DE69218912T2 - Schwerkraftsattraktionsmaschine zur anpassungsfähigen autoclusterbildung n-dimensionaler datenströme - Google Patents

Description

TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
• Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Klassifikation bzw. Einteilung mehrparametriger Daten in Echtzeit (oder aus aufgezeichneten Daten) in Clustergruppen zum Zweck der Definition verschiedener Teilchenpopulationen in einer Probe. Die Erfindung ist besonders gut verwendbar auf dem Gebiet der Durchflußzytometrie, wobei mehrparametrige Daten für jede Zelle registriert werden, die einen Beleuchtungs- und Abtastbereich passiert. Sie ist besonders gut verwendbar für die Klassifikation und Zählung von immunfluoreszenzmarkierten CD3-, CD4- und CD8-Lymphozyten in Blutproben von AIDS-Patienten.
AUSGANGSSITUATION DER ERFINDUNG
• Die Teilchenanalyse umfaßt im allgemeinen die Analyse von Zellen, Zellkernen, Chromosomen und anderen Teilchen zur Identifikation der Teilchen als Mitglieder verschiedener Populationen und/oder zum Sortieren der Teilchen in verschiedene Populationen. Dieser Typ der Analyse schließt eine automatisierte Analyse mittels Mikrobild- und Durchflußzytometrie ein. Im einen wie im anderen Falle kann das Teilchen, wie z.B. eine Zelle, mit einem oder mehreren Markern bzw. Markierungssubstanzen markiert und dann auf Anwesenheit oder Abwesenheit solcher Marker untersucht werden. Im Falle einer Zelle, wie z.B. eines Leukozyten, einer Tumorzelle oder eines Mikroorganismus, kann der Marker zu einem Molekül auf der Zelloberfläche oder zu einem Molekül im Zytoplasma gelenkt werden. Die Untersuchung der physikalischen Eigenschaften einer Zelle sowie der Anwesenheit oder Abwesenheit eines oder mehrerer Marker liefert zusätzliche Informationen, die bei der Identifikation der Population nützlich sein können, zu der eine Zelle gehört.
• Die Zytometrie umfaßt eine wohlbekannte Methodik mit Verwendung mehrparametriger Daten zur Identifikation und Unterscheidung zwischen verschiedenen Zelltypen in einer Probe. Zum Beispiel kann die Probe aus den verschiedensten biologischen Flüssigkeiten entnommen werden, wie z.B. aus Blut, Lymphe oder Urin, oder sie kann aus Zellsuspensionen aus harten Geweben abgeleitet werden, wie z.B. Colon, Lunge, Brust, Niere oder Leber. In einem Durchflußzytometer werden Zellen in Suspension im wesentlichen einzeln durch einen oder mehrere Abtastbereiche geleitet, wobei in jedem Bereich jede Zelle durch eine Energiequelle beleuchtet wird. Die Energiequelle weist im allgemeinen eine Beleuchtungseinrichtung auf, die Licht einer einzigen Wellenlänge emittiert, wie es beispielsweise durch einen Laser (z.B. einen He/Ne- oder Argon-Laser) oder durch eine Quecksilberbogenlampe mit geeigneten Filtern erzeugt wird. In einem Durchflußzytometer mit einem einzigen Abtastbereich wird im allgemeinen Licht mit einer Emissionswellenlänge von 488 nm verwendet.
• In Serie mit einem Abtastbereich dient eine Lichtdetektoreinrichtung für mehrere Wellenlängen, wie z.B. Photovervielfacher (oder "SEV") zur Registrierung von Licht, das durch jede Zelle hindurchtritt (im allgemeinen als Lichtvorwärtsstreuung bezeichnet), orthogonal zur Fließrichtung der Zellen durch den Abtastbereich reflektiertem Licht (im allgemeinen als orthogonale oder seitliche Lichtstreuung bezeichnet), und von der Zelle emittiertem Fluoreszenzlicht, wenn die Zelle mit Fluoreszenzmarker(n) markiert ist, während die Zelle den Abtastbereich passiert und durch die Energiequelle beleuchtet wird. Die Lichtvorwärtsstreuung (oder FSC), die orthogonale bzw. seitliche Lichtstreuung (SSC) und die Fluoreszenzemissionen (FL1, FL2 usw.) weisen für jede Zelle (oder jedes "Ereignis") einen getrennten Parameter auf. So können zum Beispiel von einer mit zwei verschiedenen Markern markierten Zelle zwei, drei oder vier Parameter erfaßt (und registriert) werden.
• Durchflußzytometer weisen ferner Datenerfassungs-, Analyse- und Registriereinrichtungen auf, wie z.B. einen Computer, in dem Mehrfachdatenkanäle Daten von jedem SEV für das von jeder Zelle bei ihrem Durchgang durch den Abtastbereich emittierte Streulicht und Fluoreszenzlicht registrieren. Der Zweck des Analysesystems ist die Klassifikation und die Zählung von Zellen, wobei jede Zelle als ein Satz digitalisierter Parameterwerte erscheint. Typischerweise werden nach den gegenwärtigen Analyseverfahren die in Echtzeit erfaßten (oder zur späteren Analyse registrierten) Daten zur leichteren Veranschaulichung in einem zweidimensionalen Raum graphisch dargestellt. Solche graphischen Darstellungen werden als "Punktdiagramme" bezeichnet, und ein typisches Beispiel eines Punktdiagramms, das nach für Leukozyten registrierten Lichtstreuungsdaten gezeichnet wurde, ist in der Fig. 1 der US-A-4987086 dargestellt. Durch Auftragen der orthogonalen Lichtstreuung über der Lichtvorwärtsstreuung kann man in einer aus Vollblut isolierten Leukozytenpopulation zwischen Granulozyten, Monozyten und Lymphozyten unterscheiden. Durch elektronisches (oder manuelles) "Durchlassen" ausschließlich von Lymphozyten, beispielsweise mit Hilfe der Lichtstreuung, und durch Verwendung der geeigneten, mit Fluorochromen unterschiedlicher Emissionswellenlänge markierten monoklonalen Antikörper kann man weiter zwischen Zelltypen innerhalb der Lymphozytenpopulation unterscheiden (z.B. zwischen T-Helferzellen und zytotoxischen T-Zellen). Die US-A-4727020, 4704891, 4599307 und 4987086 beschreiben die Anordnung der verschiedenen Komponenten, aus denen sich ein Durchflußzytometer zusammensetzt, die allgemeinen Anwendungsprinzipien und ein Verfahren zum Durchlassen von Zellen, um zwischen Zellpopulationen in einer Blutprobe zu unterscheiden.
• Von besonderem Interesse ist die Analyse von Zellen von Patienten, die mit HIV infiziert sind, dem Virus, das AIDS verursacht. Wohlbekannt ist, daß CD4&spplus;-T-Lymphozyten bei HIV-Infektion und AIDS eine wichtige Rolle spielen. Zum Beispiel liefert die Zählung der CD4&spplus;-T-Lymphozyten in einer Blutprobe von einer infizierten Person einen Hinweis auf das Fortschreiten der Krankheit. Eine Zellzahl unter 400 pro mm³ läßt darauf schließen, daß der Zustand des Patienten vom seropositiven Zustand zu AIDS fortgeschritten ist. Außer der Zählung von CD4&spplus;-T-Lymphozyten sind auch CD8&spplus;-T-Lymphozyten gezählt worden, und ein CD4:CD8-Verhältnis ist zum Verständnis von AIDS benutzt worden.
• In beiden Fällen wird einem Patienten eine Vollblutprobe entnommen. Monoklonale Antikörper gegen CD3 (einen universellen Marker für T-Lymphozyten), CD4 und CD8 werden direkt oder indirekt mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert. Diese Farbstoffe haben voneinander unterscheidbare Emissionsspektren. (Beispiele derartiger Farbstoffe werden im Beispiel 1 der US-A-4745285 dargelegt.) Die markierten Zellen werden dann durch das Durchflußzytometer geschickt, und die Daten werden registriert. Die Daten können in Echtzeit analysiert oder im Listenmodus zur späteren Analyse gespeichert werden.
• Im zweidimensionalen Raum analysierte Daten können zwar diskrete Zellpopulationen liefern, aber meistens repräsentieren die Punktdiagramme Projektionen von multiplen Clustern. Folglich ist es oft schwierig, zwischen Zellen zu unterscheiden, die in Bereiche mit offensichtlicher Überlappung zwischen Clustern fallen. In solchen Fällen können Zellen versehentlich in einen falschen Cluster eingeteilt werden und auf diese Weise eine Ungenauigkeit in die angegebenen Populationszählwerte und -anteile einbringen. Die Erfassung zu vieler T-Zellen als CD4&spplus; im Blut eines HIV-infizierten Patienten könnte z.B. einen Kliniker glauben lassen, daß sich der Zustand eines Patienten nicht zu AIDS verschlimmert hat, und folglich könnte eine bestimmte Behandlung vorenthalten werden, die sonst angewandt würde. Bei Krebs, wie z.B. Leukämie, könnten nach der Therapie gewisse restliche Tumorzellen im Knochenmark zurückbleiben. Diese Restzellen sind in sehr niedrigen Häufigkeiten vorhanden (d.h. ihre Anwesenheit ist selten, so daß ihr Auftreten in einer großen Probe ein "seltenes Ereignis" ist), und folglich sind ihr Nachweis und ihre Klassifikation sowohl schwierig als auch wichtig.
• Gegenwärtige Datenanalyseverfahren liefern keine ausreichenden Mittel zur Unterscheidung zwischen Zellclustern und gestatten daher keine genauere Identifikation und/oder Sortierung von Zellen in verschiedene Populationen. Außerdem sagen derartige Methoden nicht voraus, ob die vom technischen Assistenten verwendeten präparativen Bedingungen richtig gewählt wurden (z.B. ungeeignete Färbetechniken, die zu einer unspezifischen Färbung führen, oder das Pipettieren ungeeigneter Reagenzien- und/oder Probenmengen). Schließlich arbeiten die meisten Methoden gut für einkernige Präparate aus Vollblut oder bei Vollblut mit lysierten Erythrozyten, funktionieren aber schlecht bei nichtlysiertem Vollblut wegen des Überflusses an roten Blutzellen und Debris (Gewebstrümmern) in einer Probe.
• Die Verwendung eines unscharfen (fuzzy) Clusterbildungsalgorithmus bei der Verarbeitung durchflußzytometrischer Daten wird in Computer Vision, Graphics, and Image Processing 41(2) (Febr. 1988) 186-209, Academic Press Inc., beschrieben. Die Verwendung eines Neuralnetz-Computersystems zur Analyse durchflußzytometrischer Daten von Phytoplankton-Populationen wird von Frankel u. a. in Cytometry 10 (1989) 540-550 beschrieben.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
• Das anspruchsgemäße Autoclusterbildungsverfahren, das hier als "Schwerkraftanziehungsmaschine" bzw. "Schwerkraftattraktormaschine" beschrieben wird, entspricht dem Bedürfnis nach einer automatischen Zuordnung von Klassifikationen zu mehrparametrigen Ereignissen bei ihrem Eintreffen von einem Sensorfeld, wie z.B. den Lichtdetektoreinrichtungen eines Zytometers. Es funktioniert auch bei der nachträglichen Klassifikation von Aufzeichnungen mehrparametriger Ereignisse im Listenmodus oder im Datenbankformat. Es ist besonders gut verwendbar bei der Clusterbildung von Z-Parameterdaten von CD3- und CD4- sowie von CD3- und CD8-T-Zellen, die mit Immunofluoreszenz-Markern markiert sind, in Blutproben von AIDS-Patienten.
• Die Schwerkraftattraktormaschine besteht aus einer geometrischen Rand- bzw. Grenzfläche von festgelegter Größe, Form und Orientierung, aber variabler Position, einer Rechenmaschine, durch welche sich die Grenzfläche selbst optimal positioniert, um einen Cluster mehrparametriger Ereignisse einzuschließen. Es können mehrere Attraktoren gleichzeitig für die Klassifikation von mehreren Ereignisclustern innerhalb des gleichen Datenstroms oder der gleichen registrierten Datenverteilung verwendet werden, wobei die Strategie darin besteht, jeder zu identifizierenden und/oder zu sortierenden Population jeweils einen Attraktor zuzuordnen. Die Klassifikation von Ereignissen in dem Datenstrom besteht aus einem Zweischrittverfahren: Im ersten Schritt (Voranalyse) wird der Datenstrom analysiert, um die Zugehörigkeitsgrenzfläche jedes Attraktors genau um den statistischen Massenmittelpunkt des Datenclusters (d.h. der Population) zu zentrieren, den der Attraktor klassifizieren soll. Die Voranalyse wird beendet, nachdem eine vorgegebene Anzahl von Ereignissen analysiert worden sind oder wenn signifikante Abweichungen in der Position eines Attraktors festgestellt werden. Im zweiten Schritt (Klassifikation) wird die Zugehörigkeitsgrenze jedes Attraktors "in ihrer Position fixiert" und ankommende Datenstromereignisse werden durch Vergleich mit den Zugehörigkeitsgrenzen getestet, um sie nach Inklusion (Enthaltensein) bzw. Exklusion (Nichtenthaltensein) zu klassifizieren.
• Die Hauptvorteile der Schwerkraftattraktormaschine bestehen darin, 1) daß sie keine Registrierung von Ereignissen im Listenmodus im Verlauf ihrer Klassifikation erfordert (d.h. daß Daten in Echtzeit analysiert werden können); 2) daß sie ein Klassifikationsverfahren bereitstellt, das eine Wanderung des Zentral- bzw. Medianwertes eines Datenclusters zwischen verschiedenen Proben toleriert, die von irgendeiner beliebigen Kombination aus der Instrumentierung, Probenvorbereitung und den Proben innewohnenden Varianzquellen herrühren kann; 3) daß sie im Falle mehrerer fehlender Cluster Stabilität aufweist und Teilchen in einer Population in der Umgebung der Stelle, wo der Cluster erwartet wird, bis ganz hinab auf null zählen kann; und 4) daß sie während der Abtastung des Datenstroms ständigen Zugriff auf Populationsvektoreinrichtungen und Element- bzw. Zugehörigkeitszählwerte bietet und während zeitraubender Tests seltener Ereignisse eine kontinuierliche Prozeßqualitätssicherung (oder "PQA") gestattet.
• Verschiedene Erweiterungen der Schwerkraftattraktormaschine vergrößern ihre Vorteile: 1) hypersphärische Grenzflächen können auf einer bevorzugten Achse gedehnt werden, um einen zigarrenförmigen Attraktor zu erhalten; 2) die Grenzfläche, die zum Durchlassen von Ereignissen für die Gravitationswechselwirkung während der Voranalyse verwendet wird, kann sich in Form und Ausdehnung von der Zugehörigkeitsgrenze unterscheiden, die während der Klassifikation angewandt wird; und 3) die zur Clusterbildung von Ereignissen verwendete Parameterteilmenge kann für verschiedene Attraktoren unterschiedlich sein und gestattet es, Parameter zu ignorieren, die ein Verschmieren auslösen, und ermöglicht die Klassifikation von Daten bei verschiedenen Dimensionskontraktionsgraden (degrees of dimensional collapse).
• Der Hauptvorteil der Schwerkraftattraktormaschine ist ihre Fähigkeit zur genauen und effizienten Autoclusterbildung, das heißt, sie kann manuelle Clusterbildungsverfahren ersetzen, die menschliches Urteilsvermögen erfordern, um die Durchlaßgeometrie an normale Varianzen in den Positionen der Zielduster anzupassen. Im Vergleich dazu sind ältere Autoclusterbildungsverfahren, die auf die Histogramm-Kurvenanalyse angewiesen sind, um schwellwertartige Separatoren zu lokalisieren, bei der Behandlung von fehlenden Populationen (insbesondere von fehlenden multiplen Clustern) weniger robust.
• Eine zigarrenförmige Attraktormaschine arbeitet gut bei der Klassifikation von diagonal gestreckten Clustern, deren "Streckung" von teilkorrelierten (d.h. nichtkompensierten) Ereignissen herrührt. Im Vergleich dazu arbeiten ältere Verfahren, welche die eindimensionale Histogramm-Analyse benutzen, nicht so gut bei nichtkompensierten Clustern, da ihre eindimensionalen Histogramm-Projektionen zu viel Kurvenraum verbrauchen. Da ein Attraktor in einem beliebigen N-dimensionalen Raum definiert werden kann, läßt sich das Problem überlappender Cluster durch die Hinzunahme zusätzlicher Parameter beheben, um die Cluster ohne zusätzliche rechnerische Komplexität zu zerlegen. Die Einfachheit und die in hohem Grade parallele Natur der Berechnungen der Attraktormaschine, zusammen mit ihrer flußorientierten Datenwechselwirkung, macht dieses Autoklassifikationsverfahren ideal geeignet für eine Echtzeit-Klassifikation, die an mehrparametrigen Datenströmen mit hoher Ereignisrate ausgeführt wird. Verglichen mit älteren Verfahren, die zur Durchführung der Datenanalyse ein Gedächtnis für eine Aufzeichnung im Listenmodus erfordern, sind die Anforderungen an das Gedächtnis bzw. den Speicher der Attraktormaschine gering und hängen nicht mit der Länge des abgetasteten Datenstroms zusammen, so daß Routineanalysen ausführbar werden, in denen mehrere Millionen Ereignisse abgetastet werden. Der ins Auge springende Nutzen solcher Mega-Tests in der Zelldiagnostik besteht darin, daß erkrankte Zellen bei so niedrigen Schwellwerten wie 1 Zelle pro einer Million normaler Zellen nachgewiesen werden können (d.h. in Tests für seltene Ereignisse) und auf diese Weise eine frühere Erkennung und leichtere Eingriffe möglich sind, um die Krankheit zum Stillstand zu bringen.
BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
• Fig. 1 zeigt zwei mehrdimensionale Attraktormaschinen (eine kugelförmige bzw. sphärische und eine zigarrenförmige) an ihren Saat- bzw. Keimpositionen im mehrdimensionalen Raum vor der Voranalyse. In Fig. 1 sind zwei derartige projektive Streudiagramme (5 und 6) abgebildet, die den Schwerpunkt bzw. Flächenmittelpunkt (1), den Radius (2) und das Orbitalband (7) der kugelförmigen Attraktormaschine und die Mittellinie (3), den Radius (4) und das Orbitalband (8) der zigarrenförmigen Attraktormaschine darstellen.
• Fig. 2 zeigt die gleichen zwei Attraktormaschinen durch die gleichen Projektions-Streudiagramme in ihren Massenmittelpunktspositionen im mehrdimensionalen Raum während der Klassifikation.
• Fig. 3 umfaßt eine Reihe farbiger Punktdiagramme von FSC über SSC (A), log Fluoreszenz-FITC über log Fluoreszenz-PE (B) und log Fluoreszenz-FITC über log Fluoreszenz-PerCp für Daten, die im Listenmodus von Erythrozyten-Vollblut erfaßt wurden, dem verschiedene fluoreszenzmarkierte monoklonale Antikörper zugesetzt wurden. Die drei Schwerkraftattraktoren und ihre entsprechenden Keimpositionen sind vor der Autoclusterbildung dargestellt. Die blauen Punkte und Begrenzungen bezeichnen den NK-Zellen-Attraktor, die roten Punkte und Begrenzungen bezeichnen den B-Lymphozyten-Attraktor, und die grünen Punkte und Begrenzungen bezeichnen den T-Lymphozyten-Attraktor.
• Fig. 4 umfaßt die farbigen zweidimensionalen Punktdiagramme, wie sie in der nachträglichen Analyse gemäß Fig. 3 dargestellt werden, welche die Populationen nach der Autoclusterbildung und die Endpositionen der Attraktoren zeigen. Die grauen Punkte repräsentieren nichtgeclusterte Ereignisse (z.B. Monozyten, Granulozyten und Debris) in der Probe.
• Fig. 5 umfaßt zwei Punktdiagramme der log PE-Version über der PE/Cy5-Fluoreszenz, die drei Populationen nach der Autoclusterbildung aus einer Probe von nichtlysiertem Vollblut von einem AIDS-Patienten darstellen, dem eine Lösung zugesetzt worden ist, die eine bekannte Konzentration fluoreszenzmarkierter Mikroperlen und fluoreszenzmarkierter (A) monoklonaler Anti-CD3- und Anti-CD4-Antikörper oder (B) monoklonaler Anti-CD3- und Anti-CD8-Antikörper enthält.
• Fig. 6 umfaßt ein Punktdiagramm wie in Fig. 5, wobei jedoch das Blut einer normalen Person entnommen wird, die Probe aber durch Prozeßqualitätssicherung (PQA) verworfen worden ist.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
• Ein Schwerkraftattraktor ist eine kleine Rechen-"maschine". Er enthält anfänglich einen oder mehrere geometrische Parameter, die durch den Nutzer für jeden zu analysierenden Probentyp eingestellt oder zur Definition der Form, Größe und ungefähren Position eines erwarteten Zielclusters fixiert werden. Die Attraktormaschine weist ferner ein Verfahren zum Lokalisieren des tatsächlichen Massenmittelpunkts eines Clusters in dem zu analysierenden Datenstrom und zur anschließenden Klassifikation von Ereignissen in dem ankommenden Datenstrom auf, die das geometrische Element- bzw. Zugehörigkeitsprädikat des Attraktors erfüllen. Der Begriff "Schwerkraft-" ist treffend, da der Attraktor seine optimale Position zum Einschließen des Datenclusters findet, indem er unter der akkumulierenden Schwerkraft von Ereignissen in der Nähe seiner erwarteten Position im mehrdimensionalen Raum auf seine Massenmittelpunktsposition fällt. Der Begriff "Attraktor", welcher der Theorie dynamischer Systeme entnommen ist, bezieht sich auf das Verhalten eines Systems, wodurch eine große Zahl von Anfangszustandsvektoren sich zu einem gemeinsamen Endzustandsvektor im Gleichgewicht hin bewegen und gegen diesen konvergieren. In diesem Falle entspricht der Zustandsvektor der momentanen Vektorposition einer wandernden geometrischen Rand- bzw. Grenzfläche (speziell einem starr befestigten Bezugspunkt innerhalb dieser Fläche), während sich die Begrenzung von einer anfänglichen, erwarteten "Keim"-Position zum Gleichgewicht in der tatsächlichen Massenmittelpunktsposition eines Datenclusters bewegt.
• Der weiter unten beschriebene Schwerkraftattraktor stellt den einfachsten Fall der Zugehörigkeitsgeometrie dar, die Hyperkugel. Die Maschine eines sphärischen bzw. kugelförmigen Attraktors weist die folgenden festen und variablen Komponenten auf:
Feste Komponenten:
• s Keim, oder anfänglicher Schwerpunktsvektor der Hyperkugel, der die angenäherte erwartete Position des Clusters darstellt
• r Radius der Hyperkugel
Variable Komponenten:
• c aktueller Schwerpunktsvektor der Hyperkugel
• n Anzahl der bisher gravitatorisch wechselwirkenden Ereignisse innerhalb des aktuellen Datenstroms
• Vor Beginn eines Datenstroms werden zunächst die invarianten Aspekte des Zielclusters in Form der Keimposition s und des Radius r spezifiziert. Die Spezifikationen von s und r werden durch Beobachtung von Projektionen des Clusters in zweidimensionalen Projektions-Streudiagrammen durchgeführt, wodurch jeweils zwei Koordinaten von s mit Hilfe einer zweidimensionalen Lokalisiereinrichtung eingestellt werden und r bei seinem Erscheinen durch "Ziehen" mit einer Lokalisiereinrichtung editiert wird, bis er zufriedenstellend ist.
• Die Ereignisse in dem angetroffenen Datenstrom bestehen aus einer variablen Anzahl mehrparametriger Ereignisse ei, wobei i die Nummer (oder Reihenfolge) des Ereignisses in dem Strom bezeichnet und e der Vektor der Parameterwerte ist, die das jeweilige Ereignis bilden. Vor der Analyse des Datenstroms wird c mit der Keimposition s initialisiert.
• Die durch den Attraktor ausgeführte Autoclusterbildung des Datenstroms weist ein Zweischrittverfahren auf: Im ersten Schritt, der Voranalyse, wird der Datenstrom analysiert, um die Zugehörigkeitsgrenzfläche des Attraktors genau um den statistischen Massenmittelpunkt des zu klassifizierenden Datenclusters herum zu zentrieren. Nach dem Eintreffen des ersten Ereignisses und dem jedes nachfolgenden Ereignisses während der Voranalyse transformiert der sphärische Attraktor jeden Ereignisvektor in sein eigenes, lokales Koordinatensystem, dessen Ursprungspunkt bei c liegt:
• lokales ei = ei - c (Transformation in lokale Koordinaten)
• Als nächstes entscheidet der Attraktor, ob das lokale ei kurz genug ist (ob ei nahe genug an c liegt), um eine Anziehungskraft auf c zu ermöglichen. Das Wechselwirkungs-Durchlaßprädikat 9 bejaht dies, wenn das lokale ei eine kürzere Vektorlänge als r hat:
• g (lokales e&sub1;) = Länge (lokales ei) < r
• Wenn das obige Nähekriterium erfüllt wird, darf ei eine inkrementelle Anziehungskraft auf c ausüben (d.h. in die Berechnung des Massenmittelpunkts eingehen). Der Massenmittelpunkt eines Einzelclusters in einem sonst leeren Datenraum kann einfach als das Vektormittel aller N Ereignisvektoren ei definiert werden:
• c = &Sigma; ei / N (Massenmittelpunkt für Einzelcluster)
• In Mehrclusterverteilungen wendet jeder Cluster seine eigene Wechselwirkungs-Durchlaßfunktion g an, deren Aufgabe darin besteht, seine Schwerpunktsberechnung gegen den Einfluß von Dichtetaschen zu schützen, die sich anderswo im Raum befinden:
• c = &Sigma; ei * g (lokales ei) / N
• Anstatt c kontinuierlich bei jeder Wechselwirkung zu aktualisieren (ein ineffizientes Verfahren, das im Falle von fehlenden Clustern zur Instabilität neigt), wird der Schwerpunkt c des Attraktors nach einem festen Plan bei vorgeschriebenen Intervallwerten der Wechselwirkungszählung (d.h. bei s1, s2, s3 ... sm) aktualisiert. Zu diesem Zweck unterhält der Attraktor eine laufende Vektorsumme sigma für alle seine Wechselwirkungs- Ereignisvektoren. Zu Beginn der Voranalyse werden sigma und n auf null gesetzt. Während der Voranalyse wird jeder eintreffende Ereignisvektor, der das obige Durchlaßprädikat erfüllt, durch Vektoraddition in sigma akkumuliert, und der Wechselwirkungszählwert n wird inkrementiert,
• sigma = sigma + ei (Effekt jeder Ereignis-Wechselwirkung)
• n = n + 1
• und wenn n gleich einem der geplanten Aktualisierungs-Intervallwerte ist (z.B. gleich s1), dann wird der Schwerpunkt aktualisiert,
• c = sigma/n (Effekt der Schwerpunkt-Aktualisierung)
• wodurch der neue Wert von c gleich der laufenden Vektorsumme sigma, skalar dividiert durch n, ist. Nach Beendigung jeder Aktualisierung enthält c das Vektormittel aller Ereignisse, die bisher in Wechselwirkung mit dem Attraktor getreten sind. Dieser neue, verfeinerte Wert von c, der das Gewicht von mehr Daten als sein vorheriger Wert trägt, ist maßgebend für die nachfolgende Wechselwirkung, bis der nächste Aktualisierungs- Intervallwert erreicht wird.
• Der anfängliche Keimpunkt s dient als Ausgangs- oder Standardschwerpunkt für den Start der Berechnung. Er sollte die beste verfügbare Information über die erwartete Clusterposition widerspiegeln. Sobald die durchgelassene Vektorsumme einige aktuelle Daten akkumuliert hat (z.B. s1 = 50), ersetzt der berechnete Schwerpunkt c den Keimpunkt s als besten verfügbaren Zentralwert für die Verankerung der Wechselwirkungs- Durchlaßkriteriums.
• lokales ei = ei - c (berechnetes c ersetzt s)
• Der Aktualisierungsplan für c dient lediglich dem Ziel, dessen Genauigkeit im Lauf der Zeit zu verbessern. Der erste Intervallwert s1 für die Aktualisierung des Attraktors wird als Trägheitsschwellwert bezeichnet. Er muß als Wanderungskontrolle überwunden werden, um den Keimwert s zu ersetzen. Wenn ein Cluster bis auf eine Handvoll Ereignisse erschöpft wäre und eine Aktualisierung des Schwerpunkts beim ersten durchgelassenen Ereignis zulässig wäre, und wenn dieses Ereignis gerade innerhalb des Durchlaßkriteriums läge, dann könnte das aktualisierte Durchlaßkriterium bis in eine Entfernung r vom Keimpunkt verschoben werden, wobei möglicherweise mittelpunktsnahe Ereignisse aus der weiteren Betrachtung ausgeschlossen würden. Wenn der Trägheitsschwellwert nicht überwunden werden kann, wird keine Positionsverfeinerung zugelassen (d.h. der Keimwert s spezifiziert die Standardplazierung der Zugehörigkeitsgeometrie des Clusters). Infolgedessen wird für Cluster, die soweit dezimiert sind, daß keine Dichtemarke aufgestellt werden kann, ein Durchlaßkriterium um den Punkt herum vorgegeben, wo man sie zu finden erwartet hat.
• Wenn der Trägheitsschwellwert überwunden werden kann, dann darf der Attraktor zum lokalen Massenmittelpunkt hin gravitieren. Durch periodische Aktualisierungen des Schwerpunktes (z.B. nach jeweils 50 Wechselwirkungen) würde sich der Attraktor zu einem Konvergenzpunkt hin bewegen, aber ein effizienterer Aktualisierungsplan richtet sich nach der statistischen Regel, daß der Restfehler mit dem reziproken Wert der Quadratwurzel der Wechselwirkungszahl abnimmt. Daher liefert ein parabolischer Aktualisierungsplan (z.B. s1 = 100, s2 = 400, s3 = 900, s4 = 1600...) bei jeder Aktualisierung statistisch signifikante Schwerpunktskorrekturen, während periodische Aktualisierungen den Schwerpunkt auf einem stärker oszillierenden Weg zum gleichen Endergebnis führen.
• Die Beendigung der Voranalyse-Aktivität für einen einzelnen Attraktor wird entweder durch Erreichen der Wechselwirkungszahl sm, die als letzter planmäßiger Aktualisierungs-Intervallwert (das "Wechselwirkungskontingent" des Attraktors) spezifiziert ist, oder durch eine globale Zeitabschaltung ausgelöst, gemessen in Zeiteinheiten oder als Gesamtzahl der erfaßten Ereignisse, je nachdem, was zuerst eintritt. Wenn mehrere Attraktoren mit dem Voranalyse-Datenstrom wechselwirken, dann gehen Attraktoren, die ihre Wechselwirkungskontingente erreicht haben, in den Ruhezustand, in dem sie das Erreichen der Kontingente durch alle anderen Attraktoren oder die globale Zeitabschaltung abwarten, je nachdem, was zuerst eintritt. Wenn die Voranalyse durch globale Zeitabschaltung beendet wird, erhält jeder Attraktor, der sein Wechselwirkungskontingent nicht erreicht, aber seinen Trägheitsschwellwert überwunden hat, eine abschließende Schwerpunktsaktualisierung, so daß Ereigniswechselwirkungen, die sich seit seiner letzten vorhergehenden Aktualisierung angesammelt haben, in dem endgültigen Schwerpunktswert c dargestellt werden. Die Vorgabe einer globalen Zeitabschaltung in Abhängigkeit von der Zeit oder von der Gesamtzahl der erfaßten Ereignisse ist notwendig, um eine Beendigung der Datenstrom- Voranalyse zu garantieren, wenn keine a-priori-Garantien für eine ausreichende Population vorhanden sind, um für jeden Zielcluster in jeder Datenstrom-Probe stets die Beendigung durch Erreichen der Wechselwirkungskontingente zu garantieren.
• Die Autodusterbildung auf Attraktor-Basis ist ein Zweischrittverfahren. Im zweiten Schritt, der "Klassifikation", wird die hypersphärische Zugehörigkeitsgrenze jedes Attraktors an seinem Schwerpunkt c fixiert, der nach Beendigung der letzten Schwerpunktsaktualisierung festgehalten wurde (oder bei s, wenn keine Aktualisierung erfolgte). Beim Eintreffen jedes nachfolgenden ankommenden Ereignisses im weiteren Verlauf des gleichen, voranalysierten Datenstroms wird das ankommende Ereignis an jeder Zugehörigkeitsgrenze getestet, um es nach Inklusion (Enthaltensein) bzw. Exklusion (Nichtenthaltensein) zu klassifizieren, und bei jeder Inklusionsentscheidung wird ein Zugehörigkeits- bzw. Elementzählwert inkrementiert. Wenn eine mehrfache Klassifikation und Zählung des gleichen Ereignisses unnatürlich oder nicht wünschenswert ist, wird ein Konfliktlösungsmechanismus bereitgestellt, um sicherzustellen, daß jedes Ereignis nur durch einen Attraktor klassifiziert und gezählt wird. Ein einfacher Mechanismus besteht darin, bei konkurrierenden Klassifikationen Prioritäten zu setzen, ein anderer darin, die Zugehörigkeit auf der Basis der nächsten euklidischen Nähe zuzuerkennen. Ein deutlicher Vorteil der Klassifikation mit Prioritäten besteht darin, daß sie leicht auf Attraktoren mit komplexerer Geometrie erweitert werden kann, die einander auf komplexere Weise überlagern können, und aus diesem Grunde ist diese Klassifikation in die Praxis übernommem worden.
• Während der Klassifikation ist der bisher von jedem Attraktor akkumulierte Zugehörigkeitszählwert für die Entscheidung verfügbar, wann genug Zielereignisse gezählt worden sind, um den Test zu beenden. Diese anwachsenden Zählwerte können für die Früherkennung von fehlenden Clustern benutzt werden, die z.B. die Unterlassung einer Probenvorbereitung anzeigen, die Ursache für den Abbruch des Tests ist.
• Die Beendigung der Klassifikation wird durch das Erreichen von "Zugehörigkeits-" bzw. "Elementkontingenten" für alle Attraktoren oder durch eine globale Zeitabschaltung, ausgedrückt in Zeiteinheiten oder als Gesamtzahl der während der Klassifikationsphase erfaßten Ereignisse, ausgelöst.
• Sowohl während als auch nach der Klassifikationsphase hält jeder Attraktor seinen Clusterpopulationszählwert und seine Schwerpunkt- (Orts-)vektoren und bietet damit zusätzliche Vorteile für Datenanalysen. Zu diesen Vorteilen gehören Qualitätssicherungsmechanismen, durch die der Nutzer akzeptierbare bzw. anomale Datenstromverteilungen definieren und die letzteren automatisch als fehlerhaft kennzeichnen kann.
• Eine "erwartete Minimalpopulation" (die a priori für jeden Cluster als Funktion vom Zugehörigkeitszählwert oder einem daraus abgeleiteten Wert definiert wird) wird mit den tatsächlichen Zugehörigkeitszählwerten (oder einem daraus abgeleiteten Wert) während der Klassifikation und nach deren Beendigung verglichen. Für jeden Cluster, der eine unerwartet niedrige Population zeigt, wird ein Fehlerzustand oder eine Warnung erzeugt. Diese Art der Prozeßqualitätssicherung (PQA) profitiert von der außergewöhnlichen Stabilität des Schwerkraftattraktor-Klassifikationsverfahrens gegenüber fehlenden Clustern (d.h. der Attraktor zählt in der Nachbarschaft des Bereichs, wo das Erscheinen des Clusters erwartet wurde, das Auftreten von Ereignissen genau bis auf null zurück). Eine Kontrolle des Erreichens der erwarteten Minimalpopulation für jeden Zielcluster macht das gesamte Autoclusterbildungssystem wachsam gegen jede Abweichung der Gerätezahl, der Probenvorbereitung und jede eigentliche Probenabweichung, die als fehlende Zielpopulation(en) zum Ausdruck kommen.
• Als zweiter Vorteil kann ein "Spielraum" verwendet werden, um die zulässige Wanderungsentfernung jedes Attraktors von seiner Keimposition zu definieren. Eine Spielraumlänge (die a priori definiert und als skalarer Abstand im mehrdimensionalen Raum ausgedrückt wird) wird mit der tatsächlichen Verschiebung von c aus der Ausgangskeimposition s verglichen, um festzustellen, ob die Spielraumlänge überschritten worden ist. Bei Überschreitung wird ein Fehler oder eine Warnung erzeugt, der (die) anzeigt, daß ein Cluster gefunden wurde, der zu weit von seiner erwarteten Position entfernt ist. Ein Test der Nähe einer tatsächlichen Clusterposition (Vektormittelwert) zur erwarteten Clusterposition für jeden Zielcluster macht das gesamte Autoclusterbildungssystem wachsam gegen jede Abweichung der Gerätezahl, der Probenvorbereitung und jede eigentliche Probenabweichung, die als übermäßige Verschiebungen der Clusterposition im mehrdimensionalen Raum zum Ausdruck kommen.
• Obwohl andere Klassifikationsverfahren einen Populations- Vektormittelwert liefern können (und die Nähe zu einer a priori erwarteten Position vergleichen können) hat das Attraktorverfahren den einzigartigen Vorteil, daß es keine Aufzeichnung im Listenmodus erfordert. Da die Spielraum-Bedingung jedesmal, wenn der Attraktor seine Position während der Voranalyse verschiebt, kontrolliert werden kann, ist es zweckmäßig, eine Abweichung der Clusterposition während der Einwirkung des Datenstroms frühzeitig zu erkennen, so daß ein zeitraubender Mega-Test frühzeitig unterbrochen werden kann, statt seine Beendigung abzuwarten, um festzustellen, daß der Test aus Gründen der Prozeßqualitätssicherung (PQA) verworfen werden muß.
• Als dritter Vorteil sollte ein gut geformter Cluster aus einem dichten Ereignisbereich bestehen, der von einem leeren Bereich umgeben ist. Um eine einwandfreie Clusterzugehörigkeit und Klassifikation sicherzustellen, falls ein Cluster weniger gut geformt ist, kann um die Element- bzw, Zugehörigkeitsgrenze des Clusters herum ein Orbitalband angeordnet werden. Der Zweck des Orbitalbandes ist ein Schutz gegen die Bewegung eines Clusters in eine zu weit von seiner Grenze entfernte Position, gegen eine unerwartete Formänderung eines Clusters und ein stärkeres Rauschen als erwartet. In einer oder in allen derartigen Situationen ist eine große Anzahl von Ereignissen innerhalb des Orbitalbandes (oder "Orbital ereignissen") ein Hinweis darauf, daß die Daten möglicherweise nicht akzeptierbar sind. Im allgemeinen sollten weniger als 3% der Ereignisse für einen Cluster innerhalb des Orbitalbandes liegen.
• In Fig. 1 sind der Schwerpunkt (1), der Radius (2) und das Orbitalband (7) für einen sphärischen Attraktor dargestellt. Die Dicke des Orbitalbandes ist beliebig. Ein "dünnes" Band wird weniger Orbitalereignisse enthalten als ein dickes" Band. Fig. 2 zeigt die Bewegung aller Komponenten während einer Klassifikation.
• Eine Beschränkung des hypersphärischen Attraktors (d.h. seine mangelnde Anpassung an die langgestreckte Form vieler Datenduster in mehrdimensionalen Räumen) kann durch eine Modifikation der Durchlaßsteuerungsgeometrie (oder Grenzflächengeometrie) überwunden werden. Das Charakteristikum der Attraktoren, wodurch jeder Attraktor eine Wechselwirkungs-Durchlaßfunktion g verwendet, deren Aufgabe darin besteht, seine Schwerpunktsberechnung gegen den Einfluß von Ereignissen in anderen Clustern zu schützen, macht es vorteilhaft, Durchlaßgeometrien anzuwenden, welche die tatsächliche Clusterform gut annähern. Besser angepaßte Grenzen gestatten das Anvisieren von mehr Populationen innerhalb eines Datenraums von fester Größe.
• Eine Anpassung, die eine Streckung des sphärischen Attraktors bewirkt, besteht darin, seinen Schwerpunktsvektor c durch einen geraden Abschnitt im mehrdimensionalen Raum zu ersetzen, der sich zwischen zwei Endpunktvektoren e&sub1; und e&sub2; erstreckt. Die Verbindungslinie zwischen den beiden Endpunkten wird als "Mittellinie" des Attraktors bezeichnet. Statt die Nähe eines Ereignisses in Form seines Abstandes von einem einzigen Mittelpunkt zu messen, wird als Erweiterung die Nähe in Form eines Abstandes vom nächsten Punkt auf der Mittellinie gemessen. Der geometrische Ort von zur Mittellinie äquidistanten Punkten liefert eine Grenzfläche, die ein Hyperzylinder mit abgerundeten Enden ist. Im dreidimensionalen Raum nimmt dieser geometrische Körper die Form einer Zigarre an.
• Der Radius cr des zigarrenförmigen Attraktors spezifiziert sowohl den Zylinderradius der Zigarre als auch den Krümmungsradius ihrer Abschlußkappen.
• Der Mittelpunkt mp der Mittellinie ist der Mittelpunkt der Zigarre und dient als Ursprungspunkt für das lokale Koordinatensystem der Zigarre.
• Die geometrischen Komponenten des zigarrenförmigen Attraktors, die sich von denen des sphärischen Attraktors unterscheiden, sind die folgenden:
Feste Komponenten:
• Keim-Mittellinie = [e&sub1;s, e&sub2;s], wobei die Keim-Endunkte der anfänglichen Mittellinie der Zigarre die angenäherte erwartete Position und Orientierung des Clusters darstellen
• cr Radius des Zylinders und der Abschlußkappen der Zigarre
Variable Komponenten:
• Mittellinie = [e&sub1;, e&sub2;] aktuelle Endpunkte
• mp Mittelpunkt der aktuellen Mittellinie
• Die Wechselwirkungs-Durchlaßfunktion g(ei) des zigarrenförmigen Attraktors für das Ereignis ei ist:
• g(ei) = Abstand (ei, Mittellinie) < r
• Die Abstandsfunktion findet zuerst p, den nächsten Punkt auf der Mittellinie zu ei (die Projektion von ei auf die Mittellinie). Wenn p über das Ende der Mittellinie hinausragt, wird der Abstand zum nächsten Endpunkt berechnet, sonst wird der Abstand zwischen p und ei verwendet.
• Wenn der zigarrenförmige Attraktor während der Voranalyse eine Aktualisierung seiner Position beginnt, dann nimmt der neue Mittelpunkt mp den Wert des durchgelassenen Vektormittels aller Ereignisse an, die bisher in Wechselwirkung getreten sind. Auf die Endpunkte der Mittellinie, die in lokalen Koordinaten starre Werte beibehalten, wird der gleiche Delta-Vektor angewandt wie auf mp, so daß sich die Mittellinie unter dem Zug der an ihrem Mittelpunkt angreifenden kombinierten Ereignis-Schwerkraft als eine starre Struktur bewegt.
• Die während der Klassifikation angewandte Zugehörigkeits- Durchlaßfunktion für die Zigarre ist die gleiche wie die obige Funktion g(ei).
• Die Nähe-Funktion und die Mittellinien-Aktualisierung sind die einzigen Aspekte des zigarrenförmigen Attraktors, die sich von dem sphärischen Attraktor unterscheiden. Alle anderen Verhaltensweisen sind identisch. Ein Hauptvorteil des zigarrenförmigen Attraktors ist seine Fähigkeit, korrelierte mehrparametrige Cluster zu verarbeiten. Wenn zwei sensorische Kanäle in ihrer Empfindlichkeit identisch sind und mit dem gleichen Signal gespeist werden, dann fallen alle ihre zweidimensionalen Ereignisvektoren auf die Diagonale, welche durch die Gleichung (x = y) charakterisiert wird. Wenn zwei sensorische Kanäle teilweise überlappende Empfindlichkeiten aufweisen und unkorrelierten Eingangssignalen des jeweils anderen Kanals ausgesetzt werden, dann behält die gemeinsame Verteilung aufgrund eines unbeabsichtigen Kanalnebensprechens (nichtkompensierte Daten) eine gewisse diagonale Streckung. Die elektronische Kompensation (das Heraussubtrahieren von Nebensprechkomponenten) ist mit zunehmender Anzahl der sensorischen Kanäle und Nebensprechwechselwirkungen schwer zu spezifizieren. Ein zweckmäßigeres Verfahren, das in der vorliegenden Erfindung in die Praxis umgesetzt wurde, besteht darin, die Clusterbildung direkt an unaufbereiteten, unkompensierten Ereignisvektoren unter Verwendung eines zigarrenförmigen Attraktors auszuführen, der in Richtung des Hauptdehnungsvektors des Clusters im mehrdimensionalen Raum orientiert ist. Die Spezifikation der Mittellinien-Endpunkte erfolgt durch Beobachtung von Projektionen des Clusters in zweidimensionalen Projektions-Streudiagrammen, wodurch jeweils zwei Koordinaten des Endpunktes mit Hilfe einer zweidimensionalen Lokalisiereinrichtung eingestellt werden. Die Spezifikation von cr wird nach seinem Erscheinen durch "Ziehen" mit einer Lokalisiereinrichtung editiert, bis sie zufriedenstellend ist.
• In Fig. 1 sind die Mittellinie (3), der Radius (4) und Orbitalbänder für einen zigarrenförmigen Attraktor dargestellt. Fig. 2 zeigt die Bewegung dieser Komponenten während der Klassifikation.
• Eine etwas andere Geometrie (anders als zigarrenförmig), die sich für langgestreckte Cluster eignet, ist die Hyperellipse. Die Verbindung einer elliptischen Grenzfläche mit dem hier beanspruchten Attraktorverhalten wird als elliptischer Attraktor bezeichnet.
• Die Orientierungsachse der Ellipse ist durch ihre beiden Brennpunktvektoren f&sub1; und f&sub2; spezifiziert. Die Nähe eines Ereignisses wird durch die Summe seiner beiden euklidischen Abstände von den zwei Brennpunkten gemessen, und der Ellipsenradius er spezifiziert den oberen Grenzwert dieser Summe für die Inklusion bzw. das Enthaltensein des Ereignisses.
• Die Wechselwirkungs-Durchlaßfunktion (bzw. das -kriterium) g(ei) des elliptischen Attraktors für das Ereignis ei lautet:
• g(ei) = Abstand (ei, f&sub1;) + Abstand (e&sub1;, f&sub2;) < er
• Der Mittelpunkt mp der Orientierungsachse ist der Mittelpunkt der Ellipse und dient als Ursprungspunkt ihres lokalen Koordinatensystems. Die Spezifikation der Hauptachse und der Durchlaßfunktion sind die beiden einzigen Aspekte des elliptischen Attraktors, die ihn vom zigarrenförmigen Attraktor unterscheiden. Wie im Falle des zigarrenförmigen Attraktors breiten sich am Mittelpunkt angreifende Positions-Deltavektoren (Positionsverschiebungen) zu jedem Brennpunkt aus, so daß die Ellipse ihre feste Orientierung, Größe und Form beibehalten kann.
• Der Zweck der Klassifikationsgeometrie eines Attraktors besteht darin, die Ereigniswolke seines Zielclusters auf geeignete Weise einzuschließen, wenn sie sich an seinem Massenmittelpunkt entfaltet. Der Zweck seiner Wechselwirkungsgeometrie besteht darin, einen "Suchbereich" zu definieren, in welchem der Attraktor erwarten kann, seinen Cluster (und sonst wenig) zu finden. Da diese beiden Geometrien unterschiedlichen Zwecken dienen, ist es manchmal vorteilhaft, die untergeordneten Wechselwirkungen und Klassifikationen der Geometrie individuell anzupassen.
• Ein sphärischer Attraktor kann einen "Zugehörigkeitsradius" verwenden, der sich von seinem "Wechselwirkungsradius" unterscheidet. Zur Definition von Wechselwirkungs- und Zugehörigkeitsgrenzen können andere Geometrien aufgerufen werden (d.h. quadrate, Rechtecke, schräggestellte Rechtecke, Ellipsen oder beliebige, mit der Maus gezeichnete Bereiche). Im allgemeinen werden Clusterzugehörigkeitsgrenzen so gewählt, daß sie die tatsächliche Größe und Form ihrer Zielduster annähern. Wechselwirkungsgrenzen von Attraktoren werden so gewählt, daß sie sowohl 1) den Abtastbereich abgrenzen, wo der Massenmittelpunkt zu finden sein dürfte, als auch 2) benachbarte Cluster von einer möglichen Wechselwirkung ausschließen.
• Ein Attraktor kann auf einer Teilmenge ankommender Parameter definiert werden. Auf verschiedenen Teilmengen ankommender Parameter können unterschiedliche Attraktoren definiert werden, wenn sie für die Clusterbildung ihrer entsprechenden Populationen nützlich sind. In jedem Attraktor ist eine Maske M oder ein Vektor von Binärschaltungen gespeichert, um anzugeben, welche Parameter ankommender Ereignisvektoren zu beachten und welche zu ignorieren sind. Da die Attraktormaschine in einem beliebigen N-dimensionalen Raum definiert werden kann, kann sie auf einer Parameterteilmenge ohne weitere Ausschmückung über die reine Anforderung hinaus, M zu spezifizieren, definiert werden. Die der Attraktormaschine zugrundeliegenden Vektoroperationen werden so implementiert, daß durch die Maske ausgeschlossene Parameter in einer völlig transparenten Weise als nicht existent behandelt werden. Die Vorteile der Parametermaskierung sind, daß sie 1) die Definition von Datenclustern in der Parameterteilmenge gestattet, welche die schärfste Clusterdefinition bietet, 2) es erlaubt, Parameter zu ignorieren die einen sonst wohlgeformten Cluster verschmieren, und 3) die Klassifikation bei verschiedenen Dimensionskontraktionsgraden (degrees of dimensional collapse) unterstützt. Der letztere Vorteil erfordert, daß die Klassifikation eines Einzelereignisses durch mehrere Attraktoren zulässig ist.
• Für Fig. 3 und 4 wurde normalen erwachsenen Freiwilligen peripheres Vollblut in EDTA-haltigen evakuierten Blutentnahmeröhrchen entnommen. Die Erythrozyten wurden in einer Lysierlösung mit NH&sub4;Cl, KHCO&sub3; und EDTA lysiert. Die lysierten Zellen wurden abzentrifugiert und entfernt.
• Die verbleibenden Zellen wurden in ein Reagenzglas gefüllt, das PBS enthielt. In dieses Reagenzglas wurden der Reihe nach Leu 4 FITC (anti-CD3; BDIS), Leu 11 + 19 PE (anti-CD16, CD56; BDIS) und Leu 12 PerCp (anti-CD19; BDIS) gegeben. Diese Antikörper markieren T-Lymphozyten, NK-Zellen bzw. B-Lymphozyten. Nach der Inkubation wurden die Zellen gewaschen und dann durch ein mit Consort FACScan Research Software (BDIS) ausgestattetes FACScan-Durchflußzytometer (BDIS) geschickt. Die Daten wurden erfaßt und im Listenmodus gespeichert. Es wurden 15000 Ereignisse aufgezeichnet.
• In Fig. 3 wurden die Keimposition s und der Radius r oder cr des Attraktors jeder Population vor der Analyse auf der Basis wohlbekannter und veröffentlichter Daten festgesetzt. Für B-Lymphozyten wurde ein sphärischer Attraktor angewandt, während für NK-Zellen und T-Lymphozyten zigarrenförmige Attraktoren benutzt wurden. Jeder Attraktor wurde dann mit der Maus so gezeichnet, daß er die erwarteten Positionen jeder Population repräsentierte, wenn die Daten auf Streuung (A), PE über FITC-Fluoreszenz (B) und auf PerCp über FITC-Fluoreszenz (C) analysiert wurden. In den Punktdiagrammen sind eingelagerte graue Punkte dargestellt, die nichtgeclusterte Ereignisse zeigen. (In anderen Ausführungsbeispielen wird man erkennen, daß diese nichtgeclusterten Ereignisse weder in der Echtzeitnoch in der Listenmodus-Analyse dargestellt zu werden brauchen.
• In Fig. 4 sind die Ergebnisse der Klassifikation nach der Analyse aller aufgezeichneten Ereignisse dargestellt. Die gemessenen und folglich in jedem Ereignisvektor enthaltenen Parameter waren FSC, SSC, log PE-Fluoreszenz, log FITC-Fluoreszenz und log PerCp-Fluoreszenz. Bei B-Lymphozyten waren 757 Zellen (oder annähernd 19% aller geclusterten Ereignisse) in diesem Cluster enthalten. Bei T-Lymphozyten waren 2596 (oder etwa 66% aller geclusterten Ereignisse) in diesem Cluster enthalten, und bei NK-Zellen waren 587 Ereignisse in diesem Cluster enthalten. Dabei ist zu würdigen, daß die Datenanalyse für alle Attraktoren gleichzeitig erfolgt. Fig. 4 stellt die zweidimensionale Projektion jedes Attraktors nach der Analyse dar.
• Für Fig. 5 und 6 wurde Vollblut von einem AIDS-Patienten (Fig. 5) und von einem normalen erwachsenen Freiwilligen in EDTA-haltige, evaluierte Blutentnahmeröhrchen aufgenommen. Jede Probe wurde in zwei Teilmengen unterteilt. Ein Gemisch aus 50000 Fluoreszenz-Mikroperlen, titrierten Antikörper- und Puffermengen bis zu insgesamt 400 µl wurde für jede Teilmenge hergestellt. Die der einen Teilmenge jeder Probe zugesetzten Antikörper bestanden aus Leu 4 PE/Cy5 und Leu 3a PE. (Cy5 wurde von der Biological Detection Systems bezogen.) Die der anderen Teilmenge jeder Probe zugesetzten Antikörper bestanden aus Leu 4 PE/Cy5 und Leu 2a PE. (Leu 2a ist ein monoklonaler anti-CD8-Antikörper, beziehbar von BDIS.) Dem Gemisch in jeder Teilmenge wurden 50 µl Vollblut zugesetzt. Die Teilmengen wurden 30 Minuten lang inkubiert, verwirbelt und dann durch ein Durchflußzytometer der Marke FACSCount geschickt. Die Daten wurden erfaßt und im Listenmodus gespeichert. In dem PE/Cy5-Kanal wurde ein Fluoreszenz-Schwellwert eingestellt, um die Mehrzahl der roten Blutkörperchen auszuschließen, jedoch wurde darauf geachtet, sicherzustellen, daß der Schwellwert links vom äußersten zu erwartenden Rand der CD4&supmin; und CD8&supmin; Attraktoren lag.
• Auf die Perlen-, CD4&supmin;- und CD4&spplus;-Cluster oder CD8&supmin;- und CD8&spplus;-Cluster wurden drei elliptische Attraktoren angewandt. Eine bei der Analyse von CD8-Zellen auftretende Schwierigkeit besteht darin, daß CD8-Zellen, im Unterschied zu CD4-Zellen, sich nicht in wohldefinierte positive und negative Cluster differenzieren. Eine geringe Anzahl von CD8-Zellen erscheint "dunkel". Diese dunklen Zellen sind CD8&spplus; und müssen daher in den Zählwert aufgenommen werden, wenn der Absolutwert genau sein soll.
• Zur Lösung dieses Problems wurde ein neues Clusterbildungswerkzeug entwickelt. Es wird eine "Röhre" gezeichnet, die den oberen Cluster (d.h. CD8&spplus;) mit dem unteren Cluster (d.h. CD8&supmin;) verbindet. Sie wird so gezeichnet, daß sich in einem zweidimensionalen Diagramm eine Seite vom äußersten linken Rand der oberen Clustergrenze zum äußersten linken Rand der unteren Clustergrenze erstreckt und die andere Seite sich vom äußersten rechten Rand der oberen Clustergrenze zum äußersten rechten Rand der unteren Clustergrenze erstreckt. Etwaige Ereignisse, die innerhalb der Orbitalbänder liegen, welche die Clustergrenzen der Röhre umgeben, werden als PQA-Kontrolle, welche die richtige Eingrenzung von CD8dunkel-Zellen sicherstellt, und als PQA-Kontrolle gegen Beeinträchtigung durch Debris (Gewebstrümmer) überwacht.
• Zusätzlich zu dem oben beschriebenen Röhrenbereichs-Werkzeug wurde ein weiteres Werkzeug zur Behandlung des Spezialfalles entwickelt, in dem die Analyse von fluoreszenzmarkierten Zellen eine Fluoreszenzsteuerung und/oder Vergleichsperlen einschließt. In diesem Falle wird ein kreisförmiger, zweidimensionaler Perlenmaximum-Attraktor verwendet, um das Vektormittel der Perlen genau zu lokalisieren, das dann mit Hilfe fester Vektorverschiebungen zur Voraussage der wahrscheinlichsten Positionen der Zellpopulationscluster verwendet wird. Das Ziel ist, daß die Position des Perlenmaximums eine Drift des Lichtleistungsabgleichs und der Geräteempfindlichkeit erkennen läßt. Eine etwaige Drift des Perlenmaximums sagt eine ähnliche Drift der Zellcluster voraus; daher verursacht jede Positionsverschiebung des Perlenmaximums eine Verschiebung der Keimpositionen um einen ähnlichen Betrag in eine ähnliche Richtung. Dies läßt sich durch eine Zweischrittanalyse bewerkstelligen, in der anfänglich nur Perlen analysiert werden, um das Perlenmaximum festzustellen, oder mit Hilfe der Analyse eines Kontrollröhrchens vor der Erfassung der eigentlichen Probe. Im ersteren Fall wird zur Feststellung des Perlenmaximums ein kreisförmiger Attraktor verwendet, während im Analyseschritt ein elliptischer Attraktor verwendet wird.
• Fig. 5(A) und 5(B) zeigen die Endpositionen der Cluster und die innerhalb jedes Clusters liegenden Ereignisse für Vollblut von einem AIDS-Patienten. In Fig. 5(A) tritt die größere Anzahl von Ereignissen innerhalb eines Clusters in den CD4&supmin;- oder CD8&supmin;-Clustern auf. Es gibt wenige außerhalb der Cluster liegende Ereignisse, die weder CD4&spplus;- noch CD4&supmin;-T-Zellen noch Perlen sind. In Fig. 5(B) sind die Ereignisse ähnlich wie CD4&spplus;-Zellen verteilt; es wird jedoch der Röhrenbereich angewandt, um diejenigen CD8&spplus;-Zellen zu sammeln, die "dunkle" Fluoreszenzbeträge ausdrücken. In Tabelle I sind die Anzahlen von Ereignissen angegeben, die innerhalb jedes Clusters liegen, sowie diejenigen nicht als rote Blutkörperchen zu klassifizierenden Ereignisse, die nicht geclustert wurden. TABELLE I
• Aufgrund dieser Daten wurde die Anzahl von CD4&spplus;-Zellen pro µl Vollblut zu 156 berechnet; die Anzahl von CD3&spplus;-Zellen pro µl Vollblut wurde zu 972 in dem CD4-Röhrchen und zu 978 in dem CD8-Röhrchen berechnet; und die Anzahl von CD8&spplus;-Zellen pro µl Vollblut wurde zu 769 berechnet. Die Zellenzahl in den Orbitalbändern war niedrig, wodurch die Vollständigkeit der Cluster bestätigt wird.
• Die Daten von Fig. 5 sollen mit den Daten von Fig. 6 verglichen werden, um zu zeigen, wie die vorliegende Erfindung für Prozeßqualitätssicherung (PQA) sorgt. Zum Beispiel ist aus Fig. 6(A) erkennbar, daß der CD4&supmin;-Cluster mit Debris und roten Blutkörperchen verunreinigt ist, während in Fig. 5(A) eine Trennung zwischen den roten Blutkörperchen/Debris und den CD4&supmin;-Zellen auftritt. Dieses Problem zeigt sich auch in Tabelle II, wo die Anzahl der Ereignisse, die in den Orbitalbändern für CD4- und CD8- auftreten, höher als erwartet ist, wenn die Vollständigkeit der Cluster erhalten geblieben ist. Aufgrund dieser Daten hätte man die Probe in Fig. 6 verwerfen müssen. TABELLE II
• Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung zeigt sich ebenfalls in Tabelle II. Sowohl für das CD4- als auch für das CD8-Röhrchen wurde die Zählung beendet, sobald die Anzahl der CD4&spplus;-Ereignisse den Wert 2500 überstieg. Das Gerät war auf automatische Abschaltung bei 2500 Ereignissen im CD4&spplus;-Fenster eingestellt worden. Das gleiche gilt für die Anzahl von CD8&supmin;-Ereignissen im CD8-Röhrchen.
• Alle in der vorliegenden Patentbeschreibung erwähnten Veröffentlichungen und Patentanmeldungen lassen den normalen Stand der Technik erkennen, auf den sich die vorliegende Erfindung bezieht.

Claims (6)

1. Automatisiertes Verfahren zur Einteilung von Teilchen in mindestens einer Probe in einen oder mehrere Datenduster, mit den folgenden Schritten:

(a) automatische Erfassung mehrerer Parameter für jedes von mehreren Teilchen in einer Probe;

(b) automatische Darstellung jedes Teilchens in einem Satz zweidimensionaler Streudiagramme; und gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:

(c) manuelles Festlegen einer Anfangsposition mindestens einer geometrischen Randfläche mit variabler Position in dem Satz zweidimensionaler Streudiagramme, so daß die Randfläche eine Gruppe der dargestellten Teilchen in einem Datencluster einschließt;

(d) automatische Ermittlung des statistischen Massenmittelpunkts des innerhalb der geometrischen Randfläche enthaltenen Teilchendatenclusters mit Hilfe einer Schwerkraftanziehungsmaschine; und

(e) automatische Verlagerung der Position der geometrischen Randfläche in dem Satz zweidimensionaler Streudiagramme um den neu berechneten statistischen Massenmittelpunkt für die Teilchendatencluster herum.

2. Automatisiertes Verfahren nach Anspruch 1, das ferner die folgenden Schritte aufweist:

(f) automatische Wiederholung der Schritte (d)-(e), bis eine vom Anwender definierte Teilchenzahl oder alle verfügbaren Teilchen in der Berechnung eines endgültigen Mittelpunktsortes enthalten sind; und

(g) automatischer Vergleich aller verfügbaren Teilchen mit der geometrischen Randfläche zur Aufnahme in den oder zum Ausschluß aus dem mit der geometrischen Randfläche verbundenen Datencluster.

3. Automatisiertes Verfahren nach Anspruch 2, das ferner die folgenden Schritte aufweist:

(h) automatische aufeinanderfolgende Wiederholung der Schritte (a)-(g) für eine oder mehrere weitere Proben, wobei der Schritt zum manuellen Festlegen einer Anfangsposition der geometrischen Randfläche so angepaßt wird, daß die geometrische Randfläche automatisch in die Anfangsposition gebracht wird.

4. Automatisiertes Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt zum manuellen Festlegen einer Anfangsposition der geometrischen Randfläche die Definition der Größe, Form und Orientierung der geometrischen Randfläche einschließt.

5. Automatisiertes Verfahren nach Anspruch 1 zur Einteilung von Teilchen mindestens einer Probe aus einem Durchflußzytometer in einen oder mehrere Datencluster, mit den folgenden Schritten:

(a) automatische Erfassung mehrerer Parameter für jedes von mehreren Teilchen in einer Probe;

(b) automatische Darstellung jedes Teilchens in einem Satz zweidimensionaler Streudiagramme;

(c) manuelles Festlegen einer Anfangsposition mindestens einer geometrischen Randfläche mit variabler Position in dem Satz zweidimensionaler Streudiagramme, so daß die Randfläche eine Gruppe der dargestellten Teilchen in einem Datencluster einschließt, wobei die geometrische Randfläche eine vom Anwender definierte Größe, Form und Orientierung aufweist;

(d) automatische Ermittlung des statistischen Massenmittelpunkts des innerhalb der geometrischen Randfläche enthaltenen Teilchendatenclusters mit Hilfe einer Schwerkraftanziehungsmaschine;

(e) automatische Verlagerung der Position der geometrischen Randfläche in dem Satz zweidimensionaler Streudiagramme um den neu berechneten statistischen Massenmittelpunkt für den Teuchendatencluster herum;

(f) automatische Wiederholung der Schritte (d)-(e), bis eine vom Anwender definierte Teilchenzahl oder alle verfügbaren Teilchen in der Berechnung eines endgültigen Mittelpunktsortes enthalten sind; und

(g) automatischer Vergleich aller verfügbaren Teilchen mit der geometrischen Randfläche zur Aufnahme in den oder zum Ausschluß aus dem mit der geometrischen Randfläche verbundenen Datencluster.

6. Automatisiertes Verfahren nach Anspruch 5, das ferner die folgenden Schritte aufweist:

(h) automatische Wiederholung der Schritte (a)-(g) für eine oder mehrere weitere Proben, wobei der Schritt zum manuellen Festlegen einer Anfangsposition der geometrischen Randfläche so angepaßt wird, daß die geometrische Randfläche automatisch in die Anfangsposition gebracht wird.