DE68928085T2

DE68928085T2 - Verfahren zur auslese bestimmter zellen oder zellgebilden anhand von populationen mit ausgewählten merkmalen

Info

Publication number: DE68928085T2
Application number: DE68928085T
Authority: DE
Inventors: Wallace Coulter; Constance Mary Hajek; James Carey Hudson; Kenneth Kortright; Ronald Paul; Carlos Rodriguez; Thomas Russell
Original assignee: Coulter Corp
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 1988-12-16
Filing date: 1989-12-13
Publication date: 1998-01-15
Anticipated expiration: 2009-12-14
Also published as: CN1034242C; JPH04503405A; WO1990007259A3; AU4821890A; AU655154B2; JP2795746B2; CA1339840C; DE68928085D1; EP0472522B1; EP0472522A1; ATE153758T1; BR8907826A; CN1043566A; EP0472522A4; WO1990007259A2

Description

Technisches Gebiet

Diese Erfindung bezieht sich allgemein auf ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Auslese von Zellen oder geformten Körpern bzw. Zellgebilden zum Auszählen der Populationen, die ausgewählte Charakteristiken ausdrücken, und zwar für Forschungs-, Diagnose- oder Industriezwecke. Insbesondere ist die Erfindung auf eine Direktanalyse einer Population von weißen Blutkörperchen und zumindest einem Untersatz davon gerichtet, auf die Analyse von geformten Körpern bzw. Zellgebilden und eine mehrteilige Blutzellenanalyse unter Verwendung einer Kombination der elektronischen Technololgie und von Mikrosphären, die spezielle monoklonale Antikörper besitzen, die daran gebunden sind.

Technischer Hintergrund

Diese Erfindung bezieht sich allgemein auf eine automatisierte Analysevorrichtung und Verfahren zur Anwendung derselben zur Auslese bzw. Abbildung von biologischen Zellen oder geformten Körpern bzw. Zellgebilden zum Auszählen der Populationen, die ausgewählte Charakteristiken ausdrücken, und zwar zu Forschungs-, Diagnose-, medizinischen oder industriellen Zwecken. Insbesondere ermöglichen die automatisierten Analysevorrichtungen und Verfahren, die die Erfindung verkörpern, Mehrfachteilklassifikationen von Zellen und Zellgebilden, eine funktionale Phenotypisierung von Zellen und Zellgebilden, die Typosierung von Leukämie-, Lymphom- und festen Tumorzellen, und zwar unter anderen, unter Verwendung einer einzigartigen Kombination von elektronischer Technologie und der Spezifität bzw. Eigenheit von selektiven biologischen Molekülen, wie beispielsweise Antikörpern, für eine solche Auslese bzw. Abbildung und selektive Auszählung der Zellen und Zellgebilden.
Eine Automatisierung einer routinemäßigen vollständigen Blutzellenanalyse (CBC-Analyse, CBC = complete blood cell) von menschlischem Peripherie- bzw. umlaufendem Blut durch einen automatisierten Blutzellen- bzw. Blutkörperchenzähler wurde erfolgreich vom Coulter Counter -Modell A von Coulter Electronics, Inc., Hialeah, Florida, erreicht. Das Prinzip des elektronischen Partikelabfühlsystems dieses Instrumentes ist im US-Patent 2 656 508 offenbart, welches am 20. Oktober 1953 an Wallace H. Coulter ausgegeben wurde. Die Anwendung von optischen Abfühlmitteln oder Lasern, die ärgerlich und teuer sein kann, wird durch Partikelanalyseinstrumente vermieden, die allein mit diesem Coulter Electronic Abfühlprinzip betrieben werden.
Dieses Coulter-Abfühlprinzip wurde entwickelt und auf kompliziertere Instrumentierung ausgedehnt, wie beispielsweise die COULTER COUNTER -Modell S-Typen der Instrumente, die durch spezielle Computerprogramme die Bestimmung von CBC-Parametern, absolue Zellen- bzw. Körperchenzählungen, eine Plättchenzählung und eine Morphologie, eine Morphologie der roten Blutkörperchen, (RBC- Morphologie, RBC = red blood cell) eine Interpretation von normalen und abnormalen Blutproben ermöglichten.
Das Coulter Electronic-Partikelabfühlprinzip setzt eine Apertur bzw. Öffnungsabfühlschaltung unter Verwendung einer Cleichstrom-(DC = direct current) Aperturversorgung ein. Solche Partikelsensoren sind in der Struktur einfach, extrem belastungsfähig und zuverlässig, wie durch die im wesentlichen allgemeine Akzeptanz der COULTER COUNTER -Automatenanalysevorrichtung in Kliniklaboratorien in den Vereinigten Staaten und im Rest der Welt bescheinigt wird. Eine Verbesserung dieser grundlegenden Aperturabfühlschaltung wurde im US-Patent 3 502 974 offenbart, welches 1970 an Wallace Coulter und Walter Hogg ausgegeben wurde. Zusätzlich zur der herkömmlichen Gleichstrom-Aperturversorgung wurde ein Hochfrequenz-Aperturstrom angelegt, der das Abfühlen von zusätzlichen Parametern für Klassifizierungszwecke ermöglichte. Der Hochfrequenz-Aperturstrom erzeugte ein Signal, wel ches die Funktion der inneren Leitfähigkeit der Blutzellen bzw. Blutkörperchen ist, genau so wie ihres Volumens. Das gleichzeitige von der Gleichstrom-Aperturschaltung erzeugte Signal ist ein herkömmliches DC- bzw. Gleichstrom-Amplitudensignal, welches primär eine Anzeige des Zell- bzw. Körperchenvolumens liefert. Die Radiofrequenzbzw. Hochfrequenzamplitude wird durch die Gleichstrom- Impulsamplitude geteilt, und zwar unter Einsatz einer Hochgeschwindigkeits-Teilerschaltung, um einen Quotienten zu erhalten, der eine Funktion des Zellvolumens und eines inneren Widerstandes ist, auf den im allgemeinen als "Opazität" bzw. Undurchsichtigkeit Bezug genommen wird. Dieses Prinzip wird weiter im US-Patent 3 502 973 beschrieben, welches auch an Wallace Coulter und Walter Hogg 1970 ausgegeben wurde. Dieser Parameter besitzt eine Anwendbarkeit in Zellenklassifikationssystemen. Entweder könnten eine einzige oder ein Paar von getrennten Aperturen für diesen Zweck verwendet werden.
Die Klassifizierung von unterschiedlichen Populationen wird durchgeführt durch Vergleichen der Daten von Signalpaaren, wenn sie erzeugt werden; eines eine Messung des Partikelvolumens und das andere eine Messung des inneren Zellwiderstands bzw. des spezifischen Zellwiderstandes oder der Opazität Eine angenehme Form zur Darbietung dieser Daten ist durch zwei-dimensionale Aufzeichnungen bzw. Kurven, auf die als Scatter-Kurven bzw. Streuungskurven oder Scattergramme Bezug genommen wird. Solche Kurven werden gut beschrieben in "Flow Cytometry and Sorting", Seite 371, herausgegeben von Melamed Melaney und Medelsohn, 1979, John Wiley & Sons, NY. NY.
Fig. 5A ist ein Beispiel einer Datenaufzeichnung bzw. -kurve einer Probe normalen Blutes. Jeder Punkt stellt eine einzelne Zelle bzw. ein einzelnes Blutkörperchen dar. Die Höhe über der Grundlinie stellt das relative Volumen der Zelle dar. Der Abstand des Punktes nach rechts von der vertikalen Grundlinie stellt die relative Opazität dar. Eine Aufzeichnung bzw. Kurve der normalen weißen Blutzellen (WBC) bzw. weißen Blutkörperchen (wobei die roten Blutkörperchen entfernt sind) zeigt drei Ansammlungen von Punkten, die drei getrennte Populationen darstellen, die eine Folge ihrer innewohnenden Unterschiede an Größe und innerer Zusammensetzung sind. Falls erwünscht, können mit einer geeigneten Schaltung diese Populationen gezählt werden, um die Anzahl von jeder zu erhalten. Die Körperchen bzw. Zellen werden auf der Basis dieser innewohnenden Unterschiede klassifiziert.
Anfängliche Anwendungen des Coulter Electronic-Partikelabfühlprinzipes war es, Zählungen von roten Blutkörperchen auszuführen, und dann kompliziertere Bestimmungen von anderen Parametern von roten Blutkörperchen. Durch Entfernen der roten Blutkörperchen aus dem gesamten Umlauf bzw. Peripherieblut konnte eine Analyse der Populationen der weißen Blutkörperchen durchgeführt werden, so lang die Entfernung der roten Blutkörperchen nicht wesentlich die Eigenschaften der restlichen Populationen von weißen Blutkörperchen beeinflußte, die gemessen werden sollten. Lysisreagenten bzw. Lysisreaktionsmittel für rote Blutkörperchen wurden zu diesem Zweck entwickelt, die, obwohl sie nützlich sind und weithin angewendet werden, nicht vollständig zufriedenstellend in jeder Beziehung für darauffolgende Bestimmungen von weißen Blutkörperchen sind.
Vorherige Verfahren der Flußanalyse von Leukozyten unter Verwendung eines DC- bzw. Gleichstromvolumens alleine oder einer Lichtbrechung bei verschiedenen Winkeln haben drei Ansammlungen von Leukozyten entsprechend Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten gezeigt, die die neutrophilen, basophilen und eosinophilen Populationen umfaßten. Eine grobe jedoch nützliche Abschätzung der eosinophilen Konzentration kann bei manchen Proben vorgenommen werden. Die fünfte Hauptpopulation ist für diesen Ansatz relativ zu klein. Die Eosinophilen sind auch als eine getrennte Ansammlung unter Verwendung von speziellen Fluoreszenztechniken beobachtet worden.
Diese Fluoreszenztechniken wurden in Flußzytometriein strumenten verwendet, wie beispielsweise dem EPICS - Flußzytometer, welches von Coulter Corporation erhältlich ist. Solche Instrumente setzen das Prinzip der Zellen bzw. Körperchen ein, die sich in einem Säulenstrom bewegen, und zwar gebunden oder zusammengehalten von einem Scheidefluß, so daß sich die Zellen in einer einzigen Reihe aufreihten und einzeln durch einen Laserstrahl hindurchgingen. Lichtbrechungs- und/oder Fluoreszenzsignale von den Zellen wurden dann bei der Klassifizierung von Zellenpopulationen verwendet. Das Färben von Zellen bzw. Blutkörperchen mit Absorptions- oder Fluoreszenzfarbstoffen machte zusätzliche Zell- bzw. Körperchenpopulationsklassifikationen möglich. Die Entwicklung einer Instrumentierung und von Fluorchromen für eine automatisierte Multiparameteranalyse wird weiter beschrieben durch R. C. Leif und andere in Clinical Chemistry, Vol. 23, Seiten 1492-98 (1977). Diese Entwicklungen haben die Anzahl der gleichzeitigen Populationskassifikationen von Leukozyten auf vier vergrößert, nämlich Lymphozyten, Monozyten, Eosinophile und "Granulozyten" (Neutrophile und Basophile).
Ein neueres analytisches Hämatologie-Instrument hat Lichtbrechungstechniken zusammen mit einer Peroxidase- Enzym-Einfärbung (Absorptionsfarbstoff) der Zellen bzw. Blutkörperchen verwendet, um ein fünfteiliges Leukozy tendifferential bzw. -differentialverfahren zu erzeugen. Darüber hinaus haben Farbstoffe in Kombination mit spezifischen reagierenden biologischen Molekülen, wie beispielsweise monoklonale Antikörper, die Anzahl der möglichen Leukozyten-Klassifikationen gesteigert, um funktionelle Unterabteilungen vorzusehen.
Ein verbessertes einzelnes automatisiertes Instrument und Verfahren zur Verwendung desselbigen, ist in der Stammanmeldung US-Serien-Nr. 025 345 offenbart, die am 13. März 1987 eingereicht wurde, betitelt "AUTOMATED ANALYZER AND METHOD FOR SCREENING CELLS OR FORMED BODIES FOR ENUMERATION OF POPULATIONS EXPRESSING SELECTED CHAPACTERISTICS". Die Stammanmeldung kombiniert die Anwendung von elektronischen Abfühlaperturprinzipien, die Spezifität von ausgewählten biologischen Molekülen zur Identifizierung und/oder Zählung von definierten Populationen von Zellen oder Zellgebilden und die mikroskopische Partikeltechnologie. Die automatisierte Analysevorrichtung kann zusammen mit einem speziellen Lysisreaktionsmittel und/oder Antikörpern verwendet werden, die an mikroskopische Mikrosphären oder Träger von varuender Zusammensetzung gekoppelt sind.
Das selektive Anbringen von mikroskopischen Partikeln macht die Modifikation des Parameters (der Parameter) möglich, die für die ursprüngliche Anordnung von zumindest einer der Populationen verantwortlich ist. Die Massezugabe von mikroskopischen Partikeln zu gewählten Zielpopulationen, wo diese Hinzufügung das gemessene Volumen und/oder die Opazität beeinflußt, hat eine Verschiebung der Stellen der Punkte zur Folge, die eine Population darstellen.
Antikörper von bekannter Art bzw. Spezifität werden beim Beschichten von mikroskopischen Partikeln eingesetzt. Diese Beschichtung gibt dem Partikel die Fähigkeit, sich selektiv an gewisse Zellen anzukoppeln bzw. anzuhaften, die das Antigen ausdrücken, für die der Antikörper spezifisch ist. Diese beschichteten oder angehängten Zellen sind eine Kombination von Partikeln und Zellen, die sich wie eine neue Einheit benehmen. Ihre Parameter von Opazität, Volumen oder sowohl Opazität als auch Volumen können als dargestellt von der Summe der Effekte von sowohl den Zellen als auch den Partikeln in den erhaltenen Signalen angesehen werden. Wenn die Charackteristiken bzw. Merkmale der Komponenten unterschiedlich sind, wird sich die neue Einheit zu einer neuen Position in Übereinstimmung mit dem Netto- bzw. Endeffekt bewegen. Die neue Stelle sollte im Gegensatz zu der früheren Position der Zelle allein eine Klassifikation einer solchen neuen Einheit oder Gruppe von neuen Einheiten gestatten. Wenn die an den Zellen angebrachten Partikel magnetisch sind, dann können natürlich gemäß der gegenwärtigen Praxis die neuen Einheiten durch Anwendung eines Magneten eingefangen wer den. Falls sie schnell gemischt werden, treten unerwartete Ergebnisse einschließlich eines vollständigen Einfangens einer Population ohne nachteilige Beeinflussung der Eigenschaften der studierten Zellen auf.
Nur drei getrennte Zell- bzw. Körperchenpopulationen können leicht aus einer Blutprobe unter Verwendung ihrer inhärenten bzw. innewohnenden und einzigartigen Eigenschaften der zuvor erwähnten Gleichstrom-Volumen- und Opazitäts-Parameter identifiziert und gezählt werden. Zusätzliche Schritte, wie beispielsweise verbesserte Lysis- Systeme müssen vorgenommen werden&sub1; um das Detektieren und Zählen von mehreren Populationen zu ermöglichen. Natürlich stellen diese zusätzlichen Populationen Unterpopulationen von drei grundlegenden Populationen dar, auf die als Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten Bezug genommen wird. Die Schritte, die gemäß der Stammanmeldung ausgeführt werden, demonstrieren wie Unterpopulationen dieser grundlegenden drei Populationen erhalten werden.
Unter Einsatz von solchen einfachen Aperturabfühltechniken in Kombination mit zwei oder mehr biologischen Partikeln kann man eine einzigartige und neue Position der Punktansammlung erzeugen, die eine gegebene Population darstellt. Diese selektive Bewegung von Populationen auf der Punktkurve oder dem Scattergramm ist reproduzierbar und kann verwendet werden, um eine Population zu klassifizieren, die von den drei grundlegenden Populationen getrennt ist.
Die orginale und innewohnende Kombination von Gleichstrom-Volumen- und Opazitätsabfühltechniken kann durch das Anbringen von mikroskopischen Partikeln an den ausgewählten einzelnen Zellen modifiziert werden. Die Selektivität bzw. Unterscheidbarkeit wird den Partikeln durch die Natur oder Art der biologischen Moleküle, unter anderem Antikörper gegeben, die als Beschichtung auf ihren Oberflächen eingesetzt wird. Eine Population von Zellen allein, die keine Partikel auf ihrer Oberfläche haben, kann eine Punktkurvenposition einnehmen, die von anderen Populationen oder Unterpopulationen nicht unterschiedlich ist, und daher können sie voneinander nicht unterscheidbar sein. Das Zugeben von Partikeln mit einer selektiven Anziehung auf spezielle Populationen von Zellen, die man identifizieren, zählen und studieren möchte, ist unter Verwendung dieses Ansatzes möglich. Das selektive Hinzugeben einer ausreichenden Masse von selektiven Partikeln zu einer einzelnen Population von Interesse hat das Verschieben der Punktkurvenstelle dieser Population zur Folge, und zwar als eine Folge der neuen und einzigartigen Kombination von Masse, Volumen und Opazität.
Die Trennung von spezifischen Zellenpopulationen wird durchgeführt ohne materiell bzw. tatsächlich die Eigenschaften der restlichen Zellpopulationen zu beeinträchtigen. Beispielsweise gestattet die Entfernung von Erythrozyten oder roten Blutkörperchen (RBC's) aus dem gesamten Blut gemäß dieser Erfindung die Messung von T4und/oder T8-Lymphozyten, die anderenfalls nicht mit bis jetzt verfügbaren chemischen Lysisreaktionsmittel für rote Blutkörperchen möglich war. Die Verhältnisse der Anzahl der T4- gegenüber den T8-Zellen sind verwendet worden, um Immun- bzw. Immunsystemfehler oder -schwächen anzuzeigen, die bei schweren Virusinfektionen vorkommen, wie beispielsweise unter anderem dem Aids-Virus. Die Anwesenheit von speziellen Rezeptoren an der Oberfläche der Zellen kann verwendet werden, um eine Population in Untersätze einzuteilen bzw. zu klassifizieren, deren Anzahl das Detektieren des Ansatzes der Krankheit gestattet. Beispielsweise besteht bei prädominanten Formen der Leukämie ein scharfer Anstieg bei peripheren Blutlymphozyten. Wenn die Unterpopulation der Lymphozyten, die sich schnell ausbreitet, den T11-Rezeptor trägt, hat der Patient ein Risiko von Immunabnormalitäten.
Wenn weiter die unterpopulation der T11-positiven Lymphozyten den T4-Rezeptor trägt, dann wird der Patient als solches wie üblich in Japan klassifiziert. Wenn darüber hinaus die expandierenden T4-Rezeptorunterpopulationen 2H4-positiv sind, dann wird der Patient nicht nur eine Tendenz zu mehrfachen Infektionen zeigen, sondern genauso auch für akute Leukämie, da die T11-, T4-, 2H4-positive Zelle die Einleitung einer Unterdrückung ist, und funktionell die Fähigkeit des Patienten zur Erzeugung von Antikörpern behindert. Dahingehend ist der Patient mehrfach
Infektionen ausgesetzt und muß sowohl gegen Leukämie als auch gegen Immunschwäche behandelt werden. K. Takatsuki und andere, Gann Monograph on Cancer Research 28:13-22, 1982; C. Morimoto und andere, Coulter Japan Symposium, 1984; C. Morimoto und andere, Immunology 134 (3):1508-1515, 1985; C. Morimoto und andere, New England Journal of Medicine 316(2):67-71, 1987. Die Erfindung läßt sich auch auf die Analyse von Suspensionen von Zellgebilden bzw. geformten Körpern anwenden, wie unter anderen Bakterien und Viren.
Das Verfahren und die Vorrichtung, die die Erfindung verkörpern, können mit einer Vielzahl von immunologischen Reaktionen verwendet werden, wie beispielsweise immunologische Reaktionen, die Reaktionsmittel und geformte Körper bzw. Zellgebilde oder Zellen aufweisen. Zellen sind, wie hier verwendet, definiert als Tier- oder Pflanzenzellen, die getrennt oder in Aggregaten bzw. Ansammlungen identifizierbar sind. Zellen sind die kleinste strukturelle Ansammlung von lebender Materie, die als eine unabhängige Einheit funktionieren kann. Beispiele sind Populationen menschlicher roter und weißer Blutkörperchen, Krebs- oder andere abnormale Zellen aus Gewebeoder Blutproben. Zellgebilde bzw. geformte Körper sind als Bakterien, Viren und Pilze definiert, die auch ein Substrat aufweisen können. Die Erfindung kann bei der Diagnose, Überwachung oder Behandlung von Patienten verwendet werden. Die Erfindung kann insbesondere verwendet werden, um Populaltionen zu eliminieren oder zu verschie ben, um Populationen oder Unterpopulationen zu analysieren, die anderenfalls nicht einfach identifiziert werden können. Es kann erwartet werden, daß die Zellen und Zellgebilde, die geeigneterweise angehängt oder bezeichnet bzw. gekennzeichnet wurden, in vernünftiger Weise von dem Verfahren und der Vorrichtung der Erfindung in der gleichen Weise abgefühlt bzw. bestimmt werden können, wie die Beispiele von menschlichen Blutkörperchen. Die Parameterveränderung kann ohne Bezug auf das Substrat oder einen Mangel davon abgefühlt werden.
Diese Erfindung sieht eine einfache nützliche Analysevorrichtung und Verfahren zur Anwendung dieser vor, die elektronische Partikelabfühltechnologie und die Art bzw. Besonderheit von selektiven biologischen Molekülen kombiniert, um einen beträchtlichen Fortschritt auf dem Gebiet der automatischen Analysevorrichtungen für klinische Laboranwendungen und Industrieanwendungen zu ermöglichen. Das Detektieren von mehrfachen Leukozytenunterpopulationen und ihrer Beziehung zueinander im menschlichen peripheren Blut ist bei der medizinischen Forschung und der Diagnose von menschlichen Seuchen bzw. Krankheiten wichtig. Solche Daten sind als Auslese- bzw. Abbildungswerkzeug zur Identifizierung und Klassifizierung von Krankheiten, wie beispielsweise Leukämie nützlich. Abnormale Situationen, die durch die Einrichtung der Erfindung identifiziert bzw. erkannt werden, liefern hier die diagnostisch relevante Information auf Studiengebieten, die nicht nur auf die Detektion von Leukozyten-Populationen eingeschränkt sind, wie aus der Beschreibung und ihren Zeichnungen offensichtlich werden wird.
Eines der wertvollsten Merkmale dieser Erfindung ist, daß sie den einzigen robusten Coulter-Abfühlvorgang einsetzt. Er ist stabil und erfordert nicht die Komplexität und Kosten von optischen Systemen. Die Schaltungen, die zum Hinzufügen des RF- bzw. Hochfrequenzgenerators und Detektors erforderlich sind, sind wirtschaftlich, kompakt und zuverlässig. Eine einzige Apertur ist alles, was erforderlich ist, aber das Hinzufügen einer zweiten oder sogar einer dritten Apertur bzw. Öffnung kann eine größere Probendurchlaß- bzw. Probendurchsatzrate wirtschaftlich ermöglichen.

Offenbarung der Erfindung

Ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Ausführen der Auslese von Zellen oder Zellgebilden zum Zählen von Populationen, um ausgewählte Merkmale oder Eigenschaften zu identifizieren, die von den Zellen oder Zellgebilden bzw. geformten Körpern oder Untersätzen davon ausgedrückt bzw. gezeigt werden, ist vorgesehen. Ein Differential bzw. Differentialverfahren für mehrere Teile oder für fünf Teile oder Gruppen von weißen Blutkörperchen kann bei einer Vollblutprobe ausgeführt werden, oder bei einer Probe, bei der die roten Blutkörperchen und/oder Populationen der weißen Blutkörperchen entfernt worden sind. Eine Vollblutprobe oder ein Teil davon kann ausgelesen werden, um eine direkte Analyse einer Population von weißen Blutkörperchen oder mindestens eines Untersatzes einer Population von weißen Blutkörperchen zu liefern. Die Population der roten Blutkörperchen wird aus der Probe entfernt oder vorentfemt ohne wesentlich die interessanten Merkmale der Population der weißen Blutkörperchen und eines Untersatzes davon zu beeinflussen.
Die Volumen- und/oder Opazitätsparameter von mindestens dem interessanten Populationsuntersatz der weißen Blutkörperchen werden modifiziert und dann wird zumindest die Population und der Untersatz davon elektronisch analysiert, um zumindest ein Merkmal der Population der weißen Blutkörperchen zu bestimmen. Zumindest ein Untersatz der Population der weißen Blutkörperchen kann zuerst von der Probe abgezogen werden, und zwar vor der Analyse der Population und deren Untersatz. Zwei Untersätze können zur gleichen Zeit modifiziert werden, und zwar durch Vorsehen von unterschiedlich bemessenen Mikrosphären, um jeden Untersatz zu binden. Weiter kann eine Vielzahl von Mikrosphären an jeder der Zellen des interessanten Untersatzes der weißen Blutkörperchen gebunden werden. Diese Verfahren bieten direkte Analysen der weißen Blutkörperchen einschließlich irgendeines erwünschten Untersatzes davon ohne die Anwendung von optischen/lichteinsetzenden Techniken.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die bevorzugten Ausführungsbeispiele dieser Erfindung werden nun beispielhaft beschrieben, wobei Bezug genommen wird auf die Zeichnungen, die dieser Beschreibung beigefügt sind, wobei die Figuren folgendes darstellen:
Fig. 1 - 13 beschreiben die Ausführungsbeispiele, die in der Stammanmeldung Serien-Nr. 025 345 offenbart sind;
Fig. 1 ist ein schematisches Blockdiagramm eines Ausführungsbeispiels einer Zellenpopulationsanalysevorrichtung der Stammanmeldung;
Fig. 2 ist ein schematisches Blockdiagramm eines zweiten Ausführungsbeispiels einer Analysevorrichtung der Stammanmeldung;
Fig. 3 ist ein spezielles Ausführungsbeispiel der Analysevorrichtung der Stammanmeldung entsprechend der Fig. 1 und 2;
Fig. 4 ist ein schematisches Blockdiagramm eines weiteren Ausführungsbeispiels der Analysevorrichtung der Stammanmeldung;
Fig. 5A und 5B sind ein Scattergramm von einem Satz von Ergebnissen, und zwar unter Verwendung eines Prototyp-Analysesystems, welches dem ähnlich ist, welches in den Fig. 2 und 3 veranschaulicht wurde;
Fig. 6 ist ein schematisches Blockdiagramm eines weiteren Ausführungsbeispiels einer Analysevorrichtung der Stammanmeldung;
Fig. 7 ist ein schematisches Blockdiagramm von noch einem weiteren Ausführungsbeispiel einer Analysevorrichtung der grundlegenden Anmeldung;
Fig. 8A und 8B, 9A und 9B, 10A und 10B und 11A und 11B sind ein Scattergramm von einem Satz von Ergebnissen, und zwar unter Verwendung eines Prototyp-Analysesystems, ähnlich dem mit Bezug auf die Fig. 6 und 7 veranschaulichten;
Fig. 12 ist ein schematisches Blockdiagramm von noch einem weiteren Ausführungsbeispiel einer Analysevorrichtung der Stammanmeldung;
Fig. 13 ist ein Scattergramm von einem Satz von Ergebnissen, und zwar unter Verwendung eines Prototyp- Analysesystems, welches dem ähnlich ist, welches mit Bezug auf die Fig. 12 veranschaulicht wurde;
Fig. 14 - 26D sind auf Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung gerichtet;
Fig. 14 ist ein schematisches Blockdiagramm eines Ausführungsbeispiels einer Analysevorrichtung für einen Populationsuntersatz von weißen Blutkörperchen der Erfindung;
Fig. 15 ist ein weiteres schematische Blockdiagramm eines Ausführungsbeispiels einer Analysevorrichtung eines Populationsuntersatzes von weißen Blutkörperchen der Erfindung;
Fig. 16 ist ein spezielles Ausführungsbeispiel einer Analysevorrichtung der Erfindung entsprechend den Fig. 14 und 15;
Fig. 17A und 17B sind ein Scattergramm von einem Satz von Ergebnissen, und zwar unter Verwendung eines Prototyp-Analysesystems, welches dem mit Bezug auf Fig. 3 und 16 veranschaulichten ähnlich ist;
Fig. 18A ist ein Scattergramm der L-, M- und G-Populationen und Fig. 18B ist ein Scattergramm der L-, M- und B-Populationen, und zwar unter Verwendung eines Prototyp-Analysesystems, welches dem mit Bezug auf die Fig. 16 veranschaulichten ähnlich ist;
Fig. 19A-D, 20A-D und 21A-D sind Scattergramme von CD4-, CD8-, CD2- und CD20-Untersatzpopulationen, von Proben von unterschiedlichen Patienten;
Fig. 22A ist ein Scattergramm, welches dem Scattergramm der Fig. 18A ähnlich ist, Fig. 22B ist ein Scattergramm, welches die Verschiebung der E- und N- Populationen veranschaulicht und Fig.22C ist ein Scattergramm, welches die Verschiebung der E-, N- und CD4-Populationen veranschaulicht;
Fig. 23A-D sind Scattergramme, die eine direkte Untersatzanalyse der weißen Blutkörperchen veranschaulicht, und zwar unter Verwendung einer Mikrosphäre, die an den interessanten Untersatz der weißen Blutkörperchen gebunden ist, und einer zweiten Mikrosphäre, die an die erste Mikrosphäre gebunden ist;
Fig. 24A-C sind Scattergramme, die den Effekt der Größe der Mikrosphäre veranschaulichen, die bei der Verschiebungsanalyse der Erfindung verwendet wird;
Fig. 25A-D sind Scattergramme, die eine Simultananalyse von zwei Untersatzpopulationen von weißen Blutkörperchen durch die Techniken der Erfindung veranschaulichen; und
Fig. 26A-D sind Scattergramme der gleichen Population, die bei verschiedenen Parameterscattergrammen bzw. Scattergrammen mit verschiedenen Parametern veranschaulicht werden.

Weg zur Ausführung der Erfindung

Fig. 1-13 beschreiben die Ausführungsbeispiele der Stammanmeldung WO 88/07199.
Mit Bezug auf Fig. 1 ist ein erstes Ausführungsbeispiel eines Zellenpopulations-Analyseverfahrens und einer Vorrichtung der Stammanmeldung WO 88/077199 allgemein durch das Bezugszeichen 10 bezeichnet. Die Analysevorrichtung 10 weist eine biologische Probe 12 auf, die zumindest einen ersten Satz von (nicht veranschaulichten) lebensfähigen biologischen Zellen enthält, wie beispielsweise in oder aus einer Vollblutprobe. Die Zellen der biologischen Probe 12 sollen in einer biologischen Reaktion in einer quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung oder Analyse eingebunden werden. Die Probe 12 kann einen Puffer bzw. ein Puffermittel aufweisen, worin die Zellen zugefügt werden.
Die Probe 12 wird über eine Leitung 14 mit zumindest einem Reaktionsmittel 16 über eine Leitung 18 kombiniert. Die roten Blutzellen bzw. Blutkörperchen (RBC = red blood cells) werden dann aus der Mischung durch eine funktionell bezeichnete RBC-Entfernungsstation bzw. Entfernungsstation 20 für rote Blutkörperchen entfernt. Die roten Blutkörperchen können aus der Mischung durch die Station 20 auf einer Anzahl von Arten entfernt werden. Die roten Blutkörperchen können durch ein Lysismittel im Reaktionsmittel 16 lysiert werden. Ein solches bevorzugtes Lysismittel und ein Lösch- bzw. Dämpfungsmittel welches dabei verwendet werden kann, ist in Serien-Nr. 130 911 offenbart, die am 10. Dezember 1987 eingereicht wurde, betitelt "METHOD AND REAGENT SYSTEM FOR ISOLATION, IDENTIFI- CATION AND/OR ANALYSIS OF LEUKOCYTES FROM WHOLE BLOOD SAMPLES", welche eine CIP der Serien-Nr. 025 303 ist, die am 13. März 1987 unter dem gleichen Titel eingereicht wurde. Das Reaktionsmittel 16 kann eine Vielzahl von magnetischen Mikrosphären sein oder diese aufweisen, wobei ein für die roten Blutkörperchen spezifischer Antikörper an die (nicht gezeigten) Mikrosphären gebunden ist. In diesem Beispiel wird der spezielle verwendete für die roten Blutkörperchen spezifische Antikörper in der Anmeldung Serien-Nr. 799 489 offenbart, die am 19. November 1985 eingereicht wurde, betitelt "MONOCLONAL ANTIBODY FOR RECOVERY OF LEUKOCYTES IN HUMAN PERIPHERAL BLOOD AND METHOD OF RECOVERY EMPLOYING SAID MONOCLONAL ANTIBODY". Das Reaktionsmittel 16 kann auch einen Puffer zusätzlich oder anstelle des Probenpuffers aufweisen. Das Reaktionsmittel 16 kann weiter eine Kombination des bevorzugten Lysismittels für rote Blutkörperchen und der für die roten Blutkörperchen spezifischen Mikrosphären sein.
Sobald die roten Blutkörperchen im wesentlichen aus der Mischung entfernt worden sind, wird ein Teil der Mischung in eine Analysevorrichtung 22 für weiße Blutkörperchen (WBC = white blood cell) über eine Leitung 24 eingespeist. Die Analysevorrichtung 22 für weiße Blutkörperchen zählt zumindest die Anzahl der weißen Blutkörperchen in der Mischung. Die Analysevorrichtung 22 für weiße Blutkörperchen kann auch einen oder mehrere Volumen oder Opazitätsparameter der weißen Blutkörperchen messen. Die Ergebnisse aus der Analysevorrichtung 22 werden zu einem Komparator bzw. einer Vergleichsvorrichtung 26 über eine Leitung 28 gespeist.
Ein zweiter Teil der Mischung mit ausgelöschten bzw. herausgenommenen roten Blutkörperchen wird an eine Untersatzabzugsstation 30 für weiße Blutkörperchen über eine Leitung 32 gespeist. Die weißen Blutkörperchen kön- nen dann aus der Mischung in einer Anzahl von Arten abgezogen bzw. entfernt werden. Mikrosphären mit einem monoklonalen Antikörper, der für einen der daran gebundenen Untersätze von weißen Blutkörperchen spezifisch ist, kann zu der Mischung hinzugefügt werden. Nicht-magnetische Mikrosphären können an die weißen Blutkörperchen gebunden werden, um die daraus resultierenden Opazitäts- oder Volumenparameter der Zellen zu verändern oder zu verschieben. Magnetische Mikrosphären können auch an die weißen Blutkörperchen gebunden werden, die dann aus der Mischung durch ein magnetisches Feld entfernt werden können.
Die Mischung, bei der die Untersatzpopulation der weißen Blutkörperchen entfernt wurde oder bei der einer oder mehrere Parameter verändert wurden, wird dann an eine Untersatzanalysevorrichtung 34 für weiße Blutkörperchen über eine Leitung 36 gespeist. Die Analysevorrichtung 34 kann identisch mit der Analysevorrichtung 22 sein. Die Ergebnisse der Analysevorrichtung 34 werden dann an dem Komparator 26 über eine Leitung 38 gespeist. Der Komparator 26 kann dann die Ergebnisse der weißen Blutkörperchen aus der Analysevorrichtung 22 mit den modifizierten Ergebnissen von der Analysevorrichtung 34 vergleichen, um mindestens ein Merkmal der ausgewählten Population von weißen Blutkörperchen zu bestimmen, wie beispielsweise die Anzahl der Zellen in einem speziellen Bereich.
Mit Bezug auf Fig. 2 wird ein zweites Ausführungsbeispiel eines Zellen- bzw. Blutkörperchenpopulationsanalyseverfahrens und einer Vorrichtung, die die grundlegende Anmeldung verkörpern, im allgemeinen durch das Bezugszeichen 40 bezeichnet. Die Analysevorrichtung 40 weist eine biologische Probe 42 auf, die wiederum zumindest einen ersten Satz von (nicht gezeigten) lebensfähigen biologischen Zellen enthält, wie beispielsweise in einer Vollblutprobe oder aus einer Vollblutprobe. Die Zellen der biologischen Probe 42 sollen in einer biologischen Reaktion bei einer quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung oder Analyse verwendet bzw. eingebracht werden. Die Probe 42 kann wiederum einen Puffer bzw. ein Puffermittel aufweisen, worin die Zellen zugeführt werden.
Die Probe 42 wird über eine Leitung 44 mit zumidest einem Reaktionsmittel 46 über eine Leitung 48 kombiniert. In der Analysevorrichtung 40 werden die roten Blutkörperchen aus der Mischung entfernt und gleichzeitig wird zumindest ein Merkmal von mindestens einem Untersatz von weißen Blutkörperchen verändert oder verschoben, und zwar durch eine funktionell bezeichnete RBC-Entfernungs- und WBC- Verschiebungsstation 50. Wie oben bemerkt, können die roten Blutkörperchen aus der Mischung durch die Station auf eine Anzahl von Arten entfernt werden, die zuvor mit Bezug auf die Station 20 aufgezählt wurden. Gleichzeitig werden in der gleichen Mischung die weißen Blutkörperchen an allgemein nicht-magnetische Mikrosphären gebunden, um die daraus folgenden Opazitäts- und/oder Volumenparameter der Zellen zu verändern oder zu verschieben.
Die Mischung, bei der die roten Blutkörperchen entfernt sind und die Untersatzpopulation der weißen Blutkörperchen verschoben ist, wird dann an eine Analysevorrichtung 52 über eine Leitung 54 gespeist. Die Analysevorrichtung 52 kann im wesentlichen identisch mit der Analysevorrichtung 22 sein. Die Analysevorrichtung 40 sieht somit eine schnelle direkte Analyse von mindestens einem Merkmal einer ausgewählten Population von weißen Blutkörperchen oder einem Untersatz von weißen Blutkörperchen vor.
Ein spezielles Ausführungsbeispiel eines Analyseinstrumentes, welches die Stammanmeldung verköpert und welches die Analyseverfahren der ersten und zweiten Analysevorrichtungen 10 und 40 durchführen kann, wird im allgemeinen durch das Bezugszeichen 56 in Fig. 3 bezeichnet.
Im Instrument 56 wird nur eine spezielle Aufzählung veranschaulicht, die in nahezu endlosem Detail variiert werden kann, und zwar gemäß der Prinzipien der Stammanmeldung. Weiter ist das Instrument 56 im allgemeinen im Funktionsdetail beschrieben, und die speziellen Ausführungsbeispiele können strukturell auf viele verschiedene Arten eingerichtet werden.
Das Instrument 56 weist einen Ansaugpumpmechanismus 58 auf, der verwendet wird, um die interessante biologische Probe anzuziehen, beispielsweise die Probe 12 oder 42, und zwar in das Instrument 56. Die Ansaugvorrichtung 58 ist über eine Leitung 60 mit einem Probenventil 62 gekoppelt, welches an eine Probensonde 63 gekoppelt werden kann. Eine Lysismittelpumpe 64 kann das Lysismittel aufweisen bzw. zugeben, wie beispielsweise als Teil des Reaktionsmittels 18 oder 46, und ist auch an das Ventil 62 über eine Leitung 66 gekoppelt. Das Ventil 62 und die Pumpe 58 können die biologische Probe 12 oder 42 zusammen mit dem Lysismittel gegebenenfalls über die Pumpe 64 ansaugen.
Die Reaktionsmittelmischung der biologischen Probe selbst, wird dann über eine Auslaßleitung 68 in eine Mischvorrichtung 70 gespeist. Die Mischvorrichtung 70 weist eine Mischkammer 72 auf, in die die Probe oder das Reaktionsmittel gespeist wird. An diesem Punkt des Betriebes unterscheiden sich die Analysevorrichtung 10 und 40 und werden daher getrennt beschrieben.
Wenn im Fall der Analysevorrichtung 10 die roten Blutkörperchen von dem Lysismittel von der Pumpe 64 lysiert worden sind, wird dann, wenn die Reaktion vollständig ist, ein Lösch- bzw. Dämpfungsmittel oder Fixierungsmittel von einer Station 74 über eine Leitung 76 geliefert. Der Reaktion kann beigeholfen werden durch Mischen des Lysismittels und der Probe in der Kammer 72, wie funktionell bei 78 veranschaulicht wird.
Spezielle Details einer geeigneten Mischvorrichtung 70, die darin verwendet werden kann, sind in Serien-Nr. 025 337 offenbart, die am 13. März 1987 eingereicht wurde, betitelt "METHOD AND APPARATUS FOR RAPID MIXING OF SMALL VOLUMES FOR ENHANCJNG BIOLOGICAL REACTIONS". Durch Verwendung des Mischers 70 werden die Reaktionen stark in der Geschwindigkeit beschleunigt, ohne wesentlich die interessanten Eigenschaften der Zellen zu schädigen, wie beispielsweise durch Anheben der Reaktionstemperatur auftreten kann. Weiterhin werden die Reaktionen im allgemeinen in beträchtlich weniger als einer Minute vollendet, im allgemeinen in der Größenorndung von 15 Sekunden oder weniger. Dies gestattet eine schnelle Analyse des automatischen Analyseinstrumentes 56 mit großem Volumen.
Das gelöschte bzw. gedämpfte Reaktionsmittel, bei dem die roten Blutkörperchen von dem Lysismittel entfernt worden sind (wie von der Station 20), wird dann über eine Leitung 80 zu einer Haltekammer 82 gespeist, die in diesem Fall einen zweiten Teil der Mischung halten wird. Ein erster Teil der Mischung wird von der Kammer 82 über eine Leitung 84 zur Analysevorrichtung 86 für weiße Blutkörperchen gespeist werden (d. h. die Analysevorrichtung 22). Die Analysevorrichtung 86 kann viele physische Bauarten aufweisen, und zwar gemäß der Zähl- und Bemessungstechniken, die von Wallace H. Coulter im US-Patent 2 656 508 beschrieben wurden, und in zahlreichen im Handel erhältlichen Blutkörperchenzählvorrichtungen des Anmelders Coulter Electronics Inc. verkörpert wurden.
Die Analysevorrichtung 86 weist im allgemeinen einen Flußsensor oder eine Abfühlkammer 88 auf. Die Kammer 88 weist einen Wandler 90 auf, und zwar mit einer Öffnung 92 dadurch. Die Kammer 88 weist einen ersten Teil 99 auf, der eine erste Elektrode 96 besitzt, die in Kontakt mit dem Strömungsmittel darin ist.
Der Kammerteil 94 und die Elektrode 96 stehen durch die Apertur bzw. Öffnung 92 mit einem zweiten Kammerteil 98 mit einer zweiten Elektrode 100 darin in Verbindung. Die Elektroden 96 und 100 sind über Reaktionsleitungen 102 und 104 mit einer RF/DC- bzw. Rochfrequenz/Gleichstrom- Quellen- und Abfühlschaltung 106 verbunden. Die Schaltung 106 koppelt sowohl einen Gleichstrom- oder Niederfrequenzstrom oder ein Signal als auch ein Hochfrequenzsignal zwischen den Elektroden 96 und 100.
Das Niederfrequenzsignal wird verwendet, um die Amplitude eines Signalimpulses abzufühlen, der von einer Zelle bewirkt wird, die durch die Öffnung 92 hindurchgeht. Das Hochfrequenzsignal wird verwendet, um die elektrische Opazität der gleichen Zelle zu erhalten, die durch die Öffnung 92 hindurchgeht.
Die Messung der elektrischen Opazität bzw. Undurchsichtigkeit von Zellen wurde von Wallace H. Coulter und Walter R. Hogg im US-Patent 3 502 974 und mehreren Patenten und Veröffentlichungen der Anmelderin Coulter Electronics Inc. seit diesem Patent beschrieben. Eine spezielle Schaltung, die hier verwendet werden kann, ist im Fall 168 008 offenbart, betitelt "PARTICLE ANALYZER FOR MEASU- RING THE RESISTANCE AND REACTANCE OF A PARTICLE", eingereicht am 21.Oktober 1986, nun US-Serien-Nr. 921 654.
Die von der Schaltung 106 erzeugten Signale von den abgefühlten Zellen bzw. Blutkörperchen werden über eine Gleichstrom-Signalleitung 108 und eine RF- bzw. Hochfrequenz-Signalleitung 110 mit einem Komparator 112 (wie dem Komparatur 26) gekoppelt. Der Komparator 112 kann das vom ersten Teil erzeugte Signal halten, d. h. jenes, wobei der Untersatz der weißen Blutkörperchen nicht abgezogen wurde, und zwar für einen Vergleich mit den Ergebnissen vom zweiten zu beschreibenden Teil.
Die Analysevorrichtung 86 kann einen Scheidefluß bzw. eine Scheideströmung aufweisen, um die Zellen im Sensor 88 in wohl bekannter Weise zu fokussieren. Der Scheidefluß kann durch ein Strömungssystem 114 vorgesehen werden, und zwar gekoppelt mit dem Sensor 88 durch ein Paar von Leitungen 116 und 118 in bekannter Weise. Die Probenreaktionsmischung kann in den Sensor 88 über einen Einleitungsschlauch bzw. ein Einleitungsrohr 120 gespeist werden, und kann von dem Sensor 88 über einen Auslaßrohr 122 in einen Abfallbehälter 124 gespeist werden.
Während der erste Teil der Mischung von der Analysevorrichtung 86 analysiert wurde, wird der zweite Teil in der Kammer 82 gehalten, während die Mischvorrichtung 72 gereinigt oder geflutet bzw. durchgespült wird, und zwar über eine Ablaufleitung 126 und durch eine Abfalleitung 128 ausgestoßen bzw. gelehrt wird. Sobald die Kammer 72 gereinigt ist, wird der zweite Teil zurück in die Kammer 72 über eine Leitung 130 eingespeist. Wie bei der Station 30 wird der Untersatz der weißen Blutkörperchen nun abgezogen, und zwar durch Hinzufügen der Mikrosphären für die weißen Blutkörperchen von einer Station 132 über eine Leitung 134, ein Ventil 136 und eine Kammerleitung 138.
Die Mikrosphären für die weißen Blutkörperchen werden mit dem zweiten Teil des Mischmechanismus 78 gemischt. Wenn die Mikrosphären für die weißen Blutkörperchen nicht magnetisch sind, wird die Reaktionsmischung mit den gebundenen Mikrosphären für die weißen Blutkörperchen über die Leitung 80, die Kammer 82 und die Leitung 84 in die Analysevorrichtung 86 (d. h. bzw. wie die Analysevorrichtung 34) gespeist, worin der zweite Teil wie der erste Teil analysiert wird, und die Ergebnisse werden dann im Komparator 112 (d. h. bzw. wie dem Komparator 26) verglichen. Zumindest einer der Untersatzzellenparameter der weißen Blutkörperchen wird im zweiten Teil verändert, wie beispielsweise die Zellen- bzw. Körperchenopazität, und zwar durch die an den Untersatz der weißen Blutkörperchen gebundenen Mikrosphären, um die veränderten Ergebnisse zu liefern, die dann analysiert werden können.
Wenn die Mikrosphären für die weißen Blutkörperchen magnetisch sind, dann wird der Untersatz der weißen Blutkörperchen, der daran gebunden ist, von einem Magnetfeld während und/oder nach dem Mischprozeß durch ein Magnetfeld oder einen Magneten 140 entfernt. Das Feld kann durch elektromagnetische Mittel vorgesehen werden, oder dadurch, daß der Magnet 140 physisch mit Bezug auf die Kammer 72 bewegt wird, um den magnetisch gebundenen Untersatz der weißen Blutkörperchen einzufangen. Der zweite Teil ohne dem gebundenen Untersatz der weißen Blutkörperchen wird dann über die Leitung 80, die Kammer 82 und die Leitung 84 zur Analysevorrichtung 86 in der zuvor beschriebenen Weise eingespeist, um die Analyse zu erhalten (wie bei der Analysevorrichtung 34).
Das Instrument 56 wird dann vorbereitet, um die nächste Probe für die nächste Analyse aufzunehmen. Die Sonde 63 kann von einem Sondenreinigungs- bzw. Sondenspülmechanismus 142 gereinigt werden und die Leitungen und Kammern 72 und 82 können in herkömmlicher Weise durchgespült werden. Jede Analyse der daraufolgenden Probenmischung wird in schneller und automatischer Weise erhalten. Die Periode zwischen der Analyse von aufeinanderfolgenden Probenmischungen kann in der Größenordnung von Minuten oder weniger sein.
Beim Betrieb des Analyseinstrumentes 56, wie der Analysevorrichtung 40, wird die Reaktionsmischung mit dem Lysis/Reaktionsmittel 46 für die roten Blutkörperchen und der Probe 42 in der Kammer 72 zusammen mit nicht-magnetischen Mikrosphären für weiße Blutkörperchen von der Station 132 vermischt, die einen der Untersätze der weißen Blutkörperchen binden. Das Dämpfungs- bzw. Löschmittel 74 wird zu der reaktiven Mischung zugegeben, die dann über die Leitung 80, die Kammer 82 und die Leitung 84 zur Analysevorrichtung 86 für weiße Blutkörperchen für eine Analyse gespeist wird (d. h. wie die Anlysevorrichtung 52).
Alternativ zur Verwendung des Lysismittels in irgendeiner der Analysevorrichtungen 10 und 40 können die Proben 12 oder 42 zum Mischer 70 über das Ventil 62 ohne irgendeine Lysis bzw. ein Lysismittel eingespeist werden. In diesem Fall können die roten Blutkörperchen magnetisch entfernt werden, und zwar unter Verwendung der Mikrosphären, wobei der für die roten Blutkörperchen spezifische Antikörper daran gebunden ist, und zwar von einer Mikrosphärenstation 144 für rote Blutkörperchen, und können zum Ventil 136 über eine Leitung 146 und daher zur Kammer 70 über die Leitung 138 gespeist werden. Wenn keine Lysis bzw. kein Lysismittel verwendet wird, werden die gebundenen roten Blutkörperchen magnetisch vom Magneten 140 entfernt, und zwar nach der Mischung in einer Weise, die im wesentlichen identisch ist mit den magnetisch gebun- denen weißen Blutkörperchen, die oben beschrieben wurden.
Weiterhin kann in einem zweiten Fall zur Begünstigung der Reaktionsgeschwindigkeit eine Reaktionsmischung der Probe mit sowohl dem Lysismittel der roten Blutkörperchen als auch den Magnetkugeln für die roten Blutkörperchen verwendet werden. Die Reaktsionsmischung wird gemischt, das Lysismittel wird gelöscht bzw. gedämpft und die gebundenen roten Blutkörperchen werden magnetisch entfernt, und dann werden die weißen Blutkörperchen, wie zuvor beschrieben, analysiert.
Mit Bezug auf Fig. 4 ist ein weiteres Ausführungsbeispiel eines Zellenpopulations-Analyseverfahrens und einer Vorrichtung, die die Stammanmeldung verkörpern, im allgemeinen durch das Bezugszeichen 148 bezeichnet. Die Analysevorrichtung 148 weist eine biologische Probe 150 auf, die wiederum zumindest einen ersten Satz von lebensfähigen biologischen Zellen enthält wie beispielsweise in oder aus einer Vollblutprobe. Die Probe 150 kann wiederum einen Puffer bzw. ein Puffermittel aufweisen, worin die Zellen zugefügt werden.
Die Probe 150 wird über eine Leitung 152 mit zumindest einem Reaktionsmittel 154 über eine Leitung 156 kombiniert. Die roten Blutkörperchen werden dann, wie oben beschrieben, durch eine funktionell bezeichnete Entfernungsstation 158 für rote Blutkörperchen entfernt. Die Reaktionsmischung, bei der die roten Blutkörperchen entfemt sind, wird über eine Leitung 160 in eine Analysevorrichtung 162 für weiße Blutkörperchen eingespeist. Die Ergebnisse von der Analysevorrichtung 162 werden an einen Komparator 164 über eine Leitung 166 gespeist bzw. geleitet, wodurch ein dreiteiliges Differential bzw. Differentialverfahren für weiße Blutkörperchen mit Ergebnissen für Monozyten (M), Lymphozyten (L) und Granulozyten (G) vorgesehen wird.
Die Mischung wird dann an eine funktionell bezeichnete Neutrophil (N) Entfernungsstation 168 über eine Leitung 170 gespeist. Die Ns können aus der Mischung entfernt werden, und zwar durch Verschieben oder Verändern eines Parameters, wie beispielsweise der Opazität, oder durch magnetische Entfernung, was beides oben beschrieben wurde. In diesem Beispiel ist der spezielle verwendete N- spezifische Antikörper im Fall 168 306 offenbart "MONOCLONAL ANTIBODY SPECIFIC TO NEUTROPHILS", eingereicht am 8. Dezember 1986, nun US-Serien-Nr. 938 864.
Die Mischung, bei der die Ns entfernt sind oder verschoben, wir dann zu einer weiteren Analysevorrichtung 172 für weiße Blutkörperchen über eine Leitung 174 gespeist. Die Ergebnisse der Analysevorrichtung 172 werden an den Komparator 164 über eine Leitung 176 gespeist. Die Ergebnisse der Analysevorrichtung 172 werden verwendet, um einen vier-teiligen Differentialvorgang bzw. ein Differential für weiße Blutkörperchen zu erhalten, und zwar wiederum mit Ergebnissen für Ms und Ls, jedoch werden nun zusätzlich Ergebnisse für Eosinophile (E) und Basophile (B) erhalten, da die Ns verschoben oder entfernt wurden. Die zwei analytischen Ergebnisse aus den Anaylsevorrichtungen 162 und 172 können dann durch den Komparator 164 verglichen werden, um ein fünfteiliges Differential für weiße Blutkörperchen zu bilden. Insbesondere hat das Abziehen der Anzahl der Bs und Es aus der Anzahl der Gs die Anzahl der entfernten Ns zur Folge.
Mit Bezug auf die Fig. 5A und 5B werden zwei Sätze von Scattergramm-Ergebnissen veranschaulicht, die aus einer Vollblutprobe erhalten wurden, und zwar unter Verwendung eines Prototyp-Anaiyseverfahrens, ähnlich der Analysevorrichtung 148. Die biologische Probe 150 war eine Vollblutprobe von 20 Mikrolitern, die mit 40 Mikrolitern der magnetischen Mikrosphären kombiniert wurde, wobei der für die roten Blutkörperchen spezifische Antikörper daran gebunden war, und zwar kombiniert mit 140 Mikrolitern einer Pufferlösung, um das Reaktionsmittel 154 zu bilden. Die Reaktionsmischung wurde für 15 Sekunden gemischt und in einem Magnetfeld für 10 Sekunden in der Station 158 angeordnet. Die Mischung, bei der die roten Blutkörperchen entfernt wurden, wurde von der Analysevorrichtung 162 analysiert, und zwar wie veranschaulicht im Scattergramm der Fig. 5A, was Zählungen der Ls von 45,6 (1), der Ms von 5,6 (2) und der Gs von 48,7 (3) zur Folge hatte.
Die Mischung wird dann in der Station 168 mit 10 Mikrolitern magnetischer Mikrosphären kombiniert, an die der N- spezifische Antikörper gebunden ist. Die Mischung wird für 30 Sekunden gemischt und für 10 Sekunden in einem Magnetfeld angeordnet. Die Mischung mit den dann entfernten NS wurde zur Analysevorrichtung 176 gespeist, was das Scattergramm der Fig. 5B zur Folge hatte, und zwar mit der Folge der Auszählungen von Ls von 81,0 (1), Ms von 0,6 (2), Es von 11,0 (3) und Bs von 1,8 (4). Der Komparator 164 liefert dann das fünfteilige Differential der weißen Blutkörperchen der Zählungen von 45,6 Ls, 5,6 Ms, 41,6 Ns, 6,0 Es und 1,2 Bs. Dies entspricht einem herkömmlichen mikroskopischen fünfteiligen Differential der weißen Blutkörperchen unter Verwendung eines Wright- Tropfens auf der Probe auf einem Objektträger, was Zählungen von 44,0 Ls, 3,4 Ms, 45,0 Ns, 6,1 Es und 0,4 Bs zur Folge hat.
Fig. 6 veranschaulicht ein weiteres Ausführungsbeispiel eines Zellenpopulations-Analyseverfahrens und einer Vorrichtung, die die Stammanmeldung verkörpert, und zwar allgemein durch das Bezugszeichen 178 bezeichnet. Die Analysevorrichtung 178 weist eine biologische Probe 180 auf, die wiederum mindestens einen ersten Satz von lebensfähigen biologischen Zellen bzw. Körperchen enthält, und auch einen Puffer aufweisen kann.
Die Probe 180 wird über eine Leitung 182 mit einem Reaktionsmittel 184 über eine Leitung 186 kominiert. Funktionell veranschaulicht wird ein erster Teil der Mischung über eine Leitung 188 zu einer funktionell bezeichneten Entfernungsstation 190 für rote Blutkörperchen und Ns gespeist. Die roten Blutkörperchen und die Ns werden entfernt oder verschoben, wie zuvor beschrieben, und der erste Teil wird über eine Leitung 192 an eine Analysevorrichtung 194 für weiße Blutkörperchen gespeist.
Dies liefert ein Ergebnis aus der Analysevorrichtung 194, welches über eine Leitung 196 zu einem Komparator 198 gespeist wird. Das Ergebnis weist das oben erwähnte vierteilige Differential auf, und zwar einschließlich der Ms, der Ls, der Es und der Bs.
Zur gleichen Zeit wird ein zweiter Teil der Mischung der Probe 180 und des Reaktionsmittels 184 über eine Leitung 200 eingespeist, und zwar zu einer funktionell bezeich neten Entfernungsstation 202 für rote Blutkörperchen. Die Mischung, bei der die roten Blutkörperchen entfernt wurden, wird über eine Leitung 204 zu einer weiteren Analysevorrichtung 206 für weiße Blutkörperchen gespeist. Die Ergebnisse der Analysevorrichtung 206 werden an den Kom parator 198 über eine Leitung 208 gespeist. Die Ergebnisse der Analysevorrichtung 206 weisen direkt das oben erwähnte drei-teilige Differential für weiße Blutkörperchen auf, und zwar einschließlich der M,s, der Ls und der Gs. Die Ergebnisse der Analysevorrichtungen 194 und 206 werden dann vom Komparator 198 verglichen, um das fünfteilige Differential für weiße Blutkörperchen zu liefern.
Ein spezielles Ausführungsbeispiel eines Analyseinstrumentes, welches das Verfahren und die Vorrichtung der Analysevorrichtung 178 aufweist, wird im allgemeinen durch das Bezugszeichen 210 in Fig. 7 bezeichnet. Wiederum ist nur eine spezielle Hardwareaufzählung bzw. -anordnung veranschaulicht worden, jedoch kann, wie bei dem Analyseinstrument 56 das Analyseinstrument 210 in zahlreichen Konfigurationen aufgebaut werden.
Das Instrument 210 weist einen Ansaug-Spül-Mechanismus 212 auf, der mit einem Probeventil 214 über eine Leitung 216 gekoppelt ist. Das Ventil 214 kann eine Probensonde 218 aufweisen, um die interessante biologische Probe anzusaugen, wie beispielsweise die Probe 180. Eine Verdünnungsmittellieferpumpe 220 ist mit dem Ventil 214 über eine Leitung 225 gekoppelt, um ein Verdünnungsmittel für die Probe zu liefern, wie beispielsweise die Vollblutprobe, falls erwünscht. Ein erster Teil der Mischung wird dann über eine Leitung 224 und eine Leitung 226 mit einer ersten Mischvorrichtung 228 gekoppelt. Zu gleichen Zeit wird ein zweiter Teil der Mischung über eine Leitung 224 und eine Leitung 230 zu einer zweiten Mischvorrichtung 232 gespeist.
Der Mischer 228 (vergleichbar mit der Station 190) ist im wesentlichen mit dem Mischer 232 (vergleichbar mit der Station 202) identisch, und wird zuerst beschrieben werden. Der Mischer 228 weist eine Mischkammer 234 auf, in die der erste Mischungsteil eingespeist wird. Der Mischer 228 weist alle die verschiedenen oben beschriebenen Optionen auf, und kann eine Lysismitteleinlaßleitung 236 für das Lysismittel für die roten Blutkörperchen aufweisen, falls erwünscht. Falls das Lysismittel verwendet wird, wird nach einer Mischung, wie funktionell bei 238 gezeigt, das Dämpfungsmittel über eine Dämpfungs mittelleitung 240 zugefügt. Zur gleichen Zeit werden die Ns durch das Hinzufügen der geeigneten magnetischen oder nicht-magnetischen Mikrosphären entfernt, wobei der N- spezifische Antikörper daran gebunden ist, und zwar aus einer Quelle von Mikrosphären 242, die zur Kammer 234 über eine Leitung 244 gespeist werden. Wenn die magnetischen Mikrosphären für die Ns oder die roten Blutkörperchen verwendet werden, dann wird ein Magnet 246 oder ein Magnetfeld verwendet, um die magnetisch gebundenen Zellen zu entfernen.
Die gemischte und gedämpfte (wo nötig) Mischung wird dann über eine Leitung 248 durch ein Ventil 250 und eine Leitung 252 zu einer Analysevorrichtung 254 für weiße Blutkörperchen (d. h. der Analysevorrichtung 194) gespeist. Die Analysevorrichtung 254 ist die gleiche wie die Analysevorrichtung 86 und wird nicht wieder so genau beschrieben. Wiederum weist die Analysevorrichtung 254 eine Abfühlkammer 256 mit einer Apertur bzw. Öffnung 258 darin auf, durch die die Mischung und die Zellen hindurchlaufen. Ein Scheidefluß-Strömungssystem 260 kann mit der Kammer 256 gekoppelt sein. Die von den Zellen erzeugten Signale werden von einer RF/DC- bzw. Hochfrequenz/Gleichstrom-Quellen- und Abfühlschaltung 256 detektiert, deren Ausgangsgrößen zu einem Komparator 264 gespeist werden, wie zuvor beschrieben.
Gleichzeitig wird der zweite Mischungsteil in eine Mischkammer 266 gespeist. Im zweiten Teil werden nur die roten Blutkörperchen entfernt (d. h. wie die Station 202) und die roten Blutkörperchen können von dem Lysismittel für rote Blutkörperchen entfernt werden, welches in die Kammer 266 über eine Leitung 268 eingespeist wird. Das Lysismittel wird mit der Probe vermischt und dann wird ein Dämpfungsmittel über eine Dämpfungsmittelleitung 270 hinzugefügt. Alternativ können die roten Blutkörperchen durch magnetische Mikrosphären entfernt werden, an die ein für die roten Blutkörperchen spezifischer Antikörper gebunden ist, und zwar von einer Mikrosphären-Quelle 274, die in die Kammer 266 über eine Leitung 274 gespeist wird. Die Mikrosphären werden funktionell bei 276 ge mischt und dann werden die magnetisch gebundenen Mikrosphären für rote Blutkörperchen von einem Magneten 278 entfernt.
Die Mischung mit entfernten roten Blutkörperchen wird dann über eine Leitung 280 zum Ventil 250 und über die Leitung 252 zur Analysevorrichtung 254 gespeist, um die oben erwähnten Ergebnisse zu erhalten. Die Mischer 228 und 232 weisen geeignete jeweilige Spülleitungen 282 und 284 und Ablaufleitungen 286 und 288 und eine Sondenspülung 290 auf, um das Instrument 210 vor dem Ansaugen der nächsten Probe oder der Probe zur Analyse zu reinigen.
Fig. 8A und 8B veranschaulichen Scattergramm-Ergebnisse, die aus einer Vollblutprobe unter Verwendung eines ähnlichen Analyseverfahrens wie bei der Anlysevorrichtung 178 erhalten wurden. In diesem Beispiel bilden 20 Mikroliter Vollblut die Probe 180, während 40 Mikroliter magnetische Mikrosphären, an die der für die roten Blutkörperchen spezifische Antikörper gebunden ist, mit 140 Mikrolitern einer Pufferlösung kombiniert, das Reaktionsmittel 184 bilden. Ein Teil der Mischung wird für 20 Sekunden in der Station 202 gemischt und dann für 10 Sekunden in ein Magnetfeld gesetzt. Die Mischung mit entfernten roten Blutkörperchen wird dann in der Analysevorrichtung 206 analysiert, was das Scattergramm der Fig. 8A zur Folge hat, welches eine Zählung der Ls von 29,4 (1), der Ms von 8,1 (2) und der Gs von 62,4 (3) liefert.
Zur gleichen Zeit wird ein weiterer Teil der gleichen Mischung mit 10 Mikrolitern von magnetischen Mikrosphären kombiniert, an die der N-spezifische Antikörper gebunden ist, um die roten Blutkörperchen und die Ns in der Station 90 zu entfernen. Die Mischung wird für 30 Sekunden gemischt und dann in einem Magnetfeld für 10 Sekunden angeordnet. Die Mischung, bei der die Ns und die roten Blutkörperchen entfernt wurden, wird dann durch die Analysevorrichtung 194 analysiert, was das Scattergramm der Fig. 8B zur Folge hat, welches eine Auszählung der Ls von 73,5 (1), der Ms von 21,7 (2), der Es von 3,4 (3) und der Bs von 1,4 (4) zur Folge hat. Die zwei Zählungen werden im Komparator 198 verglichen, was eine fünfteilige Differentialzählung der weißen Blutkörperchen der Ls von 29,4, der Ms von 8,0, der Ns von 60,8, der Es von 1,2 und der Bs von 0,6 zur Folge hat. Wiederum wurde ein Mikroskopvergleich gemacht, der Zählungen der Ls von 29,4, der Ms von 5,0, der Ns von 65,0, der Es von 1,0 und der Bs von weniger als 1,0 zur Folge hat.
Die Fig. 9A und 9B zeigen Scattergramm-Ergebnisse eines fünfteiligen Differentialbeispiels für weiße Blutkörperchen, und zwar ähnlich dem der Fig. 8A und 8B. Eine Vollblutprobe von 20 Mikrolitern wurde in den gleichen Schritten analysiert, wie mit Bezug auf die Fig. 8A und 8B beschrieben, was das Scattergramm der Fig. 9A zur Folge hat, welches eine Auszählung der Ls von 35,4 (1), der Ms von 14,6 (2) und der Gs von 50,0 (3) zur Folge hatte. Das Scattergramm der Fig. 98 liefert eine Zählung der Ls von 66,4 (1), der Ms von 25,0 (2), der Es von 6,6 (3) und der Bs von 2,0 (4). Das daraus resultierende fünfteilige Differential der weißen Blutkörperchen hat Zählungen von 35,4 Ls, von 14,6 Ms, von 45,5 Ns, von 3,5 Es und von 1,1 Bs zur Folge, und wurde mit einer Mikroskopzählung von 36 Ls, von 11 Ms, von 49 Ns, von 3 Es und von 1 B verglichen.
Die Fig. 10A und 10B zeigen Scattergramm-Ergebnisse eines fünfteiligen Differentials für weiße Blutkörperchen, welches wiederum dem der Fig. 8A, 8B und 9A, 9B ähnlich ist, jedoch wurde in diesem Beispiel ein Lysismittel verwendet. In diesem Beispiel wurden 20 Mikroliter Vollblut mit 80 Mikrolitern Puffer bzw. Puffermitteln und 20 Mikrolitern des bevorzugten oben erwähnten Lysismittels für rote Blutkörperchen kombiniert. Die Mischung wird für 6 Sekunden gemischt, und dann wird ein Dämpfungsmittel zugegeben. Die Zeitperiode ist wichtig bzw. kennzeichnend, da das für eine größere Zeitperiode als 10 Sekunden ungedämpfte Lysismittel beginnen wird, wichtige Eigenschaften der weißen Blutkörperchen zu beeinflussen. Die Mischung, bei der die roten Blutkörperchen entfernt sind, wird analysiert, um das Scattergramm der Fig. 10A zu liefern, welches Zählungen der Ls von 25,7 (1), der Ms von 9,6 (2) und der Gs von 65,0 (3) zur Folge hat.
Ein zweiter Teil der Mischung, der eine zweite Vollblutprobe von 20 Mikrolitern aufweist, wird mit 120 Mikrolitern des Puffermittels und 10 Mikrolitern der magnetischen Mikrosphären kombiniert, an die der N-spezifische Antikörper gebunden ist, und wird für 30 Sekunden gemischt und dann für 10 Sekunden in einem Magnetfeld angeordnet. Das bevorzugte Lysismittel für rote Blutkörperchen wird dann zu der Mischung hinzugegeben, aus der die Ns entfernt wurden, welche dann für 6 Sekunden vermischt wird, bevor sie gedämpft wird. Das daraus resultierende Scattergramm der Fig. 10B hat Prozentsatzauszählungen der Ls von 74,6 (1), der Ms von 21,6 (2), der Es von 2,9 (3), und der Bs von 0,8 (4) zur Folge. Das daraus resultierende fünfteilige Differential für weiße Blutkörperchen hat Prozentsatzzählungen der Ls von 25,6, der Ms von 9,6, der Ns von 63,5, der Es von 1,0, und der Bs von 0,3 zur Folge. Wiederum ergab ein Mikroskopvergleich Auszählungen von Ls von 29,4, der Ms von 5,0, der Ns von 65,0, der Es von 1,0 und der Bs von weniger als 1.
Ein weiteres Beispiel von Scattergramm-Ergebnissen eines fünfteiligen Differentials für weiße Blutkörperchen, ähnlich dem der Fig. 10A und 10B ist in den Fig. 11A und 11B veranschaulicht. Bei einer Vollblutprobe wurden zwei Pro ben gleichzeitig in denselben Schritten analysiert, die mit Bezug auf Fig. 10A und 10B beschrieben wurden. Das Scattergramm der Fig. 11A liefert eine Auszählung der Ls von 31,9 (1), der Ms von 17,6 (2) und der Gs von 50,4 (3). Das Scattergramm der Fig. 11B sieht eine Auszählung der Ls von 67,1 (1), der Ms von 24,1 (2), der Es von 7,6 (3), und der Bs von 1,2 (4) vor. Das daraus resultierende fünfteilige Differential der weißen Blutkörperchen hat Zählungen von 31,9 Ls, von 11,4 Ms, von 46,0 Ns, von 3,6 Es und von 0,7 Bs zur Folge, und zwar im Vergleich zu einer Mikroskopzählung von 36 Ls, von 11 Ms, von 49 Ns, von 3 Es und von 1 B.
Noch ein weiteres Ausführungsbeispiel eines Zellenpopulations-Analyseverfahrens und einer Vorrichtung, die die Stammanmeldung verkörpert, wird im allgemeinen durch das Bezugszeichen 292 in Fig. 12 bezeichnet. Die Analysevorrichtung 292 weist eine biologische Probe 294 auf, die wiederum zumindest einen ersten Satz von lebensfähigen biologischen Zellen aufweist, und die einen Puffer bzw. ein Puffermittel aufweist, falls erwünscht.
Die Probe 294 wird über eine Leitung 296 mit zumindest einem Reaktionsmittel 298 über eine Leitung 300 kombiniert. In der Analysevorrichtung 292 werden die roten Blutkörperchen entfernt und die Ns werden sequentiell oder gleichzeitig in einer funktionell bezeichneten Station 302 verschoben. Die Enfernungsfunktion für rote Blutkörperchen wird mit 304 bezeichnet, und der N- Bewegungs- oder Verschiebungsteil wird mit 306 bezeichnet, um anzuzeigen, daß die Funktionen gleichzeitig oder sequentiell ausgeführt werden können. Die roten Blutkörperchen können magnetisch entfernt werden oder mit einem Lysismittel oder mit einer Kombination der beiden, wie zuvor beschrieben. Die Ns werden entfernt oder verschoben, und zwar durch Zufügen von mit einem N-spezifischen Antikörper verbundenen Mikrosphären zur Mischung.
Sobald die roten Blutkörperchen entfernt werden, und die Ns bewegt oder verschoben werden, wird dann die daraus folgende Mischung über eine Leitung 308 zu einer Analysevorrichtung 310 gespeist. In diesem Fall werden die Ns ausreichend von den Mustern der Es und der Bs verschoben, das ein fünfteiliges Differential der weißen Blutkörperchen der Ms, der Ls, der Es, der Bs und der Ns direkt erhalten wird. Die Funktionen der Analysevorrichtung 292 können entweder auf den Instrumenten 56 und 210 oder auf kleineren Varianten davon ausgeführt werden.
Die Scattergramm-Ergebnisse eines Beispiels eines direkten fünfteiligen Differentials für weiße Blutkörperchen gemäß der Analysevorrichtung 292 wird in Fig. 13 gezeigt. In diesem Beispiel ist die biologische Probe 294 20 Mikroliter einer Vollblutprobe, und das Reaktionsmittel 298 ist 10 Mikroliter von nicht-magnetischen Mikrosphären, an die der N-spezifische Antikörper gebunden ist, und zwar kombiniert mit 100 Mikrolitern eines Puffers bzw. eines Puffermittels, und in der Unterstation 306 für 30 Sekunden vermischt. 10 Mikroliter des bevorzugten Lysismittels für rote Blutkörperchen werden dann zur Mischung hinzugefügt, die in der Unterstation 304 für 6 Sekunden gemischt wird, nachdem das Dämpfungsmittel hinzugefügt wird. Die Mischung, bei der die roten Blutkörperchen entfernt und die Ns verschoben sind, wird dann analysiert durch die Analysevorrichtung 310, was das Scattergramm der Fig. 13 zur Folge hat, welches eine direkte Zählung von 29,6 Ls, von 13,6 Ms, von 52,2 Ns, von 3,4 Es und von 1,06 Bs liefert, und zwar im Vergleich zu einer Mikroskopbestimmung von 35 Ls, von 5 Ms, von 56 Ns, von 4 Es und keinem B. In diesem speziellen Beispiel wurde die Vollblutprobe auch auf einem allgemeinen Zellenzählinstrument der Coulter Electronics Inc. analysiert, was 29 Ls, 11,1 Ms und 59,9 Gs (Ns, Es, und Bs) zur Folge hat.
Mit Bezug auf Fig. 14-26D werden die Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung veranschaulicht.
Mit Bezug auf Fig. 14 wird ein erstes Ausführungsbeispiel eines Populationsuntersatz-Analyseverfahrens und einer Vorrichtung für weiße Blutkörperchen im allgemeinen durch das Bezugszeichen 320 bezeichnet. Die Analysevorrichtung 320 weist eine biologische Probe 322 auf, die zumindest einen ersten Satz von lebensfähigen (nicht veranschaulichten) biologischen Zellen enthält, und zwar einschließlich mindestens einer Population weißer Blutkörperchen mit zumindest einem definierbaren Untersatz, wie beispielsweise in oder aus einer Vollblutprobe. Wie hier verwendet, sind Untersätze weißer Blutkörperchen Untersätze einer Population von weißen Blutkörperchen, an die spezifische monoklonale Antikörper gebunden werden kön nen. Eine Nomenklatur für die monoklonalen Antikörper ist jetzt durch die World Health Orgnization und die International Immunology Society definiert worden. Die monoklonalen Antikörper werden definiert durch eine Clusterbzw. Ansammlungsdifferenzierung- (CD-) Nomenklatur, die eine spezielle Besonderheit bzw. Art für eine Zelle oder Zellgebilde und die monoklonalen Antikörper definiert, die für diese CD-Gruppe spezifisch sind. Nur zu Beispielszwecken sind in den folgenden Beispielen vier CD- Gruppen verwendet worden, CD4, CD8, CD2 und CD20. Die CD- Nomenklatur, die Art und gewisse Handelsquellen von monoklonalen Antikörpern sind in Tabelle I veranschaulicht. Tabelle I
Die Zellen der biologischen Probe 322 sollen in einer biologischen Reaktion in einer quantitaven und/oder qualitativen Bestimmung oder Analyse verwendet bzw. vorgesehen werden. Die Probe 322 kann einen Puffer bzw. ein Puffermittel aufweisen, in das die Zellen hinzugegeben werden.
Die Probe 322 wird über eine Leitung 324 mit mindestens einem Reaktionsmittel 326 über eine Leitung 328 kombiniert. In der Analysevorrichtung 320 werden die roten Blutkörperchen aus der Mischung entfernt und gleichzeiig oder sequentiell wird mindestens ein Untersatz der weißen Blutkörperchen verändert oder verschoben, und zwar durch eine funktionell bezeichnete Entfernungsstation für rote Blutkörperchen und Verschiebungsstation 330 für einen Untersatz weißer Blutkörperchen. Wie in der grundlegenden Anmeldung bemerkt, können die roten Blutkörperchen aus der Mischung durch die Station 330 durch eine Anzahl von Arten entfernt werden, wie beispielsweise aufgezählt mit Bezug auf die Station 20. Gleichzeitig oder sequentiell wird im gleichen Mischungsteil mindestens ein Untersatz der weißen Blutkörperchen an Mikrosphären für weiße Blutkörperchen gebunden, und zwar mit monoklonalen Antikörpern daran, die für den Untersatz spezifisch sind, um die daraus folgenden Opazitäts- und/oder Volumenparameter der Zellen zu modifizieren (zu wechseln bzw. zu verändern oder zu verschieben).
Die Mischung, bei der die roten Blutkörperchen entfernt wurden und die Untersatzpopulation der weißen Blutkörperchen verschoben wurde, wird dann zu einer Analysevorrichtung 322 über eine Leitung 334 gespeist. Die Analysevorrichtung 322 kann im wesentlichen identisch mit der Anlysevorrichtung 22 sein. Auf dem interessanten Untersatz der weißen Blutkörperchen wird im allgemeinen Bezug genommen als ein Prozentsatz der interessanten Population der weißen Blutkörperchen. Die Analysevorrichtung 320 liefert somit eine schnelle direkte Analyse von zumindest einer Charakteristik bzw. einem Merkmal eines gewählten Untersatzes einer Population von weißen Blutkörperchen. Die Analysevorrichtung 320 kann verwendet werden, wo der verschobene Untersatz der weißen Blutkörperchen nicht von anderen zahlreicheren Zellen verschleiert bzw. verdeckt wird, oder wo die Anzahl der verschobenen Zellen des Untersatzes der weißen Blutkörperchen ein ausreichender Prozensatz ist, so daß sie identifizierbar sind, auch wenn sie verschleiert bzw. verdeckt sind.
Mit Bezug auf Fig. 15 wird ein zweites Ausführungsbeispiel eines Populationsuntersatz-Analyseverfahrens und einer Vorrichtung für weiße Blutkörperchen im allgemeinen durch das Bezugszeichen 340 bezeichnet. Die Analysevorrichtung 340 weist eine biologische Probe auf, die mindestens einen ersten Satz von lebensfähigen (nicht-gezeigten) biologischen Zellen enthält, und zwar einschließlich mindestens einer Population von weißen Blutkörperchen mit mindestens einem Untersatz, wie beispielsweise in oder aus einer Vollblutprobe. Die Zellen der biologischen Probe 344 sollen wieder in einer biologischen Reaktion bei einer quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung oder Analyse verwendet bzw. eingesetzt werden. Die Probe 342 kann einen Puffer bzw. ein Puffermittel aufweisen, in welches die Zellen zugefügt werden.
Die Probe 342 wird über eine Leitung 344 mit mindestens einem Reaktionsmittel 346 über eine Leitung 348 kombiniert. In der Analysevorrichtung 340 werden die roten Blutkörperchen aus der Mischung entfernt und gleichzeitig oder sequentiell wird zumindest ein Merkmal von mindestens einem Untersatz weißer Blutkörperchen verändert oder verschoben, und zwar durch eine funktionell bezeichnete Entfernungsstation für rote Blutkörperchen und eine Verschiebungsstation 350 für einen Untersatz weißer Blutkörperchen. Wie zuvor bemerkt, können die roten Blutkörperchen aus der Mischung durch die Station 350 auf eine Anzahl von Arten entfernt werden, wie beispielsweise mit Bezug auf die Station 20 aufgezählt. Wiederum wird gleichzeitig oder sequentiell im gleichen Mischungsteil mindestens ein Untersatz von weißen Blutkörperchen an Mikrosphären gebunden, um die daraus folgenden Opazitätsund/oder Volumenparameter der Zellen zu modifizieren (zu verändern oder zu verschieben).
Zur gleichen Zeit oder sequentiell wird mindestens eine Population weißer Blutkörperchen oder ein Untersatz aus der Mischung entfernt. Die Population der weißen Blutkörperchen oder der Untersatz wird derart entfernt, daß der interessante Untersatz der weißen Blutkörperchen nicht durch die Population verschleiert bzw. verdeckt wird. Dies wird vorzugsweise durchgeführt durch magnetisches Entfernen der Population weißer Blutkörperchen, nachdem sie an magnetische Mikrosphären gebunden wurden, die einen daran gebundenen monoklonalen Antikörper aufweisen, der für die Population weißer Blutkörperchen spezifisch ist.
Die Mischung, bei der die roten Blutkörperchen und die Population der weißen Blutkörperchen entfernt wurde, und bei der die Untersatzpopulationen der weißen Blutkörperchen verschoben wurden, wird dann zu einer Analysevorrichtung 352 gespeist, und zwar über eine Leitung 354. Die Analysevorrichtung 352 kann wiederum im wesentlichen identisch mit der Analysevorrichtung 22 sein.
Ein spezifisches Ausführungsbeispiel eines Analyseinstrumentes, welches die Stammanmeldung verkörpert, und welches die Analyseverfahren der ersten und zweiten Analysevorrichtungen 320 und 340 durchführen kann, wird im allgemeinen durch das Bezugszeichen 360 in Fig. 16 bezeichnet.
Beim Instrument 360 wird wie beim Instrument 56 nur eine spezielle Aufzählung veranschaulicht, die in fast endlosem Detail gemäß den Prinzipien der ersten Stammanmeldung variiert werden kann. Weiter ist das Instrument 360 im allgemeinen im funktionellen Detail gezeigt, und die speziellen Ausführungsbeispiele können strukturell auf viele bekannte Arten implementiert bzw. aufgebaut werden.
Das Instrument 360 weist einen Ansaug-Pumpmechanismus 362 auf, der verwendet wird, um die interessante biologische Probe, beispielsweise die Probe 322 oder 342 in das Instrument 360 zu ziehen. Die Ansaugvorrichtung 362 ist über eine Leitung 364 mit einem Probenventil 366 gekoppelt, welches mit einer Probensonde 368 gekoppelt werden kann. Eine Lysismittelpumpe 370 kann das Lysismittel aufweisen bzw. einleiten, wie beispielsweise als Teil des Reaktionsmittels 326 oder 346 und ist auch mit dem Ventil 366 über eine Leitung 372 gekoppelt. Das Ventil 366 und die Pumpe 362 können die biololgische Probe 322 oder 342 zusammen mit dem Lysismittel über die Pumpe 370 gegebenenfalls ansaugen. Vorzugsweise wird die biologische Probe 322 oder 342 getrennt vom Lysismittel hinzugeführt.
Die Reaktionsmittelmischung oder die biologische Probe selbst wird dann über eine Auslaßleitung 374 in eine Mischvorrichtung 376 gespeist. Der Mischer 376 weist eine Mischkammer 378 auf, in die die Probe oder das Reaktionsmittel gespeist wird. Die Analysevorrichtungen 320 und 340 weichen im Betrieb nur geringfügig ab und werden daher zusammen beschrieben.
Wenn im Betrieb die roten Blutkörperchen durch das Lysismittel von der Pumpe 370 lysiert worden sind, dann wird, wenn die Reaktion vollendet ist, ein Dämpfungsmittel oder Fixierungsmittel von einer Station 380 über eine Leitung 382 geliefert. Die Entfernungsreaktion für die roten Blutkörperchen wird dann vollendet. Der Reaktion kann beigeholfen werden durch Mischen des Lysismittels und der Probe in der Kammer 378, wie funktionell bei 384 veranschaulicht.
Entweder vor, nach oder gleichzeitig mit der Entfernung der roten Blutkörperchen werden die weißen Blutkörperchen verschoben, und im Fall der Analysevorrichtung 340 wird auch eine Population oder ein Untersatz von weißen Blutkörperchen entfernt. Der Untersatz der weißen Blutkörperchen wird verschoben durch Zugabe von den für die weißen Blutkörperchen spezifischen Mikrosphären aus einer Station 386 über eine Leitung 388, ein Ventil 390 und eine Kammerleitung 392. Die Mikrosphären für die weißen Blutkörperchen werden mit der Mischung oder der Probe durch den Mischmechanismus 384 vermischt.
Die Details einer geeigneten Mischvorrichtung 376 können im wesentlichen identisch mit der Mischvorrichtung 70 sein. Durch Verwendung des Mischers 376 werden die Reaktionen stark bezüglich der Geschwindigkeit beschleunigt bzw. verbessert, ohne wesentlich die interessanten Eigenschaften der Zellen zu schädigen, wie es beipsielsweise beim Anheben der Reaktionstemperatur auftreten kann. Darüber hinaus werden die Reaktionen in beträchtlich weniger als ein paar Minuten vollendet und dies kann im allgemeinen in der Größenordnung von 2 Minuten oder weniger sein. Dies gestattet eine schnelle Analyse des automatischen Analyseinstrumentes 360 mit hohem Volumen.
In der Analysevorrichtung 320 wird das gedämpfte Reaktionsmittel, bei dem die roten Blutkörperchen durch das Lysismittel (wie aus der Station 20) entfernt worden ist, und der Untersatz der weißen Blutkörperchen modifiziert worden ist, dann über eine Leitung 394 zu einer Analysevorrichtung 396 für weiße Blutkörperchen geleitet (d. h. der Analysevorrichtung 332> 4 Die Analysevorrichtung 396 kann von irgendeiner von vielen physischen Arten bzw. Bauarten sein, und zwar gemäß der Zähl- und Bemessungstechniken, die von Wallace H. Coulter im US-Patent 2 656 508 beschrieben wurde, und in zahlreichen im Handel erhältlichen Blutkörperchenzählvorrichtungen der Anmelderin Coulter Electronics Inc. verkörpert werden.
Wie zuvor beschrieben, weist die Analysevorrichtung 396 im allgemeinen einen Flußsensor oder eine Abfühlkammer 398 auf. Die Kammer 398 weist einen Wandler 400 auf, durch den eine Apertur bzw. Öffnung 402 hindurchgeht. Die Kammer 398 weist einen ersten Teil 404 auf, der eine erste Elektrode 406 besitzt, und zwar in Kontakt mit dem Strömungsmittel darin.
Der Kammerteil 404 und die Elektrode 406 stehen durch die Öffnung 402 mit einem zweiten Kammerteil 408 in Verbindung, in dem eine zweite Elektrode 410 ist. Die Elektroden 406 und 410 werden über Reaktionsleitungen 412 und 414 mit einer RF/DC- bzw. Hochfrequenz/Gleichstrom-Quellen- und Abfühlschaltung 416 gekoppelt. Die Schaltung 416 koppelt bzw. liefert sowohl ein DC- bzw. Gleichstrom- oder einen Niederfrequenzstrom oder ein -signal als auch ein Hochfrequenzsignal zwischen den Elektroden 406 und 410.
Das Niederfrequenzsignal wird verwendet, um die Amplitude eines Signalimpulses abzufühlen, der dadurch bewirkt wird, daß eine Zelle durch die Öffnung 402 hindurchgeht. Das Hochfrequenzsignal wird verwendet, um die elektrische Opazität der gleichen Zelle zu erhalten, die durch die Öffnung 402 hindurchgeht.
Das Messen der elektrischen Opazität der Zellen wurde von Wallace H. Coulter und Walter R. Hoff im US-Patent 3 502 974 und in verschiedenen Patenten und Veröffentlichungen der Anmelderin Coulter Elecronics Inc. seit diesem Patent beschrieben. Eine spezifische Schaltung, die hier verwendet werden kann, ist in der US-Serien-Nr. 921 654 offenbart.
Die von der Schaltung 416 erzeugten Signale von den abgefühlten Zellen werden über eine DC- bzw Gleichstromsignalleitung 418 und eine RF- bzw. Hochfrequenzsignalleitung 420 mit einem Komparator bzw. einer Vergleichsvorrichtung 422 gekoppelt (wie der Komparator 26).
Die Analysevorrichtung 396 kann einen Scheidefluß aufweisen, um die Zellen im Sensor 398 in wohlbekanntner Weise zu fokussieren. Der Scheidefluß kann durch ein Strömungsmittelsystem 424 vorgesehen werden, welches mit dem Sensor 398 durch ein Paar von Leitungen 426 und 428 in bekannter Weise gekoppelt ist. Die Probenreaktionsmischung bzw. Reaktionsmittelmischung kann in dem Sensor 398 über ein Einleitungsrohr 430 geleitet werden, und kann aus dem Sensor 398 über ein Auslaßrohr 432 in einen Abfallbehälter 434 geleitet werden.
Folgend auf jeden Betrieb bzw. Vorgang wird der Mischer 378 gereinigt oder durchgespült, und zwar über eine Spülleitung 436 und wird durch eine Abfalleitung 438 ausgestoßen bzw. ausgelassen. Sobald die Kammer 378 gereinigt worden ist, kann eine weitere Probe oder ein Probenteil in das Instrument 360 geleitet werden.
In der Analysevorrichtung 340 ist der Betrieb im wesentlichen der gleiche wie in der Analysevorrichtung 320, und zwar bei Zugabe der magnetischen Mikrosphären für die Population oder den Untersatz von weißen Blutkörperchen. Der daran gebundene Untersatz von weißen Blutkörperchen wird dann durch ein Magnetfeld während und/oder nach dem Mischprozeß durch ein Magnetfeld oder einen Magneten 440 entfernt. Das Feld kann durch elektromagnetische Mittel oder durch den Magneten 440 vorgesehen werden, der physisch mit Bezug auf die Kammer 378 bewegt wird, um den magnetisch gebundenen Untersatz von weißen Blutkörperchen einzufangen. Die Mischung ohne den gebundenen Untersatz von weißen Blutkörperchen wird dann über die Leitung 394 zur Analysevorrichtung 396 in der zuvor beschriebenen Weise geleitet, um die Analyse zu erhalten (wie bei der Analysevorrichtung 320).
Das Instrument 360 wird dann vorbereitet, um die nächste Probe für die nächste Analyse aufzunehmen. Die Sonde 368 kann durch einen Sondenspülmechanismus 442 gereinigt werden und die Leitungen und die Kammer 378 können in herkömmlicher Weise durchgespült werden. Jede Analyse der darauffolgenden Probenmischung wird in schneller und automatischer Weise erhalten. Die Periode zwischen der Analyse der aufeinanderfolgenden Probenmischungen kann in der Größennordnung von 5 Minuten oder weniger sein.
Alternativ zur Anwendung des Lysismittels in irgendeiner der Analysevorrichtungen 320 und 340 kann die Probe 322 oder 342 zum Mischer 376 über das Ventil 366 ohne irgendein Lysismittel bzw. eine Lysis geleitet werden. In diesem Fall können die roten Blutkörperchen magnetisch durch Verwendung von Mikrosphären entfernt werden, an die der für die roten Blutkörperchen spezifische Antikörper gebunden ist, und zwar aus einer Mikrosphärenstation 444 für rote Blutkörperchen, und wird an das Ventil 390 über eine Leitung 446 geleitet und von da zur Kammer 376 über die Leitung 392. Wenn kein Lysismittel verwendet wird, werden die gebundenen roten Blutkörperchen auch magnetisch vom Magneten 440 nach der Mischung entfernt, und zwar im wesentlichen in ähnlicher Weise wie bei den oben beschriebenen magnetisch gebundenen weißen Blutkörperchen.
Weiter kann in einem zweiten Fall, um die Geschwindigkeit oder den Wirkungsgrad der Reaktion zu begünstigen, eine Reaktionsmischung der Probe mit sowohl dem Lysismittel für rote Blutkörperchen als auch den Magnetkügelchen für rote Blutkörperchen verwendet werden. Die Reaktionsmischung wird gemischt, das Lysismittel wird gedämpft und die gebundenen roten Blutkörperchen werden magnetisch entfernt, und dann werden die weißen Blutkörperchen, wie zuvor beschrieben, analysiert.
Mit Bezug auf Fig. 17A und 17B sind zwei Sätze von Ergebnissen veranschaulicht, die in Scattergrammen abge bildet sind, die aus einer Vollblutprobe unter Verwendung einer Prototyp-Analysevorrichtung erhalten wurden, und zwar ähnlich dem Instrumenmt 360. Zwei Populationen von weißen Blutkörperchen werden entfernt, und der T&sub8;-Untersatz wird direkt analysiert. Der T&sub8;-Untersatz der Zellen oder geformten Körper bzw. Zellgebilden, die den Rezeptor oder das Antigen besitzen, an die sich der T&sub8;-spezifische Antikörper bindet. In den Figuren sind diese als T&sub8;&spplus; bezeichnet. Die Zellen oder Zellgebilde, die nicht den Rezeptor oder Antigen besitzen, an welches sich der T&sub8;- spezifische Antikörper bindet, sind als T8&supmin; bezeichnet. In diesen Beispielen war das biologische Medium 342 eine Vollblutprobe von 20 Mikrolitern, die mit dem Mischer 376 verwendet wurde. In beiden Fig. 17A und 17B wurde die Vollblutprobe von 20 Mikrolitern, Medium 342, mit 40 Mikrolitern von magnetischen Mikrosphären kombiniert, an die der für die roten Blutkörperchen spezifische Antikörper gebunden war, und zwar kombiniert mit 120 Mikrolitern einer Pufferlösung und 10 Mikrolitern von magnetischen Mikrosphären, an die ein N- und E-spezifischer Antikörper gebunden ist, und zwar kombiniert mit 30 Mikrolitern einer Pufferlösung, die zusammen das Reaktionsmittel 346 bilden. Ein solcher beispielhafter N- und E- spezifischer Antikörper ist in der US-Serien-Nr. 068 618 offenbart, betitelt "MONOCLONAL ANTIBODY SPECIFIC TO A COMMON DETERMINANT SITE OF NEUTROPHILS AND EOSINOPHILS" eingereicht am 3. Juni 1987.
Die magnetischen Mikrosphären können von irgendeiner geeigneten Art sein, und sind im Beispiel Polystyrol-Magnetmikrosphären mit 0,7 Mikrometern Durchmesser, und zwar mit einem Verhältnis von Gewicht zu Volumen von 10% Festkörpern, verkauft von Seradyn, Inc., Indianapolis, Indiana. Die Reaktionsmischung wurde dann im Mischer 376 für 10 Sekunden vermischt, wurde für 15 Sekunden im Magnetfeld des Magneten 440 angeordnet und dann wurde die daraus resultierende Mischung, bei der die roten Blutkörperchen die Es und die Ns entfernt wurden in der Analysevorrichtung 396 analysiert. Das daraus resultierende Scattergramm A ist in Fig. 17A gezeigt.
Das Scattergramm der Fig. 17B ist das Ergebnis der gleichen Prozedur mit Zugabe von 12,5 Mikrolitern von nichtmagnetischen Mikrosphären, an die ein T&sub8;-spezifischer Antikörper gebunden ist, und zwar kombiniert mit 12,5 Mikrolitern einer Pufferlösung, um das Reaktionsmittel 346 zu bilden. Der T&sub8;-spezifische Antikörper wird unter dem Handelsnamen COULTER CLONE vom Coulter Immunology Division der Coulter Coporation verkauft. Die nichtmagnetischen Mikrosphären können wieder von irgendeiner geeigneten Art sein, und in den Beispielen sind sie oberflächenreaktionsfreie sulfierte bzw. schwefelsaure Polystytol-Latex-Mikrosphären mit 1,78 Mikrometern Durchmesser mit einem Verhältnis von Gewicht zu Volumen von 8% Festkörpern, verkauft als IDC-Mikrophären von Interfacial Dynamics of Portland, Oregon.
Die Zugabe der T&sub8;-Mikrosphären verschiebt die gebundenen CDB-Zellen in ein Gebiet B, wo sie getrennt identifiziert bzw&sub5; erkannt und gezählt werden können, wie durch einen Vergleich des Scattergramms der Fig. 17A und 17B zu sehen. In Fig. 17A werden die CDB-Zellen von den restlichen weißen Blutkörperchen versteckt bzw. verdeckt. Die Ns und Es würden aus den Scattergrammen entfernt oder sie werden die Identifizierung bzw. Erkennung der verschobenen CD8- Zellen in Fig. 17B verschleiern bzw. verdecken. Fig. 17A veranschaulicht die Entfernung der Ns und der Es, während Fig. 17B klar die Verschiebung der CD8- gebundenen Zellen aus dem Gebiet A zum Gebiet B veranschaulicht. Die Pufferlösung kann eine phosphatgepufferte Salzlösung sein, die von Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri, verkauft wird.
Fig. 18A veranschaulicht weiter das normale Scattergramm oder 3-Parameter-Histogrammpositionierung der M-, L- und G-Zellenpopulationen von der Analysevorrichtung 352. Ohne eine Entfernung der Gs, wie in Fig. 17B zu sehen, wäre das Gebiet B des verschobenen Untersatzes von weißen Blutkörperchen durch die Gs verdeckt, die viel zahlreicher sind. Fig. 18B ist ein Scattergramm, welches die Populationen von weißen Blutkörperchen M, L und B veranschaulicht, die nach der Entfernung der Es und Ns übrig bleiben. Obwohl die Bs immer noch teilweise das interessante Gebiet verdecken können, ist ihre Prozentzahl der Populationen von weißen Blutkörperchen klein genug, um nicht wesentlich die gewünschte Berechnung des Untersatzprozentsatzes zu beeinträchtigen. Jedoch kann der Beitrag der Bs von dem Untersatzprozentsatz abgezogen werden, falls erwünscht.
Mit Bezug auf die Fig. 19A-D, 20A-D und 21A-D ist die direkte Untersatzanalyse der CD2-, CD4-, CD8- und CD20- Untersatszpopulationen von weißen Blutkörperchen der jeweiligen Proben von drei unterschiedlichen Patienten gezeigt. Im Falle jeder Untersatzpopulation wurden 28 Mikroliter einer Vollblutprobe kombiniert mit 20 Mikrolitern von magnetischen Mikrosphären (2,5 Gew.% pro Lösungsvolumen), wobei der N- und E-spezifische Antikörper daran gebunden ist. Zusätzlich werden auch nicht-magnetische Mikrosphären, an die der jeweilige monoklonale Antikörper für den jeweiligen Untersatz von weißen Blutkörperchen gebunden ist, auch mit der Probe kombiniert. Die jeweiligen Mengen der T&sub4;-, T&sub8;- T&sub1;&sub1;- oder B&sub1;-beschichteten Mikrosphären sind jeweils 40 Mikroliter. (1 Gew.% pro Lösungsvolumen für jede). Jede jeweilige Gesamtmischung, d. h. N- und E-Mikrosphären mit T&sub8; werden beispielsweise mit einer Pufferlösung von phosphatgepufferter Salzlösung kombiniert, 1%-igem bovinen Serumalbumin, mit einem pH-Wert von 7,2 bis 7,4 für ein Gesamtvolumen von 150 Mikrolitern. Jede jeweilige Mischung wird in der Kammer 378 durch den Mischer 376 für 2 Minuten gemischt und wird in dem Magnetfeld 440 dann für 1 Minute angeordnet. In diesen Beispielen werden die roten Blutkörperchen sequentiell unter Verwendung des oben erwähnten Lysismittels entfernt. Die Mikrosphären für die weißen Blutkörperchen werden zuerst zugefügt, dann werden die roten Blutkörperchen durch Lysis mit 300 Mikrolitern Lysismittel entfernt, wie beispielsweise dem Erythrolyse- Lysisreaktionsmittel, welches von Coulter Electronics verkauft wird, wie beispielsweise von der Lysismittelquelle 370. Die Mischung wird dann gedämpft, und zwar mit 120 Mikrolitern Dämpfungsmittel, wie beispielsweise Stabilyze, einen Leukozyten-Konservierungsmittel, welches auch von Coulter Electronics verkauft wird, und zwar aus der Quelle 380, und wird dann an die Analysevorrichtung 396 zur Analyse geleitet.
Ein rechter Block (1) in jedem Scattergramm stellt die jeweilige interessante Untersatzpopulation der weißen Blutkörperchen dar. Die Blöcke 1, 2, 3 usw., die in den Figuren gezeigt sind, werden visuell oder automatisch um die interessante Population oder den Untersatz der weißen Blutkörperchen gepaßt.
Die Resultate wurden unter Verwendung von herkömmlicher Flußcytometrie verglichen und ergaben die folgenden Vergleichsergebnisse in Prozentsätzen für die drei Proben durch das Verfahren der Erfindung (SHIFT) gegenüber der Flußcytometrie (CYT).
Fig. 22A veranschaulicht auch das normale Scattergramm oder die 3-Paramter-Positionierung der M-, L- und G-Zellenpopulationen von der Analysevorrichtung 352. Ohne Ent fernung der Ns und Es würde die CD4-Zellenpopulation verschleiert werden. Durch Verschieben der Ns und der Es mit den N- und E-spezifischen monoklonalen Antikörpermikrosphären in ein Gebiet oder einen Block 1, der in Fig. 22B gezeigt ist, kann die CD4-Population verschoben werden und ist im Block oder Gebiet 2 zu sehen. Dieses Gebiet würde von den in Fig. 22A zu sehenden Ns und Es verdeckt werden. In diesem Beispiel für Fig. 22C würden 28 Mikroliter einer Vollblutprobe mit 50 Mikrolitern von Mikrosphären mit 2,2 Mikrometern kombiniert, an die die N- und E-spezifischen monoklonalen Antikörper gebunden sind und mit 50 Mikrolitern von Mikrosphären, an die ein T&sub4;-spezifischer monoklonaler Antikörper gebunden ist, und mit 22 Mikrolitern eines Lösungsmittels. Fig. 22B ist das gleiche ohne die T&sub4;-Mikrosphären und mit 72 Mikrolitern Lösungsmitteln und Fig. 22A war das gleiche ohne irgendwelche Mikrosphären und mit 122 Mikrolitern Lösungsmittel.
Mit Bezug auf Fig. 23A-D ist eine direkte Analyse der weißen Blutkörperchen unter Verwendung einer Vielzahl von Mikrosphären veranschaulicht, die an den interessanten Untersatz der weißen Blutkörperchen gebunden sind. Fig. 23A und 23B zeigen jeweils Scattergramme von nur der L- Population, wobei der T4-Untersatz der weißen Blutkörperchen und der T&sub1;&sub1;-Untersatz der weißen Blutkörperchen jeweils mit nicht-magnetischen Mikrosphären von 0,8 Mikrometern verschoben ist. Die Verschiebung ist nicht ausreichend, um die Untersatzpopulation der weißen Blutkörperchen in Fig. 23A und 23B zu unterscheiden. Fig. 23C und 23D veranschaulichen jeweils Scattergramme von nur der L-Population, wobei der T&sub4;-Untersatz der weißen Blutkörperchen und der T&sub1;&sub1;-Untersatz der weißen Blutkörperchen verschoben wurde, und zwar indem sie beide an eine Mikrosphäre mit 0,8 Mikrometern und 2,2 Mikrometern gebunden sind. Die Mikrosphäre mit 2,2 Mikrometern ist an die Mikrosphäre mit 0,8 Mikrometer gebunden, und zwar durch ein Ziege-Gegen-Maus-IgG-Antikörper, der daran gebunden ist, der sich mit dem T&sub4;- oder T&sub1;&sub1;-Antikörper verbindet, der an die Mikrosphäre mit 0,8 Mikrometern gebunden ist.
Der Effekt der Größe der nicht-magnetischen Mikrosphäre die an den interessanten Untersatz der weißen Blutkörperchen gebunden ist, ist in Fig. 24A-C veranschaulicht. In diesem Beispiel wurde eine Vollblutprobe mit 28 Mikrolitern kombiniert mit 10 Mikrolitern von magnetischen Mikrosphären, an die der N- und E-spezifische Antikörper gebunden ist (2,5 Gew.% pro Lösungvolumen) und mit 40 Mikrolitern von nicht-magnetischen Mikrosphären, an die der T&sub8;-spezifische Antikörper gebunden ist (1 Gew.% pro Lösungsvolumen). Die T&sub8;-Mikrosphären waren von zwei unterschiedlichen Größen, um den Unterschied der Verschiebung im Scattergramm zu veranschaulichen. Eine Pufferlösung wurde wiederum zugefügt, um ein Mischungsvolumen von 150 Mikrolitern zu bilden. Die Mischung wurde für 2 Minuten vermischt und für 1 Minute im Magnetfeld angeordnet. Die daraus resultierende Mischung mit entfernten Ns und Es wurde dann lysiert, um die roten Blutkörperchen zu entfernen und wurde dann analysiert. Fig. 24A veranschau licht einen Kontroll-Untersatz von weißen Blutkörperchen, an dem keine Mikrosphäre angebracht ist, einen T&sub8;-Untersatz von weißen Blutkörperchen, an dem eine nicht-magnetische Mikrosphäre mit 2,2 Mikrometern gebunden ist und einen T&sub8;-Untersatz von weißen Blutkörperchen, an dem eine nicht-magnetische Mikrosphäre mit 3,0 Mikrometern gebunden ist. Die Breite und Höhe veranschaulichen die Standardabweichung des detektierten Signals. Fig. 24B ist ein Scattergramm, welches die T&sub8;-Untersatzverschiebung der weißen Blutkörperchen veranschaulicht, an die die Mikrosphären mit 3,0 Mikrometern gebunden sind, während Fig. 24C ein Scattergramm ist, welches die T&sub8;-Untersatzverschiebung der weißen Blutkörperchen veranschaulicht, an die die Mikrosphären mit 2,2 Mikrometern gebunden sind. Der analysierte Prozentsatz des T&sub8;-Untersatzes der weißen Blutkörperchen für die unterschiedlichen Mikrosphären war jeweils 20,9 und 19,3. Die größere Mikrosphäre erzeugte klar ein verteilteres Scattergramm-Muster wie von Fig. 24B veranschaulicht.
Mit Bezug auf Fig. 25A-D wird eine gleichzeitige Direktanalyse von zwei Untersatzpopulationen von weißen Blutkörperchen gemäß der Erfindung veranschaulicht. In diesem Beispiel wurden 28 Mikroliter einer Vollblutprobe kombiniert mit 10 Mikrolitern von magnetischen Mikrosphären, an die der N- und E-spezifische Antikörper gebunden ist, mit 52 Mikrolitern einer Pufferlösung und mit 40 Mikrolitern von nicht-magnetischen Mikrosphären mit 3,0 Mikrometern, an die der T&sub8;-spezifische Antikörper gebunden ist und für 2 Minuten vermischt wird. Die Mischung wurde dann im Magnetfeld für 1 Minute angeordnet und dann wurde die daraus resultierende Mischung mit entfernten Ns und Es lysiert, um die roten Blutkörperchen zu entfernen, und wurde dann analysiert. Fig. 25A veranschaulicht eine Kon troll-Untersatszprobe von weißen Blutkörperchen, an die keine Mikrosphäre gebunden ist, eine T4-Auslesung, wobei eine nicht-magnetische Mikrosphäre mit 2,2 Mikrometern daran gebunden ist, und eine T&sub8;-Auslesung, wobei daran eine nicht-magnetische Mikrosphäre mit 3,0 Mikrometern gebunden ist. Dies veranschaulicht die Trennung zwischen den zwei verschobenen Untersatspopulationen der weißen Blutkörperchen. Fig. 25B ist eine Scattergrammanalyse, wobei nur die T&sub4;-Untersatzpopulation der weißen Blutkörperchen an die Mikrosphären mit 2,2 Mikrometern gebunden ist, die zum Gebiet A verschoben sind und Fig. 25C ist eine Scattergrammanalyse, wobei nur die T&sub8;-Untersatzpopulation der weißen Blutkörperchen an die Mikrosphären mit 3,0 Mikrometern gebunden sind, und zwar verschoben zum Gebiet B. Fig. 25D veranschaulicht eine Scattergrammanalyse, wobei sowohl die T&sub4;- als auch die T&sub8;- Untersatzpopulationen der weißen Blutkörperchen zu den jeweiligen Gebieten A und B verschoben sind. Dies gestattet eine gleichzeitige Analyse von sowohl den T&sub4;- als auch den T&sub8;-Untersatzpopulationen.
Mit Bezug auf die Fig. 26A-D sind drei Populationen von Ls, Ms und Gs veranschaulicht, und zwar in vier unterschiedlichen Scattergrammen unter Verwendung von unterschiedlichen Parametern. Obwohl die vorherigen Beispiele unter Verwendung von DC bzw. Gleichstrom gegenüber der Opazität (RF/DC) veranschaulicht wurden, können die Scattergramme unter Verwendung von nahezu irgendwelchen zwei unterschiedlichen Parametern gebildet werden. Fig. 26A veranschaulicht ein Scattergramm unter Verwendung von DC bzw. Gleichstrom gegenüber RF bzw. einer Hochfrequenz alleine, Fig. 26B verwendet RF gegenüber der Opazität, Fig. 26C verwendet DC-RF gegenüber der Opazität und Fig. 26D verwendet DC gegenüber der Opazität, wie zuvor veranschaulicht. Weiterhin sind, obwohl DC gegenüber RF oder RF/DC verwendet worden sind, irgendwelche zwei unterschiedlichen Frequenzen adequat, solange die Signale voneinander trennbar sind, und zwar wegen ihrer Frequenzspektrumlage und/oder der Differenz in der Phasenbeziehung. Die Opazität ist ein vorzuziehender Parameter, da er im wesentlichen eine Normalisierung des RF-Signals ist. Klar kann, wie in den Fig. 26A-D gezeigt, die Darstellung der Daten wie erwünscht, variiert werden. DC ist eine Funktion des Volumens der abgefühlten Zelle oder des Zellgebildes bzw. geformten Körpers, während RF eine Funktion der inneren Leitfähigkeit und des Volumens der abgefühlten Zelle oder des geformten Körpers bzw. Zellgebildes ist.
Obwohl das Verfahren und die Vorrichtung der Erfindung beschrieben worden sind unter Verwendung von Vollblutproben kann es auch Beispiele geben, wo es erwünscht ist, einen Teil der Probe zu verwenden, wobei die roten Blutkörperchen und/oder einige der Populationen der weißen Blutkörperchen entfernt worden sind. Klar werden die roten Blutkörperchen immer noch entfernt, jedoch wohl außerhalb und nicht innerhalb der Vorrichtung der Erfindung. Eine solche Entfernung oder Vorbereitung kann auf zahlreiche herkömmliche Arten ausgeführt werden, wie beispielsweise unter Verwendung eines Lysisreaktionsmittels von Dichte- oder Zentrifugationstechniken, wie beispielsweise Ficoll, Dextran, "Buffycoat", usw. Bei einer automatisierten Analysevorrichtung unter Verwendung der Erfindung wäre es vorzuziehen, eine Vollblutprobe zu verwenden, und zwar wegen der Geschwindigkeit und Integrität der Analyse der Probe.
Viele Modifikationen und Veränderungen der vorliegenden Erfindung sind im Lichte der obigen Lehre möglich. Die Proben 12, 42, 150, 180, 294, 322 und 342 können Vollblut, menschliche Körperflüssigkeiten, die Zellen enthalten oder andere Strömungsmittel aufweisen, die geformte Körper bzw. Zellgebilde enthalten, wie beispiels weise Bakterien, Viren und Pilze. Die beschriebenen Volumen der Mikrosphären sind in Gewicht der Mikrosphären pro Volumen des Lösungsmittels angegeben. Obwohl einige Beispiele in sequentiellen Schritten ausgeführt wurden, können die Schritte auch gleichzeitig ausgeführt werden. Eine gleichzeitige Analyse gestattet, daß das am wenigsten komplizierte Instrumentenmodul verwendet wird. Es sei daher erwähnt, daß innerhalb des Umfangs der beigefügten Ansprüche die Erfindung anders als insbesondere beschrieben, ausgeführt werden kann.

Claims

1. Verfahren zum Detektieren und/oder Zählen eines vorgewählten Sub- oder Untersatzes einer interessierenden Population weißer Blutkörperchen in einer Vollblutprobe, wobei die Vollblutprobe eine Vielzahl von unterschiedlichen Populationen weißer Blutkörperchen enthält, und wobei das Verfahren der Reihe nach folgende Schritte vorsieht:

(a) Subtrahieren von mindestens einer Population weißer Blutkörperchen von der Vollblutprobe unter der Voraussetzung, daß der vorgewählte Populationsuntersatz weißer Blutkörperchen in der Probe verbleibt;

(b) Modifizieren der Volumen- und/oder Opazitäts- Parameter der Zellen oder Körperchen in dem Populationsuntersatz weißer Blutkörperchen dadurch, daß man mit den Körperchen Mikrosphären verbindet, die damit verbundene monoklonale Antikörper aufweisen und die für die Zellen spezifisch sind;

(c) elektronisches Analysieren der im Schritt (b) erhaltenen Blutprobe durch Detektieren des Volumens und/oder der Opazität der Zellen in der Probe unter Verwendung von Coulter Abfühlverfahren.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei folgendes vorgesehen ist: Subtrahieren der Population weißer Blutkörperchen durch Vorsehen von magnetischen Mikrosphären mit einem damit verbundenen monoklonalen Antikörper spezifisch für die Population weißer Blutkörperchen und Mischen der magnetischen Mikrosphären mit der Probe, um die Population weißer Blutkörperchen zu binden und Entfernen der Population weißer Blutkörperchen durch Entfernen von mindestens einem Teil des Restes der Probe, während die magnetischen Mikrosphären innerhalb eines magnetischen Feldes angezogen werden.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei im Schritt (b) folgendes vorgesehen ist: Subtrahieren von mindestens der neutrophilen und eosinophilen Populationen aus der Vollblutprobe.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei folgendes vorgesehen ist: Subtrahieren der neutrophilen und eosinophilen Populationen durch Vorsehen von magnetischen Mikosphären mit einem damit verbundenen monoklonalen Antikörper spezifisch für die neutrophilen und eosinophilen Populationen und Mischen der magnetischen Mikrosphären mit der Probe zur Bindung der neutrophilen und eosinophilen Populationen und Entfernung der neutrophilen und eosinophilen Populationen durch Entfernen von mindestens einem Teil des Restes der Probe, während die magnetischen Mikrosphären innerhalb eines Magnetfeldes angezogen werden.

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei folgendes vorgesehen ist: Modifizieren des CD4-, CD8-, CD2- oder CD20-Populationsuntersatzes weißer Blutkörperchen durch Vorsehen von Mikrosphären mit einem spezifischen, damit verbundenen monoklonalen Antikörper, der für den Untersatz spezifisch ist, und Mischen der erwähnten Mikrosphären mit der erwähnten Probe zur Bindung der Population dieses Untersatzes, um mindestens eine elektronische Charakteristik davon zu verschieben.

6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Vollblut-Probe eine Population roter Blutkörperchen aufweist, und wobei vorgesehen ist, daß die Population roter Blutkörperchen aus der Probe entfernt wird, ohne in signifikanter Weise die relevanten Qualitäten und/oder Quantitäten von mindestens einer der interessierenden Populationen weißer Blutkörperchen nachteilig zu beeinflussen.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Entfernung der Population roter Blutkörperchen das Vorsehen von Mikrosphären umfaßt, die einen damit verbundenen für die roten Blutkörperchen spezifischen monoklonalen Antikörper aufweisen, und Mischen der Mikrosphären mit der Vollblut-Probe zur Bindung der Population roter Blutkörperchen;

Entfernung der Mikrosphären mit den gebundenen roten Blutkörperchen aus der Vollblut-Probe.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei folgendes vorgesehen ist: Vorsehen magnetischer Mikrosphären und eines magnetischen Feldes und Entfernung der Mikrosphären durch Entfernung der roten Blutkörperchen, während die magnetischen Mikrosphären innerhalb des Magnetfeldes angezogen werden.

9. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Entfernung der Population roter Blutkörperchen das Vorsehen einer Lysis roter Blutkörperchen vorsieht, um die Population roter Blutkörperchen im wesentlichen zu eliminieren.

10. Verfahren nach Anspruch 1, wobei folgendes vorgesehen ist: Modifizieren der Volumen- und/oder Opazitäts-Parameter eines zweiten Populationsuntersat zes weißer Blutkörperchen; und

elektronisches Analysieren von mindestens einem der erwähnten modifizierten Untersätze weißer Blutkörperchen und der Population weißer Blutkörperchen, aus der er abstammt, um mindestens eine Charakteristik der ausgewählten Population weißer Blutkörperchen zu bestimmen.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei folgendes vorgesehen ist: Elektronisches Analysieren der beiden erwähnten modifizierten Untersätze weißer Blutkörperchen.

12. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die erwähnten zwei Untersätze (Subsätze) weißer Blutkörperchen durch Vorsehen von Mikrosphären einer ersten Größe modifiziert werden, die damit verbunden einen monoklonalen Antikörper aufweisen, und zwar spezifisch zu dem ersten Unter- oder Subsatz weißer Blutkörperchen und Vorsehen von Mikrosphären einer zweiten Größe, die sich von der ersten Größe unterscheidet, mit einem damit verbundenen monoklonalen Antikörper spezifisch für den zweiten Untersatz weißer Blutkörperchen, und Mischen der Mikrosphären mit der Probe zur Bindung an die Populationen weißer Blutkörperchen.

13. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der erwähnte Populations-Untersatz weißer Blutkörperchen durch Vorsehen eines ersten Satzes von Mikrosphären modifiziert wird, die einen damit verbundenen monoklonalen Antikörper aufweisen, der spezifisch ist für den Untersatz weißer Blutkörperchen und Mischen der Mikrosphären mit der Probe zur Bindung mit den Populationen weißer Blutkörperchen und sodann Vorsehen eines zweiten Satzes von Mikrosphären mit einem damit verbundenen monoklonalen Antikörper, der spezifisch ist für den erwähnten monoklonalen Antikörper, der mit dem ersten Satz von Mikrosphären verbunden ist, und Mischen des zweiten Satzes von Mikrosphären mit der Probe und dem ersten Satz von Mikrosphären zur Verbindung damit.

14. Verfahren nach Anspruch 6, wobei folgendes vorgesehen ist: Modifizieren des Populations-Untersatzes weißer Blutkörperchen und Entfernen der Population roter Blutkörperchen im wesentlichen gleichzeitig.

15. Verfahren nach Anspruch 6, wobei folgendes vorgesehen ist: Modifizieren des Populations-Untersatzes weißer Blutkörperchen und Entfernen der Population roter Blutkörperchen in sequentieller Weise.