DE69223138T2

DE69223138T2 - Verfahren und vorrichtung zum reihensichten mikroskopischer zellen unter verwendung von techniken zur streuung polarisierten lichts

Info

Publication number: DE69223138T2
Application number: DE69223138T
Authority: DE
Inventors: James Hudson; Carlos Rodriguez; Thomas Russell
Original assignee: Coulter Corp
Current assignee: Coulter Corp
Priority date: 1991-02-22
Filing date: 1992-02-14
Publication date: 1998-06-10
Anticipated expiration: 2012-02-15
Also published as: AU1459392A; CN1067965A; TW215898B; DE69223138D1; ATE160170T1; JPH06505099A; WO1992014812A1; EP0574508B1; EP0574508A1; EP0574508A4

Description

Technisches Gebiet

Diese Erfindung bezieht sich allgemein auf ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Auslese- bzw. Abbildung von mikroskopischen Zellen, die ausgewählte Charakteristiken ausdrücken, und zwar unter Verwendung von Streuungstechniken mit polarisiertem Licht. Insbesondere ist die Erfindung auf eine Analyse von einer oder mehreren interessanten Zellengruppen gerichtet, die in einer Zellenpopulation versteckt bzw. abgedeckt sind, und zwar durch Verwendung von Mikrosphären mit monoklonalen Antikörpern, die daran gebunden sind, um die abgefühlten Merkmale von jeder speziellen Zelle zu verändern, um die Zellen der interessanten Zellengruppe von der Zellenpopulation zu unterscheiden.

Technischer Hintergrund

Diese Erfindung bezieht sich allgemein auf eine automatisierte Analysevorrichtung und Verfahren zur Anwendung derselben zur Auslese bzw. Abbildung von biologischen Zellen oder geformten Körpern bzw. Zellgebilden zum Auszählen der Populationen, die ausgewählte Charakteristiken ausdrücken, und zwar zu Forschungs-, Diagnose-, medizinischen oder industriellen Zwecken. Insbesondere ermöglichen die automatisierten Analysevorrichtungen und Verfahren, die die Erfindung verkörpern, Mehrfachteilklassifikationen von Zellen und Zellgebilden, eine funktionale Phenotypisierung von Zellen und Zellgebilden, die Typisierung von Leukämie-, Lymphom- und festen Tumorzellen, und zwar unter anderem, unter Verwendung einer einzigartigen Kombination von elektronischer Technologie und der Spezifität bzw. Eigenheit von selektiven biologischen Molekülen, wie beispielsweise Antikörpern, für eine solche Auslese bzw. Abbildung und selektive Auszählung der Zellen und Zellgebilden.
Eine Automatisierung einer routinemäßigen vollständigen Blutzellenanalyse (CBC-Analyse, CBC = complete blood cell) von menschlichem Peripherie- bzw. umlaufendem Blut durch einen automatisierten Blutzellen- bzw. Blutkörperchenzähler wurde erfolgreich vom Coulter Counter-Modell A (eingetragene Handelsmarke) von Coulter Electronics, Inc., Hialeah, Florida, erreicht. Das Prinzip des elektronischen Partikelabfühlsystems dieses Instrumentes ist im US-Patent 2 656 508 offenbart, welches am 20. Oktober 1953 an Wallace H. Coulter ausgegeben wurde. Dieses Coulter-Abfühlprinzip wurde entwickelt und auf kompliziertere Instrumentierung ausgedehnt, wie beispielsweise die COULTER COUNTER (eingetragene Handelsmarke) Modell S-Typen der Instrumente, die durch spezielle Computerprogramme die Bestimmung von CBC-Parametern, absolute Zellen- bzw. Körperchenzählungen, eine Plättchenzählung und eine Morphologie, eine Morphologie der roten Blutkörperchen, (RBC-Morphologie, RBC = red blood cell) eine Interpretation von normalen und abnormalen Blutproben ermöglichten.
Das Coulter Electronic-Partikelabfühlprinzip setzt eine Apertur bzw. Öffnungsabfühlschaltung unter Verwendung einer Gleichstrom- (DC- = direct current) Aperturversorgung ein. Solche Partikelsensoren sind in der Struktur einfach, extrem belastungsfähig und zuverlässig, wie durch die im wesentlichen allgemeine Akzeptanz der COULTER COUNTER (eingetragene Handelsmarke) Automatenanalysevorrichtung in Kliniklaboratorien in den Vereinigten Staaten und im Rest der Welt bescheinigt wird. Eine Verbesserung dieser grundlegenden Aperturabfühlschaltung wurde im US- Patent 3 502 974 offenbart, welches 1970 an Wallace Coulter und Walter Hogg ausgegeben wurde. Zusätzlich zur der herkömmlichen Gleichstrom-Aperturversorgung wurde ein Hochfrequenz-Aperturstrom angelegt, der das Abfühlen von zusätzlichen Parametern für Klassifizierungszwecke ermöglichte. Der Hochfrequenz-Aperturstrom erzeugte ein Sig nal, welches die Funktion der inneren Leitfähigkeit der Blutzellen bzw. Blutkörperchen ist, genauso wie ihres Volumens. Das gleichzeitige von der Gleichstrom-Aperturschaltung erzeugte Signal ist ein herkömmliches DCbzw. Gleichstrom-Amplitudensignal, welches primär eine Anzeige des Zell- bzw. Körperchenvolumens liefert. Die Radiofrequenz- bzw. Hochfrequenzamplitude wird durch die Gleichstrom-Impulsamplitude geteilt, und zwar unter Einsatz einer Hochgeschwindigkeits-Teilerschaltung, um einen Quotienten zu erhalten, der eine Funktion des Zellvolumens und eines inneren Widerstandes ist, auf den im allgemeinen als "Opazität" bzw. Undurchsichtigkeit Bezug genommen wird. Dieses Prinzip wird weiter im US-Patent 3 502 973 beschrieben, welches auch an Wallace Coulter und Walter Hogg 1970 ausgegeben wurde. Dieser Opazitäts parameter besitzt eine Anwendbarkeit in Zellenklassifikationssystemen. Entweder könnten eine einzige oder ein Paar von getrennten Aperturen für diesen Zweck verwendet werden.
Die Klassifizierung von unterschiedlichen Populationen wird durchgeführt durch Vergleichen der Daten von Signalpaaren, wenn sie erzeugt werden; eines eine Messung des Partikelvolumens und das andere eine Messung des inneren Zellwiderstands bzw. des spezifischen Zellwiderstandes oder der Opazität Eine angenehme Form zur Darbietung dieser Daten ist durch zweidimensionale Aufzeichnungen bzw. Kurven, auf die als Scatter-Kurven bzw. Streuungskurven oder Scattergramme Bezug genommen wird. Solche Kurven werden gut beschrieben in "Flow Cytometry and Sorting", Seite 371, herausgegeben von Melamed Melaney und Medelsohn, 1979, John Wiley & Sons, NY. NY.
Anfängliche Anwendungen des Coulter Electronic-Partikelabfühlprinzipes war es, Zählungen von roten Blutkörperchen auszuführen, und dann kompliziertere Bestimmungen von anderen Parametern von roten Blutkörperchen. Durch Entfernen der roten Blutkörperchen aus dem gesamten Umlauf bzw. Peripherieblut konnte eine Analyse der Populationen der weißen Blutkörperchen durchgeführt werden, so lang die Entfernung der roten Blutkörperchen nicht wesentlich die Eigenschaften der restlichen Populationen von weißen Blutkörperchen beeinflußte, die gemessen werden sollten. Lysisreagenten bzw. Lysisreaktionsmittel für rote Blutkörperchen wurden zu diesem Zweck entwickelt, die, obwohl sie nützlich sind und weithin angewendet werden, nicht vollständig zufriedenstellend in jeder Beziehung für darauffolgende Bestimmungen von weißen Blutkörperchen sind.
Vorherige Verfahren der Flußanalyse von Leukozyten unter Verwendung eines DC- bzw. Gleichstromvolumens alleine oder einer Lichtbrechung bei verschiedenen Winkeln haben drei Ansammlungen von Leukozyten entsprechend Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten gezeigt, die die neutrophilen, basophilen und eosinophilen Populationen umfaßten. Eine grobe jedoch nützliche Abschätzung der eosinophilen Konzentration kann bei manchen Proben vorgenommen werden. Die fünfte Hauptpopulation, Basophile, ist für diesen Ansatz relativ zu klein. Die Eosinophilen sind auch als eine getrennte Ansammlung unter Verwendung von speziellen Fluoreszenztechniken beobachtet worden.
Immunologische Studien sind auch wichtig, wenn Anomalien bei einer Peripherie- bzw. Umlaufblutverschmierung gefunden werden. Es ist nötig, die spezielle Unterart von Leukämie zu bestimmen, um besser ein Behandlungsverfahren für die Krankheit auszuwählen, und um dem Patienten eine so spezifische Vorhersage wie möglich zu bieten. Beispielsweise ist bei Formen von akuter Leukämie ein Vorherrschen von Blastozyten im peripheren Blut vorhanden. Diese unreifen Zellen können schwierig entweder als lymphozytisch oder granulozytisch zu klassifizieren sein, und zwar wegen des Mangels an Unterschied. Falls befunden wird, daß die Blastozytenunterpopulation, die sich schnell fortpflanzt, den Th-Rezeptor trägt, kann die Leukämie als akute lymphoblastische Leukämie der T- Zellenart klassifiziert werden. Im allgemeinen hat die T- Auskleidungs-ALL eine schlechtere Prognose als die B Auskleidungs-ALL. Darüber hinaus ist die Untergruppierung dieser Leukämien gemäß ihres Unterscheidungsniveaus auch üblich. Die Gruppen I und II zeigen Antigene, die bei früheren thymischen Vorläuferzellen zu sehen sind, während jene, die in Gruppe III eingeteilt bzw. ausgedrückt werden, ähnlich den Oberflächenantigenen sind, die bei reifen T-Zellen zu finden sind. Eine Information wie diese bezüglich der Oberflächenantigene, die auf leukämischen Zellen ausgedrückt sind, ist nützlich für die Prognose und Behandlung des Patienten.
Immunologische Experimente wurden zuerst unter Verwendung eines Lichtmikroskopes zur Bestimmung von Lymphozytenuntersätzen entwickelt. Eine Rosettenbildung zwischen menschlichen Lymphozyten und roten Blutkörperchen bzw. -zellen von Schafen wurde von Coombs und anderen 1970 beobachtet. Spätere Studien fanden heraus, daß alle oder zumindest ein Hauptteil der thymus-geprägten Lymphozyten (T-Zellen) unter den ordnungsgemäßen Bedingungen das Rosettenbildungsphänomen zeigten. Diese Studien verwendeten Ficoll-isolierte Lymphozyten und wurden für eine Zeitperiode routinemäßig für die Untersatzklassifikation von isolierten Lymphozyten eingesetzt, und zwar unter Verwendung eines Lichtmikroskopes.
Lymphozytenuntersätze werden nun herkömmlicherweise durch fluoreszente Bezeichnung der Zellen bestimmt, und zwar in einer Probe mit einem fluoreszent-angehängten monoklonalem Antikörper. Der fluoreszent-angehängte monoklonale Antikörper bindet sich mit dem interessanten Antigen auf der Oberfläche der Zellen, was das Antigen ausdrückt bzw. bezeichnet. Die Zellenprobe wird dann durch Verwendung eines Fluoreszenzmikroskopes oder durch Anwendung eines hochkomplizierten Flußzytometrieinstrumentes analysiert. Wenn man ein Flußzytometrieinstrument verwendet, müssen die Zellen- bzw. Körperchen Probenvorbereitung, die Datenaufnahme und die Datenanalyse durch einen speziell ausgebildeten Techniker ausgeführt werden. Das Flußzytometrieinstrument weist einen Laser und ein komplexes optisches System auf, einen Hochleistungscomputer und elek trische und Strömungsmittelsysteme. Die Komponentensysteme des Flußzytometrieinstrumentes müssen ordnungsgemäß instandgehalten werden und auf regelmäßiger und häufiger Basis kalibriert werden. Obwohl das Flußzytometrieinstrument gegenwärtig das Referenz-Lymphozytenuntersatz Bestimmungsverfahren ist, hat das Verfahren verschiedene Nachteile einschließlich der hohen Kosten des Instrumentes und dem Expertenwissen, welches erforderlich ist, um korrekt ein solches Instrument zu betätigen.
Lymphozytenuntersätze können auch unter Verwendung von automatisierten Instrumenten und Verfahren bestimmt werden, die von der Anmelderin der vorliegenden Anmeldung, Coulter Electronics, Inc., entwickelt wurden. Ein verbessertes einfaches automatisiertes Instrument und Verfahren zur Anwendung dieses werden offenbart in der US- Serien-Nr. 587 646, eingereicht am 20. September 1990 (US-A-5223398), betitelt "AUTOMATED ANALYZER AND METHOD FOR SCREENING ZELLS OF FORMED BODIES FOR ENUMERATION OF POPULATIONS EXPRESSING SELECTED CHARACTERISTICS" die eine Fortsetzung der US-Serien-Nr. 025 345 ist, eingereicht am 13. März 1987 (WO-A-8807199), und zwar mit dem gleichen Titel. Diese Anmeldung kombiniert die Anwendung von elektronischen Abfühlprinzipien der Spezifität von ausgewählten biologischen Molekülen zur Identifizierung und/oder Auszählung der definierten Populationen von Zellen oder geformten Körpern bzw. Zellgebilden und die mikroskopische Partikeltechnologie. Die automatisierte Analysevorrichtung kann zusammen mit einem speziellen Lysisreaktionsmittel und/oder Antikörpern verwendet werden, die an mikroskopische Mikrosphären bzw. Mikrokügelchen oder Träger von variierender Zusammensetzung gekoppelt sind.
Eine zweite Anmeldung, US-Serien-Nr. 285 856, eingereicht am 16. Dezember 1988 (WO-A-9007259), betitelt "METHOD AND APPARATUS FOR SCREENING CELLS OR FORMED BODIES WITH POPULATIONS EXPRESSING SELECTED CHAAACTERISTICS", offenbart die Abbildung bzw. Auslese von direkten Untersätzen von Vollblutproben oder Teilen davon.
Eine dritte Anmeldung, US Serien-Nr. 339 156, eingereicht am 14. April 1989 (WO-A-9013013) betitelt "METHOD AND APPARATUS FOR SCREENING CELLS OR FORMED BODIES WITH POPULATIONS EXPRESSING SELECTED CHARACTERISTICS UTILIZING AT LEAST ONE SENSING PARAMETER" offenbart mehrteilige oder fünfteilige Differentiale für weiße Blutkörperchen, Lymphozytenuntersätze und Überlappungsbestimmungen, die an einer Vollblutprobe oder an einer Probe ausgeführt wurden, bei der die roten Blutkörperchen und/oder Populationen der weißen Blutkörperchen entfernt wurden, und zwar durch Eliminieren der Populationen und/oder von Untersätzen davon, mit einem oder mehreren Licht- oder Elektronikparametern.
Eine vierte Anmeldung, US-Serial Nr. 07/525 231, eingereicht am 17. Mai 1990 (WO-A-9118086) betitelt "METHOD AND APPARATUS FOR SCREENING OBSCURED OR PARTIALLY OBSCURED CELLS", offenbart eine Analyse von verdeckten bzw. versteckten Zellen durch Anwendung von Mikrosphären bzw. Mikrokügelchen, an die spezielle monoklonale Antikörper gebunden sind, um die abgefühlten Charakteristiken der verdeckten Zellen von einem Zellenpopulationsgebiet in einem Scattergramm zu einem anderen Gebiet zu bewegen.
Ein verbessertes analytisches Hämatologieinstrument und Verfahren zur Anwendung dieses wird offenbart in der US- Serien-Nr. 025 442, eingereicht am 13. März 1987, die die US-Serien-Nr. 129 954, eingereicht am 4. Dezember 1987 (WO-A-8807198) fortsetzt, die beide betitelt sind "MULTIPART DIFFERENTIAL ANALYZING APARATUS UTILIZING LIGHT SCATTER TECHNIQUES". Dieses sogenannte VCS- Hämatologieinstrument verwendet Lichtstreuung und elektronische Abfühltechniken, um eine mehrteilige Unterscheidung bzw. ein mehrteiliges Differential der Leukozyten-(L-) Population von weißen Blutkörperchen zu erhalten. Dieses Hämatologieinstrument jedoch führt keine Unterscheidung der L-Untersätze aus, da solche Untersätze in der L-Population versteckt sind.
Eine andere damit in Beziehung stehende Anmeldung, US- Serien-Nr. 617 075, eingereicht am 23. November 1990, (WO-A-9209682) betitelt "METHOD AND APPARATUS FOR SCREENING MICROSCOPIC CELLS UTILIZING LIGHT SCATTER TECHNIQUES", verwendet Lichtstreuungstechniken, um sowohl Bestimmungen von L-Untersätzen als auch von überlappenden Untersätzen zu erhalten.
Das selektive Anbringen von mikroskopischen Partikeln macht die Modifikation des Parameters (der Parameter) möglich, die für die ursprüngliche Anordnung von zumin dest einer der Populationen verantwortlich ist. Die Zugabe einer Vielzahl von mikroskopischen Partikeln zu jeder Zelle von ausgewählten Zielpopulationen, wo diese Hinzufügung das gemessene Volumen und/oder die Opazität beeinflußt, hat eine Verschiebung der Stellen der Punkte in dem Scattergramm zur Folge, die eine Population darstellen.
Antikörper von bekannter Art bzw. Spezifität werden beim Beschichten von mikroskopischen Partikeln eingesetzt. Diese Beschichtung gibt dem Partikel die Fähigkeit, sich selektiv an gewisse Zellen anzukoppeln bzw. anzuhaften, die das Antigen ausdrücken, für die der Antikörper spezifisch ist. Diese beschichteten oder angehängten Zellen sind eine Kombination von Partikeln und Zellen, die sich wie eine neue Einheit benehmen. Ihre Parameter von Opazität, Volumen oder sowohl Opazität als auch Volumen können als dargestellt von der Summe der Effekte von sowohl den Zellen als auch den Partikeln in den erhaltenen Signalen angesehen werden. Wenn die Charakteristiken bzw. Merkmale der Komponenten unterschiedlich sind, wird sich die neue Einheit zu einer neuen Position in Übereinstimmung mit dem Netto- bzw. Endeffekt bewegen. Die neue Stelle sollte im Gegensatz zu der früheren Position der Zelle allein eine Klassifikation einer solchen neuen Einheit oder Gruppe von neuen Einheiten gestatten. Wenn die an den Zellen angebrachten Partikel magnetisch sind, dann können natürlich gemäß der gegenwärtigen Praxis die neuen Einheiten durch Anwendung eines Magneten eingefangen werden. Falls sie schnell gemischt werden, treten unerwartete Ergebnisse einschließlich eines vollständigen Einfangens einer Population ohne nachteilige Beeinflussung der Eigenschaften der studierten Zellen auf.
Nur drei getrennte Zell- bzw. Körperchenpopulationen können leicht aus einer Blutprobe unter Verwendung ihrer inhärenten bzw. innewohnenden und einzigartigen Eigenschaften der zuvor erwähnten Gleichstrom-Volumen- und Opazitäts-Parameter identifiziert und gezählt werden. Zusätzliche Schritte, wie beispielsweise verbesserte Lysis- Systeme müssen vorgenommen werden, um das Detektieren und Zählen von mehreren Populationen zu ermöglichen. Natürlich stellen diese zusätzlichen Populationen Unterpopulationen von drei grundlegenden Populationen dar, auf die als Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten Bezug genom men wird. Die Schritte, die gemäß der Stammanmeldung ausgeführt werden, demonstrieren wie Unterpopulationen dieser grundlegenden drei Populationen erhalten werden.
Unter Einsatz von solchen einfachen Aperturabfühltechniken in Kombination mit zwei oder mehr biologischen Partikeln kann man eine einzigartige und neue Position der Punktansammlung erzeugen, die eine gegebene Population darstellt. Diese selektive Bewegung von Populationen auf der Punktkurve oder dem Scattergramm ist reproduzierbar und kann verwendet werden, um eine Population zu klassifizieren, die von den drei grundlegenden Populationen getrennt ist.
Die originale und innewohnende Kombination von Gleich strom-Volumen- und Opazitätsabfühltechniken kann durch das Anbringen von mikroskopischen Partikeln an den ausgewählten einzelnen Zellen modifiziert werden. Die Selektivität bzw. Unterscheidbarkeit wird den Partikeln durch die Natur oder Art der biologischen Moleküle, unter an derem Antikörper gegeben, die als Beschichtung auf den Partikeloberflächen eingesetzt wird. Eine Population von Zellen allein, die keine Partikel auf ihrer Oberfläche haben, kann eine Punktkurvenposition einnehmen, die von anderen Populationen oder Unterpopulationen nicht unterschiedlich ist, und daher können sie voneinander nicht unterscheidbar sein. Das Zugeben von Partikeln mit einer selektiven Anziehung auf spezielle Populationen von Zellen, die man identifizieren, zählen und studieren möchte, ist unter Verwendung dieses Ansatzes möglich. Das selektive Hinzugeben einer ausreichenden Masse von selektiven Partikeln zu einer einzelnen Population von Interesse hat das Verschieben der Punktkurvenstelle dieser Population zur Folge, und zwar als eine Folge der neuen und einzigartigen Kombination von Masse, Volumen und Opazität.
Das Verfahren und die Vorrichtung, die die Erfindung verkörpern, können mit einer Vielzahl von immunologischen Reaktionen verwendet werden, wie beispielsweise immunologische Reaktionen, die Reaktionsmittel und geformte Körper bzw. Zellgebilde oder Zellen einschließen. Die Erfindung ist auch anwendbar auf Analysen von Zellgebildesuspensionen, wie beispielsweise unter anderem manche Bakterien und Viren. Wie hier verwendet, werden Zellen bzw. Körperchen als Tier- oder Pflanzenzellen definiert, und zwar einschließlich zellenartiger Bakterien und Pilze, die getrennt oder in Ansammlungen identifizierbar sind. Zellen bzw. Körperchen sind die kleinste strukturelle Ansammlung von lebender Materie, die als unabhängige Einheit funktionieren kann. Beispielsweise können Zellenpopulationen von menschlichen roten Blutkörperchen (RBC = red blood cell) und weißen Blutkörperchen (WBC = white bood cell) sein, von Krebszellen oder anderen abnormalen Gewebezellen oder aus Blutproben. Zellgebilde bzw. geformte Körper sind als einige Bakterien und Viren definiert. Die Zellen und Zellgebilde, die in geeigneter Weise angehängt oder bezeichnet bzw. markiert worden sind, können erwartungsgemäß vernünftigerweise optisch durch das Verfahren und die Vorrichtung der Erfindung in der gleichen Weise identifiziert werden, wie die Beispiele von menschlichen Blutzellen.
Obwohl der Ausdruck "Reaktionsmittel" in den obigen Anmeldungen verwendet worden ist, um Lysismittel und monoklonale Antikörper zu definieren, können Reaktionsmittel verschiedene Mittel aufweisen, die eines oder mehrere spezifische Moleküle detektieren und damit reagieren, die auf der Oberfläche einer Zelle oder eines Zellgebildes sind. Einige Beispiele sind unten aufgeführt:
Die Reaktionsmittel koppeln oder binden sich an das (die) spezifische(n) Molekül(e) an den Zellen. Diese Reaktionsmittel bilden einen Teil einer chemischen Reaktion; jedoch werden die Reaktionsmittel nicht notwendigerweise chemisch verändert.

Offenbarung der Erfindung

Ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Ausführung der Abbildung bzw. Auslese von einer oder mehreren interessanten Zellen- bzw. Körperchengruppen, die durch eine Zellenpopulation, wie beispielsweise einem oder mehreren interessanten Untersätzen einer Population von weißen Blutkörperchen verdeckt werden, wird offenbart. Die interes sante Zellengruppe wird ausgezählt durch Verwendung von Mikrosphären mit daran gebundenen monoklonalen Antikörpern, um die abgefühlten Charakteristiken von speziellen Zellen zu verändern, um die interessante Zellengruppe von der verdeckenden Zellenpopulation zu unterscheiden.
Eine Vollblutprobe oder ein Teil davon kann abgebildet bzw. ausgelesen werden, um die erwünschte Analyse eines interessanten Untersatzes von weißen Blutkörperchen vorzusehen. Der Probenteil wird mit Mikrosphären vermischt, und zwar mit monoklonalen Antikörpern, die für den interessanten Untersatz von weißen Blukörperchen spezifisch sind, wobei sich die Mikrosphären mit den interessanten Zellen verbinden, um die abgefühlten Charakteristiken der Zellen zu verschieben. Der Probenteil mit dem interessan ten Untersatz von weißen Blutkörperchen wird dann mindestens bei zwei Abfühlparametern abgefühlt, von denen einer ein Abfühlparameter von polarisiertem Licht ist, und wobei die Charakteristiken des interessanten Untersatzes von weißen Blutkörperchen ausreichend verschoben werden, um direkt den interessanten Untersatz zu messen. Überlappende Zellenpopulationen können auch analysiert werden. Zwei interessante Zellengruppen können gleichzeitig verschoben werden.
Ein Probenteil kann auch zuerst gemessen werden, dann können spezielle bzw. festgelegte Zellen daraus entfernt werden, um zu ermöglichen, daß die interessante Zellengruppe in einem Gebiet abgefühlt wird, in der sie anderenfalls durch die entfernten Zellen verdeckt bzw. abgedeckt worden wäre. Der Probenteil wird wieder gemessen und mit der ersten Messung verglichen, um die interessante Zellengruppe zu unterscheiden. In einer Vollblutprobe wäre die interessante Zellengruppe ein interessanter Untersatz von weißen Blutkörperchen, der anderenfalls durch eine Zellenpopulation von weißen Blutkörperchen verschleiert bzw. verdeckt werden würde.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die bevorzugten Ausführungsbeispiele dieser Erfindung werden nun beispielhaft beschrieben, und zwar mit Bezug auf die Zeichnungen, die diese Beschreibung begleiten, in denen die Figuren folgendes darstellen:
Fig. 1 ist ein schematisches Blockdiagramm eines Zellenauslese- bzw. Zellenabbildungsanalysevorrichtungsausführungsbeispiels der vorliegenden Erfindung;
Fig. 2 ist ein schematisches Blockdiagramm eines zweiten Zellenausleseanalysevorrichtungsausführungsbeispiels der vorliegenden Erfindung;
Fig. 3 ist ein spezielles Analysevorrichtungsausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung;
Fig. 4 ist eine polarisierte Detektoranordnung bzw. eine Polarisationsdetektoranordnung der vorliegenden Erfindung;
Fig. 5A-6D sind Scattergramme bzw. Streuungsdarstellungen, die die Techniken der vorliegenden Erfindung zum Erhalt eines interessanten Untersatzes von weißen Blutkörperchen veranschaulichen;
Fig. 7A-7C sind Scattergramme von Ergebnissen für die interessanten Untersätze von weißen Blutkörperchen, die unterschiedliche Abfühlparameter verwenden;
Fig. 8A-9D sind Scattergramme, die die Anwendung von zwei Mikrosphären der gleichen Größe gemäß der vorliegenden Erfindung veranschaulichen;
Fig. 10 ist ein weiteres schematisches Blockdiagramm von einem Zellenausleseanalysevorrichtungsausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung zur Bestimmung von überlappenden Untersätzen;
Fig. 11 ist ein schematisches Blockdiagramm eines Zellen ausleseanalysevorrichtungsausführungsbeispiels der vorliegenden Erfindung zur Bestimmung von verdeckten Zellen;
Fig. 12 ist ein schematisches Blockdiagramm eines weiteren Zellenausleseanalysevorrichtungsausführungsbeispiels der vorliegenden Erfindung zur Bestimmung von verdeckten Zellen;
Fig. 13 ist ein schematisches Blockdiagramm eines Zellenausleseanalysevorrichtungausführungsbeispiels der vorliegenden Erfindung, um gleichzeitig zwei interessante Zellengruppen zu analysieren; und
Fig. 14 ist ein schematisches Blockdiagramm eines zweiten Zellenausleseanalysevorrichtungsausführungsbeispiels der vorliegenden Erfindung, um gleichzeitig zwei interessante Zellengruppen zu analysieren.

Weg zur Ausführung der Erfindung

Mit Bezug auf Fig. 1 ist ein erstes Ausführungsbeispiel einer Zellenausleseanalysevorrichtung der vorliegenden Erfindung im allgemeinen mit dem Bezugszeichen 10 bezeichnet. Die Analysevorrichtung 10 weist eine Probe 12 auf, die mindestens einen ersten Satz oder eine Population von Zellen (nicht gezeigt) enthält. Diese Zellenpopulation verdeckt bzw. verschleiert eine interessante Zellengruppe, wie beispielsweise einen Untersatz oder einen zweiten Satz von Zellen, wenn sie, wie im folgenden beschrieben, analysiert wird. Die Probe 12 kann einen Puffer bzw. ein Puffermittel aufweisen, in welches die Zellen zugegeben werden.
Die Probe 12 oder ein Teil davon wird über eine Leitung 14 mit mindestens einem Reaktionsmittel 16 über eine Leitung 18 kombiniert. Die Zellen der interessanten Zellengruppe haben mindestens eine abgefühlte Zellencharakteristik bzw. ein abgefühltes Zellenmerkmal, welches in einer Zellengruppenverschiebestation 20 modifiziert oder verschoben wird. Das abgefühlte Merkmal der Zellen der interessanten Zellengruppe wird modifiziert oder ausreichend verschoben, um die Zellenmerkmale von den abgefühlten Zellenmerkmalen der verdeckenden Zellenpopulation zu entfernen.
Das Reaktionsmittel 16 kann eine Vielzahl von Mikrosphären sein oder diese aufweisen, und zwar mit einem daran gebundenen Antikörper, der für die interessante Zellengruppe spezifisch ist. Das Reaktionsmittel 16 und der Probenteil 12 werden vorzugsweise miteinander vermischt, um die Bindung der interessanten Gruppe von Mikrosphären zu verbessern. Eine Vielzahl von Mikrosphären ist an jede Zelle der interessanten Zellengruppe gebunden, wobei im allgemeinen jede Zelle mit Mikrosphären bzw. Mikrokügelchen beschichtet ist, was die daraus resultierenden abgefühlten Charakteristiken von jeder Zelle der interessanten Zellengruppe modifiziert oder verschiebt. Der Probenteil 12 wird dann in eine Analysevorrichtung 22 über eine Leitung 24 gespeist. Die Analysevorrichtung fühlt und zählt mindestens die Anzahl der Zellen in dem Probenteil 12. Die Analysevorrichtung 22 weist mindestens einen und vorzugsweise zwei Abfühlparameter auf, wobei mindestens einer ein polarisierter optischer Parameter bzw. ein optischer Polarisationsparameter ist, wie weiter im folgenden beschrieben.
Mit Bezug auf Fig. 2 ist ein zweites Ausführungsbeispiel einer Zellenauslese- bzw. Zellenabbildungsanalysevorrichtung der vorliegenden Erfindung im allgemeinen mit dem Bezugszeichen 30 bezeichnet. Die Analysevorrichtung 30 weist eine biologische Probe 32 auf, die mindestens einen ersten Satz von (nicht gezeigten) biologischen Zellen enthält, wie beispielsweise in oder aus einer Vollblutprobe. Die Zellen der biologischen Probe 32 sollen in einer biologischen Reaktion bei einer quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung oder Analyse verwickelt werden. Die biologische Probe 32 weist mindestens eine Population von weißen Blutkörperchen auf, wobei die Population von weißen Blutkörperchen eine interessante Untersatzpopulation von weißen Blutkörperchen verdeckt. Die Probe 32 kann auch einen Puffer bzw. ein Puffermittel aufweisen, in das die Zellen zugegeben werden.
Wie hier verwendet, sind Untersätze weißer Blutkörperchen Untersätze einer Population von weißen Blutkörperchen, an die spezifische monoklonale Antikörper gebunden werden können. Eine Nomenklatur für die monoklonalen Antikörper ist jetzt durch die World Health Orgnization und die International Immunology Society definiert worden. Die monoklonalen Antikörper werden definiert durch eine Cluster- bzw. Ansammlungsdifferenzierung- bzw. -bezeichnung (CD-) Nomenklatur, die eine spezielle Besonderheit bzw. Art für eine Zelle oder Zellgebilde und die monoklonalen Antikörper definiert, die für diese CD-Gruppe spezifisch sind. Nur zu Beispielszwecken sind in den folgenden Beispielen vier CD-Gruppen verwendet worden, CD4, CD8, CD2 und CD20. Die CD-Nomenklatur, die Art und gewisse Handelsquellen von monoklonalen Antikörpern sind in Tabelle I veranschaulicht. Tabelle I
a gp - Glycoprotein, Molekulargewicht in Kilodaltons
b Coulter - Coulter Immunology Division der Coulter Corporation (Hialeah; Florida)
BD - Becton-Dickinson Immunocytometry Systems
Ortho - Ortho Diagnostic Systems (Raritan, New Jersey)
Die Probe 32 oder ein Teil davon wird über eine Leitung 34 mit mindestens einem Reaktionsmittel 36 über eine Leitung 38 kombiniert. Die roten Blutkörperchen (RBC = red blood cells) werden dann aus der Mischung durch eine funktionell bezeichnete RBC-Entfernungsstation 40 bzw. eine Entfernungsstation für rote Blutkörperchen entfernt. Die roten Blutkörperchen können aus der Mischung durch die Station 40 auf einer Anzahl von Wegen entfernt werden. Die roten Blutkörperchen können durch ein Lysismittel in dem Reaktionsmittel 36 lysiert werden. Ein solches bevorzugtes Lysismittel (lyse) und ein Lösch- bzw. Dämpfungsmittel (quench), welches dabei verwendet werden kann, ist in der Serien-Nr. 130 911 (WO-A-8807187) offenbart, die am 10. Dezember 1987 eingereicht wurde, betitelt "METHOD AND REAGENT SYSTEM FOR ISOLATION, IDENTIFICATION AND/OR ANALYSIS OF LEUKOCYTES FROM WHOLE BLOOD SAMPLES", die eine CIP bzw. Teilfortsetzung der Serien- Nr. 025 303, eingereicht am 13. März 1987 mit dem gleichen Titel ist. Das Reaktionsmittel 36 kann eine Vielzahl von magnetischen Mikrosphären sein oder diese aufweisen, und zwar mit einem für die roten Blutkörperchen spezifischen Antikörper, der an die Mikrosphären gebunden ist (nicht gezeigt). Bei diesem Beispiel ist der spezielle verwendete für die roten Blutkörperchen spezifische Antikörper im US-Patent 4 752 563 offenbart, betitelt "MONOCLONAL ANTIBODY FOR RECOVERY OF LEUKOCYTES IN HUMAN PERIPHERAL BLOOD AND METHOD OF RECOVERY EMPLOYING SAID MONOCLONAL ANTIBODY", die hier durch Bezugnahme aufgenommen ist. Das Reaktionsmittel 16 kann auch einen Puffer bzw. ein Puffermittel aufweisen, und zwar zusätzlich oder statt dem Probenpuffer. Das Reaktionsmittel 36 kann weiter eine Kombination des bevorzugten RBC-Lysismittels und der für die roten Blutkörperchen spezifischen Mikrosphären sein.
Sobald die roten Blutkörperchen im wesentlichen aus der Probenteilmischung entfernt sind, wird ein Teil der Mischung in eine Untersatzverschiebestation 42 eingespeist. Wie in der Analysevorrichtung 10 wird die interessante Untersatzpopulation von weißen Blutkörperchen mindestens eine abgefühlte Zellencharakteristik besitzen, die in der Station 42 modifiziert oder verschoben wird, um die abgefühlten Charakteristiken der interessanten Untersatzpopulation von weißen Blutkörperchen von den abgefühlten Zellcharakteristiken der verdeckenden Population von weißen Blutkörperchen zu entfernen.
Wiederum kann das Reaktionsmittel 36 eine Vielzahl von Mikrosphären sein oder diese aufweisen, und zwar mit einem daran gebundenen Antikörper, der für die interessante Untersatzpopulation von weißen Blutkörperchen spezifisch ist. Das Reaktionsmittel 36 und der Probenteil 32 werden vorzugsweise miteinander vermischt, um die Bindung der Mikrosphären an die interessante Untersatzpopulation von weißen Blutkörperchen zu verbessern. Eine Vielzahl von Mikrosphären wird an jede Zelle der interessanten Untersatzpopulation von weißen Blutkörperchen gebunden, wobei jede Zelle mit Mikrosphären beschichtet wird, was die daraus resultierende abgefühlte Zellcharakteristik von jeder Zelle der interessanten Untersatzpopulation von weißen Blutkörperchen modifiziert oder verschiebt.
Der Probenteil wird dann in eine Analysevorrichtung 44 gespeist, die identisch mit der Analysevorrichtung 22 sein kann, wobei wiederum mindestens die Anzahl der Zellen in dem Probenteil 32 abgefühlt und gezählt wird, und zwar unter Verwendung von mindestens einem Polarisationslichtparameter.
Ein spezielles Ausführungsbeispiel eines Analysevorrichtungsinstrumentes, welches die vorliegende Erfindung verkörpert, und welches die Analyseverfahren der ersten und zweiten Analysevorrichtungen 10 und 30 ausführen kann, wird im allgemeinen mit dem Bezugszeichen 50 in Fig. 3 bezeichnet.
In dem Instrument so ist nur eine spezielle bzw. spezifische Aufzählung veranschaulicht, die in nahezu endlosen Details gemäß der Prinzipien der vorliegenden Erfindung variiert werden kann. Weiterhin ist das Instrument 50 im allgemeinen im funktionellen Detail gezeigt, und spezielle Ausführungsbeispiele können strukturell in vielen bekannten Arten eingerichtet werden.
Das Instrument 50 weist einen Ansaugpumpmechanimus 52 auf, der verwendet wird, um die interessante Zellenprobe, beispielsweise die Probe 12 oder 32, in das Instrument 50 zu ziehen. Die Ansaugvorrichtung 52 ist über eine Leitung 53 mit einem Proben- bzw. Aufnahmeventil 54 gekoppelt, welches mit einer Proben- bzw. Aufnahmesonde 55 gekoppelt werden kann. Eine Lösungsmittelpumpe 56 kann eine Lösungsmittel- oder Pufferlösung aufweisen, und ist auch mit dem Ventil 54 über eine Leitung 58 gekoppelt. Das Ventil 54 und die Pumpe 52 können die Zellenprobe 12 oder 32 zusammen mit dem Lösungsmittel über die Pumpe 56 ansaugen, wenn erwünscht.
Die Reaktionsmittelmischung oder die Zellenprobe selbst wird dann über eine Auslaßleitung 60 in eine Mischvorrichtung 66 gespeist. Die Mischvorrichtung 66 weist eine Mischkammer 68 auf, in die die Probe oder das Reaktionsmittel gespeist wird. Die roten Blutkörperchen werden dann durch ein Lysismittel von einer Lysismittelpumpe 62 lysiert, welches in die Kammer 68 über eine Leitung 64 gespeist wird. Wenn die Reaktion vollendet ist, dann wird ein Lösch- bzw. Dämpfungsmittel oder Fixierungsmittel von einer Station 70 über eine Leitung 72 geliefert. Der Reaktion kann beigeholfen werden durch Vermischung des Lysismittels und/oder des Dämpfungsmittels und der Probe in der Kammer 68, wie funktionell bei 74 veranschaulicht.
Spezielle Details einer geeigneten Mischvorrichtung 66, die hier verwendet werden kann, sind offenbart in der Serien-Nr. 025 337, eingereicht am 13, März 1987 (WO-A- 8806918) und in der Serien-Nr. 517309, eingereicht am 1. Mai 1990 (US-A-5 238 812), veröffentlicht am 24.08.93), die eine Fortsetzung der Serien-Nr. 025 337 ist, die beide betitelt sind: "METHOD AND APPARATUS FOR RAPID MIXING OF SMALL VOLUMES FOR ENHANCING BIOLOGICAL REACTIONS".
Durch Verwendung des Mischers 66 werden die Reaktionen stark bezüglich der Geschwindigkeit verbessert, und zwar ohne beträchtlich die interessanten Eigenschaften der Zellen zu schädigen, wie es beispielsweise durch Erhöhung der Reaktionstemperatur auftreten kann. Weiterhin werden die Reaktionen im allgemeinen in einer beträchtlich verringerten Zeit vollendet, im allgemeinen in der Größenordnung von 2 Minuten oder weniger. Dies gestattet eine schnelle Analyse für das automatische Analyseinstrument 50 mit hohem Volumen.
Der gedämpfte Probenteil, bei dem die roten Blutkörperchen durch das Lysismittel entfernt worden sind, kann über eine Leitung 76 direkt in eine Analysevorrichtung 78 für weiße Blutkörperchen gespeist werden (d. h. die Analysevorrichtung 22 oder 44). Der Probenteil wird direkt zur Analysevorrichtung 78 gespeist, wo eine Referenz oder ein nicht verschobenes Ergebnis zuerst von der Probe erhalten wird, und zwar für spätere Referenz- oder Vergleichszwecke. Die Anlysevorrichtung 78 kann von vielen physischen Bauarten sein, und zwar gemäß der Zähl- und Bemessungstechniken, die von Wallace H. Coulter im US- Patent 2 656 508 beschrieben wurden, und die in zahlreichen im Handel erhältlichen Blutkörperchenzählvorrichtungen der Anmelderin Coulter Electronics, Inc. verkörpert sind.
Die Analysevorrichtung 78 weist im allgemeinen eine Flußzellenbauart der Abfühlkammer 80 auf. Die Flußzelle 80 weist mindestens polarisierte optische und vorzugsweise elektronische Abfühlvorrichtungen auf. Die Flußzelle 80 wird aus irgendeinem optisch transparenten Material gebildet, beispielsweise geschmolzenem Siliziumoxid oder Quarz. Die Flußzelle 80 weist eine enge verjüngte Öffnung 82 auf, durch die der Probenteil als ein hydrodynamisch geformter Strom in wohlbekannter Weise fließt. Die Flußzelle 80 weist eine optisch flache Oberfläche auf, um einen Strahl 84 von polarisierter elektromagnetischer Lichtenergie zu fokussieren, und zwar vorzugsweise aus einer Laserquelle 86, die durch eine Linsenanordnung 88 in einem Punkt in der Öffnung 82 fokussiert wird. Das Licht, welches von den einzelnen Zellen gebrochen wird, wenn sie durch die Öffnung 82 und daher den Strahl 84 laufen, wird von einer Polarisationsdetektoranordnung 90 detektiert, wie mit Bezug auf Fig. 4 beschrieben wird.
Die Flußzelle 80 kann auch eine elektronische Abfühlschaltung aufweisen. Die Flußzelle 80 weist einen ersten Teil 91 auf, und zwar mit einer ersten Elektrode 92 in Kontakt mit dem Strörnungsmittel darin.
Der Flußzellenkammerteil 91 und die Elektrode 92 stehen durch die Öffnung 82 mit einem zweiten Kammerteil 96 mit einer zweiten Elektrode 98 darin in Verbindung. Die Elektroden 92 und 98 sind über jeweilige Leitungen 100 und 102 mit einer RF/DC- bzw. Hochfrequenz/Gleichstrom-Quelle und einer Abfühlschaltung 104 gekoppelt. Die Schaltung 104 koppelt sowohl einen Gleichstrom- oder Niederfrequenz-Strom oder ein -Signal als auch ein Hochfrequenz Signal zwischen den Elektroden 92 und 98.
Das Niederfrequenz-Signal wird verwendet, um die Amplitude eines Signalimpulses abzufühlen, der durch eine Zelle bewirkt wird, die durch die Öffnung 82 läuft. Das Hochfrequenz-Signal wird verwendet, um die elektrische Opazität bzw. Undurchsichtigkeit derselben Zelle zu erhalten, die durch die Öffnung 82 läuft.
Die Messung der elektrischen Opazität der Zellen wurde beschrieben von Wallace H. Coulter und Walter R. Hogg im US-Patent 3 502 974 und in verschiedenen Patenten und Veröffentlichungen der Anmelderin, Coulter Electronics, Inc. seit diesem Patent. Eine spezielle Schaltung, die hier verwendet werden kann, ist im US-Patent 4 791 355 offenbart, betitelt "PARTICLE ANALYZER FOR MEASURING THE RESISTANCE AND REACTANCE OF A PARTICLE".
Die von der Schaltung 104 erzeugten Signale von den abgefühlten Zellen werden über eine Gleichstrom-Signalleitung 106 und eine Hochfrequenz-Signalleitung 108 an einen Komparator 110 gekoppelt. Der Komparator 110 kann das Signal halten, welches von den Probenteilen erzeugt wird, d. h. für einen Vergleich mit den Ergebnissen von den anderen Probenteilen, die zu beschreiben sind. Auch kann der Komparator 110 einen optischen Abfühleingang oder Eingangsgrößen über eine Leitung 112 von der optischen Detektoranordnung 90 aufweisen.
Die Analysevorrichtung 78 weist einen Scheidefluß auf, um die Zellen in der Flußzelle 80 in wohlbekannter Weise zu fokussieren. Der Scheidefluß kann durch ein Strömungsmittelsystem 114 vorgesehen werden, und zwar mit der Flußzelle 80 durch ein Paar von Leitungen 116 und 118 in wohlbekannter Weise gekoppelt. Die Probenreaktionsmischung kann in die Flußzelle 80 über ein Einleitungsrohr 120 gespeist werden, und kann von der Flußzelle 80 über ein Auslaßrohr 122 in einen Abfallbehälter 124 gespeist werden.
Während der erste Teil der Mischung in der Analysevorrichtung 78 analysiert worden ist, kann der Mischer 56 über eine Ablaufleitung 126 gereinigt oder geflutet bzw. durchgespült werden, und durch eine Abfalleitung 128 ausgestoßen bzw. geleert werden. Ein zweiter Probenteil kann nun in die Kammer 68 gespeist werden, damit seine abgefühlten Zellencharakteristiken modifiziert oder verschoben werden. Alternativ kann der zu modifizierende Probenteil zuerst in die Kammer 68 gespeist werden, und zwar ohne daß ein erstes nicht verschobenes oder stan dardmäßiges Probenteilergebnis zuerst erhalten wird. Die interessante Gruppe von weißen Blutkörperchen oder anderen Zellen wird nun verschoben durch Zugabe von Mikrosphären für weiße Blutkörperchen (WBC-Mikrosphären), und zwar von einer Station 130 über eine Leitung 132, ein Ventil 134 und eine Kammerleitung 136 in die Kammer 68, um mit dem Probenteil vermischt zu werden.
Die WBC-Mikrosphären werden mit dem zweiten Teil durch den Mischmechanismus 74 vermischt. Zur Verschiebung werden die WBC-Mikrosphären und die Reaktionsmischung mit den gebundenen WBC-Mikrosphären über die Leitung 76 in die Analysevorrichtung 78 (d. h. die Analysevorrichtung 22 oder 44) gespeist, worin der zweite Teil wie der erste Teil analysiert wird, und wobei die Ergebnisse dann im Komparator 110 verglichen werden können. Zumindest eine der abgefühlten Zellencharakteristiken des Zellenuntersatzes von weißen Blutkörperchen wird im zweiten Teil verändert, wie beispielsweise die Zellenopazität durch die an den Untersatz der weißen Blutkörperchen gebundenen Mikrosphären, um die veränderten Ergebnisse zu liefern, die dann analysiert werden können.
Wenn die WBC-Mikrosphären magnetisch sind, und zwar aus später beschriebenen Gründen, dann kann die daran gebun dene Untersatzpopulation der weißen Blutkörperchen durch ein Magnetfeld entfernt werden, und zwar während und/oder nach dem Mischprozeß durch ein Magnetfeld oder einen Magneten 138. Das Feld kann durch elektromagnetische Mittel oder durch den Magnet 138 vorgesehen werden, der physisch mit Bezug auf die Kammer 68 bewegt wird, um den magnetisch gebundenen Untersatz von weißen Blutkörperchen einzufangen. Der zweite Teil ohne den gebundenen Untersatz von weißen Blutkörperchen wird dann über die Leitung 76 zur Analysevorrichtung 86 in der zuvor beschriebenen Weise gespeist, um die Analyse zu erhalten.
Das Instrument 66 wird dann vorbereitet, um die nächste Probe oder den nächsten Probenteil für die nächste Analyse aufzunehmen. Die Sonde 58 kann durch einen Sondenspülmechanismus 140 gereinigt werden, und die Leitungen und die Kammer 68 können in herkömmlicher Weise gespült werden. Jede Analyse der darauffolgenden Probenmischung wird in schneller und automatischer Weise erhalten. Die Periode zwischen der Analyse von aufeinanderfolgenden Probenmischungen kann in der Größenordnung von Minuten oder weniger sein.
Im Betrieb des Analysevorrichtungsinstrumentes 66 wird die Reaktionsmischung mit dem Lysismittel/Reaktionsmittel für rote Blutkörperchen und dem Probenteil in der Kammer 68 zusammen mit nicht magnetischen WBC-Mikrosphären von der Station 130 vermischt, die sich mit einem der Untersätze von weißen Blutkörperchen binden. Das Dämpfungsmittel 70 wird zu der Reaktionsmischung zugegeben, die dann über die Leitung 76 zur Analysevorrichtung 78 für weiße Blutkörperchen zur Analyse gespeist wird.
Alternativ zur Anwendung des Lysismittels kann die Probe 12 oder 32 zu dem Mischer 66 über das Ventil 56 ohne Lysis bzw. Lysismittel gespeist werden. In diesem Fall können die roten Blutkörperchen magnetisch durch Anwendung der Mikrosphären entfernt werden, an die der für die roten Blutkörperchen spezifische Antikörper gebunden ist, und zwar aus einer RBC-Mikrosphärenstation 142 und zum Ventil 134 über eine Leitung 142 und daher zur Kammer 68 über die Leitung 136 gespeist. Wo ein Lysismittel nicht verwendet wird, werden die gebundenen roten Blutkörperchen magnetisch durch den Magneten 140 nach der Vermischung entfernt, und zwar in einer Weise, die im wesentlichen mit den oben beschriebenen magnetisch gebundenen weißen Blutkörperchen identisch ist.
Darüber hinaus kann in einem zweiten Fall, um die Geschwindigkeit der Reaktion zu begünstigen, eine Reak tionsmischung der Probe sowohl mit dem Lysismittel für rote Blutkörperchen als auch mit den Magnetkügelchen für rote Blutkörperchen verwendet werden. Die Reaktionsmischung wird vermischt, das Lysismittel wird gedämpft bzw. gelöscht und die gebundenen roten Blutkörperchen werden magnetisch entfernt, und dann werden die weißen Blutkörperchen, wie zuvor beschrieben, analysiert.
Obwohl die Technik der vorliegenden Erfindung unter Verwendung einer Probe in ihrem natürlichen Zustand beschrieben worden ist, wie beispielsweise einer Vollblutprobe, die direkt in das Instrument 66 gespeist wird, kann die Probe auch abseits vorbereitet werden oder teilweise vor-vorbereitet werden, wo erwünscht. Die roten Blutkörperchen der Probe könnten zuvor ausgelöscht bzw. entfernt werden. Ein System kann verwendet werden, bei dem die Mikrosphären abseits bzw. "of line" oder in einem Vorbereitungsbetriebszustand zugegeben werden könnten, und der Probenteil mit den abgefühlten Zellencharakteristiken, die schon verschoben sind, könnte dann in das System für den Rest der Analyse eingeleitet werden. Einige spezifische Beispiele werden im folgenden beschrieben.
Eine Differentiation oder Unterscheidung von Leukozyten oder einer Population von weißen Blutkörperchen unter Verwendung von mehr-dimensionaler Lichtstreuung wird offenbart bzw. angewandt in einem CELL-DYN 3000 Instrument, welches von Sequoia-Turner, Mountainview, California, verkauft wird. Das Instrument verwendet eine Quelle von polarisiertem Licht und mißt gerade aus, in zehn Grad und in neunzig Grad (orthogonal) polarisierte und depolarisierte Lichtbrechung. Das Instrument verwendet auch eine Reaktionsmittelformel, um die roten Blutkörperchen "transparent" für das Laserlicht zu machen. Auch mit diesen mehrfachen Parametern jedoch sieht das Instrument keine Differentiation oder Unterscheidung irgendeiner Untersatzpopulation von weißen Blutkörperchen vor.
Mit Bezug auf Fig. 4 ist ein Beispiel der Polarisationsoptikdetektoranordnung 90 veranschaulicht. Die Anordnung 90 weist eine polarisierte Laserquelle 150 auf, die einen polarisierten Lichtstrahl 152 zur Flußzelle 80 leitet. Der Lichtstrahl 152 tritt in Gegenwirkung mit dem (nicht gezeigten) Zellenstrom und bildet einen reflektierten Strahl 154, der Informationen bezüglich der Zellen enthält. Der reflektierte Strahl 154 wird zu einem Strahlteiler 156 geleitet.
Ein erster Teil 158 des Strahls läuft durch den Strahlteiler 156 durch einen polarisierten Filter 160 und wird von einer Photovervielfältigungsröhre (PMT = photomultiplier tube) 162 detektiert, und zwar als 90 Grad polarisiertes Lichtstreuungssignal oder Ausgang bzw. Ausgangsgröße. Ein zweiter Teil 164 des Strahls wird vom Strahlteiler 156 reflektiert und wird auf eine zweite Photovervielfältigungsröhre bzw. PMT 166 geleitet und davon detektiert, und zwar als ein nicht polarisiertes Lichtstreuungssignal. Andere Lichtabfühlparameter können auch verwendet werden, wie beispielsweise in den oben erwähnten VCS- und Case 35368-Instrumenten.
Mit Bezug auf die Fig. 5A-6B sieht ein Scattergramm bzw. eine Streuungsdarstellung auf einer Gleichstrom/Polarisationslichtbrechungsdarstellung, wie in Fig. 5B gezeigt, drei Populationsgruppierungen von weißen Blutkörperchen vor, 168 Monozyten (M), 170 Ls und 172 Neutrophile (N) und Eosinophile (E), und zwar kombiniert. In diesem Scatttergramm sind keine Mikrosphären vorhanden.
Wenn Mikrosphären zugegeben werden, vermischt das von dem Mikrosphären gebrochene oder gestreute Licht die abgefühlten Charakteristiken der Art, daß nur zwei Populationsgruppierungen von weißen Blutkörperchen getrennt ausgezählt werden, wie in Fig. 5B gezeigt, 170 Ls und 174 Ms, Ns, Es kombiniert. Dieser Vermischung der Zellengruppierungen kann minimiert werden durch Anwendung einer minimalen Anzahl von Mikrosphären. Weiterhin bewirken sehr kleine Mikrosphären in der Größenordnung von weniger als 0,6 um im Durchmesser, keine signifikante Vermischung unter Verwendung einer Lichtquelle mit einer Wellenlänge von 488 nm.
Unter Verwendung der Fig. 5A als der Standard oder ale eine Kontrolle werden dann nicht magnetische Mikrosphären mit einem für einen L-Untersatz spezifischen daran gebundenen monoklonalen Antikörper, wie beispielsweise CD4, in die gleiche Probe oder in einen zweiten Teil der Probe gemischt, was eine Verschiebung zur Folge hat, die eine direkte Untersatzgruppierung (176) wie in Fig. 5B gezeigt, bildet.
Dieses Verfahren kann außerhalb (off-line) oder innerhalb (on-line) verwendet werden. Die Schritte 1-3 des Verfahrens könnten außerhalb durchgeführt werden. Dies wurde die Ausrüstung eliminieren, die notwendig ist, um die Mikrosphären zuzugeben und sie mit der Probe zu vermischen. Ein vollautomatisches Instrument 50 könnte alle diese Schritte automatisch innerhalb bzw. im Prozeß (on-line) durchführen. Das Verfahren im allgemeinen ist wie folgt:
1. Vorsehen von 150 Mikrolitern Vollblut (oder von mehr).
2. Zugabe von 15 Mikrolitern von nicht magnetischen Mikrosphären mit 2 Mikrometern, mit einem daran gebundenen für einen L-Untersatz spezifischen monoklonalen Antikörper (T4, T8 oder T11, jeweils in einem getrennten Mischgefäß) oder Zugabe von 10 Mikrometern von MSIG-Kontrollmikrosphären, um einen Kontroll/Hintergrund-Standard zu bilden.
3. Mischung für 2 Minuten (kann für eine Zeitperiode danach stehen, mindestens bis zu einer Stunde).
4. Durchlauf (automatisch) im System.
5. Lysis und Dämpfung innerhalb des Systems.
Mit Bezug auf Fig. 6A wird ein Kontrollergebnis oder ein nicht verschobenes Scattergrammergebnis wiederum veranschaulicht. Die Ls sind in einer Gruppierung 178 zu finden, während die Ms in einer Gruppierung 180 zu finden sind und die Ns und Es in einer Gruppierung 182 zu finden sind. Wie oben bemerkt, muß die Kontrolle nicht vorgesehen werden, da, wie in den Fig. 5B und 6B zu sehen ist, der interessante Untersatz von weißen Blutkörperchen direkt angeordnet bzw. gelegen sein kann, und daher gibt es keine Notwendigkeit, einen Rückvergleich mit einem Referenzergebnis durchzuführen. Die MSIG-Kontrollmikrosphären werden nur verwendet, um sicherzustellen, daß das Scattergrammmuster frei von Interferenzen ist. MSIG ist ein Maus-monoklonales Immunoglobin mit keiner Spezifität für irgendwelche weißen Blutkörperchen oder eine Untersatzpopulation von weißen Blutkörperchen.
Ein erster interessanter Untersatz von weißen Blutkörperchen, die CD4-Zellen werden durch Bindung von T4- Mikrosphären daran gebunden, wie in Fig. 68 veranschaulicht. Die restlichen Ls ohne dem verschobenen Untersatz sind in einer Gruppierung 178 gezeigt, während die Ms. Ns und Es in einer Gruppe 184 zu finden sind. Die verschobene abgefühlte Zellencharakteristik der CD4-Zellen bildet eine neue Gruppierung 186, die mit den Ergebnissen der Fig. 6A verglichen werden kann oder direkt als ein Prozentsatz der CD4-Zellen zur Gesamtheit der Ls analysiert werden kann. In diesem Beispiel wurde herausgefunden, daß der Prozentsatzbeitrag der CD4-Zellen 53,2% war. Die gleiche Probe wurde in einem herkömmlichen EPICS-Flußzytometrieinstrument (registrierte Handelsmarke) zu Vergleichszwecken analysiert, was einen Prozentsatzbeitrag von 53,3% zur Folge hatte.
Fig. 7A -7C veranschaulichen die CD4-Verschiebung unter Verwendung von unterschiedlichen Abfühlparametern, um die Scattergramme zu bilden. Diese Ergebnisse sind nicht optimiert, sind jedoch veranschaulicht, um das Prinzip der Anwendung von anderen Abfühlparametern zu zeigen, wie beispielsweise eine MAS (mittleren Winkelstreuung, MAS = medium angle scatter) - in den Fig. 3 und 4 nicht veranschaulicht. Fig. 7A veranschaulicht eine Kontroll-Zellengruppierung 188 für alle Populationen von weißen Blutkörperchen. Eine 90º-Lichtstreuung wird gegenüber einer 90º-Polarisationslichtstreuung in diesem Scattergramm aufgezeichnet.
Fig. 7B veranschaulicht eine einzelne Zellengruppierung 190 für alle Populationen von weißen Blutkörperchen und eine gestreute CD4-Gruppierung 191 für die verschobenen CD4-Zellen aus der gleichen Probenmischung. In diesem Scattergramm wird die 90º-Depolarisationslichtstreuung wiederum gegenüber einer 90º-Polarisationslichtstreuung aufgezeichnet.
Fig. 7C veranschaulicht die gleichen Daten, wie jene in Fig. 7B, wobei ein Scattergramm durch Aufzeichnung von Gleichstrom (DC) gegenüber dem MALS gebildet wird. Die Ls sind in einer Gruppierung 192 gezeigt, während die verschobenen CD4-Zellen in einer Gruppierung 104 gezeigt sind.
Die Fig. 8A-D veranschaulichen die potentielle Durchführbarkeit der gleichzeitigen Anwendung von zwei Mikrosphären des gleichen Durchmessers, um zwei unterschiedliche interessante Zellengruppierungen abzubilden bzw. auszulesen, wie beispielsweise zwei interessante Untersatzpopulationen von weißen Blutkörperchen. Die Anwendung von zwei unterschiedlichen Arten von Mikrosphären, eine 5,74 um und eine 5,11 µm und die Eintragung bzw. das Aufzeichnen von nicht polarisierter Lichtstreuung gegenüber der Opazität, wie in Fig. 8A veranschaulicht, wird nur eine einzige Mikrosphärengruppierung 196 erhalten. Jedoch werden unter Anwendung der Polarisationsabfühlparametereintragung-90º-Polarisationslichtbrechung, wie in Fig. 8B veranschaulicht, zwei getrennte Gruppierungen 198 und 200 erhalten. Durch Anwendung dieser Parameter könnten zwei getrennte Untersatzpopulationen von weißen Blutkörperchen potentiell verschoben werden, und Ergebnisse in einem Probenteil erhalten werden. Die veranschaulichten Ergeb nisse weisen keine Zellen auf, sondern nur die Mikrosphären selbst. Wie weiter in den Fig. 8C und 8D veranschaulicht, hat die Anwendung von nur der Einzelpolarisationsparametereintragung-90º-Polarisationslichtstreuung eine eindimensionale Trennung zwischen den zwei Mikrosphärengruppierungen zur Folge (Fig. 8D). Die reguläre, nicht polarisierte Lichtstreuung zeigt keine Unterscheidung zwischen den Gruppierungen (Fig. 8C).
Zwei andere Arten von Mikrosphären, eine 10 µm und eine 10,35 µm, veranschaulicht auch die potentielle Trennung unter Verwendung von polarisiertem Licht, wie in den Fig. 9A-9D veranschaulicht. Fig. 9A veranschaulicht nur eine einzelne Gruppierung 202 mit einer 90º-Streuung gegenüber der Opazität, während Fig. 98 zwei getrennte Gruppierungen 204 und 206 veranschaulicht, und zwar unter Anwendung der polarisierten Lichtstreuung bzw. Polarisationslichtstreuung. Wiederum kann diese auch mit einem einzelnen polarisierten Abfühlparameter erhalten werden, wie in Fig. 9D veranschaulicht. Die nicht polarisierten Daten in Fig. 9C zeigen nicht zwei Gruppierungen.
Mit Bezug auf Fig. 10 ist ein drittes Zellenauslese- bzw. Zellenabbildungsanalysevorrichtungsausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung im allgemeinen mit dem Bezugszeichen 190 bezeichnet. Die Analysevorrichtung 190 wird verwendet, um die prozentuale Überlappung der interessanten Zellengruppen zu bestimmen, und wird mit Bezug auf die interessanten Populationsuntersätze von weißen Blutkörperchen von einer Vollblutprobe oder einem Teil davon beschrieben.
Die Analysevorrichtung 190 weist eine biololgische Probe 192 auf, die wiederum mindestens eine erste Population von weißen Blutkörperchen enthält, die mindestens zwei interessante Populationsuntersätze von weißen Blutkörperchen enthält. Die biologische Probe 192 oder ein Teil davon wird über eine Leitung 194 mit mindestens einem Reaktionsmittel 196 über eine Leitung 198 kombiniert. Die roten Blutkörperchen werden dann von dem Probenteil durch eine funktionell bezeichnete Entfernungsstation 200 für rote Blutkörperchen bzw. RBC-Entfernungsstation entfernt. Die roten Blutkörperchen werden durch eine der zuvor beschriebenen Techniken entfernt.
Sobald die roten Blutkörperchen entfernt sind, können, Teile der Mischung an unterschiedliche Leitungen gespeist werden. Eine erste Leitung 202 kann verwendet werden, um einen ersten Probenteil direkt an eine Anylsevorrichtung 204 über eine Leitung 206 zu liefern. Wie bei den oben beschriebenen Analysevorrichtungen 22 und 44 werden die Charakteristiken bzw. Merkmale der Zellen durch mindestens zwei Abfühlparameter abgefühlt, von denen einer ein Lichtsabfühlparameter ist.
Eine zweite Leitung 208 liefert einen zweiten Probenteil an eine "X"-Zellenverschiebungsstation 210. Wie zuvor sind die "X"-Zellen ein erster interessanter Populationsuntersatz von weißen Blutkörperchen, bei denen mindestens eine abgefühlte Zellencharakteristik in der Station 210 modifiziert oder verschoben worden ist, um die abgefühlten Charakteristiken des interessanten Populationsuntersatzes der weißen Blutkörperchen von dem abgefühlten Zellencharakteristiken der verdeckenden Population von weißen Blutkörperchen zu entfernen. Die abgefühlten Zellcharakteristiken werden verschoben, und zwar durch Bindung einer Vielzahl von nicht magnetischen Mikrosphären an die Zellen, und zwar mit einem für den interessanten Populationsuntersatz von weißen Blutkörperchen spezifischen Antikörper, wie zuvor beschrieben. Der Probenteil wird dann in die Analysevorrichtung 204 gespeist. Jeder der Datensätze, die von der Analysevorrichtung 204 erhalten werden, kann in einem Komparator 212 über eine Leitung 214 zum späteren Vergleich gespeichert werden.
In gleicher Weise wird ein dritter Probenteil an eine "Y"-Zellenverschiebungsstation 216 über eine Leitung 218 gespeist. Die abgefühlten Zellcharakteristiken der "Y"- Zellen werden in der Station 216 verschoben oder modifiziert und der Probenteil wird dann an die Analysevorrichtung 204 und den Komparator 212 gespeist. Dies ermöglicht den Erhalt des Prozentsatzes der "X"-Zellen und der "Y"- Zellen, und zwar entweder direkt oder durch Vergleich mit den nicht verschobenen Ergebnissen von der Leitung 202. Dies ermöglicht jedoch nicht, den Erhalt bzw. die Erkenntnis darüber, wie viele, falls irgendwelche, der "X"- und der "Y"-Zellen überlappen.
Um den Prozentsatz der Überlappung zu bestimmen, wird ein vierter Probenteil an eine "X"- und "Y"-Verschiebungsstation 220 über eine Leitung 222 gespeist. Die Überlappung wird hier verwendet, um zu bezeichnen, daß gewisse Zellen, Zellenpopulationen, Unterpopulationen von Zellen oder Zellgebilden mindestens zwei interessante Rezeptoren oder Antigene aufweisen. In diesem Probenteil werden sowohl Mikrosphären mit einem für die "X"-Zellen oder den ersten interessanten Populationsuntersatz von weißen Blutkörperchen spezifischen Antikörper als auch Mikrosphären mit einem für die "Y"-Zellen oder den zweiten interessanten Populationsuntersatz von weißen Blutkörperchen spezifischen Antikörper miteinander kombiniert. Der Probenteil wird dann an die Analysevorrichtung 204 und die Daten zum Komparator 212 gespeist.
Der Überlappungsprozentsatz wird gefunden durch Addition der getrennten "X"- und "Y"-Prozentsatzergebnisse von den Leitungen 208 und 218 zusammen. Von diesem Gesamtergebnis wird das "X"- und "Y"-Prozentsatzergebnis von der Leitung 222 subtrahiert. Wenn die zwei Gesamtprozentsätze im wesentlichen gleich sind, überlappen sich die "X"- und "Y- Zellen nicht signifikant. Wenn es eine Differenz gibt, ist die Differenz die prozentuale Überlappung der Zellen, an die sich die "X"- und "Y"-spezifischen Mikrosphären binden werden. Obwohl die Analysevorrichtung 290 beschrieben worden ist, so daß sie eine Vielzahl von Leitungen besitzt, kann die Analysevorrichtung 290 auch eine sequentielle Analysevorrichtung sein, und zwar unter Verwendung einer einzigen bzw. einzelnen Leitung, wie mit Bezug auf die Analysevorrichtung 50 beschrieben. Die Vielzahl von Leitungen kann gemäß der Analysevorrichtung 50 vorgesehen werden, und zwar unter Verwendung von getrennten Mischern 66 für jede Leitung 208, 218 und 222, und zwar parallel angeordnet. Spezielle Ergebnisse dieses Verfahrens sind in den Fig. 9A-9F vorgesehen.
Mit Bezug auf Fig. 11 wird ein weiteres Ausführungsbeispiel einer Abbildungs- bzw. Ausleseanalysevorrichtung für versteckte Zellen der vorliegenden Erfindung im allgemeinen mit dem Bezugszeichen 250 bezeichnet. Die Analysevorrichtung 250 weist eine Probe 252 auf, die mindestens einen ersten Satz oder eine (nicht gezeigte) Population von Zellen enthält. Diese Zellenpopulation verdeckt eine interessante Zellengruppierung, wie beispielsweise einen Untersatz oder einen zweiten Zellensatz, wenn sie analysiert wird, wie im folgenden beschrieben. Die Probe 252 kann einen Puffer bzw. ein Puffermittel aufweisen, in welches die Zellen zugegeben werden.
Die Probe 252 oder ein Teil davon, wird über eine Leitung 254 mit mindestens einem Reaktionsmittel 256 über eine Leitung 258 kombiniert. Ein erster Teil der Mischung wird direkt an eine Analysevorrichtung 260 über eine Leitung 262 gespeist. Die Analysevorrichtung 260 kann die gleiche sein wie die Analysevorrichtung 22 und sie fühlt und zählt mindestens die Anzahl der Zellen im Probenteil. Die Ergebnisse werden an einen Komparator 264 über eine Leitung 266 gespeist.
Ein zweiter Probenteil wird an eine Zellenentfernungsstation 268 über eine Leitung 270 gespeist. Die Zellen werden durch Verschiebung oder Entzug entfernt, wie oben beschrieben. Zur Verschiebung werden nicht magnetische Mikrosphären an die verdeckende Zellenpopulation gebunden, und zwar durch ausreichendes Modifizieren der abgefühlten Zellencharakteristiken, um sie von den abgefühlten Zellencharakteristiken der interessanten verdeckten Zellenpopulation zu entfernen. Zum Entzug bzw. Herausziehen werden magnetische Mikrosphären an die verdeckende Zellenpopulation gebunden, die dann magnetisch aus dem Probenteil entfernt wird.
Der zweite Probenteil wird dann an die Analysevorrichtung 260 über eine Leitung 272 gespeist, und die daraus resultierenden Daten werden an den Komparator 264 gespeist. Die Daten von den zwei Probenteilen werden dann verglichen, um den Prozentsatzbeitrag der interessanten verdeckten Zellengruppe zu bestimmen.
Mit Bezug auf Fig. 12 ist ein weiteres Ausführungsbeispiel einer Zellenabbildungs- bzw. Zellenausleseanalysevorrichtung der vorliegenden Erfindung im allgemeinen mit dem Bezugszeichen 280 bezeichnet. Die Analysevorrichtung 280 ist ähnlich der Analysevorrichtung 250, weist jedoch eine biologische Probe 282 auf, die mindestens einen ersten Satz von (nicht gezeigten) lebensfähigen biologischen Zellen enthält, wie beispielsweise in oder von einer Vollblutprobe. Die Zellen der biologischen Probe 282 sollen in eine biologische Reaktion in einer quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung oder Analyse verwickelt werden. Die biologische Probe 282 weist mindestens eine Population von weißen Blutkörperchen auf, wobei die Population von weißen Blutkörperchen eine interessante Population von weißen Blutkörperchen verdeckt. Die Probe 282 kann auch einen Puffer bzw. ein Puffermittel aufweisen, worin die Zellen zugegeben werden.
Die Probe 282 oder ein Teil davon wird über eine Leitung 284 mit einem Reaktionsmittel 286 über eine Leitung 288 kombiniert. Die roten Blutkörperchen werden vom Probenteil 282 in einer Entfernungsstation 290 für rote Blutkörperchen entfernt. Die roten Blutkörperchen werden auf eine von einer Anzahl von Weisen entfernt, wie zuvor beschrieben. Ein Teil der Probe mit den entfernten roten Blutkörperchen wird über eine Leitung 292 zu einer Analysevorrichtung 294 gespeist, die wiederum die Population von weißen Blutkörperchen abfühlt und zählt. Die Daten von der Analysevorrichtung 294 werden über eine Leitung 296 zu einem Komparator 298 gespeist, wie in der Analysevorrichtung 250.
Ein zweiter Probenteil wird an eine Neutrophil (N) funktionell bezeichnete Entfernungsstation 300 über eine Leitung 302 gespeist. Die Ns können aus der Mischung entfemt werden durch Verschiebung oder Veränderung eines Parameters, wie beispielsweise der Opazität oder durch magnetische Entfernung, wie sie beide oben beschrieben wurden. In diesem Beispiel ist der verwendete spezielle N-spezifische Antikörper offenbart im US-Patent 4 931 395, "MONOCLONAL ANTIBODY SPECIFIC TO NEUTROPHILS".
Die Mischung, bei der die Ns entfernt oder verschoben sind, wird dann an die Analysevorrichtung 294 für weiße Blutkörperchen über eine Leitung 304 gespeist. Die Ergebnisse der Analysevorrichtung 294 werden an den Komparator 298 gespeist. Die Ergebnisse des zweiten Probenteils werden dann mit dem ersten Probenteil verglichen, um zu bestimmen, ob irgendwelche Zellen in dem N-Gebiet bleiben, welche zuvor von den Ns verdeckt wurden.
Mit Bezug auf Fig. 13 ist ein Ausführungsbeispiel einer gleichzeitigen bzw. gleichzeitig arbeitenden Zellgruppenabbildungs- bzw. Zellgruppenausleseanalysevorrichtung der vorliegenden Erfindung im allgemeinen mit dem Bezugszei chen 340 bezeichnet. Die Analysevorrichtung 340 weist eine Probe 342 auf, die mindestens einen ersten Satz oder eine Population von Zellen enthält (nicht veranschaulicht). Diese Zellenpopulation verdeckt mindestens zwei interessante Zellengruppen, wie beispielsweise Untersätze oder andere Sätze von Zellen, wenn sie analysiert werden, wie im folgenden beschrieben. Die Probe 342 kann einen Puffer bzw. ein Puffermittel aufweisen, worin die Zellen zugegeben werden.
Die Probe 342 oder ein Teil davon wird über eine Leitung 344 mit mindestens einem Reaktionsmittel 346 über eine Leitung 348 kombiniert. Bei jeder der interessanten Zellengruppen ist mindestens eine abgefühlte Zellencharakteristik modifiziert oder in einer Zellengruppenverschiebungsstation 350 verschoben. Jede der Gruppen von abgefühlten Zellencharakteristiken wird ausreichend modifiziert oder verschoben, um die abgefühlten Zellencharakteristiken von den abgefühlten Zellencharakteristiken der verdeckenden Zellenpopulation und voneinander zu entfernen.
Das Reaktionsmittel 346 kann Sätze einer Vielzahl von unterschiedlichen nicht magnetischen Mikrosphären sein oder diese aufweisen, und zwar jeweils mit einem daran gebundenen Antikörper, der für eine der interessanten Zellengruppen spezifisch ist. Das Reaktionsmittel 346 und der Probenteil 342 werden vorzugsweise miteinander vermischt, um die Bindung der Mikrosphären an die interessanten Zellengruppen zu verbessern. Eine Vielzahl der Mikrosphären wird an jede Zelle in jeder interessanten Zellengruppe gebunden, wobei im allgemeinen jede Zelle mit Mikrosphären beschichtet wird, was die daraus resultierenden abgefühlten Charakteristiken von jeder Zelle in der interessanten Zellengruppe modifiziert oder verschiebt.
Der Probenteil oder die Mischung 342 wird dann an eine Analysevorrichtung 352 über eine Leitung 354 gespeist. Die Analysevorrichtung fühlt und zählt mindestens die Anzahl der Zellen im Probenteil 342. Die Analysevorrichtung 352 weist mindestens zwei Abfühlparameter auf, wobei mindestens einer davon ein optischer Parameter ist, wie zuvor beschrieben. Die Anlaysevorrichtung 340 kann im wesentlichen die gleiche sein wie die Analysevorrichtung 10 und 50, und zwar mit Zugabe von mindestens zwei unterschiedlichen Sätzen von Mikrosphären.
Mit Bezug auf Fig. 14 ist ein zweites Ausführungsbeispiel einer gleichzeitigen bzw. gleichzeitig arbeitenden Zellenabbildungs- bzw. Zellenausleseanalysevorrichtung der vorliegenden Erfindung im allgemeinen mit dem Bezugszeichen 360 bezeichnet. Die Analysevorrichtung 360 weist eine biologische Probe 362 auf, die mindestens einen ersten Satz von lebensfähigen biologischen Zellen enthält (nicht gezeigt) wie beispielsweise in oder von einer Vollblutprobe. Die Zellen der biologischen Probe 362 sollen in einer biologischen Reaktion in einer quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung oder Analyse verwickelt werden. Die biologische Probe 362 weist mindestens eine Population von weißen Blutkörperchen auf, wobei die Population von weißen Blutkörperchen mindestens zwei interessante Untersatzpopulationen von weißen Blutkörperchen verdeckt. Die Probe 362 kann auch einen Puffer bzw. ein Puffermittel aufweisen, worin die Zellen zugegeben werden.
Die Probe 362 oder ein Teil davon wird über eine Leitung 364 mit mindestens einem Reaktionsmittel 366 über eine Leitung 368 kombiniert. Die roten Blutkörperchen werden dann aus der Mischung durch eine funktionell bezeichnete Entfernungsstation 370 für rote Blutkörperchen entfernt. Die roten Blutkörperchen können von der Mischung durch die Station 370 auf eine Anzahl von Arten entfernt werden, wie beispielsweise die Lysis, durch magnetische Mikrosphären oder eine Kombination davon, wie zuvor beschrieben.
Sobald die roten Blutkörperchen im wesentlichen aus der Probenteilmischung 362 entfernt sind, wird ein Teil der Mischung in eine Untersatzverschiebestation 372 gespeist. Wie in der Analysevorrichtung 10 wird jede der interessanten Untersatzpopulationen der weißen Blutkörperchen mindestens eine abgefühlte Zellencharakteristik besitzen, die in der Station 42 modifiziert oder verschoben wurde, um die abgefühlten Zellencharakteristiken der interessanten Untersatzpopulationen von weißen Blutkörperchen von den abgefühlten Zellencharakteristiken der verdeckenden Population von weißen Blutkörperchen und voneinander zu entfernen.
Wiederum kann das Reaktionsmittel 366 zwei Sätze von unterschiedlichen Mikrosphären sein oder diese aufweisen, wobei jede eine Vielzahl von nicht magnetischen Mikrosphären aufweist, und zwar mit einem daran gebundenen Antikörper, der für eine der interessanten Untersatz populationen der weißen Blutkörperchen spezifisch ist.
Das Reaktionsmittel 366 und der Probenteil 362 werden vorzugsweise miteinander vermischt, um die Bindung der Mikrosphären an die interessanten Untersatzpopulationen von weißen Blutkörperchen zu verbessern. Wie zuvor wird eine Vielzahl von Mikrosphären von einem Satz an jeder Zelle von jeder interessanten Untersatzpopulation von weißen Blutkörperchen gebunden. Wodurch jede Zelle mit Mikrosphären beschichtet wird, was die daraus resultierende abgefühlte Zellencharakteristik von jeder Zelle der interessanten Untersatzpopulation von weißen Blutkörperchen modifiziert oder verschiebt.
Der Probenteil 362 wird dann in eine Analysevorrichtung 374 gespeist, die identisch mit der Analysevorrichtung 22 sein kann, und die wiederum mindestens die Anzahl der Zellen in dem Probenteil 32 abfühlt und zählt. Das Analysevorrichtungsinstrument 50 kann das Analyseverfahren der Analysevorrichtung 360 durchführen.
Die Analysevorrichtungen können auch vorzugsweise die absolute Anzahl der weißen Blutkörperchen berechnen und daher auch die absolute Anzahl der Untersatzpopulationen von weißen Blutkörperchen. Dies ist insbesondere nützlich zur Behandlung von Personen mit Aids, da die spezifische CD4-Populationsanzahl bei der Entscheidung verwendet wird, wie eine Medikamentenbehandlung von Aids-Patienten auszuführen ist. Die absolute Anzahl wird durch Zählen der Anzahl der weißen Blutkörperchen in einem spezifischen Volumen in herkömmlicher Weise herausgefunden, wie sie in vielen, kommerziellen Zellenzählinstrumenten der Anmelderin Coulter Electronics,, Inc. ausgeführt wird.
Die verwendeten magnetischen Mikrosphären können von irgendeiner geeigneten Art sein, und sind beispielsweise magnetische Polystyrolmikrosphären mit 0,7 µm Durchmesser, und zwar mit einem Verhältnis von Gewicht zu Volumen von 10% Festkörpern, verkauft von Bangs Laboratories, Camel, Indiana. Die nicht magnetischen Mikrosphären können wiederum von irgendeiner geeigneten Art sein und sind beispielsweise oberflächenreaktionsfreie sulfierte bzw. schwefelsaure Polystyrol-Latex-Mikrosphären von 2,17 um Durchmesser mit einem Verhältnis von Gewicht zu Volumen von 8% Festkörpern, verkauft als IDC-Mikrosphären von Interfacial Dynamics, Portland, Oregon. Obwohl diese spezifischen bzw. speziellen Mikrosphären zu Beispielzwecken verwendet werden, können auch andere Arten und Größen von Mikrosphären aus anderen herkömmlichen Quellen verwendet werden.
Im allgemeinen ist es zur Verschiebung vorzuziehen, Mikrosphären mit einem Durchmesser zu verwenden, der wesentlich geringer ist als der Durchmesser der Zellen bzw. Körperchen, da eine Vielzahl von Mikrosphären sich an jeder Zelle binden sollte. Typischerweise werden Mikrosphären mit Durchmessern von 0,65 bis 3,0 um verwendet, um sicherzustellen, daß das Instrument nicht die freien Mikrosphären selbst als eine indizierte Zelle abfühlt und zählt. Weiterhin könnten sehr große Mikrosphären die Abfühlöffnungen verstopfen oder blockieren, da sich eine Vielzahl von Zellen daran binden könnte, was eine große Mikrosphären- und eine Zellenmasse zur Folge hat. Typischerweise sind nicht magnetische Mikrosphären kostengünstiger und werden daher zu Verschiebungszwecken verwendet, obwohl magnetische Mikrosphären verwendet werden können, um die abgefühlte Zellenverschiebung zu bewirken. Der Bereich der verwendeten Mikrosphären ist auch abhängig von der Wellenlänge des verwendeten Lichtes.
Um Zellen magnetisch zu eliminieren können nur magnetische Mikrosphären verwendet werden. Bei dieser Anwendung ist die Größe der Mikrosphären weniger wichtig, da die Zellen aus der Probe vor dem Abfühlen zu eliminieren sind. Die Mikrosphären sollten ausreichende Mittel sein, um schnell und leicht im Magnetfeld entfernt zu werden. In diesem Fall arbeiten Mikrosphären mit 0,65 bis 4,5 um Durchmesser gut. Da weiter die Zellen nur zu eliminieren sind, könnten Mikrosphären mit einem Durchmesser von 10 oder mehr Mikrometern verwendet werden. Eine Vielzahl von Zellen könnte an jeder Mikrosphäre gebunden werden, da jedoch keine Auszählung stattfinden wird, tritt dies nicht in Gegenwirkung mit dem Betrieb des Instrumentes.

Claims

1. Verfahren zum Erhalt einer Analyse von interessanten Zellen in einer Probe mit einer darin vorhandenen abdeckenden Zellenpopulation, wobei folgendes vorgesehen ist:

Verschieben der abgefühlten Charakteristika der interessanten Zellen bezüglich der abgefühlten Charakteristika der Zellen der abdeckenden Zellenpopulation durch Mischen mit einem ersten Probenteil Mikrosphären oder Mikrokügelchen mit einem damit verbundenen Reaktionsmittel, welches für ein spezielles Molekül an den interessanten Zellen spezifisch ist, wobei die Mikrokügelchen wesentlich kleiner sind als die erwähnten Zellen;

Hindurchführen der Zellen, im wesentlichen einzeln, durch eine Abfühlzone mit einem polarisierten Lichtstrahl, und Abfühlen und Zählen der einzelnen Zellen des Probenteils mit einem lichtstreuenden nicht polarisierten Abfühlparameter; und Verwenden der abgefühlten Parameter zur Charakterisierung der Zellen und zum Erhalt des Beitrags der interessanten Zellen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei zusätzlich vor dem Verschiebeschritt das Abfühlen und Zählen des ersten Probeteils vorgesehen ist und Vergleichen der entsprechenden Zählerstände zum Erhalt des prozentualen Beitrags.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei zusätzlich die abgefühlten Charakteristika einer zweiten interessanten Zellengruppe in dem ersten oder einem zweiten Probenteil verschoben werden, und zwar durch Mischen von Mikrosphären oder Mikrokügelchen, die damit verbunden ein Reaktionsmittel aufweisen, welches für ein spezielles Molekül auf der zweiten interessanten Zellengruppe spezifisch ist.

4. Verfahren zum Erhalt einer Analyse von interessanten Zellen in einer Probe mit einer darin befindlichen abdeckenden Zellenpopulation, wobei folgendes vorgesehen ist:

Hindurchführen der Zellen eines ersten Probenteils, und zwar im wesentlichen einzeln, durch eine einen polarisierten Lichtstrahl aufweisende Abfühlzone, und Abfühlen und Zählen der einzelnen Zellen des ersten Teils mit einem lichtstreuenden nicht polarisierten Abfühlparameter;

Entfernung oder Verschiebung der Zellen der abdekkenden Zellenpopulation aus einem zweiten Probenteil durch Mischen von Mikrosphären oder Mikrokügelchen damit die damit verbunden ein Reaktionsmittel aufweisen, welches für ein spezielles Molekül an den Zellen der abdeckenden Zellenpopulation spezifisch ist;

Hindurchführen der Zellen des zweiten Probenteils, im wesentlichen einzeln durch eine einen polarisierten Lichtstrahl aufweisende Abfühlzone, und Abfühlen und Zählen der einzelnen Zellen des zweiten Probenteils mit einem nicht polarisierten Lichtstreuungsabfühlparameter; und

Vergleichen der zwei Zählerstände zum Erhalt des Beitrags der interessanten abgedeckten Zellen.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Verschieben einer abgefühlten Charakteristik der Zellen in dem zweiten Probenteil vorgesehen ist, und wobei die Mikrosphären wesentlich kleiner als die Zellen sind.

6. Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Probe aus Vollblut besteht, und wobei die abdekkende Zellenpopulation eine Population von weißen Blutkörperchen (WBC-Population) ist, und wobei die oder jede Gruppe von interessanten Zellen eine Suboder Untersatzpopulation der Population von weißen Blutkörperchen ist.

7. Verfahren nach Anspruch 3 und 6, wobei das Verschieben der abgefühlten Charakteristika jeder der Untersatzpopulationen von weißen Blutkörperchen vorgesehen ist und zwar durch Mischen beider Mikrosphären mit einem dritten Probenteil, und Vergleichen der Ergebnisse der ersten, zweiten und dritten Probenteile, um den Prozentsatz des Überlappens der ersten und zweiten Populationsuntersätze von weißen Blutkörperchen zu bestimmen.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, wobei jeder Untersatz aus den CD2-, CD4- und CD8- Populationsuntersätzen von weißen Blutkörperchen ausgewählt ist.

9. Verfahren zum Erhalt einer Analyse einer Population von weißen Blutkörperchen in einer Vollblutprobe, wobei folgendes vorgesehen ist:

Hindruchführen der Zellen der Population von weißen Blutkörperchen, im wesentlichen einzeln, durch eine einen polarisierten Lichstrahl aufweisende Abfühlzone&sub1; und Abfühlen und Zählen der einzelnen Zellen mit einem nicht polarisierten Lichtstreuungsabfühlparameter;

Mischen eines Reaktionsmittels mit dem Probenmikrokügelchen, mit denen das Reaktionsmittel verbunden ist, welches für ein spezielles Molekül an den Zellen eines Populationsuntersatzes von weißen Blutkörperchen spezifisch ist und Entfernen der Mikrosphären mit den daran gebundenen Zellen aus der Probe; Hindurchführen der Zellen der verbleibenden Population von weißen Blutkörperchen, und zwar im wesentlichen einzeln, durch eine einen polarisierten Lichtstrahl aufweisende Abfühlzone, und Abfühlen und Zählen der einzelnen Zellen mit einem nicht polarisierten Lichtstreuungsabfühlparameter; und Vergleichen der zwei Zählerstände zum Erhalt der verbleibenden und/oder der entfernten Population von weißen Blutkörperchen.

10. Verfahren zum Erhalt einer Analyse einer Population von weißen Blutkörperchen in einer Vollblutprobe, wobei folgendes vorgesehen ist:

Hindurchführen der Zellen der Population von weißen Blutkörperchen, im wesentlichen einzeln, durch eine Abfühlzone mit einem polarisierten Lichtstrahl, und Abfühlen und Zählen der einzelnen Zellen mit einem nicht polarisierten Lichtstreuungsabfühlparamater; Verschieben der abgefühlten Charakteristika der Zellen eines Populationssubsatzes von weißen Blutkörperchen durch Mischung mit einer Probe von Mikrosphären, die damit verbunden ein Reaktionsmittel aufweisen, welches für ein spezifisches Molekül auf den Zellen des Untersatzes spezifisch ist, wobei die Mikrosphären wesentlich kleiner sind als die Zellen; Hindurchführen der Zellen, im wesentlichen einzeln, durch eine Abfühlzone einschließlich der individuellen Zellen mit einem nicht polarisierten Lichtstreuungsabfühlparameter; und

Vergleichen der zwei Zählerstände zum Erhalt der verbleibenden und/oder verschobenen Populationen von weißen Blutkörperchen.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Vollblutprobe eine rote Blutzellenpopulation (Population von roten Blutkörperchen) aufweist, wobei zusätzlich das Entfernen der Population von roten Blutkörperchen aus der Probe vorgesehen ist, und zwar ohne die relevanten Qualitäten und/oder Quantitäten der Population von weißen Blutkörperchen signifikanterweise nachteilig zu beeinflussen.

12. Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei das oder jedes Reaktionsmittel ein monoklonaler Antikörper ist und das oder jedes spezifische Molekül ein Antigen ist.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die monoklonalen Antikörper neutrophil spezifisch sind und die interessanten Zellen eine unreife Population von weißen Blutkörperchen aufweisen bzw. sind.

14. Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Zellen zusätzlich mit einem elektronischen Abfühlparameter abgefühlt werden, oder mit mindestens zwei unterschiedlichen elektronischen Abfühlparametern, um mindestens eine zweidimensionale Charakterisierung der Zellen zu liefern.