 894 ml IPA, takže koncentrace IPA v roztoku je 42,7 %. IPA se přidává po kapkách, za míchání, při laboratorní teplotě. Vzorek se nechá 15 až 30 minut míchat a potom se 30 minut odstřeďuje při 40 11 000 g (odstředivka Beckman s rotorem JA-10, otáčky 8000 min'¹, 20 °C). Odpadní peleta se rozmělní v absolutním ethanolu v nádobě Omnimix o objemu 250 ml. Tuhé části směsi se shromáždí na skleněné sintrové fritě o objemu 60 ml. Sraženina se promyje přímo na fritě absolutním ethanolem, potom acetonem a vysuší se ve vakuu nad CaCL při laboratorní teplotě v průběhu přípravy na stanovení.

4) Druhý přídavek IPA a získání meziproduktu

K supematantu o koncentraci IPA 42,7 % o objemu 2016 ml získanému podle kroku 3 se přidá 50 po kapkách při laboratorní teplotě 92,0 ml IPA, takže výsledná koncentrace IPA je 42,5 %.

Vzorek se nechá stárnout a pak se odstředí stejně jako v kroku 3. Peleta se rozmělní, shromáždí, promyje a usuší stejně jako v kroku 3. Meziprodukt Pnl8C-Ps váží 1609 mg.

-48CZ 283284 B6

5) Dialýza a lyofilizace

1612,5 mg vzorku získaného podle kroku 4 se rozpouští 2 hodiny při laboratorní teplotě v 645 ml destilované vody. Roztok o koncentraci 2,5 mg/ml se převede do dialyzační trubice (o průměru 45 mm, propustnost do molekulové hmotnosti 12 000). Dialyzuje se 30 hodin proti destilované vodě se dvěma výměnami destilované vody. Potom se dialyzovaný vzorek převede do lyofilizačních baněk. Zmrazí se na slupku v lázni ze suchého ledu a methanolu a lyofílizuje se v lyofilizátoru Virtis (Freezemobile) 2 až 3 dny až do sucha. Získá se 1487 mg Ps produktu.

Příklad 25

S. Pneumoniae 18C-OMPC konjugát. Pnl8C-Ps-OMPC

A. Převedení pryskyřice Dowex 50x2 (200 až 400 mesh) na tetrabutylamoniovou formu /Dowex 50 (Bu₄N⁺) /

Dowex 50x2 (200 až 400 mesh) H+ forma (500 g) se suspenduje ve vodě, naplní se do kolony a promývá se postupně 600 ml vody, 1000 ml roztoku HC1 o koncentraci 6 M, 400 ml vody, dokud není reakce roztoku na výtoku z kolony neutrální na pH papírek. Dále se promývá 72 g 10% roztoku tetrabutylamoniumhydroxidu, tj. tak dlouho, dokud není reakce roztoku na výtoku z kolony silně alkalická na pH papírek. Nakonec se kolona promyje 1000 ml vody, až je promývací roztok na výtoku z kolony neutrální.

B. Příprava tetrabutylamoniové podoby polysacharidu z S. Pneumoniae druhu 18 C /Pnl8C(Bu₄N⁺)/

Dowex 50x2 (Bu₄N⁺) v koloně o objemu 60 ml se promyje 250 ml vody. 650 mg Pnl8Cpolysacharidu (se sníženou velikostí molekuly) se přelije 65 ml vody a 1 hodinu míchá, čímž vznikne roztok. Tento roztok se nastříkne na kolonu a nechá se protékat za pomoci gravitace její náplní (2 hodiny). Potom se provádí eluce za pomoci vakua (1 hodinu). Kolona se promyje 150 ml vody a spojené eluáty se lyofilizují. Získá se 655 mg 18C (Bu₄N) soli. 25 mg se odebere pro NMR analýzu a zbytek se uchová.

C. Příprava 1,4-butandiaminového derivátu 18C (18C-BuA₂)

18C (Bu₄N⁺) (630 mg) se přelije 143 ml DMSO (dimethylsulfoxidu) a směs se 3,25 hodiny míchá. Během této doby se všechny tuhé částice rozpustí. Jeden ml roztoku se odebere pro titrační stanovení obsahu vody podle Karl Fischera. Zjistí se obsah vody 28,2 pmol/ml (celkem 4 mmol). K tomuto roztoku se přidá 165,1 mg karbonyldiimidazolu (CDI) a vzniklý roztok se 2 hodiny míchá při laboratorní teplotě. Připraví se roztok obsahující 1,260 g 1,4-butandiamindihydrochloridu (BuA₂.2HC1) ve 40 ml H₂O a jeho pH se upraví 2,5M roztokem NaOH na 10,20. Tento roztok se ochladí v ledové lázni. Ke studenému BuA₂ roztoku se pomalu přidá stařený DMSO roztok a směs se míchá 10 minut v ledové lázni a potom 50 minut při laboratorní teplotě. Potom se roztok naplní do dialyzační trubice Spectrapor 2, trubice se zaškrtí 1,27 cm od horní hladiny kapaliny a dialyzuje se proti následujícím roztokům: 1) 15 litrům pufru o koncentraci Na₃PO₄ 0,1 MapH 7,0, 13 hodin; 2) 15 litrům pufru o koncentraci Na₃PO₄ 0,01 M a pH 7,0, 11 hodin; 3) 15 litrům stejného pufru jako v případě 2, 10,8 hodiny; 4) 15 litrům vody, 9,5 hodiny. Objem po dialýze činí 190 ml. Odebere se alikvotní podíl o objemu 7,5 ml a ten se odděleně lyofílizuje pro NMR stanovení. Zbývajících 182,5 ml roztoku se lyofílizuje a tím se získá

-49CZ 283284 B6

416 mg 1,4-butandiaminovému derivátu 18C (Pnl8C-BuA₂). Naměřením NMR spektra asi 5 mg vzorku a srovnáním integrálů rezonančních píků vnitřních methylenových skupin butandiaminu s integrály píků methylskupin zrhamnosy (z 18C) se zjistí, že na 100 opakujících se jednotek polysacharidu připadá přibližně 10 zbytků butandiaminu.

D. Příprava bromacetylovaného butandiaminového derivátu 18C (Pnl8C-BuA₂-BrAc)

18C-BuA₂ (416 mg) se přelije 36 ml pufru (Kolthoffův boráto-fosfátový pufr) o koncentraci 0,lM a pH 9,04. Směs se míchá až vznikne roztok. Potom se přidá 256 mg p-nitrofenylbromacetátu ve 4,48 ml acetonitrilu. Výsledná směs se 20 hodin míchá při teplotě 4 °C. Potom se dialyzuje v trubici Spectrapor 2 proti 15 litrům vody, třikrát za sebou, vždy 6 hodin. Po dialýze je objem dialyzovaného roztoku 60 ml. 1,7 ml tohoto roztoku se odebere pro stanovení (NMR, Ouchterlonyho stanovení, stanovení na viskozimetru Viscotek). Ke zbylému roztoku se přidá 2,42 g suché soli fosfátového pufru o pH 8 (tato sůl se připraví lyofilizací roztoku Na₃PO₄ o koncentraci 0,1 M apH 8,0). Po rozpuštění se roztok přefiltruje přes filtr Corning spory o velikosti 0,2 pm. Získá se vodný roztok 18C-BuA₂-BrAc o pH 8,0. Filtrace probíhá pomalu a je na ni třeba čtyř filtrů pohárkového typu.

E. Konjugace OMPC (z N. meningitidis) s Pnl8C-BuA₂-BrAc ml roztoku s proteinovým komplexem z vnější membrány (OMPC) zN. meningitidis o koncentraci 3,2 mg OMPC/ml se naplní do čtyř centrifugačních zkumavek. Odstřeďuje se v odstředivce Beckman s rotorem 60Ti při otáčkách 43 000 min'¹, 2 hodiny při teplotě 4 °C. Thiolační směs se připraví rozpuštěním 680 mg EDTA (disodné soli kyseliny diamintetraoctové) a 120 mg dithiothreitolu (DTT) ve 40 ml pufru Na2B4O7 o pH 11,09. Přidá se 320 N-acetylhomocysteinthiolaktonu a roztok se potom přefiltruje přes filtr Corning s póry o velikosti 0,2 pm (pohárkového typu). Materiál se uvolní z pelet získaných centrifúgací podle postupu uvedeného výše v textu pomocí 5 ml přefiltrované thiolační směsi. Celkový objem jedné zkumavky, 20 ml, se převede do homogenizeru Dounce, kde dojde k resuspendování. Zkumavky se propláchnou dalšími 2 a 10 ml thiolační směsi. Spojené roztoky se homogenizují v homogenizeru Dounce. Celkový objem resuspendovaného materiálu (40 ml) se převede do baňky s kulatým dnem o objemu 100 ml. Po uzavření šeptem a nahrazení vzduchu dusíkem pomocí ventilu Firestone se reakční směs nechá 18,5 hodiny stát. 60 ml reakční směsi se potom rozdělí do čtyř centrifugačních zkumavek. Každá zkumavka se přelije vodným roztokem KH2PO4 o koncentraci 1 M. Odstřeďuje se 2 hodiny při otáčkách 43 000 min'¹ při 4 °C. Supematanty se odstraní a pelety se resuspendují v pufru o koncentraci Na3PO₄ 0,1 M a pH 8,0 (celkový objem při resuspendování je 40 ml). Tento roztok se převede rovnoměrně do dvou centrifugačních zkumavek z polykarbonátu o objemu 25 ml. Skleněné nádobí (homogenizátor Dounce atd.) se propláchne 10 ml fosfátového pufru o pH 8,0. Tento proplach se použije na dolití centrifugačních zkumavek. Provede se druhá ultracentrifugace za stejných podmínek jako předešlá. Pelety se resuspendují ve 30 ml fosfátového pufru o koncentraci 0,1 M apH 8,0. Ellmanovou zkouškou se zjistí, že celkové množství SH skupin je 24 pmol, tj. asi 100 nmol/mg OMPC: Thiolovaný protein se převede do baňky s kulatým dnem o objemu 100 ml. K němu se přidá přefiltrovaný roztok 18C-BuA₂-BrAc. Vzniklá reakční směs (tj . 18C-BuA₂-BrC s thiolovaným OMPC) se staří v atmosféře dusíku (s odplyněním) v dusíkovém boxu, při laboratorní teplotě 89 hodin.

Reakční směs se potom blokuje následujícím způsobem: Ke směsi se přidají 2 ml roztoku přefiltrovaného přes filtr o velikosti pórů 0,22 pm, který obsahuje 75 mg N-ethylmaleinimidu (NEM) v 5 ml pufru o koncentraci Na₃PO₄ 0,1 M a pH 8,0. Směs se 4 hodiny staří.

-50CZ 283284 B6

Ke směsi se dále přidá 1 ml roztoku přefiltrovaného přes filtr s velikostí pórů 0,22/μπι, který obsahuje 0,5 ml N-acetylcystaminu ve 2,5 ml pufru o koncentraci PO³'₄ 0,1 M a pH 8,0. Směs se

22,5 hodiny staří.

Blokovaný produkt se potom rovnoměrně naplní do čtyř centrifugačních zkumavek o objemu 25 ml a ty se dolijí 8 ml pufru o koncentraci PO³'₄ 0,1 M a pH 8,0. Odstřeďuje se při otáčkách 43 000 min'¹ 2 hodiny při 4 °C. Po odstranění supematantů se pelety resuspendují v homogenizeru Dounce ve 40 ml TED pufru. Skleněné nádobí se propláchne dalšími 10 ml TED pufru a roztok se převede do dvou zkumavek o objemu 25 ml. Tyto zkumavky se skladují 15,25 hodiny při laboratorní teplotě a potom se 2 hodiny odstřeďují při otáčkách 43 000 min¹ při 24 °C. Vzniklé pelety se resuspendují v Dounce homogenizátoru v celkovém objemu 30 ml TED pufru. Suspenze se převede do dvou centrifugačních zkumavek o objemu 25 ml. Skleněné nádobí se propláchne dalšími 20 ml TED pufru. Opět se odstřeďuje při otáčkách 43 000 min'¹, 4 °C, 2 hodiny. Pelety se resuspendují v 50 ml fosfátového pufru opH 7,0 a provede se třetí odstřeďování za stejných podmínek. Pelety se resuspendují v 82 ml vody a suspenze se převede po částech o objemu 20,5 ml do čtyř sterilních centrifugačních zkumavek (Falcon) z umělé hmoty o objemu 50 ml. Po staření 18 hodin při 4°C se konjugovaný preparát odstředí při otáčkách 1000 min'¹ 3,5 minuty v centrifuze TJ-6, v rotoru TH. Suspenze výsledného konjugovaného produktu se zkoumá na obsah proteinů (stanovení podle Lowryho), 18C polysacharidů (fenol/kyselina sírová), nekonjugovaného polysacharidu (chromatografie s rozlišením velikosti molekul - rychlostní nefelometrie) a aminokyselin (SPINCO analyzátor):

Polysacharid

Protein

Volný polysacharid

S-karboxymethylhomocystein/lysin

S-karboxymethylcysteamin/lysin

339 gg/ml

2,57 mg/ml pod 5 % (limit experimentální chyby)

0,025

0,005

Příklad 26

Příprava Pn4-Ps meziproduktu

1) Ultrazvuková hydrolýza

1,0 g prášku Pn-Ps se rozpouští ve 400 ml fyziologického roztoku (0,9% roztok NaCl) za míchání při laboratorní teplotě 4 hodiny. Na roztok se potom působí ultrazvukem v kádince z umělé hmoty, která je v ledové lázni, sonifikátorem Bronson (12,7 mm kyveta, nastavená hodnota 8) v 10 minutových intervalech, celkem 20 minut. Po každém intervalu se kontroluje viskozita. Po 20 minutách sonifikace se získá konečná hodnota viskozity 1,267.10^-6 m².s‘’. Hydrolyzovaný vzorek se ohřeje na laboratorní teplotu a přidá se k němu 18,7 g octanu sodného, takže konečná koncentrace octanu je 30 g/litr.

2) Serologická zkouška

Pokusná frakcionace isopropylalkoholem (IPA) a nefelometrické stanovení konečného bodu zaměřené na protilátku, které se provádí slOml vzorku, ukazuje, že Pn4-Ps se sráží při koncentraci IP A 45 až 55 %.

-51 CZ 283284 B6

3) První přídavek IPA

K hydrolyzovanému vzorku o objemu 385 ml připravenému podle kroku 1 se přidá 379 ml IPA, takže koncentrace IPA v roztoku je 49,7 %. IPA se přidává po kapkách, za míchání, při laboratorní teplotě. Vzorek se nechá 15 až 30 minut míchat a potom se 30 minut odstřeďuje při 11 000 g (odstředivka Beckman s rotorem JA-10, otáčky 8 000 min¹,20 °C). Odpadní peleta se rozmělní v absolutním ethanolu v nádobě Omnimix o objemu 250 ml. Tuhé části směsi se shromáždí na skleněné sintrové fritě o objemu 60 ml. Sraženina se promyje přímo na fritě absolutním ethanolem, potom acetonem a vysuší se ve vakuu nad CaCl₂ při laboratorní teplotě v průběhu přípravy na stanovení.

4) Druhý přídavek IPA a izolace produktu

K. supematantu o koncentraci IPA 49,7 % o objemu 727 ml získanému podle kroku 3 se přidá po kapkách při laboratorní teplotě za míchání 38 ml IPA, takže výsledná koncentrace IPA je 52,5 %. Vzorek se nechá stárnout a pak se odstředí stejně jako v kroku 3. Peleta se rozmělní, shromáždí, promyje a vysuší stejně jako v kroku 3. Pn4-PS produkt váží 516 mg.

5) Dialýza a lyofilizace

500 mg Pn-Ps vzorku získaného podle kroku 4 se rozpouští 2 až 3 hodiny ve 200 ml destilované vody při laboratorní teplotě. Roztok o koncentraci 2,5 mg/ml se převede do dialyzační trubice (o průměru 45 mm, propustnost do molekulové hmotnosti 12 000). Dialyzuje se 30 hodin proti destilované vodě se dvěma výměnami destilované vody. Potom se dialyzovaný vzorek převede do lyofilizačních baněk. Zmrazí se na slupku v lázni ze suchého ledu a methanolu a lyofilizuje se v lyofilizátoru Virtis (Freezemobile) 2 až 3 dny až do sucha. Získá se 491 mg Ps produktu o Kj 0,69.

Z tohoto popisu by odborníkům v oboru mělo být zřejmé, že i jiné karboxylskupinu obsahující Pn-Ps poddruhy, jako jsou Pnl-Ps nebo Pn5-Ps, se mohou připravit a konjugovat způsobem zde uvedeným pro Pn4Ps nebo Pn9V-Ps, které jsou také kyselými polysacharidy.

Příklad 27

S. Pneumoniae druh 4-OMPC konjugát. Pn4-Ps-OMPC

a) Převedení pryskyřice Dowex 50x2 (200 až 400 mesh) na tetrabutylamoniovou formu /Dowex 50 (Bu₄N⁺) /

Dowex 50x2 (200 až 400 mesh) v H+ formě (500 g) se suspenduje ve vodě (Cm-66), naplní se do kolony a promývá se postupně 600 ml vody, 1000 ml roztoku HC1 o koncentraci 6 M, 400 ml vody, dokud není reakce roztoku na výtoku z kolony neutrální na pH papírek. Dále se promývá 72 g 10% roztoku tetrabutylamoniumhydroxidu, tj. tak dlouho, dokud není reakce roztoku na výtoku z kolony silně alkalická na pH papírek. Nakonec se kolona promyje 1000 ml vody, až je promývací roztok na výtoku z kolony neutrální.

-52CZ 283284 B6

b) Příprava tetrabutylamoniové podoby polysacharidu z S. pneumoniae druh 4 /Pn4 (Bu₄bT)/

Pryskyřice Dowex 50x2 (Bu₄N⁺) v koloně o objemu 65 ml se promyje 520 ml vody. 400 mg Pn4Ps (se sníženou velikostí molekuly) se přelije 35 ml vody a 20 minut se míchá, čímž vznikne roztok. V míchání se pokračuje přes noc. Tento roztok se nastříkne na kolonu a nechá se protékat za pomoci gravitace její náplní. Kolona se promyje 150 ml vody a spojené eluáty se lyofilizují. Získá se 504 mg Pn4 (Bu₄N⁺) soli.

c) Příprava 1,4-butandiaminového derivátu Pn4 (Pn4-BuA₂)

Pn4 (Bu₄N’) (97 mg) se přelije 16 ml DMSO (dimethysulfoxidu) a směs se míchá, až vznikne roztok, při teplotě 52 °C po dobu 15 minut. Během této doby se všechny tuhé částice rozpustí. Roztok se ochladí na laboratorní teplotu.

K tomuto roztoku se přidají 2 mg karbonyldiimidazolu (CDI) rozpuštěného v 160 pl DMSO a výsledný roztok se míchá 1 hodinu při laboratorní teplotě. Připraví se roztok obsahující 0,500 g 1,4-butandiamindihydrochloridu (BuA₂.2HC1) v 5 ml H₂O a jeho pH se upraví roztokem NaOH o koncentraci 5M na hodnotu 10,20. Tento roztok se ochladí v ledové lázni. Ke studenému BuA₂ roztoku se pomalu přidá stařený DMSO roztok a směs se míchá 5 minut v ledové lázni. Dále se míchá 1 hodinu při laboratorní teplotě. Potom se roztok naplní do dialyzační trubice Spectrapor 2, trubice se zaškrtí 13 mm od okraje kapaliny adialyzuje se proti: 1) 4 litrům pufru o koncentraci Na₃PO₄ 0,1 M a pH 7,0, 15 hodin; 2) 4 litrům pufru o koncentraci Na₃PO₄ 0,01 M a pH 7,0, 9 hodin; 3) 4 litrům stejného pufru jako v případě 2, 21 hodin; 4) 4 litrům vody, 20 hodin. Roztok se lyofilizuje a tím se získá 70 mg 1,4-butandiaminového derivátu Pn4 (Pn4BuA₂). Změřením NMR spektra asi 5 mg vzorku a srovnáním integrálů rezonančních píků vnitřních methylenových skupin butandiaminu s integrály píků N-acetylmethylskupin z Pn4 se zjistí, že na 100 opakujících se jednotek polysacharidu připadá 22 zbytků butandiaminu.

d) Příprava bromacetylovaných butandiaminových derivátů Pn 4 (Pn4-BuA₂-BrAc)

Pn4-BuA₂ (54 mg) se přelije 5,5 ml pufru (Kolthoffův boráto-fosfátový pufr) o koncentraci 0,1 M a pH 9,04. Směs se míchá až vznikne roztok. Potom se přidá 55 mg nitrofenylbromacetátu v 1,0 ml acetonitrilu. Výsledná směs se míchá 17 hodin při 4 °C. Potom se dialyzuje v trubici Spectrapor 2 proti 16 litrům vody třikrát za sebou po dobu 24, 8 a 23 hodin. Po dialýze je objem roztoku 12,5 ml. 1,0 ml z tohoto roztoku se odebere pro stanovení (NMR, Ouchterlonyho stanovení, stanovení na viskozimetru Viscotek). Ke zbylému roztoku se přidá 275 mg suché soli fosfátového pufru o pH 8,0 (tato sůl se připraví lyofílizací roztoku Na₃PO₄ o koncentraci 0,1 M a pH 8,0). Po rozpuštění se roztok přefiltruje přes filtr Coming s póry o velikosti 0,2 pm. Získá se vodný roztok Pn4-BuA₂-BrAc o pH 8,0.

e) Konjugace OMPC (z N. meningitidis) s Pn4-BuA₂-BrAc ml roztoku s proteinovým komplexem z vnější membrány (OMPC) zN. meningitidis o koncentraci 4, 34 mg/ml se odstřeďuje v odstředivce Beckman s rotorem 80Ti při otáčkách 43 000 min¹, 2 hodiny při teplotě 4 °C. Thiolační směs se připraví rozpuštěním 85 mg EDTA (disodné soli kyseliny ethylendiamintetraoctové) a 15 mg dithiothreitolu (DTT) v 10 ml Na₂B₄O₇ pufru o pH 11,09. 50 mg N-acetylhomocysteinthiolaktonu se přidá k roztoku a roztok se přefiltruje přes filtr s póry o velikosti 0,2 pm. Pelety získané centrifugám' podle postupu uvedeného výše, se uvolní 5 ml přefiltrované thiolační směsi, převedou se do Dounce homogenizátoru a resuspendují se. Resuspendovaný roztok se převede do centrifugační

-53 CZ 283284 B6 zkumavky; ta se uzavře šeptem a vzduch se nahradí dusíkem pomocí ventilu Firestone. Reakční směs se 19 hodin staří a potom se převede do centrifugační zkumavky. Ta se přelije vodným roztokem KH₂PO₄ o koncentraci 1 M. Odstřeďuje se 2 hodiny při otáčkách 43 000 min’¹ při 4 °C. Supematanty se odstraní a pelety se resuspendují v 10 ml pufru o koncentraci Na₃PO₄ 0,1 M a pH 8,0. Roztok se převede do centrifugační zkumavky a provede se druhé odstředění za stejných podmínek. Pelety se resuspendují v 11,5 ml roztoku Pn4-BuA₂-BrAc, připraveném podle odstavce d). Ellmanovou zkouškou se zjistí celkové množství 3,44 pmol SH skupin, tj. 158 nmol SH/ mg OMPC. Vzniklá reakční směs (tj. Pn4-BuA₂-BrAc sthiolovaným OMPC) se staří v atmosféře dusíku (s odplyněním) v dusíkovém boxu při laboratorní teplotě po dobu 66 hodin.

Reakční produkt se potom blokuje následujícím způsobem: Ke směsi se přidá roztok přefiltrovaný přes filtr s velikostí pórů 0,22 pm, který obsahuje 5 mg N-ethylmaleinimidu (NEM) v 1 ml pufru o koncentraci Na₃PO₄ 0,1 M a pH 8,0. Směs se 5 hodin staří. Ke směsi se dále přidá roztok přefiltrovaný přes filtr s velikostí pórů 0,22 pm, obsahující 0,1 ml N-acetylcysteaminu v 0,4 ml pufru o koncentraci Na₃PO₄ 0,1 M a pH 8,0. Směs se 14,5 hodiny staří.

Reakční směs se potom odstředí při otáčkách 43 000 min'¹,4 °C, 2 hodiny. Peleta se resuspenduje v 8 ml 1 X TED pufru. Roztok se staří při laboratorní teplotě přes noc a potom se odstřeďuje při otáčkách 43 000 min'¹ při 4 °C 2 hodiny. Peleta se resuspenduje v 8 ml TED pufru a ihned se za stejných podmínek odstředí. Peleta se opět resuspenduje v 10 ml pufru o koncentraci PO₄ 0,1 M a pH 7,0 a odstředí se za stejných podmínek. Výsledná peleta se resuspenduje v 7,5 ml vody. Po staření přes noc při 4 °C se suspenze odstřeďuje 3 minuty při otáčkách 1000 min'^{1 *}. Odtažený supematant obsahuje výsledná konjugát.

Stanovení:

Obsah proteinů podle Lowryho: 0,920 mg/ml

Obsah polysacharidů (fenol/kyselina sírová) : 0,212 mg/ml

Ps/Pro=0,23

SCMHC/lys=0,031 SCMC/lys=0,022

Když se tento konjugát podá myším nebo africkým zeleným opicím, vyvolá se u nich vysoká tvorba protilátek anti-Pn4-Ps, což se zjistí pomocí stanovení ELISA, které je specifické vůči Pn4Ps.

Příklad 28

Příprava Pn9V-Ps meziproduktu

1) Ultrazvuková hydrolýza

1,0 g prášku Pn9V-Ps se rozpouští ve 400 ml fyziologického roztoku (0,9% roztok NaCl) za míchání při laboratorní teplotě 4 hodiny. Na roztok se potom působí ultrazvukem v kádince z umělé hmoty, umístěné v ledové lázni, sonifikátorem Bronson (kyveta 1,27 cm, nastavená hodnota 8) vždy po dobu 3 minut. Po této úpravě se kontroluje viskozita. Po 13 minutách sonifikace se provádí sonifikace další 1 minutu, aby se dosáhlo konečné hodnoty viskozity produktu 1,117.10'⁶ m². s¹. Hydrolyzovaný vzorek se ohřeje na laboratorní teplotu a přidá se k němu 19,5 g octanu sodného, takže konečná koncentrace octanu je 30 g/litr.

-54CZ 283284 B6

2) Serologická zkouška

Pokusná frakcionace isopropylalkoholem (IPA) a nefelometrické stanovení konečného bodu zaměřené na protilátku, které se provádí s lOml vzorku, ukazuje, že Pn9V-Ps se sráží při koncentraci IPA 40 až 45 %.

3) První přídavek IPA

K hydrolyzovanému vzorku o objemu 391 ml připravenému podle kroku 1 se přidá 281 ml IPA, takže koncentrace IPA v roztoku je 41,8%. IPA se přidává po kapkách, za míchání, při laboratorní teplotě. Vzorek se nechá 15 až 20 minut míchat a potom se 30 minut odstřeďuje při 11 000 g (odstředivka Beckman s rotorem JA-10, otáčky 8 000 min'¹,20 °C). Odpadní peleta se rozmělní v absolutním ethanolu v nádobě Omnimix o objemu 250 ml. Tuhé části směsi se shromáždí na skleněné sintrové fritě o objemu 60 ml. Sraženina se promyje přímo na fritě absolutním ethanolem, potom acetonem a vysuší se ve vakuu nad CaCI₂ při laboratorní teplotě v průběhu přípravy na stanovení.

4) Druhý přídavek IPA a získání produktu

K supematantu o koncentraci IPA 41,8 % o objemu 637 ml získanému podle kroku 3 se přidá po kapkách při laboratorní teplotě 28,6 ml IPA, takže koncentrace IPA v roztoku je 44,3 %. Vzorek se nechá stárnout a pak se odstředí stejně jako v kroku 3. Peleta se rozmělní, shromáždí, promyje a usuší stejně jako v kroku 3. Produkt Pn9V-Ps váží 342,2 mg.

5) Dialýza a lyofilizace

347 mg Pn-Ps vzorku získaného podle kroku 4 se rozpouští 4 až 5 hodin při laboratorní teplotě ve 139 ml destilované vody. Roztok o koncentraci 2,5 mg/ml se převede do dialyzační trubice (o průměru 45 mm, propustnost do molekulové hmotnosti 12 000). Dialyzuje se 25 h při 4 °C proti destilované vodě se dvěma výměnami destilované vody. Potom se dialyzovaný vzorek převede do lyofilizačních baněk. Zmrazí se na slupku v lázni ze suchého ledu a methanolu a lyofilizuje se v lyofilizátoru Virtis (Freezemobile) 2 až 3 dny až do sucha. Získá se 303,5 mg Ps produktu o K_d 0, 60.

6) Třetí přídavek IPA a izolace produktu

K supematantu o koncentraci IPA 44,3 % o objemu 655 ml získanému podle kroku 3 se přidá po kapkách při laboratorní teplotě 30,8 ml IPA, takže koncentrace IPA v roztoku je 46,8 %. Vzorek se nechá stárnout a pak se odstředí stejně jako v kroku 3. Peleta se rozmělní, shromáždí, promyje a usuší stejně jako v kroku 3. Produkt Pn9V-Ps váží 410,8 mg.

7) Dialýza a lyofilizace

420,4 mg Pn-Ps vzorku získaného podle kroku 6 se rozpouští 4 až 5 hodin při laboratorní teplotě ve 168 ml destilované vody. Roztok o koncentraci 2,5 mg/ml se převede do dialyzační trubice (o průměru 45 mm, propustnost do molekulové hmotnosti 12 000). Dialyzuje se 25 hodin proti destilované vodě se dvěma výměnami destilované vody. Potom se dialyzovaný vzorek převede do lyofilizačních baněk. Zmrazí se na slupku v lázni ze suchého ledu a methanolu a lyofilizuje

-55CZ 283284 B6 se v lyofilizátoru Virtis (Freezemobile) 3 dny až do sucha. Získá se 342,5 mg produktu o Kj

0,65.

8) Odborníkům v oboru je jasné, že produkty podle kroků 4 a 6 se mohou izolovat společně, přídavkem většího množství IPA a potom dialyzovat a lyofilizovat jako jediný produkt. Analytické hodnoty takového produktu by pak odpovídaly hmotnostnímu průměru hodnot jednotlivých frakcí produktu. Dále je také zřejmé, že Pnl-Ps nebo Pn5-Ps se mohou upravovat stejným způsobem jako je to popsáno zde pro Pn9V-Ps nebo Pn4-Ps.

Příklad 29

Konjugace Pn9V-Ps s OMPC

Pn9V-Ps připravený podle příkladu 28 se konjuguje stejným způsobem jako Pn4-Ps v příkladu 27.

Příklad 30

Kvantitativní stanovení acetátových skupin v Pn9V/18C-Ps a pyruvátových skupin v Pn4-Ps

Způsob byl vyvinut pro stanovení stupně zachování obsahu O-pyruvátových skupin v Pn4-Ps a O-acetátových skupin v Pn9V-Ps aPnl8C-Ps během zpracování pneumokokových (Pn) kapsulámích polysacharidů (Ps). O-acetylové nebo O-pyruvátové skupiny se nejprve uvolní z Pn-Ps hydrolyzátu, identifikují a kvantitativně stanoví vysokoúčinnou chromatografií na anexech, při níž se vyhodnocuje snížení vodivosti.

Vzorky zpracovaného a nezpracovaného Pn4, Pn9V aPnl8C se analyzují tímto způsobem. Předběžné výsledky ukazují molámí poměr pyruvátu ku každé opakující se jednotce Ps 1 : 1 pro nezpracovaný Pn4 a 0,8 : 1 pro Ps se zmenšenou velikostí molekuly. Molámí poměr acetátu ku každé opakující se jednotce Ps je 1 : 1 pro nezpracovaný Pnl8C-Ps a 0,8 : 1 pro Pnl8C-Ps se zmenšenou velikostí molekuly a 1,7 : 1 pro nezpracovaný Pn9V a 1,5 : 1 pro Pn9V se zmenšenou velikostí molekuly. Molámí poměr O-acetátu ku každé opakující se jednotce Pn pro vodný roztok konjugátu Pnl8C-Ps-OMPC je přibližně 0,5 : 1. V literatuře se uvádí, že pyruvátová skupina je silným iminodeterminantem u druhu 4 kapsulámích polysacharidů a že její odstranění vyvolává značné změny v imunologické specifitě /Heidelberger, M.; Dudman, W. R. a Nimmich, W., Immunochemical relationships of certain capsular polysacharides of Klebsiella, pneumococci and Rhizobia, J. Immunol., 104:1321-1328, (1970); Higginbotham, J. D., Heidelberger, M. a Gotschlich, E., Degradation of a pneumococcal type-specific polysaccharide with exposure of group-specificity Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 67: 138 - 143, (1970)/. Podobně odstranění O-acetátové skupiny u druhu Pnl8C-Ps polysacharidů ničí jeho imunologickou specifitu /Estrada-Parra, S. a Heidelberger, M., The specific polysacharide of type XVIII pneumococcus Biochemistry, 2:1288-1294 (1963)/. Proto bylo důležité vyvinout kvantitativní způsob stanovení acetátu a pyruvátu vPnl8C-Ps aPn4. O-acetylové skupiny v Pn9V mohou také hrát důležitou roli v imunologické struktuře Pn9V, protože de-O-acetylovaný Pn9V nemá antigenní reaktivitu, což se zjistilo rychlostní nefelometrií.

V souvislosti s prací na vynálezu se zjistilo, že O-acetát se snadno uvolní z Pn9V a Pnl8C-Ps v alkalických podmínkách (pH 11) při 4 °C a že O-pyruvát se snadno uvolní z Pn4 při zahřívání při teplotě 65 °C. Zjistilo se také, že acetát apyruvát se dají oddělit od hydrolyzovaného Pn-Ps vzorku s použitím sloupce Omnipac PAX500 při rychlosti průtoku 1 ml/min, přičemž se jako mobilní fáze použije roztoku NaOH o koncentraci 0,98 mM a 2% roztoku MeOH. Detekce se

-56CZ 283284 B6 provádí na základě potlačení vodivosti s použitím roztoku H₂SO₄ o koncentraci 25 mM jako regeneračního činidla při rychlosti průtoku 10 ml/min. Optimální podmínky hydrolýzy pro kvantitativní HPCL analýzu O-acetátu Pnl8C-Ps a Pn9V a O-pyruvátu z Pn4 se uvádějí v tomto příkladu.

Vybavení

Přístroj Dionex BioLC je opatřený OmniPac PAX-500 předkolonou a analytickou kolonou (rozměry 4,6 x 250 mm). Detekce na základě snížení vodivosti se provádí s použitím roztoku kyseliny sírové o koncentraci 25 mM jako regeneračního činidla. Průtoková rychlost se nastaví na 10 ml/min pomoci Dionex autoregenerační jednotky. Program pro mobilní fázi a gradientový program pro separaci acetátu apyruvátu ze vzorku hydrolyzovaného Pn-Ps uvádí následující tabulka

Čas	% fáze 1	% fáze 2	% fáze 3	% fáze 4	průtok (ml/min)
0	98	2	0	0	1
12,5	98	2	0	0	1
12,6	58	2	0	40	1,5
20,0	58	2	0	40	1,5
20,1	98	2	0	0	1,5
30,0	98	2	0	0	1,5
30,1	98	2	0	0	1
50,0	98	2	0	0	1

fáze 1 - lmM roztok hydroxidu sodného fáze 2 - 100% methanol fáze 3 - 200mM roztok hydroxidu sodného fáze 4 - voda

Za těchto podmínek a s použitím detektoru citlivosti 3 pS se snadno mohou detegovat množství 4 nmol acetátu s retenčním časem přibližně 5,2 min nebo 4 nmol pyruvátu s retenčním časem přibližně 9,5 min.

Příprava vzorku

U purifikovaných Pn-Ps vzorků (získaných z Měrek Manufacturing Division) se provede titrace podle Karl-Fischera s použitím Aquastar V 300 volumetrického titrátoru vlhkosti. Touto titrací se stanoví zbytková voda. Potom se vzorky rozpustí v Milli-Q vodě tak, aby jejich koncentrace byla 1,0 mg sušiny/ml. Aby se ze vzorků Pn9V-Ps a Pnl8C-Ps o koncentraci 100 pg/ml odstranil O-acetát, působí se na ně 16 hodin při laboratorní teplotě roztokem NaOH o koncentraci 2 mM. Pn4-Ps vzorky se 16 hodin hydrolyzují roztokem HC1 o koncentraci 1 mM při teplotě 65 °C, aby se z nich odstranil O-pyruvát. U vzorků Pn9V aPnl8C-Ps se sníženou velikostí molekuly au vodného roztoku konjugátu Pnl8C-Ps-OMPC se také provede stanovení obsahu monosacharidů pomocí iontoměničové chromatografie na anexu při vysokém pH s pulsní amperometrickou detekcí. Stanovení obsahu monosacharidů se provádí, aby se zjistila správná koncentrace Pn-Ps ve vzorku se zmenšenou velikostí molekuly a ve vzorku vodného roztoku konjugátu.

Standardy acetátu, pyruvátu a N-acetylmanosaminu se rozpustí v Milli-Q H₂O na koncentraci 200 nmol/ml.

-57CZ 283284 B6

Hydrolýza vzorků a standardů

Podmínky pro de-O-acetylaci Pnl8C-Ps se zkoumají tak, že se na Pnl8C-Ps působí roztokem NaOH o čtyřech různých koncentracích (1,2,5 a 50 mM) při různých teplotách (4,25,45 a 65°C)apo různou dobu (3, 5 a 16 hodin). U standardních roztoků acetátu, pyruvátu a N-acetylmanosaminu se sleduje, zda podmínky nezbytné pro de-O-acetylaci nezpůsobí také degradaci acetátu/pyruvátu nebo ztrátu N-acetylových skupin.

Odstranění pyruvátu z Pn4 se sleduje po zpracování buď roztokem NaOH (o koncentraci 50 mM při 100 °C, 16 hodin), nebo roztokem HC1 při různých koncentracích (1, 10, 100 mM), po různou dobu (3, 5 a 16 hodin) a při různých teplotách (65, 85 a 100 °C).

Rychlostní nefelometrie

Měří se aktivita vzorků Pn9V-Ps, Pnl8C-Ps aPn4-Ps před a po de-O-acetylaci nebo de-Opyruvylaci při rychlostní nefelometrii. Vzorky se zředí na koncentraci 1; 1,5; 2 a 2,5 pg/ml.

Vysokoůčinná chromatografie na principu rozlišení velikosti molekul /High Performance Size Exclusion Chromatography (HPSEC)/

Stanovení pomocí HPSEC u Pn9V-Ps, Pnl8C-Ps aPn4 se provádí před a po de-O-acetylaci nebo de-O-pyruvylaci. Kolona TSK G6000PW o rozměrech 7,5 x 600 mm vybavená omezovačem toku, temperovaná na teplotu 50 °C při tlaku 5,5 až 6,9 MPa se uvede do rovnovážného stavu roztokem octanu sodného o koncentraci 0,2 M při průtoku 0,3 ml/min. Na kolonu se nastříkne 60 pg vzorku (ve formě roztoku o koncentraci 1 mg/ml) a eluuje se mobilní fází při průtoku 0,3 ml/min. Za průchodem kolonou se do eluátu dávkuje roztok NaOH o koncentraci 0,5 M rychlostí 0,5 ml/min. Takto zředěný eluát se sleduje v pulsním amperometrickém detektoru Dionex a měří se jeho Kj.

Zkouška citlivosti a linearity

Linearita a citlivost detektoru se stanoví jak pro pyruvát, tak pro acetát při 3 pS. Nejnižší stanovitelné množství pyruvátu a acetátu je 0,125 nmol. Odezva detektoru pro obě složky je lineární do množství 2 nmol, přičemž korelační koeficient pro pyruvát je 0,9999 a pro acetát 0,9992.

Optimalizace pro vyštěpení 0-acetátu z Pnl8C-Ps

Předběžné studie časového průběhu hydrolýzy Pnl8C-Ps ukázaly citlivost O-acetylskupiny k alkalické hydrolýze při nízkých teplotách. Pro úplnou de-O-acetylaci Pnl8C-Ps při 4 °C postačuje roztok NaOH o koncentraci 2 mM při 16 hodinách inkubace. Hydrolýza při vyšších teplotách (nad 25 °C) způsobí uvolnění N-acetátu z N-acetylmanosaminu, který interferuje se stanovením O-acetátu z Pn9 V. Optimální podmínky hydrolýzy pro stanovení O-acetátu z Pn-Ps jsou teplota 4 °C, doba 16 hodin. Při působení roztoku NaOH o koncentraci 2 mM na standard N-acetylmanosamin při laboratorní teplotě po dobu 16 hodin se odstraní méně než 1 % acetátu.

-58CZ 283284 B6

Optimalizace odstranění O-pyruvátu z Pn4

Počáteční hydrolytické studie se u Pn4 prováděly s použitím roztoku NaOH. Rychle se však zjistilo, že při použití roztoku NaOH se uvolní jen velmi malé množství pyruvátu. Počáteční kontrolní pokusy ukázaly, že pyruvát se odštěpuje z Pn4 ve vodě při teplotě 100 °C. Po získání této informace bylo rozhodnuto provádět optimalizační pokusy pro uvolnění O-pyruvátu z Pn4 hydrolýzou roztokem HC1 při zvýšené teplotě. Při vyšších teplotách dochází k určité degradaci pyruvátu. To se může demonstrovat na vzorku pyruvátového standardu, který se hydrolyzuje za stejných podmínek jako Pn4. Maximum pyruvátu se získá, když se hydrolýza provádí roztokem HC1 o koncentraci 1 mM 16 hodin při 65 °C.

Stanovení O-acetátu a O-pyruvátu v Pn-Ps vzorcích

Různé vzorky, reprezentující Pn-Ps, Pn-Ps se zmenšenou velikostí molekuly ajeden Pnl8C-PsOMPC konjugát se analyzují na obsah O-acetátu a pyruvátu HPLC stanovením popsaným výše v textu. HPLC analýza se provádí po uvolnění O-acetátu zPn9V-Ps/18C roztokem NaOH o koncentraci 2 mM při laboratorní teplotě nebo po uvolnění O-pyruvátu z Pn4-Ps roztokem HC1 o koncentraci 1 mM při teplotě 65 °C. Výsledky tohoto pokusu jsou ukázány dále:

Vzorek

Poměr pyruvát/acetát ku každé Ps opakující se jednotce

Pn4, vzorek 1 Pn4, vzorek 2	1,0 0,8
Pn9 V, vzorek 1 Pn9 V, vzorek 2	1,7 1,5
Pn 18C-Ps, vzorek 1 Pnl8C-Ps, vzorek 2 Pn 18C-Ps, vodný roztok	1,0 0,8 0,5

Výsledky ukazují, že retence vedlejších skupin v Pn-Ps o zmenšené velikosti molekuly je přibližně 90 % pro Pn9V a 80 % pro Pn4 a 18C. Retence O-acetátu v Pn 18C-Ps-OMPC konjugátovém vodném roztoku je přibližně 50 %. Teoretické hodnoty pro Pnl8C-Ps a Pn4 jsou 1 mol acetátu nebo pyruvátu na mol Ps opakující se jednotky a pro Pn9V je tento poměr 2:1. (Jansson, P-E., Lindberg, B. a Lindquist, U. Structural studies of the capsular polysacharides from Streptococcus pneumoniae Type 4 Carbohyd. Res., 95: 73 - 80, (1981). Lugrowski, C. a Jennings, H. J. Structural determination of the capsular polysaccharide of Streptococcus pneumoniae Type 18C. Carbohyd. Res. 131: 119 - 129 (1984). Perry, Μ. B., Daoust, V. a Carlos, D. J. The specific capsular polysaccharide of Streptococcus pneumoniae Type 9V. Can. J. Biochem. 59: 524 - 533, (1981)/. Nižší retence O-acetátu v Pnl8C-Ps-OMPC konjugátu je pravděpodobně způsobena citlivostí O-acetylových skupin na hydrolýzu v alkoholických podmínkách při nízkých teplotách.

Také se měří aktivita vzorků Pn4, Pn9V aPnl8C-Ps a příslušných de-O-pyruvylovaných a de-O-acetylovaných vzorků při rychlostní nefelometrii. Výsledky ukazují, že po odstranění těchto bočních skupin (acetátu a pyruvátu) je ztráta aktivity úplná, dokonce i u vzorků s nezměněnou hodnotou K_d. Hodnoty K_d se získají HPSEC stanovením, které je popsáno výše. Avšak hodnota K_d vzorku Pn4 po de-O-pyruvylaci mírnou kyselou hydrolýzou se zvýší z 0,60 na 0,68. Údaje antigenicity pro Pn4 aPnl8C-Ps podporují studie těch autorů, kteří považují přítomnost těchto skupin (acetátu a pyruvátu) za důležitou pro imunologickou reaktivitu pneumokokových

-59CZ 283284 B6 polysacharidů. Výsledky, získané pro Pn9V nabízejí hypotézu, že kromě glukuronové kyseliny jsou důležitými imunologickými determinanty také O-acetyl-skupiny této molekuly.

Uvedeným způsobem se podařilo vyvinout citlivou metodu kvantitativního stanovení O-pyruvylketalové skupiny v Pn4 aO-acetátové skupiny v Pn9V aPnl8C-Ps. Tato metoda je cenná pro určení správného postupu při zmenšování molekuly a konjugaci Pn4, Pn9V a Pnl8C-Ps tak, aby se zachovala antigenní struktura těchto polysacharidů.

Příklad 31

Izolace Pn6B-Ps-MIEP konjugátu

1) Dva vzorky konjugátové reakční směsi (jeden dialyzovaný proti vodě, druhý nedialyzovaný) se skladují při teplotě 3 až 8 °C až do doby použití.

2) Ke vzorkům se přidá pufr (0,2 MOPS, pH 7, 2) tak, aby se získala konečná koncentrace okolo 7 mM. Ke vzorku se přidá pevný Gu HC1 až do konečné koncentrace 4,2 M.

(Poznámka: mělo by se přidat množství 1,42 g Gu HCl/ml vzorku, aby se kompenzovalo zvětšení objemu způsobené přídavkem pevného Gu HC1. Podobně, přídavek pufru by se měl upravit s ohledem na zvětšení objemu tak, aby složení vzorku bylo podobnější složení eluentu pro kolonu. Alternativně se vzorek může dialyzovat proti eluentu pro kolonu před chromatografií).

3) 2,8 ml vzorku (obsahujícího 1 mg proteinu, což se zjistí stanovením proteinů podle Lowryho) se nastříkne na kolonu o rozměrech 2,6 x 96 cm s náplní sephacryl S-1000. Kolona je uvedena do rovnovážného stavu lOmM pufrem MOPS o pH 7,2 a 6 M GuHCl při rychlosti průtoku 0,6 ml/min. Eluát z kolony se sleduje kontinuálně při vlnové délce 280 nm pomocí detektoru Perkin Elmer LC235 se soustavou diod. Sbírají se frakce o objemu 3 ml.

4) Rozdělení proteinů je podobně jako spektra založeno na A 280 a rozdělení Pn6B-Ps je založeno na testu RIA specifickém pro Pn6B-Ps. Na základě znalosti elučních poloh samotného Pn6B-Ps-BrAc a jeho fyzikálních směsí s inaktivovaným MIEP se spojí frakce obsahující jak Ps, tak protein a ty, které se eluují z jiných poloh než poloh pozorovaných u Pn6B-Ps-BrAc. se předběžně označí za Pn6B-Ps-MIEP konjugát.

5) Spojené roztoky konjugátu se zkoncentrují ultrafiltrací s použitím YM-30 membrány a diafiltrují se při použití Milli-Q vody. Obsah proteinu a Pn6B-Ps se odhadne podle kvantitativních analýz složení. Přítomnost SCMHC se stanoví analýzou aminokyselin.

Příklad 32

Přímé RIA stanovení pneumokokového polysacharidu Pnl8C-Ps

Toto stanovení se používá pro kvantitativní stanovení pneumokokového polysacharidu druhu 18C. Jedná se o RIA stanovení mnohavrstevné, sandvičového typu (multilayer sandwich RIA). Králičí anti-Pn!8C-Ps se zachytí na kuličkách z polystyrenu. Kuličky se inkubují v roztoku

-60CZ 283284 B6 vzorku, obsahujícím Pnl8C-Ps. Po inkubaci se kuličky promyjí a inkubují se ještě jednou v druhém roztoku, který obsahuje myší protilátku kPnl8C-OMPC. Po této inkubaci se kuličky promyjí a inkubují se potřetí v roztoku, který obsahuje značený ¹²⁵I-kozí anti-myší IgG. Kuličky se ještě jednou promyjí a potom se převedou do zkumavek z umělé hmoty, kvůli počítání. 5 Při kvantitativním stanovení se neznámé Pni 8C-Ps vzorky porovnají se standardní křivkou.

Vybavení ίο 1. Souprava pro RIA stanovení: Abbot Labs,. Diagnostic Div., katalogové číslo 6171-10

2. Qwik Wash systém (Abbot Labs, Diagnostic Div.)

3. Upravitelné pipety a pipetové špičky pro jedno použití (Eppendorf digital)

4. Gamma počítač (Abbott Autologic)

5. 6,35 mm polystyrénové perly se zrcadlovým leskem (Precision Plastic Balí Co., 3000 N.

Cicero Ave., Chicago, Illinois 60641, USA)

Činidla

1. Anti-Pnl8C-Ps protilátka šarže R18-44 nebo její ekvivalent (New York Statě Health

Services)

2. Myší anti-Pnl8C-Ps OMPC antisérum (spojený produkt 11260-235 nebo jeho ekvivalent)

3. Kozí anti-myší IgG ¹²⁵I-značené antisérum (NEX 159, New England Nuclear 549 Albany Street, Boston, MA, 02118, USA)

4. Inkubační pufr: RCM8 obsahující 1,0 % BSA Sigma A2153

0,1 % azidu Sigma S2002

5. Ředidlo dílů fetálního telecího séra

1 díl kozího séra díl králičího séra

0,05 % TWEEN 20

0,1 % azidu

Sigma F3885

Sigma G6767

Sigma R4505

Sigma PÍ379

Sigma S2002

3. Přidá se 1 kulička se zachyceným anti-Pnl8C-Ps do každé jamky na misce, která obsahuje vzorek nebo standard a miska se mírně míchá, aby se zajistilo úplné pokrytí všech kuliček pufrem.

4. Miska se zakryje lepivým krytem z RIA soupravy a 6 hodin se inkubuje při laboratorní teplotě.

5. Miska se promyje v přístroji Qwik Wash deionizovanou vodou.

6. Myší anti-18C protilátka se zředí 1 : 1 000 ředidlem.

7. 200 μΐ tohoto roztoku se přidá do každé jamky obsahující kuličku.

8. Miska se zakryje a inkubuje přes noc při laboratorní teplotě.

9. Miska se promyje v přístroji Qwik Wash deionizovanou vodou.

10. ^I25I značená kozí anti-myší protilátka se zředí ředidlem asi 1 : 160 na koncentraci 15 000 cpm/μΐ.

-61 CZ 283284 B6

11. 20 μΐ tohoto roztoku se přidá do každé jamky obsahující kuličku.

12. Miska se zakryje a inkubuje 2 hodiny při teplotě 37 °C.

13. Miska se promyje v přístroji Qwik Wash deionizovanou vodou.

14. Kuličky se převedou do zkumavek z umělé hmoty zRIA soupravy a na vhodném gama počítači se určí počet rozpadů.

Výpočet

1. Z měření prováděných dvojmo pro každý vzorek, standard a slepý pokus (inkubační pufr) se vypočte průměr. Od hodnot vypočtených pro standardy a vzorky se odečte hodnota pro slepý pokus.

2. Do kalkulátoru vybaveného pro statistické výpočty se vloží data pro standardní křivku a vypočte se korelační koeficient a směrnice přímky.

3. S použitím vhodné standardní křivky (zvláštní pro volné a konjugované vzorky) se vypočte odezva vzorků a provedou se korekce na zředění.

Stejný postup jako je postup výše popsaný se může použít pro jakýkoliv Pn-Ps s tím, že se odpovídajícím způsobem nahradí druhově specifická činidla.

Claims (15)

1. Konjugát, obsahující imunogenní protein, kterým je proteinový komplex vnější membrány (OMPC) Neisseria meningitidis b, nebo jeho podjednotka MIEP, kde MIEP znamená hlavní protein zvyšující imunitu, kde protein je kovalentně vázaný s polysacharidem, odvozeným od jednoho nebo více poddruhů Streptococcus pneumoniae, přičemž uvedený polysacharid obsahuje v průměru méně než 1200 opakujících se jednotek na molekulu, jeho molekulová hmotnost leží mezi 1 x 10⁵ a 1 x 10⁶, polydisperzita mezi 1,0 a 3,0 a hladina kontaminace pneumokokovým skupinově specifickým C-polysacharidem je nižší než 3 % tohoto druhově specifického polysacharidu.

2) částečnou hydrolýzu Pn-Ps v roztoku na předem stanovenou konečnou hodnotu viskozity, která je zvolena tak, že po hydrolýze se schopnost Pn-Ps vázat anti-pneumokokovou druhově specifickou protilátku nesníží o více než 30 % ve srovnání se surovým Pn-Ps, přičemž tato hydrolýza se provádí:

*) zahříváním při teplotě 50 až 150 °C po dobu jedné až 48 hodin; nebo **) sonifíkací po dobu 5 saž 5 min, v závislosti na nastavené intenzitě sonifikace, následovanou ochlazením a další sonifíkací;

***) působením střižných sil v Gaulinově lisu při tlaku 13,74 až 103,05 MPa;

c) frakcionaci hydrolyzovaného Pn-Ps a výběr frakce s molekulovou hmotností mezi 1 x 10⁵ a 1 x 10⁶ pomocí

i) postupu založeného na různé rozpustnosti v alkoholu s použitím isopropylalkoholu v koncentracích předem určených pro srážení Pn-Ps o žádané velikosti molekul nebo ii) frakcionace s využitím kapalinové chromatografie na koloně schopné pojmout a rozlišit molekuly polysacharidů o velikosti v rozmezí 5 x 10⁴ až 1 x 10⁶;

přičemž konečná hranice pro hydrolýzu nebo působení střižných sil se stanoví viskozimetricky při koncentraci Pn-Ps 1 mg/ml v roztoku o koncentraci fosforečnanu sodného 0,lM apH 7,2 nebo chromatograficky pro každý uvedený polysacharid podle konečných hodnot, které jsou pro jednotlivé poddruhy Pn-Ps uvedeny v následujícím seznamu

Pn-Ps poddruh Cílová konečná hodnota viskozity.10⁶ (m².s’) Cílová konečná hodnota Kd, pík Pn-4-Ps 1,5 až 1,00 0,65 ± 0,05 Pn6B-Ps 1,3 až 1,00 0,60 ± 0,05 Pn9V-Ps 1,3 až 1,00 0,65 ± 0,05 Pnl4-Ps 1,1 až 0,95 0,60 ± 0,05 Pnl8C-Ps 1,5 až 1,00 0,65 ± 0,05 Pnl9F-Ps 1,3 až 1,00 0,65 ± 0,05 Pn23F-Ps 1,5 až 1,00 0,54 ± 0,05,

kde Pn-Ps má shora uvedený význam.

2. Konjugát podle nároku 1, v němž má uvedený polysacharid hodnotu antigenicity mezi 0,4 a 1,1. ’ ·

3. Konjugát podle nároku 1, v němž má uvedený polysacharid hodnotu indexu antigenicity mezi 0,7 a 1, a vnitřní viskozitu mezi 0,6 a 3,0 dl/g.

4. Konjugát podle nároků 1 nebo 3, v němž je uvedený polysacharid odvozen od jakéhokoliv poddruhu Streptococcus pneumoniae vybraného ze skupiny 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 1 IA, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19F, 19A, 20, 22F, 23F a 33F.

5. Konjugát podle nároku 4, v němž uvedený polysacharid má polydisperzitu mezi 1,0 a 3,0, hladinu kontaminace C-polysacharidem nižší než 3 %, vztaženo na druhově specifický polysacharid aje odvozen od

-62CZ 283284 B6

i. Streptococcus pneumoniae 6B, přičemž v tomto případě má polysacharid

a) hodnotu Mn mezi 3 x 10⁵ a 6 x 10⁵;

b) hodnotu Kj, pík, 0,60 ± 0,05;

c) hodnotu M_w mezi 3 x 10⁵ a 7 x 10⁵;

d) vnitřní viskozitu v roztoku o koncentraci fosforečnanu sodného 0,lM apH 7,2 mezi 1,0 a 2,0 dl/g; a

e) v průměru méně než 1000 opakujících se jednotek na molekulu;

ii. Streptococcus pneumoniae 14, přičemž v tomto případě má polysacharid

a) hodnotu M_N mezi 3 x 10⁵ a 8 x 10⁵;

b) hodnotu Kj, pík, 0, 60 ± 0, 05;

c) hodnotu M_w mezi 4 x 10⁵ a 1 x 10⁶;

d) vnitřní viskozitu v roztoku o koncentraci fosforečnanu sodného 0,lM apH 7,2 mezi 0,6 a 1,6 dl/g; a

e) v průměru méně než 1200 opakujících se jednotek na molekulu;

iii. Streptococcus pneumoniae 19 F, přičemž v tomto případě má polysacharid

a) hodnotu M_N mezi 2 x 10⁵ a 6 x 10⁵;

b) hodnotu K<j,pík, 0,65 ± 0, 05;

c) hodnotu Mw mezi 2 x 10⁵ a 6 x 10⁵;

d) vnitřní viskozitu v roztoku o koncentraci fosforečnanu sodného 0,lM apH 7,2 mezi 1,0 a 2,0 dl/g; a

e) v průměru méně než 1000 opakujících se monomemích jednotek na molekulu;

iv. Streptococcus pneumoniae 23 F, přičemž v tomto případě má polysacharid

a) hodnotu M_N mezi 2 x 10⁵ a 6 x 10⁵;

b) hodnotu K^, pík, 0, 54 ± 0, 05;

c) hodnotu M_w mezi 4 x 10⁵ a 8 x 10⁵;

d) vnitřní viskozitu v roztoku o koncentraci fosforečnanu sodného 0,lM apH 7,2 mezi 1,5 a 3,0 dl/g; a

e) v průměru méně než 1000 opakujících se monomemích jednotek na molekulu;

v. Streptococcus pneumoniae 4, přičemž v tomto případě má polysacharid

a) hodnotu M_N mezi 2 x 10⁵ a 4 x 10⁵;

b) hodnotu Kj, pík, 0,65 ± 0,05;

c) hodnotu M_w mezi 2 x 10⁵ a 5 x 10⁵;

d) vnitřní viskozitu v roztoku o koncentraci fosforečnanu sodného 0,lM apH 7,2 mezi 1,0 a 3,0 dl/g; a

e) v průměru méně než 600 opakujících se monomemích jednotek na molekulu;

vi. Streptococcus pneumoniae 9 V, přičemž v tomto případě má polysacharid

a) hodnotu Mn mezi 3 x 10⁵ a 6 x 10⁵;

b) hodnotu K_d, pík 0,65 ± 0,05;

c) hodnotu M_w mezi 3 x 10⁵ a 7 x 10⁵;

d) vnitřní viskozitu v roztoku o koncentraci fosforečnanu sodného 0,lM apH 7,2 mezi 1,0 a 2,0 dl/g; a

e) v průměru méně než 800 opakujících se monomemích jednotek na molekulu;

-63 CZ 283284 B6 vii. Streptococcus pneumoniae 18C, přičemž v tomto případě má polysacharid

a) hodnotu M_N mezi 2 x 10⁵ a 6 x 10⁵;

b) hodnotu K<j,pík, 0,65 ± 0,05;

c) hodnotu M_w mezi 2 x 10⁵ a 6 x 10⁵;

d) vnitřní viskozitu v roztoku o koncentraci fosforečnanu sodného 0,lM apH 7,2 mezi 1,5 a 3,0 dl/g; a

e) v průměru méně než 700 opakujících se monomemích jednotek na molekulu;

nebo směs kterýchkoliv z těchto polysacharidů.

6. Konjugát podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, v němž má uvedený polysacharid hodnotu polydisperzity mezi 1,0 a 1,4.

7. Konjugát podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, v němž je protein vázán k uvedenému polysacharidů pomocí dvojvazných mezemíků, obsahujících thioetherovou skupinu a primární aminoskupinu, které tvoří hydrolyticky labilní kovalentní vazby mezi polysacharidem a proteinem.

8. Konjugát podle nároku 7, v němž je protein vázán k pneumokokovému polysacharidů pomocí mezemíků obsahujícího řetězec vzorce

-COCHCH₂CH₂SCH₂CONH(CH₂)₄NHCONHCOCHj.

9. Konjugát podle nároku 7, v němž je protein PRO vázán k pneumokokovému polysacharidů Pn-Ps pomocí mezemíků, jehož složení je zřejmé ze vzorce

PRO-N-COCHCH₂CH₂SCH₂CONH(CH₂)₄-NHC-O-Pn-Ps

I II

H NHCOCH,O v případě vazeb zprostředkovaných hydroxylovými skupinami polysacharidů, nebo

PRO-N-COCHCH₂CH₂SCH₂CONH(CH₂)₄-NHC-Pn-Ps

H NHCOCH3O v případě polysacharidů nesoucích karboxylové skupiny.

10. Konjugát podle nároků 7, 8 nebo 9, kde v konjugátu je hmotnostní poměr Pn-Ps : OMPC nebo Pn-Ps : MIEP mezi asi 0,05 a 0,5 a po hydrolýze a analýze aminokyselin je poměr SCMHC/lys mezi 0,01 a 0,15, přičemž SCMHC znamená S-karboxymethylhomocystein a lys znamená lysin.

11. Způsob výroby konjugátu podle nároku 1, vyznačující se tím, že zahrnuje

a) izolaci surového pneumokokového polysacharidů Pn-Ps;

b) částečnou hydrolýzu nebo mechanické smykové zpracování surového Pn-Ps;

-64CZ 283284 B6

c) derivatizaci frakcionovaného Pn-Ps odvozeného od jednoho nebo více pneumokokových poddruhů, získaného podle kroků a) až b) za účelem zavedení vyčnívajících bočních nukleofilních nebo elektrofilních skupin ;

d) izolaci OMPC nebo jeho podjednotky z Neisseria meningitidis;

e) funkcionalizaci OMPC nebo jeho podjednotky za účelem zavedení reaktivních elektrofilních nebo nukleofilních skupin;

f) konjugaci polysacharidu z kroku c) s proteinem z kroku e);

g) blokování konjugátu pro odstranění zbytkových funkčních skupin;

h) izolaci konjugátového produktu, kde OMPC a Pn-Ps mají shora uvedený význam.

12. Způsob výroby konjugátu podle nároku 1, vyznačující se tím, že zahrnuje

a) kultivaci pneumokoků a izolaci surového pneumokokového polysacharidu nebo solubilizaci práškového pneumokokového polysacharidu;.

b) purifikaci a částečnou hydrolýzu polysacharidu z kroku a) až po předem stanovenou hranici, za vzniku polysacharidu schopného konjugace, který neztratil více než 30 % polysacharidové druhově specifické antigenicity ve srovnání se surovým polysacharidem z kroku a); a

c) konjugaci produktu z kroku b) s imunogenním proteinem;

přičemž pneumokoky kultivované v kroku a) zahrnují alespoň jeden poddruh zvolený ze skupiny obsahující poddruhy 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F a 23F; Pn-Ps si zachovává svou antigenní integritu, podle měření Ouchterlonyho dvojitou imunodifúzní zkouškou nebo rychlostní nefelometrií s použitím anti-Pn-Ps druhově specifické protilátky; a Pn-Ps se před konjugací fyzikálně zpracovává smykem vGaulinově lisu při tlaku mezi 13,74 a 103,05 MPa nebo se hydrolyzuje zahříváním při 100 °C po dobu 24 hodin nebo působením ultrazvuku, až se dosáhne při koncentraci Pn-Ps 1 mg/ml v roztoku chloridu sodného o koncentraci 0,9 M konečné hodnoty viskozity nebo K._d, pík, které pro každý Pn-Ps poddruh uvádí následující seznam

Pn-Ps Cílová konečná hodnota Cílová konečná hodnota

poddruh viskozity. 10⁶ (m².s'’) K_d, pík Pn-4-Ps 1,5 až 1,00 0,65 ± 0,05 Pn6B-Ps 1,3 až 1,00 0,60 ± 0,05 Pn9V-Ps 1,3 až 1,00 0,65 ± 0,05 Pnl4-Ps 1,1 až 0,95 0,60 ± 0,05 Pnl8C-Ps 1,5 až 1,00 0,65 ± 0,05 Pnl9F-Ps 1,3 až 1,00 0,65 + 0,05 Pn23F-Ps 1,5 až 1,00 0,54 ± 0,05.

13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že kroky b) a c) zahrnují

b) 1) případnou adsorpci aniontových nečistot na diethylaminoethylcelulose, přičemž pH roztoku je 5;

-65CZ 283284 B6

14. Vakcínový přípravek, vyznačující se t í m , že obsahuje konjugát podle nároku 1 a inertní nosič, kterým je hydroxid hlinitý, fosforečnan hlinitý nebo oxid hlinitý, přičemž konjugát obsahuje jeden až všechny konjugáty vybrané ze skupiny obsahující Pn4-Ps-OMPC, Pn6B-Ps-OMPC, Pn9V-Ps-OMPC, Pnl4-Ps-OMPC, Pnl8C-Ps-OMPC, Pnl9F-Ps-OMPC, Pn23F-Ps-OMPC, Pnl-Ps-OMPC, Pn5-Ps-OMPC, Pn7F-Ps-OMPC.

15. Použití konjugátu podle některého z nároků 1 a 10, přičemž konjugát obsahuje jeden až všechny konjugáty vybrané ze skupiny obsahující Pn4-Ps-OMPC, Pn6B-Ps-OMPC, Pn9V-PsOMPC, Pnl4-Ps-OMPC, Pn 18C-Ps-OMPC, Pnl9F-Ps-OMPC, Pn23F-Ps-OMPC, Pnl-PsOMPC, Pn5-Ps-OMPC, Pn7F-Ps-OMPC, pro výrobu kombinovaného vakcínového přípravku proti Pneumococcus a jedné až všem dalším chorobám zvoleným ze souboru zahrnujícího

-66CZ 283284 B6 hepatitis B, hepatitis A, hepatitits non-A non-B, AIDS, záškrt-čemý kašel-tetanus, spalničky, příušnice, zarděnky, plané neštovice, dětskou obrnu a Haemophilus influenzae b.