JPH05281190A

JPH05281190A - 酸性色素染色法及び酸性色素染色試液

Info

Publication number: JPH05281190A
Application number: JP4188707A
Authority: JP
Inventors: Naoyuki Kono; 直幸河野; Jun Suzuoki; 純鈴置
Original assignee: Wako Pure Chemical Industries Ltd
Current assignee: Fujifilm Wako Pure Chemical Corp
Priority date: 1991-06-24
Filing date: 1992-06-23
Publication date: 1993-10-29
Anticipated expiration: 2013-09-24
Also published as: DK0520725T3; EP0520725A2; DE69221550T2; EP0520725A3; US5284560A; JP2803475B2; ATE156909T1; CA2071736A1; EP0520725B1; DE69221550D1; ES2104835T3

Abstract

(57)【要約】【目的】本発明は、蛋白質等の電気泳動画分を検出す
るために用いる、酸性色素染色方法の改良技術に関し、
従来法の煩雑を排し、処理所要時間を短縮、且つ従来の
性能を更に向上させる方法と、それに使用する試液を提
供することを目的とする。【構成】電気泳動画分の検出に用いられる酸性色素染
色法において、酸性色素溶液による染色に先行して、検
出すべき物質を担持した支持体を、炭素数１〜４の低級
アルコール及び有機酸を含有する水溶液で前処理した
後、酸性色素溶液にジカルボン酸、アミノ酸、ヒドロキ
シ酸、スルホン酸及びコウジ酸から成る群より選ばれた
１種以上の酸を共存させて染色することを特徴とする、
電気泳動における画分の酸性色素染色法。酸性色素溶液
に前記の群から選ばれた１種以上の酸を共存させて成
る、電気泳動法酸性色素染色用試液。及び炭素数１〜４
の低級アルコール及び有機酸を含有する水溶液から成る
前処理液と、前記染色用試液とを構成試薬として含んで
成る電気泳動法酸性色素染色用試薬キット。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、蛋白質等の電気泳動画
分を検出するために用いる、酸性色素染色方法の改良技
術に関する。

【発明の背景】電気泳動によって得られた蛋白質等の画
分は通常無色であるから、検出・確認のために、色素そ
の他による染色が常に行なわれている。例えばアミドブ
ラック１０Ｂ (C.I.No.20,470) は濃青に、クマシーブ
リリアントブルーＲ-２５０ (C.I.No.42,660) は明るい
青に、アシッドバイオレット１７ (C.I.No.42,650) は
明るい紫に、夫々染色する酸性色素として広く用いられ
ている。しかし従来これら酸性色素による染色では、化
学結合のような固定的な結合ではないが、支持体自体に
も色素が浸入沈積し、着色したバックグラウンドが現出
する。そこでバックグラウンドの脱色処置が不可欠にな
る。脱色操作は一般に、酢酸又はトリクロロ酢酸を含有
するメタノール−水混合溶液に振盪浸漬することによっ
て行なわれ、使用色素とか支持体の種類その他染色の諸
条件にもよるが、脱色には短くて４時間、通常完璧を要
する場合はそれ以上、６〜７時間を要するものである。

【０００２】染色に要する時間も、一部改良法では若干
短いが、実際には２〜４時間を必要とするから、合計所
要時間は１日の作業時間を越すことになる。一応 Analy
tical Biochemistry誌の２０巻１５０頁 (1967年) に
は、クマシーブリリアントブルーＲ-２５０にトリクロ
ロ酢酸を使用直前に共存させて染色する改良法、また同
誌の１５２巻３０８頁 (1986年) には、同色素にピクリ
ン酸を添加して染色する改良法が示されているが、前者
の場合染色は１時間でできるというものの、脱色操作は
不可欠であり、且つ感度が低く、また、後者の場合染色
は３０分でできるというものの、バックグラウンドの脱
色がピクリン酸の黄色の阻害によって、通常に倍する時
間を要するという重大な欠点を有する。また調液原料と
してピクリン酸を取扱う危険性の問題もある。このよう
に操作煩雑、長時間を要する酸性色素染色であるが、電
気泳動の画分検出・確認には当今最も信のおける有用
な、且つ多用される方法であることは否定できない。

【０００３】

【発明の目的】本発明は、この有用な電気泳動画分の酸
性色素染色方法の上記した如き煩雑を排し、処理所要時
間を短縮、且つ従来の性能を更に向上させる方法と、そ
れに使用する試液を提供することを目的とする。

【０００４】

【発明の構成】上記目的を達成するため、本発明は、以
下の構成より成る。「(1)電気泳動画分の検出に用いられる酸性色素染色法
において、酸性色素溶液による染色に先行して、検出す
べき物質を担持した支持体を、炭素数１〜４の低級アル
コール及び有機酸を含有する水溶液で前処理した後、酸
性色素溶液にジカルボン酸、アミノ酸、ヒドロキシ酸、
スルホン酸及びコウジ酸から成る群より選ばれた１種以
上の酸を共存させて染色することを特徴とする、電気泳
動における画分の酸性色素染色法。 (2)酸性色素溶液にジカルボン酸、アミノ酸、ヒドロキ
シ酸、スルホン酸及びコウジ酸から成る群より選ばれた
１種以上の酸を共存させて成る、電気泳動法酸性色素染
色用試液。 (3)炭素数１〜４の低級アルコール及び有機酸を含有す
る水溶液から成る電気泳動法酸性色素染色前処理試液
と、上記(2)記載の染色用試液を構成試薬として含んで
成る電気泳動法酸性色素染色用試薬キット。」

【０００５】即ち、本発明者らは上記目的を達成すべく
鋭意研究を重ねた結果、酸性色素溶液に特定の有機酸を
含有させて染色することによって、支持体自体の着色を
十分に抑え、バックグラウンドの脱色操作を不要乃至極
度に限定できることを見出し、更に、該染色操作に先立
ち、検出すべき物質を担持した支持体を炭素数１〜４の
低級アルコール及び有機酸を含有する水溶液を用いて固
定化処理することによって、染色に所要の時間を短縮
し、且つ感度を向上させ得ることを見出し、発明を完成
するに到った。

【０００６】本発明方法を適用する電気泳動用支持体
は、通常網目構造を有する素材より成るものが使用され
る。例えばポリアクリルアミドゲル、アガロースゲル、
寒天ゲル、セルロースアセテート膜などの高分子物質か
ら成るものである。本発明の前処理（固定化処理）に於
て用いられる炭素数１〜４の低級アルコールとしては、
メタノール、エタノール、プロパノール、２−プロパノ
ール、２−ブタノールなどが挙げられる。有機酸として
はギ酸、酢酸、プロピオン酸などのモノカルボン酸をは
じめとして、下記本発明の染色処理に於て用いられる各
種有機酸類が全て挙げられる。これら低級アルコール及
び有機酸の前処理試液中の濃度は特に限定されないが、
前者が通常５〜７０v/v%程度、好ましくは１５〜６０v/
v%程度であり、後者が通常５〜３０w/v%程度、好ましく
は１０〜２０w/v%程度である。前処理の固定化操作は、
これら低級アルコール及び有機酸を含有する水溶液（以
下、本発明の前処理試液と略す。）に支持体を所定時間
振盪浸漬するだけでよい。前処理試液の液量は、通常、
支持体の体積の５倍以上あれば良いが、あまり多すぎる
のは試薬の無駄使いになるので通常は１０倍前後が好ま
しく用いられる。当該前処理は、通常１回行なえばよい
が、液を取り替えて更に１回行なうことがより好まし
い。処理時間については特に制約はないが、通常は１回
に各々１０分間程度かければ十分である。

【０００７】本発明の染色に於て用いられる酸性色素と
しては、例えばクマシーブリリアントブルーＲ-２５０
(C.I.No.42,660)、クマシーブリリアントブルーＧ-２５
０(C.I.No.42,655)、アシッドバイオレット１７(C.I.N
o.42,650)、アミドブラック１０Ｂ(C.I.No.20,470)、ニ
グロシン(C.I.No.50,420)、ポンソー３Ｒ(C.I.No.16,15
5)等通常この分野に於て用いられる酸性色素が全て挙げ
られるが、なかでもクマシーブリリアントブルーＲ-２
５０、アシッドバイオレット１７が特に好ましい。これ
ら色素の濃度は必ずしも限定されるものではないが、通
常０.０１〜１.５w/v%程度、好ましくは０.０５〜１.０
w/v%程度の濃度が採用される。本発明の染色法は、酸性
色素溶液に当該色素を溶解する目的で要すれば使用され
る酢酸等の有機酸以外に特定の有機酸を添加して用いる
点に特徴を有する。酸性色素を溶解する目的で使用され
る有機酸の濃度は、用いる有機酸の種類によっても異な
り特に限定されるものではないが、例えば酢酸を用いる
場合、通常約５〜２０v/v%、好ましくは約５〜１０v/v%
程度の濃度で用いられる。

【０００８】本発明に於て酸性色素溶液に添加使用され
る特定の有機酸としては、例えば以下の如きものが挙げ
られる。即ち、例えばコハク酸、シュウ酸、アジピン
酸、グルタル酸、マロン酸、ピメリン酸、スベリン酸、
アゼライン酸、セバシン酸、フマル酸、マレイン酸、イ
タコン酸、フタル酸等の脂肪族又は芳香族ジカルボン
酸、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、
アラニン等のアミノ酸、例えば乳酸、酒石酸、クエン
酸、マンデル酸、リンゴ酸、タルトロン酸、グリセリン
酸、α-オキシ酪酸、グリコール酸、p-ヒドロキシ安息
香酸、没食子酸、プロトカテク酸、オルセリン酸、サリ
チル酸等の脂肪族又は芳香族ヒドロキシ酸、例えばスル
ホ酢酸、メタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、ベ
ンゼンスルホン酸、スルホサリチル酸等の脂肪族又は芳
香族スルホン酸、或は特殊な有機酸であるコウジ酸等が
挙げられる。これら特定の有機酸は単独若しくは二種以
上適宜混合して用いられる。これら特定の有機酸の含有
量は特に限定されるものではないが、通常酸性色素溶液
中０.１〜５w/v%程度、好ましくは０.３〜３w/v%であ
る。本発明の染色用試液は通常、支持体の体積の２〜１
０倍量、好ましくは３〜８倍量、より好ましくは３〜５
倍量用いられる。

【０００９】本発明の染色法は検出すべき物質を担持し
た支持体を上記本発明の前処理操作に付した後、上記酸
性色素と、該色素を溶解する目的で要すれば使用される
酢酸等の有機酸と、上記特定の有機酸とを含んで成る本
発明の染色用試液を用いて染色処理するわけであるが、
当該染色処理の所要時間は、通常３０分程度で十分であ
る。かくして、本発明酸性色素染色法、乃至本発明酸性
色素染色用試薬組成物（前処理試液及び染色用試液）を
用いるときは、従来不可欠とされて長時間を必要とした
脱色処置は通常不要になる。何らかの理由、例えば故意
に又は偶々長時間染色したときなどでバックグラウンド
の脱色が所望の場合は、従来通常に使用される脱色用試
液（酢酸又はトリクロロ酢酸を含有する水溶液若しくは
メタノールー水混合溶液）を用いて脱色することができ
るが、従来法の場合と異なり１０分程度の処置で十分で
ある。

【００１０】前記トリクロロ酢酸を併用したクマシーブ
リリアントブルーＲ-２５０による文献記載の方法で
は、バックグラウンドの着色を或る程度抑止するとはい
うものの、画分の染色も同様に抑制され、従って感度不
良という新しい問題が生じたのと比較して、極めて予想
を絶したことであった。

【００１１】

【実施例】以下実施例及び比較例によって本発明を説明
するが、本発明はこれによって限定されるものでない。実施例１メタノール45v/v%及び酢酸10w/v%を含有する水溶液（水
はイオン交換水を用いた。以下同様。）を調製して前処
理（固定）用試液とした。酢酸10w/v%の水溶液に、クマ
シーブリリアントブルーＲ-２５０を 0.2w/v%添加した
溶液を調製し、シュウ酸2w/v% 水溶液と1：1.5の容積比
に混合して染色用試液とした。別に、従来使用のもので
あるが、酢酸10w/v%水溶液を脱色用試液とした。牛血清
蛋白を電気泳動して得たポリアクリルアミドゲルを試料
にして、これを前処理用試液（ゲル体積の10倍量）中に
10分間×２回振盪浸漬した。次に染色用試液（ゲル体積
の４倍量）中に30分間振盪浸漬し、更にこれを脱色用試
液中に10分間振盪浸漬した。以上の所要時間の合計は60
分、得られた染色像は優秀であり、容易に従来の最高感
度を示した。その感度は、総蛋白量として 0.075μｇで
バンドが明瞭である、というレベルであった。尚、本実
施例に於て、最後の脱色操作を省いても十分検出確認で
きる鮮明な染色像が得られた。

【００１２】実施例２エタノール60v/v%及び酒石酸20w/v%を含有する水溶液を
調製して前処理用試液とした。酢酸10w/v%の水溶液に、
クマシーブリリアントブルーＲ-２５０を0.05w/v%添加
した溶液を調製し、酒石酸3w/v% 水溶液と1：1.2の容積
比に混合して染色用試液とした。別に実施例１と同様、
酢酸10w/v%水溶液を脱色用試液とした。上記前処理試
液、染色用試液及び脱色用試液を用いてホスホリラーゼ
Ｂ、牛血清アルブミン、オバアルブミン、カルボニック
アンハイドラーゼ、ソイビーントリプシンインヒビタ
ー、及びリゾチームを含有して成る市販の分子量マーカ
ーについて実施例１と同様に処理し、同様な結果を得
た。

【００１３】実施例３イソプロパノール15v/v%及びクエン酸15w/v%を含有する
水溶液を調製して前処理用試液とした。酢酸10w/v%の水
溶液に、クマシーブリリアントブルーＲ-２５０を1.0w/
v% 添加した溶液を調製し、コウジ酸0.5w/v% 水溶液と
1：2.5の容積比に混合して染色用試液とした。別に実施
例１と同様、酢酸10w/v%水溶液を脱色用試液とした。上
記前処理試液、染色用試液及び脱色用試液を用いてウサ
ギ IgG F(ab')₂について実施例１と同様に処理し、同様
な結果を得た。

【００１４】実施例４実施例２の染色用試液に於ける酒石酸をグリシンに代え
た以外は実施例２と全く同様の試液を用い、牛血清蛋白
を電気泳動して得たアガロースゲルを試料にして、実施
例１と同様に処理し、同様な結果を得た。実施例５実施例１の染色用試液に於けるシュウ酸をサリチル酸に
代えた以外は実施例１と全く同様の試液を用い、牛血清
蛋白を電気泳動して得た寒天ゲルを試料にして、実施例
１と同様に処理し、同様な結果を得た。実施例６実施例１の染色用試液に於けるシュウ酸をスルホ酢酸に
代え、クマシーブリリアントブルーＲ-２５０をアシッ
ドバイオレット１７に代えた以外は実施例１と全く同様
の試液を用い、牛血清蛋白を電気泳動して得た寒天ゲル
を試料にして、実施例１と同様に処理し、同様な結果を
得た。実施例７実施例１の染色用試液に於けるシュウ酸をクエン酸に代
えた以外は実施例１と全く同様の試液を用い、牛血清蛋
白を電気泳動して得た寒天ゲルを試料にして、実施例１
と同様に処理し、同様な結果を得た。

【００１５】比較例１（従来法１）酢酸 7w/v%の水溶液に、アミドブラック１０Ｂを1w/v%
添加した溶液を調製して、染色用試液とした。また、メ
タノール50v/v%及び酢酸10w/v%を含む水溶液を脱色用試
液とした。牛血清蛋白を電気泳動して得たポリアクリル
アミドゲルを試料にして、これを上記染色用試液中に15
分間振盪浸漬した。染色したゲルは、バックグラウンド
を含めて全体が着色し、バックグラウンドの脱色を行な
わない限り、目的画分の検出確認は全くできなかった。
これを上記脱色用試液中に４時間振盪浸漬することによ
り脱色をほぼ達成した。染色像は良好であったが、その
感度は、総蛋白量として0.75μｇでバンドが明瞭であ
る、というレベルであった。

【００１６】比較例２（従来法２）酢酸10w/v%及びエタノール45v/v%を含む水溶液にクマシ
ーブリリアントブルーＲ-２５０を0.25W/V%添加した溶
液を調製し、染色用試液とした。また、酢酸10w/v%及び
エタノール45v/v%を含む水溶液を脱色用試液とした。牛
血清蛋白を電気泳動して得たポリアクリルアミドを試料
にして、これを上記染色用試液中に15分間振盪浸漬し
た。染色したゲルは、バックグラウンドを含めて全体が
着色し、バックグラウンドの脱色を行わない限り、目的
画分の検出確認は全くできなかった。

【００１７】比較例３酢酸10w/v%及びメタノール45v/v%を含む水溶液を調製
し、前処理（固定）用試液とした。酢酸10w/v%を含む水
溶液にクマシーブリリアントブルーＲ-２５０を0.1w/v%
添加した溶液を調製し、染色用試液とした。また、酢酸
10w/v%及びエタノール45v/v%を含む水溶液を脱色用試液
とした。牛血清蛋白を電気泳動して得たポリアクリルア
ミドを試料にして、これを上記前処理用試液中に10分間
×2回振盪浸漬した。次に染色用試液中に30分間振盪浸
漬した。染色したゲルは、バックグラウンドの脱色を行
わない限り、目的画分の検出確認は全くできなかった。

【００１８】比較例４酢酸10w/v%を含む水溶液にクマシーブリリアントブルー
Ｒ-２５０を0.2w/v%添加した溶液を調製し、シュウ酸2w
/v%水溶液と1：1.5の容積比に混合して染色用試液とし
た。別に、従来使用のものであるが、酢酸10w/v%水溶液
を脱色用試液とした。牛血清蛋白を電気泳動して得たポ
リアクリルアミドゲルを試料にして、これを上記染色用
試液中に30分間振盪浸漬し、更に脱色用試液中に10分間
振盪浸漬した。染色像は良好であったが、その感度は、
総蛋白量として7.5μgでバンドが明瞭である、というレ
ベルであった。

【００１９】比較例５ Analytical Biochemistry，20巻，150頁（1967年）に記
載の方法に準じて下記の如き実験を行い、下記の如き結
果を得た。トリクロロ酢酸12.5w/v%の水溶液を前処理用
試液とした。クマシーブリリアントブルーＲ-２５０の1
w/v% 水溶液を、トリクロロ酢酸12.5w/v%の水溶液で20
倍に稀釈して、染色用試液とした。また、トリクロロ酢
酸12.5w/v%の水溶液を脱色用試液とした。牛血清蛋白を
電気泳動して得たアガロースゲルを試料にして、これを
上記前処理用試液中に30分間振盪浸漬し、次いで染色用
試液中に30分間振盪浸漬した。こうして染色したゲル
は、バックグラウンドを含めて全体が着色し、バックグ
ラウンドの脱色を行なわない限り、目的画分の検出確認
は殆どできなかった。これを上記脱色用試液中に１時間
振盪浸漬することにより脱色をほぼ達成した。染色像は
良好であったが、その感度は、総蛋白量として0.75μｇ
でバンドが明瞭である、というレベルであった。

【００２０】実施例１〜７及び比較例１〜５の結果を表
１にまとめて示す。

【表１】

【００２１】

【発明の効果】以上説明したように、酸性色素染色に先
行して、炭素数１〜４の低級アルコール及び有機酸を含
有する水溶液で前処理した後、酸性色素染色をジカルボ
ン酸、アミノ酸、ヒドロキシ酸、スルホン酸及びコウジ
酸から成る群から選ばれた１種以上の酸の共存のもとに
行なうことにより、染色に要する時間を大幅に短縮する
と共に、バックグラウンドの着色を実質的にその後の脱
色処置を不要とするまで抑止し、且つ感度を著しく向上
させた。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】電気泳動画分の検出に用いられる酸性色素
染色法において、酸性色素溶液による染色に先行して、
検出すべき物質を担持した支持体を、炭素数１〜４の低
級アルコール及び有機酸を含有する水溶液で前処理した
後、酸性色素溶液にジカルボン酸、アミノ酸、ヒドロキ
シ酸、スルホン酸及びコウジ酸から成る群より選ばれた
１種以上の酸を共存させて染色することを特徴とする、
電気泳動における画分の酸性色素染色法。
【請求項２】酸性色素溶液にジカルボン酸、アミノ酸、
ヒドロキシ酸、スルホン酸及びコウジ酸から成る群より
選ばれた１種以上の酸を共存させて成る、電気泳動法酸
性色素染色用試液。
【請求項３】炭素数１〜４の低級アルコール及び有機酸
を含有する水溶液から成る電気泳動法酸性色素染色前処
理試液と、請求項２記載の染色用試液とを構成試薬とし
て含んで成る電気泳動法酸性色素染色用試薬キット。