DE69221550T2

DE69221550T2 - Färbeverfahren mittels Säurefarbstoffe

Info

Publication number: DE69221550T2
Application number: DE69221550T
Authority: DE
Inventors: Naoyuki Kouno; Jun Suzuoki
Original assignee: Wako Pure Chemical Industries Ltd
Current assignee: Fujifilm Wako Pure Chemical Corp
Priority date: 1991-06-24
Filing date: 1992-06-22
Publication date: 1998-02-19
Anticipated expiration: 2012-06-23
Also published as: DK0520725T3; EP0520725A2; EP0520725A3; JPH05281190A; US5284560A; JP2803475B2; ATE156909T1; CA2071736A1; EP0520725B1; DE69221550D1; ES2104835T3

Description

Ausgangssituation

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Färbemethode mit Säurefarbstoff zum Detektieren von durch Elektrophorese abgetrennten Proteinfragmenten, usw., sowie eine dafür verwendete Reagenslösung.
Durch Elektrophorese abgetrennte Fraktionen von Proteinen sind in der Regel farblos, weshalb sie zum Detektieren und Identifizieren stets mit Farbstoffen usw. angefärbt wurden.
Zum Anfärben in Dunkelblau, Hellblau bzw. Hellpurpur ist die Verwendung von Säurefarbstoffen weit verbreitet, wie beispielsweise von Amidoschwarz 10B (C.I. 20470), das Coomassie- Brilliantblau R-250 (C.I. 42660) und Acid Violet 17 (CI. 42650). Beim Anfärben mit diesen Säurefarbstoffen führen diese ein Netz ein und setzen sich in diesem ab, obgleich sie darin nicht durch stationäre Bindungen, wie beispielsweise durch chemische Bindungen gebunden sind, so daß ein gefärbter Hintergrund erscheint. Ein Entfärben des Hintergrundes ist daher unumgänglich. Das Entfärben wird in der Regel durch Eintauchen unter Schütteln in einem Lösungsgemisch von Methanol und Wasser ausgeführt, das Essigsäure oder Trichloressigsäure enthält. Obgleich abhängig von der Art des verwendeten Farbstoffes und des Gels und der übrigen Bedingungen des Anfärbens, beträgt die zum Entfärben benötigte Zeit mindestens 4 Stunden. Um das Anfärben perfekt auszuführen, ist beträgt die Zeit in der Regel mehr, nämlich 6 bis 7 Stunden. Die zum Entfärben erforderliche Zeit beträgt in der Praxis 2 bis 4 Stunden, obgleich sie bei einigen modifizierten Methoden kürzer ist. Die erforderliche Gesamtzeit überschreitet daher einen Arbeitstag.
Andererseits beschreibt die "Analytical Biochemistry" 20, 150 (1967) eine modifizierte Methode, in der das Färben ausgeführt wird, indem Trichloressigsäure mit Coomassie-Brilliantblau R-250 unmittelbar vor der Verwendung zusammengebracht werden. Die "Analytical Biochemistry", 152, 308 (1986) beschreibt eine modifizierte Methode, in der das Färben durch Zusetzen von Pikrinsäure zum vorgenannten Farbstoff ausgeführt wird. In der ersteren Methode kann das Färben in einer Stunde ausgeführt werden, wobei jedoch eine Prozedur zum Entfärben unumgänglich und die Empfindlichkeit gering ist. In der zweiten Methode kann das Färben in 30 Minuten ausgeführt werden, wobei bei dieser Methode ein schwerwiegender Nachteil darin besteht, daß ein Entfärben des Hintergrundes aufgrund der Behinderung durch die gelbe Farbe der Pikrinsäure die doppelte Zeit erfordert. Bei dieser Methode besteht ein Problem der Gefahr der Handhabung der Pikrinsäure als ein Ausgangsmaterial für eine Reagenslösung.
Damit erfordert das Anfärben mit den Säurefarbstoffen eine aufwendige Prozedur und lange Zeit, wobei jedoch unbestritten ist, daß das Anfärben gegenwärtig die zuverlässigste, brauchbarste und am häufigsten angewendete Methode zur Detektion und zur Identifizierung von Fraktionen ist, die mit Hilfe der Elektrophorese separiert wurden. Die Literaturstelle "Electrophoresis", Bd. 6, Nr. 9, 1985, S. 427...448 (V. Neuhoff, et al.) gibt eine Übersicht über zahlreiche verschiedene Prozesse zur Erlangung eines klaren Hintergrundes und hochempfindlicher Protein-Anfärbungen mit Coomassie- Blau-Farbstoffen in Polyacrylamid in Gelen.

Zusammenfassung der Erfindung

Eine Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Gewährung einer Methode, mit der die vorgenannten mühseligen Operationen in der nützlichen Säurefarbstoff-Anfärbemethode für elektrophoretisch separierte Fraktionen auf einer Trägermatrix weggelassen werden können; die für die Behandlung nach dieser Methode erforderliche Zeit verkürzt und die bisher erzielten Leistungsmerkmale dieser Methode weiter verbessert werden können. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung einer in dieser Methode verwendeten.
Die vorliegende Erfindung gewährt eine Anfärbemethode mit Säurefarbstoff für elektrophoretisch separierte Fraktionen auf einer Trägermatrix, die das Fixieren der Trägermatrix nach Elektrophorese mit einer wäßrigen Lösung umfaßt, die einen niederen Alkohol mit 1 ... 4 Kohlenstoffatomen und eine organische Säure enthält; sowie danach das Färben der Trägermatrix mit einer Säurefarbstofflösung, welche aufweist: einen Säurefarbstoff, eine oder mehrere Säuren, ausgewählt aus Dicarbonsäuren, Aminosäuren, Hydroxycarbonsäuren, Sulfonsäuren und Kojisäure und erforderlichenfalls eine organische Säure zum Auflösen des Säurefarbstoffes.
Die vorliegende Erfindung gewährt außerdem eine Reagenslösung zum Färben mit Säurefarbstoff nach Elektrophorese, welche Lösung umfaßt: einen Säurefarbstoff und eine oder mehrere Säuren, ausgewählt aus Dicarbonsäuren, Aminosäuren, Hydroxycarbonsäuren, Sulfonsäuren und Kojisäure, unter der Voraussetzung, daß diese eine oder mehrere Säuren nicht die Säuren Oxalsäure, Citronensäure, Sulfoessigsäure und Sulfosalicylsäure einschließen.
Die vorliegende Erfindung gewährt ferner einen Satz zum Färben mit Säurefarbstoff nach Elektrophorese, welcher Satz umfaßt: (a) als eine Reagenslösung zum Fixieren eine wäßrige Lösung, die einen niedrigen Alkohol mit 1 ... 4 Kohlenstoffatomen und eine organische Säure; sowie (b) eine Reagenslösung zum Färben enthält, umfassend einen Säurefarbstoff, eine oder mehrere vorgegebene Säuren, ausgewählt aus Dicarbonsäuren, Aminosäuren, Hydroxycarbonsäuren, Sulfonsäuren und Kojisäure und erforderlichenfalls eine organische Säure zum Auflösen des Säurefarbstoffes.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben zur Lösung der vorgenannten Aufgaben eingehende Untersuchungen ausgeführt und als Folge festgestellt, daß ein Anfärben mit einer Säurefarbstofflösung, die einen Säurefarbstoff und eine oder mehrere vorgegebene organische Säuren aufweist, die Unterdrückung des Anfärbens einer Trägermatrix in ausreichendem Maße möglich macht und eine Prozedur zum Entfärben des Hintergrundes unnötig macht oder wesentlich einschränkt. Darüber hinaus haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung festgestellt, daß die Verringerung der zum Anfärben und zur Verstärkung der Empfindlichkeit erforderlichen Zeit erreicht werden kann, indem eine Trägermatrix nach der Elektrophorese einer Fixierung mit einer wäßrigen Lösung unterzogen wird, die einen niederen Alkohol mit 1 ... 4 Kohlenstoffen enthält sowie eine organische Säure, und zwar noch vor der vorstehend ausgeführten Prozedur zum Anfärben, womit die vorliegende Erfindung ihre Aufgabe gelöst hat.
Als die Trägermatrix zur Elektrophorese, auf die die vorliegende Erfindung zur Anwendung gelangt, wird in der Regel ein Material mit Netzwerkstruktur verwendet. Beispielhaft sind solche Materialien aus makromolekularen Substanzen, wie beispielsweise Polyacrylamid-Gele, Agarose-Gele, Agar-Gele, Celluloseacetat-Streifen, usw.
Der niedere Alkohol mit 1 ... 4 Kohlenstoffatomen, der zur erfindungsgemäßen Fixierung verwendet wird, schließt Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropanol, Isobutanol, usw. ein. Die für die Fixierung verwendete organische Säure schließt Monocarbonsäuren ein, wie beispielsweise Ameisensäure, Essigsäure, Propansäure, usw., sowie alle zahlreichen organischen Säuren, die in der nachfolgend ausgeführten Behandlung zum Anfärben nach der vorliegenden Erfindung verwendbar sind.
Obgleich die Konzentrationen des niederen Alkohols und der organischen Säure in der Reagenslösung zum Fixieren nicht entscheidend sind, beträgt die Konzentration des niederen Alkohols in der Regel 5 ... 70 % (Volumen/Volumen) und vorzugsweise 15 ... 60 % (Volumen/Volumen) und die Konzentration der organischen Säure in der Regel 5 ... 30 % (Gewicht/Volumen) und vorzugsweise etwa 10 bis etwa 20 % (Gewicht/Volumen).
Die Prozedur zum Fixieren als Vorbehandlung kann durch bloßes Eintauchen der Trägermatrix nach der Elektrophorese in eine wäßrige Lösung ausgeführt werden, die den niederen Alkohol und die organische Säure enthält (nachfolgend abgekürzt als "Reagenslösung zum Fixieren"), wobei für eine vorbestimmte Zeit geschüttelt wird. Obgleich das Volumen der Reagenslösung zum Fixieren in der Regel das Fünffache oder mehr von dem der Trägermatrix beträgt, wird in der Regel etwa das Zehnfache des Volumens der Trägermatrix bevorzugt, da die Verwendung eines zu großen Volumens der Reagenslösung zum Fixieren eine Vergeudung der Reagens bedeutet. Obgleich die einmalige Ausführung des Fixierens in der Regel ausreichend ist, wird die nochmalige Ausführung der Fixierung bevorzugt, indem die Lösung durch eine Lösung frische ausgewechselt wird. Obgleich die Dauer des Fixierens nicht entscheidend ist, ist es in der Regel ausreichend, wenn die Fixierung zweimal mit jeweils etwa 10 Minuten ausgeführt wird.
Als der in der vorliegenden Erfindung zum Färben verwendete Säurefarbstoff können alle Säurefarbstoffe exemplifiziert werden, die in der Regel auf dem Gebiet verwendet werden, beispielsweise Coomassie-Brilliantblau R-250 (C.I. 42660), Coomassie-Brilliantblau G-250 (C.I. 42655), Acid Violet 17 (C.I. 42650), Amidoschwarz 10B (C.I. 20470), Nigrosine (C.I. 50420), Ponceau 3R (C.I. 16155), usw. Von diesen Farbstoffen werden Coomassie-Brilliantblau R-250 und Acid Violet 17 besonders bevorzugt. Obgleich die Konzentration der Säurefarbstoffe nicht entscheidend ist, beträgt sie in der Regel 0,01 ... 1,5 % (Gewicht/Volumen) und vorzugsweise 0,05 ... 1,0 % (Gewicht/Volumen).
Die Färbemethode der vorliegenden Erfindung zeichnet sich durch Verwendung einer Säurefarbstofflösung aus, die eine oder mehrere vorgegebene organische Säuren zusätzlich zu einer organischen Säure enthält (z.B. Essigsäure, usw.), die wahlweise zum Auflösen des Farbstoffes verwendet wird.
Die Konzentration der organischen Säure zum Auflösen des Farbstoffes ändert sich in Abhängigkeit von der Art der verwendeten organischen Säuren und beträgt in der Regel 1 ... 30 % (Volumen/Volumen) oder mehr. Beispielsweise beträgt im Fall der Essigsäure die Konzentration bevorzugt 3 ... 20 % (Volumen/Volumen) und mehr bevorzugt 5 ... 10 % (Volumen/Volumen).
Als die in der Säurefarbstofflösung der vorliegenden Erfindung enthaltende vorgegebene, organische Säure können die folgenden exemplifiziert werden: aliphatische oder aromatische Dicarbonsäure, wie beispielsweise Succinsäure, Oxalsäure, Adipinsäure, Glutarsäure, Malonsäure, Pimelinsäure, Suberinsäure, Azelainsäure, Sebacinsäure, Funarsäure, Maleinsäure, Itaconsäure, Phthalsäure; Aminosäuren, wie beispielsweise Asparaginsäure, Glutaminsäure, Glycin, Alanin, usw.; aliphatische oder aromatische Hydroxycarbonsäuren, wie beispielsweise, Milchsäure, Weinsäure, Citronensäure, Mandelsäure, Äpfelsäure, Tartronsäure, Glycerinsäure, α-Hydroxybuttersäure, Glykolsäure, β-Hydroxybenzoesiure, Gallsäure, Protocatechusäure, Orselllinsäure, Salicylsäure, usw.; aliphatische oder aromatische Sulfonsäuren, wie beispielsweise Sulfoessigsäure, Methansulfonsäure, β-Toluolsulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Sulfosalilcylsäure, usw. sowie Kojisäure, die eine spezielle organische Säure ist. Diese vorgegebenen organischen Säuren können einzeln oder als eine Mischung davon verwendet werden.
Obgleich der Gehalt der vorgegebenen organischen Säure in der Säurefarbstoff lösung nicht entscheidend ist, beträgt er in der Regel 0,1 ... 5 % (Gewicht/Volumen) und vorzugsweise 0,3 ... 3 % (Gewicht/Volumen). Die Reagenslösung zum Anfärben nach der vorliegenden Erfindung wird in der Regel in einem zwei- .... zehnfachen Volumen und vorzugsweise drei- ... achtfachen Volumen und mehr bevorzugt drei- ... fünffachen Volumen des Volumens der Trägermatrix verwendet.
Die erfindungsgemäße Methode zum Anfärben umfaßt das Aufnehmen nachzuweisender Substanzen (Proteine, Polypeptide, usw.) auf einer Trägermatrix und nach dem Zuführen zur Elektrophorese das Ausführen der vorstehend beschriebenen Prozedur des Fixierens entsprechend der vorliegenden Erfindung und nachfolgend der Behandlung zum Anfärben mit der erfindungsgemäßen Reagenslösung zum Anfärben, die den vorgenannten Säurefarbstoff aufweist, eine organische Säure (z.B. Essigsäure, usw.), die wahlweise zum Auflösen des Farbstoffes verwendet wird, und die vorgenannte vorgegebene organische Säure. Als die für diese Färbebehandlung erforderliche Zeit sind in der Regel etwa 30 Minuten ausreichend.
Unter Anwendung der erfindungsgemäßen Färbemethode mit Säurefarbstoff und der erfindungsgemäßen Reagenslösung zum Anfärben mit Säurefarbstoff (oder des erfindungsgemäßen Satzes unter Verwendung der Reagenslösung, die die Reagenslösung zum Fixieren aufweist und die Reagenslösung zum Anfärben) wird das Entfärben, das bisher als unumgänglich galt und eine lange Zeit in Anspruch nahm, in der Regel nicht mehr erforderlich. Wenn in diesem Fall aus irgendeinem Grund ein Entfärben des Hintergrunds gewünscht wird, beispielsweise bei einem beabsichtigten oder unbeabsichtigten Färben über eine lange Zeitdauer, kann dieses unter Verwendung einer konventionellen Reagenslösung zum Entfärben erfolgen (eine wäßrige Lösung oder eine gemischte Lösung von Methanol und Wasser, die Essigsäure oder Trichloressigsäure enthält), wobei eine Behandlung zum Entfärben von etwa 10 Minuten im Gegensatz zu konventionellen Methoden ausreichend ist.
Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf die "Beispiele und Vergleichsbeispiele" erklärt, die nichteinschränkend sind und der Veranschaulichung dienen.

Beispiel 1

Als eine Reagenslösung zum Fixieren wurde eine wäßrige Lösung zubereitet (eine Lösung in deionisiertem Wasser; was auch nachfolgend gilt), die 45 % (Volumen/Volumen) Methanol und 10 % (Gewicht/Gewicht) Essigsäure enthielt. Eine Reagenslösung zum Anfärben wurde erhalten, indem Coomassie- Brilliantblau R-250 zu einer wäßrigen 10%igen (Gewicht/Volumen) Essigsäurelösung zum Einstellen der Konzentration des Farbstoffes auf 0,2 % (Gewicht/Volumen) zugesetzt wurde und die so zubereitete Lösung mit einer wäßrigen 2%igen (Gewicht/Volumen) Oxalsäurelösung in einem Volumenverhältnis von 1:1,5 gemischt wurde. Separat wurde eine wäßrige 10%ige (Gewicht/Volumen) Essigsäurelösung als eine konventionelle Reagenslösung zum Entfärben verwendet.
Als eine Probe wurde ein Polyacrylamid-Gel mit darauf der Elektrophorese unterzogenem Rinderserumprotein unter Schütteln in die Reagenslösung zum Fixieren (mit dem zehnfachen Volumen des Volumens des Gels) zweimal für jeweils 10 Minuten eingetaucht. Danach wurde das Gel unter Schütteln in die Reagenslösung zum Anfärben (mit dem vierfachen Volumen des Volumens des Gels) für 30 Minuten eingetaucht und sodann für 10 Minuten in die Reagenslösung zum Entfärben. Die erforderliche Gesamtzeit für die vorgenannte Prozedur betrug 60 Minuten. Es wurde ein hervorragend angefärbtes Bild erhalten. Es konnte mühelos die höchste Empfindlichkeit des Teils erhalten werden. Die Empfindlichkeit war so groß, daß, wenn die Gesamtmenge der Proteine 0,075 Mikrogramm betrug, klare Bande erschienen.
In dem vorliegenden Beispiel ließ sich ein ausreichend detektierbares und identifizierbares, klares Anfärbebild selbst dann erhalten, wenn die letzte Prozedur, d.h. das Entfärben, weggelassen wurde.

Beispiel 2

Als eine Reagenslösung zum Fixieren wurde eine wäßrige Lösung zubereitet, die 60 % (Volumen/Volumen) Ethanol und 20 % (Gewicht/Volumen) Weinsäure enthielt. Eine Reagenslösung zum Anfärben wurde erhalten, indem Coomassie-Brilliantblau R-250 zu einer wäßrigen, 10%igen (Gewicht/Volumen) Essigsäurelösung zum Einstellen der Konzentration des Farbstoffes auf 0,05 % (Gewicht/Volumen) zugegeben und die so zubereitete Lösung mit einer wäßrigen, 3%igen (Gewicht/Volumen) Weinsäurelösung in einem Volumenverhältnis von 1:1,2 gemischt wurde. Separat wurde wie in Beispiel 1 eine wäßrige, 10%ige (Gewicht/Volumen) Essigsäurelösung als eine Reagenslösung zum Entfärben verwendet.
Unter Verwendung der vorgenannten Reagenslösung zum Fixieren, der Reagenslösung zum Anfärben und der Reagenslösung zum Entfärben wurde in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 eine kommerziell verfügbare Molmassen-Markersubstanz behandelt, umfassend Phosphorylase B, Rinderserumalbumin, Ovalbumin, Carbonatdehydrase, Sojabohnentrypsin-Inhibitor und Lysozym, um die gleichen Ergebnisse wie in Beispiel zu erhalten.

Beispiel 3

Als eine Reagenslösung zum Fixieren wurde eine wäßrige Lösung zubereitet, die 15 % (Volumen/Volumen) Isopropanol und 15 % (Gewicht/Volumen) Citronensäure enthielt. Eine Reagenslösung zum Anfärben wurde erhalten, indem Coomassie-Brilliantblau R-250 zu einer wäßrigen 10%igen (Gewicht/Volumen) Essigsäurelösung zum Einstellen der Konzentration des Farbstoffes auf 1,0 % (Gewicht/Volumen) zugesetzt und die so zubereitete Lösung mit einer wäßrigen 0,5%igen (Gewicht/Volumen) Kojisäurelösung in einem Volumenverhältnis von 1:2,5 gemischt wurde. Als eine Reagenslösung zum Entfärben wurde separat wie in Beispiel 1 eine wäßrige 10%ige (Gewicht/Volumen) Essigsäurelösung verwendet.
Unter Verwendung der vorgenannten Reagenslösung zum Fixieren, der Reagenslösung zum Anfärben und der Reagenslösung zum Entfärben wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 Kaninchen-IGG F(ab')2 behandelt, um die gleichen Ergebnisse wie in Beispiel 1 zu erhalten.

Beispiel 4

In der gleichen Weise wie in Beispiel 1 wurde als eine Probe ein Agarose-Gel mit darauf der Elektrophorese unterzogenem Rinderserumprotein mit der Ausnahme behandelt, daß exakt die gleichen Reagenslösungen wie in Beispiel 2 verwendet wurden, außer der Verwendung von Glycin anstelle der in Beispiel 2 verwendeten Reagenslösung zum Anfärben. Dementsprechend wurden die gleichen Ergebnisse wie in Beispiel 1 erhalten.

Beispiel 5

Als eine Probe wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 ein Agar-Gel mit darauf der Elektrophorese unterzogenem Rinderserumprotein behandelt, indem exakt die gleichen Reagenslösungen wie in Beispiel 1 mit der Ausnahme der Verwendung von Salicylsäure anstelle von Oxalsäure in der Reagenslösung zum Anfärben verwendet wurden. Dementsprechend wurden die gleichen Ergebnisse wie in Beispiel 1 erhalten.

Beispiel 6

Als eine Probe wurde in der gleichen weise wie in Beispiel 1 ein Agar-Gel mit darauf der Elektrophorese unterworf enem Rinderserumprotein behandelt, indem exakt die gleichen Reagenslösungen wie in Beispiel 1 mit der Ausnahme der Verwendung von Sulfoessigsäure anstelle von Oxalsäure und unter Verwendung von Acid Violet 17 anstelle von Coomassie- Brilliantblau R-250 in der Reagenslösung zum Anfärben verwendet wurden. Dementsprechend wurden die gleichen Ergebnisse wie in Beispiel 1 erhalten.

Beispiel 7

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde mit der Ausnahme der Verwendung von Citronensäure anstelle von Oxalsäure in der Reagenslösung zum Anfärben wiederholt. Dementsprechend wurden die gleichen Ergebnisse wie in Beispiel 1 erhalten.

Vergleichsbeispiel 1 (konventionelle Methode 1)

Als eine Reagenslösung zum Anfärben wurde eine Lösung zubereitet, indem Amidoschwarz 10B zu einer wäßrigen 7%igen (Gewicht/Volumen) Essigsäurelösung zum Einstellen der Konzentration des Farbstoffes auf 1 Gewichtsprozent zugesetzt wurde. Als eine Reagenslösung zum Entfärben wurde eine wäßrige Lösung verwendet, die 50 % (Volumen/Volumen) Methanol und 10 % (Gewicht/Volumen) Essigsäure enthielt.
Ein Polyacrylamid-Gel mit darauf der Elektrophorese unterzogenem Rinderserumprotein wurde als eine Probe unter Schütteln in die vorgenannte Reagenslösung zum Anfärben für 15 Minuten eingetaucht. In dem so angefärbten Gel wurde das gesamte Gel einschließend der Hintergrund angefärbt, so daß die Detektion und Identifizierung objektiver Fraktionen gänzlich unmöglich war, sofern der Hintergrund nicht entfärbt wurde. Das Entfärben ließ sich weitgehend durch Eintauchen des angefärbten Gels unter Schütteln in die vorgenannte Reagenslösung zum Entfärben für 4 Stunden erreichen. Es konnte ein zufriedenstellendes angefärbtes Bild erhalten werden, wobei die Sensibilität so groß war, daß, wenn die Gesamtmenge der Proteine 0,75 Mikrogramm betrug, klare Bande erschienen.

Vergleichsbeispiel 2 (konventionelle Methode 2)

Als eine Reagenslösung zum Anfärben wurde eine Lösung zubereitet, indem Coomassie-Brilliantblau R-250 einer wäßrigen Lösung zugesetzt wurde, die 10 % (Gewicht/Volumen) Essigsäure und 45 % (Volumen/Volumen) Ethanol enthielt, um die Konzentration des Farbstoffes auf 0,25 % (Gewicht/Volumen) einzustellen. Als eine Reagenslösung zum Entfärben wurde eine wäßrige Lösung verwendet, die 10 % (Gewicht/Volumen) Essigsäure und 45 % (Volumen/Volumen) Ethanol enthielt.
Es wurde ein Polyacrylamid-Gel mit darauf der Elektrophorese unterzogenem Rinderserumprotein als eine Probe unter Schütteln in die vorgenannten Reagenslösung zum Anfärben für Minuten eingetaucht. In dem angefärbten Gel war das gesamte Gel einschließlich der Hintergrund angefärbt, so daß die Detektion und Identifizierung objektiver Fraktionen gänzlich unmöglich war, sofern der Hintergrund nicht entfärbt wurde. Das Entfärben ließ sich weitgehend durch Eintauchen des angefärbten Gels unter Schütteln in die vorgenannte Reagenslösung zum Entfärben für 4 Stunden erreichen. Dementsprechend wurden die gleichen Ergebnisse wie in Beispiel 1 erhalten.

Vergleichsbeispiel 3

Als eine Reagenslösung zum Fixieren wurde eine wäßrige Lösung zubereitet, die 10 % (Gewicht/Volumen) Essigsäure und 45 % (Volumen/Volumen) Methanol enthielt. Als eine Reagenslösung zum Anfärben wurde eine Lösung zubereitet, indem Coomassie-Brilliantblau R-250 zu einer wäßrigen 10%igen (Gewicht/Volumen) Essigsäurelösung zugesetzt wurde, um die Konzentration des Farbstoffes auf 0,1 % (Gewicht/Volumen) einzustellen. Als eine Reagenslösung zum Entfärben wurde eine wäßrige Lösung verwendet, die 10 % (Gewicht/Volumen) Essigsäure und 45 % (Volumen/Volumen) Ethanol enthielt.
Ein Polyacrylamid-Gel mit darauf der Elektrophorese unterzogenem Rinderserumprotein wurde als eine Probe unter Schütteln in die vorgenannte Reagenslösung zum Fixieren zweimal für jeweils 10 Minuten eingetaucht. Danach wurde das Gel unter Schütteln in die Reagenslösung zum Anfärben für 30 Minuten eingetaucht. In dem angefärbten Gel war die Identifizierung objektiver Fraktionen gänzlich unmöglich, sofern der Hintergrund nicht entfärbt wurde. Das Entfärben ließ sich weitgehend durch Eintauchen des angefärbten Gels unter Schütteln in die vorgenannte Reagenslösung zum Entfärben für 4 Stunden erreichen. Dementsprechend wurden die gleichen Ergebnisse wie in Beispiel 1 erhalten.

Vergleichsbeispiel 4

Eine Reagenslösung zum Anfärben wurde erhalten, indem Coomassie-Brilliantblau R-250 zu einer wäßrigen 10%igen (Gewicht/Volumen) Essigsäurelösung zum Einstellen der Konzentration des Farbstoffes auf 0,2 % (Gewicht/Volumen) zugesetzt und die so zubereitete Lösung mit einer wäßrigen 2%igen (Gewicht/Volumen) Oxalsäurelösung in einem Volumenverhältnis von 1:1,5 gemischt wurde. Separat wurde eine wäßrige 10%ige (Gewicht/Volumen) Essigsäurelösung als eine konventionelle Reagenslösung zum Entfärben verwendet.
Ein Polyacrylamid-Gel mit darauf der Elektrophorese unterzogenem Rinderserumprotein wurde als eine Probe unter Schütteln in die vorgenannte Reagenslösung zum Anfärben für Minuten eingetaucht und danach für 10 Minuten in die Reagenslösung zum Entfärben. Es konnte ein zufriedenstellendes angefärbtes Bild erhalten werden, jedoch war die Sensibilität so groß, daß, wenn die Gesamtmenge der Proteine 7,4 Mikrogramm betrug, klare Bande erschienen.

Beispiel 5

Der folgende Versuch wurde nach der in "Analytical Biochemistry", 20, 150 (1967), beschriebenen Methode ausgeführt, um die nachfolgend beschriebenen Ergebnisse zu erhalten.
Es wurde eine wäßrige 12,5%ige (Gewicht/Volumen) Trichloressigsäurelösung als eine Reagenslösung zum Fixieren verwendet. Eine Reagenslösung zum Anfärben wurde zubereitet, indem eine wäßrige 1%ige (Gewicht/Volumen) Coomassie- Brilliantblau R-250-Lösung 20fach mit einer wäßrigen 12,5%igen (Gewicht/Volumen) Trichloressiglösung verdünnt wurde. Als eine Reagenslösung zum Entfärben wurde eine wäßrige 12,5%ige (Gewicht/Volumen) Trichloressigsäurelösung verwendet.
Ein Agarose-Gel mit darauf der Elektrophorese unterzogenem Rinderserumprotein wurde als eine Probe unter Schütteln in die vorgenannte Reagenslösung zum Fixieren für 30 Minuten eingetaucht und danach für 30 Minuten in der Reagenslösung zum Anfärben. In dem so erhaltenen Gel war das gesamte Gel einschließlich der Hintergrund angefärbt, so daß eine Detektion und Identifizierung objektiver Fraktionen zumeist unmöglich war, sofern der Hintergrund nicht entfärbt wurde. Das Entfärben ließ sich weitgehend durch Eintauchen des angefärbten Gels unter Schütteln in die vorgenannte Reagenslösung zum Entfärben für 1 Stunde erreichen. Es konnte ein zufriedenstellend angefärbtes Bild erhalten werden, wobei die Sensibilität so groß war, daß, wenn die Gesamtmenge der Proteine 0,75 Mikrogramm betrug, klare Bande erschienen.
Die Ergebnisse von Beispiel 1 und 7 und Vergleichsbeispiel 1 bis 5 sind in Tabelle 1 zusammengestellt.
1) ... Die angegebene Zeit ist die Summe einer Zeit zum Fixieren und einer Zeit zum Färben;
2) ... Nachweisempfindlichkeit:
++++ Es erschienen klare Bande bei einer Protein- Gesamtmenge von 0,075 Mikrogramm.
+++ Es erschienen klare Bande bei einer Protein- Gesamtmenge von 0,75 Mikrogramm.
++ Es erschienen klare Bande bei einer Protein- Gesamtmenge von 7,5 Mikrogramm.
+ Es erschienen keine klare Bande bei einer Protein-Gesamtmenge von 7,5 Mikrogramm.
- Es erschienen keine klaren Bande.
Wie vorstehend erläutert, wurden durch Ausführung des Fixierens mit einer einen niederen Alkohol mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und einer organischen Säure enthaltenen wäßrigen Lösung vor dem Anfärben mit Säurefarbstoff und nach dem Ausführen des Anfärbens mit Säurefarbstoff in Gegenwart einer oder mehrerer Säuren, ausgewählt aus Dicarbonsäuren, Aminosäuren, Hydroxycarbonsäuren, Sulfonsäuren und Kojisäure, die zum Anfärben erforderliche Zeit stark herabgesetzt, das Anfärben des Hintergrundes in einem solchen Umfang unterdrückt, daß ein nachfolgendes Entfärben im wesentlichen nicht nötig war, und die Empfindlichkeit wurde stark erhöht. Dieses Ergebnis geht weit über die Erwartung im Vergleich zu dem folgenden Ergebnis hinaus, das bei der Methode in der Referenz (Analytical Biochemistry", 20, 150 (1967)) erhalten wurde, bei der Coomassie-Brilliantblau R- 250 in Kombination mit Trichloressigsäure verwendet wurde: obgleich das Anfärben des Hintergrundes bis zu einem gewissen Umfang unterdrückt wurde, wurde auch das Anfärben von Fraktionen unterdrückt, so daß ein neues Problem einer geringen Empfindlichkeit entstand.

Claims

1. Färbemethode mit Säurefarbstoff für elektrophoretisch separierte Fraktionen auf einer Trägermatrix, welches Verfahren umfaßt:

Fixieren der Trägermatrix nach Elektrophorese mit einer wässrigen Lösung, enthaltend einen niederen Alkohol mit 1 ... 4 Kohlenstoffatomen und eine organische Säure; sowie

Färben der Trägermatrix mit einer Säurefarbstofflösung, welche aufweist: einen Säurefarbstoff, eine oder mehrere vorgegebene Säuren, ausgewählt aus Dicarbonsäuren, Aminosäuren, Hydroxycarbonsäure, Sulfonsäuren und Kojisäure und erforderlichenfalls eine organische Säure zum Auflösen des Säurefarbstoffes.

2. Reagenslösung zum Färben mit Säurefarbstoff nach Elektrophorese, welche Lösung umfaßt: einen Säurefarbstoff und eine oder mehrere Säuren, ausgewählt aus Dicarbonsäuren, Aminosäuren, Hydroxycarbonsäuren, Sulfonsäuren und Kojisäure, unter der Voraussetzung, daß diese eine oder mehrere Säuren nicht die Säuren Oxalsäure, Citronensäure, Sulfoessigsäure und Sulfosalicylsäure einschließen.

3. Satz zum Färben mit Säurefarbstoff nach Elektrophorese, welcher Satz umfaßt: (a) als eine Reagenslösung zum Fixieren eine wässrigen Lösung, enthaltend einen niederen Alkohol mit 1 ... 4 Kohlenstoffatomen und eine organische Säure; sowie (b) eine Reagenslösung zum Färben, umfassend einen Säurefarbstoff, eine oder mehrere vorgegebene Säuren, ausgewählt aus Dicarbonsäuren, Aminosäuren, Hydroxycarbonsäuren, Sulfonsäuren und Kojisäure und erforderlichenfalls eine organische Säure zum Auflösen des Säurefarbstoffes.

4. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem der Säurefarbstoff Coomassie-Brilliantblau R250 ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem der Säurefarbstoff Acid Violet 17 ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, 4 und 5, bei welchem die Trägermatrix ein Polyacrylamid-Gel ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1, 4 und 5, bei welchem die Trägermatrix ein wässriges Gel oder ein Agar-Gel ist.

8. Verfahren nach einem der vorgenannte Ansprüche 1 und 4 bis 7, bei welchem die vorgegebene Säure mindestens ein Vertreter ist, ausgewählt aus Oxalsäure, Weinsäure, Citronensäure, Kojisäure, Glycin, Salicylsäure und Sulfoessigsäure.

9. Verfahren nach einem der vorgenannte Ansprüche 1 und 4 bis 7, bei welchem die für die Fixierung verwendete organische Säure Ameisensäure, Essigsäure oder Propansäure ist und die zum Färben verwendete, vorgegebene Säure mindestens ein Vertreter ist, der ausgewählt wird aus Succinsäure, Oxalsäure, Adipinsäure, Glutarsäure, Malonsäure, Pimelinsäure, Suberinsäure, Azelainsäure, Sebacinsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Itaconsäure, Phthalsäure, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Glycin, Alanin, Milchsäure, Weinsäure, Citronensäure, Mandelsäure, Äpfelsäure, Tartronsäure, Glycerinsäure, α- Hydroxybuttersäure, Glykolsäure, β-Hydroxybenzoesäure, Gallsäure, Protocatechusäure, Orselllinsäure, Salicylsäure, Sulfoessigsäure, Methansulfonsäure, β-Toluolsulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Sulfosalilcylsäure und Kojisäure.

10. Satz von Reagenzien zum Fixieren und Färben mit Säurefarbstoff nach Elektrophorese, welcher Satz umfaßt:

(a) einen Behälter mit einer wässrigen Lösung als eine Reagenslösung zum Fixieren, umfassend einen niederen Alkohol mit 1 ... 4 Kohlenstoff atomen und eine organische Säure,

(b) einen Behälter mit einer Lösung, umfassend einen Säurefarbstoff und erforderlichenfalls eine organische Säure zum Auflösen des Säurefarbstoffes, und

(c) einen Behälter mit einer Lösung, umfassend eine oder mehrere Säuren, ausgewählt aus Dicarbonsäuren, Aminosäuren, Hydroxycarbonsäuren, Sulfonsäuren und Kojisäure.

11. Verwendung einer Reagenslösung zum Färben mit Säurefarbstoff nach dem Fixieren einer Trägermatrix nach Elektrophorese unter Verwendung einer wässrigen Lösung mit einem niederen Alkohol mit 1...4 Kohlenstoffatomen und einer organische Säure, welche Lösung zum Färben mit einem Säurefarbstoff aufweist: einen Säurefarbstoff, eine oder mehrere vorgegebene Säuren, ausgewählt aus Dicarbonsäuren, Aminosäuren, Hydroxycarbonsäuren, Sulfonsäuren und Kojisäure und erforderlichenfalls eine organische Säure zum Auflösen des Säurefarbstoffes.